fenotipizacija alfa-1-antitripsina izoelektriČ · pdf fileposlj di j t ij kti i hibit t...

Fenotipizacija alfa-1-antitripsina izoelektričnim fokusiranjemD Matišić

tečaj trajnog usavršavanja medicinskih biokemičaraPrimjena automatiziranih elektroforetskih metoda visoke djelotvornosti u kliničkom laboratorijuZagreb, 09.04.2011. 1

FENOTIPIZACIJA ALFA-1-ANTITRIPSINA

IZOELEKTRIČNIM FOKUSIRANJEM

D. Matišić

Alfa-1-antitripsin - A1AT

visoko polimorfan glikoprotein kojeg stvaraju: hepatociti i alveolarni makrofagi

A1AT je najvažniji inhibitor proteaza

A1AT je jednolančani glikoprotein (MW 52 kDa) kojeg čine 394

NAN

Gal

GlcNAc

Man

NAN

Gal

GlcNAc

Man A1AT je jednolančani glikoprotein (MW 52 kDa), kojeg čine 394 aminokiseline i tri postranična ugljikohidratna lanca vezana N-glikozidnom vezom na Asp ostatke

Ugljikohidratne lance čine manoza, N-acetilglukozamin, galaktoza i sialinska kis. Na posljedne manozne ostatke nadovezuju se dvije ili tri „antene“ što je razlog mikroheterogeničnosti A1AT molekule

Man

Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Tij k i t l k l t f id i blikTijekom sinteze molekula se umata u sferoidni oblik određen s devet alfa uzvojnica i tri beta nabrane

ploče koju tvore paralelne i antiparalelne niti

Tri postranična ugljikohidratna lanca nalaze se na površini jednog dijela sferoidne strukture,

a inhibitorno mjesto Met358 – Ser359

lokalizirano je na suprotnom kraju sferoidne strukture



Alfa-1-antitripsin - A1AT

glavna antiproteaza u ljudskom tijelu:

neutralizira neutrofilne elastaze kao i druge

serinske proteaze koje mogu potjecati iz leukocita,

alveolarnih makrofaga i mikroorganizamag g

njegovo djelovanje proteaznog inhibitora prvi

je put opisano na tripsinu pa otuda i potječe naziv A1AT

Neutrofilna elastaza je jednolančani glikoprotein od

29 kD, uskladišten u primarnim granulama neutrofilnih

granulocita, a djeluje kao ekstracelularna proteaza

Neutrofilna elastaza cijepa brojne komponente

vanstaničnog matriksa avanstaničnog matriksa a

od posebne važnosti je ELASTIN koji nam omogućuje

elastično naprezanje vezivnog tkiva–npr. stijenki alveola

Neutrofili sadrže oko 2 pg NE (količina varira –

genetsko nasljeđe) i otpuštaju ga tokom fagocitoze,

perturbacije membrane ili stanične lize

Alfa-1-antitripsin A1AT

Mehanizam djelovanja A1AT nije točno poznat –t d i đ t i A1AT t j

Met358 u aktivnom centru A1AT molekule je podložan oksidaciji u sulfoksid – A1AT se

brzo inaktivira oksidirajućim agensima kao što su kisikovi radikali koje otpuštaju fagociti

-Tijekom upalnog procesa Lkc otpuštaju baktericidne kisikove radikale i granulocitne enzime:

elastazu i katepsin G koji razaranjem okolnog tkiva izoliraju strano tijelo

-Širenje tog procesa razaranja vezivnog tkiva zaustavlja se upravo djelovanjem tkivnih

smatra se da između proteaza i A1AT nastaje čvrsta veza u molarnom omjeru 1:1 posljedica čega

je inaktivacija proteolitičke aktivnosti proteaza

-Širenje tog procesa razaranja vezivnog tkiva zaustavlja se upravo djelovanjem tkivnih

proteaznih inhibitora – prvenstveno A1AT ali u središtu neutrofilne aktivnosti A1AT je inhibiran

djelovanjem otpuštenih sl. kisikovih radikala pa se tu razaranje okolnog vezivnog tkiva odvija

neometano i tu predstavlja prednost

-tako kod astme kao upalne bolesti, u tijeku upale nastaje oksidacija A1AT, kao rezultat reakcije s

H2O2 i mijeloperoksidazom (iz neutrofila i alveolarnih makrofaga) te slijedi pomak u korist

elastaze – posljedica je destrukcija elastina



Deficit A1AT

Deficit A1AT je nasljedna autosomna recesivna bolest i posljedica je mutacije SERPINA 1 gena smještenog na kromosomu 14q 31- 32.2

Pi lokus je veoma polimorfan: nađeno je više od 120 polimorfnih alela ili varijanti ali samo neke varijante prati snižena sinteza A1AT

Uobičajena podjela alela A1AT:

Normalni aleli – normalna koncentracija A1AT i normalna funkcija

Rizični aleli – rizik razvoja emfizema pluća odnosno bolesti jetre

Homologni kromosomi

Ovu skupinu alela čine:

deficijentni aleli - A1AT proteini mogu i ne moraju funkcionirati normalno

nul aleli – rezultiraju s nedektibilnom koncentracijom A1AT

disfunkcionalni aleli – kodiraju molekule A1AT koje su u serumu prisutne u normalnim koncentracijama, ali ne funkcioniraju normalno

-najčešći normalni alel je PiM kojeg prati normalna konc. A1AT (poznati su M1, M2, M3 i rijetki M4 aleli koji se fokusiraju između pH 4,4 i pH 4,67)

-od promijenjenih alela najčešće se pojavljuju PiS i PiZ koje

Deficit A1AT

prati snižena konc. A1AT u serumu kao i mala brzina PiS i vrlo mala brzina PiZ u elektroforetskoj migraciji

Z alel – Glu342 GAG – Lys AAG mutacijsko mjesto V osnovni alel M1 (Ala213)Long i sur.-1984. pokazali da je sekvenca eksona S alela identična M1 alelu osim u eksonu III S alel – Glu264 GAA – Val GTA mutacijsko mjesto III osnovni alel M1 (Val213)

Sintetizirani Z protein se u endoplazmatskom retikulumuSintetizirani Z protein se u endoplazmatskom retikulumu sporije umata u svoju trodimenzionalnu konfiguraciju, što dovodi do agregacije susjednih molekula – nastaju netopljive intracelularne inkluzije, zrnca promjera 1 - 40 μm. Posljedica agregacije u ER – smanjeno izlučivanje A1AT, tako da se u Z homozigota samo 15 % sintetiziranog proteina izluči u plazmu

Z A1AT kao i S A1AT varijanta spontano polimeriziraju na 370C



Deficit A1ATNul aleli – rijetka skupina kod kojih ne dolazi do sinteze A1AT

Rezultat su stvaranja stop kodona u kodirajućimn eksonima A1AT gena

Nasljeđivnje nul alela od oba roditelja predstavlja velik rizik za razvoj emfizema

do 30. god.života a preživljenje je rijetko iznad 40 godina života

Disfunkcionalni aleli–poznata samo jedna disfunkcionalna varijanta: Pittsburgh protein;

lj di j t ij kti i hibit t A1ATposljedica je mutacije u aktivnom inhibitornom centru A1AT

Takav A1ATviše ne djeluje kao vrlo djelotvoran inhibitor NE nego djeluje kao AT III tj. kao

inhibitor trombina pa ima značajnu ulogu u sustavu zgrušavanja krvi i dovodi do

hemoragijske dijateze, čak i u heterozigotnom obliku

S alelna varijanta je učestalija od Z varijante u europskoj populaciji; od manjeg je značaja

od Z deficijentne varijante jer u homozigotnom obliku rezultira dostatnom konc. A1AT za

zaštitu respiratornog trakta

PiMM - sintetizira se 100% od norm. konc. A1AT

PiMS - sintetizira se 80% od norm. konc. A1AT

PiSS - sintetizira se 60% od norm. konc. A1AT

PiMZ - sintetizira se 60% od norm. konc. A1AT

PiSZ - sintetizira se 40% od norm. konc. A1AT

PiZZ - sintetizira se 10-15% od norm. konc. A1AT

Kod nedostatka A1AT djelovanje proteolitičkih enzima rezultira oštećenjem tkiva:

Deficit A1AT

rezultira oštećenjem tkiva:najčešće oštećenjem plućnih alveola i to

lezijom elastinskih vlakana posljedica čega jedestrukcija alveolarne membrane

rjeđe oštećenjem jetre irijetko oštećenjem kože

Bolest se najčešće manifestira

emfizemom prije 40. godine životaemfizemom zbog profesionalneizloženosti nepovoljnom okolišu

emfizemom kod pušačaidiopatskim kroničnim hepatitisom

KOPB ili bronhoektazijom u mladostiPanikulitis



Emfizem

Panikulitis

KOMPLIKACIJE POVEZANE S DEFICITOM A1AT

Deficit alfa-1-antitripsina

Karcinom

kronična opstruktivna plućna bolest - KOPB

Kronični bronhitis

Hepatitis

Ciroza jetre

bolest KOPB

Cistična fibroza

Emfizem pluća

Bilijarna atrezija

TERAPIJA BOLESNIKA S DEFICITOM A1AT

Terapija obuhvaća:A) Protokol za praćenje bolesnika s KOPB

B) Eliminiranje izlaganja uzrocima pogoršanja bolesti

Prestanak pušenjaPrestanak izlaganja toksinima iz okoliša

Protokol za praćenje bolesnika s KOPB

Bolesnici s akutnim pogoršanjem KOPB se tretiraju: kisikom (hipoksični bolesnici)

Inhalacijom beta 2 agonistima, inhalacijom antikolinergika te primjenom antibiotika i kortikosteroida

Methylxanthin terapija se primjenjuje kod bolesnika koji ne odgovaraju na ostale bronhodilatatore

C) Supstitucijsku terapiju s tjednim injekcijama A1AT (60 mg/kg) od pool-a humane plazme

Supstitucijska terapija je indicirana u nepušača, progresivnog oblika KOPB i kod serumske konc. A1AT ispod 0,8 g/L (< 11 umol/L)

Methylxanthin terapija se primjenjuje kod bolesnika koji ne odgovaraju na ostale bronhodilatatore

-antibiotska terapija se preporuča kod infekcija s Streptococcus pneumoniae, Haemophilus

influenzae i Moraxella catarrhalis

-Kod blagog ili umjerenog pogoršanja KOPB bolesnici se uobičajeno tretiraju sa starim

antibioticima širokog spektra kao što su doxycycline, trimethoprim-sulfamethoxazole and

amoxicillin-clavulanate potassium

-Tretman s penicilinom, fluoroquinolonom, trećom-generacijom cephalosporina ili

aminoglikozidima može se imati na programu kod bolesnika s više jakih napadaja



Neke od bolesti za koje se vrši gensko

Protokol za praćenje bolesnika s KOPB

Vođenje terapije kroničnih stabilnih bolesnika s KOPB uvijek uključuje prestanak pušenja i terapiju kisikom

Inhaliranje beta 2 agonista, antikolinergika i sistemskih kortikosteroida osigurava kratkotrajno poboljšanje u

Neke od bolesti za koje se vrši gensko testiranje je i deficit A1AT

bolesnika s kroničnim stabilnim KOPBInhaliranje kortikosteroida smanjuje respiratorne

problemePrevencija akutnih napadaja skraćuje

dugotrajne komplikacijeBolesnicima s KOPB često su preporučene dugotrajne terapije s kisikom, regularno praćenje funkcije pluća te

upućivanje na plućnu rehabilitaciju

Takvim bolesnicima potrebno je dati cjepivo protiv gripe i pneumokok vakcinepneumokok vakcine

Bolesnici koji ne odgovaraju na standardnu terapiju trebaju kirurški zahvat

Rehabilitacija je sastavni i nužan dio liječenja u sklopu multidisciplinarnog programa, kojem je cilj

povećanje kapaciteta disanja i poboljšanje kvalitete života: to su vježbe disanja za jačanje pomoćne dišne

muskulature i povećava kapacitet disanja

Od diti k A1AT

Sumnja na deficit A1AT kod

produžene žutice u novorođenčadi; žutice nepoznatog porijekla u djece,

plućnog emfizema, bronhoektazije, hepatitisa ili ciroze jetre nepoznate etiologije u odraslih;

niska vrijednost alfa-1-globulin frakcije kod elektroforeze proteina u serumu

LABOROTORIJSKA DIJAGNOSTIKA DEFICITA A-1-AT

+

Odrediti konc. A1AT

Fenotipizacija - IEF-PAG ili

IEF –agaroza poluautomatizirana metoda

Anamneza obitelji o deficitu A1AT- uredna

Genotipizacija: -kad dobiveni fenotip ne odgovara kliničkoj slici - prenatalna dijagnostika

Normalna konc. A1AT Snižena konc. A1AT(za 20% od donje vrijed.RI)

Nema daljnjeg testiranja

Anamneza obitelji ukazuje na postojanje deficita A1AT

+

Pi ZZ – 10 - 20% norm. konc.A1AT

Pi SZ, Pi S0, Pi Z0 – do < 40 % norm. konc. A1AT

p j g

Testirati cijelu obiteljLiječenjePreporučiti genetsko savjetovalište



IZOELEKTRIČNO FOKUSIRANJE A1AT NA PAG uz pH = 4 - 5

2

4

678

24

678

Katoda -

Anoda +

IEF na tankom sloju PAG uz pH = 4 – 5

Izoelektričnom fokusiranju prethodi predfokusiranje (30 min) pod istim uvjetima kao i fokusiranje: U = 1400 V, S = 25 W, I = 50 mA. Nakon fokusiranja - 2,5 sata - gel se boji s Coomasie Blue R-250 oko 5 min. Zbog mikroheterogeničnosti A1AT molekule nakon IEF imat ćemo pojavu

multiplih vrpci prema čijem intenzitetu i položaju određujemo fenotip A1AT

MZ ZZ MM MM ZZ

IZOELEKTRIČNO FOKUSIRANJE A1AT NA AGAROZI UZ IMUNOFIKSACIJU AUTOMATIZIRANOM METODOM

MS

MZMM

ZZ

Izoelektrično fokusiranje na agarozi uz imunofiksaciju automatiziranom metodom

Metoda se izvodi u dva koraka: prvi je izoelektrično fokusiranje na agaroznom gelu a drugi je imunofiksacija s anti-A1AT obilježenim s peroksidazom koji poboljšava detekciju i identifikaciju različitih fenotipova

Cijeli postupak traje oko 1 sat. Osjetljivost metode je 0,05 g/L. Molekule A1AT se nakon IEF u kombinaciji s IF razdvajaju na jasno odvojene multiple vrpce prema čijem intenzitetu i položaju određujemo fenotip A1AT




1 32 54 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Z Z

MM

MS

MZ


Br. Konc. A1AT

Fenotip Genotip

9-R 1,11 MZ MZ

10-R 0,83 MZ MZ

11-D 0,80 MZ MZ

1 32 54 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

13-D 0,22 ZZ ZZ

14-D 0,83 MZ MZ

15 -D 0,82 MZ MZMZ MZ MZ MZMZ

ZZ

Iz rezultata se zaključuje da je koncentracija A1AT pouzdan pokazatelj za pretraživanje deficitnog homozigotnog fenotipa, ali ne i heterozigotnog fenotipa

fenotipizacija alfa-1-antitripsina izoelektriČ · pdf fileposlj di j t ij kti i hibit t...

Documents