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Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica Aurora Martnez Romero Jos Luis Ortega Snchez

Libro electrnico Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica. 2011 A esta obra le ha sido emitida los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14

Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 19962011.

Prohibida la reproduccin total o parcial, sin la autorizacin escrita de los autores y de veterinaria.org http://www.veterinaria.org [email protected]


Autores Dra. en C. Aurora Martnez Romero. Divisin de Estudiosde Postgrado e Investigacin de la Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Jurez del Estado de Durango. Gmez Palacio, Durango. Mxico. [email protected]

C. Dr. en C., M.S.P. Jos Luis Ortega Snchez. Unidad RegionalUniversitaria de Zonas ridas. Universidad Autnoma Chapingo. Bermejillo, Durango. Mxico. [email protected]

Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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INDICE Presentacin.................................................................................................................................................. 7 Introduccin ................................................................................................................................................. 8 Manejo, transporte y almacenamiento de materiales en el laboratorio de Inmunologa ........ 9 Prcticas generales de seguridad y bioseguridad en el laboratorio..................... 100 Reglamentos ........................................................................................................ 100 Normas de Seguridad especficas de las prcticas ................................................ 10 Manejo de residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI).................................. 13 Los residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI) ........................................................................13 Cuadro de Competencias........................................................................................... 14 Mapa del sistema de prcticas de Inmunologa. Estructura y programa del sistema de rcticas....................................................................................................................... 14 Contenido de cada prctica en particular ............................................................... 1616 PRACTICA NO. 1...................................................................................................................................... 17 ANIMALES DE EXPERIMENTACIN........................................................................ 17 Posicin de las inyecciones: a) intravenosa b) intraperitoneal ................................... 19 PRACTICA NO. 2...................................................................................................................................... 25 DILUCIONES ............................................................................................................. 25 PRCTICA NO. 3.................................................................................................................................... 300 MTODO DE OUCHTERLONY ................................................................................. 30 REACCIONES DE INMUNODIFUSIN ..................................................................... 30 PRCTICA NO. 4...................................................................................................................................... 34 DETERMINACIN DE INMUNOGLOBULINAS SRICAS ........................................ 34 1 PRUEBA DE PRECIPITACIN DEL SULFITO DE SODIO .............................. 34 2 PRUEBA DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC ........................................... 36 3 PRUEBA DEL GLUTARALDEHDO.................................................................. 39 PRACTICA NO. 5...................................................................................................................................... 40 BRUCELOSIS: Aspectos generales y Serodiagnstico ............................................. 40 PRUEBA RAPIDA DE AGLUTINACIN EN PLACA.................................................. 45 (ROSA DE BENGALA (Card Test))............................................................................ 45Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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PRACTICA NO. 6...................................................................................................................................... 48 FUNDAMENTO .......................................................................................................... 48 PRACTICA NO. 7...................................................................................................................................... 53 PRIMERA PARTE ...................................................................................................... 53 AGLUTINACION ESTNDAR EN TUBO ................................................................... 53 SEGUNDA PARTE..................................................................................................... 57 AGLUTINACIN EN TUBO EN PRESENCIA DE ...................................................... 57 2-MERCAPTOETANOL ............................................................................................. 57 PRACTICA NO. 8...................................................................................................................................... 61 PRIMERA PARTE ...................................................................................................... 61 AGLUTINACIN ESTANDAR EN MICROPLACA ..................................................... 61 AGLUTINACIN EN PRESENCIA DE 2- Me EN MICROPLACA .............................. 61 SEGUNDA PARTE..................................................................................................... 64 PRACTICA NO. 9...................................................................................................................................... 67 ANTGENOS DE SUPERFICIE DE GRUPOS SANGUNEOS .................................. 67 SISTEMA ABO ........................................................................................................... 67 METODOLOGA ........................................................................................................ 68 PRACTICA NO. 10.................................................................................................................................... 71 REACCIONES FEBRILES ......................................................................................... 71 PRCTICA NO. 11.................................................................................................................................... 75 ANTIESTREPTOLISINAS .......................................................................................... 75 PRACTICA NO. 12.................................................................................................................................... 81 DIAGNOSTICO PRECOZ DEL EMBARAZO ............................................................. 81 PRACTICA NO. 13.................................................................................................................................... 85 DIAGNOSTICO SEROLGICO DE SFILIS .............................................................. 85 PRACTICA NO. 14.................................................................................................................................... 89 DETERMINACION DEL FACTOR REUMATOIDE..................................................... 89Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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PRACTICA NO. 15.................................................................................................................................... 97 PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIN DE CLULAS MONONUCLEARES A PARTIR DE SANGRE TOTAL POR EL MTODO FICOLL-HYPAQUE................................... 97 Viabilidad Celular.................................................................................................... 97 CONGELACIN Y DESCONGELACIN DE CLULAS MONONUCLEARES...... 98 PRACTICA NO. 16.................................................................................................................................. 101 PRUEBAS CRUZADAS ........................................................................................... 101 PRACTICA NO. 17.................................................................................................................................. 104 PRUEBA DE COOMBS............................................................................................ 104 PRUEBA DE COOMBS DIRECTA ........................................................................... 104 PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA ....................................................................... 106 PRACTICA No. 18................................................................................................................................... 108 PODER BACTERICIDA DEL SUERO NORMAL ..................................................... 108 Glosario de trminos ................................................................................................ 111


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Presentacin Este manual de prcticas de Inmunologa se propone iniciar al estudiante en el estudio de la inmunologa. Su contenido es terico y esquematizado, redactado de tal manera que facilite su comprensin. Su planeacin intenta seguir el trayecto que realiza una sustancia extraa a travs del organismo, con los diversos mecanismos de defensa que opone a su penetracin y en algunos casos limitar su replicacin a travs de la respuesta inmune. Se plantea la realizacin de 17 prcticas correspondientes a la aplicacin de la inmunologa clnica, implementadas de tal manera que el estudiante las pueda realizar sin la necesidad de material ni equipo sofisticado, nicamente con el material necesario para realizar las pruebas convencionales, de rutina en cualquier laboratorio de anlisis clnicos, con fines didcticos se proporcionan a los estudiantes muestras de fluidos corporales positivas, trabajando siempre con tica profesional, en el manejo de este tipo de muestras. La base para la realizacin del presente Manual fue la visualizacin de la importancia que tiene que el estudiante de inmunologa, tenga una formacin slida sobre su conocimiento prctico y que ingrese al mbito laboral con las habilidades para resolver problemas en el rea de la inmunologa, adems los estudiantes adquieren el conocimiento sobre la importancia de desarrollar su trabajo con tica y responsabilidad, con el compromiso de otorgar a los individuos que requieran de su servicio, la confianza de saber que cuentan con un laboratorio comprometido con la calidad y de esta manera puedan ser partcipes del mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes. Esta obra enfrenta la aplicacin de otorgar un servicio de calidad, proporcionando diagnsticos oportunos y confiables, es de fundamental importancia para quienes trabajamos sobre los problemas que aquejan la salud, tengamos conciencia de ser profesionales de calidad. Este Manual de prcticas de Laboratorio de la Ctedra de Inmunologa, representa una revisin exhaustiva destinada a la enseanza de la inmunologa. La elaboracin de este proyecto inicia con la construccin de las tcnicas de laboratorio implementadas en el trabajo diario de un laboratorio clnico. Como criterios de seleccin de las prcticas, se consider la necesidad sobre el conocimiento de las mismas frente al desempeo en el campo laboral. Adems, las prcticas desarrolladas en su metodologa se manejan el uso de material accesible en nuestro laboratorio, implementado de tal manera que se puedan aplicar en un laboratorio clnico, sin necesidad de equipo sofisticado, en donde el principio en su aplicacin es el conocimiento del fundamento de cada uno de los exmenes de diagnstico realizados.Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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La problemtica que se presenta es la necesidad de que los estudiantes procesen muestras positivas, para esto se les adiestra a trabajar con responsabilidad, puesto que al procesarlas estn bajo el factor de riesgo inminente de infectarse. Es necesario trabajar con este tipo de fluidos corporales para que conozcan la interpretacin real de los resultados que sern de suma importancia en la orientacin al mdico tratante sobre el estado de salud de los pacientes, el plasmar un diagnstico presuntivo certero en la hoja de reporte dar credibilidad a nuestro desempeo como profesionales de la salud. Todo el personal involucrado en el sector salud tiene que manejar todo el material biolgico teniendo en mente que es potencialmente infectante. Al egresar de la carrera tenga una slida formacin con base en sus estudios de inmunologa, para aplicar sus conocimientos en el mundo del desempeo laboral, resolviendo problemas en el rea de serologa o inmunologa, otorgando a los pacientes que requieran de su servicio, otorgar un elevado nivel de competitividad en cuanto al trabajo de calidad en su desempeo, colaborando con el equipo del personal de salud pblica en el uso racional y oportuno de las sustancias, solamente para otorgar el mejor servicio a los usuarios. Desarrollando con tica y responsabilidad profesional su trabajo con el propsito de mejorar la calidad de vida del paciente. Incluso, este manual genera el inters del alumno a incursionar en el rea de la investigacin bsica y aplicada relacionada a las reas de la salud. Para comprender la terminologa utilizada en inmunologa, se anexa un glosario de trminos. Adems se recomienda al estudiante que busque la relacin entre sus actividades diarias y conocimientos adquiridos anteriormente, para que lo logre en ellos un aprendizaje significativo y en vez de memorizar que analicen la terminologa utilizada en inmunologa buscando su significado etimolgico, de esta manera lo que se estudie durante el curso jams se olvide.


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IntroduccinPor definicin, la Inmunologa tiene como objetivo el estudio de los fenmenos relacionados con la inmunidad, por inmunidad se entiende el conjunto de mecanismos de defensa que protegen contra los microagresores que se encuentran en el medio ambiente. Inmunologa, palabra de origen latino, etimolgicamente significa, privilegio, exencin. Actualmente, la Inmunologa ya no puede limitarse al estudio de los medios de lucha contra los agentes infecciosos: su dominio, mucho ms amplio, reagrupa las diversas reacciones que utiliza el organismo para mantener su integridad. La Inmunologa es el estudio del mecanismo y de las consecuencias de las modificaciones especficas producidas en un organismo por introduccin de una sustancia llamada antgeno; se llama reaccin inmunitaria a la reactividad nueva y especfica que el organismo adquiere despus de la introduccin de este antgeno, tanto si se trata de un agente infeccioso como de una molcula de peso molecular elevado o de una clula. Es importante generar la conciencia de trabajar con calidad, para que el mdico siempre tenga confianza en el qumico para apoyarse en l, con la certeza que se le apoyar para poder otorgar al paciente un diagnstico definitivo. En cada prctica se realiz un anlisis en la metodologa de trabajo e interpretacin de los resultados obtenidos. Se deben promover y coordinar esfuerzos de los diferentes constituyentes del sector salud para preservar la salud, combatir las enfermedades, prolongar la vida y estimular el desarrollo fsico, mental y social de sus habitantes. Otorgar un servicio de calidad a la comunidad, nuestro trabajo nos respaldar y ser nuestra carta de presentacin. Los objetivos del presente manual de prcticas son exponer de manara clara las prcticas elementales implementadas en la medicina cotidiana en un laboratorio de diagnstico del rea de serologa de un laboratorio de anlisis clnicos, desarrollar habilidades y aptitudes necesarias para el manejo adecuado de muestras biolgicas, realizar tcnicas y mtodos inmunolgicos que apoyarn en el diagnostico certero y oportuno de padecimientos inmunes.


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Manejo, transporte y almacenamiento de materiales en el laboratorio de Inmunologa Se implementa un programa de eco-eficiencia, que se logra a travs de la generacin de productos y servicios que satisfacen las necesidades humanas y generan calidad de vida, al mismo tiempo que se reducen en forma progresiva los impactos ambientales y el uso de recursos no renovables, reduccin de la energa y de las emisiones txicas, aumento de la cultura del reciclaje y durabilidad del producto/servicio, entre otros. Se llevan a cabo estrategias de gestin ambiental, por lo que, se cuenta con servicio de recoleccin, transporte y disposicin final de residuos biolgicoinfecciosos procedentes de las actividades relacionadas con la prevencin y cuidado de la salud implementada en la Facultad de Ciencias Qumicas. En las reas de laboratorio hay rtulos de informacin y los contenedores necesarios para eliminar los residuos biolgico-infecciosos: 1. Patolgicos (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/03) 2. Punzocortantes (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/05) 3. Miscelneos (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/06) Las actividades implementadas para monitorear el desempeo en el cuidado y mantenimiento del medio ambiente son: infecciosos. Inspeccionar el sitio donde se generan los residuos y los programas de recoleccin, tipos de equipo, material y procedimientos adecuados. Mantener los suministros de material necesario para la seleccin, clasificacin y empaque de residuos (contenedores plsticos, bolsas, cajas de cartn, etc.). Monitorear que se respete la programacin de las fechas de recoleccin de residuos, en funcin de sus volmenes de generacin de los mismos y realizar los ajustes y seguimientos necesarios. Vigilar que el transporte de los residuos biolgico-infecciosos generados sea el adecuado y bajo las normas de confinamiento para ste objeto. Garantizar que el destino final de los residuos biolgicos generados sea el adecuado segn las disposiciones de la Secretara de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca (SEMARNAP).Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

Capacitar al personal en el manejo adecuado de residuos biolgico-

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Prcticas generales de seguridad y bioseguridad en el laboratorio. ReglamentosEl presente manual est sustentado bajo normas oficiales mexicanas y reglamentos de los Laboratorios de la Facultad de Ciencias Qumicas de la UJED, as como,

Normas de Seguridad especficas de las prcticasa) Cuadro de Deteccin de Riesgos Particulares. Tipo de peligro Cortaduras Como evitarlo Utiliza guantes de asbesto y/o acerados en caso de manejar equipo cortante, as como solicitar al laboratorista y/o a tu docente las recomendaciones en el manejo del mismo. Como proceder en caso de un accidente Si el sangrado es intenso, aplica presin o una compresa directamente sobre la herida y consiga atencin mdica. Si la cortadura es pequea deja que sangre un poco y lvala con agua y jabn. Procura que la persona respire aire fresco. acomdala de modo que su cabeza quede debajo del cuerpo Procura que la persona respire aire fresco. Acomdala de modo que su cabeza quede debajo del cuerpo. Cierra todas las tomas de gas, desconecta todos los circuitos elctricos. Usa una manta contra el fuego o un extinguidor para apagarlos. Lava de inmediato el ojo con agua corriente. No permitas que la vctima se frote el ojo.

Descarga elctrica

Desmayo

Utiliza como tapete de piso un material aislante (madera) al encender o conectar electricidad; no tomes cables expuestos o daados visiblemente. Cerciorarte de la ventilacin en el rea de trabajo (extractores) y evita llevar a cabo la prctica en caso de sentirte dbil y/o mareado.

Incendio

Lesin de los ojos

Quemaduras

Apaga el equipo en caso de sobrecalentamiento y as mismo, desconctalo en forma inmediata. No uses material no equipo visiblemente daado. Utiliza lentes protectores y toma una distancia de medio metro o ms de ser posible en la actividad a desarrollar. Utiliza guantes, camisa de manga Lava con agua fra hasta que larga y tu bata de trabajo, tomando el la sensacin de ardor se material y el equipo calientes con calme. pinzas, contenedores, etc.


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b) Cuadro de Disposicin de desechos. Tipo de desechos Orgnicos e inorgnicos Como clasificarlos Tipo de contenedor

Orgnica: cscaras de frutas, El indicado para cada caso sobras de comida, cabello y uas, pasto y hojas, y esto es lo que usas para hacer la composta. Inorgnica: latas de aluminio y acero, pero deben de estar limpias. Al acabarse su contenido, se lavan como trastes normales y se dejan secar. Papel, cartn, envases de vidrio, de plstico.

c) Normas oficiales mexicanas. NOM-025-STPS-1999:5.1, 5.2, 5.3: NOM-001-STPS-1999:5.5. Condiciones de iluminacin en los centros de trabajo http://info4.juridicas.unam.mx/ NOM-017.STPS-2001:NOM-114-STPS-1994:NOM-022-STPS-1999 Sistema para la identificacin y comunicacin de riesgos para proporcionar seguridad a los trabajadores de los centros de trabajo, como una solucin a los problemas de riesgos de trabajo por esas sustancias. Se considera que existe una responsabilidad general para proporcionar seguridad a los trabajadores en los centros de trabajo. La comunicacin sobre riesgos es una parte importante de esta responsabilidad, ya que las empresas pueden llegar a utilizar sustancias qumicas y los trabajadores deben estar capacitados para reconocer el riesgo potencial de los diversos productos qumicos, en los procedimientos de operacin y saber usar el equipo de proteccin personal. Este sistema ha sido diseado para llenar la necesidad de una comunicacin efectiva y proporcionar informacin del uso seguro de sustancias qumicas por los trabajadores, a travs de la capacitacin de los elementos que componen el sistema. La parte central de este sistema es la identificacin de los riesgos inherentes de una sustancia:


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NOM-002-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad para la prevencin y proteccin contra incendios en los centros de trabajo. http://www.dif.gob.mx/edif/sad/SGC_CHN/EXTERNOS/NOM-002-STPS1993.pdf NOM-005-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad en los centros de trabajo para el almacenamiento transporte y manejo de sustancias inflamables y combustibles. http://wwweconomia.gob.mx/work/normas/noms/kpronoman/p005stps.pdf NOM-008-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para la produccin, almacenamiento y manejo de explosivos en los centros de trabajo. http://wwweconomia.gob.mx/work/normas/noms/kpronoman/p005stps.pdf NOM-009-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para la produccin, almacenamiento y manejo de sustancias corrosivas, irritantes y txicas en los centros de trabajo. http://wwweconomia.gob.mx/work/normas/noms/kpronoman/p005stps.pdf NOM-010-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se produzcan, almacenen y manejen sustancias qumicas capaces de generar contaminacin en el ambiente laboral. http://www.fabregat.com/catalogo/NOMs/NOM-010-STPS-1993.doc NOM-028-STPS-1993 Seguridad-cdigo de colores para la identificacin de fluidos conducidos por tuberas. http://www.celorio.com/vapor/norma.htm NOM-026-STPS-1993 Seguridad colores y su aplicacin. http://www.dif.gob.mx/edif/sad/SGC_CHN/EXTERNOS/NOM-026-STPS1993.pdf CONVENIO 170 (OIT) Convenio sobre la seguridad en la utilizacin de los productos qumicos en el trabajo. NOM-008-SCFI-1993 Sistema General de Unidades de Medida. http://www.ine.gob.mx/ueajei/publicaciones/nom-008a.html NOM-022-STPS-1999 Relativa a las condiciones de seguridad en los centros de trabajo en donde la electricidad esttica representa un riesgo. Electricidad esttica en los centros de trabajo. Condiciones de seguridad e higiene. http://www.steps.gob.mx/DGSST/normatividad/noms/Nom-022.pdf NOM-114-STPS-1994 Sistema para la identificacin y comunicacin de riesgos por sustancias qumicas en los centros de trabajo. http://www.facmed.unam.mx/deptos/salud/strabajo/pdf/nom-114.pdfManual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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Manejo de residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI) Los residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI), son los que contienen bacterias, hongos, virus, parsitos, microorganismos capaces de causar infecciones, efectos nocivos para la salud y el medio ambiente. NOM-087-ECOL-1995 Establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los RPBI que se generan en establecimientos que prestan atencin mdica (Diario Oficial de la Federacin 07/11/1995). Dicha Norma es de observancia obligatoria para los establecimientos que presten atencin mdica, tales como: hospitales, clnicas, laboratorios clnicos, laboratorios de produccin de agentes biolgicos, de enseanza e investigacin, tanto humanos como veterinarios en pequeas especies y centros antirrbicos, cuando estos generen ms de 25 kg/ mes o 1 kg/da de RPBI. http://bvs.insp.mx/artculos/2/11/06032001.pdf Los RPBI se clasifican en: 1. Residuos de sangre y sus derivados: plasma, suero, etc. 2. Cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos: vacunas, placas de cultivo, etc. 3. Residuos patolgicos: residuos de tejidos, rganos, partes y fluidos corporales, etc. 4. Residuos no anatmicos derivados de la atencin a pacientes y de los laboratorios: torundas, guantes, cubrebocas, tubos, etc. 5. Residuos de objetos punzocortantes usados o sin usar: navajas, jeringas, pipetas Pasteur, porta y cubreobjetos, etc. El siguiente cuadro muestra el color y tipo de envase requerido para cada uno de los tipos de RPBI: Tipo de residuos Sangre Cultivos y cepas de agentes infecciosos Residuos no anatmicos Patolgicos Patolgicos Objetos punzocortantes usados y sin usar Estado fsico Slidos Lquidos Envasado Bolsas de plstico Recipientes hermticos Color Rojo Rojo

Slidos Lquidos Slidos

Bolsas de plstico Recipientes hermticos Recipientes rgidos

Amarillo Amarillo Rojo


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Cuadro de Competencias Ubicar dentro del siguiente cuadro las competencias profesionales donde se ubica la ctedra de inmunologa, identificando los diferentes mbitos del desempeo profesional y laboral, el contenido requerido, as como tambin, las habilidades y actitudes que sern adquiridas durante el desarrollo de las prcticas de inmunologa. Competencia a adquirir Objetivo Intencin o finalidad Contexto o restricciones Rangos (s) o situacione s En los procesos acadmic os, relativos a la inmunolog a bsica

Aplicar

Aplicar en el laboratorio clnico las prcticas realizadas en el laboratorio de Inmunologa

Para realizar exmenes de diagnstico certeros y confiables

Utilizacin de los laboratorios, material y equipo correspondiente, en cada prctica

Mapa del sistema de prcticas de Inmunologa. Estructura y programa del sistema de prcticas. El presente manual forma parte esencial de la ctedra de Inmunologa, la cual se imparte en la Facultad de Ciencias Qumicas dentro del plan de estudios del octavo semestre de la carrera de Qumico Farmacutico Bilogo. Se desarrolla de manera secuencial, acorde al programa temtico de la parte terica de inmunologa, y es parte del sistema formativo bsico de los estudiantes de la carrera de Q.F.B. LABORATORIO Duracin: 6 sesiones (2 horas en cada una) que corresponden al 33.34% del curso.


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Competencia o unidad de competencia Encuadre

Semana 1.

Prcticas Introduccin a la parte prctica de la ctedra de Inmunologa Prctica No. 1 Animales de experimentacin Prctica No. 2 Diluciones Prctica No. 3 Mtodo de Ouchterlony Prctica No. 4 Determinacin de Inmunoglobulinas sricas Prctica No. 5 Brucelosis: Aspectos generales y serodiagnstico Prctica No. 6 Prueba de Rivanol Prctica No. 7 Primera parte. Aglutinacin estndar en tubo Segunda parte. Aglutinacin en tubo en presencia de 2Mercaptoetanol (2-Me) Primera parte. Aglutinacin estndar en microplaca Segunda parte. Aglutinacin en microplaca en presencia de 2-Mercaptoetanol (2-Me) Prctica No. 8 Antgenos de superficie de grupos sanguneos Prctica No. 9 Reacciones febriles Prctica No. 10 Antiestreptolisinas Prctica No. 11 Diagnstico precoz del embarazo Prctica No. 12 Diagnstico serolgico de sfilis Prctica No. 13 Determinacin del factor reumatoide

Tipo Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)

Pre-requisitos Lectura de reglamento de Laboratorio Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo

1. Unidad Generalidades sobre inmunidad y medios de defensa 2. Unidad Clulas involucradas en el fenmeno de fagocitosis 3. Unidad Inmunidad celular y humoral 4. Unidad Complemento 5. Unidad Anormalidades del sistema inmune e inmunidad frente a diferentes microorganismos 6. Unidad Autoinmunidad 7. Unidad Reacciones de hipersensibilidad

2.

3.

Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)

4.

5.

6.

7.

Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)

8.

8. Unidad Complejo Principal de histocompatibilidad (MHC) 9. Unidad Reacciones inmunolgicas 10. Unidad Inmunidad y terapia gnica: beneficios y riesgos 11. Unidad Biotica en Inmunologa 12. Unidad

9.

Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)

10.

11.

12.

13.

13. Unidad

14.

Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo


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14. Unidad

15.

15. Unidad

16.

Prctica No. 14 Procedimiento para la obtencin de clulas mononucleares a partir de sangre total por el mtodo de Ficoll-Hypaque Prctica No. 15 Pruebas cruzadas Prctica No. 16 Prueba de Coombs directa Poder bactericida del suero normal

Laboratorio (2 horas)

Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo

Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas) Laboratorio (2 horas)

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Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo Elaboracin de cuestionario previo con diagrama de flujo

Contenido de cada prctica en particularSe recomienda que la cantidad de alumnos por equipo para poder trabajar ptimamente en el laboratorio en la ctedra de Inmunologa, sea de 4 a 5 alumnos por mesa de trabajo, para un mejor desempeo personal y participativo de cada integrante. En el desarrollo de las prcticas se pretende que se conceptualicen y apliquen los trminos de respuesta inmune celular y humoral, fagocitosis, aglutinacin, precipitacin, inmunoglobulinas, diluciones, reacciones febriles, etc., asocindolos con la solucin de problemas enfocados a resolver problemas relacionados con la salud. Se pretende que con el presente manual el estudiante adquiera las habilidades y conocimientos necesarios para el buen desempeo en un laboratorio clnico y que con el conocimiento del fundamento de cada procedimiento den un razonamiento lgico al diagnstico presuntivo otorgado al mdico solicitante del estudio con un espritu crtico y resolutivo frente a los problemas que se puedan enfrentar en el ejercicio de su profesin.


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PRACTICA NO. 1 ANIMALES DE EXPERIMENTACIN Introduccin La biotica tiene como objetivo conectar la reflexin tica con la investigacin cientfica con la finalidad de construir una ciencia con conciencia al servicio integral del hombre, la experimentacin clnica, constituye un valor en s misma que debe ser buscado lcitamente por los cientficos y que no se contrapone con la instancia tica en cuanto al objetivo comn de ambas que es la bsqueda de la verdad para el hombre y para su salud. La Ley Federal de sanidad animal, publicada el 18 de Junio de 1993 (vigente) trata la prevencin y control de las enfermedades de los animales, la cual fija las bases para el diagnstico, prevencin, control y erradicacin de enfermedades y plagas de los animales terrestres, establece atribuciones de la Secretara en cuestiones de medidas zoosanitarias. Normas oficiales para productos, subproductos animales, productos qumicos, farmacuticos, biolgicos y alimenticios para uso en animales o consumo por stos, as como envases y rtulos. Normas que deben reunir los siguientes establecimientos: ferias, frigorficos, fbricas de productos o subproductos animales para consumo humano, los que fabriquen o expendan alimentos procesados para consumo animal y productos qumicos y farmacolgicos para uso en animales, hospitales y clnicas vegetarianas. Desde el punto de vista biotico, la experimentacin clnica es objetada en base al uso de los pacientes y el investigador y puede aplicarse en varias etapas de la investigacin: la seleccin de pacientes y su reclutamiento. La Ley Federal de Sanidad Animal contempla los laboratorios de prueba o diagnstico en cuanto al trato humanitario, cuidado zoosanitario y tcnicas de sacrificio. La eleccin de especies animales se basa en diversas consideraciones. Se debe tomar en cuenta si la especie en cuestin es susceptible a la enfermedad contra la cual estamos elaborando el producto. Es importante, adems considerar el costo de los animales as como el de su mantenimiento, el tamao y docilidad de los mismos, etc. Un factor importante en bioterios (unidades en donde se cran estos animales) y en laboratorios, es el manejo adecuado, tanto para evitar heridas por mordeduras y araazos, etc., como para evitar el excesivo sufrimiento de los mismos. El manejo de estos animales vara de especie a especie. En las figuras 1-7 se muestra el manejo adecuado de las especies ms comunes en el laboratorio. Las especies que ms se utilizan en el laboratorio son el cobayo, ratn albino, rata albina y el Hamster, ofrecen mayor dificultad la rata y el ratn porque al sentirseManual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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capturados muerden. El cobayo y Hamster son sumamente dciles, la manera ms fcil de tomar una rata es con una mano y de la cola y con la otra sujetar la piel del cuello, as queda inmovilizada. El ratn se toma boca arriba, tomando la cola con los dedos medio e ndice (como se toma un cigarro), y rodearlo con el resto de la mano. Para inyecciones o inoculaciones deber tomarse de la piel del dorso con el pulgar y el ndice, sostenindolo de la cola con el meique y el anular apoyados en la palma de la mano. El Hamster nicamente se utiliza la sujecin por la piel del dorso, ya que. Tienen la cola muy pequea. Los cobayos no ofrecen dificultad, basta con rodearlos por el dorso con una mano y ejerciendo poca presin porque fcilmente se asfixian. El uso de los animales de granja en investigacin cientfica debe estar sujeto a las mismas consideraciones ticas que el uso de otros animales para el mismo propsito, sin importar los objetivos cientficos del investigador ni las fuentes de financiamiento. Los sistemas de alojamiento para los animales de granja empleados en investigacin biomdica pueden o no ser diferentes de los usados en investigacin agrcola. Los animales utilizados tanto en investigacin biomdica como agrcola pueden alojarse en jaulas, pesebres, o pastizales. Algunos estudios agrcolas necesitan condiciones uniformes para minimizar la variabilidad medio ambiental y algunos estudios biomdicos se llevan a cabo en circunstancias de granja. Las guas para la utilizacin de los animales en estudios de campo preparadas por las sociedades profesionales son tiles siempre que se adhieran a los principios humanitarios. OBJETIVO Aprender el manejo adecuado de los animales ms comunes de laboratorio. METODOLOGA 1) Despus de observar el manejo de cada animal de laboratorio, tomars cada uno de ellos y practicars su manejo, con mucho cuidado, evitando molestar a los animales y evitar salir lesionado (Figuras 1-7). 2) Se llevar a cabo toma de muestra (venopunciones) a cada animal.


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TECNICAS DE VENOPUNCIN (SANGRADO) E INOCULACIN 1. Venopuncin o Inoculacin intravenosa en conejos. El conejo se inmoviliza como se muestra en la figura 2, se limpia la oreja en el margen exterior con una torunda y agua caliente, para favorecer la dilatacin de la arteria central; posteriormente, con una torunda se desinfecta la zona, con la ayuda de una jeringa tipo tuberculina con aguja delgada, se procede a tomar una muestra sangunea o inoculacin, segn sea el caso. Inoculacin intravenosa en ratas macho y cobayos. Anestesie al animal en cmara de ter. Despus colquelo en posicin ventral, localice la vena dorsal del pene y administre con una aguja delgada la sustancia deseada. Inoculacin intravenosa en ratn. Introduzca al ratn en un tubo de paredes lisas y con un orificio de salida en la tapa donde se extrae la cola. Limpie la cola con una torunda y agua caliente, para que la vena caudal se dilate e inocule con una jeringa de tipo tuberculina usando una aguja del 25. No debe forzarse la jeringa en ningn momento. Para la venopuncin se procede de la misma manera e incluso se puede cortar un pedazo de la cola. Inoculacin o venopuncin intraperitoneal en ratn. Sujete al animal con la mano, como se muestra en la figura 6, con la parte ventral hacia arriba, incline la cabeza hacia abajo, con la idea de que las viseras se desplacen hacia abajo, limpie la regin peritoneal con una torunda y agua caliente; posteriormente, con una torunda desinfecte la zona, con la ayuda de una jeringa tipo tuberculina con aguja delgada, se procede a tomar una muestra sangunea o inoculacin, al introducir la aguja debe percibir que perfora los dos planos (piel y pared abdominal). Inoculacin subcutnea en rata o ratn. Con la ayuda de unas pinzas, se inmoviliza al animal por atrs de las orejas, fije las pinzas del lado opuesto y jale la cola. Con los dedos pulgar e ndice forme un pliegue de la piel e introduzca la guja por este pliegue. Inoculacin con sonda gstrica. Se usa para administrar lquidos en estmago y para eso se una aguja roma, del tipo de las que se utilizan para anestesia raqudea en humanos. Sujete al animal con la parte ceflica hacia arriba con el dedo ndice y medio realice extensin del cuello e introduzca lentamente la sonda sin lastimar al animal. No es necesario anestesiar. Sangrado en aves. Se inmoviliza el animal como muestra la figura 1. Se sube una de las alas y abajo se localiza la vena alar, es la vena ms irrigada y se utiliza para realizar un sangrado exitosamente. Se limpia la zona con una rotunda y agua caliente, 19

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as se estimula la dilatacin, posteriormente se desinfecta con alcohol y se procede a tomar la muestra. Para realizar puncin cardiaca. Anestesiar al animal, limpiar la zona izquierda del trax , localizar el corazn y extraer lentamente la sangre usando una jeringa con aguja del nmero 20 x 32 Sangrado de yugular. En chivos y en carneros es relativamente fcil de realizar. Derribe al animal e inmovilcelo, crtele el pelo en un lado del cuello y localice la yugular, limpie con benzal el rea y ligue en la base del cuello lo que hace que se vea mejor la vena. Corte de vena axilar. Este sangrado se puede realizar en ratn, rata, cobayo. Se anestesia el animal, colquelo en posicin ventral y con un bistur realice una incisin en el rea axilar, corte plexo axilar y colecte la sangre con una pipeta Pasteur. Plexo venoso oftlmico. Es una tcnica para obtener pequeas cantidades de sangre en ratones y ratas. Anestesie al animal, introduzca una pipeta Pasteur en la parte interna del ojo girndola, despus se retira un poco para que la sangre suba por capilaridad.

INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. Por que es importante en Inmunologa conocer el manejo de animales de experimentacin? 2. Qu es la biotica? 3. Investiga la Ley Federal de Sanidad Animal CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) Que animales encontraste ms fcil de manejar, y porqu? 2) Que animales encontraste ms difcil de manejar, y porqu? 3) Realiza una lista de los animales manejados de acuerdo a su docilidad. 4) Cul es tu opinin acerca de la biotica y de la Ley Federal de Sanidad animal? Explica 5) Para que se realiza la inmunizacin de los animales y cuales son las prcticas de inmunizacin usando modelos en animales? 6) Cules son las especies que se usan con ms frecuencia?Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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Posicin de las intraperitoneal

inyecciones:

a)

intravenosa

b)

DIAGRAMA DE FLUJO1.- Observar la manipulacin adecuada del animal en cuestin. Metodologa

2.- Evitar molestara los animales, practicar su manejo con mucho cuidado.


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PRACTICA NO. 2 DILUCIONES En el laboratorio de Inmunologa constantemente estars realizando diluciones. Esto obedece a que, para determinar la cantidad de anticuerpos que tiene un animal, o la cantidad de antgeno que contiene una vacuna, etc., es necesario diluir stos hasta el punto donde ya no es posible detectar actividad. A este proceso se le denomina titulacin, y la ltima dilucin que todava muestra actividad se le denomina ttulo. Aunque existen muchas maneras de efectuar diluciones, dos de ellas son las ms utilizadas. Diluciones dobles Para iniciar una serie de diluciones dobles se mezcla una parte del lquido que se va a diluir en una parte del diluyente (por ejemplo, una parte de suero en una parte de solucin salina fisiolgica). A esta primera dilucin se le denomina 1:2, porque hay en este caso, una parte de suero en dos partes de lquido. Una vez mezclado esto se pasa una parte de la mezcla a una nueva parte de diluyente, la dilucin ahora es de 1:4 (Figura 1). Este tipo de diluciones son las ms utilizadas en Inmunologa, puesto que nos dan divisiones pequeas entre un tubo y el siguiente, permitiendo as determinar con bastante exactitud el ttulo de la muestra.

Diluciones Logartmicas: Estas diluciones se hacen de la misma manera que las dobles, pero en este caso, la muestra se mezcla cada vez con nueve partes (Figura 2). De esta manera se obtienen diluciones de 1:10, 1:100, 1:1000, etc. Este tipo de diluciones no se usan mucho en Inmunologa pero en ocasiones se recurre a ellas cuando se sospecha que el ttulo ser muy elevado, como por ejemplo, se titulan sueros de individuos sospechosos de Leptospirosis. El objetivo de esta prctica es aprender las tcnicas de diluciones.Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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METODOLOGA 1) En una serie de 10 tubos, pon 0.25 mide agua en cada uno. 2) Deposita 0.25 ml de colorante en el primer tubo y mezcla muy bien. 3) Con una pipeta limpia, toma 0.25 ml del primer tubo y colcalos en el segundo tubo, mezclando bien.

4) Con una pipeta limpia, pasa 0.25 ml del segundo al tercer tubo, mezclando bien. 5) Repite el proceso en todos los tubos. 6) Observa y anota tus resultados. 7) En una serie de 10 tubos, coloca 2.25 ml de agua en cada uno. 8) Mezcla 0.25 ml de colorante en el primer tubo. 9) Cambia de pipeta y transfiere 0.25 ml de la mezcla de colorante del primer tubo al segundo tubo. 10) Repite el proceso en todos los tubos. 11) Observa y anota tus resultados. Realizar una dilucin DOBLE (1:2) de cido clorhdrico (HCl) en agua, en un volumen de 25 ml


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Soluto Diluyente TOTAL

PROPORCION 1 parte de HCl 1 parte de agua 2 partes en total

VOLUMEN 12.5 ml 12.5 ml 25.0 ml

Realizar una dilucin QUINTUPLE (1:5) de cido clorhdrico (HCl) en agua, en un volumen de 25 ml PROPORCION VOLUMEN Soluto 1 parte de HCl 5 ml Diluyente 4 partes de agua 20 ml TOTAL 5 partes en total 25.0 ml Realizar una dilucin 1:250 de cido clorhdrico (HCl) en agua, en un volumen de 25 ml PROPORCION VOLUMEN Soluto 1 parte de HCl 0.1 ml Diluyente 249 partes de agua 24.9 ml TOTAL 5 partes en total 25.0 ml De lo anterior se deduce que para obtener el volumen correspondiente a una parte de la dilucin (parte correspondiente al soluto), bastar dividir el volumen deseado entre el total de partes de la dilucin: SOLUTO = VOLUMEN TOTAL / TOTAL DE Partes de la dilucin

Posteriormente se multiplicar el valor de una parte por el nmero de partes que ocupa el diluyente, para determinar el volumen del mismo: DILUYENTE = Valor de una parte No. De partes del diluyente INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1) Investigue que es dilucin. 2) Que finalidad tiene el conocer el ttulo en una aglutinacin? 3) Que diferencia habr entre una dilucin doble y una logartmica? CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE 1) Hasta que dilucin llegaste en la primera serie de tubos? 2) Hasta que dilucin llegaste en la segunda serie de tubos?Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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3) Porque cambiaste la pipeta en cada uno?

DIAGRAMA DE FLUJORealizar una dilucion DOBLE (1:2) de HCl en agua.En un volumen de 25 mL.

Realizar una dilucion QUINTUPLE (1:5) de HCl en agua, en un volumen de 25 mL.

H2O

HCl

1 H2O HCl 1

20 mL

5 mL

Realizar una dilucion (1:250) de HCl en agua, en un volumen de 25 mL.

H2O

HCl

1

24.9 mL

0.1 mL


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En una serie de 10 tubos, coloca 0.25 de agua.

En el tubo 1, deposita 0.25 mL de oolorante.

Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del primer tubo y colocalos en el segundo tubo.

Mezclar muy bien.

1 2 3 4 5 H2O 6 7 8 9 10 1 1 2 2

Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del tubo 2, pasa al tercer tubo.

Mezclar muy bien. Repite el poceso con todos los tubos. observa y anota tus resultados.

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3Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del primer tubo y colocalos en el segundo tubo.

En una serieserie de 10 tubos, En una de 10 tubos, coloca 0.25 0.25 de agua. coloca de agua.

Mezclar muy bien.

En el tubo 1, deposita 0.25 mL de oolorante.

1 2 3 4 5 H2O 2 2 1 1 6 7 8 9 10

Con una pipeta limpia, toma 0.25 mL del tubo 2, pasa al tercer tubo.

Mezclar muy bien. Repite el poceso con todos los tubos. observa y anota tus resultados.

2

3

3


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PRCTICA NO. 3 MTODO DE OUCHTERLONY REACCIONES DE INMUNODIFUSIN Cuando una solucin de antgeno soluble, es mezclado con un antisuero correspondiente, el antgeno se combina muy rpido con el anticuerpo y si las condiciones son las adecuadas los reactantes forman un precipitado. La velocidad de la reaccin de precipitacin est influenciada por factores fsicos, qumicos e inmunolgicos. Ouchterlony en 1947, introdujo el mtodo de inmunodifusin doble, es una tcnica de doble difusin en agar, se fundamenta en que cuando el antgeno y el anticuerpo, se difunden en un medio semislido (agar) forman un inmunoprecipitado, estable que se visualiza fcilmente. Antgeno y anticuerpo difunden simultneamente a partir de pozos cercanos, de modo que a su alrededor se forme un gradiente de concentraciones que, al alcanzarse y llegar al punto de equivalencia, formen bandas visibles de precipitacin. METODOLOGA 1. Se disuelve la Solucin salina amortiguada y el agar con ayuda de calor, ya disuelto totalmente, el volumen perdido se debe restituir con agua destilada. Para evitar la contaminacin microbiana se agrega 1 ml de solucin de timerosal 1:1000 en agua destilada. Se disponen de portaobjetos o capas petri. Barnice los portaobjetos con agarosa al 1% y squelos al horno. Funda agarosa al 1% y en caliente se colocan 5 ml de la agarosa al portaobjeto, sin derramar. Deje que gelifique. Si usa caja petri se llenan hasta una altura de 1 a 2 mm con la solucin de agar an caliente. Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente y si no se van a utilizar el mismo da, las cajas petri pueden guardarse en cmara hmeda a 4C. Al agar de la caja petri se le hacen varias perforaciones: una central y dos o ms alrededor de sta. En el pozo central se coloca el antgeno que se desea investigar, y en los pozos perifricos se colocan los diversos antisueros. Tanto los antgenos como los antisueros se difunden por el agar, separndose por su peso molecular, de tal manera que los que tienen menor peso se difunden ms rpidamente. Cuando el antgeno y su anticuerpo especfico se encuentran, se unen y precipitan. Este precipitado se ve como una estrecha banda blanca en el agar. Perfore los portaobjetos con un sacabocados, distribuya los agujeros alrededor de un pozo central (3 mm de dimetro aproximadamente), en 30

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4.



donde se colocar el anticuerpo, el antgeno se coloca en pequeos pozos laterales. Se debe mantener una distancia de aproximadamente 0.5 cm entre pozo y pozo. 5. Incube en una cmara hmeda, a temperatura ambiente por 24 h. Observe las bandas de precipitacin, los portaobjetos tambin se dejan reposar en una cmara hmeda y se deja proseguir la difusin a temperatura ambiente durante 24 h. INTERPRETACIN Se busca la presencia de bandas opalescentes entre ambos pozos. El nmero de bandas indica la cantidad de sistemas antgeno-anticuerpo presentes en las preparaciones. Si se trata de comparar dos antgenos, habr identidad total entre ambos si se establece la continuidad en el punto donde se alcanzan las bandas correspondientes a uno y otro; no hay identidad si ambas bandas slo se cruzan y cada una continua en lnea recta; identidad parcial si hay un fenmeno mixto. Si al cabo del perodo de incubacin no aparecen las bandas de precipitacin o stas an no son muy claras, puede proseguirse la incubacin durante el tiempo que sea necesario. Debe siempre vigilarse que el agar no se deshidrate. Las bandas pueden teirse con algn colorante de protenas (amido negro, eosina, fucsina, etc.) para ser mejor observadas. VENTAJAS DE LA PRUEBA DE OUCHTERLONY a. b. Se puede ver de cuantos antgenos est compuesto un producto (embutido, bacteria, etc.). Se pueden comparar antgenos y antisueros entre s. En efecto, cuando en dos pozos adyacentes existe un mismo anticuerpo contra el antgeno central, la lnea de precipitacin se une. A esta lnea se le denomina identidad total. Cuando los anticuerpos son diferentes y reaccionan contra antgenos del pozo central, las lneas de precipitacin se cruzan y se les denomina no identidad. Existe tambin la posibilidad de que se encuentren dos o ms antgenos diferentes que tengan el mismo peso molecular y que uno de ellos tenga anticuerpos especficos en dos pozos adyacentes y el otro solo en uno. En este caso, la lnea estar al mismo tiempo, unida y cruzada, denominndose a este fenmeno identidad parcial.


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INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO 1. A que se le llama precipitacin? 2. Investigue el sistema de difusin de Oudin (1947) 3. Investigue las aportaciones de Grabar y Williams (1953) 4. Investigue el mtodo de Manzini 5. Investigue el mtodo de Ouchterlony CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE A. B. C. D. Realiza un esquema de las perforaciones que realizaste sealando los diferentes antisueros y el antgeno que utilizaste Efecta un esquema de las lneas obtenidas en la precipitacin en gel. Enumera las fuerzas fisicoqumicas que son responsables de la unin antgeno-anticuerpo Consideras que esta prueba puede utilizarse para la identificacin de los grupos sanguneos en manchas de sangre en Medicina Legal, y porque?


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DIAGRAMA DE FLUJO

Se disulve la solucin salina amortiguadora y el agar con ayuda del calor.

Ya que este disuleto totalmente, el volimen perdido se restituye con agua destilada.

Solucin salina

H2O Destilada

Agre time ga 1 mL r des ti os al 1:1 de s oluc 0 la i c onta da, p/e 0 0 en a n v it gua mina c i n ar mic r obia na.

H2O Destilada

Fundir agarosa al 1% y en caliente se colocan de 1 a 2 mm en la caja petri con una solucin de agar caliente.

Barnizar las cajas petri con agarosa al 1% y secarlos al horno.

Se seja solidificar el agar a temperatura ambiente, al agra de la caja de petri se le hacen varias perforaciones.

En el pozo central se coloca el antigeno que se desea investigar, y en los pozos perifericos se colocan se colocan los diversos antisueros.

Incube en una camara humeda, a temperatura ambiente por 24 horas, observe las bandas de precipitacin.

Antisuero

Antigeno


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PRCTICA NO. 4 DETERMINACIN DE INMUNOGLOBULINAS SRICAS 1 PRUEBA DE PRECIPITACIN DEL SULFITO DE SODIO OBJETIVO El alumno determinar la presencia de inmunoglobulinas (Igs) sricas llevando a cabo la prueba de precipitacin de sulfito de sodio. FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la precipitacin de Igs del suero por sales de sulfito de sodio. Esta prueba es til cuando se determina la presencia de Igs en recin nacidos hasta tres semanas de edad. Su interpretacin es de tipo objetivo y tiene un porcentaje de confiabilidad de aproximadamente 93%. Es indispensable que la muestra sea de suero y no plasma, ya que este contiene protenas que se precipitaran con las Igs, dando falsos resultados. La hemlisis parcial de la muestra parece no afectar los resultados de esta prueba. Esta prueba permite diagnosticar la Falla en la Transferencia de Igs (FTI). METODOLOGA Se preparan tres soluciones de sulfito de sodio al 14, 16 y 18% en agua destilada. Se colocan 1.9 ml de cada solucin en tres tubos de ensaye (con capacidad de 3 a 5 ml) y se aade 0.1 ml de suero a cada uno de los tubos, mezclando perfectamente bien el contenido. INTERPRETACIN En caso de haber titulacin de Igs, se observar turbidez en forma inmediata y la formacin de un precipitado al cabo de 30 - 60 min. Los resultados se interpretan de la siguiente manera: Precipitacin en los tubos con 14, 16 y 18%: 15 mg Ig/ml de suero. Precipitacin en los tubos con 16 y 18%: 5 - 15 mg Ig/ml de suero. Precipitacin en los tubos con 18% o ninguna precipitacin: 5 mg Ig/ml de suero.Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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DIAGRAMA DE FLUJO1Se preparan tres disoluciones de sulfito de sodio al 14, 16 y 18 % en agua destilada.

Prueba de precipitacin del sulfito de sodio

ZnSO4 7H2O

Sulfito de sodio 14 %



2Colocar 1.9 de cada solucion y colocar 0.1 ml de suero en cada tubo.


Mexclar perfectamente el contenido.


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2 PRUEBA DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC OBJETIVO El alumno determinar la presencia de Igs sricas llevando a cabo la prueba de turbidez de sulfato de zinc. FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la precipitacin de Igs del suero al entrar en contacto sales de sulfato de zinc. Esta prueba es til cuando se determina la presencia de Igs en recin nacidos hasta tres semanas de edad. Su interpretacin es de tipo objetivo, el grado de turbidez desarrollado por la reaccin tiene una correlacin de 0.96 con el contenido de IgG o IgM del suero. Sin embargo, esta prueba puede verse afectada por la temperatura ambiental, el periodo de incubacin, la presencia de bixido de carbono en el reactivo y el grado de hemlisis de la muestra. Es indispensable que la muestra sea de suero y no plasma, ya que esta ltima causa lecturas ms altas en los resultados. Esta prueba permite diagnosticar la FTI. METODOLOGA 1. Se colocan 20.8 mg de Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4 7 H2O) dentro de un frasco color mbar de 100 ml de capacidad, se aade agua destilada a temperatura ambiente (previamente hervida) hasta llegar a la marca de 100 ml. Inmediatamente se cierra el frasco con su tapn y se agita hasta lograr una disolucin total de la sal. Se fija el tapn a la botella con cinta adhesiva para lograr un buen sellado. La solucin del reactivo debe sustituirse aproximadamente cada dos meses, ya esta absorbe gradualmente bixido de carbono, lo que altera los resultados de la prueba. Tambin la exposicin excesiva a la luz afecta la solucin, la solucin debe guardarse en refrigeracin a una temperatura de 4 a 7C 2. Se toman 0.1 ml de suero y se colocan en un tubo de ensayo al que se agregan 6 ml de la solucin de ZnSO4 7H2O. 3. Se agita suavemente la muestra y se deja incubar por una hora a 20C.Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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4. Se calibra el espectrofotmetro a 0, utilizando un tubo control con el reactivo de ZnSO4 7 H4O. A continuacin, se mezcla bien el contenido del tubo prueba y se lee en el espectrofotmetro. 5. Se lee el grado de absorbancia (turbidez) a una longitud de onda de 660 nm. 6. El resultado se multiplica por 10 y se expresa como el nmero de unidades de turbidez del ZnSO4 7 H4O. El nmero de U. TSZ corresponde a los miligramos de Igs totales por mililitro de suero. El nmero de U. TSZ se ha relacionado con las posibilidades de supervivencia del neonato. Menos de 10 U. TSZ (menos de 10 mg/ml): estos niveles son insuficientes para una proteccin adecuada (septicemia, diarrea por E. coli, etc. De 10 a 20 U. TSZ (de 10 a 20 mg/mI): accin de organismos patgenos sobre la mucosa intestinal ocasionando diarreas, principalmente. Ms de 20 U. TSZ (ms de 20 mg/ml): lactacin exitosa. A medida que aumentan los niveles de anticuerpos (Abs), la mortalidad por causas infecciosas, se reduce hasta eliminarse por completo cuando sobrepasan las 40 U. TSZ.

DIAGRAMA DE FLUJO1Colocar 20.8 mg de ( ZnSO4 7H2O), dentro de un frasco color ambar.Aadir agua destilada (previamente hervida) 100 mL. Inmediatamente se cierra el frasco con su tapon, agitacndo hasta llegar a la dilusion total.

ZnSO4 7H2O

ZnSO4 7H2O20.8


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2Una vez separado el suero, tomar 0.1 mL y colocarlo en un tubo de ensayo.

Agregar 6 ml de la solucion de (ZnSO4 7H2O), agiitar suavemente la muestra.. Incubar durante una

hora a 20 C

AGITAR SUAVEMENTE

Leer al espectofotometro a 660 nm. el resultado se multiplica por 10.

ZnSO4 7H2O

ZnSO4 7H2O


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3 PRUEBA DEL GLUTARALDEHDO Se colocan 50l de una solucin de glutaraldehdo al 10% en un tubo de ensaye, agregar 0.5 ml de suero y mezclar perfectamente. El tiempo requerido para que ocurra la coagulacin es inversamente proporcional a la concentracin de Igs en suero. Las muestras sricas con alta concentracin de Igs coagulan la muestra entre 5 y 15 min. INVESTIGACIN EXPERIMENTO PREVIA AL

1. Investigue la estructura de una Ig 2. Describa las caractersticas de cada una de las Igs 3. Porque es importante determinar la presencia de las Igs?


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PRACTICA NO. 5 BRUCELOSIS: Aspectos generales y Serodiagnstico Aspectos generales: Se entiende por Brucelosis al conjunto de enfermedades provocadas por los microorganismos del gnero Brucella tanto en el hombre como en los animales. Investigaciones en historia de la medicina consideran que la brucelosis es una enfermedad conocida desde Hipcrates (400 a. C.); sin embargo, las primeras descripciones en las que se presenta con claridad son las de Cleghorn en 1751. Marston en 1863, realiz estudios clnicos cuidadosos y autopsias de fiebres de Malta remitentes y en 1863 present una descripcin detallada de la enfermedad tal como ocurra en Malta, la que fue confirmada por otros investigadores, no solo en esas Islas sino en otras zonas, considerndose desde entonces como padecimiento endmico caracterstico de los pases del mediterrneo. Por otro lado, el agente causal de la Brucelosis fue descrito por Bruce en 1886, en el bazo de soldados muertos por esa enfermedad. El mayor impacto de esta enfermedad en el humano se debe al alto costo del tratamiento, la prdida de horas de trabajo, los costos de hospitalizacin y diagnstico. Es una enfermedad principalmente de animales y el hombre se infecta de manera accidental al estar en contacto con productos, subproductos o secreciones de animales infectados ya sea porque trabaja en ranchos ganaderos, empacadoras de carnes, queseras, rastros, frigorficos o por consumir leche o sus derivados sin pasteurizar. El gnero Brucella incluye tres especies importantes: B. melitensis, que infecta primordialmente cabras, pero puede infectar bovinos y cerdos; es el agente ms patgeno responsable de la mayora de los casos humanos; B. abortus, responsable de la brucelosis bovina y de patogenicidad moderada para el hombre; B. suis, cuyo reservorio primario son los cerdos; B. neotomae que se asla de la rata de bosque; B. canis de los perros. Actualmente, se ha aislado B. maris que se encuentra en los animales marinos. Dos nuevas especies han sido propuestas para ser adicionadas a este gnero, B. cetaceae y B. pinnipediae aisladas de mamferos marinos, cetceos y pinipedios, respectivamente. Tambin la B. cetaceae se ha aislado de focas.Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L. http://www.veterinaria.org, Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.

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1. Resistencia y sobrevivencia Comparada con otras bacterias patgenas no esporuladas, Brucella tiene la capacidad de sobrevivir y persistir en el medio ambiente bajo ciertas condiciones de humedad y temperatura (Cuadro 1). A baja temperatura, Brucella puede sobrevivir en la tierra ms de 10 semanas y en el estircol lquido ms de 2 1/2 aos. En canales congeladas puede sobrevivir por muchos aos. La Brucella es bastante sensible al calor ya que muere a temperatura de pasteurizacin o a una exposicin de 60 C por 30 min o a 70 C durante 10 min. Es bastante sensible a las radiaciones ionizantes y muere rpidamente al ser expuesta a los rayos ultravioleta o rayos Gama de tal manera que bastan 4 5 h de exposicin a la luz solar para que muera la bacteria. En leche a 15 C puede sobrevivir durante 38 das y en queso a 4.4 C hasta 180 das. En placenta y tejidos fetales expulsados por los animales durante la primavera y el invierno puede sobrevivir hasta por 135 das. 2. Desinfectantes empleados en el control de Brucelosis Las explotaciones pecuarias afectadas de brucelosis se deben desinfectar peridicamente de acuerdo a los resultados obtenidos en los muestreos serolgicos, es muy importante la desinfeccin de los materiales posteriormente a los partos as como de otras reas donde ocurren los nacimientos. Todas las especies de Brucella mueren al exponerse a los desinfectantes comunes tales como componentes fenlicos al 3%, solucin de sosa custica al 2%, creolina al 5% as como formol al 2%. El material de laboratorio empleado debe enjuagarse y desinfectarse en una solucin de fenol al 5% durante la ejecucin de pruebas (Cuadro 2). Serodiagnstico Debido a que el aislamiento de Brucella a partir de personas o animales infectados es difcil y prolongado se utilizan y se confa en las pruebas serolgicas para el diagnstico rutinario de Brucelosis. Las pruebas de aglutinacin para el diagnstico son las ms utilizadas en Mxico. Prueba rpida en placa con antgeno Rosa de Bengala Es una prueba rpida de aglutinacin en la que se emplea una suspensin de clulas de B. abortus (99S) teidas con colorante Rosa de Bengala y disueltas en cido lctico a pH 3.6. Esta prueba ha sustituido a la prueba de Huddleson, por ser ms sensible y especfica.


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Se considera como prueba positiva cuando ocurre cualquier tipo de aglutinacin y negativa cuando no hay aglutinacin al cabo de 4 min. Prueba de fijacin de complemento La finalidad de la reaccin de fijacin de complementos (FC) es descubrir si en el suero existen anticuerpos especficos contra un antgeno al comprobar que el complemento desaparece (fijacin) cuando se mezcla con el suero (anticuerpo). Al formarse un complejo antgeno anticuerpo ste fija el complemento presente en el medio, una vez fijado, este complemento est incapacitado para la lisis de glbulos rojos sensibilizados aadidos en una segunda fase. Esta prueba ha demostrado ser exacta y sensible. Es una prueba excelente, slo que para su realizacin requiere de personal capacitado, as como material y equipo adecuados. Prueba de Coombs (prueba de la antiglobulina) Es una tcnica muy

fenomeno postzona

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