Felix qui potuit rerum cognoscere causasLucrezio (De rerum natura)

Come si ottiene un aumento di flusso?

* In lievito nello switch tra fermentazione a respirazione (DeRisi, 1997)

* Nel seme durante la mobilizzazione delle riserve lipidiche (Rylott, 2001)

* Sintesi dei lipidi durante l’embriogenesi di Arabidopsis (O’Hara, 2002)

* Altri esempi (vedi Fell)

Esaminiamo alcuni esempi di aumenti di flusso in vivo

Aumentando S

Sottraendo P

Aumentando enzima

Aumentando attività

Causano aumenti locali che faticano a propagarsi lungo la via (dampening)

Diauxic shift in yeast

Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale (DeRisi

et al., 1997)

Quali sono i geni che vengono attivati e quali vengono disattivati nella transizione da fermentazione a respirazione?

Microarray con tutti i geni di lievito ibridato con mRNA a vari tempi di crescita

Rosso = Aumento

Verde = Diminuzione

Seguiamo i trascritti nel tempo

Passando da fermentazione a respirazione cosa cambia nel

metabolismo?

PYK1

4.9 Variazione

Gene interessato

Rosso = Aumento

Verde = Diminuzione

Molti geni sono regolati in modo simile

Variazione coordinata di molti geni

E’ possibile classificare i geni in base alla regolazione: 6 classi

Lipid mobilization in Arabidopsis

germinating seeds

Schematic representation of the pathways involved in storage lipid mobilization in oilseeds: 1, ACX; 2, multifuctional protein; 3, thiolase; 4, MS; 5, ICL; 6, PEPck.

Northern analysis

(A) Stages of seedling development (B) Northern blot analysis of gene expression

from 0 to 8 days after imbibition

Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. (2001) Co-ordinate regulation of genes involved in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 29:283-7.

Enzimi coinvolti

ACCMalonyl-CoA transacilasi

KAS III, II & IFAS - Acido grasso sintasi

Lipid synthesis during embryogenesis

FAS Components Exhibit Constant mRNA Ratios

3-oxoacyl-ACP reductase (KR)biotin carboxylase (BC)acyl-ACP thioesterase (TE) enoyl-ACP reductase (ENR)acyl-carrier protein (ACP)

O'Hara, P., et al. Plant Physiol. 2002;129:310-320

Abbondanza relativa dei trascritti

It was demonstrated recently that mRNAs encoding the four subunits of heteromeric (ACCase) acetyl-CoA carboxylase accumulate at a constant molar ratio throughout silique development in Arabidopsis. The ratios were found to be CAC1:CAC2:CAC3:(accD-A & accD-B) = 0.14:1.0:0.17:0.06 (Ke et al., 2000)

Via del triptofano in lievito

Solo la simultanea espressione di molti (tutti) i geni causa un ΔJ paragonabile al ΔEi (ΔJ ≃ CJ x ΔEi )

• Lütke-Eversloh T, Stephanopoulos G. (2008) Combinatorial pathway analysis for improved L-tyrosine production in Escherichia coli: identification of enzymatic bottlenecks by systematic gene overexpression. Metab Eng. 10:69-77.

Come fa la natura?Strategia multisito!

Molti altri esempi: Lipogenesi nei tessuti animali

Fotosintesi

Ciclo dell’urea

Gluconeogenesi

Sintesi degli steroidi

Operoni batterici, enzimi di fusione…

……u.s.w.

Il “metodo universale”N

S

P

B

J1 = J2 + J3

J1

J2

J3

Per aumentare J3 di 5 volte, dovremo amplificare tutti gli enzimi che da S portano a P di 5 volte.

Questo comporta un consumo di addizionale di S. Se vogliamo mantenere intatta [S], occorre aumentare J1 fino al valore di (J2 +5J3)

J1'= (J2 + J3') = (J2 + 5J3)

Se J2 >> J3 allora si può trascurare di aumentare J1. In caso contrario si rischia di danneggiare J2

J1 = J2 + J3 + J4 + J5

J’1 = (J2 + J3 + J4 + 5J5)

Il metabolismo è chiaramente più complesso, con tanti flussi diversi, presenza di cicli con cofattori (major obstacle)

Si può risalire da P verso N lungo le vie metaboliche fino a dove l’aumento di flusso può essere trascurato.

N

P

S1 B1

S3

S2 B2

B3

J1

J2

J5

J3

J4

Se il metodo universale viene implementato in vivo, ci aspettiamo che:

Quando la quantità degli enzimi cambia in risposta a stimoli fisiologici o ambientali, la proporzione relativa rimane costante.

Il fattore di aumento dell’attività enzimatica corrisponda al fattore di aumento del flusso.

Il livello di cambiamento sia maggiore nel ramo metabolico interessato mentre i tratti a monte della ramificazione vadano incontro a cambiamenti di entità minore.

Oltre all’induzione degli enzimi interessati (maggior quantità) altri meccanismi di controllo possono essere adoperati in diversi siti.

Phenotype is flux!

Ma qualche volta phenotype is concentration

Evidenze sperimentaliReguloni!

La concentrazione dei metaboliti varia molto meno del flusso

* Rate limiting step concept: more misguided than even MCA initially suggested

* Agire su un solo punto è poco efficace e potrebbe essere deleterio

Il metodo universale mantiene costanti le concentrazioni dei metaboliti [Si]

evita effetti negativi dovuti all’aumento o alla riduzione di [Si]

ReferenzeReferenze ai lavori sugli aumenti naturali in vivo Vedi anche Fell ultimo cap

* DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. (1997) Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 278:680-6.

* O'Hara P, Slabas AR, Fawcett T. (2002) Fatty acid and lipid biosynthetic genes are expressed at constant molar ratios but different absolute levels during embryogenesis. Plant Physiol. 129:310-20

* Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. (2001) Co-ordinate regulation of genes involved in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 29:283-7.

* Niederberger P, Prasad R, Miozzari G, Kacser H. (1992) A strategy for increasing an in vivo flux by genetic manipulations. The tryptophan system of yeast. Biochem J. 287:473-9.

* Zhao J, Last RL.(1996) Coordinate regulation of the tryptophan biosynthetic pathway and indolic phytoalexin accumulation in Arabidopsis. Plant Cell. 8:2235-44.

* Eastmond PJ, Rawsthorne S. (2000) Ccoordinate changes in carbon partitioning and plastidial metabolism during the development of oilseed rape embryos. Plant Physiol. 122:767-74

* Universal method: Kacser and Acerenza (1993) A universal method for achieving increases in metabolite production Eur J. of Biochemistry 216:361-367