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Fase analitica:
Terreni di coltura
ed identificazione
Dott.ssa Saveria Dodaro
Cosenza 06.05.2013
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Diagnosi eziologica 1. identificare l’agente patogeno
2. appropriato trattamento terapeutico
Laboratorio di microbiologia clinica
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Altri obiettivi : Valutare l’efficacia della terapia Valutare la presenza di portatori sani (potenziale fonte di contagio in comunità)
Laboratorio di MICROBIOLOGIA clinica
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Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive
Utilizzo di metodologie scientificamente
valide ed eseguibili in tempi accettabili
Necessità di acquisire in tempi rapidi
informazioni utili alla diagnosi ed alla terapia
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Diagnosi batteriologica
Sospetta infezione
batterica
Diagnosi diretta Diagnosi indiretta
sangue
feci
urine
biopsie
tamponi
Ecc.
Siero del paziente
Metodo immunologico
ricerca di anticorpi verso
l‘agente batterico
immunoenzimatico (EIA)
immunofluorescenza (IFA)
Diagnosi rapida
Esame colturale Semina su brodo di
arricchimento,terreno solido
non selettivo e/o selettivo
Metodo immunologico
(ricerca di antigeni dell’agente batterico)
Test di agglutinazione
ELISA
Immunocromatografia su membrana
Metodo molecolare
(ricerca di sequenze genomiche dell’agente
batterico)
PCR
Multiplex PCR
Nested PCR
NASBA
Ibridazione su una sonda verso l’agente
batterico Isolamento del microrganismo in coltura pura
Identificazione Biochimica,immunologica,molecolare
antibiogramma
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Diagnosi batteriologica
Diagnosi diretta: presenza dell’agente patogeno
Esame microscopico (batterioscopico) Esame colturale (isolamento)
Ricerca di antigeni
Ricerca di sequenze geniche
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Diagnosi diretta: esame microscopico
Campioni “a fresco”oppure fissati ( al calore o chimicamente)
La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente : Microscopia in campo oscuro Microscopia in contrasto di fase Microscopia in fluorescenza Spesso si utilizzano colorazioni “dedicate” Gram Ziehl Neelsen (alcool-acido resistenza)
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borrelia burgdorferi
Microscopia in campo oscuro
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Lieviti
Microscopia contrasto di fase
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Microscopia in fluorescenza
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Diagnosi diretta : esame microscopico (previa colorazione)
Colorazioni SEMPLICI prevedono l’impiego di un solo
colorante :
cristalvioletto
fucsina basica
blu di metilene
Colorazioni DIFFERENZIALI prevedono l’impiego di più di un
colorante :
colorazione di Gram
colorazione di Ziehl -Neelsen
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Diagnosi diretta: esame microscopico (previa colorazione)
UTILITÀ CLINICA
Campioni fissati ( a calore o chimicamente)
• Idoneità del campione (espettorato-neutrofili/ cell.squamose)
Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili
Presenza o assenza di microrganismi(batteri-funghi-parassiti)
Colorazione del campione con tecnica di Gram:
Morfologia (cocchi-bastoncelli-coccobacilli)
Disposizione ( catenelle-clusters-diplococchi)
Quantità assoluta di batteri presenti
Percentuale relativa di Gram pos/neg
Localizzazione in sede intra o extra cellulare
Altre specifiche colorazioni
bacilli alcool-acido resistenti (Ziehl Neelsen)
endospore batteriche (Verde malachite)
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Streptococcus pyogenes
Neisseria meningitidis
COLORAZIONE DI GRAM
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COLORAZIONE DI GRAM
osservazione microscopica
I batteri Gram+ (Staphylococcus, Streptococcuss, etc)
Staphylococcus epidermidis
I batteri Gram – (E. coli, P. aeruginosa, Neisseriaceae, etc.)
Escherichia coi
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COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN
Mycobacterium tuberculosis
Gli organismi acido-resistenti appaiono colorati in rosso
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ESAME COLTURALE
TERRENI
DI COLTURA
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Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare nelle
condizioni di laboratorio
A tale scopo si devono conoscere le sostanze nutritizie e le condizioni fisiche richieste
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COLTIVAZIONE DEI BATTERI
In laboratorio l’impiego di “terreni di coltura” riproduce artificialmente un ambiente in grado
di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare
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I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo La composizione chimica dei diversi terreni
di coltura è in parte differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che si desidera coltivare
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Alcune sostanze sono necessarie a tutti i microrganismi in quantità notevoli
“Macronutrienti”
CARBONIO
AZOTO
OSSIGENO
IDROGENO
ZOLFO
FOSFORO
servono per la sintesi dei componenti strutturali
della cellula
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“Altri Macronutrienti”
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Alcuni elementi sono necessari alla cellula, ma in quantità molto esigue
“Micronutrienti”
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Per poter utilizzare i nutrienti è necessario portarli all’interno della cellula: l’unico composto chimico che entra o esce senza difficoltà alcuna dalla cellula
batterica, è l’acqua
TRASPORTO DEI NUTRIENTI ALL’INTERNO DELLA CELLULA
la concentrazione interna si mantiene superiore a quella esterna, spendendo energia
L’energia spesa per il trasporto dei nutrienti può provenire dall’ idrolisi di ATP
TRASPORTO ATTIVO
Alcuni soluti possono passare il filtro della membrana per diffusione passiva (senza spesa di energia da parte del
microrganismo) questo processo è tuttavia poco efficiente e troppo lento e i procarioti fanno ricorso a enzimi di membrana
(le permeasi)
TRASPORTO FACILITATO
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Possono essere liquidi (per ottenere biomassa senza limiti spaziali), o solidi
TERRENI DI COLTURA
Stato fisico
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Per solidificare i terreni si impiega L’AGAR
Un polisaccaride, estratto da alghe, che presenta il fenomeno della sovrafusione (liquefa a 100 C ma resta liquefatto fino a 45 C). L’uso dell’agar permette di dare al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare
Inoltre:
non è metabolizzato dalla gran parte dei batteri; non manifesta alcuna tossicità;
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i microrganismi
invisibili ad occhio nudo
(<0,2 mm) si rendono visibili, dopo replicazione su substrato solido o liquido
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Preparazione dei terreni
1. Dissoluzione degli ingredienti in volume di H2O.
2. Determinazione del pH ed eventuale correzione.
3. Distribuzione in contenitori idonei. 4. Sterilizzazione
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In base alle sostanze che contengono e alle loro concentrazioni relative, i terreni di coltura sono classificati come:
Sintetici (o definiti)
Complessi
Terreni sintetici o definiti
I terreni sintetici o definiti sono quelli di cui si conosce l’esatta composizione. Vengono quasi sempre preparati ad hoc a seconda delle esigenze nutrizionali del microrganismo che si desidera far crescere.
Contengono un numero definito di sostanze a concentrazione nota.
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sono quei terreni di cui non si conosce in maniera dettagliata la
composizione chimica Questi mezzi di coltura risultano di estrema utilità in quanto
permettono di far crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro
Inoltre è possibile far crescere specie le cui esigenze nutrizionali non sono ancora ben conosciute
Terreni complessi
Oltre alle sostanze “standard” i terreni complessi contengono: Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica; Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi peptidi, acidi organici, vitamine e sali minerali; Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell’azoto.
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I caratteri colturali forniscono indizi utili per l’identificazione
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POPOLAZIONI MICROBICHE NATURALI
La popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti specie microbiche popolano
contemporaneamente vari distretti del nostro corpo (mucose: orale, intestinale, cutanea) ed in modo analogo il nostro
ambiente (aria, suolo, acqua).
COLTURE MISTE
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Una coltura pura è costituita da una popolazione di cellule derivate tutte da
un’unica cellula madre
Essa rappresenta una condizione artificiale per l’accrescimento dei batteri ed è una condizione ottenuta da manipolazioni di
laboratorio
COLTURA PURA
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Terreni elettivi Sono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o cavallo, che consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche di interesse medico.
Terreni selettivi Sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie.
Terreni differenziali Sono terreni che, grazie alla presenza di particolari componenti, permettono di distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione presuntiva della specie isolata.
Terreni di arricchimento Sono terreni che consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che inibiscono la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame.
Classificazione qualitativa dei terreni
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a - b - g - emolisi su piastra di agar sangue
ESEMPIO DI TERRENO ELETTIVO E DIFFERENZIALE
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ESEMPIO DI TERRENO SELETTIVO E DIFFERENZIALE
Fermentazione del Lattosio su agar
Mac Conkey
Lattosio fermentante
Lattosio non fermentante
Agar Mac Conkey
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Agar CLED (Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient)
Contiene: Lattosio Blu bromotimolo come indicatore del pH Cistina amminoacido nutriente
ESEMPIO DI TERRENO ELETTIVO E DIFFERENZIALE
Lattosio fermentante
Lattosio non fermentante
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• fluidificazione • concentrazione • sonicazione • diluizione
Esame colturale
Pretrattamento del campione
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quantitativa
Esame colturale
Semina del campione
per isolamento
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Esame colturale
Incubazione dei terreni di coltura
• temperatura • ossigeno
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TEMPERATURA
• Psicrofili -10 C a +20 C (L.monocytogenes 5-8 C)
• Mesofili +10 a +50 C
• Termofili +40 a +70 C
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OSSIGENO
Aerobi obbligati: Crescono solo in presenza di O2 atmosferico
Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico
Anaerobi facoltativi: crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie
Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di ossigeno;
crescono bene in atmosfera addizionata di CO2
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OSSIGENO
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CRESCITA IN
ANAEROBIOSI
• Per la coltura dei batteri anaerobi bisogna utilizzare terreni riducenti
ed in incubatori speciali.
• I terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici
(tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l’ossigeno
atmosferico fino ad esaurirlo.
• Gli incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche
(bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono
umidificate, producono CO2 e H2 e successivamente H2O con scomparsa
dell’ossigeno
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INCUBATORI SPECIALI
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INCUBATORI SPECIALI
CO2
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Diagnosi diretta : identificazione
CRESCITA DI COLONIE BATTERICHE SU
TERRENI DI COLTURA
IDENTIFICAZIONE
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Caratteri macroscopici delle colonie
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stafilococchi
streptococchi
Gram negativi Enterobatteri Non fermentanti
miceti
Agar sangue
Agar sangue
Agar
Mac Conkey
Agar
Sabouraud e
Terreni cromogenici
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PANORAMA SULLA DIVERSITA’ MORFOLOGICA: LE COLONIE
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Caratteri macroscopici
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Diagnosi diretta : identificazione
ID PRESUNTIVA - Caratteri microscopici (colorazione, forma, organizzazione) - Caratteri macroscopici (aspetto colonia) ID FINALE (DEFINITIVA) -biochimica -immunologica -molecolare
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Diagnosi diretta : identificazione biochimica
metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica)
o per via fermentativa (via aerobica)
produzione di specifici enzimi e/o di prodotti metabolici
VALUTAZIONE DELLE CAPACITÀ METABOLICHE DEI MICRORGANISMI
metodi “manuali”o “automatizzati” identificazioni in tempi rapidi (4-6 h)
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identificazione manuale
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Gram positivi
Stafilococco e streptococco
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di forma sferica
riuniti in ammassi irregolari, dall’aspetto di
grappoli, del diametro di 0.8-1 μm
immobili
privi di capsula evidente
asporigeni
Cocchi Gram positivi catalasi-positivi
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Gram positivi
Test CATALASI
2 H2O2 2 H2O + O2
Test: alcune goccie di H2O2 3% direttamente su colonie su
terreno solido (non AS); oppure mischiare una aliquota di
coltura (colonia o coltura liquida) con alcune goccie di H2O2
3% su vetrino portaoggetti e quindi coprire con vetrino
coprioggetti.
Test positivo: sviluppo rapido di effervescenza (O2)
positivo: Staphylococcus
negativo: Streptococcus
Stafilo e strepto
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la coagulasi è un enzima liberato da alcuni batteri in grado di
coagulare il plasma citrato di coniglio.
E' possibile produrre due forme differenti di coagulasi, libera o
legata. Il test in provetta è in grado di rilevare la presenza di
coagulasi libera e legata.
test coagulasi
positivo: Staphylococcus aureus
negativo: Staphylococcus epidermidis
Gram positivi
Esame microscopico cocchi gram positivi Aspetto delle colonie su agar sangue di S.aureus
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Classificazione degli streptococchi clinicamente significativi
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sferici, con diametro di 1-1.5 μm, disposti in
coppie o catenelle
capsulati
immobili
asporigeni
ossidasi-negativi
catalasi-negativi
aerobi-anaerobi facoltativi
Cocchi Gram positivi: Streptococchi
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Cocchi Gram positivi: Streptococcus pyogenes
Agar Sangue (5% sangue di montone)
Incubazione a 37 C in presenza di 5% CO2
cresce anche in atmosfera aerobia
emolisi totale (di tipoβ)
Test della identificazione dell’antigene
polisaccaridico C metodica di Lancefield
(agglutinazione)
Test della sensibilità alla bacitracina
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Cocchi Gram positivi: Streptococchi e enterococchi
Streptococcus agalactiae
Non presentano emolisi, solo raramente
presentano emolisi β.
Sono caratterizzati dal possesso
dell’antigene polisaccaridico di gruppo B
Enterococchi
Appartengono al genere Streptococcus.
Non presentano emolisi, solo raramente
presentano emolisi β. Sono caratterizzati
dal possesso dell’antigene polisaccaridico
di gruppo D
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Cocchi Gram positivi: Streptococcus pneumoniae
AgarSangue (5% sangue di montone)
Incubazione a 37 C in presenza di 5% CO2
cresce anche in atmosfera aerobia.
emolisi parziale del sangue (di tipo α)
Test della sensibilità all’optochina
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Gram negativi
Proteus su Agar sangue e mac conkey
Escherichia coli
su Agar mac conkey
pseudomonas su Agar mac conkey
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Gram negativi
Non fermentanti fermentanti
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Bacilli Gram negativi: Enterobacteriaceae
terreno indicatore McConkey Agar
Vengono incubate a 37 C in atmosfera aerobia
Bacilli Gram-negativi
asporigeni
mobili per ciglia peritriche o immobili
provvisti di pili
aerobi o anaerobi facoltativi
ossidasi-negativi
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bastoncelli diritti o incurvati
mobili (uno o più flagelli polari)
isolati o a coppie o in brevi catene
asporigeni
catalasi-positivi
ossidasi-positivi
aerobi
Bacilli Gram negativi: non Enterobacteriaceae o batteri
non fermentanti
non fermentano gli zuccheri
Esame microscopico col.Gram P.aeruginosa
Il test dell’ossidasi differenzia gli enterobatteri dai batteri gram negativi non
fermententi.I batteri lattosio non fermentanti ( pseudomoniaceae ) posseggono
l'enzima citocromo ossidasi, la cui presenza può essere messa in evidenza dalla
ossidazione di un accettore artificiale di elettroni la tetra-metil-para-fenilendiammina
Crescono su qualsiasi terreno
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Gram negativi : salmonella
bacilli Gram-negativi asporigeni,
aerobi facoltativi. Fermentano il
glucosio, producendo gas (acido
solfidrico), riducono i nitrati e non
producono citocromo-ossidasi. La
maggior parte non fermenta il lattosio
Salmonella Colorazione rosa su terreno cromogeno
Salmonella colonie nere produttrici (acido solfridico)
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Bacilli Gram negativi: Haemophilus
Cresce su Agar Cioccolato (10% sangue di montone emolizzato
incubazione a 37 C in presenza di 5%CO2
Fattore X, termostabile
Fattore V, termolabile (NAD)
Alternativamente può essere seminato su terreno
TSA (Tryptic Soy Agar) addizionato dei fattori X +V
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ID BIOCHIMICA : metodo manuale (BioMèrieux) identification System
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ID BIOCHIMICA : metodo automatizzato SIEMENS
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Grazie