Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali

Laurea in Biologia e Tecnologie Cellulari

IL RUOLO DI UNA FAMIGLIA DI MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS THALIANA NELLO SVILUPPO

Mario Larosaa.a. 2013/2014

LA TRASDUZIONE DEL SEGNALE MEDIATA DALLA CASCATA DELLE CHINASI ATTIVATE DA MITOGENO (MAPK) È UN MECCANISMO ALTAMENTE CONSERVATO NEGLI EUCARIOTI

Stimolo

MAPKKK

MAPKK

MAPK

Crescita e Sviluppo

Immunità

20 MAPK

Nel genoma di Arabidopsis 80 MAPKKK

10 MAPKK

LE MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS

(Adattata da Champion et al., 2004)

La famiglia genica ANP è costituita da tre membri: ANP1, ANP2 ed ANP3

• Sono ridondanti funzionalmente: singoli mutanti knockout (KO) non differiscono dal WT, mentre solo il doppio KO anp2 anp3 mostra evidenti difetti nello sviluppo e nella citochinesi

Il triplo mutante KO è letale:

le ANP sono COLLETTIVAMENTE ESSENZIALI nello sviluppo

della pianta

• Sono stati identificati per la loro omologia con NUCLEUS– AND PHRAGMOPLAST-ASSOCIATED PROTEIN KINASE1 (NPK1) di tabacco

LA FAMIGLIA DELLE “ARABIDOPSIS NPK1-RELATED PROTEIN KINASE” (ANP)

(Adattata da Krysan et al., 2002)

amiR1

0.05 1 5 10

Wt

DMSO

2.5 5 10 20

β-estradiolo (nM)

amiR3

DMSO β-estradiolo (µM)

TRIPLI MUTANTI CONDIZIONALI anp

pri-amiRANP1 espresso nel doppio KO anp2 anp3

(fenotipo alterato nello sviluppo)

(fenotipo normale)

Silenziamento genico mediato da microRNA artificiali (amiR) inducibili da β-estradiolo

pri-amiRANP3 espresso nel doppio KO anp1 anp2

LA PARETE CELLULARE VEGETALE

(Adattata da Malinovsky et al., 2014b)

La parete primaria è costituita da:

Componenti microfibrillari

Componenti matriciali

Cellulosa

Emicellulose

Pectine

(Adattata da Bellincampi et al., 2014)

(Adattata da Szymanski e Cosgrove, 2014)

Un danno alla parete cellulare (Cell Wall Damage, CWD) può essere causato da:

Enzimi litici rilasciati da un patogeno durante l’infezione

Stress fisici

Agenti chimici

STRESS BIOTICI E ABIOTICI POSSONO ALTERARE L’INTEGRITÀ DELLA PARETE CELLULARE IN ARABIDOPSIS THALIANA

(Adattata da Levin, 2011)

La cascata delle MAPK media la segnalazione attivata dalla percezione del danno alla parete

nel lievito

IL MECCANISMO DI MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ DELLA PARETE CELLULARE IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE

OBIETTIVO DELLA TESI

Caratterizzazione del ruolo delle ANP nello sviluppo della radice

e nel mantenimento dell’integrità della parete cellulare di Arabidopsis thaliana

Plantule di sette giorni

LA MANCANZA DELLE ANP PROVOCA L’ESPANSIONE CELLULARE RADIALE NELLA RADICE

Wt 1 μM β

amiR320 nM β

amiR11 µM β

amiR3DMSO

LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI RISULTANO SIMILI A QUELLE DI PLANTULE WT TRATTATE CON L’ERBICIDA ISOXABEN (IXB)

Wt 20 nM IXB amiR3 1 μM β

Plantule di sette giorni

(N-[3-(1-Etil-1-metilpropil)-5-isoxazolil]-2,6-dimetossibenzamide)

L’ISOXABEN È UN AGENTE MODELLO PER LO STUDIO DEL DANNO ALLA PARETE CELLULARE VEGETALE

(Adattata da De Bolt, 2007)

Piante trattate con IXB presentano un minore contenuto di cellulosa

L’IXB induce il danno alla parete cellulare vegetale

Differenti Cellulosa Sintasi A (CESA) sono bersagli dell’azione dell’IXB

E’ un potente inibitore della biosintesi di cellulosa

(Paredez et al., 2006)

(Bischoff et al., 2009)

Alcohol-Insoluble Solid (AIS)

AIS de-amilato

Radici di plantule di dodici giorni

Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid

(ChASS)

Analisi emicellulose

Residuo

Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH

Analisi degli zuccheri totali

Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione

di Updegraff

Analisi Cellulosa cristallina

ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN

WtWt β-estradiolo (1 μM)

Wt IXB (20 nM)amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM)

Analisi Pectine

LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO ZUCCHERI TOTALI

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

WtIXB - + - - - -

--+ + - +β

amiR1 amiR3

g Z

ucch

eri t

otal

i/m

g AI

S de

-am

ilato

* * *

Alcohol-Insoluble Solid (AIS)

AIS de-amilato

Radici di plantule di dodici giorni

Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid

(ChASS)

Analisi emicellulose

Residuo

Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH

Analisi degli zuccheri totali

Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione

di Updegraff

Analisi Cellulosa cristallina

ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN

WtWt β-estradiolo (1 μM)

Wt IXB (20 nM)amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM)

Analisi Pectine

LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO CELLULOSA CRISTALLINA RISPETTO AL WT

0

2

4

6

8

10

12

14

Wt amiR1 amiR3

Ce

llulo

sa c

rista

llin

a

(g

g

luco

sio

m

g-1 A

IS d

e-a

mila

to)

β - -- -+ + +

IXB - - + - - - -

**

**

Alcohol-Insoluble Solid (AIS)

AIS de-amilato

Radici di plantule di dodici giorni

Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid

(ChASS)

Analisi emicellulose

Residuo

Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH

Analisi degli zuccheri totali

Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione

di Updegraff

Analisi Cellulosa cristallina

ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN

WtWt β-estradiolo (1 μM)

Wt IXB (20 nM)amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM)

Analisi Pectine

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

*

* *

g Z

ucch

eri 0

.1M

KO

H/z

ucch

eri t

otal

i

Wt- + - - - -

--+ + - +

amiR1 amiR3

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

g Z

ucch

eri 4

M K

OH

/ zuc

cher

i tot

ali

Wt- + - - - -

--+ + +

amiR1 amiR3

Frazione pectica Frazione emicellulosica

-

Nella frazione emicellulosica estratta con KOH 4 M non ci sono differenze significative

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

* * *

g Z

ucch

eri C

hASS

/zuc

cher

i tot

ali

WtIXB - + - - - -

--+ + - +β

amiR1 amiR3

-

LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO PECTINE MA POSSIEDONO PIÙ EMICELLULOSE ESTRAIBILI CON KOH 0.1 M RISPETTO AL WT

LA SINDROME DA DANNO ALLA PARETE CELLULARE (CELL WALL DAMAGE SYNDROME - CWDS) IN ARABIDOPSIS

(Adattate da Denness et al., 2011)

La percezione del danno alla parete porta ad una serie di risposte come l’aumento di specie reattive dell’ossigeno (ROS), la deposizione ectopica di lignina e l’accumulo del fitormone acido jasmonico.

Lignina

IXB

Cell Wall Damage

ROS Acido jasmonico

00.010.020.030.040.050.060.07

Wt amiR3amiR11 µM β - - -+ + +

0.080.09

nmol

H20

2/m

g p

eso

fres

co /m

l

I TRIPLI MUTANTI MOSTRANO UN MAGGIORE ACCUMULO DI ROS EXTRACELLULARE ED UNA DEPOSIZIONE ECTOPICA DI LIGNINA

10 nM

βDMSO

Wt amiR3

20 nM

IXB

10 nM

β

Uni

tà A

rbitr

arie

(x1

0-3)

0.5

1.5

0

1

2

0

0.20.4

0.60.8

1

1.21.41.6

02468

1012141618PDF1.2 ERF1 THI2.1

10 nM β - -+ + - -+ + - -+ +

amiR3Wt amiR3Wt amiR3Wt

I TRIPLI MUTANTI MOSTRANO UNA MAGGIOR ESPRESSIONE BASALE DEI GENI REGOLATI POSITIVAMENTE DALL’ACIDO JASMONICO

LA FAMIGLIA GENICA ANP È RICHIESTA PER IL MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ STRUTTURALE DELLA PARETE IN ARABIDOPSIS

ANP

Cellulosa cristallina

Pectine

Emicellulose

Alterazione nella composizione della parete cellulare

ROS JA

Lignina nella radice

CWDS

Cellulosa cristallina

Pectine

Emicellulose

Alterazione nella composizione della parete cellulare

ROS JA

Lignina nella radice

CWDS

IXB

TALI ALTERAZIONI SONO MOLTO SIMILI AL TRATTAMENTO DEL WT CON L’ERBICIDA ISOXABEN

LE ANP SONO IMPLICATE NELLA RISPOSTA ALL’ISOXABEN

0

10

20

30

40

50

60

70

Wt anp1anp2

anp1anp3

anp2anp3

% in

ibiz

ione

del

l’allu

ngam

ento

del

la ra

dice

*

* *

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Wt

ANP1

SE

ANP3

SE

% in

ibiz

ione

del

l’allu

ngam

ento

del

la ra

dice

*

*

I doppi mutanti mostrano una minore sensibilità all’IXB al contrario dei mutanti sovraesprimenti le ANP, che risultano maggiormente sensibili all’erbicida

CONCLUSIONI

• La famiglia genica ANP è richiesta per il mantenimento dell’integrità strutturale della parete in Arabidopsis

• I tripli mutanti anp, al pari delle piante WT trattate con IXB, mostrano la sindrome da danno alla parete

• Le ANP sono richieste per la risposta al trattamento con l’IXB

Le ANP sono le prime MAPKKK note per esser coinvolte nel mantenimento dell’integrità della parete cellulare vegetale

Tra i futuri obiettivi dello studio di questa famiglia genica figurano:

Caratterizzazione della localizzazione subcellulare

Identificazione dei loro diretti interattori

PROSPETTIVE