Facoltà di FarmaciaFacoltà di Farmacia

Fattori ambientali e crescita dei batteri Fattori ambientali e crescita dei batteri

FATTORI AMBIENTALIFATTORI AMBIENTALI FATTORI AMBIENTALIFATTORI AMBIENTALI

Temperatura

Ossigeno

pH

Psicrofili

Termofili

Mesofili

Aerobi strettiAnaerobi stretti

Anaerobi facoltativi

Microaerofili

Optimum per i batteri tra 6,5 e7,5

Un aumento di pressione osmotica dovuto alla concentrazione salina o degli zuccheri determina una stasi della crescita microbica.

I batteri hanno meccanismi di protezione contro gli choc osmotici.

Microrganismi osmofili in grado di sopravvivere in particolari condizioni di pressione osmotica (lieviti in presenza di elevate concentrazioni di zucchero)

Microrganismi alofili in grado di vivere in presenza di elevate concentrazioni saline (stafilococchi)

Fattori ambientaliFattori ambientaliTerreni liquidi per la crescita in coltura.

Terreni solidi con agar al 1,5-2%, con quantità di acqua lasciata libera.

Grado di umidità (presenza di acqua libera)

Le sostanze disciolte in acqua determinano la pressione osmotica

Temperatura

Ossigeno

Aerobi

Anaerobi

Anaerobi facoltativi

Microaerofili

Aerobi

Anaerobi

Anaerobi facoltativi

Microaerofili

Psicrofili –7° 20° C optimum 18° C

Mesofili 20° 40° C optimum 37°C

Termofili > 40° C 90° C optimum diversificato

Psicrofili –7° 20° C optimum 18° C

Mesofili 20° 40° C optimum 37°C

Termofili > 40° C 90° C optimum diversificato

pH

Terreno colturale per batteri a concentrazione idrogenionica 7

Batteri optimum di sviluppo 6,5 7,5

Lieviti e muffe optimum di sviluppo 4,5 6,5

Terreno colturale per batteri a concentrazione idrogenionica 7

Batteri optimum di sviluppo 6,5 7,5

Lieviti e muffe optimum di sviluppo 4,5 6,5

FATTORI AMBIENTALI FATTORI AMBIENTALI classificazione e range di tolleranzaclassificazione e range di tolleranza

Aerobi obbligati strettiNecessitano ossigeno (colture con agitazione e aria, es. M. tubercolosis)

Anaerobi obbligati strettiL’ossigeno è tossico ( bacteroides intestinali,clostridium ed altri,)

Anaerobi facoltativi (germi di interesse medico in flora intestinale, metabolismo sia ossidativo che fermentativo: Vibrio, Escherichia, Klebsiella, Salmonella)

Microaerofili (Bassa tensione di ossigeno: <

20%, per sviluppo ottimale – streptococchi e lactobacilli)

Aerobi obbligati strettiNecessitano ossigeno (colture con agitazione e aria, es. M. tubercolosis)

Anaerobi obbligati strettiL’ossigeno è tossico ( bacteroides intestinali,clostridium ed altri,)

Anaerobi facoltativi (germi di interesse medico in flora intestinale, metabolismo sia ossidativo che fermentativo: Vibrio, Escherichia, Klebsiella, Salmonella)

Microaerofili (Bassa tensione di ossigeno: <

20%, per sviluppo ottimale – streptococchi e lactobacilli)

Ossigeno

Macroelementi e micronutrientiMacroelementi e micronutrienti

MacroelementiMacroelementi : sono elementi chimici di cui i batteri hanno bisogno in : sono elementi chimici di cui i batteri hanno bisogno in grandi quantità.grandi quantità.

Carbonio, Ossigeno, Idrogeno, Azoto, Zolfo, Fosforo, entrano nella sintesi di Carbonio, Ossigeno, Idrogeno, Azoto, Zolfo, Fosforo, entrano nella sintesi di carboidrati e lipidi proteine e acidi nucleici.carboidrati e lipidi proteine e acidi nucleici.

Inoltre esistono altri quattro elementi essenziali come Calcio (spora), Inoltre esistono altri quattro elementi essenziali come Calcio (spora), Potassio (enzimi), Magnesio (stabilizza ribosomi e m. cellulari) , Ferro Potassio (enzimi), Magnesio (stabilizza ribosomi e m. cellulari) , Ferro (enzimi).(enzimi).

Ognuno di questi elementi ha un ruolo determinante quindi nella vita del Ognuno di questi elementi ha un ruolo determinante quindi nella vita del cellula batterica.cellula batterica.

MicronutrientMicronutrientii:: elementi la cui presenza è necessaria solo in tracce : elementi la cui presenza è necessaria solo in tracce : manganese, zinco, cobalto, molibdeno, nickel, rame. Le tracce presenti in manganese, zinco, cobalto, molibdeno, nickel, rame. Le tracce presenti in quantità infinitesimali sulla vetreria, o nei normali terreni di coltura sono quantità infinitesimali sulla vetreria, o nei normali terreni di coltura sono sufficienti a garantire la crescita microbica.sufficienti a garantire la crescita microbica.

Elementi di crescita microbicaElementi di crescita microbica Il Il carboniocarbonio viene impiegato per la costruzione dello scheletro della cellula, in viene impiegato per la costruzione dello scheletro della cellula, in

genere i composti che forniscono carbonio, forniscono anche idrogeno e genere i composti che forniscono carbonio, forniscono anche idrogeno e ossigeno.ossigeno.

Le molecole organiche sono una fonte di elettroni, il loro trasferimento lungo Le molecole organiche sono una fonte di elettroni, il loro trasferimento lungo specifiche catene di trasporto produce energia, che viene utilizzata per specifiche catene di trasporto produce energia, che viene utilizzata per

produrre lavoro.produrre lavoro.

Gli elettroni sono necessari anche alla biosintesi, in quanto danno origine Gli elettroni sono necessari anche alla biosintesi, in quanto danno origine alla riduzione delle sostanze per costruire molecole organiche.alla riduzione delle sostanze per costruire molecole organiche.

L’ anidride carbonica è una fonte di carbonio ma non di idrogeno o energia, L’ anidride carbonica è una fonte di carbonio ma non di idrogeno o energia, solo gli autotrofi (per definizione) sono in grado di ridurre la CO2 di solo gli autotrofi (per definizione) sono in grado di ridurre la CO2 di

utilizzarla cioè come unica e principale fonte di carbonio. utilizzarla cioè come unica e principale fonte di carbonio.

Molti microrganismi autotrofi sono fotosintetici e usano la luce come fonte di Molti microrganismi autotrofi sono fotosintetici e usano la luce come fonte di energia, alcuni ossidano le molecole inorganiche e traggono energia dal energia, alcuni ossidano le molecole inorganiche e traggono energia dal

trasferimento di elettroni.trasferimento di elettroni.

Fonti di carbonio energia ed eFonti di carbonio energia ed e--

Carbonio Carbonio

Autrofi: la COAutrofi: la CO22 è l’unica fonte di carbonio per la biosintesi.è l’unica fonte di carbonio per la biosintesi.

Eterotrofi: Molecole organiche ridotte derivanti da altri organismi.Eterotrofi: Molecole organiche ridotte derivanti da altri organismi.

EnergiaEnergia Fototrofi : luceFototrofi : luce Chemiotrofi : ossidazione di composti organici o inorganiciChemiotrofi : ossidazione di composti organici o inorganici

Elettroni: Litotrofi : molecole inorganiche ridotte. : molecole inorganiche ridotte. Organotrofi: molecole organicheOrganotrofi: molecole organiche

Energia e Energia e metabolismometabolismo

Tipi nutrizionaliTipi nutrizionali Possono essere distinti in quattro categorie in base alle loro esigenze di Possono essere distinti in quattro categorie in base alle loro esigenze di

carbonio e di energia, In maggioranza i microrganismi finora studiati carbonio e di energia, In maggioranza i microrganismi finora studiati appartengono agli :appartengono agli :

Autotrofi fotolitotrofi e eterotrofi chemiorganotrofi.

I primi ricavano l’energia dalla luce (foto) e impiegano CO2 per la sintesi i I primi ricavano l’energia dalla luce (foto) e impiegano CO2 per la sintesi i secondi ricavano energia dai c. organici e anche carbonio da composti secondi ricavano energia dai c. organici e anche carbonio da composti organiciorganici

Tutti i microrganismi patogeni appartengono ai chemiorganotrofi.Tutti i microrganismi patogeni appartengono ai chemiorganotrofi.

Energia e Energia e metabolismometabolismo

L’ azoto è importante per la sintesi di proteine e

carboidrati, purine e pirimidine tutti costituenti la cellula

batterica. Molti microorganismi utilizzando direttamente

l’ammoniaca per ricavare azoto, una vasta gamma di organismi riducono l’azoto

atmosferico.

Il fosforo è presente negli acidi nucleici nei nucleotidi, in vari cofattori e proteine. Il fosfato

inorganico è la fonte di fosforo, in molti ambienti acquatici la

sua mancanza rappresenta un fattore limitante la crescita.

Lo zolfo è importante per la sintesi di alcune sostanze quali metionina e cisteina, carboidrati come biotina e tiamina, come fonte viene

usato il solfato.

Azoto, Fosforo, ZolfoAzoto, Fosforo, Zolfo

Fattori di crescitaFattori di crescita

I microrganismi si riproducono quando hanno a disposizione minerali, I microrganismi si riproducono quando hanno a disposizione minerali, energia, carbonio, azoto, fosforo e zolfoenergia, carbonio, azoto, fosforo e zolfo

In genere i microorganismi a partire da questi elementi sono in grado di In genere i microorganismi a partire da questi elementi sono in grado di risolvere tutte le loro esigenze nutrizionalirisolvere tutte le loro esigenze nutrizionali

Molto spesso mancando di uno o più enzimi hanno bisogno di Molto spesso mancando di uno o più enzimi hanno bisogno di assorbire dall’esterno alcuni elementi necessari (enzimi) o i loro assorbire dall’esterno alcuni elementi necessari (enzimi) o i loro

precursori. precursori.

Questi elementi si definiscono fattori di crescita :Questi elementi si definiscono fattori di crescita :aminoacidi (biosintesi delle proteine), purine e pirimidine (DNA), aminoacidi (biosintesi delle proteine), purine e pirimidine (DNA),

vitamine (sintesi).vitamine (sintesi).

Assunzione di sostanze Assunzione di sostanze dall’ambiente esternodall’ambiente esterno

Il primo passo per l’assimilazione dei nutrienti è il loro assorbimento da parte della cellula microbica.

I meccanismi devono essere specifici, devono essere assorbite le sostanze necessarie e non altre.

Devono essere in grado di trasportare il nutriente al proprio interno quindi contro gradiente di concentrazione.

Le molecole di nutrienti devono esser in grado di passare la membrana citoplasmatica che notoriamente è di tipo selettivo.

Assunzione dei nutrientiAssunzione dei nutrienti

Diffusione passiva o diffusioneDiffusione passiva o diffusione: (glicerolo): processo in cui le molecole si : (glicerolo): processo in cui le molecole si spostano da una regione ad alta concentrazione ad una con bassa spostano da una regione ad alta concentrazione ad una con bassa

concentrazione per effetto dell’agitazione termica.concentrazione per effetto dell’agitazione termica.

Diffusione facilitataDiffusione facilitata : diffusione che avviene in presenza di particolari : diffusione che avviene in presenza di particolari proteine (carrier) chiamate anche permeasi incluse nella membrana proteine (carrier) chiamate anche permeasi incluse nella membrana citoplasmatica. La velocità di diffusione in questo caso aumenta . Le citoplasmatica. La velocità di diffusione in questo caso aumenta . Le

proteine di trasporto sono in questo caso simili agli enzimi, ogni carrier proteine di trasporto sono in questo caso simili agli enzimi, ogni carrier trasporta solo una ben determinata tipologia di sostanza. Non richiede trasporta solo una ben determinata tipologia di sostanza. Non richiede

alcuna tipologia di energia metabolica.alcuna tipologia di energia metabolica.

Trasporto attivoTrasporto attivo : meccanismo che permette il movimento contro gradiente : meccanismo che permette il movimento contro gradiente di concentrazione, cioè in direzione di concentrazioni più alte. Differisce di concentrazione, cioè in direzione di concentrazioni più alte. Differisce

dalla diffusione facilitata in quanto utilizza energia metabolica per il trasporto dalla diffusione facilitata in quanto utilizza energia metabolica per il trasporto delle sostanze all’interno della cellula.delle sostanze all’interno della cellula.

Figura 4.1 Diffusione passiva e diffusione facilitata. Dipendenza del tasso di diffusione dal gradiente di concentrazione del soluto (il rapporto tra concentrazione extra- e intracellulare). Si noti l’effetto di saturazione – evidenziato dal plateau nel grafico – che si verifica al di sopra di uno specifico valore del gradiente, nel caso di diffusione facilitata da una proteina carrier. L’effetto di saturazione si osserva ogni volta che nel trasporto è coinvolto un carrier.

Figura 4.2 Modello della diffusione facilitata. La proteina di membrana con funzione di carrier può cambiare conformazione in seguito al legame con una molecola di soluto esterna, che poi viene rilasciata all’interno della cellula. Successivamente la proteina riacquista la forma originale, orientata verso l’esterno, ed è pronta a legare un’altra molecola di soluto. Poiché il tutto avviene senza apporti di energia, il soluto continuerà a penetrare soltanto finché la concentrazione esterna resterà superiore a quella interna.

I sistemi di trasporto attivo utilizzano proteine di

membrana come carrier e ATP come fonte di energia per concentrare le sostanze

trasportandole contro gradiente di concentrazione

Coltivazione dei batteriColtivazione dei batteri

Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare nelle condizioni di laboratorio.

Per questo scopo si devono conoscere quali sostanze nutritizie e quali condizioni fisiche essi richiedono.

Tali informazioni hanno consentito di sviluppare numerosi terreni o mezzi per la loro coltura.

Preparazione dei terreni colturaliPreparazione dei terreni colturali

Dissoluzione degli ingredienti in volume di H2O.

Determinazione del pH ed eventuale correzione.

Distribuzione in contenitori idonei.

Sterilizzazione.

Terreni impiegati per la coltivazione dei Terreni impiegati per la coltivazione dei microrganismi in laboratoriomicrorganismi in laboratorio

Stato fisico:Stato fisico:

liquido;liquido;

semisolido (+Agar 0,5%);semisolido (+Agar 0,5%);

solido (+Agar 2%).solido (+Agar 2%).

Terreni impiegati per la coltivazione dei Terreni impiegati per la coltivazione dei microrganismi in laboratoriomicrorganismi in laboratorio

L’L’agaragar è un polimero composto principalmente di D - galattosio, lo si ottiene di è un polimero composto principalmente di D - galattosio, lo si ottiene di solito dalle alghe rosse è un ottimo agente solidificante perché dopo solito dalle alghe rosse è un ottimo agente solidificante perché dopo essere stato sciolto in acqua bollente può raffreddare a 42°C, prima di essere stato sciolto in acqua bollente può raffreddare a 42°C, prima di

solidificare e poi liquefa a 80° - 90°C.solidificare e poi liquefa a 80° - 90°C.

Non può essere degradato dai microrganismi non ha caratteristiche di nutriente.Non può essere degradato dai microrganismi non ha caratteristiche di nutriente.

Un terreno liquido può essere reso solido mediante l’aggiunta di agar 1-2 % il Un terreno liquido può essere reso solido mediante l’aggiunta di agar 1-2 % il più delle volte 1,5%.più delle volte 1,5%.

Terreni impiegati per la Terreni impiegati per la coltivazione dei microrganismi in coltivazione dei microrganismi in laboratoriolaboratorio

Terreni sintetici (terreni di cui è nota la quantità di ogni singolo componente, spesso a scopo di ricerca è necessario conoscere

quello che i batteri metabolizzano).

Terreni complessi (si ignora la loro composizione clinica, utili poiché le necessità di un batterio sono sconosciute è quindi impossibile

preparare un terreno definito).

Terreni usati in batteriologiaTerreni usati in batteriologia

1. Terreni arricchiti: sono aggiunti di altre sostanze come sangue, siero ed emoglobina al fine di favorire la crescita di batteri eterotrofi esigenti . Brodo selenite per isolare salmonelle e shigelle da campioni di feci.

2. Terreni selettivi: terreni arricchiti con Sali biliari o coloranti come fucsina basica favoriscono la crescita dei gram negativi sfavorendo i gram postivi. Agar Endo, EMB (agar all’ eosina e Blu di metilene) e l’agar Mac Conkey che contengono coloranti che inibiscono la crescita dei Gram + mentre MSA inibisce la crescita di batteri diversi dagli stafilococchi). Anche il terreno Sabouraud può essere considerato un terreno selettivo per il pH e il contenuto in zuccheri.

3. Terreni differenziali: mettono in evidenza la presenza di particolari generi batterici sfruttando un colorante e il lattosio che fermentando abbassa il pH provocando il viraggio del colorante, la colonia diviene rossa, i gram negativi gastro intestinali patogeni non fermentano il lattosio e vengono identificati facilmente . L’agar sangue evidenzia batteri in grado di produrre una lisi dei globuli rossi con diverse forme di emolisi. (Beta emolisi, alfa emolisi, gamma emolisi).

4. Terreni di saggio (ad esempio per antibiotici, disinfettanti).

Terreni di colturaTerreni di colturaTerreni di colturaTerreni di coltura

Conservazione temporanea del microrganismo, non contiene metaboliti essenziali al metabolismo microbiale.

Conservazione temporanea del microrganismo, non contiene metaboliti essenziali al metabolismo microbiale.

Contengono particolari fattori di crescita che permettono la replicazione della maggior parte dei batteri di interesse medico compresi i patogeni più esigenti, agar sangue agar cioccolato.

Contengono particolari fattori di crescita che permettono la replicazione della maggior parte dei batteri di interesse medico compresi i patogeni più esigenti, agar sangue agar cioccolato.

Terreni solidi che contengono sostanze capaci di inibire la crescita di alcuni generi batterici consentendo la più crescita di altri. EMB, MSA, Sabouraud.

Terreni solidi che contengono sostanze capaci di inibire la crescita di alcuni generi batterici consentendo la più crescita di altri. EMB, MSA, Sabouraud.

Contengono un fattore che favorisce selettivamente la crescita di un particolare microrganismo come ad es. il brodo-selenite che favorisce la crescita dei gram negativi.

Contengono un fattore che favorisce selettivamente la crescita di un particolare microrganismo come ad es. il brodo-selenite che favorisce la crescita dei gram negativi.

Terreni di trasportoTerreni di trasporto

Terreni ricchi Terreni ricchi

Terreni di arricchimento Terreni di arricchimento

Terreni differenziali Terreni differenziali

Terreni selettivi Terreni selettivi

Contengono sostanze che consentono di sfruttare il diverso aspetto delle colonie distinguendo tra specie di microrganismi differenti. Per i batteri gram negativi Agar Mac Conkey. (diventa rosso al di sotto di ph 6,8). Lattosio positivi di colore rosso.

Contengono sostanze che consentono di sfruttare il diverso aspetto delle colonie distinguendo tra specie di microrganismi differenti. Per i batteri gram negativi Agar Mac Conkey. (diventa rosso al di sotto di ph 6,8). Lattosio positivi di colore rosso.

Terreni di coltura complessiTerreni di coltura complessi

• Brodo nutritivo : TSB (Triptic soy broth) Brodo nutritivo : TSB (Triptic soy broth) • Agar nutritivo: TSA (Triptic soy agar)Agar nutritivo: TSA (Triptic soy agar)• Agar sangue Agar sangue • Agar cioccolato Agar cioccolato • Agar Mac ConkeyAgar Mac Conkey

Non è nota l’esatta percentuale dei singoli ingredienti presenti

Colture pure e caratteri colturaliColture pure e caratteri colturali

I batteri o gli altri microrganismi, quando crescono su un

terreno di laboratorio, sono chiamati coltura.I batteri o gli altri microrganismi, quando crescono su un

terreno di laboratorio, sono chiamati coltura.

Per coltura pura si intende una coltura costituita da una popolazione di cellule derivate tutte da un’unica cellula madre.

Essa rappresenta una condizione artificiale per l’accrescimento dei batteri ed è una condizione imposta da manipolazioni di laboratorio.

Per coltura pura si intende una coltura costituita da una popolazione di cellule derivate tutte da un’unica cellula madre.

Essa rappresenta una condizione artificiale per l’accrescimento dei batteri ed è una condizione imposta da manipolazioni di laboratorio.

Coltura mista: la popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti specie microbiche abitano

normalmente varie parti del nostro corpo (orale, intestinale, cutanea) ed in modo analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua).

Caratteristiche colturaliCaratteristiche colturali

Il modo in cui le colonie batteriche si sviluppano sulla superficie dell’agar è importante nella identificazione dei batteri sia per la dimensione che per

l’aspetto.

Un corretto piastraggio di una popolazione mista può portare al riconoscimento e all’identificazione di una specie batterica.

In natura i batteri crescono sulle superfici in forma di biofilm ma a volte formano colonie distinte, di norma la crescita batterica è rapida ai margini della

colonia e molto più lenta al centro. In alcune colonie la porzione centrale va incontro ad autolisi, ai margini infatti ossigeno e nutrienti sono

abbondanti rispetto al centro.

Variazioni rilevabili a occhio nudo nella morfologia delle colonie, forma e andamento generale del suo margine

vengono rilevati osservando la colonia dall’alto, lo spessore si rileva osservando la colonia di lato, tenendo la

piastra all’altezza degli occhi.