fabiana seixas email: [email protected] bibliotecas de dna ou bancos de dna

FABIANA SEIXASemail: [email protected]

BIBLIOTECAS DE DNABIBLIOTECAS DE DNAouou

BANCOS DE DNABANCOS DE DNA

TIPOS DE VETORESTIPOS DE VETORES

• Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossômico, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras– pUC18– pBR322– pUP310

Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9kb

VETORES PLASMIDIAISVETORES PLASMIDIAIS

- Vírus que infectam bactérias;

- DNA ou RNA;

- Capsídeo

- Biologia do fago

- Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

BACTERIÓFAGOBACTERIÓFAGO

-São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos;

- Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb;

COSMÍDEOSCOSMÍDEOS

DN

A RE

COM

BIN

ANTE

DN

A RE

COM

BIN

ANTE

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO • É uma coleção de clones que

representam a totalidade do genoma de um determinado organismo

• Consiste de todas as moléculas de DNA recombinantes que foram geradas pela ligação do DNA do organismo a um vetor (plasmideo, bacteriófago ou cosmídeo)

• Servem para isolar DNA específicos de um organismo

São usadas principalmente para procariotos

Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para estudo de regiões reguladoras

Independe do tipo de célula utilizada para a obtenção do DNA

CARACTERÍSTICASCARACTERÍSTICAS

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Representa todo o genoma de um organismo

BIB

LIO

TEC

AS D

E D

NA

G

EN

ÔM

ICO

- F

agos

BIB

LIO

TEC

AS D

E D

NA

G

EN

ÔM

ICO

- F

agos

BIB

LIO

TEC

AS D

E D

NA

G

EN

ÔM

ICO

B

IBLI

OTEC

AS D

E D

NA

G

EN

ÔM

ICO

BIB

LIO

TEC

AS D

E D

NA

G

EN

ÔM

ICO

- A

plic

açõ

es

BIB

LIO

TEC

AS D

E D

NA

G

EN

ÔM

ICO

- A

plic

açõ

es

BIBLIOTECAS DE cDNA

É o conjunto de clones das seqüências É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mRNA.de moléculas cópias do mRNA.

É usada principalmente para células É usada principalmente para células eucarióticas.eucarióticas.

Varia de acordo com o tecido utilizado.Varia de acordo com o tecido utilizado.

BIBLIOTECAS DE cDNABIBLIOTECAS DE cDNA

SINTESE DE cDNASINTESE DE cDNA

Purificação do RNA

Hibridização com poly(dT)

Copia do DNA com RT

Degradação do RNA

Síntese de uma fita complementar

Clonagem de cDNA em fago Clonagem de cDNA em fago

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO


BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICOEta

pas

na

con

str

ução

de

um

a

Bib

liote

ca

gen

ôm

ica

e

de c

DN

A

Biblioteca genômica:Biblioteca genômica:

- Representam uma amostra aleatória de todas as seqüências Representam uma amostra aleatória de todas as seqüências de DNA de um organismode DNA de um organismo

Biblioteca de cDNABiblioteca de cDNA

- Contém moléculas que foram transcritas em mRNAContém moléculas que foram transcritas em mRNA

- Produção de grande quantidade de mRNA por células Produção de grande quantidade de mRNA por células especializadasespecializadas

- Varia de acordo com tipo e estado fisiológico da célulaVaria de acordo com tipo e estado fisiológico da célula

- mRNA é processadomRNA é processado

DIFERENÇAS

BIBLIOTECASBIBLIOTECAS

Seqüenciamento de todos os insertos usando

iniciadores do vetor

Screening

Projetos genoma / transcriptoma

Utilização de bibliotecasUtilização de bibliotecas



TRIAGEM DE UMA BIBLIOTECATRIAGEM DE UMA BIBLIOTECA

• Detecção do produto do gene pela Detecção do produto do gene pela utilização de anticorposutilização de anticorpos

• Detecção do DNA através da técnica de Detecção do DNA através da técnica de hibridizaçãohibridização

Triagem de uma biblioteca

Conhecer parte da Conhecer parte da seqüência do geneseqüência do gene

Sequência Sequência completa do genecompleta do gene

Sonda de DNASonda de DNA Utilizar sonda de Utilizar sonda de oligonucleotídeos oligonucleotídeos derivado de uma derivado de uma

proteínaproteína

Codon degeneradoCodon degeneradoConhecer cerca de Conhecer cerca de 6aa contíguos6aa contíguos

AnticorposAnticorpos

1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos

Triagem de uma bibliotecaTriagem de uma biblioteca

• É a formação de molécula fita dupla, É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens complementares, mas de origens diferentesdiferentes

• Hibridização Renaturação

2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização

HIBRIDIZAÇÃO HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOSDOS ÁCIDOS NUCLEICOS


Marcação da Sonda de DNAMarcação da Sonda de DNA

•Radioativa: Radioativa: 3232P – nick traslationP – nick traslation

•Enzimática: Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalinaperoxidase, fosfatase alcalina

SONDA de DNASONDA de DNA

- Seqüência de DNA Marcada- Seqüência de DNA Marcada



Radioativa: Radioativa: 3232P – nick traslationP – nick traslation

Atividade Exonucleasica da DNA polimerase

DNA polimerase preenche com nucleotídeos

marcados

Cortar o DNA fita dupla

DNA fita simples

Moléculas de DNA radioativas

Sondas



•Enzimática: Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalinaperoxidase, fosfatase alcalina

Desnaturação DNA

DNA fita simples

Ligação Fraca

(DNA+ Peroxidase)

Sondas Covalentemente marcada com a enzima

+ peroxidase complexada com polimero positivo

+ glutaraldeído


2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização

1

2 3

456

Placas com Colônias

contendo os plasmídeos

Lise das Bactérias – Desnaturação do DNA

SondaFilme de Raio - X


2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização


Caracterização da seqüência encontrada

• Seqüenciamento de DNASeqüenciamento de DNA

• PCRPCR

• Expressão da sequência codificadoraExpressão da sequência codificadora


Southern Blot - DNASouthern Blot - DNA

Northern Blot - RNANorthern Blot - RNA

Western Blot - ProteínaWestern Blot - Proteína

Técnicas de HibridizaçãoTécnicas de Hibridização

• Sonda: seqüência de DNA marcada

Transferência de DNA do gel para a membrana

Southern Blot – RNASouthern Blot – RNASouthern Blot – RNASouthern Blot – RNA

4. Geração de uma sonda marcada

pGEM-T

dATPdGTPdTTP

dCTP

1. Extração do DNA

2. Eletroforese do RNA

3. Transferencia para a menbrana

5. Hibridização

6. Visualização

Northern Blot – RNANorthern Blot – RNANorthern Blot – RNANorthern Blot – RNA

Trabalho Prático 1

fabiana seixas email: [email protected] bibliotecas de dna ou bancos de dna

Documents