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F. FischlF. Fischl

A R T – Artificial Reproductive Techniques Moderne Stimulationstherapien u.a.rFSH/rLH -GnRH- Agonisten/LH-Antagonisten etc.

AIH (artificial insem. homologous)

IUI - Intrauterine insemination AID (artificial insemination donor)

IVF - In vitro Fertilisation

ICSI - Intacytoplasmatic Sperm Injection

MESA - Mikrochirurgische epidymale Spermatozonaspiration

TESE - Testikuläre Spermien Extraction aus Hoden

IMSI - Intrazytoplasmatische Morphologisch Selektierte Spermien Injektion

2FIS - ART - Belek 2009

PICSI - Methode zur Selektion reifer Spermien in Picsi-Schale

Assisted Hatching - Schlüpfhilfe

SPS – Seminalplasmaspülung

SEET - Stimulation of endometrium embryo transferET - Embryotransfer - Tag 2 - 3

BcT - Blastocystentransfer - Tag 4 - 5

Kryoverfahren – „slow cooling“ -Vitrifikation

Präimplantationsdiagnostik –PKD - Polkörperdiagnostik PID - Präimplantationsdiagnostik

A R T – Artificial Reproductive Techniques


Evidence-based medicine (EBM)

expertopinions


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StimulationsbehandlungKontrollierte ovarielle (Hyper)Stimulation (KOH)mit Clomifen, urinären Präparaten (HMG), rFSH/rLH -GnRH- Agonisten/ LH-Antagonisten etc. z.T. mit verschiedenen Vorbehandlungen wie z.B. mit oder unterMetformin, OH, DHEA, GH usw.

Zielsetzung: Heranreifen eines od. mehrerer Follikel aus Follikelkohorte mit

Oocyten in guter Qualität

Bei IVF / ICSI: – Vermeidung der spontanen Ovulation – Gewinnung mehrerer reifer Eizellen (Metaphase II)

Bei IUI + VZO*: – Heranreifen von 1 – max. 3 Eizellen

* Verkehr zum ovul. OptimumFIS - ART - Belek 2009

Ovarielle Stimulationstherapie in der PraxisClomifen noch zeitgemäß ?

Cochrane Metaanalyse aus 12 adäquaten prospektivrandomisierten Studien (Beck et al. 2005, Cochrane Database)

Clomifen erhöht die Schwangerschaftsraten signifikantgegenüber Placebo (OR 5.8, 95% CI 1.6 – 21.5)

Die Kombination mit Dexamethason (OR 11.3, 95% CI 5.3 - 24) oder die Vorbehandlung mit einer Pille (OR 27.2, 95% CI 3.1 – 235.0) verbessern beim PCOS dieErgebnisse signifikant

Clomifen ist nach wie vor die Therapie der 1. Wahlbei anovulatorischer und idiopathischer Sterilität


PCOS mit Insulinresistenz - Stimulationen immer unter Metformin?

The role of metformin in polycystic ovary syndromeMoll E, van der Veen F, van Wely M (2007)Hum Reprod Update (ahead of print)

27 RCTs

Kein Unterschied in der Lebendgeburtenrate im VergleichMetformin vs. Placebo

(OR 0,73, 95% CI 0,51 – 1,1)

Bei CC-resistenten Frauen führte die Vorbehandlung mitMeformin zu signifikant höheren Lebendgeburtraten

(OR 6,4, 95% CI 1,2 – 35) 7FIS - ART - Belek 2009

Welches Gonadotropin sollte eingesetzt werden ?Human menopausal gonadotropin versus recombinant follicle stimulationhormone for ovarian stimulation in assisted reproductive cyclesVan Wely M, Westergaard LG, Bossuyt PMM, Van der Veen F (2003)

8 RCT

Kein signifkanter Unterschied in der Lebendgeburtenrate zwischen HMG und r-FSH

(OR 1,27, 95% CI 0,98 – 1,64)

r-FSH HMG

HMG (Menogon®) und r-FSH (Puregon®,Gonal F®) sind im wesentlichen gleich wirksam


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Long-Agonisten Schema mit rFSH

GnRH – Agonist Depot Tag 19-21 des Vorzyklus

Menstruation

150 – 300 IE rFSHab Tag 2/3

vag.Sono ev.E2

Follikel > 18mmE2> 350pro Follikel

10000 IE HCG

Transvaginale Punktion

Embryotranfer2 bis 16zeller

Progesteron Vag.

Nach 2-3 Wochen Kontrolle der „down regulation“

FIS - ART - Belek 2009

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Short Antagonistenschema mit Mehrfachgabe

GnRH-Antagonist0,25 mg

rFSH 1

Stimulationstag

e

2 3 4 5

Tranvag. Punktion (33-36h nach hCG

Embryotransfer 2-16 Zellstadum

Tag 2/3 od. BcT Tag 5

5-1000 IE hCG

Progesteron Vag.

Vag. Sono ev. E2

7 8 96


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Ovulationsmonioring

Große Follikel bis zu 19mmE2 > 350 pg/dl pro Follikel

Bereits hochaufgebautes Endometrium

Follikel- und Endometriumsbeurteilung


Ovarielle Stimulationstherapien nur unter Ultraschallkontrollen!

Optimales timing der Ovulation und des Konzeptions-zeitpunktes

Reduzierung des Mehrlingsrisiko, gerade auch bei Clomifen, besonders bei PCOS ( ≥ 3 Follikel keine IUI, Kohabitationsverbot)

Beurteilung desEndometriums

Fanchin et al. (2000)Fertil Steril 74: 274-81

Abnehmende Implantationsraten (IR)

35% 23% 17% 6% 7% 3%IR


IUI im ART-Zeitalter noch sinnvoll ?17 RCT mit 3662 Zyklen

Die IUI im natürlichen Zyklus erhöht die SS-Ratengegenüber VZO

(OR 2.43, 95% CI 1.54-3.83)

Eine zusätzliche ovarielle Stimulationstherapie führt zu einer Versechsfachung der SS-Raten

(OR 6.23, 95% CI 2.35-16.52)

Bei mehr als 1 Mio. bewegliche Spermatozoen, ohne andere Sterilitätsfaktoren, sollte die IUI mit aufbereiteten Spermatozoen bevorzugt im stimulierten Zyklus empfohlen werden.


Unexplained InfertilityIntrauterine Insemination for unexplained infertilityVerhulst SM et al. (2006)Cochrane Database

6 RCTs

Signifikante Erhöhung der SS-Rate nur in stimulierten Zyklen(OR 1,68, 95% CI 1,13 – 2,50)

Signifikant höhere Lebendgeburtenrate in stimulierten IUI-Zyklen(OR 2,07, 95% CI 1,22 – 3,50)

In vitro fertilisation forunexplained infertilityPandian Z et al. (2005)Cochrane Database

10 RCTs

Signifikante Erhöhung der SS-RateGegenüber abwartendem Verhalten(OR 3,24, 95% CI 1,07 – 9,80)

Kein Unterschied zwischen IVF und Insemination(OR 1,15, 95% CI 0,55 – 2,40)

Bei idiopathischer Sterilität (unexplained infertility) ist es daher legitim mit IUI`s in stimulierten Zyklen zu beginnen. Cave: Alter der Frau


Polkörperdiagnostik (PKD)Gilt noch immer als ein in Erprobung befindliches Verfahren

Indikationen:

Erkennung eines spezifischen genetischen, einschließlich chromosomalen kindlichen Risikos mittels indirekter Diagnostik der Eizelle

Erkennung unspezifischer chromosomaler Risiken im Rahmen von IVF zur möglichen Erhöhung der Geburtenrate – bisher in der Literatur sehr kontroversiell beurteilt, Vorteil eher nicht gegeben


Polkörperdiagnostik (PKD)Entfernung eines/mehrerer Nuclei von

Oozyten (Polkörperchen) oder Embryos (Blastomere/Trophektoderm)

Untersuchung einer mütterlichen genetischen oder chromosomalen Veränderung des haploiden weibl. Chromosomensatzes durch die Untersuchung des ersten und zweiten Polkörperchen im Ablauf einer IVF/ICSI – indirekte Diagnostik einer EizelleTestung auf Mutationen von Gensequenzen

Aneuploidie


Polkörperdiagnostik (PKD)

Die PKD ist an die Anwendung an eine IVF/ICSI Behandlung geknüpft, auch wenn keine Fertilitätsstörung vorliegt

Nachdem diese Untersuchung vor Bildung eines Embryos durchgeführt wird, ist das Embryonenschutzgesetz davon nicht berührt Nur ♀ Veränderungen können damit festgestellt werden Die Untersuchung am 2. Polkörperchen gelingt nicht immer

FISH X/Y, 13, 16, 18, 21, 22FISH X/Y, 13, 16, 18, 21, 22


PGD bei fortgeschrittenem mütterlichen AlterDie Wirksamkeit der Präimplantationsdiagnostik (PGD) bei Frauen im "fortgeschrittenem Alter" wurde vorausgesetzt, ohne in RCTs überprüft zu sein. Die neue große Multizenterstudie findet keinen Vorteil der PGD, sondern ganz im Gegenteil, signifikant weniger Schwangerschaften (ongoing) und Lebendgeburten als bei Verzicht auf die Diagnostik.Mastenbroek S, Twisk M, van Echten-Arends J, et al.In vitro fertilization with preimplantation genetic screening. N Engl J Med 2007;357:9-17

Was bringt die PGD wirklich?


In ART grundsätzlich nur ICSI durchführen?

Indikationen: < 1 Mio. progressiv motile Spermatozoen bei Azoospermie mit

MESA oder TESE Befruchtungsversagen bei IVF

ICSI versus conventional techniques for oocyte insemination during in vitro fertilisation in patients with non-male subfertilityVan Rumste MME, Evers JLH, Farquhar CM (2003), Cochrane Database1 RCT

Bei annähernd normalem Spermiogramm ist die ICSI der konventionellenIVF nicht überlegen (OR 1,40, 95% CI 0,95 – 2,2)


Spermienfaktoren, die negativen Einfluss auf die embryonale Entwicklung haben, sind v.a. durch eine verminderte Spermienreife bedingt. Hierzu zählen u. a. DNA-Fragmentationen. Alle bisher zur Verfügung stehenden Diagnosemittel waren invasiv, wodurch eine Weiterverwendung der Spermien nicht möglich war. Die IMSI erlaubt ein Screening der Spermien bei sehr hoher Vergrößerung mit einem speziellen Invertmikroskop (6000x – 10 000x) mit Videokamera und Computer ohne Färbung in Echtzeit. Dadurch kann ein Spermium bezüglich seiner morphologischen Integrität seines Nukleus analysiert werden.

Zahlreiche Publikationen haben gezeigt, dass eine Prä-Selektion des Spermaozoons für eine erfolgreiche ICSI essentiell ist. ICSI mit Spermien, die mittels hoher Ver-größerung ausgewählt wurden, ergaben eine höhere Schwangerschaftsrate, speziell in Fällen wo das Ausmaß an DNA-Fragmentationen im Spermium besonders hoch war.

IMSI - Intrazytoplasmische Morphologisch Selektierte Spermien Injektion

400x

ICSI IMSI


Bartoov etablierte ein System für eine Selektion bei hoher Vergrößerung, ungefärbte, Echtzeit hochauflösende Untersuchung der Organellen von motilen SpermienBartoov et al., NEJM 2001Bartoov et al., J. Androl. 2002 Bartoov et al., Fertil. Steril. 2003

ErgebnisseICSI mit abnormalen Spermatozoen: Reduktion der SS-Rate:

20,2% versus 36,7%Reduktion der Implantationsrate: 9,6% versus 18,7%Prä-Selektion der Spermien ist essentiell für eine erfolgreiche ICSI(De Vos et al., Hum. Reprod. 2003)

IMSI


Nicht invasive Darstellung der Spindel mittels computerassistierter Polarisationsmikroskopie - Darstellung der 3 Schichten der Zona pellucida Metaphase II – Eizellen

Spindelanalyse

Winkel zwischen erstem Polkörperchen(bei 12:00 Uhr) und meiotischer Spindel (ca. 30° abweichend) bei einermenschlichen Eizelle

Kombination von Spindelanalyse & IMSIDie Kombination könnte zur weiteren Steigerung der

Schwangerschaftsraten bei ICSI führen mit Senkung der Abortus-Raten – Entsprechende randomisierte Großstudien fehlen noch


PICSI

Eine Methode zur Selektion reifer Spermien im Rahmen der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI). Die Picsi-Schale ermöglicht in nicht invasiver Form die Auswahl von genetisch integeren, d.h. reifen Spermien durch Hyaluronsäure Spots.

Die Köpfe reifer Spermien tragen eine spezifischen Rezeptor für Hyaluronsäure (Hyaluronan). Hyaluronan ist eine wesentliche Komponente der Hülle, welche die Eizelle umgibt. Unreife Spermien verfügen nicht über diesen Rezeptor

Durch den sogenannten Hyaluronan-Bindungstest werden Spermien aufgrund von bestimmten Membran-Bindungseigenschaften selektiert. Alle bindenden Spermien sind reif und zeigen keine DNA-Degradierung auf. Diese gebundenen Spermien können für die ICSI verwendet werden.


IMSI und PICSI erlauben in bestimmten Fällen eine Verbesserung der Ergebnisse:

Bei fehlender Befruchtung nach ICSI bei fehlgeschlagener Implantation bei schwerer Teratozoospermie bei erhöhter DNA-Fragmentation und vielleicht auch bei idiopathischer Sterilität?

Es fehlen derzeit Daten aus Studien mit Evidenzklasse I und II


T E S E / M E S A


Assisted Hatching – wie sinnvoll?

Seif MMW, Edi-Osagie ECO, Farquhar C, Hooper L, Blake D, McGinlay P. Assisted hatching on assisted conception (IVF & ICSI). Cochrane Database of Systematic Reviews 2006, Issue 1. Art. No.: CD001894. 23 Studien mit guter Qualität und 2889 Frauen mit 954 Schwangerschaften

Definitiv wird die Schwangerschaftsrate erhöht bei Frauen mit mehreren Misserfolgen bei IVF/ICSI, mit reduzierter Prognose (OR 1,33 (95% CI 1,12 bis 1,57)Beispiel: von 25% auf 28% bis 39% - auch die Mehrlingsrate steigt.

„Hatchende“ Blastocyste

Klare Aussage!


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Wann ist assisted Hatching sinnvoll?

Die weltweit vorliegenden Studien sind derzeit nicht in der Lage zu sagen, die Methode nutzt sicher jeder Frau und die Nebenwirkungen sind kalkulierbar gering.

Bei Frauen im ersten IVF Versuch ist kein Effekt zu finden

auch nicht bei Transfer von kryokonservierten Zellen

oder bei hohem FSH


Embryonen im 8-Zellstadium (d 3)

Compacting Embryo (ebenfalls d 3)

Embryotransfer (ET) Tag 2-3


Blastozystentransfers (BcT) – Tag 4-5

Alter der Frau Anzahl der Oocyten Qualität der Oocyten Qualität der kommerziell erhältlichen

Medien nicht bei poor Respondern

(keineVerbesserung der Ergebnisse)

„ fully expanded“ Blastozyste (d 5)

Expandierte Blastocyste (d 5)

Morula deutlich kleiner (d4)

Frühe Blastozysten (d 5)

Durchführung eines abhängig von


Vorteile der Blastozystenkultur

Gewinnung der besten lebensfähigen Embryonen nach Überwindung der Entwicklungsblockade in den in vitro Kulturen zwischen Tag 2-3 (4-8 Zellstadium)

Bessere physiologische Bedingungen und Synchronisation zwischen Endometrium und Embryo-Entwicklungsstadium

Im 2-4 Zellstadium ist die Zona pellucida durch die Kulturbedingungen in vitro so verhärtet, dass es nur schwer zum Hatchen kommt

Völlige Entfernung der Zona pellucida mit enzymatischen Methoden und Transfer von zona pellucida freien Blastozysten

für eine bessere Implantation (Eine Möglichkeit in der Zukunft?)


Cochrane Review 2007 - 18 RCTsMehr Lebendgeburten: 9 RCTs OR 1,35, 95% CI 1,05 - 1,74 Tag 2/3: 29,4% versus Tag 5/6: 36,0% Vor allem bei den Patientinnen mit guter Prognose

„Kein Transfer“ ist signifikant häufiger bei Blastozysten, 16 RCTs OR 2,85, (95% CI 1.97 -4,11) 2,8% versus 8,9%Der Unterschied gilt aber nicht bei Patientinnen mit guter Prognose.

Embryonen- Transfer versus Blastozysten-Transfer


Erfolgsfaktoren- EmbryoqualitätWer profitiert?

Die junge Patientin mit guter Prognose reduziert nach Blastozystentransfer das Mehrlingsrisiko, weniger Fehlbildungen (Blake + Devroy, Evidenzklasse I/Ib,)mehr Single Transfers

Gute Prognosefaktoren:

Hohe Anzahl fertilisierter Oocyten Gute Embryoqualität

Schlechte Prognosefaktoren:

Geringe Anzahl fertilisierter Oocyten Schlechte Embryoqualität Alter?


Seminalplasmaspülung (SPS) bei ARTEin Teil der Samenflüssigkeit – das Seminalplasma – von den Zellbestandteilen getrennt und nach der Follikelpunktion mit einem dünnen Katheter in den Gebärmutterhals gespült. Das Seminalplasma (Ejakulat ohne Spermien) besteht zu einem Großteil aus dem Sekret der Samenblase und zu 25% aus Prostatadrüsensekret. Es enthält eine Vielfalt an Botenstoffen z.B.: TGF und Interleukin, die das Wachstum von Blutgefäßen fördern und Entzündungsreaktionen oder andere immunologische Reaktionen beeinflussen. Heidelberger Arbeitsgruppe erzielte bei Durchführung einer Seminalplasmaspülung bei 129 Patientinnen eine Steigerung der Schwangerschaftsrate um 11,6 % Intravaginal and intracervical application of seminal plasma in in vitro fertilisation or intracytoplasmatic sperm injection treatment cycles - a double blind, placebo-controlled, randomized pilot study. Michael von Wolff, Sterility and Fertility, Feb. 2008 online)


Hier fehlen für eine endgültige Aussage noch entsprechende Studien Evidenzklasse Ia und b

Im Zuge eine Blastocystenzüchtung wird am 3. Tag nach Follikelpunktion eine Spülung der Gebärmutterhöhle mit dem verwendeten Kulturmedium vorgenommen. Dadurch soll die Einnistungsbereitschaft des Endometriums verbessert werden. Am Tag 5 oder 6 nach Punktion erfolgt dann der Blastocystentransfer. Die japanische Arbeitsgruppe berichtete von einer Verdopplung der Schwangerschaftsrate, allerdings bei sehr kleiner Fallzahl.

Stimulation of endometrium embryo transfer (SEET): injection of embryo culture supernatant into the uterine cavity before blastocyst transfer can improve implantation and pregnancy ratesSakae Goto, M.D., Ph.D.a, Takashi Kadowaki, M.D., M.P.H., Ph.D.b, Hiromi Hashimotoa, Shoji Kokeguchi, M.D., Ph.D.a, Masahide Shiotani, M.D., Ph.D.a – FertilitySterility, Nov. 2007

SEET - Stimulation of endometrium embryo transfer

Hier fehlen für eine endgültige Aussage noch entsprechende Studien der Evidenzklasse Ia und b


„slow cooling“ – langsames Einfrieren mittels computergesteuerten Freezingapparaten (z.B. – 0,30C/min., bei niedrigen Kryoprotektiva ~10%)

Vitrifikation – ultraschnelles Abkühlen > -10.000oC/min wobei die Zellen direkt in einen amorphen Zustand (Verglasung) übergehen (Martino et al., 1996) Anwendung im medizinischen Bereich

Reproduktionsmedizin Fertilitätsprophylaxe Stammzellforschung

Methoden der Kryokonservierung


Nach heutigem Wissen ist die Vitrifikation die Methode für: Germinal Vesikel Eizellen Metaphase-II-Eizellen (Eizellspende) Blastozysten Ovargewebe ?

Kommerzielle Medien sind verfügbarAseptische Vitrifikation ist möglich Entsprechende Studien der Evidenzklasse Ia/Ib fehlen noch


Ovarian Tissue Banking (OTB) Grosse Anzahl an Primordialfollikeln im Gewebe vorhanden höhere Erfolgschancen?

Keine Stimulation, dafür aber LSK notwendig

Kurzfristig durchführbar (Op. Freigabe)

Natürliche Empfängnis denkbar

Als autologe Hormonersatztherapie denkbar ______________________________________________________

Ovarielle Gewebeentnahme Bestrahlung/Chemotherapie/OP Retransplantation des ovariellen Gewebes


Ovarian Tissue Banking (OTB)LSK - Entnahmetechnik 1 Präparat zur histologischen Kontrolle 1 Präparat zur Bakteriologie 2ml Kryotubs + Kryomedium (z.B. DMSO) Friervorgang Lagerung im überwachten Stickstoff-Tank


orthotop autologe: Reimplantation an die ursprüngliche Lokalisation im kleinen BeckenVorteil: spontane Ovulation und Schwangerschaft möglichNachteil: potenzielles Rezidivrisikoheterotop autologe:Autotransplantation von Gewebe an hetorotope Körperstellen (Unterarm, Oberarm) – biolog. HRT, bei KW Punktion, IVM und IVFXenotransplantation: Transplantation von Gewebe auf immundefiziente Mäuse

Ovarian Tissue Banking - Reimplantation

Technik noch nicht über klinische Forschung hinaus !39FIS - ART - Belek 2009

In-vitro-Maturation (IVM)Gewinnung von Ovargewebe - Isolierung von unreifen Oozyten (Primordialfollikel, Primärfollikel) - künstliche Reifung (FSH / HCG) IVF/ICSI-TherapieIn-Vitro-Maturation bisher nur im Mausmodell gelungen (Smitz et al., Hum Reprod, 1999)


IVM schon heute sinnvoll anwendbar?

IVM ist die in vitro Reifung der Oocyten vom GV-Stadium zum Metaphase II Stadium

IVM-Methodik: Aspiration unreifer Oocyten in nicht oder niedrig dosiert stimulierten Zyklen

In vitro Maturation (IVM) ist bisher wenig untersucht in RCTs. Keine valide Aussage aus prospektiv kontrollierten Vergleichstudien zum Erfolg gegen „normale IVF“ möglich. Priming mit FSH/hMG oder unstimuliert punktieren? Mit oder ohne hCG Gabe?Diese Fragen sind nicht bisher zuverlässig beantwortet!


IVM - mögliche Indikationen

Zustand nach OHSS? Schlechte Embryonenqualität in wiederholten Zyklen? Poor Responder? Tumor-Patientinnen + Vitrification der Oocyten/OTB Fertilitätserhalt?

Nachteile: Kosten (keine Medikamente, aber ICSI, bei 10-20% Erfolg

gegen 30-40% konventionell?, lange Punktionszeiten)

Blutungsrisiko? Geringe Zellausbeute? Wieviele Eizellen erreichen die Metaphase II?


„Future Perspectives“

Prophylaktische bilaterale Ovarektomie bei Risikopatientinnen (z.B. BRCA 1 & 2) aber auch OTB bei erst späteren Kinderwunsch ohne Erkrankung

Vorsorgliche Einlagerung zur späteren biologischen HRT ev. anti aging bzw. „better aging“ Therapie

dadurch Erhaltung der Fertilität bei möglichenspätem Kinderwunsch


f. fischl. a r t – artificial reproductive techniques moderne stimulationstherapien u.a. rfsh/rlh...

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