EXTRACCIÓN DE ADN

(Doyle & Doyle, 1987)

MATERIALES Y REACTIVOS

(Grado biología molecular a analítico)

Cloroformo

Alcohol Isoamilico

Isopropanol.

Etanol al 70%.

Bloques de Hielo

Microcentrifuga

Bloque de calentamiento

Vortex

Tubos de microcentrifuga (1,5 ml)

Micropipetas

Puntas para micropipeta

PROCEDIMIENTO

1. Separar el tejido vegetal a extraer (Hojas jóvenes plantas sanas) 2. Macerar 100 mg en nitrógeno líquido utilizando mortero y pestillo. Colocar en un tubo

de microcentrifuga (1,5 ml)

3. Añadir 400 L de bufer de extracción y agitar brevemente en un vortex 4. Incubar a 65°C durante 30 min

5. Dejar a temperatura ambiente y añadir 400 L de cloroformo-isoamilalcohol 24:1. Agitar suavemente por inversión durante 5 min.

6. Centrifugar a 14 mil rpm por 5 min.

7. Retirar el sobrenadante y transferir a un tubo limpio (aproximadamente 200 L).

8. Añadir 200 L isopropanol frío y homogeneizar por inversión durante 1 min. 9. Incubar a -20°C por 30 min mínimo a 2 h. 10. Centrifugar a 14 mil rpm por 5 min. Descartar el sobrenadante, sin desprender el

precipitado del tubo.

11. Adicionar 200 L de etanol al 70% frío. 12. Centrifugar a 14 mil rpm por 5 min. . Descartar el sobrenadante, sin desprender el

precipitado del tubo. Dejar secar en papel toalla por aproximadamente 30 min. También se puede incubar a 50°C por 45 min con la tapa del microtubo abierta en una estufa.

13. Resuspender el ADN en 100 L de bufer TE. 14. Tratar con ARNasa (5 mg/mL). Incubar a 37°C por 30 min. Esta reacción se detiene

calentando a 65°C por 15 min o añadiendo 2 L de EDTA 0.5 M. 15. Almacenar a 8 -12°C por más de 6 h para resuspender. 16. Adicionalmente se puede medir la concentración del ADN en un espectrofotómetro y

verificar su calidad corriendo un gel (5 L ADN más 2 L bufer de carga). 17. Almacenar a -20°C hasta su uso.

TAMPÓN DE EXTRACCIÓN DOYLE Y DOYLE 1987

Reactivo Concentración

final

Para 500 mL de

tampón D&D

CTAB 2% 10 g

PVP 2% 10 g

Tris HCl 1 M pH

8

1 M 50 mL

EDTA 0.5 M pH

8

0.5 M 25 mL

NaCl 5 M 200 mL

Agua destilada

estéril

completar

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CUANTIFICACIÓN DE ADN EN EL QUANTUS DE PROMEGA

MATERIALES

Muestras vegetales: Genotipos 12-2-3-4-25-50-4-13-9-10 (Ejemplo).

PROCEDIMIENTO:

Preparar solución de trabajo con el Quantifluor DNA System

Calcular # de muestras a utilizar más muestra blanco más muestra estándar de

concentración conocida más 4 muestras extra por error de pipeteo= Volumen a preparar de

la solución de trabajo QFS 1X.

En alta concentración se prepara dilución 1:200

En baja concentración 1:1000.

Ejemplo:

Son 10 muestras vegetales + Estándar + Blanco + 4 error = 16 muestras

QFS 1X = 100 L x 16 = 1600 L

Utilizar 1.6 L QFS dye más 1598.4 L bufer TE 1X para preparar la solución de trabajo.

Esta solución es estable a temperatura ambiente pero debe conservarse en oscuridad o

protegida de la luz con papel aluminio.

Para la lectura se prepara cada muestra de la siguiente manera:

Se utiliza un tubo de PCR de 0.2 mL.

Añadir 1 L de la muestra + 99 L de 1X TE + 100 L QFS solución de trabajo.

Estándar: Añadir 1 L del estándar + 99 L de 1X TE + 100 L QFS solución de trabajo.

Blanco: Añadir 100 L de 1X TE + 100 L QFS solución de trabajo.

Aplicar vortex por 5 seg. Centrifugar. Incubar 5 min en oscuridad. Leer.

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CONDICIONES DE PCR

Muestras

10 muestras de ADNs cuantificados en el Quantus de Promega más un control negativo.

Primers

Utilizaremos los cebadores Operon Technologies: OPC20, OPF04, OPF09, OPF10, OPF11,

OPF12, OPF13, OPF14, OPF15, OPF16, OPF17, OPF19, OPM01, OPM03, OPM04,

OPM05, OPM06, OPM07, OPP01, OPP07, OPK11.

Para la amplificacion del ADN se emplea un termociclador, en este caso un Agilent

Technologies (Applied Biosystems).

PROGRAMACIÓN DEL CICLO PCR

Primer paso 94,0ºC por 5:00 min (desnaturalización)

Segundo paso 94,0ºC por 30 s

Seguido por hibridación de primers a 36º - 42°C por 30 s

Extensión a 72ºC por 2:00 min

Se repite del paso 2 al 4 por n veces (generalmente 30 – 44 veces)

Posteriormente se realiza una extensión final a 72ºC por 7 min

Y se programa un paso para conservación a 15°C hasta retirar del aparato

CÓCTEL PCR MIX PARA RAPD

Se elabora un coctel con todos los ingredientes necesarios para una amplificación

exitosa del ADN de interés, generalmente buffer de reacción (1X), MgCl2 (2,42mM), dNTP´s

(0,45mM), iniciador o primer (1,33mM), enzima taq polimerasa (0,067 u/ µl), BSA (0,67

mg/ml), ADN y agua para un volumen final de reacción de 15 µl.

Mezcla (1 reacción) Mezcla (100 reacciones)

Reactivo Volumen (ul) Volumen (ul)

Buffer (5x) 3.0 300

MgCl2 1.46 146

dNTP´s 0.34 34

Primer 2.0 200

Taq 0.2 20

BSA 1.0 100

H2O 6.0 600

ADN 1.0

15 ul 1200 ul

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PREPARACIÓN DE GELES DE AGAROSA

La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y

caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un

tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma.

Así, moléculas de ADN de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una

electroforesis en gel de agarosa.

En dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de

ADN de tamaño conocido) para poder estimar el tamaño aproximado del ADN en estudio.

Preparación del gel de agarosa

1. Preparar un gel de agarosa al 1,5% disueltos en buffer TBE 0,5X. Para ello

pesaremos la cantidad adecuada de agarosa y se vierte en el volumen de buffer

utilizando un matraz.

2. Fundir la solución de agarosa en un microondas por 1 min 30 s

3. Enfriar hasta que la solución alcance unos 50ºC aproximadamente.

4. Preparar durante este período la cámara de electroforesis donde se verterá la

solución colocando correctamente un peine, formando los pocillos del gel, donde se

colocará cada muestra de ADN amplificado por PCR.

5. Permitir la polimerización durante unos 30 min

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Tampón de electroforesis 10X TBE

Trizma Base 108 g

Ácido Bórico 55 g

EDTA 0.5 M 40 mL

Llevar el pH a 8.3. Ajustar volumen final a 1 L con agua destilada.

CORRIDA

Se conectan los polos de la cámara electroforética y se establecen las condiciones

de corrida, utilizando 100 Voltios constantes, 400 mAmperios. La corrida se realiza hasta que

el color amarillo en la escalera de ADN patrón alcance menos de 2 cm del final del gel.

TINCIÓN

El gel se retira de la cámara y se coloca en una bandeja con Diamond Dye (1:10000)

de Promega con agitación suave por 20 min.

DIGITALIZACIÓN

Para visualizar las bandas amplificadas (Promega) el gel se coloca en un aparato

Enduro GDS y se activa la luz UV. Se fotografía digitalmente el gel para el análisis

correspondiente de las bandas obtenidas.