extraccion adn

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LABORATORIO DE BIOCIENCIAS EXTRACCION DEL ADN Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

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Page 1: Extraccion ADN

LABORATORIO DE BIOCIENCIAS

EXTRACCION DEL ADN

Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICASMsc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

Page 2: Extraccion ADN

CONTENIDOCONTENIDO

Generalidades sobre el ADNGeneralidades sobre el ADN

Muestras para extracción del ADNMuestras para extracción del ADN

Condiciones sobre la remisión de Condiciones sobre la remisión de muestras.muestras.

Métodos de extracción del ADNMétodos de extracción del ADN

- - Salting outSalting out

Page 3: Extraccion ADN

EL MATERIAL GENÉTICOEL MATERIAL GENÉTICO

Page 4: Extraccion ADN

CROMOSOMACROMOSOMASS

46 CROMOSOMAS 46 CROMOSOMAS 23 PARES23 PARES

DIPLOIDESDIPLOIDES

UN INDIVIDUOUN INDIVIDUOTIENE 23 CROMOSOMAS TIENE 23 CROMOSOMAS

HEREDADOS DE LA HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 MADRE Y 23

HEREDADOS DEL PADREHEREDADOS DEL PADRE

Page 5: Extraccion ADN

EL MATERIAL GENÉTICOEL MATERIAL GENÉTICO

Es el responsable de transmitir los caracteres heredados de una generación a otra.

Está conformado por millones de unidades de nucleótidos

Cada nucleótido esta a su vez formado por:Base nitrogenada, Azúcar y grupo fosfato

Page 6: Extraccion ADN

EL MATERIAL GENETICO

BN

BN

A

P

BN

AP

BN

A

PBASES

NITROGENADAS

BN

BN

BN

ADENINA

GUANINA

CITOSINA

TIMINA

Page 7: Extraccion ADN

REGIONES DEL ADN

De secuencia única (genes)

Medianamente repetitivas

Altamente Repetitivas

Page 8: Extraccion ADN

CROMOSOMACROMOSOMA

p

qGEN

ADN

REGIONESREPETIDAS

HETEROCROMATINA

EUCROMATINA

Page 9: Extraccion ADN

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN .

Cantidad de material de partida Cantidad de material de partida Número de copias de las moléculas de ANNúmero de copias de las moléculas de AN Cantidad de tejido Cantidad de tejido

Condiciones en las que se encuentra el Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, material de inicio (fresco, congelado, fijado)fijado)

Contaminantes e interferentes en el Contaminantes e interferentes en el material biológicomaterial biológico

Page 10: Extraccion ADN

MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN

SangreSangre SemenSemen SalivaSaliva CabelloCabello HuesoHueso DienteDiente TejidoTejido

Page 11: Extraccion ADN

MUESTRAS PARA EXTRACCION DEL ADN

Sangre: derivados porfirinicos de la Sangre: derivados porfirinicos de la Hemoglobina. Hemoglobina.

Manchas: secado.Manchas: secado. Residuo metanolico: Chelex.Residuo metanolico: Chelex. Soportes: Absorbente o no.Soportes: Absorbente o no.

Page 12: Extraccion ADN

REMISION PARA ANALISIS DE POLIMORFISMO MOLECULAR

La posibilidad de extraer el material genético La posibilidad de extraer el material genético en cualquier indicio biológico. en cualquier indicio biológico.

Análisis por medio de técnicas como la Análisis por medio de técnicas como la PCR ,ha permitido obtener ADN a partir de PCR ,ha permitido obtener ADN a partir de indicios biológicos en cantidades escasasindicios biológicos en cantidades escasas

Page 13: Extraccion ADN

REMISION DE LAS MUESTRAS PARA ANALISIS DEL ADN

NORMAS DE BIOSEGURIDAD. CADENA DE CUSTODIA. FORMATOS EN CASOS ESPECIFICOS.

Page 14: Extraccion ADN

PROTECCION DEL PERSONAL

Prevenir contacto directoPrevenir contacto directo Prohibir consumo de comidas y Prohibir consumo de comidas y

bebidas.bebidas. Condiciones de asepsia y Condiciones de asepsia y

material desechable.material desechable. Vacunación.Vacunación.

Page 15: Extraccion ADN

PROTECCION DE LA PROTECCION DE LA MUESTRAMUESTRA

CONTAMINACION POR MATERIAL CONTAMINACION POR MATERIAL BIOLOGICO HUMANO.BIOLOGICO HUMANO.

CONTAMINACION MICROBIOLOGICA.CONTAMINACION MICROBIOLOGICA.

CONTAMINACION QUIMICA.CONTAMINACION QUIMICA.

TRANSFERENCIA DE INDICIOS TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS.BIOLOGICOS.

Page 16: Extraccion ADN

CONTAMINACION POR MATERIAL

MATERIAL BIOLOGICO HUMANO

Depósito de material biológico Depósito de material biológico humano sobre las muestras, con humano sobre las muestras, con posterioridad a la toma de las posterioridad a la toma de las mismas.mismas.

Page 17: Extraccion ADN

CONTAMINACION MICROBIOLOGICA

Este tipo de contaminación tiene Este tipo de contaminación tiene lugar por el desarrollo de lugar por el desarrollo de microorganismos y suele estar microorganismos y suele estar favorecida por la humedad y las favorecida por la humedad y las altas temperaturas.altas temperaturas.

Page 18: Extraccion ADN

CONTAMINACION CONTAMINACION QUIMICAQUIMICA

Presencia de productos químicos que Presencia de productos químicos que dificultan procesos del análisis dificultan procesos del análisis genético, como PCR y extracción del genético, como PCR y extracción del ADNADN

Page 19: Extraccion ADN

TRANSFERENCIA DE TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS.INDICIOS BIOLOGICOS.

Debido al traslado de los Debido al traslado de los indicios de una localización a indicios de una localización a otra puede dar lugar a una otra puede dar lugar a una contaminación o puede contaminación o puede ocasionar la pérdida de la ocasionar la pérdida de la prueba. prueba.

Page 20: Extraccion ADN

DEGRADACION DE LAS DEGRADACION DE LAS MUESTRASMUESTRAS

Humedad ambiental.Humedad ambiental. Fenómenos meteorológicos, acción de Fenómenos meteorológicos, acción de

insectos, entre otros.insectos, entre otros. Recogida y envió al laboratorio de estas Recogida y envió al laboratorio de estas

evidencias de una manera adecuada para evidencias de una manera adecuada para evitar la proliferación bacteriana y por evitar la proliferación bacteriana y por consiguiente la degradación del material consiguiente la degradación del material genéticogenético

Page 21: Extraccion ADN

DEGRADACION DE LAS MUESTRAS

Exponer por mucho tiempo las muestras a Exponer por mucho tiempo las muestras a los rayos ultravioleta provoca los rayos ultravioleta provoca daños sobre daños sobre la estructura del ADN,la estructura del ADN, o aplicar ciertos o aplicar ciertos conservantes que puedan provocar efectos conservantes que puedan provocar efectos sobre la cadena del ADN.sobre la cadena del ADN.

Page 22: Extraccion ADN

DOCUMENTOS NECESARIOS

Formulario de envio de muestras.Formulario de envio de muestras.

Identificacion de Muestras.Identificacion de Muestras.

Cadena de Custodia.Cadena de Custodia.

Page 23: Extraccion ADN

FORMULARIO ENVIO DE MUESTRAS

Investigacion solicitada: Investigacion restos Investigacion solicitada: Investigacion restos de sangre.de sangre.

Antecedentes y datos sobre el caso: Causa de Antecedentes y datos sobre el caso: Causa de los hechos, lugar, fecha.los hechos, lugar, fecha.

Datos de la victima: Edad, sexo, Grupo Datos de la victima: Edad, sexo, Grupo poblacional, causa de la muerte, relacion con poblacional, causa de la muerte, relacion con el sospechoso.el sospechoso.

Datos del sospechoso: Datos del sospechoso:

Page 24: Extraccion ADN

IDENTIFICACION DE LAS IDENTIFICACION DE LAS MUESTRASMUESTRAS

Listado de muestras de referencia: Listado de muestras de referencia: Numero, tipo de muestra, Nombre de Numero, tipo de muestra, Nombre de la persona, relación con el caso.la persona, relación con el caso.

Listado de indicios biológicos: numero Listado de indicios biológicos: numero de referencia, tipo de muestra (toma de referencia, tipo de muestra (toma vaginal), a quien pertenece y vaginal), a quien pertenece y localización, tipo de indicio a estudiar.localización, tipo de indicio a estudiar.

Page 25: Extraccion ADN

CADENA DE CUSTODIACADENA DE CUSTODIA

Nombre o identificación, firma.Nombre o identificación, firma.

Fecha y hora de la recogida.Fecha y hora de la recogida.

Condiciones de almacenaje de las Condiciones de almacenaje de las muestras hasta su envío.muestras hasta su envío.

Page 26: Extraccion ADN

METODOS DE EXTRACCIONMETODOS DE EXTRACCIONDE ADNDE ADN

SALTING – OUTSALTING – OUT

CHELEX CHELEX

FENOL - CLOROFORMOFENOL - CLOROFORMO

Page 27: Extraccion ADN

FENOL CLOROFORMO

Técnica Orgánica (Solventes)Técnica Orgánica (Solventes) ADN de muy buena calidad y cantidad.ADN de muy buena calidad y cantidad. Peptidos y proteinas son extraidas en la Peptidos y proteinas son extraidas en la

fase organicafase organica (Fenol), (Fenol), después se realiza después se realiza digestión condigestión con proteinasa K. proteinasa K.

El cloroformo permite que todo el fenol El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado.pueda ser lavado.

DESVENTAJASDESVENTAJAS: : - Reactivos altamente tóxicosReactivos altamente tóxicos- Perdidas significativas de ADN y mucho Perdidas significativas de ADN y mucho

mas si esta degradado.mas si esta degradado.

Page 28: Extraccion ADN

CHELEX Técnica inorgánicaTécnica inorgánica

Previene la degradación del ADN por quelación Previene la degradación del ADN por quelación de los iones metálicos durante la ebullición al de los iones metálicos durante la ebullición al 5%.5%.

Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- inones iminodiacetato.inones iminodiacetato.

los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN.los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN.

DESVENTAJASDESVENTAJAS:: El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado

en PCR pero no en RFLPS.en PCR pero no en RFLPS.

Page 29: Extraccion ADN

SALTING-OUTSALTING-OUT

Técnica de tipo inorgánica Utiliza reactivos bajos en

toxicidad Permite visualizar la malla del

ADN.

Desventajas: Requiere una mayor cantidad de muestra.

Page 30: Extraccion ADN

1. Lisis Celular1. Lisis Celular

2. Extracción2. Extracción

3. Precipitación3. Precipitación

4. Resuspensión4. Resuspensión

SALTING OUTSALTING OUT

Page 31: Extraccion ADN

LISIS CELULARLISIS CELULAR

Buffer de lisis I: (Buffer de lisis I: (lisis glóbulos rojoslisis glóbulos rojos).).

- Sucrosa- Sucrosa

- MgCl2 1M- MgCl2 1M

- Triton x 100- Triton x 100 Buffer de lisis II: (Buffer de lisis II: (lisis glóbulos lisis glóbulos

blancos)blancos)

EDTA de NaEDTA de Na

NaCL.NaCL.

Page 32: Extraccion ADN

EXTRACCION

Lauril sulfato de sodio al 10%: Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinasdespolariza las proteinas

Perclorato de sodio 5MPerclorato de sodio 5M NaCl 6MNaCl 6M

Page 33: Extraccion ADN

PRECIPITACION

IsopropanolIsopropanol

Etanol al 70% lava el exceso de Etanol al 70% lava el exceso de sales.sales.

Page 34: Extraccion ADN

RESUSPENSION

Se realiza en Buffer T. E. ( Tris Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o también se puede EDTA) o también se puede realizar en agua.realizar en agua.

Page 35: Extraccion ADN

EXTRACCION SALTING OUT

Page 36: Extraccion ADN

CONCLUSIONES El ADN es el material genético a través del cual El ADN es el material genético a través del cual

se transmite la información contenida en los se transmite la información contenida en los genes de generación en generación.genes de generación en generación.

El ADN esta presente en los indicios biológicos El ADN esta presente en los indicios biológicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc.etc.

Es muy importante conocer las condiciones para Es muy importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras.la remision adecuada de las muestras.

El Salting-out es uno de los métodos de El Salting-out es uno de los métodos de extracción de ADN mas utilizados por su fácil extracción de ADN mas utilizados por su fácil implementacion, baja toxicidad de los reactivos y implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN.permite la visualizacion del ADN.

Page 37: Extraccion ADN

BIBLIOGRAFIA MARTINEZ JARRETA, M Begoña. La prueba MARTINEZ JARRETA, M Begoña. La prueba

del ADN en medicina forense. Masson: del ADN en medicina forense. Masson: Buenos Aires.1999.Buenos Aires.1999.

Grupo Español y portugués de la ISFG. Grupo Español y portugués de la ISFG. Recomendaciones para la recogida y envío Recomendaciones para la recogida y envío de la muestras con fines de identificación de la muestras con fines de identificación genética. Madeira, 2 de Junio 2000.genética. Madeira, 2 de Junio 2000.

MILLER S, DYKES D, POLESKY H, A simple MILLER S, DYKES D, POLESKY H, A simple salting out procedure for extracting DNA salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells, Nucl. Ac. Res. from human nucleated cells, Nucl. Ac. Res. 16: 1215. 1988.16: 1215. 1988.

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