extraÇÃo de dna (3) - bteduc.com · extrair o dna de frutas com diferente grau de amadurecimento....

Maria Antonia Malajovich / Guias de atividades

Biotecnologia: ensino e divulgação

http://www.bteduc.bio.br

Guia 70

EXTRAÇÃO DE DNA (3)

A EXTRAÇÃO DE DNA

Muitas pesquisas de Biologia Molecular começam com a extração de ácidos nucleicos. A lise celular

libera as moléculas em uma fase aquosa que é separada dos restos celulares por centrifugação. As

proteínas são removidas da fase aquosa por solventes orgânicos (fenol, clorofórmio). O DNA, que

permanece na fase aquosa, é precipitado com etanol e, posteriormente, purificado e suspendido

em um buffer adequado.

A existência de kits comerciais tem mudado a rotina de muitos laboratórios. Nos kits, os solventes

orgânicos são substituídos por filtros que retém o DNA, em condições de concentração salina

elevada. A eluição do DNA retido no filtro ocorre em baixa concentração salina.

A PRÁTICA NO LABORATÓRIO DE ENSINO

Por alguma razão que nos escapa, a extração de DNA é uma

atividade que entusiasma a alguns e decepciona a outros.

Provavelmente, as diferenças de opinião tenham mais a ver

com a personalidade dos alunos e suas fantasias que com a

atividade em si.

As etapas possíveis no laboratório de ensino são as seguintes:

1. Trituramento do tecido, para separar as células.

2. Lise das membranas celulares com detergente, em uma solução salina, para liberar os ácidos

nucleicos e as proteínas.

3. Digestão das proteínas por ação enzimática de proteases (Opcional).

4. Precipitação com etanol gelado. O DNA é solúvel em álcool, mas torna-se insolúvel na presença

de sal (NaCl), porque o sódio neutraliza a carga negativa dos grupos fosfatos. O etanol formará

uma camada na superfície por ser menos denso que a solução aquosa.

5. Observação de agregados moleculares, de consistência mucoide, na interface entre a solução

aquosa e o álcool.

Os agregados moleculares obtidos são uma mistura em proporção variável de ácidos nucleicos,

proteínas e pectina, um carboidrato presente na lamela intercelular e no vacúolo das células

vegetais.

BIBLIOGRAFIA

MADDEN D. Discovering DNA. Science in School 1: Spring 2006.

http://www.scienceinschool.org.

GENETIC SCIENCE LEARNING CENTER. How to extract DNA from anything living.

http:// learn.genetics.utah.edu

EXTRAÇÃO DE DNA (3) / FONTES ALTERNATIVAS




Guia 70

ATIVIDADE PRÁTICA

OBJETIVO

Extrair DNA a partir de diversas fontes vegetais.

MATERIAIS

Uma fonte vegetal de DNA, sal grosso, detergente neutro (lava louças), água fria, liquidificador ou

processador de alimentos, coador, béquer, amaciante de carne com protease (papaína), etanol

gelado, tubos de ensaio e grade (substituíveis por frascos pequenos ou copos), 1 pipeta ou

proveta, vareta de madeira ou agulha de crochet.

O etanol deve ser colocado no congelador, em frasco

fechado, pelo menos um dia antes da realização da prática.

PROCEDIMENTO

As membranas celulares e nucleares das células são desagregadas com detergente, em solução

salina, liberando os ácidos nucleicos que precipitam com a adição de etanol gelado.

A. Preparação da amostra

1. Escolher a fonte de DNA (Folhas, frutos, flores ou sementes)

2. Triturar o tecido

Bater no liquidificador (15-20 seg.), triturar no processador de alimentos (15 a 20 seg.) ou

esmagar manualmente o tecido em uma sacola plástica, até obter um volume aproximado de

100 ml. A quantidade de água a ser acrescentada depende da fonte vegetal escolhida.

3. Coar a massa, de maneira a obter um suco espesso.





Guia 70

Etanol gelado

B. Teste de pectina (Controle)

1. Separar uma parte do suco e misturar com uma quantidade equivalente de etanol (950).

2. Agitar a mistura, deixar repousar e observar o precipitado formado.

3. Interpretar.

Um coágulo transparente, bastante gelatinoso e firme indica alto teor de pectina; um coágulo

frágil, mais ou menos gelatinoso, que se rompe e divide em 2 ou 3 pedaços quando é feita uma

agitação leve indica um teor médio, moderado de pectina; um precipitado filamentoso

granulado, que se rompe em vários pedaços com agitação bastante leve indica baixo teor de

pectina.

C. Extração do DNA

1. Lise das membranas celulares.

No resto do suco, dissolver uma pitada de sal grosso antes de acrescentar duas colheres, das

de sopa, de detergente. Misturar suavemente e deixar em repouso durante 5 a 10 minutos.

2. Digestão das proteínas.

Colocar uma pitada de amaciante de carne nos recipientes (tubos de ensaio, frascos, copos)

onde será realizada a extração. Distribuir suavemente o suco, sem ultrapassar 1/3 da

capacidade do recipiente.

3. Precipitação do DNA com etanol gelado.

Acrescentar um volume equivalente de etanol

950gelado. Esta etapa é crítica, deve-se inclinar

levemente o tubo e, muito devagar, deixar escorrer

o etanol sobre o líquido de maneira a formar uma

segunda camada por cima da solução.

Aguardar 10 minutos sem misturar as camadas e

observar os agregados moleculares que precipitam

na interface das duas e sobe até a superfície.

4. Observação dos agregados moleculares formados.

5. Comparar esses agregados com os formados no teste de pectina.

6. Retirar o DNA com uma vareta de madeira ou uma agulha de crochet





Guia 70

1 2 3

NOSSO COMENTÁRIO

Por motivos de biossegurança, descartamos a extração de DNA de fontes animais e humanas no

laboratório de ensino.

De um modo geral, a fonte de DNA deve ser suficientemente barata como para permitir multiplicar

as estações de trabalho. Tivemos muito bons resultados com o germe de trigo natural, mas nem

sempre o encontramos no comércio. As frutas são interessantes, a condição de escolher as de

baixo teor de pectina (abacaxi, acerola, maracujá, morango, pera, pêssego, caju etc.).

O procedimento de extração de DNA foi aplicado a várias fontes vegetais, utilizando um lava louças

(Limp) e um amaciante de carne como fonte de protease (Maggi). Paralelamente, repetiu-se o

procedimento com um lava roupas que contém enzimas (Ariel). Aplicou-se o teste de pectina como

controle.

A escolha da cebola se justifica por ser um clássico dos protocolos disponíveis na Web, mas

apresenta o inconveniente do cheiro forte e gera reclamações lacrimejantes. Além disso, a maior

parte dos agregados formados parece ser de pectina (Figura 1).

Figura 1: Extração de DNA de cebola roxa.

1: teste de pectina; 2: extração com lava louças e protease; 3: extração com um lava roupas

líquido com enzimas.





Guia 70

A couve foi um sucesso totalmente inesperado (Figura 2). O aspecto dos aglomerados no teste de

pectina e nos testes de extração é muito diferente, indicando que estaríamos em presença de DNA.

No teste da pectina, na camada superior se observam restos de tecido que a coagem não elimina.

Tal vez fosse conveniente substituir o coador por um filtro de pano ou de papel.

Os experimentos realizados com kiwi e maracujá foram desapontadores (Figuras 3 e 4). Tal vez

porque as frutas não estivessem suficientemente maduras. O resultado com o abacaxi é

interessante, mas faltou o teste de pectina.

Figura 2: Extração de DNA de couve



1 2 3





Guia 70

1 2 3

Figura 3: Extração de DNA de maracujá

1: teste de pectina; 2: extração com um lava roupas líquido com enzimas; 3: extração com lava

louças e protease.

Figura 4: Extração de DNA de kiwi



1 2 3





Guia 70

Figura 5: Extração de DNA de kiwi e abacaxi.

COMO MONTAR UM PROJETO

Extrair o DNA de frutas com diferente grau de amadurecimento.

Extrair o DNA de frutas tropicais.

Kiwi Abacaxi

extraÇÃo de dna (3) - bteduc.com · extrair o dna de frutas com diferente grau de amadurecimento....

Documents