expresión de cdh2 en la biopsia de cáncer …tlamati.uagro.mx/t7e1/46.pdf · ... leucemias y...

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, Septiembre 2016

3er. Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT

Acapulco, Guerrero 22-24 de Septiembre 2016

Memorias

485

Expresión de CDH2 en la biopsia de cáncer cervicouterino positiva la variante

AA-c de E6 del VPH16.

Josué Zurita Pablo (Becario)

[email protected]

Unidad Académica Preparatoria No. 41, Universidad Autónoma de Guerrero.

Dra. Olga Lilia Garibay Cerdenares (Asesor)

[email protected]

Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero.

Introducción

El cáncer se caracteriza por la proliferación descontrolada de células anormales, que tienen la

capacidad de secretar sustancias biológicamente dañinas, y tienen el potencial de invasión y

destrucción de los tejidos adyacentes o a distancia. (Generalidades )

El cáncer Cervicouterino (CaCU) es uno de los principales problemas de salud pública en las

mujeres a nivel mundial. El CaCU es la alteración celular que se origina en el epitelio del cuello

del útero y al inicio, se manifiesta a través de pequeñas lesiones precursoras, habitualmente en

una lenta y progresiva evolución en el tiempo. En grado variable, las lesiones, evolucionan a

displasia severa cuando compromete solo al epitelio superficial y luego a cáncer invasor cuando

el compromiso traspasa la membrana basal. (Ministerio de Salud, 2015)

La Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce varios tipos histológicos de CaCU, siendo

los dos principales:

1. Carcinoma de células escamosas (constituye cerca del 80-85% de todos los casos).

2. Adenocarcinoma (constituye cerca del 10-12% de todos los casos). (Ministerio de Salud,

2015)

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016

486

A nivel mundial el CaCU ocupa cuarto lugar en los tipos de cáncer de origen ginecológico, y el

séptimo de todos los tipos de cáncer, con un estimado de 528,000 casos nuevos para el 2012. De

acuerdo a datos del GLOBOCAN, durante este mismo año se reportaron cerca de 266,000

muertes por cáncer cervical en todo el mundo, representando el 7.5% de todas las muertes por

cáncer en mujeres.

En México, el CaCU es la primera causa de muerte por neoplasias malignas entre las mujeres de

25 a 64 años. En el 2006 Guerrero se ubicó en el cuarto lugar a nivel nacional en la tasa de

mortalidad con 12.5% muertes, superando la tasa de mortalidad nacional que fue de 9.1% por

cada 100,000 mexicanas (Secretaria de Salud, 2006) y para el 2013 presentó la quinta tasa de

defunción más alta a nivel nacional por CaCU en mujeres de 25 años, con 14.1% por cada 100,00

mujeres (Secretaria de Salud, 2015).

Aun cuando se ha demostrado que la infección por los VPH- AR, dentro de los cuales se

encuentra el VPH16, promueve la alteración en la expresión de genes celulares relacionados con

procesos carcinogénicos, se requiere la validación funcional de estos resultados a partir de la

comparación de los perfiles de expresión proteica mediante tecnologías de reciente avance como

la Proteómica.

En el 2015 en un estudio realizado en el laboratorio de Biomedicina Molecular de la Facultad de

Ciencias Químico Biológicas de la UAGro, por Ortiz – Ortiz y colaboradores en la población

guerrerense se encontró la presencia de 27 variantes de E6 del VPH16. Dentro de las cuales la

más común fue la E-G350 (40%) seguida por la E- prototipo (13.03%), E-C188/G350 (11.82%),

AA-a (10.61%), AA-c (6.07%) y E-A176/G350 (5.15%), siendo la variante AA-a, E-A176/G350

y AA-c las que mostraron mayor riesgo de conducir al desarrollo de CaCU. (Ortiz-Ortiz, 2015)

Por último los resultados recientemente publicados por Zacapala-Gomez y colaboradores en el

2015 en este mismo laboratorio, demostraron que las variantes AA-a, AA-c y las EUR (E-G350,

E-A176/G350, E-C 188/G350) previamente reportadas, alteran la expresión de un total de 436

genes en células C-33A transfectantes estables con las variantes de E6, de los cuales fueron

validados un grupo de genes involucrados en adhesión celular (AMOTL1, CDH2, CDH6, CDH9,

COL11A1, NID1, NRCAM y CALCR). La expresión alterada de dichos genes sugiere que los

cambios presentes en la secuencia del gen E6 del VPH16 son suficientes para alterar el perfil

global de la expresión génica en una línea celular tumoral. (Zacapala-Gómez, 2015)

Memorias del 3er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT


487

Debido a que el laboratorio de Biomedicina Molecular cuenta con un Biobanco de biopsias de

tejido cervical provenientes del Instituto Estatal de Cancerología (IECan) “Dr. Arturo Beltrán

Ortega” ubicado en Acapulco Guerrero, se analizará la expresión de CDH2 en una biopsia

obtenida de una mujer guerrerense con CaCU positiva a la infección con VPH16 y con la variante

AA- c de E6 del VPH16.

Marco Teórico

¿Qué es el cáncer?

De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el cáncer es un proceso de crecimiento

y diseminación incontrolado de las células. La transformación de las células normales en células

cancerosas surge como consecuencia de daño al ADN, dando lugar a células inmortales en

continua división que pueden formar un tumor visible (Tumor primario) que invade el tejido

circundante y puede provocar metástasis en puntos distantes del cuerpo. (Generalidades, s.f.)

Los distintos tipos de cáncer tienen comportamientos diferentes tales como la tasa de

crecimiento, diseminación y respuesta al tratamiento, y se clasifican en etapas o estadios en

función del tumor primario (tamaño e invasión local) y de su extensión a otros órganos

(afectación ganglionar o metastásica). La estatificación se basa en las fases del desarrollo del

cáncer añadiendo otras variables como la localización anatómica, tipo de tumor, grado

histológico, extensión, etc; e información como la historia clínica, exploración física y

exploraciones complementarias. (Generalidades, s.f.)

De acuerdo al origen de las células canceras existen cinco tipos de cáncer: carcinomas, sarcomas,

linfomas, leucemias y mielomas. La extensión tanto local como a distancia de estos tipos de

cáncer permiten analizar las opciones terapéuticas y el pronóstico del paciente. (Generalidades,

s.f.)

El CaCU y su epidemiologia.

El Cáncer Cervicouterino (CaCU) es un problema de salud pública en mujeres a nivel mundial.

(Torre et al., 2015). El 80- 90% de los casos de CaCU tienen su origen en las células escamosas

del epitelio del cuello del útero, en donde la lesión precursora es la neoplasia intraepitelial del

cuello uterino (NIC), la cual puede evolucionar a carcinoma in situ (CIS) y después a cáncer


488

invasivo. Dicha progresión es lenta y en grado variable comprometiendo solo al epitelio

superficial y luego traspasa la membrana basal. (Ministerio de Salud, 2015)

A nivel mundial el CaCU ocupa cuarto lugar en los tipos de cáncer de origen ginecológico, y el

séptimo de todos los tipos de cáncer, con un estimado de 528,000 casos nuevos para el 2012. De

acuerdo a datos del GLOBOCAN, durante este mismo año se reportaron cerca de 266,000

muertes por cáncer cervical en todo el mundo, representando el 7.5% de todas las muertes por

cáncer en mujeres. (GLOBOCAN, 2012)

En México, el CaCU es la primera causa de muerte por neoplasias malignas entre las mujeres de

25 a 64 años. En el 2005 la tasa media nacional de mortalidad fue del 15.46 por cada 100,000

mujeres de 25 años o más, lo cual corresponde a 4,247 defunciones. En el 2006 Guerrero se ubicó

en el cuarto lugar a nivel nacional en la tasa de mortalidad con 12.5% muertes, superando la tasa

de mortalidad nacional que fue de 9.1% por cada 100,000 mexicanas (Secretaria de Salud, 2006)

y para el 2013 presentó la quinta tasa de defunción más alta a nivel nacional por CaCU en

mujeres de 25 años, con 14.1% por cada 100,00 mujeres (Secretaria de Salud, 2015).

La OMS reconoce dos tipos histológicos principales del CaCU:

1. Carcinoma de células escamosas (constituye cerca del 80-85% de todos los casos).

2. Adenocarcinoma (constituye cerca del 10-12% de todos los casos).

Otros tipos de carcinoma (carcinoma adenoescamosos, adenoidequisticos, neuroendocrinos,

metastásico) constituyen del 3-5% de casos restantes. (Ministerio de Salud, 2015)

El CaCU inicia como una lesión precursora conocida como Neoplasia Intraepitelial Cervical

(NIC) la cual consiste en un crecimiento descontrolado de las células escamosas del cuello

uterino. En la mayoría de los casos estas células permanecen estables o son eliminadas por el

sistema inmune del individuo sin intervención médica. Sin embargo un pequeño porcentaje de los

casos progresan a cáncer cervical, provocado por una célula invasora en un carcinoma de células

escamosas. La causa principal de las NIC es una previa infección de transmisión sexual, por el

virus del papiloma humano (VPH) principalmente los tipos oncogénicos 16 y 18.

http://www.ecured.cu/Sistema_inmune

http://www.ecured.cu/C%C3%A1ncer_cervical

http://www.ecured.cu/Carcinoma

http://www.ecured.cu/Virus_del_papiloma_humano



489

El sistema de clasificación de las NIC incluye a las lesiones escamosas precancerosas y las

clasifica en grados: NIC1, NIC2 y NIC3, tal como se indica en el siguiente cuadro y se muestra

en las figuras.

Cuadro 1. Clasificación de las NIC.

* Tabla modificada tomada de Jenkins, D. 2007. Histopathology and cytopathology of cervical

cancer. Dis Markers, 23(4):199-212.

Estadificación del CaCU.

Grado NIC Sistema Bethesda

Prueba histológica Prueba de cito e histológica

I Límites normales

II Inicio de cabios celulares ASC-

US/ASC-H

III NIC1

NIC2

NIC3

LEIBG

LEIAG

IV NIC3

V Carcinoma invasivo Carcinoma invasivo

Figura 1. Neoplasia Intraepitelial

Cervical 1 (NIC1) Figura 2. Neoplasia Intraepitelial

Cervical 2. (NIC2) Figura 3. Neoplasia Intraepitelial

Cervical 3. (NIC3)

http://www.ecured.cu/Archivo:NIC_1.jpg




490

De acuerdo a la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO), el CaCU puede

agruparse en cuatro estadios, cuyas características se encuentran en el cuadro 2. (Benedet et al.,

2000; Álvarez et al., 2012)

Debido al incremento en el número de casos de cáncer se optó por desarrollar un sistema para

medir los estadios del cáncer. El sistema TMN es un método de estadificación de neoplasias

desarrollado por la AJCC (American Joint Committe on Cancer) en colaboración con UICC

(Union Internacional contra el Cáncer). Su objetivo general es determinar correctamente el

estadio de los diferentes tumores. La extensión anatómica del tumor constituye la base de la

estadificación, los índices expresan la progresión de la enfermedad y se basa en componentes que

son el reflejo de la extensión del tumor:

T: Extensión del tumor primario, atendiendo al tamaño e invasión de las estructuras vecinas. El

estadio T0 representa un tumor que aún no ha iniciado su capacidad invasiva en los tejidos

locales, denominándose también in situ. (Gonzáles, 2004)

M: Extensión tumoral a los ganglios linfáticos regionales. Solo se incluyen en esta clasificación

los ganglios linfáticos del área del drenaje del tumor primario. La afectación de los ganglios

linfáticos a distancia se considera una enfermedad metastásica. La consideración de los cuales

son los ganglios regionales depende del tipo de cáncer. En general, la afectación extensa significa

la combinación de un mayor número de ganglios afectados, mayor extensión (tamaño de ganglios

afectados) y afectación ganglionar a mayor distancia (pero manteniéndose todavía en categoría de

ganglios regionales). (Gonzáles, 2004)

N: Analiza la presencia o no de metástasis a distancia. (Gonzáles, 2004)

Cuadro 2. Estadios del CaCU.

Categoría

TNM

Estadío

FIGO

Descripción

Tx El tumor primario no puede evaluarse.

T0 No hay evidencia de tumor primario.

Tis* Carcinoma In situ.

T1 I Carcinoma cervical confinado al útero.

T1a** IA Carcinoma invasor diagnosticado solo con microscopía.

T1a1 IA1 Invasión estromal < 3mm en profundidad y horizontal < 7mm

T1a2 IA2 Invasión estromal 3- 5mm de profundidad y horizontal < 7mm

T1b IB Lesión clínicamente visible confinada a cuello o lesión



491

microscópica mayor que IA1.

T1b1 IB1 Lesión clínicamente visible < 4cm en su mayor diámetro.

T1b2 IB2 Lesión clínicamente visible > 4cm en su mayor diámetro.

T2 II Carcinoma que invade más allá del útero, pero no compromete

la pared pelviana o el tercio inferior de la vagina.

T2a IIA Tu sin invasión de parametrios.

T2a1 IIA1 Lesión clínicamente visible < 4cm en su mayor diámetro.

T2a2 IIA2 Lesión clínicamente visible > 4cm en su mayor diámetro.

T2b IIB Tumor con invasión de parametrios, sin llegar a la pared

pelviana.

T3 III Tumor que se extiende a la pared pelviana y/o compromete el

tercio inferior de la vagina y/o hidronefrosis o alteración de la

función renal.

T3a IIIA El tumor compromete el tercio inferior de la vagina, sin

extensión a la pared pelviana.

T3b IIIB El tumor se extiende a la pared pelviana y/o causa

hidronefrosis o alteración función renal.

T4 IVA El tumor invade la mucosa de la vejiga o del recto y/o se

extiende más allá de la pelvis.

N1*** IIIB El tumor se extiende a la pared pelviana y/o causa

hidronefrosis o alteración de la función renal, con presencia de

ganglios linfáticos regionales metastásicos.

M1 IVB Metástasis a distancia.

(Ministerio de Salud, 2015)

Los VPH- AR y su relación con el CaCU.

El virus del papiloma humano (VPH) pertenece a la familia de los Papillomaviridae, y tiene un

genoma de ADN de doble cadena de aproximadamente 8,000 pares de bases. De acuerdo a su

oncogenicidad, los VPHs se clasifican en VPHs de alto riesgo (VPH- AR) y VPHs de bajo riesgo

(VPH- BR).

De los más de 100 tipos de VPH descritos, de los VPH-AR como el

16,18,31,35,39,45,51,52,56,58 y 59 existe evidencia suficiente de su carcinogenicidad (de

Villiers, et al., 2004, Muñoz, et al., 2006). La infección por el VPH16 y 18 es responsable del

25% de las neoplasias intraepiteliales cervicales tipo 1(NIC1) y del 70% de las NIC2 y NIC3.

Los subtipos 16, 18, 31, 33 y 45 son encontrados en 63-97% de los CaCU invasores. El VPH16

es el genotipo más frecuente en el CaCU, detectándose en más del 50% de los casos de CaCU a

nivel mundial (Guan, 2012)


492

La integración del ADN del VPH16 provoca el rompimiento del gen E2, lo cual resulta en una

alteración en los mecanismos regulatorios de la replicación viral.

El estado integrado del VPH16 en el genoma de la célula está asociado a la persistencia de la

infección y progresión de las lesiones cervicales, las cuales representan un riesgo en la progresión

del CaCU. Después de la infección, el VPH16 está presente en su forma episomal pero cuando el

ADN viral se integra, la sobreexpresión de sus oncogenes virales E6 y E7 se activa, y con ello la

propiedad que tienen sus proteínas de formar complejos e inactivar a otras proteínas celulares.

(Ganguly and Parihar, 2009).

Las oncoproteínas E6 y E7 de los VPH- AR pueden provocar alteraciones en el ciclo celular,

inactivando las proteínas supresoras de tumores, lo que provoca inestabilidad cromosómica y

Figura 4. Genoma del VPH16. El genoma del VPH16 está

dividido en tres regiones: Una región que contiene los

genes tempranos (E1, E2, E4, E5, E6 y E7), una región que

contiene los genes tardíos (L1 y L2) los cuales codifican

para con las proteínas de la cápside mayor y una región

larga de control (LCR, por sus siglas en ingles) que

controla la replicación viral.



493

transformaciones celulares malignas, inmortalización y carcinogénesis. (Narisawa-Saito and

Kiyono, 2007; Yim and Park, 2005).

E6 es la oncoproteína viral más estudiada del VPH16. Está constituida por 151 aminoácidos, y

tiene como característica estructural la presencia de dos dedos de zinc, que tienen funciones como

la activación transcripcional, la transformación e inmortalización celular. (Boulet et al., 2007;

Ghittoni et al., 2010). E6 induce la degradación de la proteína supresora de tumor p53 vía

proteasoma y descontrola la progresión del ciclo celular provocando un crecimiento acelerado de

las células. (Yim and Park, 2006; Ganguly and Parihar, 2009)

La Proteómica en el diagnóstico del CaCU.

Debido a que con las técnicas de diagnóstico convencionales no es suficiente detectar el CaCU en

estadios tempranos y estudiar la progresión de la enfermedad, uno de los principales enfoques de

la tecnología es la búsqueda de biomarcadores de enfermedad mediante el uso de técnicas de

reciente avance como la Proteómica.

La Proteómica es uno de los campos que puede ayudar a establecer conexiones entre las

secuencias genómicas (genes) y su función biológica (proteínas). Es el estudio a gran escala de

todas las proteínas que se expresan en una célula a partir de su genoma mediante métodos

bioquímicos. El análisis proteómico requiere de otras ciencias como bilogía molecular,

bioquímica, microbiología y bioinformática, siendo esta última de gran importancia para el

desarrollo de ordenadores de máxima capacidad para organizar gran cantidad de información que

se genera en las diversas investigaciones científicas. (Pando- Robles, 2009)

Existen tres ramas en la Proteómica que tratan de caracterizar a las proteínas estudiando de estas

distintos aspectos:

- Proteómica de expresión: Se encarga del estudio de la abundancia de proteínas y sus

modificaciones pos- traduccionales.

- Proteómica Estructural: Se encarga de caracterizar la estructura tridimensional de las

proteínas.

- Proteómica Funcional: Se encarga de la localización y distribución subcelular de proteínas

y de sus interacciones, así también de otras moléculas para determinar su función.


494

Las técnicas más usadas en la Proteómica se basan en la electroforesis unidimensional y

electroforesis bidimensional, en la cual las proteínas se separan de acuerdo a su peso molecular y

peso molecular/ punto isoeléctrico, respectivamente; y en la espectrometría de masas, en la que

las proteínas son detectadas en base a su huella peptídica. (Morales-Sánchez y Gallo-Ramírez,

2006).

Con la tecnología Proteómica se puede identificar, caracterizar y clasificar proteínas, basándose

en la función que desempeñen y sus interacciones. El análisis del proteoma ha sido de gran ayuda

en la identificación de proteínas como marcadores de diagnóstico y pronostico en el desarrollo y

progresión del CaCU.

Proteínas: Biomarcadores de diagnóstico y pronóstico en el CaCU.

Los recientes avances en la Proteómica han impulsado el descubrimiento de nuevos

biomarcadores tumorales que son útiles en la detección y pronostico del CaCU. Por estas razones

actualmente se considera a la Proteómica una herramienta importante para el descubrimiento de

nuevos biomarcadores que favorecerán a salud pública. Durante los últimos años la genómica,

Proteómica y bioinformática han experimentado un sorprendente desarrollo en los avances de la

medicina.

Cada vez es más frecuente el uso de biomoléculas para obtener información relativa al desarrollo

de procesos biológicos aplicables a la producción industrial como diagnóstico y pronóstico de

enfermedades, la monitorización de tratamientos, incluso el diseño de nuevos medicamentos.

Los biomarcadores son moléculas que sirven como indicadores del estado fisiológico y también

de los cambios que se producen durante el proceso y que desembocan en el desarrollo y

establecimiento de un padecimiento, y cuyos requisitos fundamentales son una elevada

especificidad y sensibilidad. Se realiza una búsqueda intensa de biomarcadores de diferentes

afecciones mediante Proteómica. (Pando- Robles, 2009)

La identificación de proteínas que intervienen en diversas etapas de una enfermedad ayudará a

comprender las bases moleculares y naturaleza de dicha anomalía, de la misma manera, estas

proteínas identificadas pueden utilizarse como biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de

dicha enfermedad.



495

Las proteínas como marcadores tumorales se asocian al diagnóstico y pronostico del CaCU,

pueden ser utilizadas para la el monitoreo en curso del tratamiento, remisión y recurrencia

mientras la paciente recibe cirugía, radiación y quimioterapia. Estudios realizados demostraron

que los oncogenes E6 y E7 se interponen a los procesos celulares normales y han propuesto a la

expresión de su ARNm como posible biomarcador en la detección del CaCU. Otro de los

biomarcadores más comunes en el diagnóstico del CaCU incluyen a p16INK4A, SSC- Ag (antígeno

de carcinoma de células escamosas), Ki-67, MCM y TOP2A. (Breuer and Murph, 2011).

Existen estudios en los cuales la expresión de algunos ARNs pequeños como los microRNAs

(por sus siglas en inglés) se han propuesto como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico

del CaCU. Para el análisis proteómico se utilizan también modelos in vivos (ratones transgénicos)

de cáncer para analizar el papel de las oncoproteínas E6 y E7 en la adhesión celular, proliferación

e invasión. (Martinez, Medicina y Ciencias de la Salud, 2011).

La infección por VPH genera una respuesta inmune humoral contra las proteínas de la capside L1

y L2, la cual puede ser neutralizada. También se genera una repuesta de anticuerpos contra las

proteínas tempranas del virus, que no es protectora y que hasta ahora se utiliza para el estudio de

la biología del virus y la eficacia de las vacunas contra el HPV. Diversos estudios sugieren que la

respuesta humoral contra proteínas tempranas de HPV puede ser utilizada como biomarcador del

estado de la infección y/o del estadio de la lesión cervical.

Resultados no publicados obtenidos en el Laboratorio de Biomedicina Molecular de la Unidad

Académica de Ciencias Químico Biológicas (UACQB) de la Universidad Autónoma de Guerrero

(UAGro) para la búsqueda de proteínas de expresión diferencial de en biopsias de tejido cervical

con CaCU (no tipificadas) se mostraron mediante análisis proteómico 15 proteínas con expresión

diferencial involucradas en el metabolismo celular, ciclo celular y trafico vesicular, dentro de las

cuales las proteínas S100A9, S100A8 y FABP4 se encontraron sobre expresadas. Las proteínas

identificadas fueron analizadas por MALDI- TOF MS y posteriormente analizadas in silico para

evaluar su papel probable en el proceso tumoral.


496

Cadherinas y su relación con el CaCU.

Las Cadherinas son proteínas de adhesión celular dependientes de calcio, preferentemente

interactúan con ellas mismos de una manera homofílica en la conexión de las células, esta familia

de adhesión está formada de más de 100 miembros que se dividen en seis subgrupos, las de tipo 1

y 2, desmocolinas, desmogléinas y cadherinas flamingo. En las primeras se han realizado

estudios que arrojan que este grupo está formado por la Cadherinas-E (epitelial), la P (placenta)

y la N (neural) que se nombraron dependiendo del tejido donde se localizaron. (Córdova, 2008)

Una característica principal de las Cadherinas es su capacidad de unirse con otras Cadherinas de

su misma familia para formar cadenas que unirán las células. La adhesión entre las células y la

matriz extracelular son fundamentales para mantener la organización estructural y funcional de

los tejidos (Córdova, 2008). Las Cadherinas son un grupo de proteínas que participan en la

adhesión celular. Su estudio en células y tejidos ha desencadenado su relación directa con el

proceso metastático de los tumores, la metástasis inicia con la degradación de la interacción local

célula-célula, alterando la membrana basal, invadiendo e infiltrando tejido circunvecino,

alcanzando y penetrando al interior de los vasos sanguíneos o linfáticos (intravasación),

provocando la transportación de células neoplásicas por el torrente sanguíneo.

Las células se adhieren entre si y a la matriz extracelular a través de proteínas llamadas moléculas

de adhesión celular (CAM). Las CAM pueden ser moléculas de adhesión célula-célula o

moléculas de adhesión matriz extracelular-célula. Un tipo de molécula que participa en la unión

entre células son las Cadherinas siendo las principales moléculas que forman parte de las CAM

responsables de la adhesión célula-célula.

Las Cadherinas tienen un dominio extracelular largo, que las une de manera homofílica a otras

Cadherinas, las cadenas formadas por las Cadherinas están mediadas por Ca2+ en tejidos de

vertebrados. Estas moléculas de adhesión intervienen en el reconocimiento celular, la

morfogénesis del tejido y la supresión de tumores Los cambios en la expresión de las cadherinas

juegan un papel crítico durante la progresión del tumor. La pérdida de expresión o función de la

Cadherina E en carcinomas epiteliales ha sido considerada como la razón principal para la

ruptura del contacto estrecho célula-célula del tejido epitelial, conduciendo a la progresión de



497

tumores a un estado invasivo metastático. Estas moléculas juegan un papel importante en la

tumorigénesis epitelial. (Sánchez- Sánchez, 2005)

En el 2015 en un estudio realizado en el laboratorio de Biomedicina Molecular de la Facultad de

Ciencias Químico Biológicas de la UAGro, por Ortiz – Ortiz y colaboradores en la población

guerrerense, se encontró la presencia de 27 variantes de E6 del VPH16. Dentro de las cuales la

más común fue la E-G350 (40%) seguida por la E- prototipo (13.03%), E-C188/G350 (11.82%),

AA-a (10.61%), AA-c (6.07%) y E-A176/G350 (5.15%), siendo la variante AA-a, E-A176/G350

y AA-c las que mostraron mayor riesgo de conducir al desarrollo de CaCU. (Ortiz-Ortiz, 2015)

Por último los resultados recientemente publicados por Zacapala-Gomez y colaboradores en el

2015 en este mismo laboratorio, demostraron que las variantes AA-a, AA-c y las EUR (E-G350,

E-A176/G350, E-C 188/G350) previamente reportadas, alteran la expresión de un total de 436

genes en células C-33A transfectantes estables con las variantes de E6, de los cuales fueron

validados un grupo de genes involucrados en adhesión celular (AMOTL1, CDH2, CDH6, CDH9,

COL11A1, NID1, NRCAM y CALCR). La expresión alterada de dichos genes sugiere que los

cambios presentes en la secuencia del gen E6 del VPH16 son suficientes para alterar el perfil

global de la expresión génica en una línea celular tumoral. (Zacapala-Gómez, 2015)

Como parte del 3er Verano de Investigación Científica “Asómate a la ciencia este verano”, se

realizó una estancia de investigación en el Laboratorio de Biomedicina Molecular de la UACQB

de la UAGro., en la cual se analizó la expresión de CDH2 una biopsia de CaCU positiva a la

variante AA-c de E6 del VPH16. Dicha estancia de investigación se llevó a cabo en el período

comprendido del 27 de Junio al 05 de Agosto del 2016, bajo la tutoría de la Dra. Olga Lilia

Garibay Cerdenares.

Planteamiento del problema

¿Existirá expresión de CDH2 en la biopsia de CaCU positiva a la variante AA- c de E6 del

VPH16?

Hipótesis

Se encontrará expresión de CDH2 en la biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c de E6 del

VPH16.


498

Objetivos

Objetivo General:

Detectar la expresión de CDH2 en la biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c de E6 del

VPH16, proveniente del Biobanco del Laboratorio de Biomedicina Molecular de la Facultad de

Ciencias Químico Biológicas.

Objetivo Específico:

Detectar por Western Blot la expresión de CDH2 en la biopsia de CaCU positiva a la variante

AA-c de E6 del VPH16 proveniente del Biobanco del Laboratorio de Biomedicina Molecular.

Metodología

Procesamiento de las Muestras

Extracción de Proteínas.

La biopsia de tejido cervical criopreservada en All protect se lavó 3 veces con PBS 1X estéril. Se

eliminó el PBS y se agregó 1 ml de amortiguador de lisis (Tris-HCl 5 mM, EDTA 2 mM y

Nonidet P-40 al 1%) con inhibidores (10 µg/ml de TLCK, 1A, NEM, Na3VO4 y 5 µg/ml de E64)

+ 955 µg/ml de RIPA. La biopsia se maceró sobre un mortero y el lisado obtenido se centrifugó

a 13,200 rpm durante 10 min a 4 °C y se agitó en vórtex durante 3 min 3X. Se colectó el

sobrenadante y se etiquetó como extracto total (ET). Para la precipitación de proteínas se usó el

Kit de Calbiochem (Proteo Extract Protein Precipitation Kit No. de Cat. 539180) y luego la

muestra se calentó durante 5 min en agua hirviendo.

Cuantificación de proteínas

Las muestra se cuantificó utilizando el Kit Dc Protein assay (BIORAD, No. de Cat. 500-0114)

para la cuantificación de proteínas mediante DC Bradford (BIORAD, No. de Cat. 500-0205). Se

hicieron alícuotas de 2 µl de la muestra, 18 µl de agua destilada y 180 µl del reactivo de Bradford

(por duplicado). Las concentraciones de proteína se estimaron por absorbancia a 595 nm

(Bradford) comparando con una curva estándar obtenida a partir de una serie de diluciones de

Albúmina Sérica Bovina (BSA). Terminada la estandarización de la curva de BSA se continuó

con la cuantificación de proteína de las biopsias (ambos se leyeron en el Nanodrop 2000c

Spectrophotometer, Thermo Scientific). Las curvas estándar de concentración obtenidas se



499

compararon con la curva de la proteína de referencia BSA (BIORAD, No. de Cat. 500-0206),

leída a un espectro visible de longitud de onda de 595 nm con el NanoDrop 2000c

Spectrophotometer (Thermo Scientific), con un valor de R: 0.920.

Electroforesis unidimensional

Las muestras se sometieron a SDS-PAGE 1D a concentraciones de 10% para proteínas de peso

molecular que van desde 150 a 25 kDa. El corrimiento inició aplicando 80 V durante 20 min

aumentando el voltaje a 120 V durante 1 h aproximadamente. Los geles se tiñeron con azul de

Coomassie, el cual incrementa la sensibilidad para la detección de proteínas y la resolución en el

patrón de bandas mayores a 75 kDa y menores de 25 kDa.

Western Blot

Se realizó un Western Blot a partir de extractos de proteína total (1 mg), que se transfirieron a

una membrana de nitrocelusa, bloqueada con leche descremada en TBS-T 5% durante 1 h a TA y

se lavaron 10X con TBS-T 1X. La membrana se incubó con 1:2000 de anticuerpo primario anti-

CDH2 durante toda la noche la noche a 4°C. La membrana se lavó 10X con TBS-T (10 min c/u),

en seguida se incubó con el anticuerpo secundario anti-ratón IgG1 conjugado a HRP, (PIERCE,

Cat. No. 31430) y diluido en TBS-T leche al 2.5 % por 2 h. Luego, se aplicaron 5 lavados con

TBS-T (10 min c/u) y después la señal fue revelada por quimioluminiscencia en el C-DiGit.

Resultados

Características generales de las muestras.

Se tiene el registro de la biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c, obtenida de una paciente

guerrerense clínicamente diagnosticada con CaCU, proveniente del IECan de Acapulco, Gro., y

que se encuentra en el Biobanco del Laboratorio de Biomedicina Molecular la FCQB-UAGro y

que cuenta con datos de los expedientes y características clínicas, almacenadas en el programa

STATA 11.1 para su posterior análisis estadístico. En el siguiente cuadro se muestran las

características generales de la biopsia con folio CC231.


500

Cuadro 3. Características generales de la biopsia CC231.

Muestra No. Folio Genotipo

viral

Variante de

E6 del

VPH16

Estadio clínico

de acuerdo a

FIGO

1 CC-231 16 AA-c IB

Cuantificación de proteínas.

Para determinar la concentración de proteína presente en la biopsia de CaCU positiva a la

variante AA-c se realizó una curva estándar obtenida a partir de una dilución de albúmina sérica

bovina (BSA), para lo cual se pesaron 0.01 g de BSA y se disolvieron en 10 ml de agua destilada,

después se realizó lo siguiente

Cuadro 4. Cuantificación de proteínas.

Blanco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

H2O

destilada

20 µl 18 µl 16 µl 14 µl 12 µl 10 µl

BSA

0.01g

0 2 µl 4 µl 6 µl 8 µl 10 µl

Reactivo

de

Bradford

180 µl 180 µl 180 µl 180 µl 180 µl 180 µl

Los tubos se leyeron en el espectro visible a una longitud de onda de 595 nm en el NanoDrop

2000c Spectrophotometer (Thermo Scientific) y se obtuvo la siguiente curva con un valor de R=

0.960



501

Gráfica 1. Curva estándar de concentración de BSA por el método de Bradford.

Como parte fundamental para detectar la presencia de proteínas asociadas a adhesión celular en la

biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c, es importante evaluar la calidad del material

biológico de las biopsias criopreservadas en All protect (Qiagen, No de Cat. 76405), para lo cual

se realizó la extracción de proteínas a través del RIPA+ inhibidores y la cuantificación de

proteína mediante el método de Bradford (BIORAD, No. de Cat. 500-0205). La concentración de

proteína se estimó por absorbancia a 595 nm (Bradford) y se comparó con la curva de la proteína

de referencia BSA (BIORAD, No. de Cat. 500-0206), leída a un espectro visible de longitud de

onda de 595 nm con el NanoDrop 2000c Spectrophotometer (Thermo Scientific), con un valor de

R: 0.920.

Cuadro 5. Concentración de proteína de la biopsia con folio CC196 por el método Bradford.

Folio Variante de E6 del

VPH16

Concentración

(µg/µl)

CC-231 AA-c 3.6

0

2

4

6

8

10

12

Standard1 Standard2 Standard3 Standard4 Standard5

µl/ml

Avg. Abs.

Lineal (µl/ml)

R= 0.960

µl/ml


502

Electroforesis unidimensional

Como parte de la estandarización para la extracción de proteínas, se procesaron tres tejidos

obtenidos de una rata macho de la cepa Wistar (cerebelo, músculo y páncreas), los cuales fueron

proporcionados por la Dra. Mónica Espinoza Rojo profesor/investigador del Laboratorio DE

Biología Molecular y Genómica; y procesados a través de dos métodos: RIPA + inhibidores y

RIPA/Thio-urea+ inhibidores con el propósito de mejorar la obtención de proteína. Los extractos

obtenidos se analizaron en una electroforesis 1D y los resultados fueron los siguientes:

Figura 5. SDS-PAGE 1D al 10% con concentraciones de 10 a 70 µg de proteína. En la figura se

muestra una curva de concentración en un gel SDS-PAGE al 10% con concentraciones de 10 a 70

µg de proteína obtenida de músculo de rata con RIPA + inhibidores, teñido con Azul de

Figura. SDS-PAGE 1D al 10% con concentraciones de 10 a 70 µg de proteína.

MPM

kDa

150

100

75

50

37

25

20

10 20 30 40 50 60 70

µg DE PROTEÍNA



503

Coomassie. Se observan zonas con proteínas abundantes indicas en corchetes y alta resolución de

proteínas de bajo peso molecular a una concentraciones de 50 a 70 µg.

Figura 6. SDS-PAGE 1D al 10% con concentraciones de 10 a 70 µg de proteína. En la figura

se muestra una curva de concentración en un gel SDS-PAGE al 10% con concentraciones de 10 a

70 µg de proteína obtenida de músculo de rata con RIPA/Thio-urea + inhibidores, teñido con

Azul de Coomassie. Se observa alta resolución de proteínas de alto peso molecular pero la

intensidad en el patrón de bandas es baja. Se indican varias zonas con proteínas abundantes.

10 20 30 40 50 60 70

µg DE PROTEÍNA

MPM

kDa

150

100

75

50

37

25

15


504

Figura 7. Detección de CDH2 por quimioluminiscencia. Se realizó un Wester blot para detectar

la presencia de CDH2 en la biopsia CC-231 positiva a la variante AA-c del VPH16. La señal fue

revelada por quimioluminiscencia en el C-DGit a sensibilidad alta. Se observan dos bandas

correspondientes a la isoforma 1 (99.8 kDa) y a la isoforma 2 (97 KDa) de CDH2.

Conclusiones

Se estandarizaron dos métodos para la extracción de proteínas: RIPA+inhibidores de proteasas y

RIPA/Thio + inhibidores de proteasas, de los cuales el primero mostró alta resolución en la

separación de proteínas de bajo peso molecular (~100 kDa).

Se detectó por WB la presencia de las dos isoformas de CDH2 en la biopsia CC231 positiva a la

variante AA-c de E6 del VPH16.

99.8 KDa

97 KDa

CC-231



505

Referencias bibliográficas

1. GLOBOCAN. (2012).

2. Córdova, A. T. (2008). Cadherina-Cadherina: mecanismo de adhesión. 1-2.

3. Generalidades . (s.f.). eco Fundacion para la Excelencia y Calidad de la Oncologia, 3-11.

4. Gonzáles, B. S. (2004). TMN: Escala de estadiaje del cáncer. TMN: Escala de estadiaje del

cáncer, 1-2 .

5. Guan, P. H.-J. (2012). Human papillomavirus tyes in 115, 789 HPV- positive women: a meta-

analysis from cervical infection to cancer. Int J Cancer, 131:2349–59.

6. Martinez, J. C. (3 de Marzo de 2011). Medicina y Ciencias de la Salud. Recuperado el 10 de

Julio de 2016, de Marcador molecular para la deteccion del cancer cervicouterino :

http://www.innovacion.unam.mx/images/trans_fichas/medicina/Marcador_molecular.pdf

7. Ministerio de Salud. (2015). Cáncer Cervico Uterino. Guías Clínicas AUGE, 14-15.

8. Ortiz-Ortiz, L. d.-R.-L. (2015). Association of human papillomavirus 16 E6. Virology Journal.

9. Pando- Robles, H. L.-M. (2009). La importancia de la proteomica en la salud pública. 2-8.

10. Sánchez- Sánchez, J. M. (2005). PAPEL DE LAS CADHERINAS EN LA METÁSTASIS. 6-

7.

11. Sánchez, M. y.-R. (2006). Métodos Fisíco-Químicos en Biotecnología. Instituto de

Biotecnología, 1-7.

12. Zacapala-Gómez, O.-H. N.-S. (2015). Changes in globa lgene expression profiles induced by

HPV16 E6. Virology.

13. Secretaria de salud, SSA (2015) Defunciones de mujeres de 25 años y más por tumor

maligno del cuello del útero (C53), 2000-2013. Obtenida en Julio de 2016 de

http://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/12951/MortalidadCaCu2000a2013.pdf

14. Secretaría de Salud, SSA (2006). Dirección General de Información en Salud. México, 2006.

Obtenida en Octubre de 2015 de http://www.dgis.salud.gob.mx/descargas/xls/m_016.xls

15. Torre, L., Bray, F., Siegel, R., Ferlay, J., Lortet-Tieulent, J., and Jemal, A. (2015). Global

Cancer Statistics, 2012. CA Cancer J Clin; 65: 87-108.

http://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/12951/MortalidadCaCu2000a2013.pdf


506

16. Breuer, E., K. and Murph, M., M. (2011).The Role of Proteomics in the Diagnosis and

Treatment of Women's Cancers: Current Trends in Technology and Future Opportunities. Int J

Proteomics, 2011: 373584.

17. Benedet, J., L., Bender, H., Jones, H. 3rd, Ngan, H., Y. and Pecorelli, S. (2000). FIGO

staging classifications and clinical practice guidelines in the management of gynecologic cancers.

FIGO Committee on Gynecologic Oncology. Int J Gynaecol Obstet.

18. Ganguly, N. and Parihar, S., P. (2009). Human papillomavirus E6 and E7 oncoproteins as

risk factors for tumorigenesis. J Biosci, 34 (1):113-23.

19. Morales-Sánchez y Gallo-Ramírez (2006). Métodos físico-químicos en Biotecnología.

Plataformas de proteoma. Instituto de Biotecnología, UNAM, Cuernavaca, Mor, pp. 1-7.

20. Ghittoni R, Accardi R, Hasan U, Gheit T, Sylla B and Tommasino M (2010).The biological

properties of E6 and E7 oncoproteins from human papillomaviruses. Virus Genes., 40(1):1-13.

21. Narisawa-Saito M. and Kiyono, T. (2007). Basic mechanisms of high-risk human

papillomavirus-induced carcinogenesis: roles of E6 and E7 proteins. Cancer Sci, 98 (10):1505-

11.

22. Boulet G, Hor vath C, Broeck DV, Sahebali S and Vanden Bogers J (2007). Human

papillomavirus: E6 and E7 oncogenes. Int J Biochem Cell Biol, 39:2006-11.

23. Yim, E-K and Park, J-S. (2005). The Role of HPV E6 and E7 Oncoproteins in HPV-

associated Cervical Carcinogenesis. Cancer Res Treat., 37(6):319-324.

24. Ganguly, N. and Parihar, S., P. (2009). Human papillomavirus E6 and E7 oncoproteins as

risk factors for tumorigenesis. J Biosci, 34 (1):113-23.

expresión de cdh2 en la biopsia de cáncer …tlamati.uagro.mx/t7e1/46.pdf · ... leucemias y...

Documents