INVESTIGACION APLICADADiana C.CharajaRosmery Cardenas UrtadoDalia Chacon Sanchez

INTRODUCCIONActinomicetos

bacterias filamentosas parecidas superficialmente a los hongos.

El crecimiento es un micelio ramificado que tiende a fragmentarse en elementos bacterianos

Tiene un rol en la descomposición de materia orgánica: la celulosa y quitina.

Renuevan las reservas de nutrientes en la tierra y son fundamentales en la formación de humus. 

Estreptograminas:

Producidas por diversas especies de streptomyces

Constituyen un amplio conjunto de péptidos cíclicos

Grupo de antibióticos formados por 2 componentes: estreptogramina A y estreptogramina B

Ambas inhiben la síntesis proteica bacteriana,

Actuando sobre el dominio de la peptidil-transferasa de la subunidad ribosomal

La mayoría son seres aerobios estrictos, que crecen bien a temperaturas del orden de los 25ºC, son microorganismos mesófilos; y a pH alcalino (pH ≈ 9).

Producen vitaminas (principalmente del grupo B), antibióticos y pigmentos de gran interés industrial.

D/Q – MECANISMO DE ACCIÓN

Inhiben la síntesis de proteínas al unirse a la subunidad ribosomal 50S. Un derivado, la quinupristina, inhibe la elongación de la cadena polipéctidica y la dalfopristina interfiere directamente con la peptidil transferasa.Ejercen su actividad a nivel del ribosoma bacteriano.

El componente A se une al peptidil tRNA y bloquea la unión de nuevos aa.

El componente B impide la elongación de la cadena peptídica.

El componente A aumenta la afinidad del componente B por la subunidad 50S

La combinación de A+B es bactericida

•En 1953, fue aislado un nuevo Streptomyces

(graminofaciens) capaz de producir un grupo de sustancias

antibióticas

estreptograminas

• estreptograminas:

• Micamicina,• pristinamicina,.

vernamicina virginamicina

• En los últimos años se desarrolló una investigación

sobre un derivado semisintético de esta familia

quinupristina-dalfopristina

El orden Actinomycetales se reconoce en la industria farmacéutica. existen una amplio número que inhibe microorganismos blanco sensibles a esos antibióticos (patógenas humanas, animales o vegetales). Los Streptomyces son los mas comunes. La estreptomicina es un antibiótico aminoglucósido producido por Streptomyces griseus.

Las especies de Streptomyces hidrolizan la quitina, también y otras la celulosa y las hemicelulosas. Nocardia oxida hidrocarburos del tipo de las parafinas, fenoles, esteroides, con la posibilidad de emplearlos en biorremediación

Aplicaciones industriales y ambientales

La mayoria de antibioticos son

sustancias producidas por

Streptomycetos

• Se han utilizado con éxito en la agricultura,industria alimentaria, y en la medicina

VERNAMICINA • Pertenece al grupo depsipeptidos • Es activo contra gram +y gram- • PM: 422,38 g/mol• Formula empirica C20H25O5N2• Espectro absorcion 230-270 nm

Vernamicina inhibe la union de fmet-tRNA a

los ribosomas 70 S en la sub unidad 50S

• Este antibiotico probablemente inhibe la formacion de enlaces peptidicos mediante la inhibicion de union ARNt al ribosoma

ResumenSe aislaron 75 cepas de

actinomycetos denominadas AZ-SH-29 de diferentes muestras de suelo de diferentes localidades de Egipto

Estas bacterias producen un agente

antimicrobiano amplio espectro

Tiene similitud con genero Streptomyces

Morfologia,fisiologia,caract. Bioquimicos.

Durante la formación agente antimicrobiano Parámetros de control:

pH,Temp,periodo de incubacion y diferentes

fuente de carbono y nitrogeno

Para extaer metabolito activo se uso ACETATO DE ETILO (1:1 a pH7)

Para separar y purificar el ingrediente activo se uso Cromatografia en

columna (CC)

• Este analisis indica la formula empirica C20H25N2O5

• Se determino las concentraciones minimas de inhibicion (CMI)

• El agente antimicrobiano purificado pertenece a depsipeptidos (MICAMICINA) del grupo Vernamicina producido po S. ramulosus.

Materiales y Metodos

Aislamiento actinomiceto

AZ-SH-29

Detección actividad antimicrobiana

Estudio de caracterización del

actinomiceto aislado

Se aislo apartir de muestras de

sueloSe purifico utilizando tecnica

Dilucion en placa

Morfologicas: hifas aereas, masa de

esporas, superficie de esporas,color micelios

aereosY el sustratoFisiologicas y bioqquimicas:

Se detecto

Lecitinasa----medio yema de

huevoLipasa

ProteasaPectinasaA amilasa

Pruebas bioquimicas

Prueba catalasaReduccion nitratoProduccion H2S

(utilizand diferentes fuentes de carbono

y nitrogeno

Parámetros de control en la biosíntesis del agente

antimicrobiano

Incluyen: Tamaño inoculo

Periodo incubacionValores Ph

T° incubacionFuentes carbono

y nitrogeno(glucosa , nitrato

de sodio

Micrografia electronica de barrido del actinomiceto

aisladoCrecio en un (medio de agar

+ almidon+nitrato)

FermentacionExtraccion

PrecipitacionPurificacion

Bioautografia del agente antimicrobiano

Analizaron las propiedades fisico-

quimicas del agente antimicrobiano

Analisis elemental C,H,ON, SAnalisis

espectroscopico(IR,UV,espectro

de masas y espectro RMN)

Se evaluo reaccion del

agente antimicrobiano con siguientes

pruebas:Rx MolishRx FehlingNihidrina

NitroprusiatoCloruro ferrico

Rx Mayer

Se determino su actividad biologica

Con la prueba de CMI

20 ul de compuesto purificado fue

cargado en tiras de papel de

cromatografiaSe secaron al aire y

colocaron e placas de agar sembradas

con-. Micrococcus, S.aureus,B.SubtilisE.Coli, Klebsiella y candida albicans

Como cepas bacterianas de

prueba

Resultados

1.La detección de las actividades antimicrobianas

• Bacterias Gram positivas

• Bacterias Gram negativas

• Hongos unicelulares

2.Caracterizaciones del actinomiceto aislado, AZ-SH-29

2.1Características morfológicas• Espiral• Gris rosa• Lisa• Micelio marrón amarillento• Pigmento difusible marrón

2.2 Pared celular hidrolizada: contiene acido diaminopimelico

3.Características fisiológicas y bioquímicas

Hidroliza proteínas, almidón, pectina de lípidos, lecitina, y celulosa

La prueba de catalasa y el pigmento melanina es negativo

La degradación de la xantina, esculina, la producción de H2S y la reducción de nitrato son positivos

Descomposición de la urea; y la utilización de citrato son negativos.

El aislado AZ-SH-29 utiliza D-manosa, D-glucosa, Ramnosa, manitol, L-arabinosa, Rafinosa , maltosa, L-Cycteine, L-fenilalanina, L-Arginina, y citrato de sodio

D- galactosa, sacarosa, meso-inositol, lactosa, L-Valina, y L-histidina son negativosCrecimiento en presencia de hasta (10%) de NaCl

El crecimiento no se inhibe en presencia de azida de sodio y fenol

El aislado de actinomicetos no es resistente a la amoxicilina, Augmentina, carbenicilina, Cefadroxilo, Gentamicina, Cephardine, Ceptrine, Chloramphinicol, Cloxacillina, doxiciclina, eritromicina, Keflex, y Noroxin.

3.1.Características de color y cultivo• El aislado AZ-SH-29 exhibió un buen crecimiento en el medio agar de almidón-nitrato , el micelio aéreo es gris medio, micelio de sustrato es de color marrón amarillento claro, y pigmento difusible es marrón amarillento moderado

• No hay crecimiento en el medio de caldo de extracto de triptona-levadura (ISP-1)• un buen crecimiento en el medio agar de extracto de malta-levadura (ISP-2) , el micelio aéreo es marrón amarillento claro y el pigmento difusible es de color marrón amarillento moderado.

• No hay crecimiento en medio de agar de avena (ISP-3).• Se detectó un crecimiento moderado en medio de agar de sales inorgánicas-almidón (ISP-4) el micelio aéreo es de color rosa grisáceo, micelio sustrato es amarillo naranja pálido y el pigmento difusible es brillante amarillo-naranja.

• No hay crecimiento en el medio de agar glicerol - asparragina (ISP-5).• Buen crecimiento fue detectado en medio de agar de extracto de levadura y peptona (ISP-6), el micelio aéreo del medio es gris medio; micelio de sustrato es marrón amarillento claro y pigmento difusible marrón moderado.

• Se detectó buen crecimiento en medio de agar tirosina (ISP-7), el micelio aéreo es gris claro, micelio sustrato es marrón claro y pigmento difusible es marrón amarillento moderado

• AZ-SH-29 es sugerente de relacionarse con Streptomyces ramulosus

4. Identificación del actinomiceto aislado, AZ-SH-29

• Periodo de incubación: 5 días• Valor de pH: pH 7• La temperatura de incubación: 25 °C• Fuente de carbono: Glucosa 2.5 mg/100ml• Fuente de nitrógeno: nitrato de sodio 0.25 mg/100 ml

5. Parámetros que controlan la biosíntesis del agente antimicrobiano

6. Fermentación y aislamiento del agente microbiano

•El proceso de fermentación se realizó durante cinco días a 30°C

•Filtración•Centrifugación a 5000 rpm durante 15 min

•Los filtrados transparentes fueron ajustados a pH 7,0

•acetato de etilo al nivel de 1: 1 (v / v)

•La fase orgánica se recogió, y se evaporó bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio

•La fase orgánica se recogió, y se evaporó bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio

•El material residual se disolvió en la menor cantidad de DMSO y filtrado

•El agente antimicrobiano se precipitó por el éter de petróleo (pe 60-80? C) y se centrifugó a 4000 rpm durante 15 min donde un precipitado en polvo de color marrón podría ser obtenido

•El proceso de purificación a través de cromatografía con gel de sílice

7. Bioautografía del Agente(s) antimicrobiano purificado

• El agente antimicrobiano purificado produce olor característico, su punto de fusión es de 195° C.

• El compuesto es soluble en cloroformo, acetato de etilo, Demso, n-butanol, y dietil éter, pero insoluble en agua, éter de petróleo, y hexano.

8. Características físico-químicas del agente

antimicrobiano

• Los datos analíticos elementales del agente antimicrobiano (s) revelo lo siguiente:. C = 63,54, H = 6.67, N = 7,29 y O = 21.7 Este análisis indica una fórmula empírica sugerida de C20H25N2O5.

8.1. Análisis elemental

La RMN- espectro

 Reacción bioquímica del agente antimicrobiano

 Las actividades biológicas del agente antimicrobiano

Identificación del agente antimicrobiano

4. Discusión

AZ-SH-29 se aisló de una muestra del suelo (medio almidón nitrato)

optimización de la biosíntesis se estudiaron diferentes condiciones culturales tales como el pH, la temperatura y período de incubación, efecto de fuente carbono y fuentes de nitrógeno.

La biosíntesis máximo se alcanzó al final de un periodo de incubación de cinco días para la producción de agente antimicrobiano. 

rendimiento máximo del agente antimicrobiano se produjo al final de una temperatura de incubación de 30 ° C

efecto de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno en la producción del agente antimicrobiano indicaron que Streptomyces ramulosus- AZ-SH-29 requieren glucosa y nitrato de sodio a concentraciones 2.5.0 g / 100 ml; 0,25 g / 100, respectivamente

metabolitos activos fueron extraídos por acetato de etilo a pH 7.

Conclusiones:

características físico-químicas del antibiótico purificada revelaron que, su punto de fusión es 195 ° C. 

soluble en cloroformo, acetato de etilo, Denso, n-butanol y éter dietilio pero insoluble en agua, éter de petróleo, y hexano. estudio del análisis elemental del agente antibacteriano conduce a una fórmula imperica de: C 20 H 25 O 5 N 2