ESTUDIOS CON MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE LA DESCENDENCIA DE RATAS INOCULADAS INTRACEREBRALMENTE CON LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO DE PACIENTES ESQUIZOFRÉNICOS.

SEGUNDO MESA CASTILLO* ENMA GONZALEZ PACHECO*, EDUARDO SACARÍAS SOSA**, ODELSA ANCHETA NIEBLA***-,

LUCÍA GONZÁLEZ NÚÑEZ, HILARIO GOMEZ BARRY****, CARLOS DOMINGUEZ ALVAREZ"***** Hospital Psiquiátrico de La Habana*. Instituto de Ciencias Médicas de Cuba**. Centro Nacional de Investigaciones Científicas***. Instituto de Nefrología****. Hospital "Hermanos Ameijeiras"*****. SUMMARY. A study is made by means of immuno-electron microscopic techniques in brains of four descending rats of parents inoculated intra-cerebrally with the cerebrospinal fluid (CSF) of a hebephrenic schizophrenic patient, comparing its results with a study in control rats. In a previous study we have found alterations compatible with herpes simplex hominis type I (HSV1) virus etiology in the brain of an aborted fetus from this patient using the same research technique, as well as in chicken embryos inoculated with this patient's CSF. The results obtained up to present in this study can constitute a further element favoring the vertical type transmission outlined for the illness as their relationship with the virus HSV1. Key words: schizophrenia, immuno-electron microscopy, rats inoculation, cerebrospinal fluid, herpes simplex virus. RESUMEN. Se hace un estudio mediante técnicas inmuno-electromicroscópicas en cerebros de cuatro ratas descendientes de padres inoculados intra-cerebralmente con el líquido cefalorraquídeo (LCR) de una paciente esquizofrénica hebefrénica, comparando sus resultados con un estudio en ratas controles. En un estudio anterior se habían encontrado alteraciones compatibles con la etiología por el herpes simplex hominis tipo I (HSV-I) en el cerebro

de un feto abortado de dicha paciente utilizando la misma técnica de investigación, así como en embriones de pollo inoculados con el LCR de esta paciente. Los resultados obtenidos hasta el momento en este estudio pueden constituir un elemento más en favor de la trasmisión de tipo vertical planteada para la enfermedad, así corno su relación con el virus HSV-1. Palabras claves: esquizofrenia, inmuno-electromicroscopía, inoculación en ratas, líquido céfalo-raquídeo, virus herpes simple. INTRODUCCION

En trabajos anteriores hemos reportado alteraciones electromicroscópicas en el cerebro de embriones de pollo inoculados con el LCR de una paciente esquizofrénica hebefrénica cuyo feto abortado había sido estudiado y en el que se había encontrado alteraciones similares en el sistema nervioso a las encontradas posteriormente en los embriones de pollo inoculados [1-4].

En un intento de reproducir en forma experimental los elementos que sustentan la hipótesis de la trasmisión de tipo vertical de la enfermedad, utilizamos el mismo LCR con el que habíamos inoculado los embriones de pollo inoculándolo en el cerebro de ratas y estudiando su descendencia. Los resultados de este trabajo son los que se exponen a continuación. MATERIAL Y METODO

Mediante trepanación del cráneo utilizando una fresa estomatológica, se inocularon intracerebralmente en el hemisferio cerebral izquierdo, dos ratas Wistar, hembra y macho, de cinco semanas de edad y de 150 gr. de peso, con una décima de cc de LCR de la paciente esquizofrénica hebefrénica L.M.S. (Feighner et al) [5]. Dos meses después se aparearon las ratas inoculadas, esperándose el tiempo de gestación hasta el nacimiento de la descendencia. De ésta se seleccionaron cuatro ratas, las dos primeras de ocho días de nacidas, de 9,9 gr. (distrófica) y 13,9 gr. de peso respectivamente. Una semana después se seleccionaron dos ratas de 15,9 gr. y 30,6 gr., la primera distrófica. Los controles N = 2, de 6 días de nacida y 16,2 gr. de peso y 19 días de nacida con 32,2 gr. de peso. Todas las ratas se registraron con los números del 1 al 6, 1, 2, 4 y 5, las ratas de padres inoculados y 3 y 6, las ratas controles. En todos los casos, después de la trepanación del cráneo, se realizó toma del hemisferio izquierdo y fijación inmediata del tejido cerebral en glutaraldehido-paraformaldehído al 1% durante 1 hora a 4º centígrados. Las muestras así obtenidas, se trasladaron a los laboratorios de microscopía electrónica del Centro Nacional de Investigaciones Científicas y al Departamento de Patología del Instituto de Nefrología, donde fueron procesadas mediante las técnicas inmunoelectromicroscópicas ya descritas en trabajos anteriores [6]. Los cortes de los bloques fueron examinados en los laboratorios

de microscopía electrónica de los centros antes citados y en el laboratorio de microscopfa electr6nica del hospital "Hermanos Ameijeiras". El trabajo de inoculación de las ratas, observación de las mismas y obtención de las muestras, se realizó en el Departamento de Embriología del Instituto de Ciencias Médicas de Cuba y en el bioterio del propio Instituto. RESULTADOS

De las cuatro ratas descendientes de padres inoculados, solamente en una, la de menor peso, se observó la presencia de partículas en el núcleo de neuronas, semejantes a formas virales inmaduras, que reaccionaron ligeramente con el anticuerpo para el HSV-1. El diámetro de dichas partículas osciló entre 40 a 60 NM, apareciendo en grupos con simetría en su disposición (figura 1). No se observó el fenómeno de replicación de membranas, ni la localización de dichas partículas fuera del núcleo, como se ha reportado en trabajos anteriores. La frecuencia de aparición también fue menor en relación a los trabajos ya citados. En los controles no se observó ninguna alteración. Figura 1 [a,b,c,d]: La figura 1a muestra la presencia de partículas intranucleares que semejan formas virales inmaduras de 80-100 NM de diámetro equivalente en muestras del núcleo amigdalino de un paciente esquizofrénico joven fallecido [flecha]. En la figura 1b se observan partículas con características similares con una intensa reacción al anticuerpo anti-HSV1 en una muestra del cerebro de un feto abortado de madre esquizofrénica hebefrénica estudiado con técnicas inmuno-electromicroscópicas. La figura 1c corresponde a una muestra del cerebro de una rata cuyos padres fueron inoculados con el LCR de la paciente cuyo feto fue estudiado con igual técnica. Un análisis digital de la figura 1c destaca la reacción antígeno-anticuerpo en las partículas [flecha, figura 1d].

200

Fig. 1a

Fig. 1b

200 nm

Fig. 1c

100

Fig. 1d

DISCUSION

En 1979 se reportó por Tyrrell y colaboradores que el LCR de un 35% de pacientes esquizofrénicos tenia efectos citopáticos cuando era inoculado en fibroblastos de embrión humano [6]. Sin embargo, este hallazgo no era especifico para la esquizofrenia, ya que el LCR de pacientes con trastornos afectivos producía igual efecto citopático en igual proporción. Se desconoce aún si este efecto se debía a una toxina o a un virus. La imposibilidad de trasmitir este efecto citopático de cultivo a cultivo y su persistencia a pesar del uso de inhibidores de la síntesis proteica y de DNA o RNA, sugería más la posibilidad tóxica que virológica a menos que se tratara de una forma viral no convencional. En 1983 Baker reportó los resultados de la inoculación intracerebral a monos de la América del Sur con el LCR que había producido efectos citopáticos en cultivos de tejidos [7]. Este autor señaló alteraciones de conducta en una parte de los animales inoculados que se caracterizaba por disminución de la actividad normal y cambios en la conducta social que seme-jaban los síntomas del defecto esquizofrénico, por el contrario, la inyección de LCR que no producía efectos citopáticos no provocaba tales alteraciones de

conducta. En el estudio de la descendencia de animales inoculados, en algunos, se reportaron anomalías congénitas: defecto del cierre del cráneo con encefalocele y cambios en la coloración de la cola. De estos resultados se consideró la posibilidad de que las malformaciones encontradas fueran el resultado de una infección viral persistente o crónica en los padres inoculados. Esto estaba sustentado además en que el efecto citopático se relacionaba regularmente con partículas de 30 a 60 NM de diámetro cuando se usaron filtros de membrana de celulosa para el filtrado del LCR. En 1988 reportamos cambios neurológicos y encefálicos macroscópicos en embriones de pollo inoculados con el LCR de una paciente esquizofrénica hebefrénica cuyo feto había sido estudiado mediante técnicas inmunoelectromicroscópicas y en el que se había observado en las neuronas y células endoteliales, partículas y cuerpos de inclusión que reaccionaban con el anticuerpo para el HSV1 [1]. Posteriormente reportamos hallazgos similares en un estudio a doble ciego con mayor cantidad de muestras de mayor cantidad de pacientes [2]. En este último estudio realizamos un análisis computarizado de las partículas, lo que nos permitió identificar la estructura de las mismas, así como realizar las mediciones de sus distintos componentes. Este estudio nos sirvió además, para confirmar la hipótesis que habíamos planteado anteriormente de la relación de las partículas con las membranas celulares y la multiplicación aumentada de estas membranas en cerebros de adultos esquizofrénicos, en su descendencia y en embriones de pollo inoculados con el LCR de pacientes esquizofrénicos [8]. En estas observaciones la similitud encontrada entre el feto de la madre esquizofrénica y los adultos esquizofrénicos estudiados, hizo que consideráramos este hallazgo como un elemento más en favor de la trasmisión de tipo vertical do la enfermedad, lo que nos motivó a tratar do reproducir en forma experimental la posible sucesión de acontecimientos biológicos que pueden ocurrir en este tipo de trasmisión, mediante la inoculación directa en el sistema nervioso del LCR de pacientes esquizofrénicos en animales con el objetivo de estudiar posteriormente su descendencia. El neurotropismo del herpes virus es un hecho que se había demostrado así como la presencia de DNA de este tipo de virus en el núcleo amigdalino de pacientes esquizofrénicos -demostrado mediante técnicas de hibridización- y el aumento significativo de anticuerpos neutralizantes en el suero de estos pacientes y en el LCR [9-14]; todos estos elementos nos permitieron considerar la inoculación de LCR de pacientes esquizofrénicos en animales de experimentación, como un método posible para reproducir en forma experimental la enfermedad o un equivalente neuropatológico de la misma, por la acción directa del virus en el sistema nervioso, su multiplicación y la posible trasmisión a la descendencia. La presencia de partículas virales en las neuronas de una de las ratas estudiadas, de todas las nacidas la de menor peso y las características morfológicas de estas partículas, similares a las observadas en los estudios anteriores, es un aspecto interesante de esta investigación en una enfermedad en la que se plantea la trasmisión de tipo vertical, sin descartar la contaminación ocasional por el HSV1 en el laboratorio o la presencia del mismo en el sistema nervioso en condiciones normales. Otro aspecto que debe considerarse, es que la trasmisión a la descendencia se relacione con los cambios inmunológicos que la enfermedad produce en las poblaciones linfocitarias B, T y TH en los pacientes y por ende en los animales inoculados y no se deba a una trasmisión directa del virus. Estos cambios inmunológicos no se limitan al número de poblaciones o subpoblaciones de linfocitos, sino que se relacionan además con cambios en su actividad

funcional, cambios en la producción de interleukinas y presencia de auto anticuerpos[15-18]. Se relaciona además con las características clínicas de la enfermedad y con la presencia de enfermedad autoinmune. Un mecanismo patogénico en la esquizofrenia puede ser el resultado de una infección viral en etapas tempranas de la vida que actuara junto a predisponentes genéticos sobre el sistema inmunológico con la consiguiente liberación de linfoquinas como la interleukina 10 que tiene entre otras propiedades la posibilidad de actuar sobre las membranas celulares y de producir cambios de conducta lo cual se ha demostrado en trabajos experimentales en ratas inoculadas y en su descendencia [19].

La posibilidad de que el hallazgo de partículas virales en la descendencia de ratas inoculadas no se relacione con la etiología de la enfermedad, debe tenerse en cuenta, dada la posible presencia de formas latentes del HSV1 en animales, incluyendo al hombre en condiciones normales.

No obstante todas las consideraciones hechas, se destaca la necesidad de continuar estos estudios en mayor cantidad de animales y con inóculos que procedan de pacientes con distintas formas clínicas de la enfermedad y en distintos periodos evolutivos, con el objetivo de establecer posibles relaciones que permitan un mejor conocimiento del posible rol de los virus en la etiología de la esquizofrenia. AGRADECIMIENTO

Agradecemos a las compañeras técnicas de microscopia electrónica Maria Cristina de la Rosa, Magaly Pujada y Maria Elena Ramos, su valiosa colaboración técnica.

BIBLIOGRAFIA 1. Mesa CS, Ancheta NO, Sosa ES. Inoculación de embriones de pol lo con l íquido céfalo-raquídeo de pacientes esquizofrénicos.

Rev Hosp Psiq Habana 1988; 29: 17-27.

2. Mesa CS, Aguilera A, Ancheta NO, Gómez Barry H, Sacarías SE, González PE et al. Esquizofrenia. Resultados del estudio inmuno-electromicroscópico en animales de experimentación inoculados con líquido céfalo-raquídeo. Datos adicionales. Rev Hosp Psiq Habana 1988; 29: 385-97.

3. Mesa CS, Sosa ES, Niebla OA, Gómez Barry H, Orgas MH, González PE. Inoculation of chicken embryos with the cerebrospinal fluid of schizophrenic

patients. Abstr S8-6. Presented at the Second World Conference on Viruses, Immunity and Mental Health. Mont Gabriel. Quebec 4-7 Oct 1988. 4. Mesa CS. Inoculación de embriones de pollo con líquido céfalo-raquídeo de pacientes esquizofrénicos. Estudio inmuno-electromicroscópico. WPA

Educational Section. Available at http://www.wpanet.org/education/wpaeln3.html, Mayo, 2005. 5. Feighner JP, Robins E, Guze SB, Woodruff RA, Winokur G, Minoz R. Diagnostic criteria for use in psychiatric research. Arch Gen Psychiatry 1972; 26:

57-63. 6. Tyrrell DAJ, Parry RP, Crow TJ, Johnstone E, Ferrier N. Possible virus in schizophrenia and some neurological disorders. Lancet 1979; 1: 389-841. 7. Baker HF, Ridley RM, Crow TJ, Bloxham CA, Parry RP, Tyrrell DAJ. An investigation of the effects of intracerebral injection in the marmoset of

cytopathic cerebrospinal fluid from patients with schizophrenia or neurological disease. Psychol Med 1983; 13: 499-511. 8. Mesa CS, González PE, Pérez JL, Domínguez AC, Ancheta NO, De la Rosa GM et al . Análisis digital de las imágenes

obtenidas por inmunoelectromicroscopía en cerebros de pacientes psicóticos, en su descendencia y en animales experimentalmente inoculados. Primeros resultados. Rev Hosp Psiq Habana 1989; 30: 343-48.

9. Libikova H, Pogady J, Rajcani J, Skodacek I, Ciampor F, Kocisova M. Latent herpesvirus hominis I in the central nervous system of psychotic

patients. Acta Virol 1979; 23: 231-9. 10. Dickerson FB, Boronow JJ, Stallings C, Origoni AE, Ruslanova I, Yolken RH. Association of serum antibodies to herpes simplex virus 1 with cognitive

deficits in individuals with schizophrenia. Arch Gen Psychiatry 2003; 60: 466-72.

11. Libíkova H. Schizophrenia and viruses: principles of etiological studies. In P.V. Morozov, edit. Research on the viral hypothesis of mental disorders.

Karger, Basel 1983; P. 20-51. 12. Bartola L, Rajcani J, Pogady, J. Herpes simplex virus antibodies in the cerebrospinal fluid of schizophrenic patients. Acta Virol 1987; 31: 443-6. Rajcáni J. Herpes simplex virus DNA in the brain of psychiatric patients. Second World Conference on Viruses, Immunity and Mental Health, Quebec, Canada. p. 19, Oct. 4-7, 1988. Deatly, A. HSV-1 transcription during latent infections of mouse and man. Second World Conference on Viruses, Immunity and Mental Health, Quebec, Canada, p. 50 Oct. 4-7, 1988.

13. 14. Masserini, C. Lymphocyte subsets in schizophrenic patients. Second World Conference on Viruses, Immunitv and Mental Health, Quebec, Canada, p. 43, Oct. 4-7, 1988. 15. Koliaskina F. Immunological and virological studies in schizophrenia: General trends and personal data. Second World Conference on Viruses. Immunity and Mental Health, Quebec,

Canada, p. 42, Oct. 4-7, 1988. 16. Sekirina, T. P. Peculiarities of blood lymphocytes in schizophrenia: quantitative correlations, proliferative activity, interleukin-2 production. Second World Conference on Viruses,

Immunity and Mental Health, Quebec, Canada, p. 44, Oct. 4-7, 1988. 17. Gangull, R. . Autoimmunity in schizophrenia: Defining a subgroup vulnerable to autoimmune disease. Second World Conference on Viruses, Immunity and Mental Health. Quebec,

Canada, p. 48, Oct. 4-7, 1988. 18. Meyer U, Feldon J, Schedlowski M, Yee BK. Towards an immuno-precipitated neurodevelopmental animal model of schizophrenia. Neurosci Biobehav Rev 2005; 29: 913-47