estudio de sustancias antimicrobianas
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LAURA TOMÁS MENOR
Estudio de sustancias alternativas
antimicrobianas
Línea temporal del descubrimiento de las distintas familias de antibióticos
Generación de resistencias
Tendencia al alza en las resistencias antibióticas
Porcentaje considerable de cepas aisladas en pacientes hospitalarios con resistencia antibiótica a Staphylococcus aureus por país europeo. En rojo y naranja se observan las regiones más afectadas.
¿A qué se debe el fenómeno de resistencia?
Sustancias alternativas antimicrobianas
Antibiótico semi-sintético derivado de las penicilinas
Amoxicilina + Ácido clavulánico: Antibiótico natural producido por
Streptomices clavuligerus
-Sustancias extraídas del metabolismo de hongos o bacterias
Sustancias alternativas antimicrobianas
Antibiótico semi-sintético derivado de las penicilinas
Amoxicilina + Ácido clavulánico: Antibiótico natural producido por
Streptomices clavuligerus
-Sustancias extraídas del metabolismo de hongos o bacterias
Sustancias alternativas antimicrobianas
Caspofungina: medicamento antifúngico desarrollado en el Centro de Investigación Básica de Madrid a partir de un hongo natural.
-Sustancias extraídas del metabolismo de hongos o bacterias
Lipopéptido (hexapéptido cíclico con cadena de ácido grasos de longitud variable)
Sustancias alternativas antimicrobianas
Proantocianinas del arándano rojo: previene tanto la adhesión y la proliferación de las bacterias concretamente para el tratamiento de la cistitis.
-Sustancias extraídas de extractos de plantas o frutos
Grupo de sustancias químicas de las plantas
Producto metabolismo 2º o menor
Presentes por toda la planta las partes más
expuestas al sol, contenido más alto
Actividad: colorante (antocianinas y flavonas),
protectora para la planta
1 misma planta varios polifenoles
¿Qué son los polifenoles?
> 8000 compuestos polifenólicos
Plantas del género Cistus
Las cistáceas, familia nativa del mediterráneo con 200 especies de arbustos.
Se distribuyen en diferentes áreas no siguiendo un mismo patrón.
Crecen en el ecosistema
semiárido Mediterráneo.
Hojas simples con 5 pétalos.
Colores que dependiendo del
subgénero van del blanco al
púrpura y rosa oscuro.
Especies pirófitas.
Se han utilizado desde la
medicina tradicional y también
como sustitutos del té.
Búsqueda de compuestos bioactivos de origen natural con
actividad bacteriostática o bactericida con aplicaciones
farmacéuticas/dermocosméticas.
Los extractos, fueron obtenidos de 4 plantas especialmente
abundantes en el territorio español: C. albidus, C. ladanifer, C. salviifolius,
C. clusii y de diferentes subgéneros.
El objetivo del trabajo
Extractos acuosos
Hidroalcoholicos
Extractos
Estudios de bioactividad y mecanismo de acción
Caracterización de los extractos mediante diversas
técnicas analíticas
Método de elaboración de extractos
LiofilizaciónSDY
-Actividad antibacteriana-Sinergia-Ensayos de cinética -Interacción en membrana
-Determinación del contenido polifenólico-Ensayos de capacidad antioxidante
Caracterización de los extractos
Determinación de compuestos polifenólicos
Determinación del contenido en fenoles totales: oxidación grupos fenólicos por reactivo de Folin-
Ciocalteu. Coloración azul abs 700nm proporcional [grupos fenólicos], patrón ác. gálico.
Determinación de flavonoides: dilución de las muestras con MeOH y tras añadirles acetato potásico
y cloruro de alumino. Coloración amarilla con abs 415nm proporcional [flavonoides], patrón quercetina.
Caracterización de los extractos
Identificación de compuestos polifenólicos por cromatografía líquida.
Para la detección de compuestos fenólicos se utilizaron los
sistemas de detección más utilizados Uv-vis y
espectrometría de masas.
Columna utilizada: RP-C18 (fase reversa) los compuestos apolares se
retienen más tiempo en la columna permitiendo una mejor separación.
Gradientes: fase móvil (polar) Ácido fórmico y acetonitrilo
Caracterización de los extractos
Determinación de la capacidad antioxidante.Los métodos de determinación de la actividad antioxidante se basan en distintos
sistemas generadores de radicales libres. Los radicales libres generados
disminuirán dependiendo de la fuerza antioxidante del extracto.
Debido a que no existe un solo método que refleje de forma completa el perfil
antioxidante, se deben utilizar varios métodos:
TEAC reducción del catión ABTS
FRAP reducir el ión Fe
ORAC bloquear radicales libres mediante la donación de un átomo de HTBARS inhibir la peroxidación lipídica
Antioxidante Radical libre
Ensayos de cinética bacteriana
Estudios de bioactividad
Estudiar la cinética de crecimiento de
microorganismos en modelos
patógenos en presencia de diferentes
extractos vegetales y controles
antimicrobianos.
Estudios de bioactividad
Actividad sinérgica antimicrobiana
Ensayo de bioactividad
Examinar la interacción sinérgica de
combinaciones binarias entre los
principales polifenoles de los extractos
testados.
Estudios de bioactividad
DEFINICION DE SINERGIA: la actividad de la mezcla es mayor que la suma de las actividades de los componentes por separado.
¿Cómo estudiar la sinergia?
Método cualitativo: representación gráfica del valor de actividad que aporta un
determinado compuesto a la CIM50de una combinación (isobolol)
Método cuantitativo: expresión matemática
Índice Sinergia Aditividad Indiferencia Antagonismo
FICI ≤ 0.5 > 0.5-1 > 1 a < 2 ≥ 2
Valores proporcionados por EUCAST para el índice FICI (índice de inhibición fraccionado) en función del tipo de interacción existente entre los componentes de una mezcla concreta (EUCAST, 2000).
Ensayos de bioactividad
Interacción de los compuestos principales del extracto con membranas modelo bacterianas
Comprobar si los principales
compuestos de los extractos
actúan a nivel de los fosfolípidos de
la membrana.
CALORIMETRÍA: estudio de los cambios de capacidad calorífica de una
muestra cuando es calentada o enfriada. De esta manera, se pudo obtener información
de los cambios de estabilidad de las vesículas fosfolipídicas debido a las propiedades
termotrópicas registradas en un termograma.
Rango de temperatura de exploración:
Termograma E. coli: -20ºC – 30ºC
Termograma S. aureus: 25ºC- 60ºC
Técnicas biofísicas
COEFICIENTE DE PARTICIÓN: estudio del reparto preferencial de
compuestos polifenólicos por las membranas modelo a estudio. Se utilizaron 2
sistemas:
Lípido/ tampón (Afinidad por la membrana modelo)
Octanol/ agua (Hidrofobicidad)
Técnicas biofísicas
Mediante HPLC-DAD-MS/MS, se analizaron las diferentes fracciones para
comprobar que cantidad de compuesto queda en contacto con el sistema
fosfolipídico y a su vez es hidrofóbico.
ENSAYO DE LIBERACIÓN DE CONTENIDOS: El ensayo de liberación de
la sonda fluorescente carboxifluoresceína (CF) encapsulada en liposomas,
permite estudiar si la presencia de un determinado compuesto en la
membrana conducen a la desestabilización de la bicapa y a la liberación de
la sonda.
Medida de cambios en la intensidad de fluorescencia después de 30 minutos de
incubación a temperatura ambiente.
Como control para liberar el 100% de CF, se utilizó Triton X-100.
Técnicas biofísicas
Acción de los antibióticos
La acción de los antibióticos
no sólo tiene lugar a nivel de
los fosfolípidos de membrana,
por lo que se deben estudiar
todos los mecanismos posibles
de acción y comparar de ese
modo finalmente la acción
observada del nuevo principio
activo, con el fármaco homólogo
que está ya en el mercado para
comprobar de ese modo el
verdadero potencial.
LAURA TOMÁS MENOR
Estudio de sustancias alternativas
antimicrobianas