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V Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica XVI Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica

VI Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular

Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C. P. 02090, México, D. F. Tel. y Fax: 5623 3088 email: [email protected], [email protected]

Clave: 1524696

ESTANDARIZACIÓN DE LA RT-PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA RUBÉOLA EN MÉXICO

Venegas-Medina, Adriana Marcela 1,2; Bautista-Matías, Norma 1; Ribas-Aparicio, Rosa María 2 DIRECCIÓN DE LOS AUTORES

1 Laboratorio de Pruebas Moleculares del Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (SSa). Carpio 470. 11340. D.F. México. 2 Laboratorio de Producción y Control de Biológicos, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (IPN). Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n. 11340. D.F. México. CORREO ELECTRÓNICO

[email protected]




INTRODUCCIÓN

La rubéola se describió por primera vez en el siglo XVIII y se aceptó como una infección diferente al sarampión y a la fiebre escarlatina en 1881. El primero en identificar a la rubéola como una entidad nosológica independiente fue George Maton en 1814, quien describió sus características clínicas y el período de incubación de la enfermedad. En 1866 Henry Veal propuso el término rubella en el idioma inglés, que ha pasado como “rubéola” al español. En 1945 Norman McAllister Gregg descubre el efecto teratogénico del virus de la rubéola, al identificar cataratas congénitas y otras malformaciones en niños cuyas madres sufrieron la enfermedad durante el embarazo, lo que convirtió a esta enfermedad presumiblemente benigna en un terrible azote bajo determinadas circunstancias (Bellini e Icenogle, 2003). Esta enfermedad afecta principalmente a niños aunque también se presenta en adultos y si se trata de mujeres en los primeros meses de gestación, el virus puede infectar al producto y ser causa de teratogénesis o de muerte (Chantler et al., 2001). El virus de la rubéola (VR) es el único miembro del género Rubivirus de la familia Togaviridae. Es un virus pequeño, envuelto, con pequeñas espículas que se proyectan entre 5 y 6nm. Su genoma es de RNA de una sola cadena de polaridad positiva con estructura cap (7 metil guanosina) en su extremo 5´ y una cola de poli A en el extremo 3´ terminal, tiene un peso molecular de 3.8 x106 Da y una longitud de 10kb. Tiene un contenido G-C de 69%, cuyo porcentaje es el más alto de cualquier virus de RNA hasta ahora identificado. La erupción o exantema aparece entre el día 16 y 20 (en promedio, 18 días) después de la exposición con el virus de la rubéola (Bellini e Icenogle, 2003). Aparece primero en la cara, se produce viremia y la diseminación del virus se generaliza en todo el cuerpo, incluida la placenta durante el embarazo (Lee y Bowden, 2000). El virus se multiplica en muchos órganos, pero pocos signos son manifiestos, a excepción de artralgias y artritis, relativamente frecuentes en las mujeres, acompañando a las infecciones de las membranas sinoviales; leucopenia producida por la replicación vírica en los linfocitos; trombocitopenia, pero con manifestaciones purpúricas poco frecuentes, y rara vez encefalitis. En la infección natural, la vacunación o la exposición intrauterina, el VR persiste en el humano por largo periodo de tiempo y posiblemente indefinidamente (Eggerding et al., 1991). Es una enfermedad sumamente contagiosa que se propaga por medio de las secreciones nasales de persona a persona (Lee y Bowden, 2000). A diferencia del sarampión o la varicela, la infección por la rubéola suele ser inaparente, favoreciendo la diseminación vírica (Mori et al, 2006). Los pacientes son más contagiosos durante el período prodrómico debido a la gran cantidad de virus presentes en la nasofaringe, pero la contagiosidad puede persistir hasta 7 días después de la aparición de la erupción. La vacuna contra la rubéola fue autorizada por primera vez en los EEUU y en Europa en 1969, (Plotkin y Reef, 2004), y la que se utiliza hoy en día fue autorizada en 1979.




El diagnóstico serológico del VR puede confirmarse mediante la inoculación de materiales infectados como secreciones nasofaríngeas y orina en cultivos celulares susceptibles mediante inmunofluorescencia o hemadsorción mediante titulaciones de inhibición de la hemaglutinación (Plotkin y Reef, 2004). El cultivo celular involucra un conjunto de técnicas que nos permite el mantenimiento y propagación de virus in vitro (dispersas tanto en suspensión como en monocapas sobre cristal o plástico), conservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Una monocapa confluente de la línea celular Vero es expuesta a una dilución del virus para infectar sólo una fracción de las células que se van observando para seguir el progreso de la infección (Condit, 2001). Los inmunoensayos en fase sólida como ELISA se utilizan con fines diagnósticos por su facilidad de ejecución y rapidez (Bellini e Icenogle 2003). En los laboratorios la confirmación de los casos de rubéola es por medio de la detección de IgM específica para rubéola en suero en pacientes con sospecha de tener la infección. En una infección postnatal, la IgM frecuentemente no es detectada hasta varios días después de la aparición del exantema. Se pueden obtener resultados falsos negativos si solamente se toma una muestra de suero alrededor del día en que se establece el exantema (Zhu et al, 2007). El diagnóstico de una infección fetal por la cuantificación directa de anticuerpos específicos IgM contra virus de rubéola en la sangre fetal es muy útil, pero la capacidad de los fetos para producir anticuerpos IgM no se desarrolla exitosamente hasta al menos la semana 21 a 22 de embarazo (Tanemura et al., 1996). El virus está presente normalmente en garganta o nasofaringe desde unos pocos días antes hasta 5 días después de la aparición exantema por lo que lo hace una muestra adecuada para la detección del virus por RT-PCR (Zhu et al., 2007). El aislamiento del virus de la sangre y la nasofaringe es difícil dos semanas después de la erupción, la probabilidad de recuperar al virus se reduce 4 días después de la erupción (Ginsberg, 1995). Se ha realizado diagnóstico por RT-PCR a partir de fluido amniótico (Macé et al., 2004) En la práctica clínica es frecuente la incorporación de procedimientos diagnósticos, sin que se abandonen los métodos anteriores en uso. La simultaneidad de exámenes para la misma finalidad, habitualmente arroja resultados confusos o contradictorios (Fescina et al., 1985); por lo que es importante evaluar el rendimiento de diferentes marcadores diagnósticos de infección para el virus de la rubéola (Mosquera et al., 2006). La prevención y vigilancia epidemiológica activa de la infección materna por rubéola es muy importante ya que tiene como principal objetivo proteger al feto. Por lo que es necesario el diseño y ejecución de técnicas con una alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico oportuno de esta enfermedad. Así, este trabajo se enfocó en establecer las condiciones de reacción óptimas para el diagnóstico de la rubéola por medio de la retrotranscripción acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), como alternativa o complemento de los métodos serológicos de diagnóstico utilizados en México actualmente.




MATERIAL Y MÉTODOS CULTIVO DEL VIRUS DE RUBÉOLA Cultivo celular. Se cultivó la cepa vacunal del virus de la rubéola RA27/3 y cepas virales aisladas de casos clínicos, en células Vero. Producción de abasto viral. Propagación del virus de rubéola: Se observó mediante un microscopio invertido que las botellas tengan una monocapa celular confluente al 100%. Se inoculó la botella, usando un volumen de 200µL de suspensión viral, para obtener una multiplicidad de infección (MOI) de por lo menos 0.1 (un virus/10 células). EXTRACCIÓN DE RNA DE LOS CULTIVOS VIRALES Para realizar la comparación de las tres técnicas de extracción: tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo, TRIzol reagent® y QIAamp® Viral RNA Mini Kit de QIAGEN, se utilizaron cultivos de células Vero que se infectaron con la cepa vacunal del VR RA27/3 (control +). Se mantuvo el contacto con el virus durante 5-7 días. OBTENCIÓN POR RT-PCR DE UNA REGIÓN CONSERVADA DEL GEN E1 DEL VIRUS DE RUBÉOLA Oligonucleótidos. Tienen como diana el gen E1 del virus de rubéola. El oligonucleótido R2 fue descrito por Ho-Terry y colaboradores (1990) y el R7 por Bosma y colaboradores (1995) produciendo un fragmento de 185pb. Los productos amplificados por RT-PCR fueron confirmados por electroforesis en gel de agarosa.

Tipo de oligonucleótidos

Secuencia Posiciones de los nucleótidos

R2 5´ CAA CAC GCC GCA CGG ACA AC 3´ 8807-8826 RT-PCR R7 5´ CCA CAA GCC GCG AGC AGT CA 3´ 8991-8972

ESPECIFICIDAD DE LA RT-PCR PARA EL VIRUS DE RUBÉOLA Se realizó la reacción de RT-PCR utilizando como referencia la cepa vacunal de rubéola RA27/3. Se utilizaron otros virus de RNA y se sometieron a las mismas condiciones de reacción, con los iniciadores R2 y R7. Virus utilizados fueron Dengue cepas: D1 (Hawai), D2 (New Ginea C), D3 (H87), D4 (H241); Sarampión cepa Chicago, y para poliovirus se utilizaron RNAs proporcionados por el CDC (Pv1, Pv2, Pv3). CLONACIÓN DEL cDNA DE LA REGIÓN DE 185pb DEL GEN E1 Cultivo de E. coli DH5α. Los cultivos se hicieron utilizando el medio Luria-Bertani (LB). Obtención de células competentes de E. coli DH5α . Se indujo el estado de competencia de las células de E. coli DH5α por el método del cloruro de calcio (Sambrook y Russell, 2001). Se cultivó E. coli DH5α en 3mL de caldo LB en agitación, a 37ºC durante 24h. Con el cultivo anterior se inocularon 100mL de caldo LB y se incubó a 37ºC en agitación durante 1.5h. El cultivo se centrifugó, se decantó el sobrenadante. Se adicionan 4mL de




MgCl2 0.1M estéril frío. Se mezcló y se dejó en hielo durante 10 min. Se centrifugó, se decantó el sobrenadante y el paquete celular se resuspendió en 2mL de CaCl2 0.1M estéril y frío. Se adicionaron 400µL de medio LB con glicerol (20%). Reacción de ligación. El cDNA del virus de rubéola RA27/3 amplificado por PCR (E1=185pb) fue clonado con el vector pGEM-T Easy® usando un estuche de reactivos de clonación de Promega®. Se incubó toda la noche a 4ºC para obtener pGEM-E1. Transformación de células de E. coli DH5α . Se transformaron células competentes de E. coli DH5α con pGEM-E1 para obtener las clonas recombinantes por α complementación. Las colonias seleccionadas se cultivaron en medio líquido adicionado con ampicilina. Extracción de DNA plasmídico recombinante. Se utilizó el método de lisis alcalina modificado (Sambrook y Russell, 2001). También para el DNA que sería utilizado para secuenciación automatizada se extrajo con el sistema Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System de Promega. Reacción de digestión con EcoRI. H2O destilada, desionizada y estéril 13µL, Regulador 10X 2µL, BSA (50mg/mL) 1µL, EcoRI 10U/µL, 1µL, pGEM-E1 3µL. La secuencia nucleotídica de las clonas recombinantes de pGEM-E1 se obtuvieron por medio de un método automatizado con el iniciador universal T7 del plásmido recombinante. Las secuencias nucleotídicas obtenidas se compararon con las del GenBank a través del BLAST/blastn (URL7) del NCBI. SENSIBILIDAD ANALÍTICA DE LA RT-PCR Se determinó usando un transcrito de RNA de polaridad positiva. Transcripción in Vitro. El transcrito de RNA se obtuvo a partir del cDNA-pGEM (pGEM-E1) linealizado con SalI y con la RNA polimerasa del fago T7, utilizando el sistema de reactivos “Riboprobe® Transcripción in vitro” de Promega, diseñado para la obtener µg de RNA in vitro a partir de insertos de DNA clonados. Se adicionó 20µL de Buffer 5X, 10µL de DTT, 100U RNasin recombinante (inhibidor de Ribonucleasas); 20µL de rATP, rGTP, rCTP, rUTP 2.5mM de cada uno, 4µL del molde de DNA linealizado y purificado con una concentración de 640µg/mL, 40U de RNApol T7 y 34µL de agua libre de nucleasas. El RNA se trató con DNasa RQ1 para eliminar el molde de DNA después de la transcripción in vitro y se extrajo con fenol pH 4.7:cloroformo, precipitado con etanol al 100% y resuspendido en agua libre de nucleasas; se cuantifió espectrofotométricamente. Se realizaron diluciones logarítmicas (10-1 – 10-10) del transcrito de RNA y cada una de las diluciones fue tratada con transcriptasa reversa, se determinó la dilución a la cual eran detectados los transcritos de RNA. Fue cuantificado espectrofotométricamente. La reacción de RT-PCR se llevó a cabo como sigue: 42ºC 60 min, 94ºC 5 min; 35 ciclos de: 94ºC 30s, 62ºC 45s, 72ºC 1 min; 72ºC 7min y 4ºC ∞.




DESARROLLO COMPARACIÓN DE TRES TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN - Se compararon las tres técnicas de extracción. - Se extrajo el RNA de 5 cultivos de células Vero sin infectar y cultivos de células Vero infectadas con el virus de rubéola. Se determinó espectrofotométricamente la pureza y cantidad de RNA extraído para cada uno de los tres métodos de extracción probados. - Se amplificó la región del gen E1 más conservada de la cepa vacunal RA27/3 con los iniciadores R2 y R7 para obtener un fragmento de 185pb. ESPECIFICIDAD DE LA RT-PCR PARA EL VIRUS DE RUBÉOLA - Se utilizaron muestras de orina y EF de fase aguda, tomadas aproximadamente durante los primeros 7 días desde la aparición del exantema, de 150 pacientes con enfermedad exantemática bajo sospecha clínica de sarampión o rubéola entre diciembre del 2005 y enero del 2007 del Distrito Federal, Estado de México, Nayarit, Hidalgo, Nuevo León, Puebla. Síntomas de enfermedades febriles exantemáticas para realizar diagnóstico de sarampión y rubéola son: fiebre de 38.2 a 38.7°C, exantema maculopapular, tos, conjuntivitis y no se reportan las manchas de Koplik. - Se realizaron cultivos celulares de las muestras de EF y orina, se extrajo el RNA por medio de la técnica de tiocianato de guanidinio y se amplificó la región de 185bp del gen E1 con los iniciadores R2 y R7 - Se realizó un ensayo de especificada. Para la reacción de RT-PCR con los iniciadores R2 y R7 se utilizó como referencia la cepa vacunal de rubéola RA27/3 y otros virus de RNA. CLONACIÓN, SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN DEL cDNA DE 185pb DE LA REGIÓN DEL GEN E1 - Se seleccionaron muestras de los cultivos celulares infectados con la cepa vacunal RA27/3 del virus de rubéola (VR) de primero, segundo y tercer pase. - Obtención de RNA y la amplificación por RT-PCR del fragmento de 185pb para cada una de las cuatro muestras. - Se ligó el fragmento de 185pb purificado al vector pGEM-T Easy® y se transformaron células competentes de E. coli DH5α, se seleccionaron las clonas recombinantes por α complementación. Extracción del DNA plasmídico por el método de lisis alcalina. - Digestión con EcoRI - Obtención de los plásmidos recombinantes se realizó con el sistema de reactivos Wizard® de Promega, - Determinación de la secuencia nucleotídica del amplicón. SENSIBILIDAD ANALÍTICA DE LA RT-PCR




RESULTADOS

COMPARACIÓN DE TRES TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN Tabla I. Resultados obtenidos de la extracción de RNA para cultivos celulares infectados con la cepa vacunal RA27/3 del virus de rubéola, por medio de tres técnicas a comparar.

Técnica de extracción # de pase A 260nm RNA (µg/mL) Pureza Proteínas (mg/mL)

Células Vero 1 0.012 19.8 2.034 0

1 0.017 26.4 1.003 0.5

2 0.021 33.1 1.127 0.5

Tiocianato de

guanidinio Células Vero

infectadas con VR

3 0.022 36 1.698 0.2

Células Vero 1 0.006 9.6 2.1 0 Trizol Células vero con

VR 1 0.007 11.2 1.8 0

Células Vero 1 0.031 49.6 1.959 0

2 0.045 71.4 1.956 0 Columna Qiagen Células Vero con

VR 3 0.047 75.1 2.08 0

ESPECIFICIDAD DE LA RT-PCR PARA EL VIRUS DE RUBÉOLA Tabla II. Comparación de los resultados obtenidos por RT-PCR secuenciación y ELISA indirecto.

Muestras confirmadas para Rubéola por RT-PCR y secuenciación

Positivas (3) Negativas (147) positivas 3 0 RT-PCR negativas 0 147 positivas 3 0 Enzygnost Anti-rubella-

Virus/IgM negativas 0 147 Las muestras positivas para el virus de rubéola provenían de exudados faríngeos.

Debido a que no se contó con un número de muestras positivas adecuado, se realizó un ensayo de especificidad (figura 1) utilizando la cepa vacunal RA27/3 como control positivo y virus de RNA que se diagnostican en el Laboratorio de Pruebas Moleculares del InDRE. En la figura 1 se observa que el producto amplificado de 185pb se obtuvo únicamente para la cepa vacunal RA27/3, y no así para los otros virus tratados bajo las mismas condiciones de reacción en la RT-PCR.



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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 MV

b

Figura 1. Se ilustra el electroferograma obtenido para el ensayo de espRT-PCR de la región del gen E1 con el VR RA27/3 y otros virus de RNVero infectadas con el VR RA27/3; 3) células Vero infectadas con VR RA27/3 pcultivo de la línea celular B95; 4) células Vero sin infectar; carril 5,6,estrechamente relacionados con el virus Dengue (D1, D2, D3 y D4 respectivamVero; 10) células B95 infectadas con el virus del Sarampión; 11) células B95 no12,13,14) fragmentos de RNA de Poliovirus de las cepas vacunales Pv1, Pv2, Pv315 y 16) testigos positivos de células Vero infectadas con el VR RA27/3; 17) co18 y 19) fragmentos de DNA de 185pb; MV) Marcador de bajo peso molecular. CLONACIÓN, SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS DE RESTRICCIÓDE 185pb DE LA REGIÓN DEL GEN E1 La comprobación de que las clonas seleccionadas tenían el plásmido rrealizó mediante la digestión con EcoRI. Se realizó la electroforesis en un 0.8%. En la figura 2 se observan las bandas obtenidas, una correspondieclonación y otra correspondiente al fragmento liberado de 185pb.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

185pb

3015pb

Figura 2. Se ilustra el electroferograma de pGEM-E1 digerido con Eco6, 7, 8, 9) clonas recombinantes seleccionadas por complementación α (c10) marcador de bajo peso molecular; 11) marcador de tamaño molecular d

185 p

xico, D. F. o.com.mx

ecificidad de la A. 1 y 2) células

rovenientes de un 7,8: cuatro virus

ente); 9) células infectadas; carril respectivamente;

ntrol de reactivos;

N DEL cDNA

ecombinante, se gel de agarosa al nte al vector de

RI. 1, 2, 3, 4, 5, olonias blancas); e 1 kb.




La secuencia nucleotídica de dos clonas recombinantes de pGEM-E1, obtenidas por medio de un método automatizado con el iniciador universal T7 del plásmido recombinante, se compararon con las del GenBank a través del BLAST/blastn del NCBI, realizando alineamientos múltiples se comprobó que corresponden a un fragmento de 185pb de la región diana del gen E1 de rubéola con una identidad máxima del 100% con la cepa vacunal RA27/3 pGEM-E1 ACGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTCAACACGCCGCACGGACAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCCCGACCCCGGGGACCTGGTTGAGTACATTATGAACCACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGGGGCCTCGGGAGCCCGAATTGCCATGGCCCCGATTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCTGACGAGCATCACAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAACCCGACAGGACTATAAAGATACAGCT SENSIBILIDAD ANALÍTICA DE LA RT-PCR Se linealizó el plásmido pGEM-E1, con SalI (Figura 3, carril 1-3) y se utilizó como molde de DNA para llevar a cabo la transcripción in vitro. Este RNA se cuantificó y se utilizó para determinar la sensibilidad analítica de la RT-PCR.

1 2 3 4 5 6 7 8

Aproximadamente 3200pb

Figura 3. Se ilustra el electroferograma de plásmidos extraídos por Wizard, linealizado con SalI y purificados; se utiliza pGEM-E1 como molde de DNA para la transcripción in vitro. 1, 2 y 3) Plásmidos linealizados; 4, 5, 6 y 7) plásmidos no linealizados, extraídos con Wizard; 8) marcador 100pb.




Al utilizar el sistema de reactivos “Riboprobe® Transcripción in vitro” de Promega para realizar la reacción de transcripción in vitro, se obtuvo el RNA a partir del molde de DNA de aproximadamente 3200pb, que fue eliminado por digestión con la DNasa RQ1. De los 4µL de DNA molde, utilizados a una concentración de 640µg/mL, se obtuvieron 158.4µg/mL de RNA. Para realizar la RT-PCR a partir del RNA obtenido in vitro; se utilizó el sistema de reactivos “Titan One Tube RT-PCR” de Roche® con los iniciadores R2 y R7 en donde se requieren de 1pg - 1µg de RNA total, por lo que partimos de una concentración de 0.1584µg/mL (158.4ng/mL) de RNA. Al realizar las diluciones seriadas del RNA de 10-1 a 10-10, se determinó espectrofotométricamente la concentración para cada una de las diluciones y se sometieron a las mismas condiciones de reacción de la RT-PCR con los iniciadores R2 y R7 y con una Tm = 62ºC, para determinar la dilución más alta a la cual son detectados los transcritos de RNA (Figura 4).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

185pb

Figura 4. Se ilustra el electroferograma para la determinación de la sensibilidad analítica. 1) marcador 100pb; 2) RNA* tratado con DNasa RQ1; 3 al 8) amplificados de 185pbobtenidos por RT-PCR a partir de las diluciones del RNA, 3) 10-1 (15.84ng); 4) 10-2

(1.584ng); 5) 10-3 (0.1584ng); 6) 10-4 (0.0158ng); 7) 10-5 (0.00158ng); 8) 10-6 (0.158pg); 9) amplificado de 185pb obtenido de células Vero infectadas con la cepa vacunal RA27/3 del virus de rubéola; 10) Control + de amplificado de 185pb previamente obtenido. Para realizar la reacción de RT-PCR con el Kit, se especifica que se requiere de 1pg – 1µg de RNA total; en el Sambrook se especifica que se requiere de 1pg – 100ng de mRNA o 10pg – 1µg de RNA total; por lo que el análisis de sensibilidad analítica se realizó a partir de una concentración final de 0.1584µg de RNA/mL. Se determinó que el fragmento de interés es amplificado hasta una dilución 10-5 la cual corresponde a una concentración de RNA de 0.00158ng/mL.




DISCUSIÓN

Al comparar las tres técnicas de extracción (Tabla I), con la técnica realizada con QIAamp® Viral RNA Mini Kit de QIAGEN se obtuvo una mayor concentración de RNA libre de proteínas, con una alta pureza. Se obtuvo una mayor concentración de RNA a partir del cultivo de células Vero infectadas con el virus de rubéola en el tercer pase; sin embargo la concentración es similar a la obtenida en el segundo pase. Esto se puede deber a que se esté en una etapa de máxima producción de virus; por lo que, la concentración de virus producida se mantiene sin cambio (Condit, 2001). En el 1º pase, es posible que no todas las células sean infectadas por el virus debido a que la cantidad de virus inoculado no es suficiente, sino hasta el día 5 de exposición. En el caso del 2º y 3º pase, la cantidad de virus con la que se infectan a las células es mayor favoreciendo que la mayoría; o todas las células en el cultivo sean infectadas y que después de un determinado tiempo, la infección entre en fase de crecimiento rápido seguido de una meseta. Para la técnica de tiocianato de guanidinio se observó lo mismo, ya que se observó un aumento en la concentración de RNA obtenido con respecto al número de pases realizados, aunque la concentración de RNA en ningún caso fue tan alta como la obtenida por el método en columna QIAGEN. Arroyave (2001) describe esta técnica de extracción indicando que se que pueden procesar 108 células, pero no especifica la cantidad de RNA que se puede obtener. Se detectó la presencia de proteínas a partir de los 1º, 2º y 3º pases, aunque no se encontraron proteínas cuando se extrajo RNA de células Vero sin infectar (Tabla I); lo que indica que hubo probablemente un error en la realización de la técnica en el momento de separar la fase acuosa, la presencia de proteínas influye mucho en los resultados ya que disminuyen el rendimiento de la reacción de RT-PCR. En el caso de la técnica realizada con Trizol reagent®, se obtuvo un RNA puro libre de proteínas, pero en menor concentración que las técnicas anteriores. Todas las DNA polimerasas termoestables requieren cationes divalentes como el Mg2+ para su actividad, la concentración de MgCl2 que con frecuencia se utiliza es de 1.5mM (Sambrook y Russell, 2001), pero en este trabajo se determinó que la concentración más adecuada es de 0.6mM (Tabla 5). Se realizó la reacción de RT-PCR con los iniciadores R2 y R7, se obtuvo un amplicón de 185pb de tamaño esperado correspondiente a la región del gen E1 del virus de la rubéola; la extracción de RNA realizada con el equipo QIAamp® Viral RNA Mini Kit de QIAGEN se obtuvo una banda muy intensa observada en el electroferograma (dato no mostrado). Al realizar la reacción de RT-PCR con el RNA obtenido por la técnica de tiocianato de guanidinio, se observó menor intensidad de las bandas de 185pb. Con Trizol se detectó una señal muy débil en comparación con las otras dos técnicas. El valor de una prueba diagnóstica, es decir su confiabilidad para distinguir un sujeto enfermo de otro no enfermo, se basa en dos categorías: la especificidad y la sensibilidad (Toman, 1981). Para establecer la especificidad y con ello, determinar la capacidad que




tiene el método de hacer un diagnóstico correcto de ausencia de la enfermedad de las muestras de orina y EF de pacientes con enfermedad exantemática bajo sospecha clínica de sarampión o rubéola; los datos del examen clínico deben constituir el prerrequisito básico en la orientación de cuáles pruebas o procedimientos corresponde indicar (Fascina et al., 1985). Sería importante distinguir los cuadros clínicos causados por el virus del sarampión de los ocasionados por el virus de la rubéola y de otros virus que tienen síntomas parecidos, pero únicamente con la información clínica hay problemas con el diagnóstico de rubéola, ya que hay individuos que son asintomáticos o tienen síntomas leves o parecidos a otras enfermedades (Mori et al., 2006). La enfermedad no se diferencia del sarampión salvo en que es más leve, su duración es menor y tiene menos complicaciones (Ginsberg, 1995; Bellini e Icenogle, 2003). Las muestras analizadas en este trabajo fueron tomadas 2-7 días después de la aparición del exantema; este virus tiene la capacidad de diseminarse días antes y después de la aparición del exantema (Lee y Bowden, 2000). Las muestras que llegaron al InDRE de diferentes partes de la República Mexicana, primero son diagnosticadas por ELISA para sarampión y rubéola, dando tres pases en cultivos celulares y posteriormente se realiza el diagnóstico por RT-PCR. De las muestras de EF que se analizaron por RT-PCR, sólo se detectaron 3 positivos a rubéola, y ninguna muestra positiva proveniente de orina, de aproximadamente 150 muestras. El diagnóstico realizado por la técnica de ELISA, reporta los mismos resultados y al realizar la RT-PCR y la secuenciación para confirmar, se determina que corresponden al virus de rubéola (Tabla II). Hay estudios que se han realizado con tan solo 24 muestras de las cuales todas son positivas (Zhu et al., 2007) para demostrar categóricamente que la patología está presente o ausente en los sujetos de prueba. Una desventaja de este tipo de técnica y otros que requieren cultivos celulares, fue la necesidad de obtener un abasto con virus infectivo a partir de las muestras de los pacientes para poder detectarlo; en ocasiones no se logra este objetivo debido a que se pierde la infectividad del virus y la degradación del RNA después de la colección y transporte de la muestra, se propone que el diagnóstico por RT-PCR sea primero a partir de muestras directas de pacientes o que sea a partir de 1° pase, evitando con ello, realizar tres pases en cultivos celulares para ser diagnosticados primero por técnicas de ELISA. Una ventaja de la RT-PCR es que existe la posibilidad de hacer un diagnóstico temprano del virus de rubéola en sangre de feto, debido a que la IgM no se produce totalmente sino hasta la semana 20-21 del embarazo (Tanemura et al., 1996). En la práctica clínica es frecuente la incorporación de procedimientos diagnósticos, sin que se abandonen los métodos en uso. La simultaneidad de exámenes para la misma finalidad, habitualmente arroja resultados confusos o contradictorios (Fescina et al., 1985); por lo que es importante evaluar diferentes marcadores diagnósticos de infección para el virus de la rubéola




(Mosquera et al., 2006; Zhu et al., 2007). En otro estudio se obtuvieron resultados en los que algunos casos de rubéola fueron negativos para IgM y positivo 1 día después de la aparición del exantema utilizando otras técnicas de diagnóstico. O ser positivo para IgM y después de realizar los cultivos celulares resultara negativo, en esos casos en un principio había virus infectivo el cual pudo inactivarse durante la colección y el transporte de la muestra (Zhu et al., 2007), por lo que no se pueden propagar en el cultivo celular y por lo tanto por RT-PCR el resultado es negativo. Es necesario el uso de diferentes técnicas que sean complemento una de otras para el diagnóstico. Debido a que no se contó con una cantidad de muestras positivas suficientes, se realizó un ensayo para demostrar la especificidad de la técnica de RT-PCR utilizando los oligonucleótidos específicos R2 y R7 para la región E1 del genoma de rubéola, para ello se sometieron a estudio en paralelo otros virus de RNA que también son diagnosticados en el laboratorio de Pruebas Moleculares del InDRE. En todos los casos las condiciones de reacción fueron las mismas que las utilizadas para detectar la cepa vacunal de rubéola RA27/3, obteniéndose únicamente la amplificación de un fragmento de 185pb con la cepa vacunal y no observándose amplificación para los otros virus probados (Figura 1). En cuanto a la clonación en, el producto de la ligación correspondería a un fragmento de aproximadamente 3200pb que es la suma del plásmido pGEM-T easy de 3015pb y el amplificado de 185pb del virus de rubéola RA27/3 dando como resultado el plásmido recombinante pGEM-E1. Cuando se transformaron competentes de E. coli DH5α introduciendo un plásmido recombinante pGEM-E1 para obtener las clonas recombinantes, las cuales fueron seleccionadas por α complementación, en placas con ampicilina, IPTG y Xgal se pudieron seleccionar las bacterias transformadas por medio de marcadores específicos como son la resistencia a ampicilina y la selección de colonias blancas. Se demostró teóricamente que no se digiere el producto amplificado con la enzima de restricción EcoRI. Experimentalmente se comprobó que las clonas seleccionadas tenían el plásmido recombinante al realizar la digestión del DNA plasmídico recombinante con EcoRI debido a que esta enzima de restricción corta en los dos extremos que flanquean el fragmento de 185pb de E1. En la figura 2 se observan las bandas obtenidas, una correspondiente al vector de clonación y otra correspondiente al fragmento de E1 liberado de 185pb. Se comprobó que el fragmento clonado (pGEM® T-Easy + inserto) de 185pb correspondía a la secuencia de la región diana del gen E1 del virus de rubéola RA27/3 con una identidad del 100% con la cepa vacunal RA27/3. Esto nos permitió utilizar el vector clonado como molde para realizar la transcripción in vitro y determinar la sensibilidad analítica. Para la sensibilidad analítica se determinó que el fragmento de interés de 185pb se detecta hasta una dilución de 10-5 en un gel de agarosa al 1.5% revelado con bromuro de etidio a




partir del RNA obtenido por transcripción in vitro (Figura 4), la cual corresponde a una concentración de RNA de 1.584x10-6µg/mL (0.00158ng/mL), con el uso de los iniciadores R2 y R7 bajo las condiciones de reacción llevadas a cabo en este trabajo. Comparada con otros trabajos en donde utilizan RT-PCR para el diagnóstico de rubéola, como la realizada en el trabajo de Eggerding y colaboradores (1991) donde se detectan las bandas de DNA a partir de una concentración de hasta 0.05ng/mL de RNA, que para incrementar la sensibilidad de su técnica, utilizan iniciadores internos para realizar un RT-PCR anidado, donde, se detectan concentraciones de hasta 5fg, por lo que se hace más sensible el método. Debido a esto, se propone el diseño de iniciadores internos para aumentar la sensibilidad del método para el diagnóstico de rubéola.

CONCLUSIONES

Los tres métodos extracción de RNA fueron adecuados para detectar al virus de la rubéola a partir del primer pase en cultivos celulares. Sin embargo, con el equipo de reactivos de Qiagen se obtuvieron los mejores resultados y reduce el tiempo de ejecución. Las condiciones de reacción de la RT-PCR establecidas en este estudio son específicas para el virus de la rubéola, lo cual fue demostrado al trabajar bajo las mismas condiciones con otros virus de RNA, en donde únicamente se obtuvo el producto de amplificación de 185pb del gen E1 en la muestra del virus de rubéola. La especificidad de la RT-PCR se corroboró además por medio de la determinación de la secuencia nucleotídica del fragmento de cDNA de 185pb del gen E1 del virus de rubéola RA27/3 y algunas muestras clínicas, en donde se obtuvo una identidad con secuencias del virus de rubéola depositadas en GenBank del 100%. La sensibilidad analítica en este trabajo fue de 0.00158ng de RNA/mL; esto indica que se requiere menor concentración de RNA para la detección del virus de rubéola bajo estas condiciones de reacción con respecto a otros trabajos. La clona recombinante pGEM-E1 obtenida en este trabajo podrá ser utilizada para obtener RNA in vitro y emplearlo como control positivo, lo que ayudará a mejorar el procedimiento; ya que disminuirá el tiempo y el trabajo realizado para obtener un control positivo de la sepa vacunal de rubéola RA27/3 en cultivo de células Vero que dura aproximadamente 1 semana; además de disminuir la cantidad de reactivos utilizados para este fin, y los cuidados que se deben tener para mantener la viabilidad de las células y la infectividad del virus.




REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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