establecimiento y validacion de un ensayo inmunoenzimatico tipo
TRANSCRIPT
ESTABLECIMIENTO Y VALIDACION DE UN ENSAYO INMUNOENZIMATICO TIPO ELISA, EMPLEADO EN EL CONTROL DE CALIDAD DEL INTERFERON ALFA 2B HUMANO RECOMBINANTE
CENTRO DE INGENIERI A GENETICA Y BIOTECNOLOGIA
CUBA
RESUMEN
Se estableció y valido un ELISA para la cuantificación del interferón alfa 2b humano recombinante en el ingrediente F. A.
LINEALIDAD ESPECIFICIDAD EXACTITUD RANGO PRECISION ROBUSTEZ
INTRODUCCION
Con el desarrollo de la industria biofarmaceutica se busca métodos de control de calidad exactos reproducibles y confiables, por lo tanto se hace la validación de estas técnicas analíticas para garantizar la obtención de resultados confiables.
MATERIALES Y MÉTODOS
REACTIVOS BIOLOGICOS
Anticuerpos monoclonales (CB- IFN 2.3 & CB- IFN 2.4) empleados como recubrimiento de las placas de ELISA.
MR- grupo de estabilidad y materiales de referencia de la dirección de control de la calidad.
Control +. IFA de IFN alfa 2b humano recombinante.
ESTABLECIMIENTO DEL MÉTODO
30 minutos / 37º C
TAMPON DE ENSAYO (leche descremada al 0.5% en sln salina tamponada con fosfatos)
MR & CONTROL POSITIVO
LOS POCILLOS SE LAVARON 2 VECES Sln de Tween-20 al 0.05%
37º c / 3 horas
PLACAS DE MICROTITULACION DE 96 POCILLOS[10 mcg/ml ] CB-IFN 2.3 Sln tampón
5 Lavados con sln Tween-20 al 0.05%
CB-IFN 2.4 diluido 1:80000 en tampón
40 min/ 37ºc
Después de 8 lavados
La reacción fue revelada con ortofenilendiamina (OPD) al 0.04% como sustrato y en tampón citrato (PH5.5) con 0.04% de peróxido de hidrogeno.
Lectura de absorbancias
492 nm Lector de microplacas
Y se detuvo añadiendo 50 microlitros por pocillo de una sln H2SO4 2M
La reacción transcurrió en la oscuridad
10 horas y 20 min
VALIDACION
La precisión se evaluó mediante la repetibilidad y la precisión intermedia tanto para la curva patrón de IFN alfa 2b hu-rec como para los controles positivos (IFA de IFN alfa 2b hu-rec).
La repetibilidad para la curva patrón se estudio con 5 curvas patrones de forma independiente en un mismo ensayo & la precisión intermedia se estudio en 3 ensayos, evaluándose el comportamiento de las abs para cada [].
Las condiciones de REPETIBILIDAD estipulan que los resultados pruebas se obtienen con el mismo método aplicado a idénticos objetos de prueba en el mismo laboratorio por el mismo operador con el mismo aparato en poco tiempo.
La repetibilidad para las muestras se estudio mediante la medición de los valores de 15 replicas de una muestra control en una misma placa por un mismo analista.
La PRECISIÓN INTERMEDIA esta basada en varias combinaciones de tiempo, calibración, operador y equipos.
Se estudio con 2 muestras evaluadas a diferentes diluciones con 1 y 2 analistas diferentes.
En todos los casos se determino la media, la DE y el CV, y se considero que el CV fuese inferior al 10% para el caso de repetibilidad e inferior al 20% para la precisión intermedia.
La ROBUSTEZ es una aproximación alternativa a los métodos estadísticos clásicos. El objeto es producir estimadores que no sean afectados por variaciones pequeñas respecto a las hipótesis de los modelos.
El estudio evaluó el efecto borde en las placas de ELISA y la estabilidad de las soluciones empleadas utilizando la media +/- DE, calculado para la posición central de la placa.
RESULTADOSESTABLECIMIENTO DEL METODOLos criterios de validez para el ELISA:
DO del fondo= 0.1 [] del control + del ensayo= dentro del
rango de trabajo calculado & el CV intraensayo inferior al 10%.
Coeficiente de determinación de la regresión > 0.98.
VALIDACIÓN
ROBUSTEZVariantes estudiadas ( Centro & Bordes ) se observa que los valores promedios de [] se encuentran dentro del intervalo calculado a partir de la muestra colocada en la posición central.
La variabilidad interensayo obtenida fue inferior al 20% cumpliendo con los criterios de validez para este parámetro, lo que confirma la robustez del ensayo con relación a la estabilidad de las soluciones.
DISCUSIONEste método es comparable con otros ELISAs destacándose entre sus ventajas:
Sensibilidad hasta 0.5 ng/ml Ensayo entre 8 y 10 muestras diferentes
además del control +. Tiempo de ensayo corto Bajo costo Manipulación respectivamente fácil
