escherichia coli o que vale para e. coli vale para elefantes jacques lucien monod (1910 –1976)...

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  • Escherichia coli O que vale para E. coli vale para elefantes Jacques Lucien Monod (1910 1976) Prticas microbiolgicas
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  • Escherichia coli -Presente no intestino -Caracterizada em 1855 pelo Dr Theodor Escherich Cepa O157:H7 patognica a humanos Cepa K-12 comensal Auxilio nos estudos pioneiros da biologia molecular 100 mil publicaes (Lederberg, 2004)
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  • Escherichia coli Unicelular na forma de basto Cresce rapidamente a 37 o C ciclo de 20 min Pouco exigente nutricionalmente Meio mnimo ou rico Glicose - melhor fonte de C Extrato de levedura - essenciais Triptona e Peptona: fonte aminocidos
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  • Escherichia coli Todas cepas derivam da K-12 Denominao Nome do Laboratrio e nmeros representam sequencia de obteno da cepa Cepas mais utilizadas (DH10, BL21, JM 109, HB 101, DH5a, XL blue,......) Nomenclatura para genes e marcas genticas -3 letras em itlico ou sublinhado indica locus gentico auxotrfico (his ou his -1 ) -Varias enzimas usa letras maisculas para indicar locus (hisA, hisB) -O fentipo escrito em letra maiscula His + ou His
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  • Escherichia coli -DH10B F- endA1 recA1 galE15 galK16 deoR nupG rpsL lacX74 80lacZM15 araD139 (ara,leu)7697 mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) - - BL21 (AI) F ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#BL21.28AI.29
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  • 4.609.221 pares de base Mapa de marcas e gentico SequenciamentoConjugao e mutantes auxotroficos
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  • Plasmdeo DNA extra cromossomial So menores que o principal Alto replicativos tamanho de 1 a > 200 Kpb Determinam caracterstica com resistncia a antibiticos ou sntese de enzimas de restrio Deles derivam os vetores utilizados na biologia molecular Clonar fragmentos
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  • Tipos de plasmdeos
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  • Vetores de clonagem Plasmdeo - 0,1 a 10 Kb pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET Insertos: genmico, transcrito reverso de mRNA (cDNA), subclonagem ou sinttico
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  • Vetores de clonagem Plasmdeo Caractersticas para uso: origem de replicao marcadores de seleo resistncia a antibitico (amp R, tet R, Cam R, Kan R, ) gene lacZ - amino terminal b-galactosidase (complementa) IPTG e X - Gal stio mltiplo de clonagem (MCS) tamanho (quanto menor melhor!) Manipulao aps purificaco larga escala mini-prep ou lise alcalina
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  • Clonagem
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  • pBR322 1 o plasmdeo -1977 Bolivar et al 1977 Plasmdeos naturais pBR322 = R1 + R6.5 + pMB1 4363 pb
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  • Seleo Transformao Placa Rplica
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  • pUC8 1982 Vieira & Messing (pBR322 and M13mp8)
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  • Plasmdeo pUC Mutano no gene rop Permite um maior numero de copias por celula Sistema lacZ Adicionar ao meio IPTG = isopropil thio galactose X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d- galactopiranosdeo (branco/azul)
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  • Bactrias para Transformao Clulas no apresentam fator de conjugao No apresentam DNA plasmidial Precisam ser preparadas Tornar-se competentes Transformao Quimiotransformao Eletroporao F-F-
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  • Prtica Microbiolgicas
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  • Condies Estril Ambiente de manipulao Regentes e meio de cultivo Vidraria Prticas devem manter o ambiente estril Fluxo Laminar
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  • Cultivo e conservao Meio cultivo Indefinido definido Consevao de microrganismos Meses placa de petri a 4 o C, tubo inclinado. 1ano stab 4 ano glicerol 15-20% a -70 o C DMSO entre 7-8% a -70 o C
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  • Inoculao Estoque ou de um cultivo
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  • Isolamento Colnia isolada formada a partir de 1 UFC (unidade formadora de colnia) Estoque ou de um cultivo Certificar da pureza do isolado
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  • Curva de Crescimento Trabalhar com DNA recombinante priorizar fase exponencial (10 7 UCF, 10 9 UCFdificulta aerao) Inoculo inicial, colnia isolada, pr- cultivo (10 9 ), diluir de 10 ou 100 vezes, avaliar curva de crescimento por algumas horas
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  • Curva de Crescimento
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  • Pratica Microbiolgicas-Contagem Diluio Serial 1UCF entre 8-16hs forma uma colnia visvel ao olho nu Absorbncia 400-600 nm 0,7 limite
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  • Transferncia horizontal de DNA