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Esame Prenatale Non Invasivo (NIPT) mediante analisi del DNA fetale libero
da sangue materno
E’ un test prenatale non invasivo (NIPT) che, analizzando il DNA fetale libero circolante isolato da un campione di sangue materno, rileva aneuploidie fetali comuni in gravidanza, quali:
Trisomia 21 (Sindrome di Down)
Trisomia 18 (Sindrome di Edwards)
Trisomia 13 (Sindrome di Patau)
Monosomia X (Sindrome di Turner)
XXX (Trisomia X)
XXY (Sindrome di Klinefelter)
XYY (Sindrome di Jacobs)
Il test prevede anche un livello di approfondimento che consente di valutare aneuploidie e alterazioni cromosomiche strutturali (delezioni e duplicazioni) fetali a carico di ogni cromosoma, con risultati molto simili all’analisi del cariotipo fetale mediante tecniche invasive di diagnosi prenatale.
Cos’è
Campione di sangue materno
DNA libero di origine materna
DNA libero di origine fetale
analizza il DNA fetale libero circolante nel sangue materno
Il DNA fetale libero (cfDNA) circolante nel sangue materno
Durante la gravidanza, alcuni frammenti del Dna del feto circolano nel sangue materno.
Il DNA fetale è rilevabile a partire dalla 5˚settimana di gestazione. La sua concentrazione aumenta nelle settimane successive e scompare subito dopo il parto.
La quantità di DNA fetale circolante dalla 10˚ settimana di gestazione è sufficiente per garantire l’elevata specificità e sensibilità del test.
Origine del DNA fetale libero (cfDNA)
Il DNA fetale libero consiste in corti frammenti di DNA (~145/200 bp) presenti nel plasma in percentuali variabili a seconda del periodo gestazionale
Viene rilasciato, attraverso il processo dell’apoptosi (morte cellular programmata)
Origina dai trofoblasti placentari.
Caratteristiche del test
PrenatalSafe®: Tecnologia FAST ad Alta RisoluzioneRisultato in 3 giorni
Grazie alla recente introduzione della innovativa tecnologia FAST ad elevata profondità di lettura (~30 milioni di sequenze), è possibile ottenere i risultati dell'esame dopo soli 3 giorni lavorativi, mantenendo i medesimi parametri di sensibilità e specificità del test.
La procedura FAST è attualmente applicabile solo ai test:PrenatalSafe® 3 (aneuploidie dei cromosomi 21, 18, 13 e sesso fetale) PrenatalSafe® 5 (aneuploidie dei cromosomi 21, 18, 13, X, Y);PrenatalSafe® Karyo (analisi del cariotipo fetale).
Test eseguito da GENOMA
Maggiore accuratezza rispetto al Bi-test
I test di screening del primo trimestre (Bi-Test) presentano un’incidenza del 5% di falsi positivi, comportando un aumento significativo di esami invasivi non necessari, e non
rilevano il 5-15% dei casi di trisomia 21 (falsi negativi)
Gravidanze in cui è controindicata la diagnosi prenatale invasiva (es. rischio di aborto spontaneo)
Screening del primo trimestre (Bi-Test) positivo
Età materna avanzata (>35 anni)
Quadro ecografico di anomalie fetali suggestive di aneuploidia
Anamnesi personale/familiare di anomalie cromosomiche
Partner(s) della coppia portatore(i) di traslocazione cromosomica bilanciata.
Gravidanze a basso rischio (casistica limitata)
Indicazioni all’esecuzione del test
gravidanze singole ottenute mediante:
concepimento naturale
tecniche di fecondazione assistita omologhe
tecniche di fecondazione assistita eterologhe
gravidanze gemellari ottenute mediante:
concepimento naturale
tecniche di fecondazione assistita omologhe
tecniche di fecondazione assistita eterologhe
precedenti gravidanze andate a termine
precedenti gravidanze esitate in aborto spontaneo o seguite da interruzione volontaria di gravidanza
A chi è dedicato il testA tutte le donne in gravidanza con un età gestazionale di almeno 10 settimane
prevede 5 livelli di indagine
Cromosomi
2 3 4 5 61
8 9 10 11 127
14 15 16 17 1813
20 21 22 XX-sesso femminile
o
XY-sesso maschile
19
Trisomia 13
Trisomia 21
Trisomia 18
Il test PrenatalSafe® rileva le trisomie 21, 18 e 13 sia nelle gravidanze singole che in quelle gemellari
PrenatalSafe® 3 rileva le principali trisomie fetali
prevede 5 livelli di indagine
Il test PrenatalSafe® 5 rileva sia le trisomie 21, 18 e 13, che le aneuploidie dei cromosomi sessuali (solo nelle gravidanze singole). Nelle gravidanze gemellari, viene rilevata la presenza o
l’assenza del cromosoma Y.Cromosomi
2 3 4 5 61
8 9 10 11 127
14 15 16 17 1813
20 21 22 XX-sesso femminile
o
XY-sesso maschile
19
Trisomia 13
Trisomia 21
Trisomia 18
XXY XYYXXX Monosomia X
PrenatalSafe® 5 rileva anche le aneuploidie dei cromosomi sessuali
prevede 5 livelli di indagine
Esame Prenatale Non Invasivo del Cariotipo Fetale
E’ il test prenatale non invasivo (NIPT) tecnologicamente più avanzato e rappresenta una evoluzione dei tradizionali test di screening non invasivi che analizzano il cfDNA da sangue materno
Prenatalsafe Karyo rileva:
Aneuploidie fetali (sia quelle comuni in gravidanza che quelle meno frequenti);
Alterazioni cromosomiche strutturali fetali (delezioni e duplicazioni segmentali)
a carico di ogni cromosoma del cariotipo fetale
E’ un test prenatale non invasivo (NIPT) che consente di studiare il cariotipo fetale
Che cos’è
Il nuovo test prenatale non invasivo per lo studio
del cariotipo fetale
Nessun altro NIPT oggi disponibile offre un livello d’indagine così avanzato.
Gli altri test prenatali non invasivi analizzano solamente alcuni cromosomi fetali, quali i cromosomi 21, 18, 13, X e Y.
Il test prenatale non invasivo che studia il cariotipo fetale
prevede 2 livelli di indagine
Detection rate
Il test evidenzia il 92.6%delle anomalie cromosomiche fetali rilevabili in epoca prenatale, ed il 96.2% di quelle riscontrate alla nascita
Livello di detection rate molto simile al cariotipo fetale tradizionale
Cariotipo fetale tradizionale vs
prevede 2 livelli di indagine
Detection rate
Il test evidenzia il 95.5%delle anomalie cromosomiche fetali rilevabili in epoca prenatale, ed il 99.1% di quelle riscontrate alla nascita
Plus
Livello di detection rate molto simile al cariotipo fetale tradizionalePlus
Cariotipo fetale tradizionale vs Plus
E’ consigliabile ricorrere all’utilizzo del PrenatalSafe® Karyo Plus solo in determinati contesti clinici(esempio dubbi ecografici suggestivi di sindrome da microdelezione cromosomica)
Studi di validazione pubblicati
Esempi di casi clinici
Esempio di un recente caso clinico (Caso 1)
Paziente di 31 anni
5
Risultato Negativo
Anomalie fetali ecografiche(ipoplasia del cervelletto; ventricolomegalia)
Rianalisi con Amniocentesi
20^ settimana di gestazione
12^ settimana di gestazione
Del5p15.33-13.2
Chr. 5Chr. 5
PrenatalSafe® KaryoArray-CGH
cfDNALiquido
Amniotico
34 Mb
Identifica una delezione 5p confermata con array-CGH
Paziente di 32 anni
5
Risultato Negativo
Anomalie fetali ecografiche
Amniocentesi
21^ settimana di gestazione
13^ settimana di gestazione
(difetto interventricolare, piede torto, intestino iperecogeno, dismorfismo facciale, arteria ombelicale unica)
Esempio di un recente caso clinico (Caso 2)
Del18p11.32-p11.31Chr. 18
PrenatalSafe® KaryoArray-CGH
cfDNALiquido
Amniotico
3,8 Mb
Del18q21.32-q2321,3 Mb
Identifica due delezioni (18p e 18q) confermate con array-CGH
Chr. 18
Paziente di 32 anniPortatrice di traslocazione reciproca 46,XX,t(7;9)(p15;q22)
Gravidanza ottenuta con PMA
Risultato Patologicorilevato cariotipo fetale con traslocazione sbilanciata
Anomalie fetali ecografiche
Villocentesi
12^ settimana di gestazione
11^ settimana di gestazione
(labiopalatoschisi; idrocefalia tetraventricolare, ipoplasia cuore)
Chr. 7
Chr. 9
Esempio di un recente caso clinico (Caso 3)
Risultato confermato
PrenatalSafe® KaryoArray-CGHcfDNAVilli Coriali
PrenatalSafe® KaryoArray-CGHVilli Coriali
Dup7p22.3p21.2 15 Mb Dup9p24.3-q31.1 107.5 Mb
cfDNA
Identifica una traslocazione sbilanciata confermata con array-CGH
Paziente di 35 anni
Amniocentesi(cariotipo tradizionale)
13^ settimana di gestazione
Risultato Negativo(Cariotipo fetale 46, XY)
Esempio di un recente caso clinico (Caso 4)
Anomalie fetali ecografiche(Sospetta Sindrome di DiGeorge)
20^ settimana di gestazione
Sindrome di DiGeorge
Amniocentesi
PrenatalSafe® KaryoArray-CGH
cfDNALiquidoAmniotico
Del22q11.21Sindrome di DiGeorge
Identifica una gravidanza con sindrome di DiGeorgePlus
4 Mb
Chr.22
Paziente di 33 anni(non consapevole di essere portatrice di traslocazione cromosomica)
Risultato Patologicorilevato cariotipo fetale con delezione 13q33.1q34 di 11.4 Mb
Anomalie fetali ecografiche
Villocentesi15^ settimana di gestazione
12^ settimana di gestazione
(Igroma Cistico e Sacci Giugulari)
Esempio di un recente caso clinico (Caso 5)
Paziente portatrice di traslocazione reciproca
46,XX,t(13;20)(q33;q13.3)
Risultato confermato
Chr. 13 Chr. 20
(cfDNA)
Del13q33.1q34 11.4 Mb
Identifica una traslocazione sbilanciata di origine materna
Dup20q13.33 1.9 Mb
Array-CGH(CVS)
Chr. 13 Chr. 20
(cfDNA)Array-CGH
(CVS)PrenatalSafe® KaryoPrenatalSafe® Karyo
Paziente di 40 anni
Risultato Patologicorilevata duplicazione 18p
Villocentesi
12^ settimana di gestazione
11^ settimana di gestazione
Esempio di un recente caso clinico (Caso 6)
Risultato confermato
Identifica una duplicazione 18p confermata con array-CGH
Chr. 18
Paziente di 38 anni
Risultato Patologicorilevata duplicazione 11p
Amniocentesi
16^ settimana di gestazione
10^ settimana di gestazione
Esempio di un recente caso clinico (Caso 7)
Risultato confermato
Chr. 11
PrenatalSafe® KaryoArray-CGH
cfDNALiquido
Amniotico
Dup11p15.4p15.1
16 Mb
Dup11p15.4p15.1
16 Mb
Identifica una duplicazione 11p confermata con array-CGH
Paziente di 40 anni
NIPT(screening 5 cromosomi)
Trisomia 21 non rilevataRilevata CNV materna
Identificata causa del risultato Falso Positivo riportato dal
test eseguito da altro laboratorio
13^ settimana di gestazione
Risultato PositivoAlto Rischio per Trisomia 21
Esame eseguito da altro laboratorio
Esempio di un recente caso clinico (Caso 8)
Riduce il rischio di falsi positivi determinati da CNV materni
PrenatalSafe® KaryocfDNA
Array-CGHPrelievo ematico gestante
Riduce il rischio di falsi positivi determinati da CNV materni
Riduce il rischio di falsi positivi determinati da CNV materni
Chudova et al., 2016 NEJM
Studio Prospettico
Background Conventional cfDNA-based NIPT approaches focus on detection of common
trisomies and sex-chromosome aneuploidies.
This leaves a gap of approximately 17% of clinically relevant chromosomal/subchromosomal abnormalities that would go undetected.
Previous studies have shown the potential of extending conventional NIPT to detect fetal microdeletion syndromes from maternal plasma (Peters et al., 2011; Srinivasan et al., 2013).
Other studies showed how genome-wide cfDNA testing can contribute in lowering the incidence of false positive results generated by maternal copy number variants (Snyder et al., 2015; Chudova et al., 2016).
At present, there are limited data available on the potential of genome-wide screening to detect rare autosomal trisomies and structural chromosome anomalies in a general population of pregnant women.
Aim of the study
From December 2015 through February 2016, genome-wide cell-free fetalDNA (cfDNA) testing was offered to pregnant women undergoingconventional cfDNA-based non-invasive prenatal testing (NIPT) for commonfetal aneuploidy.
We aimed to compare the performance of the two test in a general obstetricalpopulation.
Characteristics n
No. of eligible patients 7163
Maternal age-yr
- Mean ±SD 35.1±4.5
- Min-max 20-58
Gestational age at sample collection -wk
- Mean ±SD 12.7±2.2
- Min-max 10-29
Indications for NIPT
- Parental Anxiety 2264 (31.6%)- Advanced maternal agea 2622 (36.6%)- Positive prenatal screen 673 (9.4%)- Fetal ultrasound abnormality 279 (3.9%)- Prior pregnancy with fetal aneuploidy 79 (1.1%)- More than one indication 1246 (17.4%)
Demographic and pregnancy characteristics
Results of samples testedTotal
No. of patients analyzed 7163
Samples with a call - no. (%) 7142 (99.7)
Total cancellations - no. (%) 115 (1.6)
- Samples with low FF - no. (%) 93 (1.3)
- Samples with test failure - no. (%) 22 (0.3)
Samples with a conclusive result - no. (%) 7048 (98.1)
Chromosomally abnormal results
- Genome-wide cfDNA screening - no. (%) 128 (1.8)
- Conventional cfDNA screening - no. (%) 105 (1.8)
Pregnancies confirmed as chromosomally abnormal - no. (%)
- Genome-wide cfDNA screening - no. (%) 107 (1.5)
- Conventional cfDNA screening - no. (%) 93 (1.3)
Clinically relevant chromosomal abnormalities classes detected by genome-wide cfDNA analysis
0
10
20
30
40
50
60
70
Trisomy 21 Trisomy 18 Trisomy 13 Monosomy X(X0)
Triple XSyndrome
(XXX)
KlinefelterSyndrome
(XXY)
JacobsSyndrome
(XYY)
RareAutosomalTrisomies
Structuralanomalies -
CNV
Num
ber o
f ano
mal
ies
Types of chromosome anomalies detected by conventional and genome-wide cfDNA testing
86,9%
13,1%
Common aneuploidies Chr. abnormalities not detected by standard cfDNA testing
Conventional
cfDNA
screening
Genome-wide
cfDNA
screening
P-value§
No. of pregnancies assessed 7048 7048
Clinical relevant chromosomal abnormalities detected - no. (%) 105 128
Pregnancies confirmed as chromosomally abnormal - no. (%) 93 107
False Positive 12 21
False Negative 10^ 0
True Positive 93 107
True Negative 6933 6920
Sensitivity 90.29% 100.00% 0.001**
Specificity 99.83% 99.70% 0.116
Positive Predictive Value (PPV) 88.57% 83.59% 0.27
Negative Predictive Value (NPV) 99.86% 100.00% 0.016**
^ Clinically relevant chromosomal abnormalities, not detected by conventional cfDNA screening, potentially resulting in the birth of babies with chromosomal anomalies, have been considered as false negative. § A P-value of less than 0.05 was considered to indicate statistical significance (**).
Performance of conventional cfDNA screening vs. genome-wide analysis
Performance of the Genome-wide cfDNA screening
Conclusion
The clinical utility of expanding NIPT to cover the entire genome iscontroversial, especially in low-risk pregnancies. In fact, it pertains a risk ofoverdiagnosis with a higher number of false positives because ofchromosomal rearrangements which are confined to the placenta, potentiallyleading to an increase in unnecessary invasive testing.
The results of this study demonstrate that a high specificity may bemaintained while extending the screen to all chromosomal abnormalities.
La tecnologia
La Tecnologia del test
PrenatalSAFE® utilizza la tecnologia avanzata di sequenziamento massivo parallelo (MPS) dell’intero genoma umano, a differenza di altri test disponibili in commercio che invece impiegano una strategia diagnostica mirata, in cui il processo è limitato ai soli cromosomi 21, 18, 13, X e Y.
Analisi dell’intero genoma mediante Sequenziamento Massivo Parallello (MPS)
Metodi di sequenziamento mirato (5 cromosomi)
l’evoluzione tecnologica
Tecnologia di sequenziamento totale del genoma fetale
VeriSeq™ NIPT Analysis Software21
74+
15+ …
(Example)
Le sequenze cromosomiche del DNA fetale vengono quantificate mediante sofisticate analisi bioinformatiche, al fine di determinare la presenza di eventuali aneuploidie cromosomiche.
Per l’analisi bioinformatica viene utilizzato il software VeriSeq™, fornito in licenza esclusiva da Illumina / Verinata;
Il software VeriSeq™ è marcato CE-IVD, e quindi utilizzabile per applicazioni cliniche diagnostiche in vitro, in conformità alla normativa Europea (Direttiva 97/79/CE) ed al D.lgs. 332/2000;
Il software VeriSeq™ è stato validato su centinaia di migliaia di campioni clinici;
Maggiore garanzia dei risultati.
VeriSeq™ NIPT Analysis Software
Tecnologia di nuova generazioneMigliore qualità dei risultati
Totale Automazione e High Throughput
Procedura di laboratorio completamente automatizzata, dall’estrazione del DNA all’analisi dei dati
Capacità di analisi di elevati volumi di campioni
L’introduzione del Sequenziamento bidirezionale (Paired-end) del genoma fetale raddoppia il numero di letture, migliorando l’affidabilità del test.
Maggiore risoluzione
Tecnologia di nuova generazioneMigliore qualità dei risultati
Tecnologia di nuova generazioneMigliore qualità dei risultati
Determinazione della frazione fetale più accurata
Differenziazione del DNA di origine fetale da quello maternoin base alla differente lunghezza
Tecnologia di nuova generazioneMigliore qualità dei risultati
Fiorentino et al., Prenatal Diagnosis (2016) 36:304-311
rileva le aneuploidie anche a bassa FF (<4%)
rileva le aneuploidie anche a bassa FF (<4%)
Le linee guida Italiane e Internazionali* concordano nel dedicare particolare attenzione ai campioni a bassa frazione fetale in quanto ritenuti a maggiore rischio (da 4 a 10 volte) di aneuploidie cromosomiche
*-Ministero della Salute. Linee-Guida Screening prenatale non invasivo basato sul DNA (Non Invasive Prenatal Testing – NIPT). Maggio 2015-Committee Opinion No. 640: Cell-free DNA Screening for Fetal Aneuploidy. Obstet Gynecol 2015; 126:e31-7.-Society for Maternal-Fetal Medicine (SMFM) Publications Committee #36: Prenatal aneuploidy screening using cell-free DNA. Am J Obstet Gynecol2015;212:711-6.-Benn P, Borrell A, Chiu RW, et al. Position statement from the Chromosome Abnormality Screening Committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis. Prenat Diagn 2015; 35:725-34.
Fiorentino et al., Prenatal Diagnosis (2016) 36:304-311
Fiorentino et al., Prenatal Diagnosis (2016) 36:304-311
Performance procedura Standard
Performance procedura FAST
Validazione pre-clinica del test
Fiorentino et al., EJHG conference 2016
Performance casi clinici
Procedura e Servizi gratuiti
Procedura semplice ed intuitiva
Servizi gratuiti forniti con il test
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