1 1

Enzimski profili jetre

Predavanja iz Kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija -medicinska

biohemija Školska 2014/2015. godina

2 2

Vrste oštećenja jetre

• Akutno oštećenje jetre – Obično praćeno žuticom – Glavno akutno oboljenje jetre je:

• Akutni hepatitis • Holestaza

• Hronično oštećenje jetre – Hronični hepatitis

• Komplikacije su: – Ciroza – HCC – hepatocelularni karcinom

2

3 3

Vrste oštećenja jetre

Zavisno od tipa oštećenih ćelija:

•Hepatociti hepatocelularna bolest

•Ćelije bilijarnog trakta holestaza

•Sva oštećenja ćelija indukuju fibrozu kao adaptaciju ili

zarastanje

•Zavisno od dužine trajanja bolesti i genetskih faktora

određuju da li će doći do ciroze ili karcinoma

3

4 4

Bolesti jetre

Akutno oštećenje

Hronično oštećenje

Fibroza Ciroza Smrt

Oporavak bez posledica

Fulminantni hepatitis

Oporavak

Hepatocelularni Karcinom

Portalna hipertenzija ( ascites, encefalopatija)

Regeneracija

Nema regeneracije

5 5

Biohemijska dijagnostika oštećenja jetre

Laboratorijski testovi su važni u dijagnozi: 1. Tipa oštećenja hepatocelularni ili holestatski 2. Hroničnost oštećenja akutni ili hronični 3. Težine oštećenja srednje ili teško

5

6 6

Testovi za ispitivanje funkcije jetre:

1. Testovi za ispitivanje ekskretorne funkcije jetre 2. Testovi za ispitivanje sintetske funkcije jetre 3. Testovi za ispitivanje metaboličke funkcije jetre 4. Testovi koji se zasnivaju na ispitivanju supstanci

oslobođenih iz oštećenog tkiva jetre Enzimska dijagnostika

7

Testovi za ispitivanje endogenih supstanci koje se oslobađaju iz oštećenog tkiva

Hepatociti AST ALT GLD

Kanikularne membrane Epitela žučne kese Endotela centralne i Peritonealne vene Alkalna fosfataza

Gama-GT,5-nukleotidaza

Enzimska dijagnostika

8

Enzimska dijagnostika oboljenja jetre

1. Enzimi koji se sintetišu u jetri i funkcionišu u jetri i krvi holinesteraza i faktori koagulacije

2. Indikatorski enzimi a. Enzimi kod oštećenja hepatocita: aspartat aminotransferaza, alanin aminotransferaza, laktat

dehidrogenaza, sorbitol dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza, izocitrat dehidrogenaza

b. Enzimi kod oštećenja tj promena žučnih puteva lezija epitela ili opstrukcija žučnih puteva: alkalna fosfataza, gama-glutamiltransferaza, 5-nukleotidaza i leucinaminopeptidaza

9 9

Enzimi jetre

• U bolestima jetre povećane su aktivnosti

– citozolnih, mitohondrijalnih i membranski vezanih enzima

– profil i stepen povišenja enzimskih aktivnosti varira i zavisi od tipa

oboljenja jetre

– enzimi u jetri su važni u prepoznavanju i diferencijalnoj dijagnostici

oštećenja jetre

10 10

Enzimi jetre

• Nekoliko faktora utiču na sposobnost jetrenih enzima da sudeluju u dijagnozi oboljenja jetre:

1. Tkivna specifičnost 2. Subcelularna distribucija 3. Odnos enzimske aktivnosti u jetri i plazmi 4. Način oslobađanja enzima iz hepatocita 5. Klirens iz plazme

11 11

1. Tkivna specifičnost jetrenih enzima

• Šest enzima se koristi u dijagnozi jetrenih oboljenja:

• ALT, AST, ALP, GGT se uobičajeno koriste, a LD i CHE ređe

• ALT i GGT se nalazi u više organa, ali povišene vrednosti u plazmi pre svega odražavaju oštećenje jetre

• AST u jetri i mišićima (skeletni i srčani), nešto malo u eritrocitima

• LD je široko rasprostranjen u svim tkivima i relativno je nespecifičan

• ALP se nalazi u više tkiva ali njegova aktivnost u plazmi zdravih osoba potiče od jetrene i koštane izoforme

• Na osnovu tkivne distribucije:

• ALT i GGT su najspecifičniji markeri oštećenja jetre

12 12

2.Subcelularna distribucija enzima jetre

• Citozolni enzimi • AST, ALT i LD su citozolni enzimi

– pri oštećenju lako prelaze u plazmu – brzo se pojavljuju u plazmi

• Mitohondrijalni enzimi • AST i ALT postoje kao mitohondrijalni i citozolni izoenzimi

– ALT ima malo u mitohondrijama i kada se oslobodi pošto je poluživot mALT kratak brzo se eliminiše i nema dijagnostički značaj

– AST mitohondrijalni predstavlja značajnu frakciju ukupne aktivnosti AST u hepatocitima

• Membranski enzimi • ALP i GGT su membranski enzimi i to glikoproteini • Najvažnije njihovo mesto je u kanikularnim membranama

• GLD,NTP,GST

13

Mitohondrije

Lizozomi

Golđijev kompleks

Glatki endoplazmatični retikulum

Zrnasti endoplazmatični retikulum

Lokalizacija enzima u hepatocitima

AST, GLD

ALT, LAP,AST, LD, GST

ALP, GGT, 5’-NTP

Citoplazma

GGT Mikrozomi

14 14

3. Odnos aktivnosti enzima u jetri i plazmi

• Dijagnostička senzitivnost jetrenih enzima zavisi od odnosa aktivnosti (količine) enzima u jetri i u plazmi.

• Aktivnost AST u hepatocitima je 2x veća od ALT dok su plazmatske aktivnosti slične.

• Aktivnost LD je manja u hepatocitima u odnosu na transaminaze – Plazmatske aktivnosti LD su nekoliko puta veće od aktivnosti AST i

ALT u plazmi – Plazmatska aktivnost LD potiče iz nehepatičnih izvora – Zaključak manji je porast aktivnosti LD kod oštećenja jetre u

odnosu na transaminaze

15 15

3. Relativna aktivnost enzima jetre u plazmi

• Relativna količina enzima u tkivu nije isto u raznim bolestima – U cirozi i malnutriciji i alkoholizmu – Veće sniženje se vidi u c-ALT nego c-AST – Uticaj drugih mehanizama

• Razvoj imunoeseja za merenje ALT je ukazao na disproporciju između mase (M) ovog enzima i njegove aktivnosti (A) kod nekih oboljenja jetre – Zdrave osobe i hronični hepatitis A i M se menjaju paralelno. – Akutni hepatitis A >> M – Ciroza i hepatocelularni karcinom M > A

• Potrebna su dodatna istraživanja da se ovo objasni tj šta sve utiče na aktivnost enzima

16 16

4. Mehanizmi oslobađanja enzima jetre

• Postoji nekoliko mehanizama oslobađanja enzima iz hepatocita 1. Oštećenje ćelije

– omogućava izlazak citoplazmatskih enzima – minimalan je izlazak enzima iz ostalih delova ćelije

2. Inflamatorne bolesti – Izlazak citozolnih enzima pre svega ALT i AST i u manjem obimu LD, – Nema oslobađanja m-AST i membranskih enzima ALP ili GGT.

3. Nekrotično oštećenje – oslobađanje m-AST i membranskih enzima ALP ili GGT.

4. Drugi mehanizmi – Alkohol indukuje ekspresiju m-AST na površini hepatocita

17 17

4. Mehanizmi oslobađanja enzima jetre

• Mehanizam oslobađanja membranskih enzima u cirkulaciju – manje protumačen

1. Indukcija sinteze enzima – Povećana je indukovana sinteza GGT i ALP u bolestima jetre – Tačan mehanizam kojim ova indukovana sinteza povećava

aktivnost enzima se ne zna – Indukcija sinteze GGT

• Efekat alkohola • Efekat lekova - antikonvulzivi, varfarin, oralni kontraceptivi

18 18

4. Mehanizmi oslobađanja enzima jetre

• Mehanizam oslobađanja membranskih enzima

2. Uticaj holestaze na oslobađanje enzima – Fragmenti membrane hepatocita koji su bogati aktivnostima

GGT i ALP se mogu detektovati u plazmi kod pacijenata sa holestazom

– Fragmentacija membrane sa žučnim kiselinama

– Žučne kiseline su deterđenti mogu da solubilizuju i oslobode GGT i ALP sa plazmatske membrane

– ALP membranska se brže kreće anodno i naziva se:

– “brza jetrena” ili “makrohepatična” ili “alfa-1 izoenzim”

19 19

5. Klirens enzima jetre iz plazme

• Klirens enzima jetre varira i zavisi od poluvremena života • Klirens transaminaza

– Poluživot ALT je 47 sati – Poluživot c-AST je 17 sati – Iako se mnogo više oslobađa AST iz hepatocita duži poluživot

ALT utiče na više aktivnosti ALT u plazmi kod većine oboljenja jetre.

• Klirens membranskih enzima – Poluživot jetrene ALP varira od 1 do 10 dana – Poluživot GGT 4 dana

• Mehanizam uklanjanja jetrenih enzima iz plazme – Receptor zavisna endocitoza pomoću makrofaga jetre

20

Enzimi jetre • Transaminaze

– Alanin aminotransferaza ALT

– Aspartat aminotransferaza AST

• Laktat dehidrogenaza LD

• Alkalna fosfataza

• Holinesteraza

• gama GT

• Glutamat dehidrogenaza

• Glutation-S-transferaza

• 5’-nukleotidaza

• Pojam hepatogram

21

Laboratorijska dijagnostika oboljenja jetre Značaj enzima jetre

• Laboratorijski testovi pomažu u određivanju 1. Vrste oštećenja

– hepatocelularno ili holestazno 2. Hroničnost procesa

– akutni – hronični 3. Težina oštećenja

– Blago – teže • Enzimi aminotransferaze i ALP mogu da

razdvoje tip oštećenja (1)

22

Testovi za ispitivanje endogenih supstanci koje se oslobađaju iz oštećenog tkiva

Hepatociti AST ALT

Kanikularne membrane Epitela žučne kese Endotela centralne i Peritonealne vene Alkalna fosfataza

Gama-GT 5-nukleotidaza

Enzimska dijagnostika

23

Akutni hepatitis • Akutna inflamacija

– Predominantna limfocitna inflamatorna infiltracija • Uzroci akutnog hepatitisa (najčešći) • Virusni

• Hepatitis A HAV, hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV), postoji i hepatitis D (delta), E i G

• Lekovi • Direktno ili preko toksičnog metabolita

• Etanol • Ishemia

• Direktno oštećenje – Acetaminofen – Ishemijom

• Indirektno oštećenje imunološko oštećenje – hepatičnim virusima, većina lekova i alkohol

23

24 24

Enzimska dijagnostika u akutnom hepatitisu

Direktno oštećenje – Brz rast citoplazmatičnih enzima AST, ALT i LD – Sledi brz pad u zavisnosti od poznatih poluvremena života enzima

Indirektno - Imunološka oštećenja – Postepeni porast citoplazmatičnih enzima – Plato – Postepena eliminacija enzima

• Klinička tačnost enzimske dijagnostike kod akutnog hepatitisa

– Porast AST više od 200 U/L ili – Porast ALT više od 300 U/L – specifičnost i osetljivost veću od 90 % kod akutnog hepatitisa

25

Biohemijska dijagnostika akutnog hepatitisa Dinamika promena enzima

• Enzimska dijagnostika • Porast pre svega AST i ALT • Dinamika promena • U početku AST >ALT prvog dana • Posle viši ALT zbog dužeg t1/2

• AST može biti viši od ALT kod • Alkoholnog hepatitisa • Ciroze • Deficijencije piridoksal fosfata

• ALP je ili normalan ili malo povišen (< 3xURL) – Više vrednosti kod holestaze ili holestatskog hepatitisa 25

26 26

Biohemijska dijagnostika akutnog hepatitisa

• Enzimska dijagnostika – dinamika enzimskih promena – AST, ALT, AST/ALT, ALP – AST/ALT De Ritisov koeficijent – Pik aktivnosti – Trajanje povišenih vrednosti ALT

27 27

Dijagnostika akutnog hepatitisa B: enzimska dijagnostika i detekcija antigena i antitela

Rana enzimska dijagnostika

28 28

Enzimska dijagnostika u akutnom virusnom hepatitisu Porast enzima i bilirubina

•Svi akutni virusni hepatitisi (HAV, HBV i HCV) imaju sličan enzimski profil

•Dijagnoza na osnovu povišenih vrednosti aminotransferaza • 8 do 50 x više od URL

•ALT je tipično viši od AST zbog sporijeg klirensa.

• Aktivnosti enzima pokazuju pik pre pika u bilirubinu i ostaju povišeni 4-5 nedelja (duže ALT zbog t1/2)

29 29

Dijagnostika toksičnog hepatitisa

• Direktno oštećenje toksinom ili toksičnim metabolitom • Trovanje najčešće u Americi i Evropi sa acetaminofenom

(analgetikom) • Normalan metabolizam leka se odvija sa glutationom, kod

poremećaja javljaju se toksični metaboliti • Enzimska dijagnostika

– Porast hepatocelularnih enzima – Obično je LD više apsolutno povećan u odnosu na AST – AST je viši od ALT – Pik aktivnosti enzima > 100 x URL dostiže se za 24 do 48 sati – Posle sledi brzi klirens

30 30

Aktivnosti serumskih aminotransferaza u raznim bolestima jetre

31

Toksični efekti metabolizma etanola Oštećenje jetre

I. Masna jetra II. Hepatitis III. Ciroza jetre A. Redosled u oštećenju ćelija jetre

acetaldehid

masna jetra

indukcija sinteze kolagena

fibroza

ciroza

32

Enzimska dijagnostika akutnog alkoholnog hepatitisa

• Povećanje citozolnih enzima – AST je veći od ALT (2x veći) – AST/ALT >2 – AST > 8xURL – Uzrok viših vrednosti AST je :

• oštećenje mitohondrija i oslobađanje mitohondrijalnog enzima • deficijencija piridoksal-5’-fosfata zbog malnutricije • redukcija ALT zbog smanjene količine enzima u hepatocitima

• Povišen GGT – Izlazak enzima iz oštećenih ćelija i indukcija sinteze

• ALP (3x) umereno povišen izuzev ako je prisutna holestaza

33 33

Enzimska dijagnostika alkoholnog hepatitisa

Dinamika promena enzima • AST je viši od od ALT • GGT porast

• Indukcija sinteze

Značaj mitohondrijalnog izoenzima AST u raznim bolestima jetre

34

Laboratorijski nalazi hroničnog alkoholizma

• Markeri alkoholizma: – GGT test visoke osetljivosti, a niske specifičnosti zbog

interferencije lekova (za otkrivanje alkoholičara)

– Izoforma transferina • CDT carbohydrate-deficient transferrin – hiposialiltransferin ili asialiltransferin

(potvrda i praćenje alkoholičara)

35

Hronični hepatitis

• Inflamatorno oštećenje jetre • Traje duže od 6 meseci • Učestalost veća u odnosu na akutni hepatitis 2 važne komponente hroničnog hepatitisa: 1. Inflamatorno oštećenje jetrenog parenhima 2. Zarastanje fibrozom Inflamacija • Enzimska dijagnostika • ↑ AST i ↑ ↑ ALT • ALT može biti i normalan kod HCV (15%) i masne jetre • Dijagnoza: na osnovu neobjašnjivog porasta transaminaza Destrukcija hepatocita • Fibrozne trake, periportalna fibroza • Progres fibroze i ciroza • Dijagnoza biopsijom

35

36

Uzroci hroničnog hepatitisa

1. Nealkoholna masna jetra (NAFLD) 2. Nealkoholni steatohepatitis (NASH) 3. HBV i HCV 4. Autoimuni hepatitis Nasledne bolesti 5. Hemohromatoza 6. Wilsonovo oboljenje 7. Deficijencija alfa-1-antitripsina

Mali značaj određivanja aktivnosti enzima u postavljanju dijagnoze

36

37 37

Laboratoriski testovi u dijagnostici uzroka hroničnog hepatitisa

Uzrok Screening test Potvrdni test

HBV HBsAg HbeAg, HBV DNA

HBC Anti-HCV HCV RNA

NAFLD Ultrazvuk Biopsija jetre

Hemohromatoza Fe, TIBC, feritin Genetska analiza HFE

Wilsonova bolest Ceruloplazmin, Cu serum Cu urin

Biopsija jetre, genetika

Autoimunihepatitis ANA, anti tela na glatke mišiće

Biopsija jetre

38

Holestatske bolesti jetre • Holestaza nastaje zbog potpunog ili otežanog protoka žuči što uslovljava

retenciju žuči u ekskretornom sistemu.

• Opstrukcija - neadekvatan pojam

• Holestaza se javlja i bez mehaničke opstrukcije

• Podela holestaza: – Intrahepatična zbog funkcionalnih ili mehaničkih problema

– Ekstrahepatična obično zbog fizičke opstrukcije • žučnim kamencima –holedoholitijaza

• bilijarne strikture

• tumori

Glavne holestatske bolesti su: 1. Mehaničke opstrukcije žučnih puteva

2. Primarna bilijarna ciroza PBC

3. Primarni sklerozirajući holangitis

4. Druge bolesti: holangiopatija posle transplantacije koštane srži ili jetre, holestaze indukovane lekovima, AIDS, itd 38

39 39

Enzimska dijagnostika holestatskih bolesti jetre

Holestaza porast kanalikularnih enzima ALP i GGT

Uzroci porasta enzima:

1. Povećana sinteza enzima

2. Oslobađanje enzima vezanih za membranu

• Postoji lag faza u porastu enzima

• ALP je obično niži od GGT

• Blago povećanje ALP

• Porast ALP i GGT do platoa

Transaminaze

• Prolazno povećanje AST i ALT (vrednosti povišene kao kod akutnog hepatitisa)

• Brz pad u okviru referentnih vrednosti iako opstrukcija i dalje postoji

• Primena testova za dijagnozu, ali ne i za utvrđivanje uzroka

• Nema mogućnosti razdvajanja intrahepatične od ekstrahepatične opstrukcije

• Perzistirajući porast AST i ALT ukazuje na intrahepatičnu opstrukciju

40

Ciroza • Hronična, progresivna i neizlečiva bolest • Svaki hronični hepatitis ili hronična holestaza može da progredira u

cirozu • Patofiziološke promene su:

– Hepatocelularna nekroza, fibroza i prevođenje tkiva jetre u abnormalne čvorove (noduli)

• Rani stadijum ciroze – Nema simptoma

• Kasniji stadijumi imaju brojne komplikacije – Portalna hipertenzija – Hepatična encefalopatija

• Akumulacija supstanci koje se normalno eliminišu putem jetre

– Hepatorenalni sindrom – Ascit – Ciroza jetre nosi povećani rizik i za hepatocelularni karcinom

40

41

Enzimska dijagnostika u cirozi jetre

• Rani stadijum ciroze – Kompenzovana ciroza, nema promena u biohemijskim

parametrima

• Progresija ciroze – faza nekroze – Transaminaze 5x URL AST/ALT >1 – Povišen GGT, LD i ALP

• Terminalna faza – Snižena sintetska funkcija jetre – Snižena aktivnost holinesteraze – Smanjena aktivnost ostalih enzima jetre

41

42

Tumori jetre

1. Metastaze – Kod metastaza sa multiplim tumorima

• Povećan je nivo GGT i ALP

2. Benigni tumori hemangiomi

3. Primarni maligniteti jetre: – Hepatocelularni karcinom

– Holangiokarcinom

42

43

Transplantacija jetre

• Praćenje pacijenta i utvrđivanje ranih znakova

odbacivanja • Post-transplantacioni status jetre

– Jetreni enzimi ALT, LD, GGT i ALP – Posebno značaj GST

• Tumačenje dobijenih vrednosti – Porast enzima ukazuje na – Ponovno oboljenje jetre – Odbacivanje transplantata

43

Praćenje efekta terapije hipolipidemicima Preporuke ESC/EAS 20011

• Praćenje neželjenih efekata statina:

– rabdomijolize – hepatotoksičnost

• Određivanje aktivnosti enzima – CK – ALT

• Praćenje se preporučuje u intervalima od 6 do 12 meseci • U cilju monitoringa potencijalnih toksičnih sporednih efekata

• Kod pacijenata sa porastom funcionalnih testova jetre za 3X

URL obavezno uzeti u obzir da li konzumira alkohol ili ima masnu nealkoholičarsku jetru

• Ako je aktivnost i dalje povećana a isključene su ove bolesti, zaustaviti uzimanje statina

• Kada se vrednosti vrate na normalu moguće je ponovno uzimanje lekova

Praćenje jetrenih enzima kod terapije hipolipidemicima

• Koliko često treba određivati jetrene enzime (ALT) kod pacijenata koji primaju hipolipidemike ? – Pre tretmana – 8 nedelja posle početka terapije ili posle svake promene doze – Godišnje jedanput ako je ALT < 3X URL

• Šta treba uraditi ako se povećaju vrednosti jetrenih enzima kod pacijenata na terapiji hipolipidemicima ?

• < 3X URL – Nastaviti sa terapijom – Proveriti enzime za 4-6 nedelja

• > 3 X URL • Prestati sa statinima ili redukovati doze, proveriti enzime svakih 4-6

nedelja • Ponovno uvođenje terapije se može sprovesti tek kada se ALT vrati u

normalu

46 46

Dijagnostička strategija u ispitivanju funkcije jetre

Testovi za ispitivanje funkcije jetre se koriste:

– u detekciji i dijagnozi bolesti tj disfunkcije jetre – za evaluaciju težine bolesti – za praćenje terapije – za procenu prognoze

Glavni (najučestaliji) testovi za ispitivanje bolesti jetre 1. Plazmatska aktivnost enzima: ALT, AST, ALP, GGT i LD. 2. Albumin 3. PT 4. Bilirubin

47

Zaključak Enzimska dijagnostika

• Plazmatski enzimi • Alkalna fosfataza i transaminaze

• Diferencijacija hepatocelularnog od holestatskog oboljenja jetre

• Pacijenti obično imaju izolovan porast ALP ili aminotransferaza

Alkalna fosfataza • U praksi teško je protumačiti izolovanu, visoku aktivnost ALP

• Kod dece postoji benigna prolazna hiperfosfatemija

• Kod odraslih uvek treba prvo potvrditi da je ALP hepatobilijarnog porekla – Diferencijacija izoenzima ALP

– Merenjem drugih kanalikularnih enzima poput GGT i 5-NP čija je aktivnost paralelno povećana sa aktivnošću ALP u holestazi

47

48

Zaključak Enzimska dijagnostika

Transaminaze • Povišene aktivnosti AST i ALT se javljaju kod mnogih bolesti

• Da bi utvrdili da li je njihovo povećanje posledica bolesti jetre treba isključiti

lekove i alkohol (posebno ukoliko je AST veći od ALT)

• Ukoliko povećanje i dalje postoji, treba uraditi

1. Ultrazvuk (da se isključi nealkoholičarska hepatično oštećenje)

2. Serološko ispitivanje na hepatitis B i C

• Više od 50 % izolovanih enzimskih povećanih vrednosti je poreklom iz jetre

• Biopsija jetre je neophodna za specifičnu dijagnostiku

• Za dijagnozu fibroze koristi se samo biopsija jetre

48

49 49

Uloga enzima u dijagnostičkoj strategiji oboljenja jetre

50 50

Uloga enzima u dijagnostičkoj strategiji oboljenja jetre Tumačenje algoritma

• Prvo se odredi aktivnost jetrenih enzima • Povećana jedna transaminaza to je hepatocelularno oboljenje • Povećanje ALP ukazuje na holestatsko oboljenje • Povećanje samo alkalne fosfataze - utvrditi da li je ALP jetrena • Odredi se koštana alkalna fosfataza ili se odredi i drugi

kanalikularni enzim GGT ili NTP • Ako je ALP iz jetre onda imaging tehnike da se vide žučni kanali

– Dilatirani kanali ukazuju na ekstrahepatičnu mehaničku opstrukciju – Normalni kanali ukazuju na intrahepatičnu holestazu