Enzimoloģija

12. Lekcijas saturs:Praktiskā enzimoloģija. Enzīmi diagnostikā. Enzīmi terapijā. Enzīmi tautsaimniecībā.

Molekulāras bioloģijas (bioķīmijas)katedra 2009/2010. akad.gads

Praktiskā enzimoloģija1. Diagnostiskā enzimoloģija a) aktivitāte orgānos (prenatālā diagnostika) b) asinīs (klīnikā nosaka apmēram 30 enzīmu aktivitātes- svarīgākās AsAT, AlAT, LDH),izoenzīmi c) ELISA2. Enzīmi kā farmakopreparāti: a) aizvietotājterāpija b) hemostāzes modulācija c) viroterāpija d) onkoloģija e) pretiekaisuma terāpija3.Enzīmi rūpniecībā: himozīns (rennīns), amilāze, lipāzes 4. Praktiskās enzimoloģijas perspektīvas: a) liposomas b) imobilizācija c) rekombinantu biotehnoloģija d) gēnu terapija

Enzīmi prenatālai iedzimto slimību diagnostikai

Prenatāla iedzimto slimību diagnostikavisbiežāk tiek lietota glikogenožu, glikolipidožu,glikoproteidožu un mukopolisaharidožu diagnostikai

Indikatorie enzīmi asinīsAknu indikatorie enzīmi:1. Aminotransferāzes – AsAT, AlAT2. Holīnesterāze 3. Fruktozes -1,6- difosfāt aldolāze4. Histidāze5. SorbītdehidrogenāzeSirds indikatorie enzīmi:1. Laktātdehidrogenāze2. Aspartātaminotransferāze3. KreatīnkināzePankreasa indikatorie enzīmi:1. Amilāze2. LipāzeEritrocītu enzīmi:• Glikozes-6-fosfātdehidrogenāze Prostatas indikatorie enzīmi• Skābā fosfatāzeKaulaudu indikatorie enzīmi• Alkālā fosfatāze

Dažādi orgāniievērojami atšķirasar dažu enzīmu daudzumu tajos

Alkālai fosfatāzeiir daudzas izoformas

Visātrākais infarkta marķieris ir kreatīnkināzes MB izoforma (CK2)

Laktātdehidrogenāzes izoenzīmu spektrs dažādos orgānos

Indikatorie enzīmi urīnāPankreasa enzīmi• amilāze

Kaulaudu enzīmi•TRACP - tartrāta rezistentā skābās fosfatāzes izoforma

Urogenitalās sistēmas marķierenzīmi•γ-Glutamīltransferāze, γ-Glutamīlpeptīd : Aminoskābe•Laktātdehidrogenāze

Enzīmi bioanalītikā

1. Imunoenzimātiskās reakcijas: a) peroksidāze b) alkālā fosfatāze c) glikozooksidāze d) beta- galaktozidāze e) glukozes-6-fosfāt-dehidrogenāze f) malātdehidrogenāze2. Nukleīnskābju ķīmijā a) avidīna- biotīna konjugāti b) fluorescentie substrāti

Imunoglobulīnu analīzes metodes IIIImunoanalīzes metodes uz cietās fāzes:

imunoenzimātiskās metodes, radioimunometodes.

1. Imunometožu tipi: antivielu saistība (antibody capture assay) - piemērs: antivielu titra noteikšana ar enzīmsaistīto imunosorbenta analīzi (Enzyme-linked Immunosorbent Assays) antigēna saistība (antigen capture assay) divu antivielu saistība (two-antibody sandwich assys) 2. Populārākie ELISA varianti: a) tiešā ELISA b) netiešā c) konkurentā tiešā d) konkurentā netiešā e) divpusējā (sandwich)

3. Izpildīšanas tehnika

Imunoenzimātiskās reakcijas (netiešās ELISA) princips

Hemostāzi modulējošie enzīmi

Asins recēšanas faktori vairumā ir serīna proteināzes Fak- Nosaukums, Aktivātors Faktora funkcija Hemofīlijators sinonīmi (ko faktors aktivē)

I Fibrinogēns Trombīns AfibrinogenēmijaII Protrombīns Ca2+,vit.K, Fibrinogēns Hipoprotrombinēmija faktori V,XIII Audu faktors IV Ca2+ II,VII,IX,XV Proakcelerīns, X II,X Iedzimtā parahemofīlija Labīlais faktors, Akcelerātor globulīnsVI Neeksistē, kļūdas dēļ aktivēto V faktoru nosauca par VIVII Prokonvertīns Ca2+ , vit.K K vitamīna trūkums Sēruma protrombīna konversijas akcelerātors, KotromboplastīnsVIII Antihemofīlais faktors A, IX, etc. X Klasiskā hemofīlija A Antihemofīlais globulīnsIX Antihemofīlais faktors B, Ca2+ , vit.K VIII, X Hemofīlija B, Kristmas faktors , K vitamīna trūkums Plazmas tromboplastīna komponentsX Stujarta-Power factor Ca2+,vit.K, II Iedzimtais K vitamīna trūkums VIII,IXXI Plazmas tromboplastīns XII IX Hemofīlija C XII Hagemana faktors kollagēns, XI Iedzimts trūkums kallikreīns XIII Fibrīnu stabilizējošais faktors II I Iedzimts trūkums Fibrinoligāze Fibrīna recekli vēlāk šķīdina plasminogēns (plazmīns),kuru aktivē audu plazminogēna aktivātors (Tissue plasminogen activator,(alteplase), urokināze, streptokināze etc.

EC 2.3.2.13Accepted name: protein-glutamine γ-glutamyltransferaseReaction: protein glutamine + alkylamine = protein N5-alkylglutamine + NH3Other name(s): transglutaminase; Factor XIIIa; fibrinoligase; fibrin stabilizing factor; glutaminylpeptide γ-glutamyltransferase; polyamine transglutaminase; tissue transglutaminase; R-glutaminyl-peptide:amine γ-glutamyl transferase

Systematic name: protein-glutamine:amine γ-glutamyltransferase

Comments: Requires Ca2+. The γ-carboxamide groups of peptide-bound glutamine residues act as acyl donors, and the 6-amino-groups of protein- and peptide-bound lysine residues act as acceptors, to give intra- and inter-molecular N6-(5-glutamyl)-lysine crosslinks. Formed by proteolytic cleavage from plasma Factor XIIIReferences:

1. Folk, J.E. and Chung, S.I. Molecular and catalytic properties of transglutaminases. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 38 (1973) 109-191. [Medline UI: 74169138]

Faktors XIII, fibrinoligāze ir transferāze

Asins recēšanas vispārējā shēma

Stjuarta-Povera faktors

Enzīmi citu slimību ārstēšanā

Preparāts Ražotājs Indikācija Reģistr.gads

Glukocerebrozidāze Genzyme Gošē slimība 1994DN-āze (pulmozīms) Roche Cistiskā fibroze 1994Superoksīddismutāze Nippon Sirds slimības III F. 1994Rasburikāze Sanofi Podagra 2002alfa-galaktozidāze Genzyme Fabrī slimība 2001beta- galaktozidāze Genzyme Fabrī slimība 2001Glukozaminoglikān- Genzyme Mukopolisaharidoze 2003iduronidāzeAsparagināzeTripsīnsPepsīnsLipāzesHimotripsīnsRibonukleāze

Glikolipidožu terapijai arī mēģina lietottrūkstošos enzīmus

Enzīmi tautsaimniecībā

LignīnsAugstmolekulārs zarots polimērs no fenīlpropionskābes atliekām (C6-C3)

3

2 1

Lignin is a complex polymer of phenylpropanoid subunits. It is an essential component of woody tissue, to which it imparts structural rigidity. Lignin is remarkably resistant to degradation by most microbes; nevertheless, a few species of white-rot fungi are able to catalyse its oxidation to CO2. Its biodegradation is of great ecological significance because, next to cellulose, lignin is the most abundant renewable polymer on Earth. The first step in lignin degradation is depolymerization, catalysed by the lignin peroxidase isozymes (ligninases). These isozymes are secreted, along with hydrogen peroxide (H2O2) by the fungus Phanerochaete chrysosporium Burds. under conditions of nutrient (nitrogen) limitation. Ligninases are not only important in lignin biodegradation, but are also potentially valuable in chemical waste disposal because of their ability to degrade environmental pollutants. We have undertaken the cloning of the ligninase genes to understand further their regulation and enzymology. We report here the isolation and characterization of a ligninase complementary DNA clone with a full-length insert. The cDNA sequence shows that the sequence of the mature ligninase is preceded by a 28-residue leader, and the mature protein is predicted to have a relative molecular mass of 37,000 . Consistent with the classification of ligninase as a peroxidase certain residues thought to be essential for peroxidase activity can be identified and near these residues the ligninase shows homology with other known peroxidases. Our cDNA clone has also allowed us to show that expression of ligninase is regulated at the messenger RNA level.

Grūtības enzīmu pielietošanā un to pārvarēšana

Enzīmu biotehnoloģija

1. Mikrobialā biosintēze

2. Rekombinantu biotehnoloģija

3. Virzīta mutagenēze

4. Enzīmu imobilizācija