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Enzimi: concetti di base e meccanismi di catalisi enzimatica

a. Classificazione, meccanismo d’azione

b. Esempi di reazioni catalizzate

c. Descrizione di alcune tipiche proteine enzimatiche.

Cofattori e vitaminea. caratteri generali, funzioni, effetti biologici b. regolazioni metaboliche delle vitamine A, D, E, F, K,

B1, B2, B3, B6, B8, B12, C, H, PP; c. trasformazione di vitamine in coenzimi.

Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 2

Gli enzimi

Gli enzimi promuovono effetti catalitici. Possono essere proteine semplici ma spesso possiedono un gruppo prostetico che è fondamentale per la regolazione degli effetti catalitici.Quando siamo in presenza di un enzima che sia una proteina coniugata si indica:

OloenzimaOloenzima= = apoenzimaapoenzima++coenzimacoenzima

Apoenzima: parte proteica semplice, alcuni enzimi sono solo apoenzimiCoenzima: gruppo prostetico, parte non proteica (derivato da una vitamina o metallo) che determina gli effetti catalitici


Classificazione degli enzimi

Sono stati individuati 6 tipi fondamentali di reazioni enzimatiche:1.OSSIDOREDUTTASICHE (trasporto di elettroni)2.TRANSFERASICHE (trasferimento di gruppi)3.IDROLASICHE (scissione o resintesi con partecipazione di H2O)4. LIASICHE (formazione o scissione reversibile di legami)5. ISOMERASICHE (isomerizzazione del substrato)6. LIGASICHE (sintesi irreversibile di legami con consumo di

composti ad alta energia)

Sono di conseguenza state individuate 6 classi di enzimi, una per ciascuna delle reazioni suindicate.


Classificazione degli enzimi

Ogni enzima è classificato con un codice a 4 cifre: a. b. c. da: si riferisce alla classe (reazione catalizzata, es. 4. liasi)b-c: si riferiscono alla modalità della catalisi e individuano la sottoclasse e la sotto-sottoclassed: numero di serie dell’enzima all’interno della sotto-sottoclasse.

Consideriamo ora una classificazione ordinata


1. OSSIDOREDUTTASI

Trasportano unità riducenti, (H+)+(e-)La sottoclasse indica il donatore dell’H (alcool, aldeide ecc.) o altre unità riducenti (es. alcooldeidrogenasi). I vari numeri indicano i vari tipi di substrato che possono donare unità riducenti. Il 3° numero indica l’accettore delle unità riducenti (NAD+, FAD, Citocromo ecc) (es. alcooldeidrogenasi: accettori sono enzimi del metabolismo lipidico oppure citocromi, il numero progressivo individua la reazione). Il 4° numero indica il numero di serie nella sotto-sottoclasse.


1. OSSIDOREDUTTASI: coenzimi

Le ossidoreduttasi sono proteine coniugate (apoenzima + coenzima). Il coenzima deriva dalla trasformazione da una vitamina oppure è una struttura che la cellula è in grado di prodursi: per esempio le strutture tetrapirroliche del protoemo nei citocromi.Nel dettaglio vedremo le caratteristiche di reazione di ossidoriduttasi di tipo:

PIRIDINICO (coenzima derivato dalla VITAMINA PP)FLAVINICO (coenzima derivato dalla VITAMINA B2 )CHINONICO (coenzima Q oppure derivato dalle VITAMINE E, K )PTERINICO (coenzima derivato dalla VITAMINA B8 )VITAMINA C DIPENDENTI


OSSIDOREDUTTASI con coenzima PIRIDINICO (NAD+ e NADP +)

I coenzimi piridinici utilizzati da questa classe di ossidoreduttasiderivano dalla vitamina PP

3

2

4

N1

5

6

O

NH2


N

C

O

NH2 VITAMINA PP

N

C

O

NH2

-OH

NH3

[1]Ne sono dipendenti molti animali e molti eucarioti. E’ l’eterociclo della piridina che in posizione 3 ha un gruppo amidicoSi tratta dell’amide dell’acido nicotinico [1]: dopo l’assunzione abbiamo l’idrolisi del legame amidico e quindi liberazione dell’acido nicotinico [2] che servirà per la sintesi del coenzima. In caso di deficienza soltanto le cellule animali hanno selezionato un sistema di supporto che utilizza gli intermedi del metabolismo del triptofano per sintetizzare un acido dicarbossilico ciclico: l’acido chinolinico [3].

N

C

O

OH

[2]

N

C

O

OH

C

O

OH

[3]


COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [1]

Per la costruzione del coenzima sono necessari l’eterociclo della piridina, mono o disostituito con il carbossile (ACIDO NICOTINICO O CHINOLINICO). Inoltre è necessario, un saccaride, il RIBOSO. Si ottiene nella forma fosforilata sulla posizione 5 e con difosforilazionecon l’anidride esterna dell’acido fosforico sulla posizione 1.

O

OH

P O

OH

OH

H

OH

H2C

H

P

O

O

OHOH

O

OPOH

OH

15

N

C

O

OH

ACIDO NICOTINICO RIBOSO-5-FOSFATO-1-PIROFOSFATO



In questi enzimi avremo quei metalli di transizione (Me) che sono in grado di dare legami dativi con l’atomo di ossigeno che in seguito diventano legami covalenti: questo effetto si compie sull’O legato al C1 del riboso: viene sottratta la struttura pirofosforica sulla posizione 1 su cui compare una carica +: il C1 diventa C+, in contemporanea si ha una inversione di configurazione del C1 da α a β.Il C1+ può quindi ricevere attacco nucleofilo dal N1 del substrato (acido nicotinico o acido chinolinico). Si forma il prodotto di addizione e viene eliminato del pirofosfato (PPi).

O

OH

P O

OH

OH

H

OH

H2C

H

P

O

O

OHOH

O

OPOH

OHN

C

O

OH

+

Me

CH+ O

H

OH

H

OH

H2C

H

P

O

O

OHOH

N

C

O

OH

+ PPi


COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [3]La struttura che si forma è costituita da un pentoso legato all’acido fosforico (in posizione 5 del riboso) e ad un’eterociclo azotato (o base azotata) tramite legame del C1 del riboso con l’N1 dell’eterociclo. Possiamo definire questa struttura un nucleotide: il nicotinato mononucleotide (NMN) oppure il chinolinato mononucleotide (CMN).

OH

OH

H

OH

CH2O P

H

N+

COOH

COOH

CMN

OH

OH

H

OH

CH2O P

H

N+

COOH

NMN



Il chinolinato mononucleotide viene ulteriormente modificato da un metalloenzima Mn dipendente che riconosce il COOH in posizione 2 dell’eterociclo e lo sottrae sotto forma di CO2, generando quindi il nicotinato mononucleotide che serve per la formazione del coenzimafunzionale.

OH

OH

H

OH

CH2O P

H

N+

COOH

COOH

Mn

OH

OH

H

OH

CH2O P

H

N+

COOH

+ CO2


COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [5]La sintesi del coenzima prevede una ulteriore reazione del nicotinato mononucleotide con ATP:

un Mn enzima riconosce l’ossigeno del legame di anidride che collega il Pα con il Pβ e destabilizza il legame tramite la transizione dativo-covalente dell’interazione Mn-O. Il Pα diventa sede di una carica + su cui da attacco nucleofilo uno degli atomi di ossigeno del fosforile del nicotinato. Quando il legame Mn-O ritorna dativo si libera pirofosfato e il prodotto di condensazione: il nicotinato adenin dinucleotide, ossia la forma desaminatadel NAD+ (desamido-NAD+).

N

N

N

N

NH2

OO

OHOH

P

O

OHP

O

OOH

OHOH

O

O

PN

N

N

N

NH2

OO

OHOH

P+O

OH

N+

COOH

OO

OH OH

OH

OHO P

Mn



Per ottenere la forma attiva del coenzima (NAD+) si ha la seguente reazione:desamidoNAD+ + ATP + Q → ADP + Pi +E + NAD+

La reazione si basa sulla destabilizzazione del legame amidico della glutammina(Q) che viene scomposta a acido glutammico e un gruppo amminico che si trasferisce sul carbossile dell’acido nicotinico che torna quindi a formare una nicotinamide.Si ottiene il primo coenzima piridinico attivo, il NICOTINAMIDE ADENIN DINUCLEOTIDE (NAD+).

NAD+

O

N+

OO

OH OH

OH

O P

NH2

N

N

N

N

NH2

OO

OH

P

O

OHO

OH

O

N+

OO

OH OH

OH

O PN

N

N

N

NH2

OO

OH

P

O

OHO

OH

OH

desamidoNAD+



L’altro coenzima piridinico attivo si ottiene dal NAD+ tramite fosforilazionedella posizione 2 del riboso legato all’anello purinico dell’adenina.

NAD+ + ATP → ADP + NADP+

I due coenzimi hanno identico meccanimo di azione ma sono caratterizzati da un differente pH isoionico ed isoelettrico, poiché uno (il NADP+ ) contiene un gruppo fosforico e ha quindi una carica netta negativa maggiore. Questi coenzimi interagiranno quindi con proteine che hanno simmetricamente un diverso pH isoelettrico ed eventualmente cariche positive complementari a quelle del coenzima. Alcune apoproteine si legheranno in modo specifico al NAD+ e altre al NADP+ a formare differenti oloenzimi ossidoreduttasici piridinici.

O

N+

OO

OH OH

OH

O P

NH2

N

N

N

N

NH2

OO

OH

P

O

OHO

PO

O

OH

OH


Struttura trimensionaledel coenzima

La molecola da un punto di vista spaziale risulta ripiegata intorno ad un asse in corrispondenza dell’O che connette i due gruppi fosforici. I due eterocicli si trovano su piani affacciati e paralleli. Tra i due piani si collocano i metalli cofattori, ioni

metallici bivalenti (Ca2+ Mg2+ Mn2+ ), effettori della catalisi, che danno 4 interazioni con gli atomi indicati dagli asterischi *

O

N+

OO

OH OH

OH

O P

NH2

N

N

N

N

NH2

OO

OH

P

O

OHO

OH

*

*

**


Effetto catalitico

I metalli cofattori catalizzano la ridistribuzione del sistema di insaturazioni: la adenina transisce dalla forma lattimica alla forma semilattamica, e questo effetto, amplificato dai metalli cofattori si trasmette alla piridina, che verrà a trovarsi in 2 possibili forme di risonanza: la aromatoide e la chinoide.

N

O

NH2

+

H

CH3

N

O

NH2

H

Chinoide (NAD(P)H + H+)

+ H + elettrone

Aromatoide (NAD(P)+)


Effetto catalitico

La transizione scatenata dall’equilibrio tra le due forme di risonanza fa sì che sulla posizione 4 si concentri la carica positiva portata in precedente dall’N e che possa essere fissato in 4 un atomo di idrogeno in più mentre un elettrone viene accettato dal sistema delocalizzato degli anelli. Si forma pertanto una struttura neutra.

Le ossidoreduttasi che contengono questi coenzimi operano reversibilmente, catalizzando la riduzione o l’ossidazione dei substrati.

NAD+

NADP++ XH2

ossidazione

riduzioneX +

NADH + H+

NADPH + H+

La catalisi è stereospecifica: il substrato interagisce con il coenzimasolo solo se si trova in una conformazione sterica appropriata.


Interazione coenzima-apoproteina

L’interazione con la proteina è esclusivamente salina, il coenzima si lega all’apoproteina tramite interazioni dei fosforili del pirofosfato. Nei coenzimi NADP viene coinvolto anche il gruppo fosforico presente in 2’. Gli enzimi che interagiscono con NAD o NADP hanno pH isoelettrico differente.

Nelle cellule eucariotiche:I coenzimi NAD sono presenti in enzimi intra-mitocondriali.I coenzimi NADP in enzimi extra-mitocondriali

Eccezione: le ossidoreduttasi della glicolisi utilizzano NAD anche se la glicolisi è extra-mitocondriale.


Interazione coenzima-apoproteina

•Durante il trasferimento delle unità riducenti si realizzano nel sito attivo dell’enzima dei cambiamenti conformazionali che fanno variare la costante di dissociazione (Kd) tra coenzima e apoproteina, fino a farla aumentare di un fattore 103-104

•Il coenzima trasformato dissocia (infatti all’aumentare della Kd diminuisce l’affinità del coenzima per la apoproteina) e lo stesso enzima trasformato può essere accettato da un’altra apoproteina che lo utilizzerà per una reazione spostata in verso opposto rispetto alla precedente


Substrati delle ossidoreduttasi con coenzimi piridinici. Tipo 1

Coinvolgono unità MONOCARBONIOSE (gruppi con un solo atomo di carbonio).

CH-OH alcool 2ario + NAD+ C=O (chetone) + NADH + H+

CH2-OH alcool 1ario + NAD+ CHO (aldeide) + NADH + H+

CHO aldeide + NAD+ COOH (carbossile) + NADH + H+

COOH carbossile: può essere ossidato a CO2 o ridotto a -CHO

il gruppo aminico può andare incontro a desaminazione ossidativa

H2N-C-H + NAD+ C=NH (immino gruppo) + NADH + H+


Esempio: passagio aldeide-acido

E0 + NAD+ E1- NAD+ + R-C-OH E2- NAD+

E3- NADH E4-Zn + NADH + H3PO4 E5-Zn

SH

OH

HS

R-C-OHH

SR-C=O

SR-C=O

S+ R-C-OP

O


Substrati delle ossidoreduttasi con coenzimi piridinici. Tipo 2

Alcune ossidoreduttasi NAD dipendenti hanno potenziale standard che consente l’interazione diretta con altre ossidoreduttasi.

In particolare si ha l’interazione con enzimi redox che hanno coenzimi flavinici.

FADH2 FAD + NAD(P)+ + NAD(P)H + H+

FMNH2 FMN

E’ IMPORTANTE PER LE CATENE REDOX, es. catena respiratoria


Substrati delle ossidoreduttasi concoenzimi piridinici. Tipo 3

Possono interagire con l’ossigeno molecolare NAD(P)H + H+ + O2 NAD(P)+ + OH- + OH•Si tratta di MONO-OSSIGENASI

Si forma un radicale OH• e a questo punto l’enzima puòospitare nel sito attivo il substrato su cui avviene una sostituzione radicalica ad opera del radicale OH•(ossigenazione). Es. un gruppo metilenico diventa un alcol.

Alcuni batteri che operano per il disinquinamento trasformano gli idrocarburi in alcoli che sono poi in grado di metabolizzare.

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