“enzimas proteolíticas de vegetales superiores”
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOacuteGICAS
LIProVe
Trabajo de Tesis Doctoral
Estudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas y su
comparacioacuten con bromelina
Mariacutea Eugenia Errasti
(Director Dr Neacutestor Oscar Caffini)
2013
El motivo con que fueron construidas las guardas de la portada estaacute presente en tejidos elaborados con las fibras extraiacutedas de las hojas de Bromelia hieronymi (chaacuteguar) ambas actividades realizadas
por mujeres pertenecientes a la comunidad wichiacute (Sastre et al 2013)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Indice
1 Introduccioacuten general y Objetivos
11 Productos Naturales Medicina Tradicional y Fitomedicinas 1
12 Generalidades de la familia Bromeliaceae 3
121 Importancia Usos 5
1211 Uso comestible 5
1212 Obtencioacuten de fibras 6
1213 Usos medicinales 7
13 Tipos de Proteasas Distribucioacuten y Rol en los Vegetales 9
131 Proteasas Tipos y sistemas de clasificacioacuten 9
1311 Sistema EC de clasificacioacuten de enzimas 10
1312 El Sistema MEROPS de clasificacioacuten de peptidasas 11
132 Distribucioacuten de proteasas en los seres vivos 12
133 Rol de las peptidasas en los vegetales 13
1331 Peptidasas cisteiacutenicas 14
14 Enzimas Proteoliacuteticas de Bromeliaceae 16
141 Endopeptidasas del ananaacute 16
1411 Bromelina de tallo 17
1412 Ananaiacutena 17
1413 Comosaiacutena 18
1414 Bromelina de fruto 18
142 Balansaiacutena 18
143 Hieronymaiacutenas 19
1431 Hieronymaiacutena I 19
1432 Hieronymaiacutena II 19
1433 Hieronymaiacutena III 20
144 Macrodontaiacutenas 20
15 Objetivos 21
16 Referencias 23
2 Material Vegetal
21 Material Vegetal Utilizado 28
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211 Bromelia hieronymi Mez 28
2111 Extracto parcialmente purificado de frutos de B hieronymi (Bh) 28
212 Bromelia balansae Mez 28
2121 Extracto parcialmente purificado de frutos de B balansae (Bb) 29
213 Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [=P sagenarius (Arruda) Camargo]29
2131 Extracto parcialmente purificado de frutos de P macrodontes (Pm) 29
214 Ananas comosus (L) Merr 30
215 Reactivos quiacutemicos 30
22 Caracterizacioacuten proteoliacutetica de los extractos parcialmente purificados (Bh Bb y Pm) y de bromelina 30
221 Teacutecnicas y metodologiacutea 30
2211 Dosaje de la actividad caseinoliacutetica 30
2212 Cuantificacioacuten del contenido proteico 31
2213 Isoelectroenfoque 31
2214 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 32
2215 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina 33
22151 Tratamiento con E-64 33
222 Resultados 33
2221 Perfiles de pI y de peso molecular de Bh Bb y Pm 33
2222 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina 35
23 Referencias 38
3 Efecto antiinflamatorio
31 Inflamacioacuten 39
311 Inflamacioacuten aguda 39
3111 Respuesta vascular 39
3112 Respuesta celular 40
3113 Mediadores quiacutemicos 40
312 Regulacioacuten y resolucioacuten de la inflamacioacuten 43
313 Inflamacioacuten croacutenica 44
314 Proteasas como antiinflamatorios 45
3141 Bromelina 46
31411 Efecto sobre los componentes de la coagulacioacuten 47
31412 Efecto sobre el sistema de calicreiacutenas 47
31413 Efecto sobre la viacutea de la COX y NOS 47
31414 Modulacioacuten de moleacuteculas de superficie celular 47
31415 Activacioacuten celular y produccioacuten de citoquinas 48
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32 Objetivos 49
33 Materiales y meacutetodos 50
331 Modelos de inflamacioacuten 50
3311 Modelos de inflamacioacuten aguda Edema de pata de rata 50
33111 Edema de pata inducido por carragenina 50
331111 Procedimiento experimental 51
33112 Edema de pata inducido por histamina 51
331121 Procedimiento experimental 51
33113 Edema de pata inducido por serotonina 52
331131 Procedimiento experimental 52
33114 Equipamiento medidas y caacutelculo del volumen de edema 52
3312 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma 53
331 21 Procedimiento experimental 53
3313 Caacutelculo del efecto antiinflamatorio y anaacutelisis estadiacutestico 53
332 Animales 54
333 Dosis 54
334 Material vegetal ensayado 54
34 Resultados y Discusioacuten 56
341 Modelos de inflamacioacuten aguda 56
3411 Edema de pata de rata inducido por carragenina 56
34111 Bromelia hieronymi 56
341111 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina 57
34112 Pseudananas macrodontes 59
341121 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm 60
34113 Bromelia balansae 61
341131 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb 61
3412 Otros modelos de inflamacioacuten aguda 63
34121 Edema de pata inducido por histamina en ratas 63
34122 Edema de pata inducido por serotonina en ratas 64
341221 Bromelia hieronymi 64
341222 Pseudananas macrodontes 65
342 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma 65
3421 Bromelia hieronymi 65
34211 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina
en el test del granuloma 67
3422 Pseudananas macrodontes y Bromelia balansae 69
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34221 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb en el
test del granuloma 70
34222 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm en el
test del granuloma 71
3423 Posible relacioacuten entre la actividad proteoliacutetica-accioacuten antiinflamatoria-
modulacioacuten sobre poblacioacuten linfocitaria T 74
35 Conclusiones 77
36 Referencias 78
4 Efecto anticoagulante fibrinogenoliacutetico y fibrinoliacutetico
41 Hemostasia 82
411 Vasoconstriccioacuten 82
412 Formacioacuten del trombo plaquetario 82
413 Coagulacioacuten 83
4131 Fase inicial 85
4132 Fase de amplificacioacuten 86
4133 Fase de propagacioacuten 86
4134 Formacioacuten de fibrina 87
4135 Regulacioacuten de la coagulacioacuten 89
414 Fibrinoacutelisis 90
42 Trombosis 91
421 Agentes para el tratamiento de la trombosis 93
4211 Proteasas vegetales como antitromboacuteticos 94
43 Objetivos 95
44 Materiales y meacutetodos 95
441 Efecto anticoagulante 95
4411 Ensayos in vitro 95
44111 Pool de plasma pobre en plaquetas 95
44112 Tiempo de protrombina (TP) 96
44113 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 97
44114 Efecto de la inhibicioacuten de la actividad proteoliacutetica sobre la
accioacuten anticoagulante 98
44115 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados 98
4412 Ensayos in vivo 98
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v
44121 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados 99
442 Efecto fibrinogenoliacutetico 100
4421 Hidrolizados 100
4422 Tricina-SDS-PAGE 101
443 Efecto fibrinoliacutetico 102
4431 Placa de fibrina 102
4432 Caacutelculos y anaacutelisis de resultados 103
444 Material vegetal 104
45 Resultados y discusioacuten 105
451 Efecto anticoagulante 105
4511 Ensayos in vitro 105
45111 Tiempo de Protrombina (TP) 106
45112 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 108
45113 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de los preparados
proteoliacuteticos sobre su efecto anticoagulante 112
4512 Ensayos in vivo 114
452 Efecto fibrinogenoliacutetico 116
453 Efecto fibrinoliacutetico 119
46 Conclusiones 122
47 Referencias 123
5 Efecto antitumoral
51 Las causas de la aparicioacuten del caacutencer 125
52 Epidemiologiacutea del caacutencer 126
53 Carcinoma Hepatocelular 128
531 Factores de riesgo 128
532 Patogeacutenesis molecular 129
533 Tratamiento 129
54 Terapia enzimaacutetica sisteacutemica en pacientes con caacutencer 130
55 Objetivos 130
56Materiales y meacutetodos 131
561 Cultivo celular 131
562 Tratamientos 131
5621Evaluacioacuten de la viabilidad celular (Ensayo con MTS) 131
5622 Ensayo de adhesioacuten celular (Tincioacuten con cristal violeta) 132
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vi
563 Anaacutelisis estadiacutestico 132
564 Material vegetal ensayado 132
57 Resultados y discusioacuten 133
571 Ensayo de viabilidad 133
572 Ensayos de adhesioacuten 133
573 Efecto de la actividad proteoliacutetica sobre los porcentajes de viabilidad
y de adhesioacuten celular 135
58 Conclusiones 139
59 Referencias 140
6 Conclusiones finales y perspectivas 142
Agradecimientos 146
1 INTRODUCCIOacuteN GENERAL Y OBJETIVOS
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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1
11 Productos Naturales Medicina Tradicional y Fitomedicinas
Los productos naturales en especial los de origen vegetal han sido una importante
fuente de agentes terapeacuteuticos Los medicamentos derivados de productos naturales
representan alrededor de un 25-30 de los agentes terapeacuteuticos actuales Si bien en las
uacuteltimas deacutecadas debido al avance de la quiacutemica combinatoria la investigacioacuten sobre
productos naturales en la industria farmaceacuteutica ha mostrado una desaceleracioacuten para
algunas enfermedades complejas los productos naturales todaviacutea constituyen una fuente
muy valiosa para la produccioacuten de nuevas entidades quiacutemicas ya que representan
estructuras seleccionados por mecanismos evolutivos durante millones de antildeos (Calixto
2005)
Los ldquoFitomedicamentosrdquo o ldquoFitomedicinasrdquo constituyen una categoriacutea especial de
drogas vegetales Una de las criacuteticas tradicionalmente formuladas a la Medicina Natural o
Medicina Tradicional es la falta de normalizacioacuten o estandarizacioacuten de los materiales
bioloacutegicos pero las fitomedicinas difieren de las asiacute llamadas ldquoplantas medicinalesrdquo en que
estaacuten normalizadas o estandarizadas lo que significa que ciertos compuestos que estaacuten
presentes en el material vegetal se han cuantificado y dilucidado con lo que en principio se
cuenta con un producto final de composicioacuten maacutes o menos constante (Israelsen 1993) en la
medida en que se respeten la eacutepoca y el lugar de recoleccioacuten (Bennett et al 1990)
En contraste con los millones de doacutelares y antildeos de investigacioacuten necesarios para
desarrollar un nuevo medicamento por siacutentesis o incluso desde el prototipo de una fuente
natural el desarrollo de fitofaacutermacos estandarizados exige menos presupuesto y parece ser
perfectamente factible en los paiacuteses en desarrollo Esta aacuterea estaacute recibiendo mucha
atencioacuten en Brasil y en la mayoriacutea de los paiacuteses de Ameacuterica Latina Por otra parte la
comercializacioacuten de las fitomedicinas se ha expandido en todo el mundo durante los uacuteltimos
antildeos especialmente en paiacuteses de Europa como Alemania Francia Italia Reino Unido
Espantildea y maacutes recientemente tambieacuten en los Estados Unidos de Ameacuterica (Calixto 2005)
El intereacutes por las plantas medicinales y las fitomedicinas adopta diferentes
caracteriacutesticas en las diferentes partes del mundo De acuerdo a la Organizacioacuten Mundial de
la Salud aproximadamente el 65-80 de la poblacioacuten de los paiacuteses en desarrollo como
consecuencia de la pobreza y de la imposibilidad de acceso a la medicina moderna
dependen esencialmente de las plantas para la Atencioacuten Primaria de la Salud (Calixto
2005) En todo el continente africano alrededor del 80 de sus habitantes utilizan
fitomedicinas especialmente en el tratamiento de enfermedades que resultan prevalentes
en la zona tales como el VIHSIDA el paludismo la anemia falciforme o drepanociacutetica la
diabetes y la hipertensioacuten Los defensores de las fitomedicinas argumentan que son maacutes
beneficiosas que sus equivalentes sinteacuteticos por ser seguras econoacutemicas aceptables
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culturalmente y adecuadas para tratamientos croacutenicos sugiriendo que su uso deberiacutea
integrarse a la agenda de Salud de dichos paiacuteses (Okigbo amp Mmeka 2006)
La produccioacuten de plantas medicinales y aromaacuteticas tiene una larga tradicioacuten en varios
paiacuteses de Europa tales como el Reino Unido Italia Grecia Alemania Austria y Francia
mientras que en Finlandia Irlanda y Holanda se ha establecido a lo largo de las uacuteltimas
deacutecadas (Verlet amp Leclercq 1998) Desde la deacutecada del 90 se ha producido un
resurgimiento en el intereacutes y el uso de productos de plantas medicinales en Ameacuterica del
Norte y Europa Estudios sobre el uso de plantas medicinales por el puacuteblico norteamericano
han mostrado un aumento en el consumo de casi el 3 de la poblacioacuten en 1991 a maacutes del
37 en 1998 Un factor importante que sin duda contribuyoacute a dicho incremento fue la
promulgacioacuten en ese paiacutes de la legislacioacuten federal de 1994 (Dietary Supplement Health and
Education Act) que facilitoacute la produccioacuten y comercializacioacuten de productos fitomedicinales y
el consiguiente ingreso de varias compantildeiacuteas farmaceacuteuticas importantes en la produccioacuten de
fitomedicinas (Brevoort 1998) En los paiacuteses desarrollados se ha venido dando un aumento
en el uso de la medicina complementaria y alternativa dentro de la cual se incluyen las
fitomedicinas Esto podriacutea deberse ademaacutes de a la tradicioacuten al bajo costo y a una
preocupacioacuten creciente por los efectos adversos de los faacutermacos sinteacuteticos Por otro lado la
esperanza de vida maacutes larga en dichos paiacuteses ha dado como resultado un aumento de los
riesgos de desarrollar enfermedades croacutenicas y debilitantes (las enfermedades coronarias
el caacutencer y la diabetes) y para muchos pacientes la medicina alternativa parece ofrecer
medios menos agresivos para el tramiento de dichas enfermedades que la medicina
alopaacutetica (OMS 2002)
Las Farmacopeas de diversos paiacuteses han recogido en sus monografiacuteas algunas de
las plantas medicinales de mayor difusioacuten La legislacioacuten europea sobre medicamentos
tambieacuten aborda el uso medicinal de los productos procedentes de las plantas El Comiteacute de
Medicamentos a Base de Plantas (HPMC) se constituyoacute en la Agencia Europea de
Medicamentos (EMA) para proporcionar monografiacuteas y entradas de la lista de sustancias y
sus preparados a base de hierbas Mientras tanto se han publicado aproximadamente 100
monografiacuteas donde se define el estaacutendar cientiacutefico y regulatorio vigente para asegurar la
eficacia y la seguridad de las sustancias vegetales y preparados vegetales utilizados en los
medicamentos (Knoumlss amp Chinou 2012)
La Farmacopea de los Estados Unidos de Ameacuterica (USP 32 ndash NF 27) contiene 76
monografiacuteas relacionadas con productos de origen vegetal Si bien existe una farmacopea
herbolaria bastante completa editada con el tiacutetulo de American Herbal Pharmacopoeia eacutesta
no tiene caraacutecter oficial La Farmacopea Mexicana (FEUM) por su parte registra 56
productos vegetales de aplicacioacuten en medicina En la actualidad ambas Farmacopeas
contienen un nuacutemero reducido de monografiacuteas de productos vegetales en comparacioacuten al
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que registran sus homoacutelogas europeas En el caso del coacutedigo mexicano esta ausencia es
auacuten maacutes pronunciada y fue en el antildeo 2000 cuando se inicia un cambio con la publicacioacuten de
la Farmacopea Herbolaria la cual forma parte de la FEUM Esta publicacioacuten marca el inicio
del rescate del arsenal terapeacuteutico conocido y usado en Meacutexico desde siglos atraacutes (Schifter
Aceves et al 2009)
En cuanto a la Farmacopea Argentina en 2008 se renovoacute su Comisioacuten Permanente
quien ya ha producido la uacuteltima versioacuten de la misma (Farmacopea Argentina VIIIa Edicioacuten)
disponible en la paacutegina de la Administracioacuten Nacional de Alimentos Medicamentos y
Tecnologiacutea Meacutedica (ANMAT) en cuatro voluacutemenes1 el tercero de los cuales contiene un
ldquoApartado de Fitoteraacutepicosrdquo que incluye 29 monografiacuteas (ANMAT 2011)
La flora argentina se encuentra representada por maacutes de 8000 especies de plantas
superiores De ellas alrededor de 1600 son utilizadas por la poblacioacuten como ldquoremedio
caserordquo (Rondina et al 2010) en especial por parte de los sectores sociales de menor
acceso a los sistemas de salud
Un estudio sobre el nuacutemero de trabajos publicados entre 1984 y 2004 en revistas
cientiacuteficas indexadas con referato da cuenta del avance que ha tenido en los uacuteltimos antildeos la
investigacioacuten sobre productos naturales (especiacuteficamente plantas) en Ameacuterica Latina siendo
Brasil y luego Meacutexico Argentina y Chile los paiacuteses con mayor nuacutemero de publicaciones Los
estudios de domesticacioacuten produccioacuten biotecnologiacutea y de mejora geneacutetica de las plantas
medicinales son otros campos de la ciencia que se desprenden de tales avances en el uso
de plantas medicinales en Ameacuterica Latina (Calixto 2005)
Latinoameacuterica contiene gran parte de la biodiversidad de todo el mundo pero a pesar
de ello nuestros paiacuteses nunca han podido utilizarla en beneficio de su propio desarrollo
Peor auacuten como consecuencia de la explotacioacuten sin control la mayor parte de las aacutereas
relevantes en cuanto a biodiversidad se ha reducido sensiblemente antildeo tras antildeo mas allaacute
de los esfuerzos esporaacutedicos de algunos gobiernos por preservarla Inclusive el
conocimiento de la medicina tradicional tambieacuten estaacute desapareciendo especialmente el
derivado de las comunidades indiacutegenas originarias (Calixto 2005)
12 Generalidades de la Familia Bromeliaceae
La familia Bromeliaceae estaacute constituida por casi 3700 especies incluidas en 57
geacuteneros Tradicionalmente la familia ha sido subdividida en tres subfamilias Pitcairnioideae
Tillandsioideae y Bromelioideae La subfamilia Pitcairnioideae incluye a las bromeliaacuteceas
maacutes ancestrales y muchas de sus especies recuerdan a la familia de las gramiacuteneas
(Poaceae) de la cual evolucionaron La mayoriacutea son terrestres contando con un sistema
1 httpwwwanmatgovarwebanmatfnaoctava_edicionasp
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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extenso de raiacutez La subfamilia Tillandsioideae formada mayoritariamente por especies
epiacutefitas se ha adaptado para sobrevivir en condiciones muy secas las semillas tienen alas
lo que las hace susceptibles de ser dispersadas por el viento y apeacutendices plumosos que les
permite adherirse sobre superficies rugosas Bromelioideae es la subfamilia maacutes diversa
La mayoriacutea de sus especies tambieacuten son epiacutefitas aunque algunas se han adaptado a las
condiciones terrestres Estaacuten compuestas de un arreglo foliar espiralado denominado
ldquorosetardquo donde las bases foliares se superponen parcialmente y pueden funcionar como un
reservorio hiacutedrico Generalmente tienen hojas espinosas y sus semillas son a menudo
distribuidas por los paacutejaros y animales que consumen sus frutos carnosos (Bromeliad
Society International) Pero en base a recientes estudios geneacuteticos (Givnish et al 2011) los
geacuteneros de la subfamilia Pitcairnioideae han sido reagrupados en 6 subfamilias con lo que
la situacioacuten taxonoacutemica actual de las Bromeliaceae es la que se muestra en la Tabla 11
Subfamilia Geacutenero
Brocchinioideae Brocchinia
Lindmanioideae Connellia Lindmania
Hechtioideae Hechtia
Navioideae Brewcaria Cottendorfia Navia Sequencia Steyerbromelia
Pitcairnioideae Deuterocohnia Dyckia Encholirium Fosterella Pepinia Pitcairnia
Puyoideae Puya
Tillandsioideae
Alcantarea Catopsis Glomeropitcairnia Guzmania Mezobromelia
RacinaeaTillandsia Vriesea Werauhia
Bromelioideae
Acanthostachys Aechmea Ananas Androlepis Araeococcus Billbergia
Bromelia Canistropsis Canistrum Cryptanthus Deinacanthon Disteganthus
Edmundoa Eduandrea Fascicularia Fernseea Greigia Hohenbergia
Hohenbergiopsis Lymania Neoglaziovia Neoregelia Nidularium Ochagavia
Orthophytum Portea Pseudaechmea Pseudananas Quesnelia Ronnbergia
Ursulaea Wittrockia
Tabla 11 Subfamilias y geacuteneros de Bromeliaceae (Bromeliad Society International) Los geacuteneros incluidos en
esta subfamilia se encontraban originalmente dentro de las Pitcairnioideae
Las Bromeliaceae poseen un rango de haacutebitat muy amplio desde desiertos caacutelidos y
secos hasta bosques lluviosos y friacuteas regiones montantildeosas mostrando un rango de altitud
que va desde el nivel del mar hasta los 4700 metros La mayoriacutea se distribuye en
Sudameacuterica con el nuacutemero maacutes grande de especies halladas en Brasil se extienden desde
Chile y Argentina a traveacutes de Centroameacuterica y el Caribe alcanzando el liacutemite norte en los
alrededores de Virginia en el sudeste de los EEUU (Smith 1934) Una uacutenica especie
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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(Pitcairnia feliciana) ha sido encontrada en el oeste de Aacutefrica (Figura 11) A la Argentina
llegan 13 geacuteneros y alrededor de 120 especies (Flora del Conosur Cataacutelogo de las Plantas
Vasculares)
Figura 11 Distribucioacuten mundial de especies de Bromeliaceae lthttpcommonswikimediaorgwikiImage
WorldBromeliadDistributionjpggt
121 Importancia Usos
En la actualidad los usos ornamentales y comestibles son los maacutes difundidos dentro
de las Bromeliaceae siendo el ananaacute o pintildea (Ananas comosus L) el fruto maacutes ampliamente
consumido en el mundo El primer registro que se tiene data de 1493 cuando Cristobal
Coloacuten vio a los indiacutegenas cultivar la especie en las Antillas y a su regreso a Espantildea la
introduce en el ldquoViejo Mundordquo (Bromeliad Society International)
En Latinoameacuterica diversas especies de Bromeliaceae han sido de gran importancia
para el hombre desde tiempos ancestrales En las distintas regiones se les ha dado un uso
particular que puede ser enmarcado en las siguientes categoriacuteas ceremonial comestible
textil medicinal ornamental y combustible entre otros Un estudio reciente (Hornung-Leoni
2011) que incluye 78 especies de Bromeliaceae en 19 paiacuteses latinoamericanos demostroacute
que 33 de ellas son empleadas en Meacutexico Venezuela Peruacute y Bolivia para rituales y
ceremonias de las cuales el 73 corresponde a especies del geacutenero Tillandsia El uso
ornamental involucra 12 especies principalmente de los geacuteneros Tillandsia Aechmea y
Guzmania en Argentina Chile Venezuela y Meacutexico mientras que 2 especies de Puya son
usadas en Peruacute y Ecuador como combustibles Los usos comestibles medicinales y para la
extraccioacuten de fibras han sido registrados para 24 19 y 17 especies respectivamente a lo
largo de numerosos paiacuteses y seraacuten detallados a continuacioacuten
1211 Uso comestible
Ademaacutes de Ananas comosus Bromelia pinguin es una de las especies maacutes usadas
como comestible Se consumen sus frutos raiacuteces semillas y flores tanto directamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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como para la preparacioacuten de dulces refrescos postres y guisos Su uso estaacute extendido
desde Meacutexico y las Antillas hasta el norte de Sudameacuterica y Ecuador Hojas de especies de
Tillandsia y Puya son empleadas para envolver bollos tipo ldquotamalesrdquo en Venezuela
Colombia y norte de los Andes Sudamericanos asiacute como tambieacuten se consumen brotes de
otras especies de Tillandsia en Bolivia y Argentina Los frutos de B balansae se comen
asados en algunas zonas de Brasil (Hornung-Leoni 2011)
Distintos grupos eacutetnicos del Chaco paraguayo y argentino consumen frutos maduros
cocidos o crudos de Bromelia serra y B balansae siendo sus semillas tambieacuten empleadas
a partir de las cuales se obtiene un polvo que se consume directamente o bien se utiliza
para hacer sopa Las partes vegetativas de B serra B hieronymi y Dickya ferox tambieacuten
son consumidas Si bien las partes maacutes usadas son las vainas foliares joacutevenes y el eje
vertical de las rosetas basales (Suaacuterez amp Montani 2010) el consumo de los brotes joacutevenes
(ejes laterales) de B hieronymi es una nueva modalidad entre los nintildeos (Arenas 2004)
1212 Obtencioacuten de fibras
El empleo de las Bromeliaceae para la extraccioacuten de fibras es de gran importancia
para el desarrollo de numerosas comunidades a lo largo del continente Las fibras son
destinadas a la fabricacioacuten de varios productos tanto para uso propio de las comunidades
como para su comercializacioacuten2 Hamacas bolsas de mano redes para la pesca puntas de
flecha sillas de montar cesteriacutea sacos cordeleriacutea para adornar vestimentas sombreros
zapatos sandalias y cinturones objetos para uso ceremonial son algunos de los ejemplos
Diversas especies del geacutenero Aechmea son usadas por distintos indiacutegenas en
Meacutexico y Ecuador principalmente A magdalenae a partir de la cual se obtiene una fibra
(conocida como ldquoixtlerdquo o ldquofibra de pitardquo) de gran resistencia usada en la fabricacioacuten de
elementos para la pesca La fibra obtenida de varias especies de Ananas spp
caracterizada por su flexibilidad es empleada para tejidos hamacas y cestas en Venezuela
Tillandsia usneoides es utilizada para rellenar colchones y como material de empaque en
Ecuador En Chile de las hojas de Puya chilensis se obtiene una fibra resistente empleada
para las redes de pesca Fibras duras son extraidas de B pinguin en Meacutexico y Nicaragua
(Hornung-Leoni 2011)
Las fibras de Bromelia hieronymi Mez (conocida como chaacuteguar) son utilizadas por
indiacutegenas del Gran Chaco En cambio el uso textil de B balansae Mez y B serra Griseb no
es certero ya que aunque en la bibliografiacutea consta el empleo de sus fibras por parte de
vilelas y tobas orientales no ha sido registrado en trabajos de campo recientes La fibra maacutes
apreciada por distintas etnias chaquentildeas es la obtenida a partir de Deinacanthon
urbanianum Mez que debido a su durabilidad y resistencia es usada para la elaboracioacuten de
2 Productos elaborados con fibras de ldquobromeliaacuteceas textilesrdquo por la comunidad Wichi (Sastre et al 2013)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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objetos para la pesca Sin embargo su escasez ha llevado a su reemplazo por B hieronymi
Nativos de filiacioacuten guaraniacute en el Paraguay oriental asiacute como los makaacute asentados en las
inmediaciones del riacuteo Paraguay usan como textil las fibras obtenidas de Pseudananas
sagenarius mientras que su uso por parte de nativos del Chaco consta soacutelo en la literatura
(Arenas 1997)
A pesar del uso difundido de las ldquoBromeliaacuteceas textilesrdquo entre numerosas
comunidades son pocas las empleadas como materia prima para la industria En Argentina
a fines del siglo XIX se iniciaron estudios teacutecnicos a fin de evaluar el uso de las
Bromeliaceae con fines textiles Industrias extractoras de fibras fueron instalaacutendose en
Corrientes Chaco Formosa Santiago del Estero y Tucumaacuten pero tuvieron corta duracioacuten
Sin embargo con la Segunda Guerra Mundial y el consecuente desabastecimiento de yute
caacutentildeamo y lino textil se reiniciaron las tareas exploratorias impulsadas por el Estado (Res Nordm
949-46 del Ministerio de Agricultura) llegaacutendose a hacer estudios de cultivos en campos de
experimentacioacuten en distintas provincias del norte Como resultado de tales estudios se
concluyoacute que las Bromeliaceae factibles de uso textil en orden creciente de importancia
industrial son Pseudananas sagenarius Bromelia hieronymi B balansae B serra
Deinacanthon urbanianum Dyckia ferox y Aechmea distichantha adjudicaacutendoles potencial
para la elaboracioacuten de telas tipo batista cuerdas para pescar y telas de arpillera entre otros
Las dificultades con el mercado asiacute como las deficiencias teacutecnicas en la explotacioacuten y la
maquinaria de extraccioacuten no posibilitaron el desarrollo de esta industria en Argentina
(Arenas 1997) En Brasil sin embargo existen pequentildeas industrias textiles extractoras de
fibras de B laciniosa y Neoglaziovia variegata (Hornung-Leoni 2011)
1213 Usos medicinales
Diversas especies del geacutenero Hechtia tienen importancia medicinal en Meacutexico H
glomerata ha sido empleada contra el catarro y la bronquitis las hojas masticadas o
hervidas de H melanocarpa se usan para el tratamiento de la diabetes mientras que el teacute
obtenido de hojas de H podantha es usado como diureacutetico Puya gummifera es empleada
en Ecuador para dolencias de rintildeoacuten mientras que en Chile empleaban como emoliente y
astringente las secreciones de sus inflorescencias producto de las picaduras de las larvas
de mariposas Tambieacuten en Chile es usada P berteroniana como emoliente e infusiones de
tallos y hojas de P chilensis se emplean como antiinflamatorio y para aliviar fiebre y
diarreas Las raiacuteces de Pitcairnia pungens son utilizadas como diureacutetico en Ecuador
(Hornung-Leoni 2011) En Argentina personas pertenecientes a comunidades Wichiacute de
Salta han sentildealado que diversas especies de Tillandsia pueden ser utilizadas para aliviar el
dolor causado por dislocaciones o fracturas (Suaacuterez amp Montani 2010) Tillandsia dasyliriifolia
y T elongata han sido empleadas contra el catarro y la bronquitis en Meacutexico en tanto que T
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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aeranthos (el ldquoclavel del airerdquo) es usada como antiespasmoacutedico y para el tratamiento de
afecciones oculares en Sudameacuterica (Hornung-Leoni 2011)
Dentro de las especies del geacutenero Bromelia B pinguin es conocida por sus
propiedades medicinales en Centroameacuterica Cuba y en algunas regiones de Meacutexico Su fruto
es usado como antihelmiacutentico pero tambieacuten como diureacutetico y antirreumaacutetico Las hojas de
B karatas son utilizadas en algunas regiones de Meacutexico como antiinflamatorio (Hornung-
Leoni 2011) En Brasil los frutos de B balansae son usados por la medicina popular como
jarabe para la tos (Coelho 2010) y el jugo de los frutos de B fastuosa (gravataacute) para el
tratamiento de la bronquitis y el asma (Guimaraes-Ferreira et al 2007)
El uso medicinal de Ananas comosus trasciende a las comunidades latinoamericanas
asentadas en las regiones en las cuales es autoacutectona Desde los tiempos de la colonizacioacuten
la pulpa se empleaba por las comunidades aboriacutegenes para tratar parasitosis intestinales
accioacuten que fue sustentada por los meacutedicos europeos de la eacutepoca (Patintildeo 2002) Tambieacuten
ha sido utilizada como coadyuvante de la digestioacuten (Hornung-Leoni 2011)
El extracto obtenido a partir de A comosus conocido como bromelina o bromelaiacutena
es comercializado desde mediados de la deacutecada del acute50 y desde entonces se han publicado
numerosos trabajos cientiacuteficos en relacioacuten a sus propiedades terapeacuteuticas antiinflamatoria
antitromboacutetica fibrinoliacutetica antitumoral antimetastaacutesica inmunomodulador promotora de la
absorcioacuten de antibioacuteticos debridante de heridas y cicatrizante (Maurer 2001) La bromelina
ha sido usada como agente antiinflamatorio y antiedematoso en casos de artritis lesiones
deportivas traumatismos edema posquiruacutergico quemaduras y como complementario a la
quimioterapia (Bhui 2012) Actualmente la bromelina es un producto medicinal popular para
el tratamiento de la inflamacioacuten y trastornos digestivos (Hornung-Leoni 2011) Es de libre
venta en farmacias y tiendas naturistas principalmente de Estados Unidos de Ameacuterica y
paiacuteses de Europa como un producto meacutedico sin licencia (Brien et al 2004) La
Administracioacuten de Drogas y Alimentos de EEUU (Food and Drug Administration FDA)
considera a la bromelina dentro del subcapiacutetulo correspondiente a los alimentos para
consumo humano y en tal caraacutecter es categorizada como GRAS (Generally Recognized as
Safe) No hace referencia a su utilizacioacuten como medicamento (FDA 2012) Por su parte la
Agencia Europea de Medicinas (European Medicines Agency) ha aprobado muy
recientemente un producto conteniendo bromelina para su uso como debridante de las
escaras producidas como consecuencia de quemaduras (European Medicines Agency
2012)
Si bien los extractos obtenidos tanto a partir de tallos como de frutos de A comosus
son una mezcla compleja de fosfatasas glucosidasas peroxidasas celulasas inhibidores
glicoproteiacutenas y carbohidratos (todos poco caracterizados) los componentes responsables
de sus acciones antihelmiacutentica antiedematosa antiinflamatoria fibrinoliacutetica antitromboacutetica
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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antitumoral debridante de heridas asiacute como aceleradora de la cicatrizacioacuten de heridas
parecieran ser las proteasas cisteiacutenicas presentes en grandes cantidades (Maurer 2001
Salas et al 2008)
13 Tipos de Proteasas Distribucioacuten y Rol en los Vegetales
131 Proteasas Tipos y sistemas de clasificacioacuten
Se conoce como proteasas a las enzimas que catalizan la degradacioacuten de las
proteiacutenas (proteoacutelisis) mediante la adicioacuten de una moleacutecula de agua en los enlaces
peptiacutedicos Aunque el Comiteacute de Nomenclatura de la Unioacuten Internacional de Bioquiacutemica y
Biologiacutea Molecular3 (NC-IUBMB) ha recomendado usar el teacutermino peptidasa para referirse a
estas enzimas en trabajos recientes se siguen utilizando alternativamente las
denominaciones proteasa enzima proteoliacutetica o proteinasa por lo que en la presente tesis
usaremos estos teacuterminos indistintamente
Un sistema de nomenclatura y clasificacioacuten de proteasas es fundamental para el
manejo de la informacioacuten A pesar de que existe una gran variedad de proteasas distribuidas
en los siete reinos (Archaea Bacteria Protozoa Fungi Planta Animalia y Virus) que
cumplen roles fisioloacutegicos muy distintos la existencia de caracteriacutesticas comunes permitioacute
establecer sistemas de clasificacioacuten Estos se basan en los mecanismos cataliacuteticos las
regiones de la cadena polipeptiacutedica sobre las que actuacutean las relaciones evolutivas y la
homologiacutea de sus secuencias
Antes del establecimiento de un organismo reconocido internacionalmente que fijara
pautas de clasificacioacuten y nomenclatura para las enzimas Hartley (1960) propuso clasificar
las proteasas teniendo en cuenta su mecanismo cataliacutetico Este criterio dio lugar a cuatro
clases o tipos cataliacuteticos de peptidasas seriacutenicas cisteiacutenicas aspaacuterticas y
metalopeptidasas La denominacioacuten hace referencia al grupo quiacutemico del sitio cataliacutetico
responsable de la actividad enzimaacutetica serina cisteiacutena aacutecido aspaacutertico e ioacuten metaacutelico
(frecuentemente Zn2+ Mn2+ Co2+) respectivamente Maacutes recientemente fueron incorporados
otros dos tipos las peptidasas glutaacutemicas (Kakudo et al 1992) y treoniacutenicas (Barrett et al
1998)
No obstante estas diferencias los seis tipos cataliacuteticos se pueden agrupar en dos
categoriacuteas las que forman complejos covalentes entre la enzima y el sustrato (peptidasas
seriacutenicas cisteiacutenicas y treoniacutenicas) donde el nucleoacutefilo del sitio cataliacutetico es parte de un
aminoaacutecido (serina cisteiacutena o treonina respectivamente) y las que no forman complejos
enzima-sustrato covalentes (peptidasas aspaacuterticas glutaacutemicas y metalopeptidasas) siendo
responsable del ataque nucleofiacutelico una moleacutecula de agua activada
3 lthttpwwwchemqmulacukiubmbgt
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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1311 Sistema EC de clasificacioacuten de enzimas
En 1961 quedoacute establecido el sistema de clasificacioacuten y nomenclatura de enzimas de
la Comisioacuten Internacional de Enzimas (Enzyme Commission EC) actualmente NC-IUBMB
Basaacutendose en el tipo de reaccioacuten que catalizan la EC agrupoacute las enzimas en seis clases y
les asignoacute un coacutedigo numeacuterico Oxidorreductasas (1) Transferasas (2) Hidrolasas (3)
Liasas (4) Isomerasas (5) y Ligasas (6)
Dentro de la clase 3 (hidrolasas) se agrupan las enzimas que catalizan la reaccioacuten de
escisioacuten de un enlace mediante la adicioacuten de una moleacutecula de agua Los productos de esta
reaccioacuten son dos moleacuteculas a una de las cuales se ha unido el hidroacutegeno y a la otra el
hidroxilo provenientes ambos de la hidroacutelisis del agua
R1-R2 + H2O R1-OH + R2-H
Hidrolasa
Las enzimas de la clase 3 se subagrupan en funcioacuten del enlace quiacutemico sobre el que
actuacutean Asiacute si el enlace entre R1 y R2 es el grupo amida de la unioacuten peptiacutedica las hidrolasas
que catalizan tal reaccioacuten son peptidasas y pertenecen a la subclase 34 (EC 34) la que a
su vez se divide en catorce sub-subclases como se muestra en la Tabla 12
Sub-subclases Descripcioacuten Cantidad
Exopeptidasas
EC 3411 Aminopeptidasas 26 76
EC 3413 Dipeptidasas 11 32
EC 3414 Dindash y trindashpeptidil-peptidasas 8 23
EC 3415 Peptidil-dipeptidasas 4 12
EC 3416 Carboxipeptidasas Tipo Serina 4 12
EC 3417 Metalocarboxipeptidasas 20 58
EC 3418 Carboxipeptidasas Tipo Cisteiacutena 1 03
EC 3419 Omega peptidasas 11 32
Endopeptidasas
EC 3421 Endopeptidasas Seriacutenicas 98 285
EC 3422 Endopeptidasas Cisteiacutenicas 98 285
EC 3423 Endopeptidasas Aspaacuterticas 41 119
EC 3424 Metaloendopeptidasas 20 58
EC 3425 Endopeptidasas Treoniacutenicas 2 06
EC 3499 Endopeptidasas de mecanismo desconocido 0 0
Total 344 100
Tabla 12 Sub-subclases de peptidasas (34) seguacuten el sistema EC (Consultado 12112012)
Las peptidasas EC 3411 a EC 3419 son exopeptidasas mientras que las EC 3421
a EC 3425 y EC3499 son endopeptidasas Las exopeptidasas hidrolizan
secuencialmente uno o maacutes aminoaacutecidos desde los extremos carboxilo (carboxipeptidasas)
amino (aminopeptidasas) o extremos sustituidos ciclados o unidos por uniones
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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isopeptiacutedicas (omegapeptidasas) Las que atacan el N-terminal pueden liberar un uacutenico
residuo aminoaciacutedico (aminopeptidasas EC 3411) o un di- o tripeacuteptido (di- y tripeptidil-
peptidasas EC 3414) A su vez las que actuacutean sobre el C-terminal pueden liberar un uacutenico
amino aacutecido (carboxipeptidasas EC 3416-18) o un dipeacuteptido (peptidil-dipeptidasas EC
3415)
Las endopeptidasas hidrolizan las uniones peptiacutedicas internas de la proteiacutena y si
actuacutean sobre pequentildeos peacuteptidos se denominan geneacutericamente oligopeptidasas (Barrett
2001)
Como puede observarse la clasificacioacuten propuesta por Hartley quedoacute incorporada en
el sistema EC Las carboxipeptidasas se agrupan seguacuten el mecanismo cataliacutetico en
metalocarboxipeptidasas (EC 3417) seriacutencarboxipeptidasas (EC 3416) y
cisteiacutencarboxipeptidasas (EC 3418) mientras que las endopeptidasas se agrupan en
seriacutenicas (EC 3421) cisteiacutenicas (EC 3422) aspaacuterticas (EC 3423) treoniacutenicas (EC
3425) y metaloendopeptidasas (EC 3424)
1312 El sistema MEROPS de clasificacioacuten de peptidasas
Desde mediados del siglo XX a la actualidad la Biologiacutea Molecular (BM) ha aportado
conocimientos no soacutelo referentes a los mecanismos de accioacuten de las enzimas sino tambieacuten
a sus estructuras La posibilidad de conocer las secuencias de aminoaacutecidos de las
proteiacutenas asiacute como su conformacioacuten espacial permitioacute establecer nuevos criterios de
clasificacioacuten de las enzimas que a su vez a la luz del Dogma Central de la BM refleja las
relaciones evolutivas entre ellas
Asiacute Rawlings y Barrett (1993) haciendo uso del gran nuacutemero de secuencias
aminoaciacutedicas de las que disponiacutean dieron a conocer un nuevo sistema de clasificacioacuten de
peptidasas basado en las similitudes estructurales de las proteiacutenas Seguacuten el grado de
homologiacutea las peptidasas fueron agrupadas en familias y eacutestas a su vez en clanes Para
1996 este sistema habiacutea dado lugar a la base de datos MEROPS4 Los tres niveles de
clasificacioacuten se definen a continuacioacuten
Clan Es un conjunto de familias cuyas peptidasas tienen un origen evolutivo comuacuten
que si bien no llega a evidenciarse por comparacioacuten de sus secuencias de aminoaacutecidos siacute
por las similitudes de sus estructuras terciarias Se construye por comparacioacuten de las
estructuras terciarias y cuando no estaacuten disponibles se comparan los ordenamientos de
aminoaacutecidos cataliacuteticos en la cadena polipeptiacutedica o las secuencias aminoaciacutedicas alrededor
de los aminoaacutecidos cataliacuteticos
Familia Se construye por comparacioacuten de la estructura primaria Estaacute constituida por
peptidasas cuyas secuencia de aminoaacutecidos que debe incluir la secuencia de la ldquounidad
4 lthttpmeropssangeracukgt
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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peptidasardquo (regioacuten de la proteiacutena responsable de la actividad cataliacutetica) presentan similitudes
estadiacutesticamente significativas
Peptidasa Cada proteiacutena con actividad peptidasa recibe un nombre y un
identificador (ID MEROPS) Se diferencian por su estructura funcioacuten bioloacutegica sustrato
mecanismo cataliacutetico y origen geneacutetico
Dentro de algunas familias se han detectado dos o maacutes grupos de peptidasas con
suficientes diferencias como para constituir una subfamilia Del mismo modo algunos clanes
han sido divididos en subclanes que contienen familias que evidencian una muy antigua
divergencia
El sistema MEROPS tambieacuten tuvo en cuenta la clasificacioacuten de Hartley ya que en la
asignacioacuten de los identificadores a las familias clanes y peptidasas se usaron letras que
hacen referencia al tipo cataliacutetico de las peptidasas que las integran S (seriacutenicas) C
(cisteiacutenicas) T (treoniacutenicas) A (aspaacuterticas) G (glutaacutemicas) M (metalopeptidasas) N
(asparagiacutenicas) y U (mecanismo desconocido)
La letra P es utilizada para identificar clanes que contienen familias de peptidasas de
maacutes de un tipo cataliacutetico El identificador de un clan se completa con una segunda letra
mayuacutescula asignada secuencialmente (por ejemplo clan CA) y el identificador para una
familia es completado con un nuacutemero (por ejemplo C1 la familia de la papaiacutena) El
identificador MEROPS para cada peptidasa individual comienza con el identificador de
familia y se completa con un nuacutemero decimal (por ejemplo C01005 para bromelaiacutena de
tallo) La versioacuten 97 de la base de datos actualizada al 1ordm de octubre de 2012 cuenta con
320834 secuencias de las cuales 113968 corresponden a peptidasas seriacutenicas 118637 a
metalopeptidasas 52745 a peptidasas cisteiacutenicas 14225 a peptidasas aspaacuterticas 11439 a
peptidasas treoniacutenicas 338 a peptidasas glutaacutemicas 3222 a peptidasas asparagiacutenicas
6256 a peptidasas de tipo cataliacutetico desconocido y 4 inclasificables La base contiene
ademaacutes 520 estructuras (Rawlings et al 2012)
132 Distribucioacuten de Proteasas en los Seres Vivos
En la Tabla 13 se consigna la distribucioacuten de las familias de proteasas en 8546
organismos de los distintos reinos Dentro del reino vegetal la mayoriacutea de las familias estaacuten
constituidas por peptidasas del tipo metaloproteasas (34101) seriacutenicas (22101) y
cisteiacutenicas (20101) Sin embargo el mayor nuacutemero de peptidasas registradas son las
seriacutenicas (29) seguidas por las aspaacuterticas (25) y las cisteiacutenicas (24) La mayoriacutea de las
proteasas cisteiacutenicas en plantas pertenecen a la familia de la papaiacutena (C1)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Reino
Tipo de peptidasas Bacteria Archaea Protozoa Fungi Planta Animalia Virus
Aspaacuterticas 9 5 6 6 9 7 4
Cisteiacutenicas 27 11 20 16 20 22 30
Glutaacutemicas 2 1 - 1 - - 1
Metalopeptidasas 62 34 32 34 34 33 14
Seriacutenicas 25 18 20 16 22 25 18
Treoniacutenicas 1 1 1 1 1 1 -
Asparagiacutenicas 3 - - - - - 6
Distintos Tipos 20 13 15 13 14 18 25
Mecanismo Desconocido 7 4 2 1 1 3 2
Totales 156 87 96 88 101 109 100
Tabla 13 Distribucioacuten de familias de peptidasas de organismos de diferentes reinos en el sistema propuesto por MEROPS (httpmeropssangeracuk consultado 12112012)
133 Rol de las peptidasas en los vegetales
La proteoacutelisis es vital para las ceacutelulas Por un lado es necesaria para el recambio
proteico permitiendo que proteiacutenas dantildeadas mal plegadas o innecesarias sean eliminadas
a la vez que los aminoaacutecidos liberados sean utilizados para la siacutentesis de nuevas proteiacutenas
Por otro lado la degradacioacuten proteica en sitios especiacuteficos es una de las modificaciones
postraduccionales necesaria para que las proteiacutenas sean funcionalmente activas por
ejemplo para la activacioacuten de proenzimas o bien permitiendo el ensamblado de proteiacutenas y
su direccionamiento hacia distintos compartimientos celulares La degradacioacuten proteica
tambieacuten sirve como mecanismo de control celular si el sustrato son proteiacutenas regulatorias
La principal viacutea proteoliacutetica en las ceacutelulas eucariotas estaacute mediada por el sistema
ubiquitinaproteasoma la proteiacutena que debe ser degradada es marcada por unioacuten a la
ubiquitina facilitando la direccioacuten al complejo proteasomal efector de la hidroacutelisis
En las plantas el recambio proteico es considerado fundamental para el crecimiento
Ejemplos de ello son la degradacioacuten de proteiacutenas de reserva durante la germinacioacuten de las
semillas o la removilizacioacuten de proteiacutenas luego de la senescencia foliar con la relocalizacioacuten
de fuentes de N en los oacuterganos reproductivos Maacutes recientemente con la asociacioacuten
encontrada entre el sistema ubiquitinaproteasoma y la embriogeacutenesis la fotomorfogeacutenesis
los ritmos circadianos el desarrollo de flores y tricomas asiacute como la sentildealizacioacuten hormonal
la degradacioacuten selectiva de proteiacutenas ha tomado relevancia como mecanismo de regulacioacuten
de numerosos procesos de crecimiento y desarrollo en las plantas (Schaller 2004)
En Arabidopsis thaliana la primer planta en tener su genoma completamente
secuenciado se han encontrado maacutes de 600 genes de proteasas de todos los tipos
cataliacuteticos a excepcioacuten de las glutaacutemicas ademaacutes de 1300 genes asociados con el sistema
ubiquitina-proteasoma (Schaller 2004) Puesto que Arabidopsis es tomada como modelo
para el estudio fitobioloacutegico la falta de exclusividad del sistema proteasomal en la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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degradacioacuten proteica podriacutea ser extensible a otras especies vegetales El anaacutelisis en
alrededor de cien genomas ha demostrado que aproximadamente un 2 de todos los
productos geacutenicos son peptidasas evidenciaacutendose asiacute que se trata de uno de los grupos
funcionales de proteiacutenas maacutes grandes e importantes (Barrett et al 2004)
En el trabajo de revisioacuten y actualizacioacuten sobre el rol regulatorio de proteasas vegetales
Schaller (2004) cita referencias sobre proteasas (de todos los tipos cataliacuteticos a excepcioacuten
de las treoniacutenicas y las glutaacutemicas) claves para varios procesos bioloacutegicos de las plantas
destacaacutendose las funciones en la degradacioacuten proteica y movilizacioacuten de nitroacutegeno durante
la germinacioacuten de las semillas y la senescencia foliar el procesamiento de proteiacutenas de
reserva durante su acumulacioacuten en semillas diferentes eventos de la muerte celular
programada (iniciacioacuten regulacioacuten y autolisis) la resistencia a insectos y patoacutegenos la
digestioacuten de insectos en plantas carniacutevoras la sentildealizacioacuten por brasinoesteroides y en la
regulacioacuten de procesos de desarrollo y crecimiento tales como la diferenciacioacuten xilemaacutetica
la densidad de estomas y la formacioacuten lateral de raiacuteces del patroacuten embrionario y del
meristema apical entre otros
1331 Peptidasas cisteiacutenicas
Seguacuten el sistema MEROPS las peptidasas cisteiacutenicas estaacuten distribuidas en 76 familias
agrupadas en 13 clanes Dentro del reino Planta las proteasas cisteiacutenicas son una de las
maacutes conocidas por ser el tipo cataltico en que se centraron los primeros estudios sobre
proteasas vegetales En las plantas la mayoriacutea de las proteasas cisteiacutenicas pertenecen a
las familias de la papaiacutena (C1) y la legumaiacutena (C13) (Schaller 2004)
A nivel subcelular las proteasas cisteiacutenicas se localizan en vacuolas y en la pared
celular (Grudkowska amp Zagdańska 2004) sin embargo actividad tipo caspasa en plantas ha
sido detectada en el citosol pero no en vacuolas (Korthout et al 2000) En cuanto a su
distribucioacuten en la planta se han encontrado proteasas en praacutecticamente todos los oacuterganos
vegetales (Salas et al 2008)
Durante la maduracioacuten de las semillas las proteiacutenas de reserva son sintetizadas como
precursores que deben ser procesados para su ensamblado y acumulacioacuten (Jung et al
1998) Ese procesamiento ha sido atribuido a proteasas tipo legumaiacutenas conocidas como
enzimas de procesamiento vacuolar (VPE) (Hara-Nishimura et al 1998 Kinoshita et
al1999) Por otro lado dentro de las proteasas responsables de la degradacioacuten y
movilizacioacuten de proteiacutenas de reserva las cisteiacutenicas son las maacutes abundantes e incluye
ademaacutes de las legumaiacutenas a las del tipo papaiacutena (Grudkowska amp Zagdańska 2004)
Una caracteriacutestica de las proteasas cisteiacutenicas es que responden a estiacutemulos internos y
externos Ante el estreacutes abioacutetico la sequiacutea y el shock teacutermico algunas proteiacutenas son
dantildeadas o innecesarias hacieacutendose imprescindible la siacutentesis de nuevas proteiacutenas Este
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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recambio proteico conlleva un considerable aumento en la siacutentesis de proteasas cisteiacutenicas
hecho demostrado en las hojas de trigo ante el deacuteficit de agua Por otra parte los
aminoaacutecidos liberados actuacutean regulando la presioacuten osmoacutetica celular La induccioacuten de
proteasas cisteiacutenicas principalmente tipo papaiacutena y tipo caspasas acompantildea la muerte
celular programada la cual estaacute asociada con procesos de desarrollo y diferenciacioacuten
vegetal tales como la xilogeacutenesis y la senescencia asiacute como tambieacuten con las respuestas de
defensa (Grudkowska amp Zagdańska 2004)
Algunas proteiacutenas vegetales han sido clasificadas como proteiacutenas ldquoprescindiblesrdquo
puesto que algunas especies pueden sobrevivir sin ellas mientras que otras especies o
variedades dentro de la misma especie las producen en elevadas cantidades siendo poco
claro su rol fisioloacutegico en la planta Dentro de esta categoriacutea entran las proteasas presentes
en cantidades extremadamente altas principalmente en laacutetex y frutos caracteriacutesticas de
ciertas familias (Caricaceae Bromeliaceae y Moraceae) dado que si bien podriacutean
desempentildearse en la defensa contra la invasioacuten de patoacutegenos no se explica la variedad de
contenido proteoliacutetico entre especies altamente relacionadas (Adams amp Rinne 1981) En
estos casos las actividades proteoliacuteticas detectadas son al menos dos oacuterdenes de magnitud
mayores que las actividades encontradas en tejidos comparables de la mayoriacutea de otras
plantas (Glazer amp Smith 1971) Puesto que la siacutentesis acumulacioacuten y utilizacioacuten de las
proteiacutenas ldquoprescindiblesrdquo ocurre en determinados periacuteodos que podriacutean estar relacionados
con estadios del desarrollo de la planta se les ha asignado un posible rol como metabolitos
secundarios (Adams amp Rinne 1981) La sorprendente similitud bioquiacutemica (elevada
estabilidad amplia especificidad y baja tendencia autoliacutetica) de las proteasas cisteiacutenicas
muy abundantes no indicariacutea un ancestro comuacuten sino maacutes bien una convergencia evolutiva
como resultado de una funcioacuten defensiva comuacuten (Boller 1986)
La actividad de proteasas cisteiacutenicas frente a diferentes estiacutemulos puede ser elevada
al 90 de la actividad proteoliacutetica total (Grudkowska amp Zagdańska 2004) En el caso de
Carica papaya L se ha demostrado que la produccioacuten de heridas repetidas en los frutos
aumentan la cantidad de proteiacutenas y la actividad proteoliacutetica en el laacutetex de la papaya lo cual
estaacute acorde con el posible rol de estas proteasas en la defensa de la planta (Azarkan et al
2006)
El papel desempentildeado por las proteasas en las respuestas de defensa en plantas
desencadenadas por patoacutegenos y pestes estaacute comenzando a aclararse No soacutelo
intervendriacutean en la ejecucioacuten directa del patoacutegeno como es el caso de la papaiacutena y otras
proteasas tipo papaiacutena sino tambieacuten en la percepcioacuten por parte del organismo defensor y en
las cascadas de sentildealizacioacuten involucradas con las respuestas de defensa (van der Hoorn amp
Jones 2004)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
16
14 Enzimas Proteoliacuteticas de Bromeliaceae
Varias especies de la familia Bromeliaceae se caracterizan por poseer endopeptidasas
en cantidades superiores a las fisioloacutegicamente necesarias (Barrett 2001) A pesar del
elevado nuacutemero de integrantes de la familia Bromeliaceae es muy reducido el nuacutemero de
geacuteneros todos pertenecientes a la subfamilia Bromelioideae que han sido estudiados hasta
la fecha en busca de enzimas proteoliacuteticas (Ananas Bromelia Hohenbergia y
Pseudananas) siendo Ananas comosus L (el ldquoananaacuterdquo o ldquopintildeardquo) la especie maacutes estudiada a
partir de cuyos tallos se obtiene la bromelina (Heinicke amp Gortner 1957) Otras proteasas de
Bromeliaceae que han sido aisladas y caracterizadas incluyen a la hemisfericina a partir de
frutos de Bromelia hemispherica (Agundis et al 1977 Ochoa et al 1987) pinguinina
obtenida de frutos de Bromelia pinguin (Toro-Goyco et al 1980 Abreu Payrol et al 2008)
karatasina aislada de frutos de Bromelia plumieri (Montes et al 1990) macrodontaiacutena I y II
de frutos inmaduros de Pseudananas macrodontes (Morr) Harms (Brullo et al 1994
Natalucci et al 1996 Loacutepez et al 2000 y 2001 Brullo 2003) balansaiacutena I de frutos
inmaduros de Bromelia balansae Mez (Pardo et al 2000) hieronymaina I II y III aisladas de
frutos inmaduros de Bromelia hieronymi Mez (Bruno et al 2003 2006 2008) fastuosaiacutena
extraiacuteda de frutos inmaduros de Bromelia fastuosa (Cabral et al 2006) y penduliflorain I
obtenida a partir de frutos de Hohenbergia penduliflora (Peacuterez et al 2010) Tambieacuten se han
aislado proteasas de frutos de otras especies de Bromelia B serra (Caffini et al 1988) B
laciniosa (Buttazzoni et al 1984 Priolo et al 1986) B palmeris y B sylvestris (Cruz et al
1974 Hernaacutendez Arana et al 1983)
Dado que el presente trabajo de tesis doctoral estaacute centrado en el estudio de posibles
aplicaciones farmacoloacutegicas de las proteasas presentes en frutos de Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes en comparacioacuten con la bromelina a continuacioacuten se
brinda un resumen de las principales caracteriacutesticas bioquiacutemicas de las proteasas aisladas a
partir de esos materiales
141 Endopeptidasas del ananaacute
Las endopeptidasas del ananaacute son de tipo cisteiacutenicas y pertenecen a la superfamilia de
la papaiacutena (C01) Conocidas en su conjunto como ldquobromelinardquo teacutermino que se ha
reemplazado en los uacuteltimos antildeos por ldquobromelaiacutenardquo En el presente trabajo se utilizaraacute
indistintamente cualquiera de los dos teacuterminos Rowan et al (1990) denominan ldquobromelaiacutena
de tallordquo a la principal endopeptidasa del tallo de ananaacute y ldquobromelaiacutena de frutordquo a la principal
endopeptidasa de fruto Adicionalmente dos endopeptidasas menores (ananaiacutena y
comosaiacutena) fueron separadas del tallo de ananaacute (Rowan et al 1988 1990) Actualmente y
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
17
en base a estudios geneacuteticos se considera que existen dos tipos de bromelinas de fruto
denominas ldquom-tipo 1rdquo y ldquom-tipo 2rdquo (Rawlings et al 2008)
1411 Bromelina de tallo
La bromelina de tallo (EC 342232) es la proteasa predominante (casi el 90) en los
extractos de tallos de Ananas comosus y se trata de una uacutenica cadena polipeptiacutedica
glicosilada de 245 kDa (Harrach et al 1995) con un punto isoeleacutectrico (pI) de 955
(Murachi 1970) conteniendo siete residuos Cys (Napper et al 1994 Harrach et al 1995) y
tres puentes disulfuro La secuencia aminoaciacutedica completa ha sido deducida por Ritonja et
al (1989) siendo su masa molecular de 22831 Da Para expresar su maacutexima actividad la
enzima requiere la presencia de agentes reductores tales como cisteiacutena El pH oacuteptimo tanto
con sustratos sinteacuteticos como proteicos es amplio (Rowan amp Buttle 1994) A pesar de su
elevada actividad sobre distintos sustratos proteicos actuacutea eficientemente sobre sustratos
sinteacuteticos que contengan uniones Arg-Arg (Rowan et al 1988 Napper et al 1994)
Tambieacuten se ha comunicado una cierta preferencia de la enzima por aminoaacutecidos polares en
las posiciones P1 y P1acute5 (Napper et al 1994) Una caracteriacutestica distintiva de esta proteasa
es su relativamente deacutebil inhibicioacuten por E-64 y la carencia de inhibicioacuten por cistatina de pollo
lo que la diferencia de la mayoriacutea de las peptidasas de la familia C1 (Rowan et al 1990)
1412 Ananaiacutena
Rowan et al (1988) lograron purificar una enzima distinta a la bromelina de tallo a la
que denominaron ananaiacutena (EC 342231) y que representa el 5 de las proteiacutenas totales
del extracto de tallo de ananaacute A diferencia de la bromelina de tallo la ananaiacutena muestra
baja preferencia por sustratos sinteacuteticos que contengan Arg-Arg y alta actividad frente a Z-
Phe-Arg-NHMec y a Bz-Phe-Val-Arg-NHMec Ananaiacutena muestra mayor preferencia por
aminoaacutecidos polares en la posicioacuten P1acute mientras que el requerimiento para el sitio P1 es
mucho menos especiacutefico (Napper et al 1994) en tanto que en el sitio P2 manifiesta
preferencia por una cadena lateral hidrofoacutebica (Rowan et al 1990) El pH oacuteptimo tanto con
sustratos sinteacuteticos como proteicos es cercano a la neutralidad (Rowan amp Buttle 1994)
Ananaiacutena no es glicosilada estaacute formada por una cadena proteica simple de 235 kDa
(Rowan et al 1988 Napper et al 1994 Harrach et al 1995) y su pI es gt 10 (Rowan et al
1988 Harrach et al 1995) Tambieacuten contiene siete residuos Cys (Napper et al 1994) La
secuencia primaria de ananaiacutena ha sido determinada comprobaacutendose que incluye un
inserto entre los residuos 170 y 174 que no estaacute presente en bromelina de tallo ni en
5 En el modelo ideado por Schechter y Berger (1967) para describir la especificidad de corte de las peptidasas
los residuos de aminoaacutecido del sustrato (P) se unen a subsitios del sitio activo de la enzima (S) Estos residuos se numeran a partir del enlace a ser clivado hacia el extremo N-terminal como P1 P2 P3 etc en tanto que los que se encuentran hacia el C-terminal se denominan P1 P2 P3 etc Los subsitios de la proteasa actuacutean acomodando los residuos del sustrato y se numeran como S1 S2 S3 y S1 S2 S3 respectivamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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papaiacutena y una serie de aminoaacutecidos hidrofoacutebicos adyacentes a la His-157 (Lee et al 1997)
El comportamiento de la enzima frente a los inhibidores es similar al de la papaiacutena ya que
es eficientemente inhibida tanto por cistatina de pollo como por E-64 (Rowan et al 1988)
1413 Comosaiacutena
Comosaiacutena es la endopeptidasa menos abundante del extracto de tallo de ananaacute y
representa menos del 1 de las proteiacutenas totales Se trata de una glicoproteiacutena de 245 kDa
y pI gt 10 conteniendo siete residuos Cys y tiene una composicioacuten similar en carbohidratos a
la bromelina de tallo pero es marcadamente diferente en su composicioacuten aminoaciacutedica
(Napper et al 1994) Tiene actividad sobre Z-Arg-Arg-NHMec (Rowan et al 1990) muestra
preferencia por residuos polares tanto en el sitio P1 como P1acute y es inhibida por E-64
(Napper et al 1994)
1414 Bromelina de fruto
La preparacioacuten denominada ldquobromelina de frutordquo (EC 342233) constituye el 30-40
de las proteiacutenas totales del fruto representa casi el 90 del material proteoliacuteticamente
activo (Murachi 1970) y al igual que la bromelina de tallo tiene un amplio pH oacuteptimo frente a
sustratos proteicos y sinteacuteticos (Rowan amp Buttle 1994) Se trata de una cadena polipeptiacutedica
simple de aproximadamente 25 kDa (Rowan et al 1990) cuyo pI es 46 y parece no
tratarse de una glicoproteiacutena (Ota et al 1985) La secuencia N-terminal es ideacutentica a la de
bromelina de tallo (Yamada et al 1976) pero es inmunoloacutegicamente distinta de eacutesta y de
ananaiacutena (Rowan et al 1990)Tiene preferencia por el sustrato sinteacutetico Bz-Phe-Val-Arg-
NHMec y no por Z-Arg-Arg-NHMec lo que la diferencia de la bromelina de tallo (Rowan et
al 1990)
142 Balansaiacutena
Utilizando frutos semimaduros de Bromelia balansae Mez Natalucci et al (1988)
obtienen una preparacioacuten proteoliacutetica activa en un rango de pH amplio (60ndash95) que se
resuelve en tres fracciones proteoliacuteticamente activas por cromatografiacutea de intercambio
ioacutenico Posteriormente Pardo et al (2000) estudiaron las proteasas presentes en frutos en
distintos estadios de maduracioacuten determinaacutendose un aumento en el nuacutemero de proteiacutenas
con diferente pI y un incremento en el contenido de proteiacutenas totales y de azuacutecares a
medida que avanza el grado de madurez La actividad caseinoliacutetica y la actividad especiacutefica
fueron mayores en los estadios de menor madurez Mediante purificacioacuten parcial por
precipitacioacuten etanoacutelica lograron retener el 92 de la actividad enzimaacutetica y el 83 de las
proteiacutenas iniciales eliminaacutendose el 45 de los azuacutecares contenidos en el extracto crudo
Dicha preparacioacuten mostroacute alta estabilidad teacutermica conservaacutendose un 80 de actividad
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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proteoliacutetica luego de ser incubada durante 2 h a 45 ordmC Una banda activa de pI 55
(balansaiacutena I) se encontroacute en cantidades apreciables durante todo el proceso de
maduracioacuten mientras que otra banda activa de pI 87 (balansaiacutena II) soacutelo pudo encontrarse
en cantidades apreciables en frutos maduros trataacutendose en ambos casos de
cisteiacutenendopeptidasas
El peso molecular de Balansaiacutena I determinado por espectrometriacutea de masas (MALDI-
TOF) fue de 23192 Da y por electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-
PAGE) fue 244 kDa su pH oacuteptimo frente a caseiacutena fue 87 y conservoacute maacutes del 80 de
actividad en el rango de pH 58 a 100 Balansaiacutena I mostroacute preferencia por los derivados
Ala y Gln de N-α-CBZ-p-Nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos seguido por los de Gly Tyr y Leu
La secuencia N-terminal muestra gran similitud con las proteasas del ananaacute (Pardo et al
2000)
143 Hieronymaiacutenas
A partir de frutos inmaduros de Bromelia hieronymi Mez Bruno et al (2002) obtienen
extractos parcialmente purificados por precipitacioacuten acetoacutenica (PAR) y etanoacutelica (PER)
conteniendo alta cantidad de proteiacutenas (91 en el PAR y 79 en el PER) y de actividad
caseinoliacutetica (90 en el PAR y 83 en el PER) respecto al extracto crudo de partida
mientras se eliminan la mayor parte de azuacutecares y fenoles Las enzimas presentes
resultaron ser cisteiacutenendopeptidasas Los preparados conservaron maacutes del 90 de la
actividad original cuando fueron preincubados a 37 ordmC y 55 ordmC durante 2 h y mostraron
actividad en un amplio rango de pH alcanzando el 80 de la actividad maacutexima entre los pH
7 y 10 Mediante isoelectroenfoque (IEF) se logran separar 6 bandas de pI 59 64 76 83
y gt 93
1431 Hieronymaiacutena I
Desde frutos inmaduros de B hieronymi Bruno et al (2003) logran aislar una fraccioacuten
a la que denominan ldquohieronymaiacutena Irdquo (pI gt93) cuya homogeneidad fue confirmada por
MALDI-TOF donde mostroacute una masa molecular de 24066 Da por SDS-PAGE mostrando
una banda de 25 kDa y por IEF La enzima de tipo cisteiacutenica presentoacute una actividad
caseinoliacutetica maacutexima en el rango de pH 85-95 y fue completamente inhibida por E-64 y
aacutecido iodoaceacutetico mientras que se incrementoacute por la adicioacuten de cisteiacutena 20 mM
1432 Hieronymaiacutena II
A partir del mismo material Bruno et al (2006) purifican una segunda proteasa
cisteiacutenica (hieronymaiacutena II) cuya homogeneidad fue confirmada por MALDI-TOF-TOF
mostrando un peso molecular de 23411 Da y por SDS-PAGE con un peso molecular de 25
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
20
kDa aunque por IEF se observaron dos isoformas de pI 76 y 83 La actividad caseinoliacutetica
maacutexima fue detectada en el rango de pH entre pH 75-90
1433 Hieronymaiacutena III
Una tercera endopeptidasa cisteiacutenica (hieronymaiacutena III) fue purificada desde frutos
inmaduros de B hieronymi (Bruno et al 2008) cuyo pH oacuteptimo sobre caseiacutena se encuentra
en el rango de pH 86-93 La masa molecular determinada por SDS-PAGE fue de 25 kDa y
por espectrometriacutea de masas de 23713 Da Mediante IEF se observaron dos bandas de pI
59 y 64
La actividad de las tres endopeptidasas frente a sustratos sinteacuteticos mostroacute
diferencias significativas Soacutelo hieronymaiacutena I pudo degradar PFLNA (un sustrato comuacuten
para proteasas de ananaacute) Z-Phe-Arg-p-nitroanilida fue hidrolizado por hieronymaiacutena I y II
mientras que Z-Arg-Arg-p-nitroanilida el sustrato sobre el que tiene alta afinidad bromelina
de tallo y comosaiacutena fue degradado soacutelo por hieronymaiacutena III Ademaacutes las tres
endopeptidasas mostraron diferentes especificidades sobre 5 de los 13 sustratos N-α-CBZ-
p-nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos ensayados el derivado de Ala fue preferido por
hieronymaiacutena I y II seguido por Gly y Asp respectivamente mientras que hieronymaiacutena III
clivoacute preferentemente el derivado de Lys seguido por Asp (Bruno et al 2008)
La comparacioacuten de la secuencia de los N-terminales de hieronymaiacutena II y III mostroacute
gran similitud entre siacute (93) y con las de la bromelina de tallo bromelina de fruto
comosaiacutena ananaiacutena y balansaiacutena I (70-90) (Bruno et al 2006 2008) Mientras que la
secuencia del N-terminal de hieronymaiacutena I mostroacute una similitud del oacuterden del 70 con la de
hieronymaiacutena II y balansaiacutena I y del 60 con las de hieronymaiacutena III bromelina de tallo
ananaiacutena y comosaiacutena (Bruno et al 2003 2008)
144 Macrodontaiacutenas
A partir de frutos de Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [= Pseudananas
sagenarius (Arruda) Camargo] se obtuvo un extracto parcialmente purificado por
precipitacioacuten acetoacutenica denominado macrodontaiacutena el cual fue activo en un amplio rango
de pH obtenieacutendose valores superiores al 75 de la actividad maacutexima entre pH 70 y 105
(caseiacutena) Macrodontaiacutena fue estable en el rango de pH de maacutexima actividad asiacute como en
condiciones de elevada fuerza ioacutenica Por el contrario a diferencia de otras fitoproteasas
macrodontaiacutena no fue demasiado termoestable ya que la actividad residual se redujo al
50 luego de ser incubada durante 2 h a 45 ordmC (Brullo 2003)
Desde macrodontaiacutena se lograron purificar dos endopeptidasas macrodontaiacutena I con
una masa molecular de 25 kDa (SDS-PAGE) y pI de 61 y macrodontaiacutena II con masa
molecular de 27 kDa (SDS-PAGE) y pI de 59 Macrodontaiacutena I exhibioacute un rango de pH
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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oacuteptimo entre pH 61 y 85 en tanto que en macrodontaiacutena II fue maacutes estrecho (pH 75-85)
La actividad de ambas proteasas sobre N-α-CBZ-p-nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos mostroacute
mayor afinidad hacia el derivado de Ala seguido por el de Gln y Tyr El E-64 inhibidor
especiacutefico del sitio activo de cisteiacutenproteinasas exhibioacute un comportamiento diferencial frente
a una y otra proteasa ya que produjo inhibicioacuten praacutecticamente total de macrodontaiacutena I
pero macrodontaiacutena II conservoacute un 15 de actividad residual hecho que podriacutea
relacionarse con una diferente geometriacutea del sitio activo como sugieren Ritonja et al (1989)
para bromelaiacutena de tallo (Brullo 2003) Macrodontaiacutena I y II fueron activas frente a Bz-Phe-
Val-Arg-NHMec pero no frente a Z-Arg-Arg-NHMec Las secuencias N-terminales de
macrodontaiacutena I y II revelan un 926 de identidad entre siacute un 80-90 con comosaiacutena
ananaiacutena bromelina de tallo y balansaiacutena I (Loacutepez et al 2001) un 70-80 con
hieronymaiacutena II y III y un 60 con hieronymaiacutena I (Bruno et al 2008)
Brullo (2003) determinoacute la estructura primaria de macrodontaiacutena I que demostroacute estar
compuesta por 213 aminoaacutecidos con un peso molecular calculado de 23486 Da valor
consistente con el dato aportado por la espectrometriacutea de masas (23459 Da) La
comparacioacuten con las secuencias completas de algunas fitoproteasas cisteiacutenicas reveloacute un
alto grado de identidad (alrededor del 70) con las de Ananas comosus con bromeliacutena de
fruto exhibioacute la mayor similitud (770 de identidad) seguida por ananaiacutena (con 719 de
identidad) y bromeliacutena de tallo (con 671 de identidad) Ademaacutes fue determinado el
caraacutecter no glicoproteacuteico de la enzima Al igual que en papaiacutena en macrodontaiacutena I existen
7 residuos Cys seis de los cuales participan de los tres puentes disulfuro presentes en la
estructura de esta clase de enzimas Dada la semejanza estructural entre varias proteasas
comparadas se concluye que macrodontaiacutena I integra el Clan CA de las proteasas
cisteiacutenicas que lidera papaiacutena (Brullo 2003)
15 Objetivos
Como se ha dicho el extracto acuoso obtenido del ananaacute [Ananas comosus (L)
Merr] conocido como bromelina ha mostrado tener tanto in vivo como in vitro efectos
antiedematoso antiinflamatorio antitumoral antitromboacutetico entre otras acciones
farmacoloacutegicas Pertenece al grupo de proteasas que son administradas oralmente en el
tratamiento sisteacutemico contra la inflamacioacuten las enfermedades relacionadas con la
coagulacioacuten sanguiacutenea y el caacutencer Su baja toxicidad permite que sea bien tolerada en
tratamientos largos Si bien su mecanismo de accioacuten auacuten no ha sido definitivamente
dilucidado sus efectos farmacoloacutegicos son adjudicados principalmente a sus
endopeptidasas cisteiacutenicas Actividades farmacoloacutegicas diversas han sido tambieacuten atribuidas
a fitoproteasas de tipo cisteiacutenicas pertenecientes a otras bromeliaacuteceas (Bromelia fastuosa)
asiacute como a especies pertenecientes a otras familias (Caricaceae Moraceae)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Algunas especies de la familia Bromeliaceae entre ellas Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes se caracterizan por producir grandes cantidades de
endopeptidasas cisteiacutenicas Crecen en amplias regiones de nuestro paiacutes (NEA y NOA) asiacute
como en Brasil Bolivia Paraguay y Colombia Excepto el uso de frutos de B balansae para
tratar la tos en una regioacuten de Brasil no se conocen usos medicinales para estas tres
especies A partir de sus frutos se han aislado y caracterizado en el LIProVe varias
proteasas de tipo cisteiacutenicas que sin embargo no han sido objeto de estudios
farmacoloacutegicos hasta este momento
Es propoacutesito del presente trabajo aportar al conocimiento en relacioacuten a los posibles
usos medicinales de especies de bromeliaacuteceas autoacutectonas de nuestro paiacutes no estudiadas
auacuten para dichos fines Bajo la suposicioacuten que las proteasas de Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes por pertenecer al mismo tipo cataliacutetico y a la misma
subfamilia vegetal podriacutean mostrar actividades bioloacutegicas similares a las proteasas de
Ananas comosus nos planteamos como objetivo general de la presente tesis
La buacutesqueda de posibles efectos farmacoloacutegicos de extractos ricos en
cisteiacutenendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi B balansae
y Pseudananas macrodontes y su comparacioacuten con bromelina
Y como objetivos especiacuteficos
Evaluar el efecto antiinflamatorio de los extractos de B hieronymi B balansae
y P macrodontes
Evaluar los efectos de los extractos de B hieronymi B balansae y P
macrodontes sobre algunos de los componentes de la hemostasia
Evaluar los extractos de B hieronymi B balansae y P macrodontes como
posibles agentes antitumorales
Tratar de establecer la posible relacioacuten entre los efectos medidos y la actividad
proteoliacutetica de las cisteiacutenendopeptidasas estudiadas
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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2 MATERIAL VEGETAL
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
28
21 Material Vegetal Utilizado
211 Bromelia hieronymi Mez
Crece en bosques xeroacutefitos de la provincia fitogeograacutefica chaquentildea Habita desde el
SE de Bolivia a traveacutes del Chaco paraguayo y argentino hasta las provincias de Tucumaacuten
Santiago del Estero y Chaco (Arenas 1997)
Frutos inmaduros fueron recogidos en los alrededores de la ciudad de Santiago del
Estero por el Ing Lucas Roic de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad
Nacional de Santiago del Estero Un ejemplar de referencia ha sido depositado en el
herbario de la Divisioacuten Plantas Vasculares de la Facultad de Ciencias Naturales y Museo de
la Universidad Nacional de La Plata Los frutos fueron lavados secados al aire y
almacenados en freezer a -20 ordmC hasta su uso
2111 Extracto parcialmente purificado de frutos de B hieronymi (Bh)
Aproximadamente 50 g de frutos congelados fueron cortados y triturados en una
procesadora durante 1 min en intervalos de 10 s con igual tiempo de espera con 250 mL de
buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 conteniendo EDTA y cisteiacutena 5 mM Luego de filtrar con
gasa se centrifugoacute durante 30 min a 4 ordmC y 12000 g El sobrenadante que constituye el
extracto crudo se fraccionoacute y almacenoacute a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue
realizada sobre bantildeo de hielo
A fin de eliminar compuestos fenoacutelicos y la mayoriacutea de los carbohidratos presentes
al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y en agitacioacuten suave se le adicionaron 4
voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC Luego de permitir la precipitacioacuten durante 30 min
a 4 ordmC se centrifugoacute a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC Se descartoacute el sobrenadante y el
precipitado fue secado al vaciacuteo durante 30 min el que finalmente fue resuspendido en buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Bruno 2007)
212 Bromelia balansae Mez
Frecuente en el sotobosque umbriacuteo es una planta asociada con el aacutembito fluvial Se
distribuye desde Colombia Amazonia Centro y Este de Brasil Regioacuten Oriental del
Paraguay hasta Corrientes y Misiones y las zonas riberentildeas de Formosa y Chaco en
Argentina (Arenas 1997)
El material estudiado proviene de la Provincia de Misiones (en la proximidad de
Posadas ruta 105 Km 28 a 33 entre los departamentos de San Joseacute y Fachinal) La
recoleccioacuten fue llevada a cabo por el Dr Aniacutebal Amat de la Facultad de Ciencias Exactas
Quiacutemicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones donde se encuentra
depositado un ejemplar de herbario Los frutos fueron lavados secados y almacenados a -
20 ordmC hasta su uso
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
29
2121 Extracto parcialmente purificado de frutos de B balansae (Bb)
Aproximadamente 40 g de frutos semimaduros congelados fueron cortados y
triturados en una procesadora 10 veces durante 10 s (con intervalos de 20 s) con 200 mL de
buffer fosfato soacutedico 01M de pH 7 conteniendo EDTA 5 mM y cisteiacutena 125 mM Luego de
filtrar la preparacioacuten resultante con gasa se la centrifugoacute a 12000 g durante 25 min a 4 ordmC y
el sobrenadante resultante que corresponde al extracto crudo fue fraccionado y
almacenado a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue realizada sobre bantildeo de
hielo
Al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y con agitacioacuten suave se le agregoacute un
volumen de etanol preenfriado a -20 ordmC y se lo dejoacute durante 30 min a 4 ordmC Luego se
centrifugoacute a 3000 g durante 30 min a 4 ordmC El sobrenadante en bantildeo de hielo fue tratado
con 3 voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC y luego de dejarlo durante 30 min a 4 ordmC fue
centrifugado a 3000 g durante 30 min a 4 ordmC Una vez eliminado el sobrenadante el
precipitado fue secado al vaciacuteo durante 45 min Finalmente fue resuspendido con buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Pardo 2004)
213 Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [= P sagenarius (Arruda) Camargo]
Vegeta en el interior de bosques huacutemedos y sombriacuteos es caracteriacutestico en bosques
de galeriacutea Se extiende desde el nordeste centro y este de Brasil a traveacutes del Paraguay
Oriental hasta la Mesopotamia argentina Se halla en toda la cuenca de los riacuteos Paraguay y
Paranaacute desde Bolivia hasta la altura del litoral santafecino (Arenas 1997)
Los frutos en estado semimaduro fueron recogidos en Santa Ana departamento de
Candelaria Provincia de Misiones por el Prof Aniacutebal Amat Un ejemplar de referencia ha
sido depositado en el herbario de la Facultad de Ciencias Exactas Quiacutemicas y Naturales de
la Universidad Nacional de Misiones Los frutos fueron lavados secados al aire y
almacenados a -20 ordmC hasta su uso
2131 Extracto parcialmente purificado de frutos de P macrodontes (Pm)
Aproximadamente 120 g de frutos semimaduros congelados y desprovistos de
semillas y bracteacuteolas fueron cortados y triturados en una procesadora durante 1 min (en
intervalos de 10 s con igual tiempo de espera) con 200 mL de buffer fosfato soacutedico 01M de
pH 6 conteniendo EDTA y cisteiacutena 5 mM Luego de filtrar la preparacioacuten resultante con gasa
se la centrifugoacute a 5000 g durante 30 min a 4 ordmC y el sobrenadante resultante (extracto crudo)
fue fraccionado y almacenado a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue realizada
sobre bantildeo de hielo
Al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y con agitacioacuten suave se le agregoacute un
volumen de etanol preenfriado a -20 ordmC y se lo dejoacute durante 30 min a 4 ordmC Luego se
centrifugoacute a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC El sobrenadante en bantildeo de hielo fue luego
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
30
tratado con 3 voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC y luego de dejarlo durante 120 min a
4 ordmC fue centrifugado a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC Una vez eliminado el sobrenadante
el precipitado fue secado al vaciacuteo durante 30 min Finalmente fue resuspendido con buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Brullo 2003)
214 Ananas comosus (L) Merr
Es una planta perenne nativa de Ameacuterica del Sur de escaso porte y con hojas duras
y lanceoladas de hasta 1 metro de largo fructifica una vez cada tres antildeos produciendo un
uacutenico fruto fragante y dulce muy apreciado en gastronomiacutea (Garciacutea Suaacuterez amp Serrano
2005)
Los efectos evaluados de los preparados proteoliacuteticos fueron comparados con los de
bromelina de tallo comercial (B4882 Sigma Aldrich)
215 Reactivos quiacutemicos
En todos los casos se usoacute etanol 96ordm calidad medicinal (Soria) EDTA (Invitrogen)
cisteiacutena (Sigma Aldrich) y fosfato soacutedico pureza 98 (Carlo Erba)
22 Caracterizacioacuten proteoliacutetica de los extractos parcialmente purificados (Bh Bb y Pm) y de bromelina
221 Teacutecnicas y metodologiacutea
2211 Dosaje de la actividad caseinoliacutetica
La preparacioacuten del sustrato se realizoacute suspendiendo 1 g de caseiacutena de leche bovina
(Sigma Aldrich) en 100 mL de solucioacuten buffer (Tris-HCl 01M pH 80) la suspensioacuten se
colocoacute en un bantildeo de agua que se llevoacute a ebullicioacuten y se mantuvo durante 20 min en esas
condiciones La solucioacuten resultante se filtroacute en caliente y una vez enfriada se agregoacute cisteiacutena
25 mM como activador de proteasas cisteiacutenicas
La mezcla de reaccioacuten se preparoacute con 11 mL de solucioacuten de caseiacutena al 1 y 01 mL
de solucioacuten del extracto en estudio La reaccioacuten fue llevada a cabo a 37 ordmC y detenida a los 2
min por la adicioacuten de 18 mL de aacutecido tricloroaceacutetico al 5 luego de lo cual los tubos fueron
centrifugados a 4000 g durante 30 min determinaacutendose la absorbancia de los
sobrenadantes a 280 nm medida a traveacutes de una celda de 1 cm de paso En todos los
casos fueron realizados ensayos en blanco agregando al preparado proteoliacutetico primero el
aacutecido tricloroaceacutetico y por uacuteltimo la solucioacuten de caseiacutena
Siguiendo el criterio de Sarath et al (1989) para expresar la actividad enzimaacutetica
cuando se utilizan sustratos proteicos se definioacute para este caso una unidad arbitraria
(Unidad caseinoliacutetica UCas) que corresponde a la cantidad de enzima requerida para
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
31
producir un incremento de una unidad de absorbancia a 280 nm al cabo de 1 min en las
condiciones de ensayo
2212 Cuantificacioacuten del contenido proteico
Se utilizoacute el meacutetodo de Bradford (1976) basado en que la unioacuten del Coomassie Blue G-
250 a la proteiacutena produce un corrimiento del maacuteximo de absorbancia de 465 nm (forma roja
del colorante libre) a 595 nm (forma azul del complejo colorante-proteiacutena) Las curvas de
calibracioacuten se confeccionaron utilizando seroalbuacutemina bovina (Sigma-Aldrich) en el rango de
02-12 mgmL para el ensayo estaacutendar y en el rango de 10-100 μgmL para el microensayo
2213 Isoelectroenfoque
Las bandas proteicas se determinaron por isoelectroenfoque (IEF) utilizando un equipo
Mini IEF Cell (Modelo 111 Bio Rad) Las muestras se precipitaron con 4 voluacutemenes de
acetona durante 30 min y luego de centrifugar a 16000 g durante 15 min el precipitado
resultante fue redisuelto con agua bidestilada
Los geles fueron preparados mezclando 20 mL de acrilamida-bisacrilamida (25T6
3C7) 20 mL de glicerol (25 pv) 05 mL de anfolitos Biolyte 3-10 (para Bh Bb y
bromelina) o Pharmalyte 4-65 (para Pm) y 55 mL de agua luego que dicha mezcla fue
degasificada se adicionaron 3 μL de TEMED y 60 μL de persulfato de amonio al 10
Las muestras (1-5 microL) se sembraron y se permitioacute que difundieran dentro del gel
durante 5 min Los electrodos fueron humedecidos con agua bidestilada y los geles se
apoyaron inmediatamente sobre los mismos El IEF fue llevado a cabo en tres etapas
sucesivas 15 min a 100 V 30 min a 200 V y finalmente 1 h a 450 V
Una vez concluida la corrida los geles fueron sumergidos durante 30 min en solucioacuten
fijadora (4 g de aacutecido sulfosaliciacutelico 30 mL de metanol 125 g de aacutecido tricloroaceacutetico y agua
csp 100 mL) Una vez fijados los geles fueron tratados durante 2 h con la solucioacuten
colorante (10 mL de aacutecido aceacutetico glacial 27 mL de etanol 40 mg de Coomassie Brilliant
Blue R-250 500 mg de CuSO4 y agua csp 100 mL) decolorados por tres lavados
sucesivos con solucioacuten decolorante I (7 mL de aacutecido aceacutetico glacial 12 mL de etanol 500
mg de CuSO4 y agua csp 100 mL) y finalmente sumergidos en solucioacuten decolorante II (7
mL de aacutecido aceacutetico glacial 12 mL de Etanol y agua csp 100 mL) hasta obtener un fondo
claro
6 T= (g acrilamida+g bisacrilamida) x 100 volumen total
7 C= g bisacrilamida x 100 (g acrilamida+g bisacrilamida)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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2214 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Para el moldeado de los geles y la realizacioacuten de la corrida electroforeacutetica se empleoacute
el equipo Mini Protean III (Bio-Rad) y se procedioacute de acuerdo a la teacutecnica de Laemmli (1970)
con modificaciones Los geles se prepararon con poliacrilamida al 16 (Tabla 21)
Reactivos Gel de apilamiento
(5) Gel de resolucioacuten
(16)
Acrilamida-Bisacrilamida (3008) 115 mL 4 mL
Buffer de resolucioacuten - 094 mL
Buffer de apilamiento 09 mL
H2O 453 mL 2425 mL
SDS al 10 70 μL 75 μL
PSA 10 52 μL 50 μL
TEMED 4 μL 4 μL
Tabla 21 Sistema de geles empleado Buffer de resolucioacuten Tris-HCl 3M pH 88 Buffer de apilamiento Tris-HCl
05M pH 68 PSA persulfato de amonio TEMED NNNacuteNacute-tetrametiletilendiamina
Las muestras fueron tratadas con el agregado de un volumen de buffer de muestra
(Tabla 22) previa adicioacuten de aacutecido iodoaceacutetico 1 mM (concentracioacuten final) llevadas a
ebullicioacuten durante 10 min y centrifugadas durante 10 min a 16000 g
Buffer de muestra
Tris 157 g
SDS 4 g
Glicerol 16 mL
Azul de bromofenol 4 mg
β-mercaptoetanol 25 μL
Llevar a pH 68 con HCl 1M
AD csp 100mL
Tabla 22 Composicioacuten del buffer de muestra El β-mercaptoetanol fue agregado durante el tratamiento de las
muestras
El buffer de reservorio (03 pv de Tris 01 pv de SDS y 144 pv de glicina) se
colocoacute en el reservorio catoacutedico hasta cubrir la parte superior del gel y en el anoacutedico hasta
una altura suficiente como para permitir que todo el electrodo haga contacto con eacutel
En las distintas calles se sembraron 10-15 μL de las muestras y 3 μL de los patrones
de peso molecular (LMW GE Healthcare) fosforilasa b (97 kDa) albuacutemina (66 kDa)
ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (30 kDa) inhibidor de tripsina (201 kDa) y α-
lactoalbuacutemina (144 kDa)
La intensidad de corriente fue de 30 mA durante el apilado y de 60 mA durante la
resolucioacuten hasta la finalizacioacuten de la corrida Inmediatamente despueacutes los geles fueron
removidos de las placas y dejados durante 30 min en solucioacuten fijadora (10 vv de aacutecido
aceacutetico 50 vv de metanol) Luego fueron coloreados con solucioacuten colorante (10 vv de
aacutecido aceacutetico 40 vv de metanol y 100 mg de Coomassie Brillant Blue R-250) y
decolorados con una solucioacuten de aacutecido aceacutetico al 10 vv
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
33
2215 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina
Con el fin de determinar si los efectos medidos para los distintos preparados
proteoliacuteticos eran debidos a la accioacuten de sus proteasas cisteiacutenicas fue necesario evaluar el
efecto de los mismos preparados desprovistos de actividad proteoliacutetica
El meacutetodo de inhibicioacuten que se eligioacute fue tratar los preparados con E-64 (trans-
epoxisuccinil-L-leucilamido(4-guanidino)butano) un potente irreversible y selectivo inhibidor
de proteasas cisteiacutenicas El grupo trans-epoxisuccinil (resto activo) del E-64 se une
irreversiblemente al grupo tiol del sitio activo de muchas proteasas cisteiacutenicas tales como
papaiacutena y bromelina y no reacciona con los grupos tiol de otras enzimas no proteasas como
L-lactato deshidrogenasa (Barrett et al 1982) Dada esta gran especificidad y la baja
toxicidad que ha mostrado es considerado muy uacutetil para ensayos in vivo (Katunuma et al
1995)
22151 Tratamiento con E-64
Bh Bb y Pm fueron obtenidos seguacuten lo indicado previamente (2111 2121 y
2131 respectivamente) y antes de liofilizarlos diferentes aliacutecuotas de cada uno fueron
incubadas con soluciones de 5 10 30 60 80 y 100 μM (concentracioacuten en volumen de
mezcla) de E-64 (E3132 Sigma Aldrich) durante 30 min a 37 ordmC La solucioacuten de bromelina
fue preparada resuspendiendo el polvo comercial en buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 (30
mgml) y diferentes aliacutecuotas fueron incubadas con 60 100 130 150 y 250 μM de E-64 Los
blancos se incubaron de igual manera pero reemplazando el E-64 por igual volumen de
agua destilada Luego se determinoacute la actividad proteoliacutetica de cada aliacutecuota y se la
referencioacute a la actividad proteoliacutetica del preparado blanco a la que se consideroacute el 100
(actividad residual porcentual)
222 Resultados
2221 Perfiles de pI y de peso molecular de Bh Bb y Pm
El contenido proteico la actividad proteoliacutetica y la actividad especiacutefica de cada
preparado de Bh Bb y Pm evaluado se indican en cada capiacutetulo En la Figura 21 se
muestran los perfiles de pI obtenidos para cada preparado los cuales se correspondieron
con los reportados para los extractos parcialmente purificados de Bromelia hieronymi (Bruno
et al 2003) B balansae (Pardo et al 2000) y Pseudananas macrodontes (Loacutepez et al
2000)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
34
Figura 21 IEF A Bh bandas de pI 59 y 64 (Hironymaiacutena III) pI 76 y 83 (Hieronymaiacutena II) pH ge93
(Hieronymaiacutena I) B Bb banda de pI asymp 5 (Balansaiacutena I) bandas de pI 85 y 87 (balansaiacutena II) C Pm bandas de pI 57 59 (Macrodontaiacutena I) y 61 (Macrodontaiacutena II) D Bro (Bromelina de tallo) banda de pI gt93
La banda de pI asymp 46 para bromelina (Fig21 D) se corresponde a la bromelina de
fruto que estaacute presente en pequentildeas cantidades en los tallos de Ananas comosus (Hale et
al 2005)
En la Figura 22 se observan las bandas caracteriacutesticas todas ellas de alrededor de
25 kDa de las proteasas de Bh (asymp25 kDa) Bb (asymp24 kDa) y Pm (asymp26 kDa) La banda de asymp 29
kDa presente en Bh y la banda de asymp30 kDa contenida en Pm tambieacuten estaacuten presentes en los
extractos crudos respectivos y desaparecen cuando las corridas electroforeacuteticas se hacen
sin previa inhibicioacuten con aacutecido iodoaceacutetico comportamiento frecuente en el caso de
proteasas vegetales que actuacutean de inmediato sobre sus sustratos
Figura 22 SDS-PAGE de Bh Bb y Pm A la izquierda patrones de PM (kDa)
A B C D
Bh Bb Pm
144
201
300
450
660
970
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
35
2222 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina
En la Figura 23 se muestra la actividad porcentual residual de Bh Bb Pm y
bromelina luego de incubarlos con distintas concentraciones de E-64 durante 30 min a 37
ordmC
Figura 23 Actividad residual () de la actividad especiacutefica de Bh Bb Pm y bromelina (Bro) Media plusmn
DE (n=3)
De las curvas de inhibicioacuten de la Figura 23 se obtuvo la concentracioacuten miacutenima de E-
64 que inhibe a cada preparado 30 μM para Bh 10 μM para Bb y Pm 150 μM para 30
mgmL de bromelina las cuales fueron aumentadas un 10 maacutes al momento de obtener los
preparados inhibidos para los distintos ensayos
Cuando los preparados fueron liofilizados (excepto bromelina) previo a la evaluacioacuten
de los distintos efectos se les midioacute la actividad proteoliacutetica y la concentracioacuten de proteiacutenas
Sin embargo se observoacute una aparente inconsistencia en la concentracioacuten de proteiacutenas
medidas la concentracioacuten de proteiacutenas del liofilizado inhibido fue un 15 30 y 70 respecto
de la concentracioacuten del liofilizado sin inhibir para Bh Bb y Pm respectivamente
Habitualmente el proceso de liofilizacioacuten no genera peacuterdida de proteiacutenas en este tipo de
preparaciones Para comprobar si ello se debiacutea a una destruccioacuten parcial de las proteasas
se analizoacute cada material liofilizado por SDS-PAGE lo que permitioacute mostrar la presencia de
las bandas esperadas con intensidad similar en los liofilizados activos e inhibidos
Debido a que Bh era el preparado que aparentemente ldquoperdiacuteardquo maacutes proteiacutenas se lo
eligioacute para hacer ensayos de inhibicioacuten y evitando la liofilizacioacuten determinar el contenido
proteico Para esto se repitioacute el procedimiento de inhibicioacuten descripto en 22151 con 10
30 y 60 μM de E-64 y a cada una de las aliacutecuotas de Bh se le determinoacute la concentracioacuten de
proteiacutenas la actividad proteoliacutetica y el perfil por SDS-PAGE
-5
15
35
55
75
95
0 50 100 150 200 250
Act
ivid
ad r
esi
du
al (
)
E-64 (μM)
Pm
Bb
Bh
Bro
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
36
En la Figura 24 se muestran la actividad porcentual residual (A) y el contenido de
proteiacutenas (B) de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 durante 30
min a 37 ordmC
Figura 24 A Actividad porcentual residual () de la actividad proteoliacutetica y de la actividad especiacutefica de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 B Contenido proteico de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 Media plusmn DE (n=3)
Se observa una disminucioacuten en la concentracioacuten de proteiacutenas de Bh al aumentar la
concentracioacuten de E-64 Sin embargo en el SDS-PAGE de las distintas aliacutecuotas de Bh
(Figura 25) no se observa peacuterdida ni disminucioacuten de intensidad de las bandas principales de
Bh aun despueacutes de incubar Bh con 60 μM de E-64
Figura 25 SDS-PAGE Ec extracto crudo de B hieronymi 0 Bco 10 30 y 60 Bh luego de incubarlo con E-64 10 30 y 60 μM respectivamente P patrones de peso molecular (LMW Bio-Rad fosforilasa b 974 kDa seroalbuacutemina 662 kDa ovoalbuacutemina 45 kDa anhidrasa carboacutenica 31 kDa inhibidor de tripsina 215 kDa y lisozima 144 kDa
Por otro lado en la Figura 24 B se observa que luego de inhibir Bh con 30 μM de E-
64 (30) la concentracioacuten de proteiacutenas fue asymp14 de la concentracioacuten de proteiacutenas de Bh sin
inhibir (0) lo cual concuerda con la relacioacuten de proteiacutenas de los liofilizados activo e inhibido
observada para Bh
La aparente inconsistencia entre lo observado en la Figura 24 B y la Figura 25
podriacutea explicarse por la dependencia de la sensibilidad del meacutetodo de Bradford con la
composicioacuten de aminoaacutecidos en la superficie proteica (Lucarini amp Kilikian 1999) Si bien el
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 10 30 60
Pro
teiacuten
as (
mg
ml)
E-64 (μM)
A B
-2
18
38
58
78
98
0 5 10 30 60 80 100
Act
ivid
ad r
esi
du
al (
)
E-64 (μM)
Actividad caseinoliacutetica (Ucasml)
Actividad especiacutefica (Ucasmg)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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E-64 interacciona esencialmente con la cisteiacutena del sitio activo de las cisteiacutenendopeptidasas
el inhibidor parece inducir alguacuten cambio conformacional en las proteasas tratadas que afecta
fuertemente la reaccioacuten con el colorante No hemos encontrado referencia alguna a este
comportamiento en la bibliografiacutea consultada
A pesar de esta dificultad en la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas para
los distintos ensayos los preparados inhibidos se obtuvieron inhibieacutendolos seguacuten las
concentraciones de E-64 definidas en 2222 y luego se les midioacute la actividad caseinoliacutetica y
se realizoacute un IEF y un SDS-PAGE La inhibicioacuten fue llevada a cabo al momento previo de la
liofilizacioacuten para los preparados destinados a la evaluacioacuten del efecto antiinflamatorio
(Capiacutetulo 3) ya que los mismos fueron realizados en San Luis y se consideroacute maacutes adecuado
transportarlos ya inhibidos con la caracterizacioacuten ya hecha en el LIProVe En tanto que los
preparados destinados al resto de los ensayos (Capiacutetulos 4 y 5) fueron inhibidos luego de
ser liofilizados previamente a los ensayos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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3 EFECTO
ANTIINFLAMATORIO
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31 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al dantildeo
causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por cualquier agresor de naturaleza
bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica (Garciacutea Barreno 2008) Una respuesta inflamatoria
tiacutepica consta de cuatro componentes los inductores inflamatorios los sensores que los
detectan los mediadores inflamatorios inducidos por los sensores y los tejidos diana o
efectores que se ven afectados por los mediadores Dependiendo de la naturaleza de la
causa desencadenante diferentes combinaciones de los distintos componentes existentes
daraacuten lugar a diferentes respuestas inflamatorias Asiacute las respuestas inflamatorias a la
infeccioacuten y a la lesioacuten tisular esteacuteril tienen diferentes propoacutesitos la primera tiene por objeto
proteger al hueacutesped de la infeccioacuten y se puede acoplar con la induccioacuten de la inmunidad
adaptativa mientras que la segunda sirve principalmente para promover la reparacioacuten de los
tejidos (Medzhitov 2010)
311 Inflamacioacuten aguda
La inflamacioacuten aguda es la respuesta temprana de un tejido ante la lesioacuten es
inespeciacutefica de corta duracioacuten y se caracteriza por cambios en la microcirculacioacuten
exudacioacuten de liacutequido y migracioacuten de leucocitos desde los vasos sanguiacuteneos al aacuterea
afectada Desde el punto de vista cliacutenico se caracteriza por los cinco signos cardinales que
se manifiestan en el aacuterea dantildeada rubor (eritema) calor tumoracioacuten (edema) dolor y
functio laesa (peacuterdida de la funcioacuten por una combinacioacuten de los 4 puntos anteriores) Las
alteraciones morfoloacutegicas y funcionales son una manifestacioacuten de una serie compleja de
eventos interrelacionados respuesta vascular respuesta celular y cooperacioacuten tisular viacutea
mediadores quiacutemicos de la inflamacioacuten (Garciacutea Barreno 2008)
3111 Respuesta vascular
Luego de una vasoconstriccioacuten pasajera de las arteriolas en el sitio de agresioacuten le
sigue una vasodilatacioacuten de las arteriolas precapilares producida por la relajacioacuten del
muacutesculo liso vascular Estos cambios llevan a un aumento del flujo sanguiacuteneo en el aacuterea
lesionada causando rubor y calor
Ciertos mediadores son capaces de producir la contraccioacuten de las ceacutelulas
endoteliales de veacutenulas y capilares lo cual produce separacioacuten de las uniones intercelulares
de dichas ceacutelulas conduciendo a un aumento de la permeabilidad vascular y permitiendo
el pasaje de proteiacutenas y liacutequido al espacio extracelular Este escape neto de fluido se
denomina exudacioacuten Entre las proteiacutenas plasmaacuteticas que exudan estaacute el fibrinoacutegeno el
cual se deposita como fibrina sobre los tejidos extravasculares lo cual disminuye la
permeabilidad tisular evitando la reentrada del exudado al vaso que finalmente conduce a la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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formacioacuten del edema A raiacutez del aumento de la permeabilidad vascular se produce un
aumento de viscosidad sanguiacutenea y el flujo sanguiacuteneo comienza a disminuir permitiendo el
acercamiento de los leucocitos a la pared de los vasos (Roitt 2003)
3112 Respuesta celular
Si bien los tipos celulares presentes en los exudados dependeraacuten del agente
agresor la ceacutelula predominante es el polimorfonuclear (PMN) neutroacutefilo en especial en la
fase temprana de la inflamacioacuten Los leucocitos llegan al sitio lesionado mediante una serie
de pasos marginacioacuten adhesioacuten emigracioacuten y quimiotaxis a traveacutes de la pared vascular
A raiacutez del enlentecimiento del flujo sanguiacuteneo los leucocitos son desplazados hacia
la periferia del vaso lo cual junto al aumento de la viscosidad sanguiacutenea favorece la
marginacioacuten leucocitaria hacia la superficie endotelial Esto les permite adherirse a la
superficie endotelial de los vasos proceso incrementado durante la inflamacioacuten aguda por el
aumento en la expresioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten (CAM) en ceacutelulas endoteliales de las
veacutenulas (P y E-selectinas ICAM PAF etc) y en los leucocitos (MAC-1 LFA-1 PAF-R L-
selectinas etc) Los neutroacutefilos adheridos pueden atravesar el vaso sanguiacuteneo por las
uniones intercelulares y la membrana basal (diapeacutedesis) alcanzando el espacio intersticial
(emigracioacuten) desde donde se dirigen al sitio de inflamacioacuten inducidos por un gradiente de
concentracioacuten de factores quimiotaacutecticos (quimiotaxis) (Roitt 2003)
La fagocitosis llevada a cabo fundamentalmente por macroacutefagos y neutroacutefilos es la
internalizacioacuten y digestioacuten celular de partiacuteculas extrantildeas y requiere el reconocimiento el
englobamiento y la degradacioacuten de la partiacutecula Cuando se trata de un agente inerte y
grande el reconocimiento es directo Las opsoninas son sustancias que recubren la
partiacutecula y favorecen su fagocitosis La destruccioacuten del material se lleva a cabo por las
especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) las especies reactivas de nitroacutegeno y el sistema
halogenador ademaacutes de mecanismos independientes del oxiacutegeno tales como la proteinasa
3 la catepsina G la lisozima y la lactoferrina entre otros Estos efectores junto a los
productos de degradacioacuten son liberados al medio extracelular por lo que los dantildeos
colaterales a los tejidos del hueacutesped resultan inevitables (Nathan 2006)
3113 Mediadores quiacutemicos8
La respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso dispositivo de mediadores
que se organizan en complejas redes reguladoras (Garciacutea Barreno 2008) Se trata de
moleacuteculas solubles que difunden faacutecilmente y actuacutean sobre los receptores de los efectores
Los mediadores pueden provenir de los sistemas plasmaacuteticos (coagulacioacuten complemento
cininas) ser liberados desde graacutenulos almacenados en ceacutelulas (serotonina histamina) o ser
8 En este apartado aquellos paacuterrafos que no contienen citas fueron adaptados convenientemente de Rotelli
(2004)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
41
sintetizados inmediatamente cuando se requieren (eicosanoides) Teniendo en cuenta su
accioacuten y su origen se pueden clasificar como se indica en la Tabla 31
Tabla 31 Clasificacioacuten de mediadores de la inflamacioacuten seguacuten accioacuten y origen
La histamina es un mediador temprano de la inflamacioacuten aguda y es liberado desde
los graacutenulos almacenados en los mastocitos perivasculares luego de ser estimulados por
neuropeacuteptidos liberados desde las terminaciones nerviosas (Benoist amp Mathis 2002)
antiacutegenos IL-1 C3a y C5a (Roitt 2003) entre otros Su accioacuten es mediada por receptores
(H) ubicados a lo largo de todo el lecho vascular principalmente en ceacutelulas del muacutesculo liso
y ceacutelulas endoteliales Sobre el muacutesculo liso produce dilatacioacuten mientras que sobre las
ceacutelulas endoteliales produce contraccioacuten y por tanto aumenta la permeabilidad vascular
estimula la expresioacuten de P-selectinas aumentando la adhesioacuten leucocitaria y estimula la
siacutentesis de NO y prostaciclina (PGI2) ambas con efectos vasodilatadores (Brunton et al
2006)
La serotonina (5-hidroxitriptamina 5-HT) puede tener un efecto vasoconstrictor o
vasodilatador seguacuten el receptor sobre el cual actuacutee sin embargo durante la inflamacioacuten
aguda actuacutea tempranamente provocando vasodilatacioacuten con aumento de permeabilidad
aunque con menor potencia que la histamina
Los eicosanoides son las familias de prostaglandinas (PGs) leucotrienos (LTs) y
compuestos similares que derivan de aacutecidos grasos poliinsaturados esenciales de 20
aacutetomos de carbono Son sintetizados en la membrana celular por activacioacuten de la
fosfolipasa A2 o de la fosfolipasa C las cuales catalizan la liberacioacuten del precursor
eicosanoide (aacutecido araquidoacutenico) desde la membrana celular (Brunton et al 2006)
A partir del aacutecido araquidoacutenico se inician dos viacuteas principales de siacutentesis la viacutea de
la ciclooxigenasa (COX) la cual conduce a la formacioacuten de PGs prostaciclinas (PGIs) y
tromboxanos (TXAs) y la viacutea de la lipooxigenasa la cual conduce a la siacutentesis de LTs
Mediadores que incrementan la permeabilidad vascular en el edema inflamatorio
Vasoactivos derivados de ceacutelulas Vasoactivos derivados del plasma
-Aminas bioacutegenas serotonina histamina
-Eicosanoides
-Factor activador de plaquetas (PAF)
-Oxido niacutetrico (NO)
-Cininas
-Cascada de coagulacioacuten
-Sistema de complemento
Mediadores involucrados en el reclutamiento celular (Factores quimiotaacutecticos)
-C5a C3a
-Eicosanoides (LTB4)
-Quimiocinas
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Existen dos isoformas de la COX COX-1 expresada de manera constitutiva en la mayoriacutea
de las ceacutelulas y COX-2 inducida por citocinas y factores de crecimiento entre otros
estiacutemulos
Los leucotrienos LTC4 y LTD4 aumentan la permeabilidad vascular aumentando el
exudado de plasma El LTB4 ademaacutes de aumentar la permeabilidad es un potente agente
quimiotaacutectico aumenta la adherencia y emigracioacuten de los neutroacutefilos a traveacutes del endotelio y
estimula la degranulacioacuten y la siacutentesis de superoacutexido en los PMNs
Mientras que la PGF2 es vasoconstrictora PGE2 y PGI2 son vasodilatadoras y
aumentan el edema y la infiltracioacuten de leucocitos en el aacuterea inflamada Sin embargo PGE2
puede actuar como inmunosupresor inhibe la liberacioacuten de los productos lisosomales de los
neutroacutefilos y macroacutefagos asiacute como la participacioacuten de leucocitos en reacciones de
hipersensibilidad tardiacutea (Brunton et al 2006)
El factor activador de plaquetas (PAF) ademaacutes de ser un potente estimulador de la
agregacioacuten y activacioacuten plaquetaria aumenta la permeabilidad vascular la quimiotaxis y la
adhesioacuten de neutroacutefilos al endotelio asiacute como la generacioacuten de superoacutexido y enzimas
lisosomales desde los PMNs Al actuar sobre receptores acoplados a proteiacutenas G activa las
fosfolipasas A2 y C estimulando la siacutentesis de TXA2 PGs y LTs La trombina e histamina
estimulan su expresioacuten en las ceacutelulas endoteliales Se sintetiza en mastocitos plaquetas
neutroacutefilos eosinoacutefilos monocitos y NK (ldquonatural killersrdquo)
El oacutexido niacutetrico (NO) es un potente vasodilatador potencia la citotoxicidad de los
fagocitos y activa las COX-1 y COX-2 (Salvemini et al 1993) Es sintetizado por dos
isoformas de la oacutexido niacutetrico sintasa (NOS) La NOS constitutiva (c-NOS) estaacute presente en
plaquetas y ceacutelulas endoteliales y produce pequentildeas cantidades de NO La NOS inducible
(i-NOS) se expresa en muacuteltiples ceacutelulas tales como neutroacutefilos macroacutefagos ceacutelulas
endoteliales y muacutesculo liso vascular Diversos agentes vasoactivos (serotonina histamina
bradicinina trombina y estiacutemulos fiacutesicos) estimulan la siacutentesis de NO en las ceacutelulas
endoteliales
Las cininas (bradicinina plasmaacutetica y calidina tisular) son peacuteptidos derivados por
accioacuten de calicreiacutenas del cininoacutegeno plasmaacutetico (cininoacutegeno de alto peso molecular) y del
cininoacutegeno tisular (cininoacutegeno de bajo peso molecular) La calicreiacutena plasmaacutetica es activada
a partir de la precalicreiacutena por accioacuten del factor XII el cual a su vez es activado por contacto
con superficies cargadas negativamente (colaacutegeno heparina productos plaquetarios etc)
Las cininas tienen propiedad vasodilatadora (sobre arteriolas) y vasoconstrictor (sobre
arterias y venas de gran calibre) asiacute como tambieacuten aumentan la permeabilidad en la
microcirculacioacuten y estimulan la siacutentesis de PGs por activacioacuten de fosfolipasas A2 y C En
macroacutefagos estimulan la liberacioacuten de la interleucina IL-1 y del factor de necrosis tumoral
(TNF-α) Uno de sus receptores (B1) es inducible por dantildeo tisular e inflamacioacuten
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El paso final de la coagulacioacuten es la formacioacuten de fibrina la cual no soacutelo frena el
sangrado permitiendo la reparacioacuten del aacuterea lesionada sino que tambieacuten forma una malla en
la que quedan atrapados los agentes agresores impidiendo su diseminacioacuten Por otro lado
durante la formacioacuten de la fibrina se liberan fibrinopeacuteptidos A y B desde el fibrinoacutegeno los
cuales actuacutean como quimiotaacutecticos de los PMNs y potencian los efectos de la bradicinina
El sistema del complemento estaacute formado por proteiacutenas plasmaacuteticas (C) que actuacutean
en forma de cascada en la que cada enzima activa la siguiente La activacioacuten es
desencadenada por complejos antiacutegeno-anticuerpo y productos bacterianos Como
consecuencia de su activacioacuten se forman productos con propiedad opsonizante
quimiotaacutectica y capacidad liacutetica sobre ceacutelulas diana Los productos C5a y C3a estimulan el
estallido respiratorio en los fagocitos desencadenan la liberacioacuten de mediadores (histamina
PAF IL-3 4 5 y 6 entre otros) asiacute como la siacutentesis de LTs PGs y TXs desde mastocitos y
basoacutefilos C5a y en menor medida C3a es un potente agente quimiotaacutectico de neutroacutefilos
ademaacutes de estimular la siacutentesis de eicosanoides C5a tambieacuten genera vasodilatacioacuten y
aumento de la permeabilidad capilar C5a y C3a tambieacuten se pueden formar por accioacuten de la
plasmina la calicreiacutena y enzimas leucocitarias
Bajo el estiacutemulo local el macroacutefago hiacutestico libera las citocinas IL-1 y TNF-α entre
otros mediadores las cuales actuacutean estimulando las ceacutelulas endoteliales (luego de la
trombina o la histamina) ceacutelulas epiteliales y fibroblastos a liberar quimiocinas (MCP-1) Las
quimiocinas actuacutean sobre diversos tipos leucocitarios conducieacutendolos al sitio inflamado IL-8
es un potente quimiotaacutectico para neutroacutefilos pero tambieacuten para linfocitos (Roitt 2003)
312 Regulacioacuten y resolucioacuten de la inflamacioacuten
La finalizacioacuten de la respuesta inflamatoria y la transicioacuten al estado homeostaacutetico es
un proceso activo y altamente regulado conocido como la resolucioacuten de la inflamacioacuten
(Medzhitov 2010) Entre los mecanismos reguladores identificados se pueden mencionar
proteiacutenas reguladoras del complemento el factor transformante β (TGF-β) las IL-4 y IL-10
la PGE2 y los glucocorticoides endoacutegenos que actuacutean regulando la proliferacioacuten y
activacioacuten de las ceacutelulas inflamatorias (Roitt 2003) las lipoxinas (producidas por la 15-
lipooxigenasa en los tejidos) inhiben el reclutamiento de neutroacutefilos y promueven el
reclutamiento de los monocitos que eliminan las ceacutelulas muertas e inician la reparacioacuten del
tejido las resolvinas y protectinas (derivadas del aacutecido eicosapentanoico y del
docosahexanoico) tienen un papel crucial en la resolucioacuten de la inflamacioacuten junto a las
lipoxinas (Medzhitov 2008) los fosfoliacutepidos de las membranas de las ceacutelulas endoteliales
vasculares oxidados por las ROS disminuyen la expresioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten
(Brash 1999)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Dependiendo de la cantidad de tejido destruido y la naturaleza del agente agresor la
inflamacioacuten puede generar secuelas tales como la cicatrizacioacuten y la formacioacuten de abscesos
La cicatrizacioacuten ocurre cuando hay dantildeo sustancial al tejido conectivo yo el tejido
carece de la capacidad para regenerar ceacutelulas especializadas Los tejidos muertos y el
exudado inflamatorio agudo se reemplazan por un tejido conectivo vascular especializado
llamado tejido de granulacioacuten el cual produce gradualmente colaacutegeno para formar una
cicatriz fibrosa A pesar de la peacuterdida de algunas ceacutelulas especializadas y algo de distorsioacuten
arquitectoacutenica de la cicatriz fibrosa se restablece la integridad estructural
La formacioacuten de abscesos es un proceso que tiene lugar cuando la reaccioacuten
inflamatoria aguda no puede destruireliminar el agente agresor y continuacutea con un
componente de la inflamacioacuten croacutenica Esto es maacutes comuacuten en el caso de la infeccioacuten por
bacterias pioacutegenas (Woolf et al 2002)
313 Inflamacioacuten croacutenica
Cuando la inflamacioacuten se mantiene durante un tiempo prolongado (semanas o
meses) se habla de inflamacioacuten croacutenica en la que coexisten el dantildeo tisular y los intentos
de reparacioacuten Puede producirse por mantenimiento de la inflamacioacuten aguda (si no se
resuelve la causa) o bien empezar de manera progresiva y poco evidente sin las
manifestaciones de la inflamacioacuten aguda Este segundo caso es el responsable del dantildeo
tisular de algunas enfermedades como la artritis reumatoide la aterosclerosis la
tuberculosis y la fibrosis pulmonar Ademaacutes es importante en el desarrollo del caacutencer y en
enfermedades que anteriormente se consideraban exclusivamente degenerativas como el
Alzheimer Entre las causas de la inflamacioacuten croacutenica se pueden distinguir las infecciones
persistentes (micobacterias ciertos hongos virus y paraacutesitos) las enfermedades mediadas
por el sistema inmune (artritis reumatoide reacciones aleacutergicas enfermedad de Crohn y
esclerosis muacuteltiple) y la exposicioacuten prolongada a agentes toacutexicos (polvo de siacutelice fibras
suturas y cuerpos extrantildeos que no pueden ser removidos por fagocitosis) (Kumar 2009)
Ante la persistencia durante diacuteas del agente agresor los PMNs son reemplazados
por ceacutelulas mononucleares (macroacutefagos linfocitos y ceacutelulas plasmaacuteticas) si bien pueden
persistir algunos neutroacutefilos Los macroacutefagos presentan una morfologiacutea variable secretan
mediadores de inflamacioacuten regulan la actividad de linfocitos y favorecen la proliferacioacuten y el
desarrollo de fibroblastos y ceacutelulas endoteliales Durante la fase proliferativa de la
inflamacioacuten croacutenica los fibroblastos restauran la matriz del tejido conectivo dantildeado
conduciendo a la fibrosis en tanto que la proliferacioacuten de ceacutelulas endoteliales favorece la
formacioacuten de pequentildeos capilares (angiogeacutenesis)
Un tipo morfoloacutegico de la inflamacioacuten croacutenica es la inflamacioacuten granulomatosa
caracterizada por una coleccioacuten organizada de macroacutefagos los cuales forman ceacutelulas
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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epiteliodes o se fusionan formando ceacutelulas gigantes ante la imposibilidad de digerir el agente
fagocitado Independientemente de su causa los granulomas pueden contener otras ceacutelulas
(linfocitos neutroacutefilos eosinoacutefilos fibroblastos) ademaacutes de fibrosis (Mukhopadhyay et al
2012) El proceso de formacioacuten de granulomas se puede dividir en 4 fases (iniciacioacuten
acumulacioacuten efectora y de resolucioacuten) en las cuales las ceacutelulas T tienen un rol
importante Durante la iniciacioacuten los macroacutefagos son atraiacutedos por el estiacutemulo inflamatorio y
comienza a nuclear la lesioacuten granulomatosa Durante la acumulacioacuten ceacutelulas T CD4+ se
acumulan en el sitio y reclutan otras ceacutelulas efectoras incluyendo ceacutelulas T maacutes
macroacutefagos y en algunos casos eosinoacutefilos Durante la fase efectora las ceacutelulas intentan
reducir la carga de patoacutegenos Por uacuteltimo una vez que la amenaza del patoacutegeno ha sido
reducida o eliminada la infiltracioacuten celular se reduce y se induce la formacioacuten del tejido
cicatricial (Co et al 2004) Las infecciones micoacuteticas la tuberculosis la lepra y la presencia
de cuerpos extrantildeos (talco suturas etc) son algunas de las causas de la inflamacioacuten
granulomatosa
En la inflamacioacuten no granulomatosa las ceacutelulas se encuentran diseminadas Se
caracterizan por la acumulacioacuten de linfocitos sensibilizados por antiacutegenos ceacutelulas
plasmaacuteticas y macroacutefagos Puede observarse necrosis tisular y fibrosis Las causas maacutes
comunes son las infecciones virales croacutenicas y las enfermedades autoinmunes entre otras
(Rotelli 2004)
314 Proteasas como antiinflamatorios
El rol de las proteasas como agentes antiinflamatorios especialmente el de la
tripsina es considerado desde la deacutecada del 50 en varios estudios (Martin et al 1954
Cohen et al 1955) En 1957 Innerfield reporta el efecto antiinflamatorio de la tripsina
administrada intramuscularmente en pacientes con tromboflebitis con gran componente
edematoso Atribuye a la proteasa un aumento en la permeabilidad tisular una disminucioacuten
en la viscosidad de los exudados y la reversioacuten del edema asiacute como la superacioacuten de la
isquemia en los tejidos con inflamacioacuten aguda al eliminar las barreras exudativas
extravasculares al flujo sanguiacuteneo en los pequentildeos vasos comprimidos
Un antecedente importante en el estudio de la accioacuten antiedematosa de las
proteasas cisteiacutenicas es el trabajo de Netti et al (1972) quienes compararon los efectos de
proteasas y agentes antiinflamatorios conocidos sobre edemas inducidos por distintos
agentes flogiacutesticos en pata de rata Los porcentajes de inhibicioacuten de edema para ficina
bromelina al igual que para un concentrado de enzimas proteoliacuteticas pancreaacuteticas fueron
iguales o superiores a los de indometacina acido acetilsaliciacutelico y fenilbutazona mientras
que la papaiacutena a la concentracioacuten ensayada no fue efectiva frente a ninguacuten edema En los
modelos animales la viacutea de administracioacuten de las preparaciones proteoliacuteticas es en su
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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mayoriacutea oral aunque la eficacia antiedematosa de la bromelina administrada
intraperitonealmente tambieacuten ha sido comprobada (Smyth et al 1962 Uhlig amp Seifert
1981)
3141 Bromelina
Desde su introduccioacuten comercial en 1957 se han publicado resultados cientiacuteficos
que revelan los efectos antitromboacutetico fibrinoliacutetico y antiinflamatorio de la bromelina
evaluados mediante ensayos in vivo e in vitro (Maurer 2001) Ademaacutes de los modelos de
edema ya mencionados otros modelos experimentales de inflamacioacuten en los que la
bromelina ha sido efectiva son los siguientes encefalomielitis aleacutergica experimental (un
modelo experimental de la esclerosis muacuteltiple humana) asma aleacutergico pleuritis inducida por
carragenina enfermedades reumatoloacutegicas en ratoacuten arterioesclerosis inmunoloacutegicamente
mediada en aloinjertos aoacuterticos de rata y enfermedad inflamatoria intestinal en ratones IL-10-
- (Fitzhugh et al 2008 Secor et al 2012)
Una serie de estudios cliacutenicos controlados reportaron la eficacia de la bromelina
frente a edema inflamacioacuten dolor hematomas entre otros signos en sinusitis aguda
traumatismos en cara cabeza y extremidades inferiores tumefaccioacuten post-operatoria
inflamacioacuten e hinchazoacuten post-traumaacutetica y cirugiacutea oral (Maurer 2001)
El uso de la bromelina como antiinflamatorio o analgeacutesico en la artritis reumatoide fue
sugerido por Cohen amp Goldman (1964) Maacutes recientemente la bromelina ha sido evaluada
para la artrosis en varios estudios cliacutenicos abiertos o de equivalencia disentildeados para
determinar la efectividad comparativa y la seguridad respecto al tratamiento estaacutendar con
antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) Dichos estudios sugieren que la bromelina sola o
en complejos enzimaacuteticos (PHL9 WOB10 y WOB-N11) puede ser beneficiosa o tan eficaz
como el tratamiento con AINEs mostrando buena tolerabilidad y leves reacciones adversas
(principalmente siacutentomas gastrointestinales) Sin embargo la mayoriacutea de los estudios tienen
determinados problemas metodoloacutegicos que hacen difiacutecil extraer conclusiones definitivas
(Brien et al 2004 2006)
En un estudio de nivel II de medicina basada en la evidencia (EBM) se ha
demostrado que el tratamiento con bromelina en nintildeos con sinusitis aguda puede ser
considerada como segura y beneficiosa (Braun et al 2005)
El efecto antiinflamatorio de la bromelina puede ser explicado por su accioacuten sobre
distintos niveles del complejo proceso inflamatorio como se sentildeala a continuacioacuten
9 PHL Phlogenzyme contiene bromelina tripsina y rutina
10 WOB Wobenzyme contiene bromelina papaiacutena tripsina quimotripsina pancreatina lipase y amilasa
11 WOB-N contiene bromelina tripsina papaiacutena quimotripsina pancreatina y rutina
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31411 Efecto sobre los componentes de la coagulacioacuten
En el modelo edema de pata inducido por carragenina la accioacuten antiinflamatoria de
bromelina fue correlacionado con el aumento de la actividad fibrinoliacutetica seacuterica (Pirotta amp
Giuli-Morghen 1978) Ademaacutes la bromelina ha mostrado aumentar la concentracioacuten de
plasmina seacuterica (Smyth et al 1962) la activacioacuten de plasminoacutegeno a plasmina (Maurer et
al 2000) y disminuir el nivel seacuterico de fibrinoacutegeno (Livio et al 1978) Todos estos efectos
disminuiriacutean la deposicioacuten de fibrina en el aacuterea inflamada produciendo un aumento en la
permeabilidad tisular y vascular lo que promoveriacutea la reabsorcioacuten del fluido del edema
(Maurer 2001)
31412 Efecto sobre el sistema de calicreiacutenas
En el modelo de inflamacioacuten en ratas ldquobolsa de airerdquo inducido por caoliacuten la bromelina
redujo de manera dosis-dependiente el nivel de bradicinina en el sitio de inflamacioacuten y el
nivel de precalicreiacutena seacuterica los que fueron correlacionados con la reduccioacuten del exudado
plasmaacutetico (Kumakura et al 1988) explicando la accioacuten antiedematosa asiacute como
analgeacutesica de la bromelina
31413 Efecto sobre las viacuteas de la COX y la NOS
Los niveles de PGE2 asiacute como de sustancia P (un neuropeacuteptido asociado a la
percepcioacuten del dolor) se encontraron disminuidos en el exudado inflamatorio generado en
ratas por la implantacioacuten de esponjas embebidas en carragenina (Gaspani et al 2002) En
otro modelo inflamatorio la bromelina redujo de manera dosis-dependiente los niveles de
PGE2 y TXs junto con el volumen de exudado (Vellini et al 1986) Maacutes recientemente la
bromelina ha mostrado reducir la expresioacuten de la COX-2 y PGE2 por inhibicioacuten en la
translocacioacuten del factor nuclear kappa-B (NF-ĸB) en ceacutelulas tumorales asiacute como en modelos
experimentales de caacutencer (Chobotova et al 2010 Bhui et al 2012)
La administracioacuten oral de bromelina mejoroacute la disminucioacuten de la defecacioacuten en ratas
postoperatorias laparotomizadas al menos en parte mediante la inhibicioacuten de la
sobreexpresioacuten de la i-NOS del colon a traveacutes de la ruta del NF-kB (Wen et al 2006)
31414 Modulacioacuten de moleacuteculas de superficie celular
La bromelina ha mostrado remover moleacuteculas de superficie celular en leucocitos
(granulocitos monocitos y linfocitos) asociadas con la adhesioacuten y la activacioacuten leucocitaria
(Hale et al 2002) La reduccioacuten de la migracioacuten de neutroacutefilos en tres modelos murinos de
migracioacuten leucocitaria en cavidad intraperitoneal inflamada fue asociada a la remocioacuten de L-
selectina y principalmente de CD128 (receptor del quimioatractante IL-8) desde la superficie
leucocitaria lo que llevoacute a la eliminacioacuten de la adhesioacuten de alta afinidad mediada por
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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48
integrinas de los vasos sanguiacuteneos del sitio inflamado (Fitzhugh et al 2008) La bromelina
activa proteoliacuteticamente redujo la expresioacuten de CD25 (presente en la superficie de ceacutelulas T
activas que actuacutea como receptor del factor de proliferacioacuten IL-2) de manera dosis y tiempo
dependiente en ensayos in vitro y se propuso como mecanismo el clivaje proteoliacutetico de
CD25 desde la superficie celular (Secor et al 2009) Tambieacuten se ha sugerido que bromelina
podriacutea mediar su efecto antiinflamatorio actuando como moleacutecula de sentildealizacioacuten sobre los
receptores activados por proteasas (PAR) (Engwerda et al 2001 Muumlller et al 2012)
31415 Activacioacuten celular y produccioacuten de citoquinas
La bromelina mostroacute inhibir la transduccioacuten de sentildeales (viacutea MAPKERK-2) y la
produccioacuten de citoquinas (IL-4 IL-2 e IFN-γ) desde ceacutelulas T accioacuten que fue revertida al
inhibir la actividad proteoliacutetica de bromelina (Mynott et al 1999) En un modelo murino de la
enfermedad aleacutergica respiratoria ya establecida la bromelina redujo significativamente el
contenido de ceacutelulas T (CD4 y CD8) en el lavado bronqueoalveolar (BAL) sin afectar el
nuacutemero de ceacutelulas en el bazo o los ganglios linfaacuteticos hiliares ademaacutes de una disminucioacuten
de IL-4 IL-12 IL-17 asiacute como de IFN-α en el suero (Secor et al 2012)
La bromelina regula la produccioacuten de IFN-γTNF-α IL-1β e IL-6 de forma dependiente
de las condiciones inflamatorias La secrecioacuten de TNF-α IL-1β e IL-6 desde ceacutelulas
mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) obtenida de voluntarios sanos asiacute como de
macroacutefagos de ratoacuten seriacutea estimulada in vitro por la bromelina mediante un mecanismo
dependiente de IFN-γ Sin embargo en situaciones en las que las ceacutelulas inmunes ya han
sido estimuladas la bromeliacutena reduce la produccioacuten elevada de TNF-α IL-1β e IL-6 Por
ejemplo en presencia de lipopolisacaacuterido (LPS) un inductor de la reaccioacuten de inflamacioacuten
aguda bromelina reduce la expresioacuten de dichas citocinas desde PBMC (Chobotova et al
2010) Esta probable dualidad tambieacuten ha sido observada en modelos in vivo donde la
bromelina ha mostrado ser capaz tanto de mejorar como de inhibir las respuestas inmunes
dependientes de ceacutelulas T lo cual podriacutea depender del entorno inmunoloacutegico particular en el
que se la administra (Engwerda et al 2001)
Maacutes recientemente en un ensayo cliacutenico aleatorio controlado con placebo la
bromelina ha mostrado modular las respuestas celulares de linfocitos (cambio significativo
en el perfil circadiano de IFN-γ) despueacutes de su administracioacuten oral en voluntarios sanos
(Muumlller et al 2012)
Las evidencias experimentales dan cuenta de que la bromelina tendriacutea accioacuten sobre
muacuteltiples dianas y si bien su mecanismo antiinflamatorio no ha sido completamente
dilucidado numerosos efectos estaacuten mediados por su actividad proteoliacutetica (Pirotta amp Giuli-
Morghen 1978 Hale amp Haynes 1992 Mynott et al 1999 Hale et al 2002 Wen et al
2006 Hale et al 2005 Fitzhugh et al 2008 Secor et al 2009)
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32 Objetivos
Dentro del objetivo general de estudiar el posible efecto antiinflamatorio de los
extractos ricos en cisteiacutenendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) B
balansae (Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) se plantearon los siguientes objetivos
especiacuteficos
Evaluar el efecto de Bh Bb y Pm sobre la inflamacioacuten aguda y croacutenica empleando
modelos de inflamacioacuten en animales
Determinar si los efectos medidos tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los
extractos
Comparar los efectos de Bh Bb y Pm con los medidos para bromelina
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50
33 Materiales y meacutetodos
331 Modelos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria provocada por distintos estiacutemulos (isquemia agentes
infecciosos injuria quiacutemica teacutermica o mecaacutenica interaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo) puede ser
medida por los signos cliacutenicos que la acompantildean eritema edema dolor e hiperalgesia Una
serie de mecanismos dan lugar a distintas fases en que puede caracterizarse al proceso
inflamatorio
-Fase aguda transitoria caracterizada por vasodilatacioacuten local e incremento de la
permeabilidad capilar
-Fase subaguda caracterizada por infiltracioacuten de leucocitos y ceacutelulas fagociacuteticas
-Fase croacutenica proliferativa en la cual aparece una degeneracioacuten del tejido y fibrosis
Diferentes modelos desarrollados en animales de experimentacioacuten permiten
reproducir dichas fases (Vogel 2002) proporcionando un meacutetodo necesario para el
descubrimiento del uso apropiado de nuevos agentes terapeacuteuticos (Willoughby 2003)
El efecto antiinflamatorio de los preparados proteoliacuteticos fue evaluado usando
modelos de inflamacioacuten aguda o subaguda (edema de pata de rata) y un modelo de
inflamacioacuten croacutenica proliferativa (test del granuloma)
3311 Modelos de inflamacioacuten aguda Edema de pata de rata
Este modelo se basa en medir la capacidad de los agentes antiinflamatorios de
inhibir el edema producido en la pata trasera de ratas o ratones luego de la inyeccioacuten de un
agente flogiacutestico El efecto antiinflamatorio medido asiacute como su duracioacuten dependen de la
sustancia empleada como agente flogiacutestico (Vogel 2002)
33111 Edema de pata inducido por carragenina
Los carragenanos son un grupo complejo de polisacaacuteridos formados por la repeticioacuten
de monoacutemeros de galactosa modificada y son de tres tipos principales lambda kappa y
iota En el modelo de edema de pata la carragenina tipo lambda es inyectada
subcutaacuteneamente en la pata trasera La respuesta inflamatoria generada se caracteriza por
edema hiperalgesia y eritema y se cuantifica por el aumento de tamantildeo de la pata a raiacutez del
edema formado el cual es maacuteximo alrededor de las 5 h posteriores a la inyeccioacuten de
carragenina (Morris 2003)
El incremento en el volumen del edema es dependiente del tiempo y su desarrollo ha
sido descripto como un proceso bifaacutesico (Vinegar et al 1969 Salvemini et al 1996) La
fase temprana (0-1 h) se caracteriza por la liberacioacuten de histamina e 5-hidroxitriptamina (5-
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
51
HT) y le sigue un corto periacuteodo (asymp15-25 h) en que se libera bradicinina (Di Rosa et al
1971) mientras que la fase tardiacutea (asymp25-10 h) ha sido correlacionada con la produccioacuten de
prostaglandinas (PGs) atribuida a la induccioacuten de la ciclooxigenasa inducible (COX-2)
(Seibert et al 1994) La infiltracioacuten y activacioacuten de neutroacutefilos contribuye a la respuesta
inflamatoria principalmente de la fase tardiacutea por liberacioacuten de radicales libres derivados del
oxiacutegeno (O2- radicales hidroxilo) El oacutexido niacutetrico (NO) producido por la oacutexido niacutetrico sintasa
constitutiva (c-NOS) en la primera fase y por la oacutexido niacutetrico sintasa inducible (i-NOS) en la
fase tardiacutea actuacutea como un potente vasodilatador y tendriacutea un rol clave en el mantenimiento
de la respuesta inflamatoria tardiacutea al aumentar la produccioacuten de PGs por activacioacuten de la
COX-2 (Salvemini et al 1996)
La inhibicioacuten del edema de pata inducido por carragenina ha demostrado ser
altamente predictivo de la accioacuten antiinflamatoria del faacutermaco en la enfermedad inflamatoria
humana y las dosis de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en este modelo se
correlacionan bien con la dosis eficaz en los pacientes (Morris 2003)
331111 Procedimiento experimental
En la pata trasera izquierda de cada animal se realizoacute una inyeccioacuten subplantar de
01 mL de carragenina lambda tipo IV (Sigma Aldrich) al 2 en solucioacuten fisioloacutegica Una
hora antes cada lote de animales recibioacute intraperitonealmente (05 mL) los preparados a
ensayar El lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 y como control positivo se
usoacute 10 mgml de indometacina (Sigma Aldrich) o 50 mgml de diclofenac soacutedico (Sigma
Aldrich) Los voluacutemenes de las patas traseras fueron medidos con un pletismoacutemetro a
distintos tiempos post-inyeccioacuten de carragenina (1 3 5 y 7 h)
Aquellos preparados que mostraron tener un efecto antiinflamatorio durante la
primera hora en el modelo de edema inducido por carragenina fueron probados en modelos
de edema inducido por mediadores de la fase temprana histamina y serotonina
33112 Edema de pata inducido por histamina
La histamina a traveacutes de sus receptores (H) distribuidos en el lecho vascular
produce vasodilatacioacuten e hiperpermeabilidad capilar Luego de ser administrada produce un
efecto vasodilatador de muy corta duracioacuten dando lugar a hiperemia enrojecimiento y
edema
331121 Procedimiento experimental
Los animales recibieron en la pata trasera izquierda una inyeccioacuten subplantar de 01
mL de histamina clorhidrato (Sigma Aldrich) al 01 en solucioacuten fisioloacutegica Una hora antes
a cada lote se le administroacute intraperitonealmente 05 mL de los preparados a ensayar y el
lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Mediante la utilizacioacuten de un
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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pletismoacutemetro se midioacute el volumen de edema a los 15 30 y 60 min despueacutes de la
administracioacuten de histamina (Rotelli 2004)
33113 Edema de pata inducido por serotonina
En la inflamacioacuten aguda la serotonina (o 5-HT) produce vasodilatacioacuten e
hiperpermeabilidad vascular aunque con menor potencia que la histamina
331131 Procedimiento experimental
Cada animal recibioacute en su pata trasera izquierda una inyeccioacuten subplantar de 01 mL
de serotonina clorhidrato (Sigma Aldrich) al 001 en solucioacuten fisioloacutegica Una hora antes
cada lote recibioacute intraperitonealmente 05 mL de los preparados a ensayar y el lote control
recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Mediante la utilizacioacuten de un pletismoacutemetro se
midioacute el volumen de edema a los 30 60 y 120 minutos posteriores a la administracioacuten de la
serotonina (Rotelli 2004)
33114 Equipamiento medidas y caacutelculo del volumen de edema
Las medidas del volumen de las patas traseras fueron realizadas mediante el uso de
un pletismoacutemetro (Ugo Basile 7140) que consiste en una celda conteniendo liacutequido en la
cual se sumerge la pata y un transductor que transforma el volumen de liacutequido desplazado
en una sentildeal eleacutectrica la cual se lee como volumen de la pata con una precisioacuten de 001
mL
La celda estaacute constituida por dos tubos interconectados en uno de los cuales se
sumerge la pata y el desplazamiento de agua producido genera un cambio en el nivel del
liacutequido en el segundo tubo donde se encuentra el transductor Este uacuteltimo consiste en dos
pares de electrodos de Pt-Ir Un par de electrodos (electrodo de nivel) mide la conductancia
y la conductividad del liacutequido Por estar los electrodos parcialmente sumergidos la
conductancia es proporcional al nivel del liacutequido y por lo tanto al volumen de la pata Un
segundo par de electrodos (electrodos de compensacioacuten) por estar totalmente sumergidos
soacutelo son sensibles a la conductividad y a traveacutes de un circuito electroacutenico corrigen la lectura
del electrodo de nivel de manera que la sentildeal resultante es proporcional a la conductancia y
por tanto al volumen sumergido El liacutequido contenido en la celda es una solucioacuten de NaCl al
5 conteniendo un agente tensioactivo (proporcionado por el fabricante) que minimiza el
menisco de lectura12
Ambas patas traseras fueron marcadas con una fibra indeleble por encima del
maleacuteolo lateral y cada una fue sumergida hasta hacer coincidir la marca con el menisco del
liacutequido momento en el cual se registroacute la medida del volumen Cada volumen fue medido
12
httpwwwugobasilecomcataloguecategorypain_and_inflammationproduct37140_plethysmometerhtml
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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por triplicado en todos los tiempos de medida El volumen de edema fue calculado por la
resta de los voluacutemenes promedio de ambas patas
3312 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma
Meier et al (1950) demostraron que el implante de algodones esteacuteriles en ratas
produciacutean granulomas de cuerpo extrantildeo caracterizados por tejido conectivo no
diferenciado ceacutelulas gigantes e infiltracioacuten de fluido Despueacutes de varios diacuteas el incremento
del peso del pellet implantado puede ser medido constituyendo una medida del tejido
granulomatoso y por lo tanto de la respuesta inflamatoria (Vogel 2002) Este meacutetodo ha
demostrado ser uacutetil para la demostracioacuten de la actividad farmacoloacutegica de los esteroides
como antiinflamatorios (Bailey et al 1982)
El desarrollo del edema implica distintos eventos Tempranamente en la vecindad
del algodoacuten se producen sustancias quimiotaacutecticas para neutroacutefilos y monocitos Durante los
primeros 5 diacuteas despueacutes de la implantacioacuten se demostroacute la continua acumulacioacuten de ceacutelulas
polimorfonucleares (PMNs) principalmente neutroacutefilos que penetraban al algodoacuten desde la
periferia Entre los diacuteas 5 y 7 los estudios histoloacutegicos mostraron que la amplia
vascularizacioacuten se llevaba a cabo con la formacioacuten de una caacutepsula fibrosa junto con una
infiltracioacuten masiva de la caacutepsula por las ceacutelulas mononucleares El aumento en el peso del
granuloma resulta significativo recieacuten a partir del diacutea 5 (Bailey et al 1982)
33121 Procedimiento experimental
Ratas hembra fueron anestesiadas por inyeccioacuten intraperitoneal de una mezcla
conteniendo 75 mgkg de ketamina clorhidrato (Holliday Scott SA) y 12 mgkg de xilacina
clorhidrato (Richmond Laboratories Vet Pharma) El granuloma fue inducido por el implante
subcutaacuteneo de un pellet de algodoacuten esteacuteril (50 mg) en el aacuterea dorsal Un diacutea despueacutes del
implante los animales fueron divididos en lotes de 6 animales e inyectados
intraperitonealmente (05 mL) con los preparados a ensayar Como control positivo se usoacute
un lote administrado con dexametasona fosfato soacutedico (adquirida a Norgreen y a Klonal) en
tanto que el lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 La administracioacuten fue
repetida diariamente durante los 5 diacuteas siguientes El 7mo diacutea las ratas fueron pesadas y
luego de sacrificarlas por dislocacioacuten cervical se les extrajo el granuloma el timo y el bazo
los cuales tambieacuten fueron pesados El aumento en el peso del algodoacuten introducido permitioacute
cuantificar el tejido inflamatorio (granulomatoso) depositado en el algodoacuten (Meier et al
1950)
3313 Caacutelculo del efecto antiinflamatorio y anaacutelisis estadiacutestico
Los datos obtenidos se analizaron estadiacutesticamente mediante ANOVA con posterior
comparacioacuten por las pruebas de Tukey o Dunnett El grado de significancia de las
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
54
diferencias entre los lotes fue evaluado con el paraacutemetro p consideraacutendose
estadiacutesticamente significativo un p lt 005 () Para el procesamiento de los datos se empleoacute
el programa GraphPad Prism Version 500 En los graacuteficos y en las tablas los resultados se
expresan como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de la media (SEM) En todos los casos
salvo excepciones que son especificadas el nuacutemero de reacuteplicas por experimento (n) fue = 6
Los porcentajes de inhibicioacuten de la inflamacioacuten como una medida de la accioacuten
antiinflamatoria fueron calculados con la siguiente foacutermula
inhibicioacuten = (1 - VT VC) x 100
siendo VC la medida promedio para el lote control (volumen para los modelos de edema de
pata de rata masa para el test del granuloma) y VT la medida promedio para el lote que fue
tratado con la droga en estudio La misma foacutermula fue usada para calcular los porcentajes
de reduccioacuten de las masas del timo y del bazo
332 Animales
En todos los ensayos de inflamacioacuten fueron empleadas ratas Wistar de ambos sexos
proporcionadas por el bioterio de la Universidad Nacional de San Luis En el laboratorio
fueron pesadas y distribuidas en lotes de 6 dejadas en jaulas y abastecidas con alimento y
agua ad libitum durante el periacuteodo de los ensayos Para los modelos de inflamacioacuten aguda
se emplearon animales de entre 170 y 220 g y luego de los ensayos fueron sacrificados
mediante una corriente de CO2 Los animales usados para los ensayos de inflamacioacuten
croacutenica pesaron entre 90 y 140 g y fueron sacrificados mediante dislocacioacuten cervical
333 Dosis
Las dosis de Bh Bb y Pm fueron preparadas resuspendiendo los liofilizados en agua
esteacuteril mientras que para preparar las dosis de bromelina se resuspendioacute el polvo comercial
en buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Todas las soluciones fueron preparadas en el
momento de administrarlas
334 Material vegetal ensayado
En la Tabla 32 se presentan los valores de actividad caseinoliacutetica y contenido
proteico por mg de liofilizado (UCasmg y μg proteiacutenamg respectivamente) asiacute como la
actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos parcialmente purificados obtenidos
por precipitacioacuten etanoacutelica a partir de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) Pseudananas
macrodontes (Pm) y Bromelia balansae (Bb) Debido a que se obtuvieron varios extractos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
55
para cada material vegetal (Bh1-5 Bb1-4 y Pm1-4) esto se indica en cada una de las tablas
en que se exponen los resultados obtenidos para cada experimento
Liofilizados UCasmg liofilizado μg proteiacutenamg liofilizado UCasmg proteiacutena
Bh1 0177 plusmn 0004dagger 18 plusmn 2
dagger 98
Bh2 0173 plusmn 0042dagger 21 plusmn 3
dagger 82
Bh3 019 plusmn 003dagger 18 plusmn 2
dagger 106
Bh4 020 plusmn 002dagger 21 plusmn 2
dagger 97
Bh5 020 plusmn 002 19 plusmn 2 9
Bh (Promedio total plusmn DE) 019 plusmn 002 20 plusmn 2 10 plusmn 1
Bb1 0161 plusmn 0006dagger 9 plusmn 1
dagger 17
Bb2 0164 plusmn 003dagger 9 plusmn 1
dagger 17
Bb3 0135 plusmn 0009dagger 13 plusmn 1
dagger 104
Bb4 017 plusmn 001 14 plusmn 1 12
Bb (Promedio total plusmn DE) 016 plusmn 002 11 plusmn 3 14plusmn 4
Pm1 017 plusmn 002 29 plusmn 4 59
Pm2 0187 plusmn 0009 30 plusmn 3 6
Pm3 025plusmn 003dagger 32 plusmn 4
dagger 9
Pm4 0125 plusmn 0013 25 plusmn 2 5
Pm (Promedio total plusmn DE) 018 plusmn 005 29 plusmn 3 6 plusmn 2
Bromelina (Sigma Aldrich) 063 plusmn 006 200 plusmn 20 32 plusmn 05
Tabla 32 Actividad caseinoliacutetica contenido proteico y actividad especiacutefica de los extractos parcialmente
purificados Media plusmn DE daggerError calculado como [Xmaacuteximo-Xmiacutenimo]2 siendo Xmaacuteximo y Xmiacutenimo valores promedios (n =
3) maacuteximo y miacutenimo respectivamente obtenidos de dos mediciones independientes UCas unidades
caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
56
34 Resultados y Discusioacuten
341 Modelos de inflamacioacuten aguda
3411 Edema de pata de rata inducido por carragenina
34111 Bromelia hieronymi
En un trabajo previo (Boeris et al 2004) se encontroacute que en el modelo de edema de
pata de ratoacuten inducido por carragenina una dosis de 50 mgkg de un extracto parcialmente
purificado obtenido de frutos de Bromelia hieronymi presentaba efecto antiinflamatorio Esa
dosis fue evaluada en ratas como una primera aproximacioacuten a la determinacioacuten de una dosis
efectiva En la Tabla 33 se muestran los voluacutemenes de edema promedio y los porcentajes
de inhibicioacuten respecto al lote control medidos a 1 3 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina
de lotes tratados con 50 mgkg de Bh1 y con 50 mgkg de bromelina
Tabla 33 Efecto de Bh1 y bromelina en edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Tanto Bh como bromelina inhibieron significativamente la formacioacuten de edema en
alguno de los tiempos de medida Mientras Bh mostroacute actividad antiinflamatoria a las 3 h tal
como fue reportado (Boeris et al 2004) bromelina lo hizo a las 5 y 7 h post inyeccioacuten de
carragenina
A fin de corroborar si al aumentar la dosis de Bh se lograba efecto antiinflamatorio en
los otros tiempos de medida se ensayaron dosis de 100 y 200 mgkg Ademaacutes puesto que
la hipoacutetesis de partida fue que la actividad proteoliacutetica podriacutea ser la responsable de la accioacuten
antiinflamatoria de los extractos se tuvieron en cuenta las UCaskg administradas De la
Tabla 32 puede deducirse que una dosis de 200 mgkg de Bh1 equivale a un promedio de
35 UCaskg Con fines comparativos la dosis de bromelina se llevoacute a 55 mgkg (equivalente
a 35 UCaskg)
Tiempo
(h)
Control Bh1
50 mgkg Bromelina 50 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 025plusmn002 020plusmn002 20c 029plusmn007 -14c
3 052plusmn002 023plusmn003 56a 03plusmn01 33ca
5 11plusmn01 058plusmn009 45ca 04plusmn02 60a
7 127plusmn005 114plusmn006 10c 05plusmn02 60a
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
57
En los resultados expuestos en la Tabla 34 puede observarse que Bh mostroacute un
efecto antiinflamatorio significativo desde la primera hora en la cual inhibioacute la formacioacuten de
edema con una eficacia de alrededor del 35 alcanzando el maacuteximo valor a las 5 h con un
porcentaje de inhibicioacuten significativamente similar al de bromelina e indometacina (asymp 75)
Mientras que los porcentajes de inhibicioacuten de 100 y 200 mgkg de Bh fueron
significativamente equivalentes a los de la bromelina desde la primera hora hasta las 5 h a
las 7 h soacutelo la dosis de 200 mgkg mantuvo un efecto significativamente similar al de
bromelina (asymp 70) Dado que 55 mgkg de bromelina y 200 mgkg de Bh son equivalentes
en actividad proteoliacutetica (35-36 UCaskg) los resultados de la Tabla 34 estaacuten acordes con
la hipoacutetesis de que la actividad proteoliacutetica seriacutea responsable de la actividad antiinflamatoria
de los preparados enzimaacuteticos Para fortalecer esta hipoacutetesis se proboacute el efecto que tiene la
inhibicioacuten con E-64 de las proteasas cisteiacutenicas sobre la accioacuten antiinflamatoria exhibida por
Bh y bromelina
Tabla 34 Efecto de diferentes dosis de Bh1 bromelina e indometacina en edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
341111 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina
En la Tabla 35 se muestran los voluacutemenes de edema y los porcentajes de inhibicioacuten
respecto al lote control de lotes tratados con 150 mgkg de Bh4 y 150 mgkg de Bh4
incubado con E-64 (Bh4E-64) 50 mgkg de bromelina y 50 mgkg de bromelina incubada
con E-64 (BromelinaE-64) y 025 μmolkg de E-64 (equivalente a los μmoles contenidos en
las dosis de Bh4E-64 y bromelinaE-64)
Tiempo
(h)
Control
Bh1
50 mgkg
90plusmn02UCaskg
Bh1
100 mgkg
180plusmn04UCaskg
Bh1
200 mgkg
354plusmn08UCaskg
Bromelina
55 mgkg
35plusmn3UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 034plusmn001 024plusmn002 29bc 021plusmn003 38b 022plusmn002 35b 031plusmn005 9bc 030plusmn001 12bc
3 059plusmn006 052plusmn009 12c 027plusmn003 54ba 025plusmn002 58b
027plusmn005 54ba 050plusmn005 15ac
5 12plusmn01 07plusmn01 44a 029plusmn009 75b 026plusmn001 78b 028plusmn003 76b 040plusmn004 66ba
7 124plusmn009 09plusmn01 27ac 08plusmn01 40ad 038plusmn006 69b 032plusmn006 74b 053plusmn004 57bd
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
58
Tiempo
(h)
Control
Bh4
150 mgkg
30plusmn3 UCaskg
Bh4E-64
150 mgkg
09plusmn01 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
BromelinaE-64
50 mgkg
4plusmn2 UCaskg
E-64
025 μmolKg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 042plusmn003 022plusmn002 48b 026plusmn004 38b 022plusmn003 48b 028plusmn002 33ba 040plusmn003 5ac
3 067plusmn007 020plusmn003 70b 04plusmn01 33cb 018plusmn002 73b
05plusmn01 25c 062plusmn006 75c
5 115plusmn008 033plusmn005 71b 10plusmn02 13c 020plusmn001 83b 09plusmn02 20c 103plusmn007 10c
7 144plusmn009 09plusmn02 34a 125plusmn006 13ac 028plusmn007 80b 13plusmn02 9c 120plusmn007 17c
Tabla 35 Efecto del tratamiento con E-64 de Bh y bromelina sobre la accioacuten inhibitoria de edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Puede observarse que Bh y bromelina tuvieron efecto antiinflamatorio a lo largo de
todo el ensayo mientras que BhE-64 y bromelinaE-64 soacutelo mostraron efecto significativo
en la primera h post inyeccioacuten de carragenina Auacuten cuando durante todo el ensayo los
porcentajes de inhibicioacuten de Bh fueron maacutes altos que los de BhE-64 soacutelo a las 5 h lo fue
estadiacutesticamente significativo (71 gt 13 plt005) Por su parte los porcentajes de
inhibicioacuten de bromelina fueron significativamente superiores a los de bromelinaE-64 a las 3
5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina E-64 no mostroacute efecto antiinflamatorio en ninguacuten
tiempo de medida
Dado que al eliminar la actividad proteoliacutetica de Bh y bromelina se observoacute una
peacuterdida de actividad antiinflamatoria desde las 3 h siendo maacutes evidente en los tiempos en
que Bh y bromelina muestran los maacuteximos porcentajes de inhibicioacuten (a las 5 h para Bh y a
las 5 y 7 h para bromelina) se podriacutea suponer que las cisteiacutenendopeptidasas seriacutean las
responsables de la actividad antiinflamatoria medida para Bh y bromelina a partir de las 3 h
post inyeccioacuten de carragenina Por otro lado teniendo en cuenta el rol secuencial de los
distintos mediadores de la inflamacioacuten descriptos para este modelo tambieacuten se podriacutea
suponer que las cisteiacutenendopeptidasas de Bh y bromelina inhibiriacutean la infiltracioacutenactividad
de neutroacutefilos o la siacutentesisaccioacuten de NO y PGs los cuales alcanzan picos de produccioacuten
entre las 3 y las 6 h post inyeccioacuten de carragenina (Salvemini et al 1996) Tanto la
inhibicioacuten de la migracioacuten de neutroacutefilos como de la produccioacuten de PGs y NO ya han sido
demostradas para la bromelina en otros modelos (Gaspani et al 2002 Wen et al 2006
Fitzhugh et al 2008 Kalra et al 2008 Bhui et al 2012)
Los bajos porcentajes de inhibicioacuten medidos en la primera hora post inyeccioacuten de
carragenina respecto a los de las siguientes horas para Bh (Tablas 33 34 y 35) y para
bromelina (Tabla 35) estariacutean indicando que Bh y bromelina tienen un bajo efecto inhibitorio
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
59
sobre los mediadores de la primera fase del modelo Aunque otra explicacioacuten posible es que
durante la primera hora auacuten no se haya alcanzado la concentracioacuten efectiva de los
compuestos activos en el sitio de accioacuten Sea cual fuere la causa de la informacioacuten
aportada en la Tabla 35 se puede concluir que los efectos antiinflamatorios de Bh y
bromelina en la primera hora no dependeriacutean de la actividad proteoliacutetica de las
cisteinendopeptidasas
34112 Pseudananas macrodontes
Los resultados obtenidos para Bh y bromelina fueron tenidos en cuenta para
establecer las dosis a ensayar de los extractos obtenidos a partir de frutos de Pseudananas
macrodontes (Pm) En la Tabla 36 se presentan los voluacutemenes y porcentajes de inhibicioacuten
de edema inducida por carragenina en el modelo de pata de rata a distintas horas para 90 y
180 mgkg de Pm1 (equivalentes a 15 y asymp 30 UCaskg respectivamente) 50 mgkg de
bromelina y 10 mgkg de indometacina
Tiempo
(h)
Control
Pm1
90 mgkg
15plusmn2 UCaskg
Pm1
180 mgkg
31plusmn4 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 027plusmn003 019plusmn002 28bc 012plusmn002 55b 018plusmn002 33bc 024plusmn002 11c
3 064plusmn007 035plusmn004 45ba 019plusmn002 70b 029plusmn003 55b
055plusmn006 14ca
5 114plusmn008 06plusmn02 46b 023plusmn002 80b 028plusmn002 75b 038plusmn003 67b
7 13plusmn01 08plusmn02 37a 020plusmn002 85b 045plusmn004 65d 055plusmn004 58ad
Tabla 36 Efecto de diferentes dosis de Pm1 bromelina e indometacina en edema de pata de rata inducido por
carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey p lt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Puede observarse que ambas dosis de Pm tuvieron efecto antiinflamatorio
significativo alcanzando los maacuteximos porcentajes de inhibicioacuten de edema entre las 3 y las 5
h para la menor dosis y entre las 5 y las 7 h para la mayor dosis Por lo tanto Pm es maacutes
efectivo en la fase tardiacutea propuesta para el modelo de edema inducido por carragenina
Si bien en este ensayo bromelina no alcanzoacute los porcentajes de inhibicioacuten medidos
en los anteriores experimentos (Tablas 34 y 35) puede verse que hasta las 5 h fueron
significativamente similares a los de Pm (180 mgkg) Teniendo en cuenta los valores de la
Tabla 32 se observa que la mayor dosis de Pm (180 mgkg) es equivalente en UCas (asymp 30
UCaskg) a las dosis probadas para bromelina y Bh4 (Tabla 35) mostrando los tres
preparados efectos similares Por otro lado los porcentajes de inhibicioacuten de la dosis de 90
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
60
mgkg de Pm (equivalente a 15 UCaskg) y de 100 mgkg de Bh1 (equivalente a 18
UCaskg) mostrados en la Tabla 34 son similares a excepcioacuten de los medidos a las 5 h
341121 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm
A fin de poner a prueba la hipoacutetesis de que la actividad proteoliacutetica es necesaria para
el efecto antiinflamatorio de Pm del mismo modo que para Bh y bromelina se midioacute el efecto
antiinflamatorio luego de inhibir las cisteiacutenendopeptidasas con E-64 (Tabla 37)
Tiempo
(h)
Control
Pm1
180 mgkg
31plusmn4 UCaskg
Pm1E-64
180 mgkg
04plusmn02 UCaskg
E-64
02 μmolkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 038plusmn003 017plusmn003 55b 028plusmn006 26ba 036plusmn003 5ca
3 060plusmn007 017plusmn002 72b 032plusmn006 47b 056plusmn006 7c
5 104plusmn008 021plusmn003 80b 066plusmn03 36cb 093plusmn007 11c
7 126plusmn01 021plusmn004 83a 09plusmn02 29b 108plusmn007 14cb
Tabla 37 Efecto del tratamiento con E-64 sobre el efecto antiinflamatorio de Pm en modelo de edema de pata
generado por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En la Tabla 37 se puede observar que los porcentajes de inhibicioacuten de Pm fueron
superiores a los de la misma dosis de Pm tratada con E-64 (PmE-64) llegando a ser poco
maacutes del doble a las 1 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina lo cual estariacutea indicando que
las cisteiacutenendopeptidasas contribuyen al efecto antiinflamatorio de Pm No obstante esta
contribucioacuten no parece ser la uacutenica puesto que tanto a las 3 como a las 7 h PmE-64 mostroacute
efecto antiinflamatorio significativo sugiriendo que otros componentes presentes en Pm
estariacutean actuando principalmente sobre la fase tardiacutea
Ante este resultado se hicieron ensayos posteriores a fin de dilucidar el posible
componente con actividad antiinflamatoria de Pm Si bien las UCasmg de PmE-64 fueron
0002 plusmn 0001 y por tanto la dosis de 180 mgkg equivalioacute a 04 UCaskg la primera
posibilidad que se evaluoacute es que en el caso de PmE-64 las proteasas no hubieran sido
completamente inhibidas En ensayos posteriores se evaluoacute la actividad fibrinoliacutetica (mm2)
de Pm1 mediante el ensayo de la placa de fibrina13 por tratarse de un meacutetodo muy sensible
(Jespersen amp Astrup 1983) y pudo determinarse que la dosis de Pm1 conteniacutea 658 (plusmn08)
x103 mm2kg mientras que la dosis de Pm1E-64 conteniacutea 206 (plusmn04) x103 mm2kg un 31
de la actividad fibrinoliacutetica de Pm1 Por lo tanto no puede descartase la posibilidad de que
13
Ver 443 (Capiacutetulo Efecto anticoagulante fibrinogenoliacutetico y fibrinoliacutetico)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
61
las proteasas sean las responsables de la actividad antiinflamatoria de PmE-64 De todos
modos dado que al inhibir las proteasas cisteiacutenicas de Pm (llevando la dosis a 04 UCaskg)
los porcentajes de inhibicioacuten de edema disminuyen aproximadamente un 50 respecto a los
de la dosis de 31 UCaskg de Pm podriacutea atribuirse actividad antiinflamatoria a las proteasas
cisteiacutenicas de Pm Dilucidar el grado de participacioacuten de las mismas en el proceso requeriraacute
ensayos ulteriores
34113 Bromelia balansae
Siguiendo el mismo razonamiento que para Pm las dosis a ensayar de los extractos
parcialmente purificados obtenidos a partir de frutos de B balansae (Bb) fueron definidas de
manera que contuvieran la misma actividad proteoliacutetica que las dosis efectivas de bromelina
y Bh (entre 10 y 35 UCaskg) En un primer ensayo se proboacute una dosis intermedia 120
mgkg de Bb1 equivalente a aproximadamente 20 UCaskg (Tabla 38)
Tiempo
(h)
Control
Bb1
120 mgkg
19plusmn1 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 027plusmn003 022plusmn004 19c 018plusmn002 33c 024plusmn002 11c
3 064plusmn007 03plusmn01 53b 029plusmn003 55b 055plusmn006 14cb
5 114plusmn008 05plusmn02 56b 028plusmn002 75b 038plusmn003 67b
7 13plusmn01 06plusmn02 51b 045plusmn004 65b 055plusmn004 58b
Tabla 38 Efecto de Bb bromelina e indometacina sobre el edema de pata generado por carragenina Los
voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6 excepto n=5 para el lote Bb1 a las 5 y 7 h) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En este caso entre las 3 y las 5 h una rata del lote tratado con Bb murioacute por lo que a
las 5 y 7 h el valor de n fue igual a 5 Como puede verse en la Tabla 38 Bb mostroacute
porcentajes de inhibicioacuten significativos a las 3 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina los
cuales no se diferenciaron estadiacutesticamente de los de bromelina asiacute como tampoco de los
de indometacina a las 5 y 7 h A la h post inyeccioacuten de carragenina ninguno de los
compuestos ensayados mostroacute porcentajes de inhibicioacuten significativos
341131 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb
En otro experimento (Tabla 39) se probaron dos dosis de Bb2 100 y 200 mgkg
equivalentes aproximadamente a 15 y 30 UCaskg respectivamente asiacute como 200 mgkg
de Bb2 tratado con E-64 (Bb2E-64)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
62
La dosis de 200 mgkg de Bb2 fue antiinflamatoria soacutelo a las 7 h post inyeccioacuten de
carragenina mostrando un porcentaje de inhibicioacuten significativamente similar al de
diclofenac soacutedico (50 mgkg) La misma dosis de Bb tratada con E-64 (Bb2E-64) no mostroacute
efecto antiinflamatorio aunque no se detectaron diferencias significativas entre los
porcentajes de inhibicioacuten de Bb2 y Bb2E-64 Las dosis de 100 mgkg de Bb2 y E-64 (025
μmolkg) no mostraron efecto significativo en ninguacuten tiempo de medida
Tabla 39 Efecto de diferentes dosis de Bb y BbE-64 sobre el edema de pata generado por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n = 6 excepto n=5 para el lote Bb2E-64 a partir de las 5 h) Test de Tukey plt 005 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Al comparar los resultados de la Tabla 39 con los de la Tabla 38 puede observarse
que si bien el efecto antiinflamatorio se sigue manifestando en la fase tardiacutea propuesta para
este modelo la dosis de 200 mgkg (33 plusmn 6 UCaskg) de Bb2 fue menos efectiva que la de
120 mgkg (19 plusmn 1 UCaskg) de Bb1 lo cual no seriacutea lo esperado si tenemos en cuenta la
actividad proteoliacutetica de ambas Sin embargo el tratamiento con el inhibidor E-64 produjo
una peacuterdida del efecto antiinflamatorio de Bb2 concordante con la hipoacutetesis de que la
actividad de las proteasas presentes en Bb es la causante de tal efecto Una caracteriacutestica
comuacuten de los valores de las Tablas 38 y 39 es la alta dispersioacuten de los voluacutemenes medidos
para los lotes tratados con Bb hecho que no se observa en los valores de los lotes
controles asiacute como tampoco en lotes tratados con diclofenac soacutedico e indometacina
Por otro lado es necesario mencionar que otros ensayos con Bb presentaron cierta
dificultad en relacioacuten a una posible toxicidad En un ensayo el 50 de los animales que
recibieron una dosis de Bb (Bb3 Tabla 32) equivalente a 35 UCaskg murieron entre las 3 y
las 6 h post inyeccioacuten de carragenina En otro ensayo en que se probaron dosis
equivalentes a 10 20 y 30 UCaskg varios animales de los tres lotes tratados mostraron
signos tiacutepicos de toxicidad (pasividad motora alteracioacuten respiratoria ereccioacuten pilomotora y
extremidades cianoacuteticas) a partir de la primera hora post inyeccioacuten de carragenina y entre
las 4 y 5 h murieron Por lo expuesto no deberiacutea descartarse la posibilidad de que Bb
Tiempo
(h)
Control
Bb2
100 mgkg
16plusmn3 UCaskg
Bb2
200 mgkg
33plusmn6 UCaskg
Bb2E-64
200 mgkg
05plusmn01 UCaskg
E-64
025 μmolkg
Diclofenac soacutedico
50 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 033plusmn003 028plusmn004 15c 033plusmn008 0c 043plusmn005 -30c 031plusmn007 6c 024plusmn003 27c
3 07plusmn01 09plusmn02 -19c 05plusmn01 32c 09plusmn01 -32c 06plusmn02 14c 035plusmn005 52c
5 14plusmn01 11plusmn03 24bc 08plusmn03 48bc 11plusmn02 23bc 09plusmn02 34bc 044plusmn007 69b
7 15plusmn01 11plusmn02 30bc 08plusmn02 48b 099plusmn007 35bc 10plusmn02 33bc 073plusmn008 52b
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
63
presente cierta toxicidad a las dosis ensayadas hecho que deberaacute comprobarse mediante
futuros ensayos de toxicidad
Sin dejar de lado las dificultades sentildealadas de los resultados obtenidos se puede
concluir que Bb muestra efecto antiinflamatorio significativo soacutelo sobre la fase tardiacutea del
modelo de edema de pata (Di Rosa et al 1971 Salvemini et al 1996) mostrando menores
porcentajes de inhibicioacuten que dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica de Bh Pm y
bromelina Ademaacutes el efecto antiinflamatorio de Bb podriacutea estar relacionado con la actividad
proteoliacutetica de sus cisteiacutenendopeptidasas
3412 Otros modelos de inflamacioacuten aguda
Como ya se ha mencionado la primera fase (0-1 h) del desarrollo de edema de pata
inducido por carragenina es mediada principalmente por histamina y serotonina (Di Rosa et
al 1971 Salvemini et al 1996) Para corroborar si el efecto inhibitorio de edema observado
en la primera h para Bh Pm y bromelina se debiacutea a un efecto inhibitorio sobre alguno de
estos mediadores se evaluaron las dosis efectivas de dichos preparados a esa h en los
modelos de edema de pata inducidos por histamina y por serotonina
34121 Edema de pata inducido por histamina en ratas
En la Tabla 310 se consignan los voluacutemenes de edema y los respectivos porcentajes
de inhibicioacuten de edema a los 15 30 y 60 min post inyeccioacuten de histamina Se evaluaron
dosis de Bh Pm y bromelina cuyos contenidos en UCas fueran equivalentes a las de las
dosis que en el modelo de edema inducido por carragenina fueron efectivas en la primera
hora esto es 200 mgkg de Bh2 (equivalente a 35 plusmn 8 UCaskg) 170 mgkg de Pm2
(equivalente a 32 plusmn 2 UCaskg) y 55 mgkg de bromelina (equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg)
Tiempo
(min)
Control
Bh2
200 mgkg
35plusmn8 UCaskg
Pm2
170 mgkg
32plusmn2 UCaskg
Bromelina
55 mgkg
35plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
15 039plusmn003 046plusmn003 -18c 038plusmn003 25c 045plusmn002 -15c
30 034plusmn003 041plusmn003 -21c 034plusmn003 0c 044plusmn003 -30c
60 032plusmn003 033plusmn004 -3c 031plusmn003 3c 042plusmn004 -31c
Tabla 310 Efecto de Bh Pm y bromelina sobre el edema inducido histamina Los voluacutemenes de edema son
expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
64
Puede observarse que ninguno de los compuestos probados fue efectivo a las dosis
probadas Por tanto es liacutecito suponer que los efectos antiinflamatorios medidos para Bh Pm
y bromelina en la primera hora post inyeccioacuten de carragenina no se deben a la inhibicioacuten de
la accioacuten de la histamina
La bibliografiacutea en relacioacuten al efecto de la bromelina sobre la inflamacioacuten mediada por
histamina es escasa Seguacuten Kumakura et al (1988) dosis crecientes de bromelina
administradas intravenosamente aumentaban el exudado plasmaacutetico inducido por histamina
a los 30 min en el modelo de ldquobolsa de airerdquo en ratas
34122 Edema de pata inducido por serotonina en ratas
341221 Bromelia hieronymi
En la Tabla 311 se exponen los voluacutemenes de edema y los porcentajes de inhibicioacuten
de edema a los 30 60 y 120 min post inyeccioacuten de serotonina para 100 y 200 mgkg de Bh2
(equivalentes a 17 plusmn 4 y 35 plusmn 8 UCaskg respectivamente) y para 55 mgkg de bromelina
(equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg)
Tiempo
(min)
Control
Bh2
100 mgkg
17plusmn4 UCaskg
Bh2
200 mgkg
35plusmn8 UCaskg
Bromelina
55 mgKg
35plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
30 122plusmn005 118plusmn005 33c 08plusmn01 37a 060plusmn009 51a
60 109plusmn004 116plusmn005 -6c 08plusmn01 28a
063plusmn008 42a
120 083plusmn004 070plusmn003 16ac 066plusmn007 20ac 057plusmn007 31a
Tabla 311 Efecto de Bh2 y bromelina sobre el edema inducido por serotonina Los voluacutemenes de edema son
expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
El efecto medido para bromelina es concordante con el reportado por Netti et al
(1972) quienes midieron un porcentaje de inhibicioacuten de asymp 40 a los 60 min post inyeccioacuten
de serotonina en ratas que recibieron por viacutea oral bromelina (100 mganimal) 4 h previas a la
inyeccioacuten de serotonina
Bh exhibioacute porcentajes de inhibicioacuten significativos a los 30 y 60 min soacutelo con la dosis
de 200 mgkg Si bien dichos valores fueron inferiores a los de la bromelina no fueron
significativamente diferentes Estos resultados estariacutean indicando que la inhibicioacuten que
ejercen Bh y bromelina sobre el edema inducido por carragenina estariacutea al menos en parte
mediada por un efecto inhibidor de la accioacuten de la serotonina
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
65
341222 Pseudananas macrodontes
En la Tabla 312 se muestra el efecto de una dosis de Pm2 (170 mgkg) equivalente
a 32 plusmn 2 UCaskg sobre el edema de pata inducido por serotonina Pm mostroacute un porcentaje
de inhibicioacuten significativo soacutelo a los 30 min Por lo tanto asiacute como en el caso de Bh y
bromelina parte del efecto antiinflamatorio evaluado a la hora post inyeccioacuten de carragenina
se podriacutea deber a un efecto inhibitorio sobre la accioacuten de la serotonina
Tiempo
(min)
Control
Pm2
170 mgkg
32plusmn2 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
30 105plusmn007 08plusmn01 29a 052plusmn003 50a
60 087plusmn007 07plusmn01 22ca 050plusmn004 42a
120 067plusmn006 06plusmn01 20c 046plusmn004 31c
Tabla 312 Efecto de Pm2 sobre el edema inducido por serotonina Los voluacutemenes de edema son expresados
como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
342 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma
Como primera aproximacioacuten en el modelo de inflamacioacuten croacutenica se probaron las
dosis de los preparados que mostraron efecto antiinflamatorio sobre el edema de pata
inducido por carragenina
Como control positivo se utilizoacute dexametasona la cual posee entre otros efectos
adversos tiacutepicos de los glucocorticoides efectos inmunosupresor y cataboacutelico Con el
objetivo de comparar dichos efectos con los de los preparados proteoliacuteticos se calcularon
como una medida del efecto inmunosupresor los porcentajes de reduccioacuten de las masas del
timo y del bazo (Ben Rhouma amp Sakly 1994 Hori et al 1996) mientras que el efecto
cataboacutelico fue medido calculando la peacuterdida de masa corporal (se pesaron los animales
antes y despueacutes del tratamiento y la diferencia de peso corporal fue comparada con los
controles)
3421 Bromelia hieronymi
En la Tabla 313 se exponen los resultados obtenidos para 90 y 180 mgkg de Bh3
(equivalentes a 17 plusmn 3 y 34 plusmn 5 UCaskg respectivamente) 55 mgkg de bromelina
(equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg) y dexametasona (3 mgkg) en el test del granuloma inducido
por pellet de algodoacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
66
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 054plusmn006 043plusmn002 078plusmn009
Bh3
(90 mgkg- 17plusmn3 UCaskg)
047plusmn002 13c 035plusmn002 18bc 09plusmn01 -9c
Bh3
(180 mgkg- 34plusmn5 UCaskg)
032plusmn001 41b 031plusmn002 28b 07plusmn01 7c
Bromelina
(55 mgkg- 35plusmn3 UCaskg )
036plusmn005 34b 031plusmn002 28b 077plusmn008 1c
Dexametasona (3 mgkg) 024plusmn001 55a 011plusmn002 74a 040plusmn004 49b
Tabla 313 Efecto de Bh3 bromelina y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de
algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
La dosis de 180 mgkg de Bh bromelina (55 mgkg) y dexametasona (3 mgkg)
resultaron antiinflamatorias Bh (180 mgkg) y bromelina mostraron porcentajes de inhibicioacuten
de granuloma significativamente similares pero ambos fueron significativamente inferiores al
de dexametasona En relacioacuten al efecto inmunosupresor mientras dexametasona causoacute
significativa reduccioacuten del peso de bazos y timos Bh (180 mgkg) y bromelina soacutelo redujeron
el peso de los timos mostrando porcentajes iguales (28) aunque significativamente
inferiores al de dexametasona (74) Por otra parte la dosis de 90 mgkg de Bh no fue
antiinflamatoria pero tampoco redujo los pesos de los bazos y los timos
En la Figura 31 se muestran los cambios de peso corporal
Figura 31 Efecto de Bh3 bromelina (Bro) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas
tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
-20
-10
0
10
20
30
b
b
a
cControl
Bh3 (173 UCaskg)
Bh3 (345 UCaskg)
Bro (353 UCaskg)
Dex (3 mgkg)
c
Ca
mb
io d
e p
es
o c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
67
Bh (180 mgkg) y bromelina no provocaron peacuterdida de masa corporal aun cuando la
ganancia en masa corporal (14 y 13 g respectivamente) fuera significativamente maacutes baja
que la del lote control (22 g) En cambio dexametasona provocoacute una significativa peacuterdida de
masa corporal (-14 g) respecto al control El lote tratado con la dosis de 90 mgkg de Bh no
mostroacute cambios respecto al lote control
Por lo tanto si bien Bh (180 mgkg) y bromelina (55 mgkg) fueron menos efectivas
que dexametasona (3 mgkg) para inhibir la formacioacuten del granuloma tambieacuten mostraron
menos efectos sobre bazos timos y masa corporal
Debido a la similitud en el contenido de UCas (asymp35 UCaskg) de las dosis de Bh (180
mgkg) y de bromelina (55 mgkg) que mostraron similares efectos en el test del granuloma
se proboacute si dichos efectos dependiacutean de la accioacuten de proteasas cisteiacutenicas
34211 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina en el test del
granuloma
A fin de determinar si la actividad proteoliacutetica de Bh y bromelina es causa de la
accioacuten antiinflamatoria evaluada en el test del granuloma se ensayaron Bh y bromelina con
y sin actividad proteoliacutetica (luego de inhibir con E-64) Los resultados se muestran en la
Tabla 314
Tabla 314 Efecto de Bh5 y bromelina con actividad proteoliacutetica y sin actividad proteoliacutetica (Bh5E-64 y bromelinaE-64) E-64 y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En el caso de bromelina puede observarse que al inhibir sus cisteiacutenendopeptidasas
con E-64 pierde su efecto antiinflamatorio el porcentaje de inhibicioacuten cambia de 24 a -8
dejando de ser significativo Lo mismo sucede con el efecto reductor sobre el peso de los
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Control 036 plusmn 002 043 plusmn 003 053 plusmn 008
Bromelina
(55 mgkg- 35plusmn3 UCaskg )
0272 plusmn 0006 24a 033 plusmn 002 23a 08 plusmn 02 -42c
BromelinaE-64
(55 mgkg- 2plusmn3 UCaskg)
039 plusmn 004 -8c 046 plusmn 003 -7c
065 plusmn 009 -23c
Bh5
(180 mgkg- 36plusmn4 UCaskg)
039 plusmn 001 -8c 042 plusmn 001 2c
082 plusmn 02 -55c
Bh5E-64
(180 mgkg- 1plusmn2 UCaskg)
040 plusmn 003 -11c 040 plusmn 002 7ca
06 plusmn 01 -19c
E-64
(03 μmolkg)
039 plusmn 004 -8c 0421 plusmn 0009 2c
06 plusmn 01 -15c
Dexametasona (3 mgkg) 0230 plusmn 0006 36a 0042 plusmn 0003 90b 033 plusmn 008 38c
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
68
timos el porcentaje de reduccioacuten para bromelina es de 23 mientras que para
bromelinaE-64 es de -7 Por tanto las cisteiacutenendopeptidasas no soacutelo estariacutean actuando
como antiinflamatorias sino tambieacuten ejerciendo un leve efecto reductor sobre el peso de los
timos En este ensayo el porcentaje de reduccioacuten del peso de los timos provocado por
bromelina fue aproximadamente 14 del de dexametasona mientras que los porcentajes de
inhibicioacuten del granuloma de ambas fueron significativamente similares E-64 (03 μmolkg) no
tuvo efecto sobre los granulomas asiacute como tampoco sobre los pesos de los timos y los
bazos
Los resultados obtenidos para Bh no permiten sacar ninguna conclusioacuten respecto al
rol que tendriacutean sus cisteiacutenendopeptidasas como antiinflamatorias puesto que a diferencia
de los datos consignados en la Tabla 313 Bh no tuvo efecto inhibidor significativo de los
granulomas asiacute como tampoco efecto reductor de los timos ademaacutes de no encontrarse
diferencia significativa entre Bh y BhE-64 Los efectos de Bh y BhE-64 fueron ensayados
una vez maacutes pero no pudieron extraerse resultados concluyentes Una posible explicacioacuten a
la dificultad en la reproducibilidad de los resultados para Bh probablemente obedezca a la
poca sensibilidad que el test de granuloma inducido por algodoacuten tiene especialmente para
antiinflamatorios no esteroideos (Bailey et al 1982)
En relacioacuten al efecto sobre el peso corporal no se observaron diferencias
significativas respecto al control para bromelina y para bromelina inhibida con E-64 El E-64
produjo una ganancia de masa corporal significativamente mayor que la de los controles
Pero ninguno de los compuestos probados a excepcioacuten de dexametasona produjeron
peacuterdida de masa corporal (Figura 32)
Figura 32 Efecto de Bh5 bromelina (Bro) y Bh5 y bromelina inhibidas con E-64 (Bh5E-64 y BroE-64
respectivamente) E-64 y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas tratadas durante el ensayo del test del granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
-20
-10
0
10
20
30
Control
Dex (3 mgkg)
Bh5 (364 UCaskg)Bh5E-64(12 UCaskg)
Bro (353 UCaskg)
BroE-64(23 UCaskg)
E-64 (03 molkg)c
cd
a
b b
d
c
Cam
bio
de p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
69
3422 Pseudananas macrodontes y Bromelia balansae
En un mismo ensayo se probaron dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica (asymp30
UCaskg) de Pm y Bb cuyos efectos fueron comparados con los de bromelina (50 mgkg
equivalente a asymp30 UCaskg) y dexametasona (3 mgkg) Como en todos los ensayos los
lotes estuvieron conformados por 6 animales excepto en el caso de Pm donde los datos
provienen de 4 animales ya que dos de ellos murieron luego de la tercera y cuarta dosis
Puede observarse en la Tabla 315 que Pm y Bb mostraron porcentajes de inhibicioacuten del
granuloma similares a los de bromelina Los porcentajes de reduccioacuten del timo para Pm y Bb
fueron significativamente similares entre siacute y si bien mayores no se diferenciaron
significativamente de los de bromelina
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 054plusmn003 038plusmn003 071plusmn007
Pm3
(130 mgkg- 33plusmn4 UCaskg)
036plusmn002 33ab 020plusmn001 47b 08plusmn01 -8c
Bb 4
(180 mgkg- 31plusmn2 UCaskg)
041plusmn004 24a 021plusmn001 45b 052plusmn007 27cb
Bromelina
(50 mgkg- 32plusmn3 UCaskg)
036plusmn002 33ab 028plusmn002 26b 070plusmn007 1c
Dexametasona (3 mgkg) 024plusmn001 56b 010plusmn002 74a 036plusmn004 49b
Tabla 315 Efecto de Pm3 Bb4 bromelina y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y
sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n = 6 excepto para Pm n=4) Test de Tukey p lt 005 p lt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Los porcentajes de reduccioacuten de los timos de los preparados proteoliacuteticos fueron
significativamente menores al de dexametasona y a diferencia de eacutesta no mostraron efecto
reductor significativo sobre el peso de los bazos
En la Figura 33 pueden observarse los cambios en los pesos corporales de los
animales tratados Si bien los animales de los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos
no aumentaron de peso en la misma cantidad que los del lote control no padecieron peacuterdida
de masa corporal como siacute ocurrioacute con los del lote tratado con dexametasona
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
70
Figura 33 Efecto de Pm Bb bromelina (Bro) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas
tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6 excepto para Pm n=4) Test de Tukey p lt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Los efectos de Pm y Bb sobre los distintos paraacutemetros evaluados en este modelo
fueron similares a los de Bh3 (Tabla 313) Sin embargo la muerte de dos animales del lote
tratado con Pm podriacutea estar indicando un efecto toacutexico del preparado
34221 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb en el test del granuloma
En la Tabla 316 se exponen los resultados obtenidos para 180 mgkg de Bb2
equivalente a 30 UCaskg y para 180 mgkg de Bb2 tratada con E-64 (Bb2E-64) Puede
observarse que Bb no mostroacute efecto inhibidor significativo sobre los granulomas y su
porcentaje de inhibicioacuten no se diferencioacute significativamente del de BbE-64 Tampoco se
observaron efectos significativos de Bb y BbE-64 sobre el peso de los timos
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 050plusmn003 036plusmn002 068plusmn003
Bb 2 (180 mgkg
30plusmn5 UCaskg)
052plusmn008 -4c 036plusmn003 0c 098plusmn005 -44a
Bb2E-64 (180 mgkg
006plusmn001 UCaskg)
039plusmn005 22c 028plusmn003 22c 095plusmn008 -40a
Dexametasona (3 mgkg) 0230plusmn0005 54a 0050plusmn0004 86a 034plusmn001 50b
Tabla 316 Efecto de Bb2 con actividad proteoliacutetica y sin actividad proteoliacutetica (Bb2E-64) y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey p lt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
-20
-10
0
10
20
30
ab
b
a
d
Control
Pm3 (334 UCaskg)
Bb4 (312 UCaskg)
Bro (323 UCaskg)Dex (3 mgkg)
c
Ca
mb
io d
e p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
71
A diferencia de lo observado para los preparados en los anteriores ensayos del test
del granuloma los bazos aumentaron significativamente de peso Este efecto fue
independiente de la actividad proteoliacutetica de Bb
En la Figura 34 se muestran los efectos de Bb y BbE-64 sobre los pesos corporales
de los animales Si bien los animales del lote tratado con Bb proteoliacuteticamente activo no
aumentaron de peso en la misma cantidad que los del lote control no mostraron peacuterdida de
masa corporal como siacute ocurrioacute con los del lote tratado con dexametasona
Siendo que la dosis de Bb2 tiene el mismo contenido de UCas (30) que la dosis de
Bb4 que siacute mostroacute efecto antiinflamatorio (Tabla 315) pudo existir alguacuten otro factor que no
se ha controlado y afectoacute a las medidas conduciendo a los resultados contradictorios de las
Tablas 315 y 316 Como se mencionoacute anteriormente la falta de reproducibilidad podriacutea
deberse a la baja sensibilidad del test del granuloma para compuestos no esteroideos
(Bailey et al 1982) Por otro lado Bb2 es el mismo preparado que mostroacute bajo porcentaje
de inhibicioacuten en el modelo de edema de pata inducido por carragenina (Tabla 39) El
aumento en el tamantildeo de los bazos podriacutea estar relacionado con el posible efecto toacutexico que
ha sido detectado en algunos de los ensayos en que se proboacute Bb y que podriacutea enmascarar
su accioacuten antiinflamatoria
Figura 34 Efecto de Bb y Bb inhibida con E-64 (BbE-64) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de
las ratas tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
34222 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm en el test del granuloma
Debido a que la dosis de 30 UCaskg de Pm pareciacutea mostrar cierta toxicidad
(ademaacutes del ensayo cuyos resultados se exponen en Tabla 315 en otro ensayo tambieacuten
murioacute 13 de los animales) se decidioacute bajar la dosis a 13 (equivalente a 10 UCaskg) Al
igual que para Bh y bromelina se ensayoacute el efecto que tiene la inhibicioacuten de las
cisteiacutenendopeptidasas presentes en Pm sobre su efecto antiinflamatorio en el test del
granuloma En la Tabla 317 se muestran los resultados obtenidos para 90 mgkg de Pm4
90 mgkg de Pm4 inhibido con E-64 (Pm4E-64) y dexametasona (3 mgkg)
-20
-10
0
10
20Control
Dex (3 mgKg)
Bb2 (305 UCaskg)
Bb2E-64 (006001 UCaskg)
a
bcb
c
Ca
mb
io d
e p
eso
co
rpo
ral (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
72
Tabla 317 Efecto de Pm4 con y sin actividad proteoliacutetica (Pm4E-64) y dexametasona sobre el granuloma
inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Las dosis ensayadas de Pm en esta oportunidad no provocaron la muerte de los
animales tratados Si bien los porcentajes de inhibicioacuten de granuloma de Pm y de PmE-64
no se diferenciaron significativamente entre siacute el porcentaje de Pm fue estadiacutesticamente
significativo pero no asiacute el de PmE-64 lo cual estariacutea indicando que las
cisteiacutenendopeptidasas de Pm tendriacutean un rol antiinflamatorio en este modelo PmE-64 no
mostroacute actividad fibrinoliacutetica en el ensayo de la placa de fibrina6
De igual modo que para bromelina al inhibir las proteasas de Pm con E-64 no soacutelo
se pierde el efecto antiinflamatorio sino tambieacuten el efecto reductor sobre el peso de los
timos Si bien los porcentajes de reduccioacuten del peso de los timos de Pm y de PmE-64 no se
diferencian significativamente el porcentaje de reduccioacuten respecto al control de Pm es
significativo mientras que el de PmE-64 no
Por otro lado Pm y PmE-64 no redujeron significativamente los pesos de los bazos
al igual que todos los preparados proteoliacuteticos ensayados previamente
En la Figura 35 se observa que Pm y PmE-64 no afectaron significativamente la
ganancia de masa corporal de los animales tratados respecto a los del lote control
Figura 35 Efecto de Pm4 Pm4 inhibida con E-64 (PmE-64) y dexametasona (Dex) sobre los pesos
corporales de las ratas tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Control 050plusmn003 0 36plusmn002 068plusmn003
Pm4 (90 mgkg
11plusmn1 UCaskg)
037plusmn002 26a 026plusmn002 28b 08plusmn01 -23c
Pm4E-64 (90 mgkg
02plusmn01 UCaskg)
0417plusmn0009 17ac 031plusmn003 14cb 062plusmn007 9c
Dexametasona (3 mgkg) 0230plusmn0005 54b 005plusmn0004 86a 034plusmn001 50b
-20
-10
0
10
20
30Control
Dex (3 mgKg)
Pm4 (111 UCaskg)
Pm4E-64 (0201 UCaskg)
a
cc
c
Cam
bio
de p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
73
Pm4 mostroacute efectos similares a los de bromelina con una dosis que contuvo 3 veces
menos UCas que la dosis de bromelina usada como referencia (50-55 mgkg equivalente a
30-35 UCaskg) Para verificar si bromelina alcanza su efecto maacuteximo con una dosis de 10
UCaskg se evaluoacute la accioacuten antiinflamatoria de dosis equivalentes a 11 plusmn 1 31 plusmn 3 y 94 plusmn 9
UCaskg Simultaacuteneamente se midieron los porcentajes de reduccioacuten de los pesos de los
timos y los bazos y se registroacute la ganancia de peso corporal Los resultados se muestran en
la Figura 36 excepto los porcentajes de reduccioacuten de los pesos de los bazos y los cambios
de peso corporal ya que no fueron estadiacutesticamente significativos para ninguna de las
dosis
Figura 36 Porcentajes de inhibicioacuten de granuloma y porcentajes de reduccioacuten de timos para 17 50 y 150 mgkg
de bromelina equivalentes a 11 31 y 94 UCaskg mp masa del granuloma o timo del animal tratado con el preparado mc masa del granuloma o timo del animal del lote control Test de Dunnettt p lt 005 p lt 001 p lt 0001 Media plusmn SEM
Como puede observarse en la figura 36 la dosis de bromelina equivalente a 11 plusmn 1
UCaskg mostroacute un porcentaje de inhibicioacuten de 15 que no resultoacute ser estadiacutesticamente
significativo mientras que la dosis equivalente a 31 plusmn 3 UCaskg mostroacute un porcentaje de
inhibicioacuten similar a los de ensayos anteriores (25-30) Queda de este modo comprobado
que las dosis equivalentes en UCas de Pm4 y bromelina no muestran efectos
antiinflamatorios equivalentes
La UCas es una medida de la actividad hidroliacutetica de la proteasa frente a la caseiacutena
un sustrato con muacuteltiples puntos de corte Igual cantidad de UCas significa igual intensidad
de eficacia proteoliacutetica pero nada indica acerca de la especificidad de la enzima activa
Probablemente la dosis de Pm con igual UCas que la de bromelina tiene maacutes especificidad
hacia los blancos involucrados en el mecanismo de inflamacioacuten que subyacen en el modelo
del granuloma
10 30 900
20
40
60
Granuloma Timo
)x100mm(1 cp
UCaskg
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
74
3423 Posible relacioacuten entre la actividad proteoliacutetica-accioacuten antiinflamatoria-
modulacioacuten sobre poblacioacuten linfocitaria T
En la Figura 36 tambieacuten se puede observar que el aumento en el porcentaje de
inhibicioacuten del granuloma se acompantildea de un aumento en el porcentaje de reduccioacuten del
peso de los timos
Para todos los preparados en que se detectoacute efecto antiinflamatorio significativo
tambieacuten se acompantildeoacute de un efecto significativo sobre el peso de los timos y para Pm y
bromelina ambos dependieron de la actividad proteoliacutetica A modo de resumen en la Figura
37 se muestran graficados los pesos de granulomas en funcioacuten de los pesos de los timos
de los animales tratados con los preparados asiacute como con dexametasona (3 mgkg) a lo
largo del presente trabajo
Figura 37 Relacioacuten peso del granuloma - peso del timo para todos los preparados ensayados Los valores fueron calculados dividiendo el peso promedio del granuloma o timo del lote tratado por el peso promedio del granuloma o timo respectivamente del lote control y expresados como la media plusmn SEM Unidades arbitrarias (ua) Las liacuteneas de puntos representan el liacutemite por debajo del cual los valores se diferencian estadiacutesticamente de los controles (ANOVA Tukey plt005)
Puede observarse maacutes claramente que soacutelo los preparados que redujeron
significativamente el peso de los granulomas (valores por debajo de la liacutenea de puntos
horizontal) disminuyeron significativamente el peso de los timos (valores a la izquierda de la
liacutenea de puntos vertical)
Bromelia balansae (Bb)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bb2E-64(006001 UCaskg)
Bb2(305 UCaskg)
Bb4(312 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Pseudananas macrodontes (Pm)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Pm4(111 UCaskg)
Pm4E-64(0201 UCaskg)
Pm3(334 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Bromelina (Bro)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bro(333 UCaskg)
BroE-64(23 UCaskg)
Bro(101 UCaskg)
Bro(949 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Bromelia hieronymi (Bh)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bh5(364 UCaskg)
Bh5E-64(105 UCaskg)
Bh3(173 UCaskg)
Bh3(345 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
75
A partir de dichas observaciones se podriacutea considerar que parte del mecanismo de
accioacuten antiinflamatorio involucrariacutea la accioacuten moduladora sobre la poblacioacuten de linfocitos T
siendo dependiente de la actividad proteoliacutetica para Pm y bromelina
Ademaacutes de los efectos directos de bromelina sobre los linfocitos T ya mencionados
tales como la inhibicioacuten en la transduccioacuten de sentildeales (Mynott et al 1999) y la regulacioacuten en
la activacioacuten mediado por la remocioacuten de moleacuteculas de la superficie celular (Hale et al
2002) en varios modelos animales la accioacuten reguladora sobre la poblacioacuten linfocitaria T ha
sido asociado al efecto antiinflamatorio de la bromelina En un modelo murino de asma
aleacutergica inducida por ovoalbuacutemina la bromelina administrada intraperitonealmente pudo
atenuar el desarrollo de la enfermedad disminuyendo significativamente las ceacutelulas T CD4+
activadas en particular CD4+CD25+ las ceacutelulas T CD8+ y la relacioacuten CD4+CD8+ en el BAL
(Secor et al 2005) Luego se demostroacute in vitro que bromelina cliva proteoliacuteticamente CD25
desde la superficie de los linfocitos T activos (Secor et al 2009) Por su parte Targoni et al
(1999) reportan que una mezcla de enzimas que contiene bromelina inhibe la
encefalomielitis aleacutergica experimental murina un modelo de enfermedad autoinmune
mediada por ceacutelulas T Este efecto se atribuyoacute a la escisioacuten proteoliacutetica de las moleacuteculas
accesorias CD4 CD44 y CD80 que median las interacciones de ceacutelulas T y ceacutelulas
presentadoras de antiacutegenos En una serie de ensayos in vitro e in vivo Engwerda et al
(2001) concluyen que la bromelina puede simultaacuteneamente mejorar e inhibir las respuestas
mediadas por linfocitos T a traveacutes de una accioacuten estimulante sobre las ceacutelulas accesorias y
una accioacuten inhibidora directa sobre las ceacutelulas T
Es sabido que en el timo los progenitores linfoides tiacutemicos maduran y se diferencian
en linfocitos T inmunocompetentes a traveacutes de un proceso complejo mediado por
quimocinas interleucinas moleacuteculas de adhesioacuten factores de crecimiento y
fundamentalmente por la interaccioacuten entre las ceacutelulas del estroma intratiacutemico (ceacutelulas
epiteliales ceacutelulas dendriacuteticas interdigitadas y macroacutefagos) y los linfocitos (Fainboim amp
Geffner 2008) Durante su paso por el timo el precursor pasa por distintos estadiacuteos de
diferenciacioacuten que se reflejan por la expresioacuten de distintas moleacuteculas de superficie entre
ellas CD25 y CD44 las cuales han mostrado ser sensibles a la accioacuten de la bromelina como
ya se ha mencionado Por otro lado los timocitos proliferan activamente durante la
diferenciacioacuten sin embargo mediante el proceso de seleccioacuten tiacutemica soacutelo aproximadamente
un 2 de los timocitos originados en el timo murino son rescatados de la apoptosis y
pueden emigrar a la periferia como linfocitos T maduros (Kanwar et al 2008)
Teniendo en cuenta 1) que la bromelina es capaz de afectar la poblacioacuten linfocitaria
T y que esto seriacutea mediado por su accioacuten proteoliacutetica sobre las moleacuteculas de superficie
celular 2) que se ha postulado para la bromelina la capacidad de modular la relacioacuten entre
ceacutelulas accesorias y linfocitos T 3) que el proceso de maduracioacuten de los timocitos es
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
76
mediado por diferentes moleacuteculas de superficie celular en su interaccioacuten con el estroma
tiacutemico 4) que una intensa proliferacioacuten linfocitaria acompantildea el proceso de diferenciacioacuten y
5) la asociacioacuten entre el efecto antiinflamatorio y efecto reductor del peso del timo medidos
para los preparados en especial la posible dependencia entre dichos efectos y la actividad
proteoliacutetica de Pm y bromelina se podriacutea interpretar que los preparados alterariacutean los
complejos mecanismos de interaccioacuten celular entre las ceacutelulas del estroma tiacutemico y los
timocitos afectando la proliferacioacuten de los linfocitos T y dando lugar a una poblacioacuten
linfocitaria T perifeacuterica deficiente cuali yo cuantitativamente para intervenir en la respuesta
inflamatoria
Sin embargo esta hipoacutetesis es deacutebil dada las escasas evidencias sobre las que se
sustenta Por empezar un cambio en el peso del timo no indica cuaacuteles son los tejidos
afectados por lo que una evaluacioacuten histoloacutegica permitiriacutea determinar si la disminucioacuten del
peso se debe a la reduccioacuten en la poblacioacuten de ceacutelulas linfoideas ademaacutes de identificar
alteraciones en la arquitectura del oacutergano Por otro lado no es claro el rol que tendriacutean los
linfocitos T en la inflamacioacuten que se desarrolla en el modelo del granuloma inducido por el
pellet de algodoacuten Si bien el desarrollo de la inflamacioacuten granulomatosa es en general un
proceso en el que los linfocitos T tendriacutean un rol predominante los granulomas generados
por cuerpo extrantildeo como es el caso del pellet de algodoacuten estaacuten compuestos casi
exclusivamente por macroacutefagos al menos durante las fases de iniciacioacuten y acumulacioacuten (Co
et al 2004) siendo muy escasas las ceacutelulas linfociacuteticas (Ohtani 2013)
Dado el perfil de actividad de muacuteltiples blancos que caracteriza a la bromelina (Muumlller
et al 2012 Chobotova et al 2010) y probablemente a los preparados proteoliacuteticos
ensayados en el presente trabajo es muy posible que los efectos antiinflamatorio y sobre el
peso de los timos sean independientes entre siacute aunque ambos dependientes de la actividad
proteoliacutetica tanto en el caso de Pm como de bromelina
Dado que los mecanismos de accioacuten que subyacen a los efectos medidos no han
sido objeto de estudio del presente trabajo doctoral futuras investigaciones permitiriacutean
profundizar el conocimiento del rol que cumplen las proteasas de bromelina y especialmente
de Pm que hasta entonces no habiacutean sido estudiadas farmacoloacutegicamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
77
35 Conclusiones
Bh Bb Pm y bromelina mostraron efecto antiinflamatorio frente a la inflamacioacuten
aguda (edema de pata de rata inducido por carragenina)
Dosis de Bh Pm y bromelina equivalentes en actividad proteoliacutetica mostraron
porcentajes de inhibicioacuten de edema similares entre siacute y con el de indometacina (10
mgkg) actuando predominantemente sobre la fase tardiacutea (3-7h) propuesta para el
modelo edema de pata inducido por carragenina
Bb actuoacute soacutelo sobre la fase tardiacutea propuesta para el modelo edema de pata de rata
inducido por carragenina mostrando porcentajes de inhibicioacuten de edema inferiores a
los de dosis de Bh Pm y bromelina con equivalente actividad proteoliacutetica
Proteasas cisteiacutenicas de Bb Pm y principalmente de Bh y bromelina seriacutean las
causales del efecto antiinflamatorio sobre la inflamacioacuten aguda (edema de pata de
rata inducido por carragenina) y actuariacutean sobre la fase tardiacutea del modelo (3-7h)
En algunos de los ensayos de edema de pata de rata Bb mostroacute signos de toxicidad
Bh Pm y bromelina mostraron efecto antiinflamatorio frente al modelo de inflamacioacuten
aguda edema de pata de rata inducido por serotonina
A las dosis ensayadas Bh Pm y bromelina no inhibieron el edema de pata de rata
inducido por histamina
Una dosis de Pm con 3 veces menos de actividad proteoliacutetica que una dosis de
bromelina mostraron efectos antiinflamatorios significativamente similares sobre el
modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma inducido por algodoacuten
Los efectos antiinflamatorios de Pm y bromelina en el test del granuloma inducido por
algodoacuten dependeriacutean de la actividad proteoliacutetica de sus proteasas cisteiacutenicas
Los efectos antiinflamatorios de dosis equivalentes a 30 UCaskg de Bh y Bb no
fueron reproducibles en el modelo de inflamacioacuten croacutenica
Los efectos antiinflamatorios medidos para los preparados proteoliacuteticos en el modelo
del test del granuloma inducido por algodoacuten fueron acompantildeados de un significativo
y leve efecto reductor del peso del timo de los animales tratados
Los efectos reductores del peso del timo fueron dependientes de la actividad
proteoliacutetica de las proteasas cisteiacutenicas de Pm y de bromelina
Los efectos antiinflamatorios de los preparados proteoliacuteticos fueron significativamente
menores al de dexametasona (3 mgkg)
A diferencia de la dexametasona ninguno de los preparados redujo
significativamente el peso del bazo como tampoco produjeron peacuterdida de masa
corporal mientras que los porcentajes de reduccioacuten del peso del timo fueron
significativamente menores al de dexametasona
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
78
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82
41 Hemostasia
En los vertebrados la sangre fluye con una presioacuten relativamente elevada por
conductos que conforman un compartimento cerrado Sin embargo frente a una injuria vascular
la peacuterdida de sangre desde dicho compartimento es limitada El conjunto de mecanismos
fisioloacutegicos que mantienen la sangre fluida e impiden su fuga se denomina hemostasia En ella
intervienen la pared de los vasos sanguiacuteneos componentes celulares (plaquetas) y solubles
(factores plasmaacuteticos de la coagulacioacuten) de la sangre el flujo sanguiacuteneo y de manera
indirecta el almohadillado celuloadiposo y conjuntivo que rodeando el aparato vascular lo
protege por fuera (Castillo et al 1994)
Se denomina hemostasia correctora a la que actuacutea evitando la peacuterdida de sangre
cuando una lesioacuten afecta la integridad de la pared vascular y puede dividirse en cuatro fases
1 Vasoconstriccioacuten localizada
2 Formacioacuten de un agregado plaquetario sobre el aacuterea lesionada
3 Coagulacioacuten (formacioacuten de fibrina)
4 Fibrinoacutelisis (degradacioacuten y remodelacioacuten del coaacutegulo de fibrina)
Puesto que parte de los objetivos de esta tesis se refieren al efecto de los preparados
proteoliacuteticos sobre las fases 3 y 4 las fases 1 y 2 soacutelo seraacuten someramente expuestas
411 Vasoconstriccioacuten
Luego de la lesioacuten vascular se produce una vasoconstriccioacuten en el aacuterea afectada que
conduce al enlentecimiento del flujo sanguiacuteneo Esto favorece la interaccioacuten entre las plaquetas
y los factores de la coagulacioacuten con el endotelio iniciando las fases 2 y 3 Inicialmente y durante
los primeros segundos la vasoconstriccioacuten es debida a una estimulacioacuten simpaacutetica en la
musculatura lisa del vaso y es sostenida probablemente por la serotonina la adrenalina y el
tromboxano A2 (TXA2) liberados desde las plaquetas activadas (Castillo et al 1994)
412 Formacioacuten del trombo plaquetario
En condiciones fisioloacutegicas el trombo plaquetario se forma en el aacuterea lesionada y consta
de varias etapas que involucran la adhesioacuten la activacioacuten y la agregacioacuten plaquetaria
Las plaquetas se adhieren a la pared vascular a traveacutes del subendotelio que queda
expuesto por la lesioacuten Las proteiacutenas que median la unioacuten son fundamentalmente el colaacutegeno
subendotelial el factor de von Willebrand (FvW) y la fibronectina mientras que los receptores
plaquetarios involucrados son glicoproteiacutenas de membrana la GPVI las integrinas GPIaIIa
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83
(α2β1) y GPIIbIIIa (αIIbβ3) y el complejo Ib-V-IX La consecuencia inmediata de la adhesioacuten es la
activacioacuten plaquetaria que se caracteriza por a) cambio de forma discoide a esfeacuterica con
emisioacuten de pseudoacutepodos y b) contraccioacuten dependiente de Ca+2 intracitoplasmaacutetico la cual
determina el proceso de agregacioacuten plaquetaria Durante el proceso de activacioacuten se
desencadenan reacciones metaboacutelicas asiacute como se generan yo liberan agonistas que
amplifican el proceso tales como ADP y TXA2 Algunos agonistas de la activacioacuten plaquetaria
son el colaacutegeno la adrenalina la noradrenalina la serotonina y el PAF (Castillo et al 1994)
El ADP es liberado desde los graacutenulos densos junto a la serotonina al medio
extracelular e induce la activacioacuten de plaquetas por unioacuten a receptores de membrana El TXA2
sintetizado a partir del aacutecido araquidoacutenico (AA) por las viacuteas de la ciclooxigenasa (COX) y la
tromboxano sintetasa es un potente agregante plaquetario y vasoconstrictor El AA es liberado
desde la membrana plaquetaria por la fosfolipasa A2 activada por la unioacuten de agonistas a sus
receptores Otros agonistas desencadenan el metabolismo del fosfatidilinositol conduciendo a
la activacioacuten de proteincinasa C (PKC) que junto a otras cinasas intervienen en varios procesos
de la activacioacuten plaquetaria (Martinuzzo et al 2003)
La agregacioacuten plaquetaria consiste en la unioacuten de plaquetas entre siacute iniciada por la
unioacuten de plaquetas circulantes a las plaquetas ya adheridas al subendotelio Esta unioacuten es
mediada por el FvW y el fibrinoacutegeno el receptor plaquetario es la integrina GPIIbIIIa que es
expresada en la membrana luego de cambios conformacionales dependientes de Ca+2 y
fosforilaciones mediadas por cinasas (Martinuzzo et al 2003) La trombina induce la activacioacuten
y la agregacioacuten plaquetaria provocando la liberacioacuten de ADP y la siacutentesis de TXA2 (Castillo et
al 1994) Una consecuencia de la activacioacuten plaquetaria es la exposicioacuten de fosfoliacutepidos
anioacutenicos en la membrana cruciales para el proceso de coagulacioacuten (Martinuzzo et al 2003)
413 Coagulacioacuten
La coagulacioacuten plasmaacutetica consiste en la transformacioacuten catalizada por la trombina del
fibrinoacutegeno soluble en una red de fibras (fibrina) proceso que intensifica y asegura la
hemostasia temporal iniciada con la vasoconstriccioacuten y desarrollada por las plaquetas Se
produce como resultado de una serie de reacciones en cascada en la que sucesivamente una
proenzima inactiva (zimoacutegeno) es convertida en enzima activa la cual a su vez activa otra
proenzima Los componentes de esta cascada son denominados factores de coagulacioacuten
(Tabla 41) y se clasifican en tres grupos dependientes de la vitamina K sensibles a trombina y
de contacto Los factores dependientes de la vitamina K se caracterizan por poseer un
aminoaacutecido particular el aacutecido γ-carboxiglutaacutemico obtenido por la carboxilacioacuten del aacutecido
glutaacutemico mediada por la vitamina K (Castillo et al 1994)
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84
Factor Nombre sinoacutenimos Peso molecular
(kDa)
Vida media
(h) Grupo
FI Fibrinoacutegeno 340 100-150 T
FII Protrombina 72 50-80 K
FIII Factor tisular (FT)
tromboplastina tisular 44
FIV Calcio
FV Proacelerina 290-400 24 T
FVII Proconvertina 63 6 K
FVIII Factor antihemoliacutetico A 240 12 T
FIX Factor antihemoliacutetico B 554 24 K
FX Factor Stuart 55 25-60 K
FXI Antecedente tromboplastiacutenico
del plasma (PTA) 160 40-80 C
FXII Factor Hageman 90 50-70 C
FXIII Factor estabilizante
de la fibrina 320 150 T
Precalicreiacutena 88 35 C
cininoacutegeno de alto peso
molecular (HMWK)
120 150 C
FvW Factor de von Willebrand 500-20000 24
Tabla 41 Factores de coagulacioacuten Pesos moleculares vida media en plasma y grupo al que pertenecen K
vitamina K-dependientes T trombina sensibles C de contacto
La cascada de coagulacioacuten fue claacutesicamente descripta como dos viacuteas de activacioacuten de
zimoacutegenos que confluiacutean activando el FX y una viacutea comuacuten en la que el FX convertiacutea la
protrombina en trombina y eacutesta el fibrinoacutegeno en fibrina (Figura 41) En este modelo la viacutea
intriacutenseca es desencadenada por contacto del FXII con una superficie cargada negativamente
(por exposicioacuten de un epitelio distinto al vascular) e involucra ademaacutes a los factores FXI FIX
FVIII precalicreiacutena y HMWK La viacutea extriacutenseca desencadenada por la exposicioacuten del FT (por
una lesioacuten tisular) a la circulacioacuten involucra a FVII (Castillo et al 1994) Las plaquetas
activadas intervienen aportando su superficie fosfolipiacutedica (factor plaquetario III) que actuacutea
como catalizador en la etapa final de la viacutea intriacutenseca y en la viacutea comuacuten
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85
Figura 41 Modelo claacutesico de la cascada de coagulacioacuten La coagulacioacuten se puede iniciar con la liberacioacuten del FT (Viacutea extriacutenseca) yo con el contacto del FXII con una superficie cargada negativamente (Viacutea intriacutenseca) Ambas viacuteas confluyen activando el FX a FXa el que desencadena la viacutea comuacuten que finaliza con la formacioacuten de fibrina Los factores representados como ciacuterculos actuacutean como cofactores para los factores que actuacutean como enzimas (estrellas)
en las reacciones sentildealadas La superficie fosfolipiacutedica es representada como un oacutevalo celeste
Maacutes recientemente se ha propuesto otro modelo de coagulacioacuten en el cual a) el FT es
el principal desencadenante de la coagulacioacuten b) la amplificacioacuten generada por la trombina es
considerada esencial para el desarrollo del coaacutegulo estable y c) existe interdependencia entre
los factores plasmaacuteticos y los elementos celulares (Figura 42) En este modelo la cascada de
coagulacioacuten es vista como un proceso gradual y superpuesto de activaciones proteoliacuteticas en
tres fases inicial de amplificacioacuten y de propagacioacuten en cuyas dos uacuteltimas fases la superficie
celular es fundamental para localizar la formacioacuten del coaacutegulo sobre la superficie dantildeada Las
dos viacuteas claacutesicas se unen a traveacutes del complejo FTFVIIa (viacutea extriacutenseca) el cual es capaz de
activar el factor de la viacutea intriacutenseca FIX (Adams amp Bird 2009)
4131 Fase inicial
La exposicioacuten del FT a la sangre por dantildeo o activacioacuten del endotelio actuacutea como
desencadenante de la coagulacioacuten activando el FVII circulante a FVIIa junto con el cual forma
el complejo tenasa del factor extriacutenseco (FTFVIIa) sobre la superficie fosfolipiacutedica de la
membrana celular Este complejo activa el FX a FXa y el FIX a FIXa (Adams amp Bird 2009) Si el
FXa permanece en la superficie puede unirse al FVa y activar el FII generando cantidades
picomolares de trombina (FIIa) (Martinuzzo et al 2003)
La duracioacuten de esta fase depende de la concentracioacuten del complejo FTFVIIa y del
inhibidor de la viacutea del factor tisular (TFPI) el cual forma un complejo FTFVIIaFXaTFPI capaz
VIacuteA INTRIacuteNSECA
Superficie dantildeada(carga negativa)
FXII
FXIIa
HMWK FXI
FXIa
FIX
FIXa
FX
FXa
FVIIIa
Ca+2
Trauma
Fosfo
liacutepid
os FT
FVIIa
FVII
VIacuteA EXTRIacuteNSECA
Protrombina
Trombina
Fibrinoacutegeno
Fibrina
VIacuteA COMUacuteN
Fosfo
liacutepid
osCa+2
FVa
Calicreiacutena
Precalicreiacutena
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86
de limitar la formacioacuten de FXa La expresioacuten del FT tambieacuten puede ser inducido en plaquetas y
monocitos asiacute como en micropartiacuteculas circulantes (MP) derivadas de las ceacutelulas en las que se
expresa (Adams amp Bird 2009)
Resulta importante sentildealar que la fase de contacto de la viacutea intriacutenseca en la que
intervienen el FXII la precalicreiacutena y el HMWK no es requerida para iniciar la cascada si bien
es fundamental para los estudios in vitro de la coagulacioacuten (Furie amp Furie 2008)
4132 Fase de amplificacioacuten
Las pequentildeas cantidades generadas de trombina pueden activar al FV y al FVIII los
cuales actuacutean como cofactores de los complejos protrombinasa (FVaFXa) y tenasa intriacutenseca
(FVIIIaFIXa) formados junto a Ca+2 sobre superficies fosfolipiacutedicas pertenecientes
principalmente a las plaquetas La amplificacioacuten de la coagulacioacuten estaacute dada por el incremento
en la produccioacuten del FXa por parte del complejo tenasa intriacutenseca (entre 50 y 100 veces maacutes
que la generada por el complejo FTFVIIa) y de trombina (Adams amp Bird 2009) El FVIII se
asocia al FvW el que mediante su interaccioacuten con la glicoproteiacutena Ib-V-IX se une a la plaqueta
haciendo maacutes eficiente la activacioacuten del FVIII por la trombina (Martinuzzo et al 2003)
Otro efecto amplificador es la activacioacuten del FXI a FXIa por parte de la trombina en
presencia de Ca+2 y protrombina lo que permite al FXIa localizarse en la superficie plaquetaria y
activar maacutes FIX La trombina activa las plaquetas mediante la unioacuten al PAR-1 (receptor activado
por proteasas) lo que a su vez induce la degranulacioacuten de graacutenulos α la expresioacuten de FVa
sobre la membrana y la activacioacuten de GPIIbIIIa estimulando la agregacioacuten plaquetaria y
activando la superficie plaquetaria al inducir la exposicioacuten de fosfoliacutepidos anioacutenicos
(fosfatidilserina) sobre la misma Las plaquetas activadas por trombina muy probablemente
sean las activadas por colaacutegeno durante la adhesioacuten plaquetaria y tienen una gran afinidad para
unir en su superficie los complejos protrombinasa y tenasa intriacutenseca (Adams amp Bird 2009)
4133 Fase de propagacioacuten
Durante la fase de amplificacioacuten se generan plaquetas activadas capaces de unir los
complejos cataliacuteticos maacutes eficientes para la produccioacuten de trombina la cual a su vez activa a las
plaquetas y a los factores y cofactores que componen esos complejos La fase de propagacioacuten
se basa en el reclutamiento de esas plaquetas activadas en el sitio de injuria El resultado de
estas reacciones es la produccioacuten ldquoexplosivardquo de trombina suficiente como para transformar el
fibrinoacutegeno en fibrina y generar un coaacutegulo estable (Adams amp Bird 2009)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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Figura 42 Modelo de la coagulacioacuten con base celular 1 La coagulacioacuten se inicia sobre la ceacutelula portadora del FT originando pequentildeas cantidades de trombina MP micropartiacuteculas circulantes MB membrana basal del endotelio Plt plaquetas 2 La pequentildea cantidad de trombina generada permite activar cofactores plaquetas y FXI formaacutendose sobre las plaquetas los efectivos complejos tenasa intriacutenseco (FVIIIaFIXa) y protrombinasa (FVaFX) que amplifican las reacciones productoras de trombina PS fosfatidilserina 3 Durante la fase de propagacioacuten la cantidad de trombina requerida para la formacioacuten del coaacutegulo se forma desde la superficie de las plaquetas localizadas en el sitio de injuria (Modificado de Adams amp Bird 2009)
4134 Formacioacuten de la fibrina
Puesto que la fibrina se construye a partir de los cambios estructurales que produce la
trombina sobre el fibrinoacutegeno es conveniente describir brevemente la estructura de este uacuteltimo
El fibrinoacutegeno es una glicoproteiacutena fibrosa de gran tamantildeo (340 kDa) compuesta por un diacutemero
de tres cadenas polipeptiacutedicas Aα Bβ y γ unidas por 29 puentes disulfuro (Figura 43) En
cuanto a su estructura terciaria se pueden identificar una regioacuten nodular central (E) y dos
regiones nodulares finales (D)
Figura 43 Estructura molecular del fibrinoacutegeno humano basado en la estructura cristalograacutefica obtenida por rayos X (Kollman et al 2009) las regiones α-C y sus cadenas conectoras no pueden ser resueltas por cristalografiacutea de rayos
X por lo que se muestran esquemaacuteticamente Los fibrinopeacuteptidos son esquematizados para destacar su interaccioacuten con α-C (Tomado de Guthold amp Cho 2011 y parcialmente modificado)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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88
La regioacuten E estaacute formada por los extremos amino terminal unidos por puentes disulfuro
de las seis cadenas Las regiones D estaacuten formadas por los extremos globulares carboxilo
terminales de las cadenas Bβ (β-C) y γ (γ-C) los que a su vez estaacuten formados por tres
dominios Los extremos carboxilo terminales de las cadenas Aα (α-C) se extienden desde el
extremo de la moleacutecula e interactuacutean entre siacute y con el centro (Weisel 2005) Los segmentos
centrales de las tres cadenas se enroscan formando una triple α-heacutelice (regioacuten coiled-coil) que
proporciona flexibilidad y estabilidad mecaacutenica a la moleacutecula uniendo las regiones D a la regioacuten
E (Lauricella 2007)
Se han identificado funciones para varias de las regiones del fibrinoacutegeno la regioacuten E
posee sitios de unioacuten de diferentes afinidades para la trombina el extremo carboxilo terminal de
una variante de la cadena γ (γ`) une trombina y FXIII la regioacuten D aporta sitios DD que
contribuyen a la alineacioacuten de los monoacutemeros de fibrina y sitios DA (en γ-C) o DB (en β-C) donde
se insertaraacuten los sitios A y B (regioacuten E) respectivamente de monoacutemeros vecinos (Figura 44)
finalmente el sitio γXL de la cadena γ interviene en el ensamblado de la fibrina y facilita la accioacuten
del FXIII (Lauricella 2007)
Figura 44 Formacioacuten de fibrina Esquemas de la moleacutecula de fibrinoacutegeno y de la formacioacuten de los distintos niveles estructurales de la fibrina (Tabla de la derecha) luego de la accioacuten de la trombina y del FXIIIa (Estructuras de fibrinoacutegeno y fibras parcialmente modificadas de Undas amp Arieumlns 2011)
TROMBINA
TROMBINA
Fibrinopeacuteptidos A
Fibrinopeacuteptidos B
MICROFIBRA
FIBRA
FIBRINA INSOLUBLE
FIBRINOacuteGENO
Monoacutemero de fibrina
NIVEL
POLIMERO
NIVEL
GEL
(Agregados de microfibras)
(Red tridimensional con distintos grados de ramificaciones)
(Presencia de entrecruzamientos)FXIIIa
FIBRINA SOLUBLE
FXIII
TROMBINACa
++
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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La trombina cliva cuatro enlaces especiacuteficos Arg-Gly de los extremos amino terminales
de Aα y Bβ en la regioacuten E desde los cuales se liberan los fibrinopeacuteptidos A y B
respectivamente y se exponen nuevos sitios (A y B respectivamente) en las cadenas clivadas
del ahora monoacutemero de fibrina
La polimerizacioacuten ocurre en varias etapas conduciendo a distintos niveles estructurales
La unioacuten entre monoacutemeros por interacciones de sus sitios A y B (regioacuten E) con sitios DA y DB
(regiones D) de otros monoacutemeros asiacute como las interacciones entre regiones D (a traveacutes de los
sitios DD) de monoacutemeros contiguos que contribuyen a la elongacioacuten del poliacutemero da lugar a la
formacioacuten de microfibras (o protofibras) estabilizadas por interacciones E-D (Lauricella 2007)
La liberacioacuten del fibrinopeacuteptido B produce tal cambio conformacional que los dominios α-C se
disocian de la regioacuten E y quedan disponibles para las interacciones intermoleculares que
favorecen la agregacioacuten bilateral de las microfibras dando lugar a fibras maacutes gruesas ademaacutes
de contribuir a la estabilidad y a las propiedades mecaacutenicas del coaacutegulo (Weisel 2007 Zhmurov
et al 2011) A su vez las fibras se asocian generando ramificaciones que conforman una red
tridimensional (fibrina soluble) La red es finalmente estabilizada (fibrina insoluble) por el FXIIIa
una transglutaminasa activada por trombina en presencia de Ca+2 El FXIIIa forma puentes
amida entre un grupo amino de residuos de lisina y un grupo carbonilo de residuos de glutamina
dando lugar a entrecruzamientos en la red que pueden ser entre dos cadenas γ dos Aα o una
γ con una Aα La fibrina estabilizada es maacutes resistente a la fibrinoacutelisis (Lauricella 2007)
4135 Regulacioacuten de la coagulacioacuten
Numerosas proteiacutenas cumplen con la funcioacuten regulatoria de la coagulacioacuten actuando en
los distintos niveles El FT es regulado por el inhibidor de la viacutea del factor tisular (TFPI) el que
es expresado por el endotelio y las plaquetas asiacute como por otras ceacutelulas y circula unido a LDL
TFPI tambieacuten neutraliza la actividad del FXa e inhibe el complejo FTFVIIa
La antitrombina el principal inhibidor de la coagulacioacuten es un inhibidor de
serinoproteasas tales como FXa FXIa FIXa y calicreiacutena y se sintetiza en el endotelio Por
actuar preferencialmente sobre las enzimas libres contribuye a limitar la coagulacioacuten en la
regioacuten de lesioacuten (Adams amp Bird 2009)
El cofactor II de heparina es un inhibidor de trombina que requiere la presencia de
dermataacuten sulfato o heparina para acelerar su reaccioacuten Los FVa y FVIIIa son inactivados por la
proteiacutena C activa (APC) actuando como cofactor la proteiacutena S La activacioacuten de la proteiacutena C es
llevada a cabo por la trombina unida a la trombomodulina del endotelio mientras que la APC es
inhibida por α1-antitripsina (α1-AT) y por α2-macroglobulina (α2-MG) asiacute como por el inhibidor de
proteiacutena C (PCI) La α1-AT inhibe tambieacuten FXIa calicreiacutena y trombina La α2-MG es un inhibidor
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de amplio espectro ya que inhibe la plasmina la tripsina la calicreiacutena y la elastasa entre otras
ademaacutes de trombina El FXa y el FXIa son inhibidos por el inhibidor de proteasas dependiente
de proteiacutena Z (ZPI) una proteiacutena K-dependiente usando como cofactor la proteiacutena Z
(Martinuzzo et al 2003)
El endotelio actuacutea regulando la hemostasia manteniendo las caracteriacutesticas no
trombogeacutenicas de la cara luminal en contacto con la sangre a traveacutes de la siacutentesis de heparaacuten y
dermataacuten sulfato componentes del sistema de la proteiacutena C antiagregantes plaquetarios como
prostaciclina G2 (PGI2) y oacutexido niacutetrico (NO) entre otros Mientras que ante estiacutemulos
trombogeacutenicos se sintetizan factores prohemostaacuteticos (FvW FT FV)
414 Fibrinoacutelisis
La deposicioacuten de fibrina induce el sistema fibrinoliacutetico que de manera controlada
remueve o remodela el coaacutegulo a traveacutes de la fibrinoacutelisis evitando el depoacutesito indeseado de
fibrina El sistema fibrinoliacutetico estaacute compuesto por zimoacutegenos activadores e inhibidores y a
traveacutes de diferentes mecanismos activa el plasminoacutegeno (Plg) a plasmina que actuacutea
proteoliacuteticamente sobre la fibrina La fibrinoacutelisis estaacute regulada por la concentracioacuten de los
activadores de Plg los cuales tienen una lenta difusioacuten a coaacutegulos ya formados por lo que es
importante su presencia durante la formacioacuten de la red de fibrina de manera que queden
incorporados al coaacutegulo Los principales activadores del Plg son el activador tisular del
plasminoacutegeno (t-PA) y el activador de tipo uroquinasa (u-PA) ademaacutes de algunos activadores
exoacutegenos como la estreptoquinasa generada por estreptococos β-hemoliacuteticos (Martinuzzo et
al 2003)
El t-PA es sintetizado en el endotelio y liberado en respuesta a trombina histamina
bradicinina interleucinas estreacutes y eacutestasis venoso (Martinuzzo et al 2003) entre otros La baja
afinidad del t-PA circulante por el Plg aumenta en presencia de fibrina que es capaz de fijarlo
al igual que al Plg sobre su estructura Asiacute la fibrina promueve la formacioacuten de plasmina sobre
su superficie favoreciendo una lisis local y no una generalizada
El u-PA es secretado por ceacutelulas endoteliales renales y tumorales Se sintetiza en forma
de simple cadena (scu-PA) conocida como prouroquinasa (activa el Plg sobre la fibrina) que
puede ser activada a su forma de doble cadena (tcu-PA) por accioacuten de la plasmina o por los
factores de la fase de contacto (precalicreiacutena HMWK FXII) siendo capaz de actuar sobre el Plg
en fase fluida (Martinuzzo et al 2003)
La plasmina degrada la fibrina (estabilizada por el FXIIIa) liberando fragmentos de
distintos pesos moleculares que en su mayoriacutea incluyen al diacutemero DD (contiene las regiones D
de monoacutemeros contiguos unidos covalentemente) La accioacuten de la plasmina sobre el fibrinoacutegeno
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produce fragmentos X Y D y E similares a los que genera al actuar sobre la fibrina no
estabilizada salvo por la ausencia de los fibrinopeacuteptidos A y B (Figura 45)
Figura 45 Productos de degradacioacuten del fibrinoacutegeno y de la fibrina Las flechas rojas indican puntos de corte de la
plasmina las barras negras representan los entrecruzamientos en la fibrina formados por el FXIIIa (Estructuras de
fibrinoacutegeno y fibrina parcialmente modificadas de Undas amp Arieumlns 2011)
La plasmina tambieacuten es capaz de degradar otras proteiacutenas plasmaacuteticas como el FII el
FV el FVIII cininas componentes del complemento asiacute como tambieacuten activar metaloproteasas
que intervienen en la degradacioacuten de la matriz extracelular Por esto es importante la regulacioacuten
de la fibrinoacutelisis que se da tanto a nivel de la plasmina como de los activadores del Plg
(Martinuzzo et al 2003)
La plasmina circulante es inhibida por unioacuten de la α2-antiplasmina (α2-AP) que no soacutelo
afecta el sitio activo sino tambieacuten los sitios de unioacuten a la fibrina Los inhibidores de los
activadores de Plg (PAI) se encuentran en altas concentraciones en sangre y actuacutean formando
complejos covalentes ya sea con el t-PA como con el u-PA
Por su parte la trombina inhibe la fibrinoacutelisis mediante la activacioacuten del inhibidor de la
fibrinoacutelisis activable por trombina (TAFI) El TAFIa remueve residuos Lys de la fibrina
eliminando los sitios de unioacuten al Plg requeridos para la activacioacuten por el t-PA (Adams amp Bird
2009)
42 Trombosis (Korin 2003)
La trombosis es la presencia intravascular de material fibrino-plaquetario con variable
contenido de hematiacutees y leucocitos y puede ser una respuesta fisioloacutegica (trombo hemostaacutetico)
Fibrinoacutegeno
Fragmento X
Fragmento DFragmento Y
Fragmento D Fragmento E
Fragmento (DD)EFragmento (DD)
Fragmento DYYD
Fibrina estabilizada
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tal como ya ha sido descripto o ser la consecuencia de una activacioacuten patoloacutegica e inapropiada
del sistema de coagulacioacuten
El trombo patoloacutegico puede ser parcial o totalmente oclusivo hecho que puede llevar a
una isquemia de grado variable y consecuente peacuterdida de la funcioacuten vital del oacutergano ademaacutes
de la posibilidad de embolizacioacuten distal y la consecuente embolia pulmonar Seguacuten donde se
asienten los trombos se dividen en venosos arteriales cardiacuteacos y de microcirculacioacuten
La trombosis venosa se caracteriza por la presencia de trombos compuestos
principalmente por hematiacutees y fibrina (trombos rojos) Los factores desencadenantes maacutes
importantes son la disminucioacuten de la velocidad del flujo sanguiacuteneo (anestesias incapacidad
motora aumento de viscosidad sanguiacutenea etc) y cambios en los sistemas de coagulacioacuten y
fibrinoacutelisis (descenso de inhibidores aumento en la concentracioacuten de factores hipofuncioacuten
fibrinoliacutetica etc) Asiacute actuacutean como factores de riesgo los estados post-operatorios las
neoplasias las plejiacuteas los estados trombofiacutelicos y la edad creciente Cuando la trombosis se
localiza en el sistema venoso profundo suele estar asociada con el riesgo de embolia pulmonar
y constituyen los polos cliacutenicos del tromboembolismo venoso (TEV)
El TEV es tratado y prevenido con anticoagulacioacuten (heparinas no fraccionadas
heparinas de bajo peso molecular o dicumariacutenicos) Casos de TEV severos requieren de un
tratamiento tromboliacutetico
La trombosis arterial se produce en zonas de alta velocidad de flujo sanguiacuteneo y los
trombos se componen fundamentalmente de agregado plaquetario y fibrina y en menor
medida de hematiacutees y leucocitos (trombos blancos) Es consecuencia de alteraciones en la
pared vascular (placas ateromatosas) y puede conducir a accidentes cerebrovasculares y
sindromes coronarios agudos entre otras complicaciones
Los factores que pueden desencadenar la trombosis arterial son un endotelio
disfuncional alteraciones en el flujo sanguiacuteneo y la activacioacuten del sistema de coagulacioacuten
mediado por la exposicioacuten del FT Paralelamente se produce reclutamiento activacioacuten y
agregacioacuten plaquetaria asiacute como la activacioacuten del sistema fibrinoliacutetico el que es regulado por el
PAI-1 depositado en la placa ademaacutes del TAFI y la α2-AP La trombogenicidad de una placa es
una funcioacuten del contenido de FT el cual determina la velocidad de produccioacuten de trombina El
FT presente en las placas proviene de las micropartiacuteculas (MP) derivadas de macroacutefagos
linfocitos y ceacutelulas musculares lisas activadas por citoquinas asiacute como de las membranas de
neutroacutefilos y monocitos que invaden la placa por quimiotaxis y adhesioacuten todo ello favorecido por
el endotelio disfuncional Asiacute el nivel de inflamacioacuten tambieacuten contribuye al desarrollo de la
trombosis arterial Por otro lado el colaacutegeno presente en la placa es un desencadenante de la
activacioacuten plaquetaria El tratamiento depende de la localizacioacuten y compromiso del oacutergano
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afectado para lo cual se usan heparinas aspirina inhibidores de la GPIIbIIIa y tromboliacuteticos
entre otros Dado que la aterotrombosis es una enfermedad multifactorial y multigeacutenica se
asocian muacuteltiples factores de riesgo que deben ser tenidos en cuenta para un tratamiento maacutes
adecuado A los factores de riesgo claacutesicos (diabetes obesidad tabaquismo hiperlipidemia
etc) se han empezado a evaluar otros tales como niveles altos de fibrinoacutegeno indicadores de
inflamacioacuten variantes de glicoproteiacutenas plaquetarias niveles de PAI-1 y polimorfismos de APO
entre otros
421 Agentes para el tratamiento de la trombosis
El tratamiento de los desoacuterdenes tromboacuteticos requieren de tres grupos de faacutermacos
anticoagulantes antiagregantes plaquetarios y fibrinoliacuteticos (Tabla 42) Dado que los blancos
de accioacuten son componentes del sistema hemostaacutetico la desventaja que comparten es el riesgo
a la hemorragia El antitromboacutetico ideal seriacutea aquel que inhibe la trombosis y evita el riesgo de
hemorragia (Furie amp Furie 2008)
Anticoagulantes Antiagregantes plaquetarios Fibrinoliacuteticos
Heparina no fraccionada (HNF)
Heparina de bajo peso molecular
(HBPM)
Inhibidores de trombina (ej
argatroban bivalirudina hirudina)
Anticoagulantes orales
Aspirina
Inhibidores de GPIIbIIIa (ej
abciximab eptifibatide tirofiban)
Bloqueador del receptor de ADP (ej
Ticlopidina clopidogrel)
Inhibidores de TXA2 sintasa
Antagonistas de TXA2
Estreptoquinasa
Activadores del plasminoacutegeno tisular
recombinantes (r-TPAs)
Tabla 42 Agentes para el tratamiento de la trombosis
Los desoacuterdenes cardiovasculares representan la principal causa de muerte en el mundo
asiacute como en la Argentina (WHO) Aunque la trombosis sigue siendo la viacutea final de enfermedad y
muerte en algunas de las enfermedades maacutes comunes tales como infarto de miocardio
accidente cerebrovascular y caacutencer todos los agentes farmacoloacutegicos disponibles para su
prevencioacuten o tratamiento han estado en uso durante deacutecadas o han sido reemplazados con
nuevas variantes que ofrecen una modesta mejora incremental (Furie amp Furie 2008)
En los uacuteltimos antildeos una serie de combinaciones de anticoagulantes antiagregantes
plaquetarios y agentes fibrinoliacuteticos se han probado en ensayos cliacutenicos en pacientes con
siacutendromes coronarios agudos dando lugar a cambios en la praacutectica cliacutenica y mejoras en la
morbilidad y mortalidad de los pacientes (Merli 2007)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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En cuanto a los agentes fibrinoliacuteticos la estreptoquinasa sigue siendo un medicamento
efectivo para disolver coaacutegulos estando indicada en el tratamiento de algunos casos de infarto
de miocardio (Sikri amp Bardia 2007) Sin embargo la estreptoquinasa y la u-PA activan no soacutelo
el Plg unido a fibrina sino tambieacuten el Plg circulante generando plasmina libre la cual es capaz
de degradar otras proteiacutenas plasmaacuteticas ademaacutes de contribuir a eventos proinflamatorios
(Syrovets et al 2012) Durante la uacuteltima deacutecada la atencioacuten se ha centrado en la mejora de la
potencia eficacia y facilidad de administracioacuten de los agentes fibrinoliacuteticos En este sentido se
han desarrollado variantes recombinates de los PAs que preferencialmente activan el Plg unido
a fibrina (Collen 1996)
La buacutesqueda de enzimas fibrinoliacuteticas alternativas llevoacute hace 70 antildeos al descubrimiento
de los venenos de serpiente como agentes de disolucioacuten intravascular para coaacutegulos La
alfimeprasa una variante recombinante del veneno se caracteriza por tener un efecto directo
sobre la fibrina y es raacutepidamente inhibida al ser unida por α2-MG (Anoacutenimo 2008)
4211 Proteasas vegetales como antitromboacuteticos
La bromelina ha mostrado ser un agente fibrinoliacutetico in vivo e in vitro no soacutelo actuacutea
directamente sobre la fibrina tambieacuten activa el Plg y aumenta la concentracioacuten de plasmina Por
otro lado y en relacioacuten a su efecto antimetastaacutesico es capaz de disminuir la expresioacuten de uPAR
(receptor de u-PA) en ceacutelulas tumorales (Maurer 2001) En un modelo inflamatorio animal
bromelina incrementoacute la actividad fibrinoliacutetica seacuterica de manera dosis dependiente (Pirotta amp de
Giuli-Morghen 1978)
En un modelo de trombosis in vivo la administracioacuten oral de esta proteasa disminuyoacute la
formacioacuten de trombos (13 en arteriolas y 5 en veacutenulas) mientras que in vitro redujo la
adhesioacuten al endotelio de plaquetas humanas activadas por trombina Por otro lado el
tratamiento de plaquetas humanas con bromelina redujo la agregacioacuten inducida por trombina
(Metzig et al 1999) y por ADP (Glaumlser amp Hilberg 2006)
El tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
fueron prolongados significativamente luego de la administracioacuten oral de bromelina en ratas
(Livio et al 1978) En el mismo estudio se observoacute inhibicioacuten en la agregacioacuten plaquetaria La
administracioacuten oral de bromelina durante 10 diacuteas en personas sanas no afectoacute el TP aunque siacute
levemente el TTPa pero dentro de rangos normales (Eckert et al 1999)
Maacutes recientemente Bilheiro et al (2013) reportaron que una fraccioacuten rica en
cisteiacutenendopeptidasas aislada del laacutetex de Carica candarmarcensis manifestoacute efecto
fibrinoliacutetico fibrinogenoliacutetico y tromboliacutetico actividad inhibitoria de la agregacioacuten plaquetaria
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inducida por ADP asiacute como la prolongacioacuten del TP TT y TTPa Todos estos efectos fueron
dosis dependiente y cesaron al agregar inhibidores de cisteiacutenproteasas
43 Objetivos
Dentro del objetivo general de investigar la posible aplicacioacuten como agentes para el
tratamiento de la trombosis de los extractos parcialmente purificados obtenidos de frutos de
Bromelia hieronymi (Bh) B balanasae (Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) se plantearon
como objetivos especiacuteficos
Evaluar y comparar los posibles efectos de Bh Bb y Pm sobre la coagulacioacuten
sanguiacutenea el fibrinoacutegeno y la fibrina
Determinar si los efectos medidos tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los
extractos
Comparar los efectos de Bh Bb y Pm con los medidos para bromelina
44 Materiales y meacutetodos
441 Efecto anticoagulante
Para medir el efecto de los preparados sobre la coagulacioacuten sanguiacutenea se realizaron dos
pruebas globales de la coagulacioacuten el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de
tromboplastina parcial activado (TTPa) Las pruebas globales se caracterizan por ser raacutepidas y
sencillas y aunque sus resultados pueden indicar una alteracioacuten no identifican el componente
afectado (Duboscq 2003)
Los valores del TP y del TTPa se obtuvieron a partir de ensayos in vitro e in vivo Los
ensayos in vitro se realizaron midiendo el TP y el TTPa de un pool de plasma humano pobre en
plaquetas antes y despueacutes de ser incubado con distintas concentraciones de los preparados
proteoliacuteticos mientras que los ensayos in vivo consistieron en medir el TP y el TTPa de plasmas
obtenidos de ratas Wistar tratadas con los preparados proteoliacuteticos
4411 Ensayos in vitro
44111 Pool de plasma pobre en plaquetas
El pool fue elaborado con 15 muestras de plasma pobre en plaquetas (ppp) obtenidas de
dadores voluntarios adultos de entre 30 y 65 antildeos que no hubieran consumido aspirina u otros
faacutermacos con accioacuten anticoagulante en los 10 diacuteas previos El ppp fue obtenido del
sobrenadante luego de centrifugar sangre anticoagulada con citrato de sodio al 38 (relacioacuten
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sangrecitrato de sodio = 91) durante 10 min a 3000 g El pool fue conservado en freezer a -20
ordmC durante su elaboracioacuten (1 semana) y una vez terminado fue fraccionado en tubos de plaacutestico
y conservado a -80 ordmC hasta su uso (2 meses)
44112 Tiempo de protrombina (TP)
El TP o tiempo de Quick se basa en la medida del tiempo de coagulacioacuten de un plasma
decalcificado en presencia de tromboplastina tisular y Ca+2 El teacutermino tromboplastina tisular
hace referencia a una mezcla de tromboplastina o factor tisular (FT) y fosfoliacutepidos (Duboscq
2003)
Esta prueba permite evaluar la viacutea extriacutenseca del modelo claacutesico de la coagulacioacuten ya
que es sensible a cambios en los niveles del FVII ademaacutes de los otros factores vitamina K-
dependientes (FII y FX) y del FV El nivel de fibrinoacutegeno debe estar muy disminuido (menos del
50 de la concentracioacuten normal en plasma) para alterar el TP Es un ensayo esencial para el
monitoreo de pacientes bajo tratamiento con anticoagulantes orales (Duboscq 2003)
Para la medida del TP se usoacute el kit comercial Soluplastin (Wiener lab Group) que
contiene tromboplastina tisular de cerebro de conejo En la Tabla 43 se esquematiza el
protocolo seguido el cual fue adaptado del procedimiento establecido por el kit
Mezcla de reaccioacuten (MR)
100 μL de ppp + 10 μL de muestra1
en tubo de plaacutestico
Reactivo
(Tromboplastina CaCl2 NaCl)
200 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubacioacuten a 37 ordmC (diferentes tiempos) Incubacioacuten a 37 ordmC durante 2 min
2 Agregar 100 μL de MR al tubo con reactivo y en simultaacuteneo iniciar el cronometraje
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 43 Protocolo experimental para la medida del TP 1 Preparado proteoliacutetico o solucioacuten control (buffer fosfato
soacutedico 01M pH 6)
El coaacutegulo fue detectado ldquopescaacutendolordquo mediante un ansa de acero inoxidable los
valores de TP medidos para el pool de ppp tratado con los distintos preparados proteoliacuteticos
(TPp) fueron expresados en s y se compararon con los medidos para los controles (TPc)
obtenidos al mezclar el pool de ppp con buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 (buffer de
resuspensioacuten de la bromelina y de los precipitados etanoacutelicos de cada uno de los extractos
ensayados)
En cuanto a los valores de referencia seguacuten informacioacuten del proveedor del reactivo el
intervalo de los valores de TP de individuos normales adultos oscila entre 10 y 14 s aunque
dichos valores dependen de los reactivos y del procedimiento Tiempos prolongados indican un
estado de hipocoagulabilidad por deficiencia tanto de factores de la viacutea extriacutenseca como de
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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vitamina K y por presencia de inhibidores mientras que tiempos acortados se asocian a estados
de hipercoagulabilidad Altas concentraciones (gt 50 μgmL) de productos de degradacioacuten de
fibrina asiacute como enfermedad hepaacutetica son algunas causas de prolongados valores de TP
(Duboscq 2003)
44113 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
El ensayo consiste en medir el tiempo de coagulacioacuten del plasma decalcificado en
presencia de un exceso de tromboplastina parcial un activador y Ca+2 El teacutermino
tromboplastina parcial se refiere a la porcioacuten fosfolipiacutedica en la que se encuentra anclada la
tromboplastina (o FT) El activador proporciona la superficie cargada negativamente
desencadenante de la fase de contacto generalmente tierra de diatomeas celite o caoliacuten
(Duboscq 2003)
Esta prueba sirve para detectar anormalidades en la viacutea intriacutenseca del modelo claacutesico
ya sea por deficiencia de factores procoagulantes como por la presencia de inhibidores por ser
sensible frente a deficiencias de los factores FXII FXI FIX y FVIII como tambieacuten frente a
deficiencias severas de fibrinoacutegeno FII FV y FX Es usada para monitorear el tratamiento
terapeacuteutico con heparina no fraccionada y con acenocumarol (Duboscq 2003)
Se utilizoacute el kit comercial APTTest (Wiener lab Group) que utiliza cefalina como
tromboplastina parcial y tierra de diatomeas como activador En la Tabla 44 se esquematiza el
protocolo seguido en los ensayos el cual fue adaptado del procedimiento establecido por el kit
Mezcla de reaccioacuten (MR)
100 μL de pool de ppp + 10 μL de muestra1 en tubo
de plaacutestico
Reactivo
(Cefalina + tierra de diatomeas)
100 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubar de MR a 37 ordmC (diferentes tiempos)
2 Agregar 100 μL de MR al tubo con reactivo e incubar a 37 ordmC durante 3 min
3 Agregar 100 μL de CaCl2 0025 molL (precalentado a 37 ordmC) iniciar simultaacuteneamente el cronometraje y homogeneizar
4 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 44 Protocolo experimental para la medida del TTPa1 Preparado proteoliacutetico o control (buffer fosfato soacutedico
01 M pH 6)
El coaacutegulo fue detectado ldquopescaacutendolordquo mediante un ansa de acero inoxidable Los
tiempos de tromboplastina parcial activada medidos para el pool de ppp tratado con las distintas
preparaciones proteoliacuteticas (TTPap) fueron expresados en s y se compararon con los medidos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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para los controles (TTPac) los que se obtuvieron al mezclar el pool de ppp con buffer fosfato
soacutedico 01M de pH 6
Los valores de TTPa dependen fuertemente de los reactivos y del sistema de deteccioacuten
utilizado por lo cual es importante comparar los resultados obtenidos de la muestra ensayada
con la de un control usando un mismo lote de reactivo Seguacuten informacioacuten del proveedor del
reactivo el intervalo de los valores de TTPa de individuos normales adultos oscila entre 33 y 48
s y los tiempos que se diferencian en maacutes de 6 s de un plasma control deberaacuten ser
considerados anormales Tiempos prolongados indican un estado de hipocoagulabilidad
(deficiencia de factores o presencia de inhibidores) en tanto que los tiempos acortados
corresponderiacutean a un estado de hipercoagulabilidad aunque en este caso es aconsejable tomar
una nueva muestra pues la muestra podriacutea haber sido activada in vitro (Duboscq 2003)
44114 Efecto de la inhibicioacuten de la actividad proteoliacutetica sobre la accioacuten anticoagulante
Las soluciones de Bh Bb Pm y bromelina que extendieron el TP y el TTPa del pool de
ppp por encima de 180 s fueron incubadas durante 30 min a 37 ordmC con 035 mM de E-64 Luego
de verificar la peacuterdida de la actividad proteoliacutetica de dichas soluciones se volvioacute a determinar los
valores de TP y de TTPa siguiendo los protocolos de las tablas 33 y 34 respectivamente La
solucioacuten control para ambos ensayos fue buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 conteniendo 035
mM de E-64
44115 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados
Los datos fueron analizados estadiacutesticamente mediante ANOVA y posterior test de
Dunnett Cuando se compararon soacutelo dos grupos se utilizoacute la prueba t (no pareada) Un p lt
005 () fue considerado significativo Los caacutelculos fueron realizados con el programa
GraphPadPrism version 50
Para todos los preparados proteoliacuteticos las soluciones y diluciones ensayadas fueron
elaboradas n veces (indicado en cada caso) y a cada una de ellas se les midioacute el TP y el TTPa
por duplicado (intraensayo) Los resultados son expresados como el promedio de los valores
promedio intraensayo plusmn desviacioacuten estaacutendar (DE)
4412 Ensayos in vivo
Los resultados obtenidos en los ensayos in vitro se usaron para estimar las dosis que
pudieran resultar efectivas como anticoagulantes en los ensayos in vivo Para estos ensayos
ratas Wistar de ambos sexos y pesos entre 150 y 240 g fueron divididas en lotes de 6 animales
(3 hembras y 3 machos) Cada lote recibioacute intraperitonealmente los preparados proteoliacuteticos el
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
99
lote control no recibioacute tratamiento Previo a la extraccioacuten sanguiacutenea los animales fueron
anestesiados con una mezcla de 75 mgkg de ketamina clorhidrato (Holliday Scott SA) y 12
mgkg de xilacina clorhidrato (Richmond Laboratories Vet Pharma) administrada
intraperitonealmente La extraccioacuten fue realizada por puncioacuten cardiacuteaca y la sangre obtenida fue
mezclada con citrato soacutedico al 38 en una relacioacuten sangreanticoagulante = 91 se centrifugoacute
durante 10 min a 3000 g y el sobrenadante (ppp) fue separado en tubos de plaacutestico que se
almacenaron en freezer a -20 ordmC hasta el momento de medida del TP y del TTPa En la tabla
45 se esquematiza el protocolo seguido para las determinaciones del TP y del TTPa del ppp de
cada animal seguacuten indicaciones de los respectivos kits comerciales (Wiener lab Group)
TP
Plasma pobre en plaquetas (ppp)
100 μL en tubo de plaacutestico
Reactivo (Tromboplastina CaCl2 NaCl)
200 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubacioacuten a 37 ordmC durante 2 min
2 Agregar 100 μL de ppp al tubo con reactivo y en simultaacuteneo iniciar el cronometraje
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
TTPa
Plasma pobre en plaquetas (ppp)
100 μL
Reactivo
(Cefalina + tierra de diatomeas)
100 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Agregar 100 μL de ppp al tubo con reactivo e incubar a 37 ordmC durante 3 min
2 Agregar 100 μL de CaCl2 0025 moll (precalentado a 37 ordmC) en simultaacuteneo iniciar el cronometraje y homogeneizar
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 45 Protocolos experimentales para las medidas del TP y del TTPa
Tanto el TP como el TTPa de cada animal corresponden al promedio de los valores
obtenidos en dos determinaciones
44121 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados
Los datos obtenidos se analizaron estadiacutesticamente mediante ANOVA seguido por el
test de Tukey y las diferencias entre los grupos fueron consideradas significativas para un
plt005 () Los caacutelculos fueron efectuados con el programa GraphPadPrism version 50 Los
resultados se expresan como el promedio plusmn SEM
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
100
442 Efecto fibrinogenoliacutetico
El efecto de los preparados proteoliacuteticos sobre el fibrinoacutegeno fue evaluado mediante el
registro electroforeacutetico por la teacutecnica de tricina-SDS-PAGE de los hidrolizados obtenidos al
incubar las mezclas de dichos compuestos
4421 Hidrolizados
Se utilizoacute como sustrato proteico el fibrinoacutegeno bovino (F8630 Sigma Aldrich)
solubilizado en buffer Tris-HCl 0025M pH 8 Las mezclas de reaccioacuten se hicieron de manera
que la concentracioacuten final de fibrinoacutegeno fuera mayor o igual a 1 mgmL a fin de poder detectar
la proteiacutena remanente tras el desarrollo de la electroforesis mientras que las concentraciones
de los preparados proteoliacuteticos se fueron variando en funcioacuten de los perfiles obtenidos Las
mezclas se incubaron a 37 ordmC durante diferentes tiempos y las reacciones fueron finalizadas por
el agregado de aacutecido iodoaceacutetico (inhibidor de cisteiacutenendopeptidasas) y de buffer de muestra
(BM) Finalmente fueron llevadas a ebullicioacuten durante 5 min El procedimiento se resume en la
Tabla 46 y la composicioacuten del buffer de muestra en la Tabla 47
Tabla 46 Finalizacioacuten de la reaccioacuten y preparacioacuten de los hidrolizados resultantes para la corrida electroforeacutetica
Buffer de muestra
Tris 157 g
SDS 4 g
Glicerol 16 mL
Azul de bromofenol 4 mg
β-mercaptoetanol 25 μL
Llevar a pH 68 con HCl 1M
AD csp 100mL
Tabla 47 Composicioacuten del buffer de muestra (BM) AD agua destilada β-mercaptoetanol fue agregado en el
momento de tratar los hidrolizados
Para los blancos de reaccioacuten se respetaron las mismas cantidades de la Tabla 46 pero
se cambioacute el orden en que se agregaron los reactivos (Tabla 48)
Tratamiento de los hidrolizados
1) Hidrolizados 25 μL
2) Acido iodoaceacutetico (11 mM) 5 μL
3) BM 25 μL
4) Llevar a ebullicioacuten 5 min
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
101
Tabla 48 Procedimiento para la preparacioacuten de blancos de reaccioacuten Los voluacutemenes de la solucioacuten del
preparado proteoliacutetico (E) y del fibrinoacutegeno (S) fueron tales que S+E = 25 μL
Las muestras resultantes se conservaron en freezer a -20ordmC hasta el momento de la
siembra
4422 Tricina-SDS-PAGE
Esta teacutecnica electroforeacutetica es muy adecuada para la separacioacuten de polipeacuteptidos y
proteiacutenas en el rango de 1 a 100 kDa y es la preferida para la resolucioacuten de proteiacutenas con pesos
moleculares maacutes pequentildeos que 30 kDa (Schaumlgger 2006) La tricina es utilizada como ion de
arrastre en el buffer catoacutedico permitiendo una mayor resolucioacuten de proteiacutenas pequentildeas a
concentraciones menores de acrilamida que en el caso del buffer Tris-glicina utilizado en la
teacutecnica ideada por Laemmli (1970) La electroforesis con tricina permite una mejor resolucioacuten de
polipeacuteptidos sobre todo en el rango de 5 y 20 kDa sin la necesidad del uso de urea (Schaumlgger
amp von Jagow 1987)
Para el moldeado de geles y la corrida electroforeacutetica se empleoacute el equipo Mini-Protean
III (Bio-Rad) Debido a que el PM de la cadena maacutes grande del fibrinoacutegeno (Aα) es de alrededor
de 65 kDa se eligioacute el sistema de geles que permite resolver mezclas proteicas en el rango 5-
100 kDa que consiste en un gel de resolucioacuten con 10 de T14 y 3 de C15 y en un gel de
apilamiento con 4 de T y 3 de C (Tabla 49)
Las muestras obtenidas seguacuten lo indicado en 4421 fueron centrifugadas durante 10
min a 16000 g y el sobrenadante fue sembrado (5 μL) sobre el buffer catoacutedico (Tris 01M
Tricina 01M SDS 01) contenido en las calles
14
T= (g acrilamida+g bisacrilamida) x 100 volumen total 15
C= g bisacrilamida x 100 (g acrilamida+g bisacrilamida)
Blancos de reaccioacuten
1) Volumen de solucioacuten del preparado proteoliacutetico
E μL
2) Acido iodoaceacutetico (11 mM) 5 μL
3) BM 25 μL
4) Volumen de solucioacuten de fibrinoacutegeno S μL
5) Llevar a ebullicioacuten 5 minutos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
102
Reactivos Gel de apilamiento 4T y 3C
Gel de resolucioacuten 10T y 3C
AcrilBis (4815) 06 mL 2 mL
Buffer del gel 100 mL 33 mL
H2O 34 mL 47 mL
PSA 10 40 μL 50 μL
TEMED 4 μL 5 μL
Tabla 49 Sistema de geles empleado (rango 5-100kDa) Buffer del gel Tris-HCl 3M pH 845 conteniendo SDS 03
PSA persulfato de amonio TEMED NNNacuteNacute-tetrametiletilendiamina
En los reservorios anoacutedicos y catoacutedicos de la celda electroforeacutetica se colocaron buffer
anoacutedico (Tris-HCl 02M pH 89) y buffer catoacutedico respectivamente
La electroforesis fue desarrollada sin refrigeracioacuten El voltaje inicial fue de 30 V y se
mantuvo constante durante el paso de las muestras por el gel de apilamiento cuando las
muestras entraron al gel de resolucioacuten se lo aumentoacute a 100 V valor que se mantuvo constante
hasta que el frente de colorante alcanzoacute el fondo del gel Inmediatamente despueacutes los geles
fueron removidos de las placas y las bandas proteicas visualizadas mediante tincioacuten con
Coomassie para lo cual los geles se dejaron durante 30 min en solucioacuten fijadora (10 vv de
aacutecido aceacutetico 50 vv de metanol) Luego fueron coloreados con solucioacuten colorante (10 vv
de aacutecido aceacutetico 40 vv de metanol y 100 mg de Coomassie Brillant Blue R-250) y
decolorados con una solucioacuten de aacutecido aceacutetico al 10 vv Una vez secos fueron escaneados y
las imaacutegenes reducidas a un tamantildeo y resolucioacuten adecuados en un programa de procesamiento
de imaacutegenes (Adobe Photoshop y Aldus Photostyler) Luego se utilizoacute un software especial
(Scion Image 1998 URL httpwwwscioncorpcom) que convierte la intensidad de color de las
bandas presentes en los geles en datos numeacutericos permitiendo realizar densitogramas de las
calles sembradas
443 Efecto fibrinoliacutetico
4431 Placa de fibrina
A fin de evaluar la actividad fibrinoliacutetica de los preparados proteoliacuteticos se desarrolloacute el
ensayo de la placa de fibrina Este ensayo altamente reproducible y sensible consiste en
depositar gotas de la solucioacuten en ensayo sobre un coaacutegulo de fibrina formado en una placa de
Petri y determinar la cantidad de fibrina degradada midiendo las aacutereas de las zonas lisadas
despueacutes de incubar la placa a 37 ordmC sobre una superficie nivelada en una caacutemara huacutemeda
(Jespersen amp Astrup 1983)
Se siguioacute la teacutecnica desarrollada por Dametto et al (2000) con algunas modificaciones
seguacuten la cual 4 mL de fibrinoacutegeno al 05 en el buffer de reaccioacuten (barbital 0045 M pH 775
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
103
conteniendo CaCl2 166 mM MgCl2 07 mM y NaCl 92 mM) fueron mezclados con 4 mL de una
solucioacuten de agarosa al 2 preparada en el mismo buffer y 02 mL de 20 unidades NIHmL de
trombina todos a 42 ordmC La mezcla fue depositada en una placa de Petri (15 x 9 cm)
homogeneizada mediante movimientos circulares y dejada 1 h a temperatura ambiente para
permitir la correcta formacioacuten y estabilizacioacuten de la fibrina Sobre la superficie del coaacutegulo se
sembraron 10 μL por muestra y luego de incubar en atmoacutesfera huacutemeda a 37ordmC durante 14 h se
midieron 2 diaacutemetros perpendiculares para cada aacuterea de lisis
Se utilizoacute fibrinoacutegeno bovino (F8630 Sigma Aldrich) y trombina bovina (T7513 Sigma
Aldrich) mientras que como control se empleoacute plasmina humana (P1867 Sigma Aldrich) La
concentracioacuten de trombina usada en el ensayo fue obtenida por dilucioacuten de una solucioacuten stock
de trombina (100 unidades NIHmL en solucioacuten de 09 de NaCl y 01 de seroalbuacutemina
bovina) con el buffer de reaccioacuten
4432 Caacutelculos y anaacutelisis de resultados
El aacuterea de la zona circular lisada durante el periacuteodo de incubacioacuten es proporcional a la
cantidad de producto (fibrina lisada) formado enzimaacuteticamente y por tanto una medida de la
actividad fibrinoliacutetica de la solucioacuten sembrada la cual fue estimada como el producto de 2
diaacutemetros perpendiculares (mm2) de la zona lisada (Jespersen amp Astrup 1983) La relacioacuten
entre la concentracioacuten de la enzima (C) y la actividad fibrinoliacutetica (A) tal como fue definida es
A = kCa siendo k y a constantes
Puesto que a es diferente de 1 esta relacioacuten no es una funcioacuten lineal Sin embargo
aplicando logaritmos a ambos miembros de la relacioacuten se obtiene
log A = b + alog C siendo b = log k
Lo cual permite estimar los paraacutemetros k y a de forma maacutes precisa mejorando la
precisioacuten del ensayo El paraacutemetro b expresa la actividad fibrinoliacutetica (como log k) cuando la
concentracioacuten es 1 mientras que el paraacutemetro a expresa impliacutecitamente el mecanismo del
ensayo (Jespersen amp Astrup 1983)
La actividad fibrinoliacutetica fue medida por triplicado para una serie de diluciones de cada
preparado proteoliacutetico y se graficaron las relaciones doble logariacutetmicas entre A y C Los
paraacutemetros de correlacioacuten calculados mediante el programa GraphPadPrism version 50
sirvieron para comparar las actividades fibrinoliacuteticas de los distintos preparados ademaacutes de
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
104
encontrar una correlacioacuten entre la actividad caseinoliacutetica y la actividad fibrinoliacutetica para cada una
de ellas
444 Material vegetal
El contenido proteoliacutetico (UCasmg) y proteico (μg proteiacutenamg) asiacute como la actividad
especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos utilizados se presenta en la Tabla 410
Liofilizados UCasmg μg proteiacutenamg UCasmg proteiacutena
Bh 0275 plusmn 0005 27 plusmn 2 10
Pm 0166 plusmn 0009 34 plusmn 3 5
Bb 0155 plusmn 0008 11 plusmn 1 14
Bromelina (Sigma Aldrich) 068 plusmn 004 205 plusmn 2 33
Tabla 410 Contenido proteoliacutetico (UCasmg) proteico (μg proteiacutenamg) y actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos ensayados UCas unidades caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC) Media plusmn DE
Para todos los ensayos las soluciones de los extractos fueron preparadas por
resuspensioacuten de los liofilizados en agua destilada mientras que la bromelina fue redisuelta en
buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
105
45 Resultados y discusioacuten
451 Efecto anticoagulante 4511 Ensayos in vitro
Con el objetivo de determinar las concentraciones tiempos y voluacutemenes a incubar se
realizaron ensayos preliminares con un uacutenico ppp a partir de cuyos resultados (no mostrados)
se decidioacute que el tiempo de incubacioacuten fuera de 2 min Durante los ensayos con el pool de ppp
las concentraciones que no mostraron resultados concluyentes a los 2 min tambieacuten fueron
ensayadas incubando durante 10 min
Debido a que no todas las concentraciones fueron replicadas en igual nuacutemero eacuteste (n)
se indica en la tabla junto con el valor de la desviacioacuten estaacutendar (DE) Como se mencionoacute cada
replicado corresponde a un ensayo independiente y es el promedio de dos medidas realizadas
dentro de cada ensayo Cuando el coaacutegulo no fue detectado dentro de los 180 s desde el inicio
del cronometraje dichas medidas (indicadas como nc) no fueron tenidas en cuenta para el
anaacutelisis estadiacutestico y por tanto no se contabilizaron dentro del valor de n se decidioacute considerar
este tiempo como un efecto maacuteximo
En las tablas aparecen las concentraciones finales es decir referidas al volumen de
mezcla (pool de ppp + preparado proteoliacutetico)
En la mayoriacutea de los casos ademaacutes de diferencias significativas de los valores de TP y
de TTPa respecto a los del control se detectaron coaacutegulos con una consistencia diferente a la
del coaacutegulo obtenido a partir del pool de ppp sin tratamiento proteoliacutetico Por este motivo se
elaboroacute una escala que contempla las diferentes caracteriacutesticas de los coaacutegulos formados
(Tabla 411) En algunos casos se observoacute que el tiempo en que se detecta el hilo de fibrina
(primer indicio de la formacioacuten de fibrina) difiere maacutes del 5 del tiempo en que se detecta el
coaacutegulo de fibrina En este caso se tomoacute como tiempo de coagulacioacuten el promedio de ambos
tiempos y el hecho fue indicado con la letra D
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
106
Caracteriacutestica del coaacutegulo Nuacutemero de referencia
asignado
Filamentoso (carece del volumen y del aspecto
ldquogelatinosordquo del coaacutegulo normal)
I
Muy fraccionado (maacutes de 6 ldquosubcoaacutegulosrdquo) II
Fraccionado (menos de 6 ldquosubcoaacutegulosrdquo) III
Coaacutegulo uacutenico pero de menor solidez que el del pool
de ppp no tratado (imposibilidad de levantarlo con el ansa)
IV
Tabla 411 Escala en que fueron agrupados los coaacutegulos con caracteriacutesticas diferentes de los normales
45111 Tiempo de Protrombina (TP)
En la Tabla 412 se exponen los valores de TP de un pool de ppp luego de incubarlo con
distintas concentraciones de bromelina a 37 ordmC durante 2 min
Bromelina
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
14 gt180 2
13 82 2 37 I (23) nc (13)
11 615 4 8 D (24)
09 38 4 8 D (24)
065 20 3 1
0 165 4 05
Tabla 412 TP para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones bromelina Resultados del test de
Dunnett plt001 plt0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo
nuacutemero de referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada)
nc TPgt180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
La prolongacioacuten significativa del TP fue acompantildeada con alteracioacuten ya sea en el
intervalo de deteccioacuten del coaacutegulo (D) como en la caracteriacutestica del coaacutegulo (I)
En la tabla 413 se muestran los valores de TP del pool de ppp despueacutes de incubarlo con
distintas concentraciones de Bh a 37 ordmC Luego de incubar el pool de ppp con 35 mgmL
durante 2 min se obtuvieron valores y caracteriacutesticas de coaacutegulo muy dispares entre los
replicados Por esta razoacuten se ensayoacute tambieacuten el tiempo de incubacioacuten de 10 min para 35
mgmL y 25 mgmL suponiendo que quizaacutes Bh requiriera mayor tiempo para llegar a un
equilibrio
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
107
Bh (Incubacioacuten 2 min) Bh (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE Caracteriacutestica del coaacutegulo TP (s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
55 62 2 23 I (23) nc (13)
35 437 4 13 I (24)IV (24)D 345 3 9 I (13)
25 20 3 35 IV 22 3 3 IV
15 175 3 2
0 167 3 06 165 3 06 165
Tabla 413 TP para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bh Resultados test de
Dunnett plt001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo nuacutemero de
referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TPgt180
s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
Sin embargo puede observarse que no ha habido variacioacuten significativa luego de
incubar 10 min respecto de los valores obtenidos al incubar 2 min Al igual que lo observado
para bromelina la prolongacioacuten significativa del TP fue acompantildeado por una alteracioacuten en la
caracteriacutestica del coaacutegulo
En la tabla 414 se muestran los valores de TP del pool de ppp luego de incubarlo con
distintas concentraciones de Bb a 37 ordmC
Bb (Incubacioacuten 2 min) Bb (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TP
(s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
85 58 2 0 I (23) nc (13)
75 58 1 0 I (13) nc (23)
73 437 3 55 46 3 4 I (13)
65 29 3 4
0 15 3 1 16 3 06
Tabla 414 TP para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bb n nuacutemero de replicados
DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo nuacutemero de referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la
frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TPgt180 s Resultados test de Dunnett (Bb incubacioacuten 2
min) plt005 plt0001 Resultado t-test (Bb incubacioacuten 10 min) plt0001
No se observan cambios significativos entre los valores de TP del pool de ppp incubado
a 2 y 10 min para una misma concentracioacuten Sin embargo hay un gran cambio en relacioacuten a la
caracteriacutestica del coaacutegulo cuando se variacutea muy poco la concentracioacuten (de 73 a 75 mgmL) En
este caso siacute hay una concentracioacuten que variacutea significativamente el TP sin alterar (al menos
visiblemente) la caracteriacutestica del coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
108
En la tabla 415 se exponen los valores de TP del pool de ppp luego de incubarlo con
Pm durante 2 min a 37 ordmC No se ha observado alteracioacuten visible en la caracteriacutestica del
coaacutegulo aunque siacute en el intervalo de deteccioacuten del coaacutegulo (D) y al igual que ocurre con Bb
existe una concentracioacuten que provoca una variacioacuten significativa del TP sin alterar la
caracteriacutestica del coaacutegulo
Pm
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
9 gt180 2
8 551 5 10 D (45)
78 563 4 45 D (34)
65 323 3 35
55 215 2 05
0 153 3 07
Tabla 415 TP para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de Pm Resultados test de Dunnett
p lt 005 p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo D diferencia
temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica
mencionada)
45112 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
Los valores de TTPa del pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min a 37 ordmC con
distintas concentraciones de bromelina se muestran en la Tabla 416 La concentracioacuten a partir
de la cual se observa una prolongacioacuten significativa del TTPa es similar a la miacutenima
concentracioacuten que prolonga el TP (asymp 09 mgmL) Si bien se observaron diferencias entre el
tiempo en que se detecta el hilo y el coaacutegulo (D) no se visualizaron cambios en la caracteriacutestica
del coaacutegulo respecto a la de un coaacutegulo normal
Bromelina
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
10 gt180 2
085 523 6 8 D (26)
050 343 3 07
0 364 5 3
Tabla 416 TTPa para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de bromelina Resultados test de
Dunnett p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
109
El TTPa del pool de ppp incubado con distintas concentraciones de Bh durante 2 min a
37 ordmC (Tabla 417) fue prolongado significativamente con concentraciones similares a las que
prolongaron el TP Al igual que lo observado en el ensayo para determinar el TP las
concentraciones que prolongaron el TTPa tambieacuten produjeron cambios visibles en la
caracteriacutestica del coaacutegulo
Bh (Incubacioacuten 2 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
38 gt180 3
35 74 4 8 II (34)I(14)
33 534 5 3 IV D (35)
3 457 3 9 IV
0 397 3 06
Tabla 417 TTPa para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de Bh Resultado test de Dunnett
p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica
la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
En la tabla 418 se presentan los valores de TTPa del pool de ppp luego de incubarlo
con distintas concentraciones de Bb durante 2 y 10 min En comparacioacuten con los resultados del
ensayo de medida de TP puede observarse que las concentraciones que prolongaron
significativamente los TTPas estaacuten dentro del rango de concentraciones que prolongaron los
TPs Sin embargo se observoacute cambio en la caracteriacutestica del coaacutegulo cuando hubo
prolongacioacuten significativa de los tiempos
Bb (Incubacioacuten 2 min) Bb (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DS
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TTPa
(s) n DS
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
85 765 2 5 I nc (13) 70 2 9 I nc (13)
75 58 3 7 IIID (23) 60 3 9 II D (13)
65 45 1 IV
55 407 3 3 IV
0 403 3 2 403 3 2
Tabla 418 TTPa para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bb n nuacutemero de
replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada
de la caracteriacutestica mencionada) nc TTPa gt 180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo Bb
(Incubacioacuten 2 min) plt001 (Dunnett) Bb (Incubacioacuten 10 min) plt005 (t-test)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
110
Los tiempos medidos a los 2 y 10 min no fueron significativamente diferentes mientras
que las caracteriacutesticas de los coaacutegulos formados apenas variaron (de III a II)
Luego de incubar el pool con diferentes concentraciones de Pm durante 2 min no se
encontroacute una concentracioacuten que prolongara significativamente el TTPa antes de que lo hiciera
con un TTPa gt 180 s Siacute se observaron cambios en la caracteriacutestica de los coaacutegulos formados
luego de incubar el pool con cada concentracioacuten ensayada (Tabla 419) Cuando se incuboacute
durante 10 min la concentracioacuten de 45 mgmL prolongoacute significativamente el TTPa que resultoacute
ser mayor al TTPa luego de incubar el pool durante 2 min con la misma concentracioacuten Si se
comparan las tablas 415 y 419 se puede observar que la concentracioacuten que prolongoacute maacutes allaacute
de 180 s el TP fue aproximadamente dos veces mayor que la necesaria para prolongar a maacutes
de 180 s el TTPa lo cual estariacutea indicando una mayor especificidad de Pm hacia alguno de los
componentes de la viacutea intriacutenseca que de la extriacutenseca
Pm (Incubacioacuten 2 min) Pm (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) N DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
5 60 2 0 I nc (13)
45 433 3 4 III D (23) 757 3 13 II D (23)
4 362 3 3 IV D (23)
25 362 2 04 D
0 41 3 06 41 3 07
Tabla 419 TTPa para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Pm Resultados t- test p
lt 005 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la
frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TTPa gt 180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de
hilo y coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
111
Para facilitar la comparacioacuten de los efectos de los preparados proteoliacuteticos sobre el TP y
el TTPa se graficaron las relaciones TPpTPc y TTPapTTPac en funcioacuten de la actividad
proteoliacutetica (UCas) de los preparados (Figura 46)
Figura 46 Tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) del pool de ppp luego de
incubarlo con los preparados (TPp TTPap respectivamente) respecto a los tiempos del control (TPc TTPac
respectivamente) en funcioacuten de las UCasmL de bromelina (Bro) y de los preparados de Bromelia balanse (Bb) B
hieronymi (Bh) y Pseudananaacutes macrodontes (Pm) Media plusmn SEM Las liacuteneas verticales con la flecha correspondiente
indican la miacutenima concentracioacuten del preparado respectivo en que no se detecta el coaacutegulo antes de 180 s
El hecho de que la caracteriacutestica del coaacutegulo (I II III IV) variara en relacioacuten a la
concentracioacuten y al preparado con el cual se incuboacute ademaacutes de la alteracioacuten en el intervalo de
deteccioacuten del coaacutegulo (D) dificultoacute las medidas de los tiempos y aportoacute una variabilidad
cualitativa que afectoacute la variabilidad de los tiempos principalmente cuando fueron cercanos al
nc Esto dificultoacute la comparacioacuten entre los efectos de los preparados asiacute como establecer
00 05 10 15
2
4
6
Bro
Bh
Bb
Pm
088 116 15215
I
D
D
DIV
I
IV
I DD
UCasmL
TP
pT
Pc
00 05 10 1505
10
15
20
25
30
Bro
Bh
Bb
Pm
083 132068 104
I
DIII
IV
D
II
IVIV
DIV
DIII
I
DIVD
UCasmL
TT
Pa
pT
TP
ac
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
112
concentraciones efectivas pero de todos modos no impidioacute obtener algunas conclusiones tal
como se indica a continuacioacuten
En todos los casos de un corto rango de concentraciones que alteraron
progresivamente la caracteriacutestica normal del coaacutegulo se pasoacute bruscamente a TP y TTPa
prolongados a maacutes de 10 y 4 veces respectivamente
Para todos los preparados hubo alguna concentracioacuten que ademaacutes de prolongar el TP y
el TTPa modificoacute la caracteriacutestica del coagulo o afectoacute el intervalo de deteccioacuten del mismo (D)
Esto podriacutea estar indicando un efecto directo sobre la estructura de la fibrina yo puesto que
eacutesta depende fuertemente de la concentracioacuten asiacute como de la estructura del fibrinoacutegeno
(Lauricella 2007) tambieacuten sobre la del fibrinoacutegeno Dado que la creciente evidencia apoya el
concepto de que las caracteriacutesticas estructurales de la fibrina pueden representar un nuevo
factor de riesgo para el tromboembolismo arterial y venoso (Undas amp Arieumlns 2011) el
acompantildeamiento de alteraciones en el coaacutegulo al efecto anticoagulante puede resultar una
desventaja De todos modos esto soacutelo podraacute ser determinado mediante estudios que empleen
modelos de trombosis
Otra informacioacuten que se puede obtener de la Figura 46 es que teniendo en cuenta las
actividades proteoliacuteticas de cada preparado la bromelina ha sido la maacutes potente Se requirieron
088 (plusmn 005) 116 (plusmn 006) 15 (plusmn 008) y 152 (plusmn 003) UCasmL de bromelina Bb Pm y Bh
respectivamente para prolongar el TP a maacutes de 180 s yo producir un coaacutegulo Tipo I En tanto
que para prolongar el TTPa a maacutes de 180 s (yo coaacutegulo Tipo I) se requirieron 068 (plusmn 004)
083 (plusmn 004) 104 (plusmn 002) y 132 (plusmn 007) UCasmL de bromelina Pm Bh y Bb
respectivamente Pareceriacutea existir cierta especificidad de cada preparado proteoliacutetico hacia una
u otra viacutea del modelo claacutesico de la coagulacioacuten Por ejemplo 083 UCasmL de Pm son
suficientes para prolongar el TTPa a maacutes de 180 s mientras que el mismo efecto sobre el TP
requirioacute 152 UCasmL de Pm Algo similar ocurre para los demaacutes preparados
Probablemente estas diferencias se pudieron deber a componentes diferentes a las
proteasas cisteiacutenicas presentes en los preparados Para poner a prueba dicha suposicioacuten y
determinar si el efecto anticoagulante es debido a la accioacuten de proteasas cisteiacutenicas se
determinoacute el TP y el TTPa del pool de ppp luego de incubarlo con soluciones de los preparados
tratados y no tratados con E-64
45113 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de los preparados proteoliacuteticos
sobre su efecto anticoagulante
En las Figuras 47 y 48 se muestran el TP y el TTPa respectivamente del pool de ppp
luego de incubarlo durante 2 min a 37 ordmC con las soluciones de bromelina Bh Bb y Pm antes y
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
113
despueacutes de inhibir sus cisteiacutenendopeptidasas Las concentraciones ensayadas fueron un 10
mayor que aquellas que prolongaban el TP y el TTPa por encima de 180 s En la Tabla 420 se
muestran los valores de actividad caseinoliacutetica de las soluciones de bromelina Bh Pm y Bb
antes y despueacutes de tratarlas con E-64 (035 mM) El TP y el TTPa del control fue obtenido luego
de incubar durante 2 min a 37 ordmC 100 μL del pool de ppp con 10 μL de 035 mM de E-64 en
buffer fosfato soacutedico 01M pH 6
Figura 47 TP de un pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min con Bro (155 mgmL) Bh (6 mgmL) Bb (95 mgmL) y Pm (95 mgmL) inactivas (Con E-64) y activas (Sin E-64) proteoliacuteticamente Valores expresados como la media plusmn DE (n = 3) excepto para los grupos Sin E-64 cuyos TP fueron mayores a 180 s Resultado test de Dunnett entre el grupo Con E-64 y el grupo Control p lt 005
Figura 48 TTPa de un pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min con Bro (11 mgmL) Bh (45 mgmL) Bb (95 mgmL) y Pm (65 mgmL) inactivas (Con E-64) y activas (Sin E-64) proteoliacuteticamente Valores expresados como la media plusmn DE (n=3) excepto para los grupos Sin E-64 cuyos TTPa fueron mayores a 180 s Resultado test de Dunnett entre el grupo Con E-64 y el grupo Control p lt 001 p lt 0001
0
50
100
150
Sin E-64Con E-64Control
Bro(155 mgmL)
Bh(6 mgmL)
Bb(95 mgmL)
Pm(95 mgmL)
180
TP
(s)
0
50
100
150
Con E-64
Control
Sin E-64
180
Bro(11 mgmL)
Bh(45 mgmL)
Bb(95 mgmL)
Pm(65 mgmL)
TT
Pa (
s)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
114
Puede observarse que la prolongacioacuten del TP y del TTPa del pool de ppp luego de
incubarlo con cada preparado es debida preponderantemente a la actividad proteoliacutetica de
proteasas cisteiacutenicas Sin embargo el efecto anticoagulante de Bb y Pm no revirtioacute
completamente cuando sus proteasas fueron inhibidas lo cual podriacutea indicar la presencia de
otro componente anticoagulante presente en los preparados Esto es maacutes notable para el TTPa
medido luego de incubar el pool con Pm sin actividad proteoliacutetica (TTPapTTPac igual a 215) lo
cual sumado a que el TP no es afectado por Pm inhibido es coherente con el hecho de que se
requiere mayor UCasmL para prolongar el TP que para prolongar el TTPa Bb inhibido tambieacuten
prolongoacute significativamente el TP y el TTPa aunque las relaciones TPpTPc y TTPapTTPac
fueron maacutes bajas (13 y 14 respectivamente) Un dato importante es que la caracteriacutestica de
los coaacutegulos formados a partir del pool tratado con los preparados inhibidos no mostroacute
diferencias respecto a la caracteriacutestica de un coaacutegulo normal Esto estariacutea indicando que las
alteraciones observadas (I II III IV D) en los coaacutegulos formados desde el pool tratado con los
preparados se debieron a la accioacuten de las proteasas
Liofilizados Solucioacuten (mgmL) Sin E-64 (UCasmL) Con E-64 (UCasmL)
Bro 204 14 plusmn 02 -045 plusmn 027
Bh 100 273 plusmn 04 -03 plusmn 02
Bb 160 244 plusmn 06 -06 plusmn 03
Pm 100 165 plusmn 01 -02 plusmn 01
Tabla 420 Actividad proteoliacutetica frente al sustrato caseiacutena de las soluciones de Bro Bh Bb y Pm antes (Sin E-64) y
despueacutes (Con E-64) de ser tratadas con 035 mM de E-64 durante 30 min a 37ordmC Los valores son expresadas como la media plusmn DE (n = 3) UCas unidades caseinoliacuteticas a 37 ordmC en buffer Tris-ClH 01M pH 75
Otra causa posible que pudiera explicar el efecto anticoagulante de los preparados
tratados con E-64 es que haya quedado una actividad proteoliacutetica remanente que no haya sido
detectada por el ensayo de actividad caseinoliacutetca Puesto que la teacutecnica de la placa de fibrina
es muy sensible tambieacuten se evaluoacute la actividad fibrinoliacutetica de las soluciones de bromelina Bh
Bb y Pm inhibidas con E-64 Sin embargo tampoco pudo detectarse actividad frente a fibrina
4512 Ensayos in vivo
Las dosis de bromelina Bh Bb y Pm administradas a los animales fueron estimadas
teniendo en cuenta los resultados de los ensayos in vitro y la relacioacuten plasmapeso corporal
establecida para ratas Wistar por Bijsterbosch et al (1981) seguacuten la cual
volumen de plasma (mL) = 00291PC(g) + 254 donde PC es el peso corporal
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115
Como primera aproximacioacuten se definioacute una misma dosis en UCaskg de bromelina Bh
Bb y Pm a fin de poder compararlas La dosis que se eligioacute fue aquella que en los ensayos in
vitro para todos los preparados evaluados prolongara el TP y el TTPa maacutes de 180 s De la
informacioacuten provista por la figura 46 se puede concluir que a partir de la concentracioacuten de 155
UCasmL de plasma se cumple con dicho requisito Por tanto se optoacute por una dosis de 2
UCasmL de plasma equivalente a 633 UCaskg de animal (aplicando la ecuacioacuten antes
mencionada) que fue redondeada a 65 UCaskg
En la Figura 49 se exponen los valores de TP y de TTPa de ppp extraiacutedos luego de 4 h
de la administracioacuten intraperitoneal de los preparados proteoliacuteticos El tiempo de 4 h fue
establecido de experimentos previos con bromelina
Figura 49 TP y TTPa de ppp obtenido de ratas Wistar luego de 4h de la administracioacuten intraperitoneal de 65 UCaskg de bromelina (Bro) Bh Bb y Pm Valores expresados como la media plusmn SEM Nuacutemero de replicados (n) 6 (Control Bh Pm) 5 (Bro y Bb) Tukeyacutes test p lt 005 p lt 001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt005
Aunque todos los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos mostraron valores
prolongados de TP y de TTPa respecto a los de los lotes controles soacutelo fueron significativos
(plt005) los tiempos de los lotes tratados con bromelina y el TP del lote tratado con Bb los
cuales significaron alrededor de un 20 de los tiempos del lote control Por otra parte los
tiempos de los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos no se diferenciaron
significativamente entre siacute Tampoco se detectaron alteraciones en los coaacutegulos durante las
medidas de TP y de TTPa
Los resultados obtenidos en los experimentos in vivo e in vitro (Figura 46) coinciden en
que la bromelina ha sido la maacutes efectiva frente a TTPa y a TP y en que Bb es maacutes efectivo para
prolongar el TP que el TTPa De todos modos debe tenerse en cuenta que estos resultados
soacutelo sirven como una primera aproximacioacuten en la determinacioacuten de dosis efectivas
Control Bro Bh Bb Pm 0
10
20
30aa
cca ca
TP
(s)
Control Bro Bh Bb Pm 0
10
20
30
ca
a
cca
ca
TT
Pa (
s)
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116
452 Efecto fibrinogenoliacutetico
En la Figura 410 se muestran las electroforesis junto al densitograma respectivo de los
hidrolizados obtenidos luego de incubar 200 μL de fibrinoacutegeno bovino 12 mgmL con 075 μL de
cada preparado proteoliacutetico equivalente a 1 UCasmL durante 2 30 60 90 120 y 180 min a 37
ordmC El tiempo 0 min corresponde al blanco de reaccioacuten resultante de inactivar el preparado
proteoliacutetico con iodoaceacutetico y buffer de muestra antes de mezclarlo con la solucioacuten de
fibrinoacutegeno
La similitud entre los perfiles electroforeacuteticos obtenidos con todos los preparados estariacutea
indicando una similar actividad proteoliacutetica frente al fibrinoacutegeno ya sea por la preferencia de
sustrato como por la velocidad de reaccioacuten La primera subunidad en ser degradada
completamente fue Aα hecho observado para todos los preparados a los 2 min de incubacioacuten
Le siguioacute Bβ a los 30 min mientras que la subunidad γ fue la maacutes resistente permaneciendo
intacta durante 180 min de incubacioacuten con cada preparado Otra caracteriacutestica comuacuten
observada en todas las electroforesis fue la presencia de un polipeacuteptido de alrededor de 30
kDa aunque en menor cantidad luego de incubar con Bh que probablemente sea producto de
degradacioacuten de la subunidad Bβ puesto que aparece luego de su desaparicioacuten
Para determinar si la resistencia de la subunidad γ a ser degradada por los preparados
es absoluta se incuboacute el fibrinoacutegeno con una concentracioacuten mayor de cada preparado de
manera de aumentar en 100 veces la relacioacuten enzimasustrato Los perfiles electroforeacuteticos
obtenidos luego de incubar 68 μL de fibrinoacutegeno 34 mgmL con 7 μL de 10 UCasmL de cada
preparado durante 10 y 120 min a 37 ordmC se muestran en la Figura 411
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117
Figura 410 Tricina-SDS-PAGE de fibrinoacutegeno bovino antes (calle 2) y luego de incubarlo a 37ordmC durante 2 30 60 90 120 y 180 min (calles 4 5 6 7 8 y 9 respectivamente) con bromelina (Bro) Bh Bb y Pm Calle 3 blanco de reaccioacuten (0 min) Calle 1 patrones de peso molecular (Bio-Rad) A la derecha de cada electroforesis se encuentra el densitograma respectivo Son indicadas con flechas las subunidades Aα (α) Bβ (β) y γ del fibrinoacutegeno
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Bro
a b g
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Bh
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)Bb
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Pm
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
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118
Figura 411 Tricina-SDS-PAGE de fibrinoacutegeno bovino antes (calle 2) y luego de incubarlo a 37ordmC durante 10 y 120
min con bromelina (Bro) Bh Bb y Pm (calles 3 4 5 y 6 respectivamente) Calle 1 patrones de peso molecular (Bio-Rad) A la derecha de cada electroforesis se encuentra el densitograma respectivo Son indicadas con flechas las subunidades Aα Bβ y γ del fibrinoacutegeno
Puede observarse que hubo una disminucioacuten en la banda correspondiente a la
subunidad γ a partir de los 10 min de incubacioacuten con cada preparado y que siguioacute disminuyendo
hasta casi desaparecer a los 120 min lo cual confirma que si bien la subunidad γ es altamente
resistente a la accioacuten de las proteasas finalmente es susceptible de ser degradada
A diferencia de lo observado en los ensayos de medidas del efecto anticoagulante la
misma cantidad de UCasmL de cada preparado tuvo un efecto similar sobre el fibrinoacutegeno
Esto puede deberse a que en el plasma cada preparado puede actuar tambieacuten sobre otros
componentes del sistema hemostaacutetico como asiacute tambieacuten pueden ser inhibidos de manera
diferente por α2-MG
Si bien el efecto fibrinogenoliacutetico fue evaluado usando fibrinoacutegeno bovino dada la
escasa diferencia estructural y funcional entre los fibrinoacutegenos de diferentes especies (Weisel
2005) el efecto sobre la subunidad Aα puede servir para explicar la alteracioacuten del coaacutegulo
formado luego de incubar el pool de ppp con los preparados La regioacuten C-α de Aα una vez
producida la liberacioacuten de los fibrinopeacuteptidos A y B produce la agregacioacuten lateral de microfibras
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
10 min
120 min
a b g
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) Bro(4) Bh
(5) Bb(6) Pm
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(4) Bh
(5) Bb(6) Pm
(3) Bro
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119
de fibrina contribuyendo al espesor de la fibra la resistencia a la traccioacuten de la fibrina (Undas amp
Arieumlns 2011) y la rigidez macroscopia observada (Purohit et al 2011)
Por otro lado dado que el fibrinoacutegeno une las plaquetas favoreciendo la agregacioacuten
plaquetaria se podriacutea suponer que Bh Bb y Pm a traveacutes de su accioacuten fibrinogenoliacutetica
afectaraacuten dicho proceso
453 Efecto fibrinoliacutetico
El efecto de los preparados sobre la fibrina fue evaluado mediante el ensayo de la placa
de fibrina En la Figura 412 se muestran los graacuteficos en escala doble logariacutetmica de
(a) la actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la actividad caseinoliacutetica (UCasmL) y
(b) la actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas (μgmL)
Figura 412 Ensayo de la placa de fibrina a Actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la actividad
caseinoliacutetica (UCasmL) y b actividad fibrinoliacutetica en funcioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas (μgmL) de bromelina (Bro) Bh Bb Pm y plasmina en escala doble logariacutetmica (Log-Log) Valores expresados como la media plusmn DE
En las tablas 421 y 422 se muestran los paraacutemetros de correlacioacuten lineal
(GraphPadPrism) determinados para cada preparado seguacuten la relacioacuten log A = b + alog C
siendo A la actividad fibrinoliacutetica y C la concentracioacuten del preparado (Jespersen amp Astrup
1983)
Actividad fibrinoliacutetica-Actividad caseinoliacutetica
Paraacutemetros Bro Bh
Bb
Pm
a 022c plusmn 002 063
a plusmn 003 063
a plusmn 004 052
b plusmn 002
b 417 plusmn 001 369 plusmn 002 368 plusmn 003 378plusmn 002
r2
09017 09775 09639 09767
N 12 14 11 13
Tabla 421 Paraacutemetros de correlacioacuten lineal de la relacioacuten Log-Log entre actividad fibrinoliacutetica y actividad
caseinoliacutetica a pendiente b Log A (cuando C=1 UCasmL) N nuacutemero de puntos Letras superiacutendices distintas indican diferencias significativas (p lt 005)
a b
-05 00 05 10 1530
35
40
45
50
Actividad caseinoliacutetica (UCasmL)
Ac
tiv
ida
d f
ibri
no
liacuteti
ca
(m
m2m
L)
1 2 3 430
35
40
45
50
Pm
Bh
Bro
Plasmina
Bb
Concentracioacuten de proteiacutenas (gmL)
Ac
tiv
ida
d f
ibri
no
liacuteti
ca
(m
m2m
L)
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Actividad fibrinoliacutetica-Proteiacutenas
Paraacutemetros Bro Bh Bb
Pm Plasmina
a 022c plusmn 002 062
b plusmn 004 062
b plusmn 004 052
b plusmn 002 023
c plusmn 002
b 363 plusmn 007 24 plusmn 01 26 plusmn 01 261plusmn 006 388plusmn 003
r2
08884 09586 09624 09812 09575
N 12 14 11 13 8
Tabla 422 Paraacutemetros de correlacioacuten lineal de la relacioacuten Log-Log entre actividad fibrinoliacutetica y proteiacutenas a
pendiente b Log A (cuando C=1 μgmL) N nuacutemero de puntos Letras superiacutendices distintas indican diferencias significativas (p lt 005)
Tanto para la relacioacuten entre actividad fibrinoliacutetica y actividad caseinoliacutetica como para la
relacioacuten entre actividad fibrinoliacutetica y proteiacutenas puede observarse que la pendiente a y la
ordenada al origen b de Bh Bb y Pm fueron similares entre siacute y diferentes significativamente de
las de bromelina En la tabla 422 se puede observar que bromelina y plasmina tuvieron
similares pendientes a lo cual permite expresar la actividad fibrinoliacutetica de la bromelina en
unidades de plasmina (Jespersen amp Astrup 1983) En este caso 1 μg de bromelina equivale a
007 μg de plasmina humana (P1867 Sigma Adrich)
La existencia de diferentes pendientes estariacutea indicando diferentes mecanismos
intriacutensecos (Jespersen amp Astrup 1983) En este sentido un factor que puede estar influyendo en
el valor del aacuterea de lisis ademaacutes de la actividad proteoliacutetica es la difusioacuten de las proteasas en
la red de fibrina Puesto que todas las proteasas tienen pesos moleculares similares (entre 22 y
25 kDa) y que las soluciones ensayadas de Bh Bb y Pm se prepararon al disolver el liofilizado
(a partir de una solucioacuten de buffer fosfato soacutedico 01M pH 6) en agua mientras que la bromelina
se disolvioacute en buffer de placa (barbital 0045 M pH 775 NaCl 92 mM) se supuso que el medio
de resuspensioacuten podriacutea estar influyendo Sin embargo no se encontraron diferencias
significativas entre las aacutereas de lisis medidas para bromelina disuelta en diferentes molaridades
del buffer fosfato soacutedico de pH 6 (BF) respecto al aacuterea medida para la bromelina disuelta en el
buffer de placa (BP) como asiacute tampoco se hallaron diferencias significativas entre las
pendientes y las ordenadas al origen de las curvas de actividad fibrinolitica en relacioacuten a la
concentracioacuten de bromelina disuelta en BF o BP (Figura 413)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
121
Figura 413 Efecto del buffer de resuspensioacuten sobre la actividad fibrinoliacutetica de bromelina A Actividad fibrinoliacutetica (mm
2mL) en funcioacuten de la concentracioacuten (mgmL) en escala doble logariacutetmica BF buffer fosfato soacutedico 01 M pH 6
B Actividad fibrinoliacutetica (mm2gota sembrada) para 35 mgmL de bromelina disuelta en diferentes molaridades de BF
de pH 6 Valores expresados como la media plusmn DE
Por lo tanto puede concluirse que bromelina demuestra poseer una mayor actividad
fibrinoliacutetica que Bh Bb y Pm para concentraciones menores a 10 UCasmL mientras que para
concentraciones mayores a 10 UCasmL Bh Bb y Pm tendriacutean mayor actividad fibrinoliacutetica que
bromelina
Una comparacioacuten de la actividad fibrinoliacutetica (412 a) y del efecto anticoagulante (Figura
46) de los preparados permite observar que para prolongar el TP y el TTPa a maacutes de 180 s
bromelina requirioacute aproximadamente 3 veces maacutes de actividad fibrinoliacutetica (entre 136 x103 y
144 x103 mm2mL) que Bh Bb y Pm (entre 52 x103 y 64 x103 mm2mL) Expresado en otros
teacuterminos bromelina muestra mayor efecto fibrinoliacutetico que Bh Bb y Pm sin afectar el TP y el
TTPa lo cual podriacutea llevar a suponer que resultariacutea maacutes ventajosa como agente fibrinoliacutetico
para el tratamiento de algunos de los desoacuterdenes tromboacuteticos (Merli 2007) Sin embargo se
trata de una comparacioacuten entre dos sistemas distintos que tampoco presentan la complejidad
de una trombosis Futuros ensayos fundamentalmente en modelos in vivo son necesarios para
afianzar o descartar estos resultados preliminares
Actividad fibrinoliacutetica de Bromelina (35mgmL)Efecto del buffer de resuspensioacuten
005M 02M 04M Buffer de placa0
50
100
150
200
250
Buffer fosfato soacutedico pH 6
Buffer de resuspensioacuten
mm
2
BromelinaEfecto del buffer de resuspensioacuten
00 05 10 1540
41
42
43
44
45
BF (01M)
BP (005 M)
Concentracioacuten (mgmL)
Acti
vid
ad
fib
rin
oliacuteti
ca (
mm
2m
L)
A B
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
122
46 Conclusiones
Todos los preparados mostraron actividad anticoagulante en los ensayos in vitro efectos
completamente atribuibles a la accioacuten proteoliacutetica de las cisteiacutenendopeptidasas
presentes en Bh y Bro pero parcialmente a las cisteiacutenendopeptidasas de Pm y Bb
Bromelina Bh y Pm fueron maacutes efectivas para prolongar el TTPa de un pool de ppp que
el TP mientras que Bb fue maacutes efectiva para prolongar el TP que el TTPa
Para todos los preparados el efecto sobre el TP y sobre el TTPa fue acompantildeado de un
efecto sobre la caracteriacutestica del coaacutegulo formado (filamentoso fraccionado fraacutegil) el
cual revirtioacute cuando las proteasas fueron inhibidas con E-64
En los ensayos in vivo soacutelo bromelina y Bb con dosis equivalentes en unidades
caseinoliacuteticas tuvieron un leve efecto anticoagulante
Todos los preparados con unidades caseinoliacuteticas equivalentes degradaron el
fibrinoacutegeno con una cineacutetica similar siendo la subunidad Aα la primera en ser degradada
y γ la maacutes resistente
Todos los preparados mostraron accioacuten fibrinoliacutetica siendo maacutes efectiva la bromelina
para concentraciones menores a 10 UCasmL
La bromelina mostroacute un comportamiento similar frente a la fibrina que la plasmina
Los resultados obtenidos en los ensayos permiten concluir que Bh Pm y en especial Bb
podriacutean tener un potencial efecto antitromboacutetico y tromboliacutetico hecho que deberaacute
evaluarse en otros modelos experimentales
Los resultados obtenidos para Bh Pm y Bb pueden ser de utilidad para el disentildeo de
futuros ensayos a los fines de establecer su efectividad como agentes para el
tratamiento de trombosis
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
125
51 Las causas de la aparicioacuten del caacutencer
El caacutencer sigue siendo una de las enfermedades que maacutes preocupan a la
humanidad auacuten cuando no ocupe el primer lugar entre las principales causas de muerte en
el mundo Si bien la ciencia ha ido aportando sucesivos conocimientos en diferentes
aspectos hecho que ha permitido incrementar los mecanismos de prevencioacuten y de
tratamiento se encuentra auacuten sin respuesta la pregunta relacionada con las verdaderas
causas de la enfermedad (Gibbs 2003) Una explicacioacuten posible es que una ceacutelula debe
adquirir habilidades extraordinarias para convertirse en ceacutelula maligna hace poco maacutes de
una deacutecada Hahn amp Weinberg (2002) describieron las condiciones que debe reunir una
ceacutelula normal para convertirse en canceriacutegena a las que denominaron ldquolos seis
superpoderes diaboacutelicos del caacutencerrdquo ilustrados en la Figura 51 y que se describen a
continuacioacuten
1 Crecimiento en ausencia de sentildeales La mayoriacutea de las ceacutelulas normales esperan un
mensaje externo antes de comenzar a dividirse Las ceacutelulas cancerosas a menudo
falsifican sus propios mensajes pro-crecimiento
2 Crecimiento a pesar de oacuterdenes de detencioacuten A medida que el tumor se expande
comprime al tejido adyacente el cual enviacutea mensajes quiacutemicos que normalmente
detienen la divisioacuten celular Las ceacutelulas malignas ignoran tales oacuterdenes asiacute como los de
sus propios mecanismos internos de envejecimiento
3 Evasioacuten de los mecanismos de autodestruccioacuten En las ceacutelulas sanas el dantildeo geneacutetico
por encima de un nivel criacutetico usualmente activa un programa suicida Las ceacutelulas
cancerosas eluden este mecanismo aunque a veces algunos agentes del sistema
inmune pueden obligar a las ceacutelulas cancerosas a autodestruirse
4 Construccioacuten de nuevos vasos sanguiacuteneos Los tumores necesitan oxiacutegeno y nutrientes
para sobrevivir que obtienen obligando a que los vasos sanguiacuteneos vecinos formen
nuevas ramas que se desarrollen a lo largo de la masa tumoral en crecimiento
5 Inmortalidad efectiva Las ceacutelulas sanas usualmente no se dividen maacutes de 70 veces pero
las ceacutelulas malignas necesitan un nuacutemero mayor de divisiones para formar tumores El
envejecimiento celular parece estar relacionado con los teloacutemeros ubicados a ambos
extremos de cada cromosoma La telomerasa permite mantener la longitud normal de los
teloacutemeros solamente en ceacutelulas sexuales no en el resto de las ceacutelulas del organismo Sin
embargo las ceacutelulas canceriacutegenas son capaces de desarrollar actividad telomeraacutesica lo
que praacutecticamente las torna inmortales
6 Poder para invadir otros tejidos y extenderse a otros oacuterganos Cuando las ceacutelulas
cancerosas logran deshabilitar el circuito celular que las confina a una parte especiacutefica
del oacutergano en el cual se generaron se manifiesta la capacidad de invadir los tejidos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
126
cercanos y provocar metaacutestasis en partes lejanas de su ubicacioacuten original lo que le da al
caacutencer su caraacutecter letal
Figura 51 Ilustracioacuten de las seis principales capacidades desarrolladas por las ceacutelulas caacutenceriacutegenas (tomado de
Hanahan amp Weinberg 2011)
A favor de la manifestacioacuten de estas caracteriacutesticas de las ceacutelulas tumorales juega un
rol fundamental la inestabilidad del genoma que genera la diversidad geneacutetica que facilita
su aparicioacuten asiacute como la inflamacioacuten que tambieacuten fomenta muacuteltiples funciones distintivas
Como resultado del avance conceptual en la uacuteltima deacutecada se han antildeadido dos nuevas
caracteriacutesticas a las seis capacidades de las ceacutelulas tumorales antes sentildealadas
involucradas en la patogeacutenesis de algunos y quizaacutes de todos los tipos de caacutencer la
reprogramacioacuten del metabolismo energeacutetico y la capacidad de evadir la destruccioacuten inmune
La primera de ellas consiste en la capacidad de modificar o reprogramar el metabolismo
celular con el fin de apoyar maacutes eficazmente la proliferacioacuten neoplaacutesica La segunda permite
que las ceacutelulas cancerosas puedan evadir la destruccioacuten inmunoloacutegica en particular por
linfocitos T y B macroacutefagos y ceacutelulas asesinas naturales (ldquonatural killersrdquo) Por otra parte la
inflamacioacuten generada por las ceacutelulas inmunes disentildeadas para combatir las infecciones
quizaacutes pueda dar apoyo accidental a las muacuteltiples capacidades de las ceacutelulas tumorales
Pero ademaacutes de las ceacutelulas cancerosas los tumores muestran otra dimensioacuten de
complejidad ya que poseen un repertorio de ldquoceacutelulas reclutadasrdquo ostensiblemente normales
pero que contribuyen a la adquisicioacuten de los rasgos caracteriacutesticos mediante la creacioacuten del
microambiente del tumor (Hanahan amp Weinberg 2011)
52 Epidemiologiacutea del caacutencer
Como se ha mencionado el caacutencer es una de las principales causas de muerte en el
mundo Seguacuten un informe del antildeo 2008 de la Agencia Internacional de Investigacioacuten sobre
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
127
el Caacutencer (IARCWHO 2008) esta enfermedad produjo 76 millones de muertes (alrededor
del 13 del total) de las cuales aproximadamente el 70 ocurrieron en paiacuteses de bajo y
medianos recursos Sin embargo si se evaluacutean las tasas estandarizadas por edad (ASR) de
muerte por caacutencer (excluyendo el caacutencer de piel con histologiacutea distinta al melanoma) cada
100000 habitantes eacutestas no pueden ser correlacionadas con el nivel de ingreso de los
paiacuteses (Figura 52)
Figura 52 Tasa estandarizada por edad (ASR) de mortalidad por caacutencer para ambos sexos cada 100000 habitantes distribuidas por paiacuteses estimadas en el 2008 Fuente IARCWHO 2008
Puede verse que Argentina en relacioacuten al resto del mundo se encuentra en un nivel
medio-alto de mortalidad por caacutencer De acuerdo a un estudio de la Organizacioacuten Mundial
de la Salud (WHO 2011) en nuestro paiacutes el caacutencer representa la segunda causa de muerte
(20) despueacutes de las producidas por las enfermedades cardiovasculares (33) Respecto
a la incidencia de caacutencer (IARCWHO 2008) Argentina ocupa el mismo nivel (medio-alto)
seguacuten las ASR de incidencia de caacutencer cada 100000 habitantes (Figura 53)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Figura 53 Tasa estandarizada por edad (ASR) de incidencia de caacutencer para ambos sexos cada 100000
habitantes distribuidas por paiacuteses estimadas en el 2008 Fuente Fuente IARCWHO 2008
53 Carcinoma Hepatocelular
Dentro de los distintos tipos de caacutencer el carcinoma hepatocelular (CHC) tiene la
seacuteptima ASR de incidencia y la cuarta ASR de mortalidad maacutes alta en el mundo ambas
calculadas al 2008 cada 100000 habitantes y para ambos sexos constituyendo la tercer
causa de muerte por caacutencer Por su parte en Argentina la ASR de incidencia y de mortalidad
ocupan los lugares 16deg y 12deg respectivamente lo cual la ubica en el grupo de paiacuteses con
nivel medio-bajo de incidencia de CHC Tomando el nivel de ingresos de los paiacuteses seguacuten el
Banco Mundial los paiacuteses con niveles de ingresos bajo o medio-bajo son los que
presentaron una mayor ARS de incidencia de CHC (GHOWHO 2008)
531 Factores de riesgo
La heterogeneidad en la incidencia mundial refleja las variaciones en los principales
factores de riesgo de CHC En Asia oriental y en Aacutefrica subsahariana el factor de riesgo
dominante es la infeccioacuten croacutenica con el virus de la hepatitis B (HBV) junto con la exposicioacuten
a la aflotoxina B1 responsables del 80 de los casos de CHC En cambio en Ameacuterica del
Norte Europa y Japoacuten el principal factor de riesgo es la infeccioacuten con el virus de la hepatitis
C junto con la ingesta de alcohol (Forner et al 2012)
En el 70-90 de los pacientes el CHC se desarrolla dentro de una enfermedad
hepaacutetica croacutenica subyacente La infeccioacuten croacutenica con HBV constituye el factor de riesgo
maacutes frecuente el cual se da en maacutes del 50 de los casos con CHC En pacientes con
cirrosis el CHC constituye la principal causa de muerte (Forner et al 2012) Otros factores
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
129
de riesgo son la enfermedad del hiacutegado graso no alcohoacutelico y la diabetes (Stickel amp
Hellerbrand 2010)
532 Patogeacutenesis molecular
El CHC es un tumor epitelial desarrollado a partir de los hepatocitos La
hepatocarcinogeacutenesis es un proceso complejo de muacuteltiples pasos durante el cual se alteran
varias cascadas de sentildealizacioacuten relacionadas con la supervivencia y la proliferacioacuten celular
generando un perfil molecular heterogeacuteneo En maacutes del 50 de los casos de CHC las viacuteas
de sentildealizacioacuten Ras y del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) son activadas
mientras que en el 40-50 la viacutea del MTOR (mammalian Target of Rapamycin complejo
sensible a rapamicina) es interrumpida La viacutea de sentildealizacioacuten del receptor del factor de
crecimiento tipo insulina (IGF1R) se activoacute en 20 de los CHC tempranos mientras que la
desregulacioacuten de la viacutea de c-MET y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es un
evento comuacuten La viacutea de sentildealizacioacuten Wnt es activada en un tercio de los CHC La alta
vascularizacioacuten y actividad angiogeacutenica presente en el CHC estaacute asociada a las viacuteas de
sentildealizacioacuten del factor de crecimiento endotelio vascular (VEGFA) la angiopoyetina 2
(ANGPT2) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (Forner et al 2012)
Las dos mutaciones maacutes frecuentes ocurren en el gen supresor de tumor TP53 (en
alrededor del 25-40 de los casos) y en el gen para β catenina CTNNB1 que se da en
aproximadamente el 25 de los casos y predomina en los CHC relacionados con la
infeccioacuten de HCV (Forner et al 2012)
533 Tratamiento
A pesar de ser un problema de salud mundial importante en los uacuteltimos decenios no
se han producidos avances significativos en el pronoacutestico de la mayoriacutea de los pacientes
(Asghar amp Meyer 2012) La deteccioacuten temprana y el posterior tratamiento es la uacutenica opcioacuten
para alcanzar una supervivencia sin enfermedad a largo plazo Un tratamiento precoz
efectivo estaacute asociado con una supervivencia media superior a los 5 antildeos (Forner et al
2012) Existen varios tratamientos que deberaacuten ser elegidos en relacioacuten al pronoacutestico del
paciente (Llovet et al 1999) Sin embargo no existen suficientes estudios cliacutenicos que
comparen los distintos tratamientos principalmente en el caso de pacientes con un estadio
temprano de la enfermedad (Forner et al 2012)
La reseccioacuten quiruacutergica la ablacioacuten y el trasplante tienen potencial curativo y son las
opciones terapeacuteuticas en la fase temprana de la enfermedad Sin embargo en Occidente y
Japoacuten pudieron ser aplicados solamente en un 30 de los pacientes (Llovet et al 2008)
Ademaacutes la recurrencia representa un serio inconveniente para la reseccioacuten y la ablacioacuten
Los uacutenicos tratamientos no curativos que proporcionan supervivencia son la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
130
quimioembolizacioacuten transarterial (TACE) aplicada en pacientes con grandes caacutenceres o
enfermedad multifocal y el Sorafenib una droga administrada oralmente en pacientes con
CHC avanzado (Forner et al 2012)
54 Terapia enzimaacutetica sisteacutemica en pacientes con caacutencer
Con el propoacutesito de evaluar el beneficio de la administracioacuten de mezclas de enzimas
proteoliacuteticas tales como tripsina quimotripsina papaiacutena o bromelina (terapia enzimaacutetica
sisteacutemica) como complementaria en pacientes que sufren de caacutencer de mama colorrectal y
plasmocitoma se llevaron a cabo estudios de cohorte que representan el nivel IIB de la
medicina basada en evidencia (EBM) aceptados por la Unioacuten Europea para mostrar la
seguridad y la eficacia de los tratamientos meacutedicos Estos estudios demostraron que la
terapia enzimaacutetica sisteacutemica disminuyoacute significativamente los efectos secundarios inducidos
por el tumor y la terapia estabilizoacute la calidad de vida y prolongaron la sobrevida (Beuth
2008)
En cuanto a la bromelina existe abundante evidencia de su efecto anti caacutencer
especialmente en modelos celulares y animales asiacute como en ensayos cliacutenicos Sin
embargo como agente terapeacuteutico para el tratamiento del caacutencer no ha sido objeto de
estudios cliacutenicos controlados aleatorios (Chobotova et al 2010) La actividad anti caacutencer es
atribuida a la actividad proteoliacutetica de sus proteasas las cuales permanecen funcionalmente
intactas luego de ser absorbidas por el tracto gastrointestinal (Maurer 2001) La baja
toxicidad de la bromelina (Moss et al 1963) ha permitido la administracioacuten oral de dosis
altas durante largos periacuteodos y ser bien tolerada (Maurer 2001 Brien et al 2004)
55 Objetivos
Dentro del objetivo general de evaluar el posible efecto antitumoral de los preparados
proteoliacuteticos obtenidos a partir de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) B balansae (Bb) y
Pseudananas macrodontes (Pm) asiacute como de bromelina (Bro) se plantearon los siguientes
objetivos especiacuteficos
Evaluar el efecto de Bh Bb Pm y Bro sobre la viabilidad de ceacutelulas de
hepatocarcinoma humano
Evaluar el efecto de Bh Bb Pm y Bro sobre la adhesioacuten de ceacutelulas de
hepatocarcinoma humano
Comparar los efectos medidos de los preparados y de la bromelina en relacioacuten a la
actividad proteoliacutetica
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
131
56 Materiales y meacutetodos
561 Cultivo celular
Se empleoacute una liacutenea celular de hepatocarcinoma primario humano HepG2 C3A
(ATCC) la cual fue mantenida en medio esencial Dulbecco con alta glucosa (Gibco)
suplementado con suero fetal bovino (SFB) inactivado con calor (Natocor Argentina) al 10
conteniendo 50 UmL de penicilina y 50 μgmL de estreptomocina a 37 ordmC en una atmoacutesfera
humidificada con 5 de CO2 Las ceacutelulas fueron incubadas junto al medio de cultivo en
policubetas de 96 pocillos durante 24 h a fin de permitir su adhesioacuten
562 Tratamientos
Las ceacutelulas crecidas en monocapa a una densidad de 15000 ceacutelulaspocillo fueron
incubadas en 90 μL del medio de cultivo libre de SFB y 10 μL de la solucioacuten del preparado
proteoliacutetico Se ensayaron diferentes concentraciones de cada uno y distintos tiempos de
incubacioacuten luego de los cuales se midioacute la viabilidad y la adhesioacuten celular Como control se
usoacute buffer fosfato soacutedico 002M pH 6 el cual a su vez se ensayoacute frente a agua como
control
Con el objetivo de determinar si los efectos medidos fueron debido a la actividad
proteoliacutetica se hicieron ensayos de adhesioacuten y viabilidad incubando las ceacutelulas con los
preparados proteoliacuteticos tratados y no tratados con solucioacuten 40 μM de E-64 En estos
ensayos el control fue una solucioacuten 40 μM de E-64 en buffer fosfato soacutedico 002 M pH 6
5621 Evaluacioacuten de la viabilidad celular (Ensayo con MTS)
La viabilidad celular fue evaluada mediante un ensayo colorimeacutetrico utilizando el kit
Cell Titer 96 AQueous Non-Radiactive Cell Proliferation Assay (Promega Corp USA) Este
ensayo se basa en que el metabolismo de las ceacutelulas viables produce compuestos
reductores que pueden reducir un derivado de tetrazolio 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-
carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS) en presencia de metosulfonato de
fenazina (PMS) a formazaacuten un producto soluble y coloreado (Buttke et al 1993) Por lo
tanto la cantidad de formazaacuten formado seraacute proporcional al nuacutemero de ceacutelulas viables El
PMS actuacutea como acoplador de electrones entre el producto metaboacutelico y el MTS
Luego de los distintos tratamientos 100 μL de MTS y PMS fueron incorporados al
cultivo celular y despueacutes de incubarlos durante 30 min a 37 ordmC se midioacute la absorbancia a 490
nm en un lector de ELISA (Metertech 960) que es considerada como proporcional al
nuacutemero de ceacutelulas viables Los resultados fueron expuestos como porcentajes de ceacutelulas
viables respecto a los controles
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
132
5622 Ensayo de adhesioacuten celular (Tincioacuten con cristal violeta)
Luego de la incubacioacuten con los distintos preparados proteoliacuteticos el medio de cada
pocillo se descartoacute a fin de eliminar las ceacutelulas no adheridas se lavoacute con solucioacuten salina de
buffer fosfato (PBS) y se agregoacute formaldehido al 37 durante 15 min a temperatura
ambiente para fijar las ceacutelulas adheridas Posteriormente se incuboacute con colorante cristal
violeta al 05 en aacutecido aceacutetico al 3 durante 20 min Luego se lavoacute exhaustivamente y se
agregoacute SDS al 1 para disolver el colorante Finalmente se midioacute la absorbancia a 600 nm
utilizando un lector de ELISA (Metertech 960) que es considerada proporcional al nuacutemero
de ceacutelulas adheridas (Martiacutenez et al 2004) Los resultados fueron expresados como
porcentajes de ceacutelulas adheridas respecto al control
563 Anaacutelisis estadiacutestico
Todos los ensayos fueron realizados por triplicado en tres ensayos independientes
Los promedios de cada ensayo fueron considerados medidas independientes y las
diferencias de las medias de los grupos de tratamiento y del grupo control fueron evaluadas
mediante ANOVA seguido del test de Dunnett Un p lt 005 () fue considerado significativo
Los valores son expresados como la media plusmn SEM
564 Material vegetal ensayado
El contenido proteoliacutetico (UCasmg) y proteico (μg proteiacutenamg) asiacute como la actividad
especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos utilizados se presenta en la Tabla 51
Liofilizados UCasmg μg proteiacutenamg UCasmg proteiacutena
Bh 027 plusmn 005 27 plusmn 2 10
Pm 014 plusmn 001 33 plusmn 3 42
Bb 015 plusmn 001 11 plusmn 1 14
Bromelina (Sigma Aldrich) 065 plusmn 002 209 plusmn 2 31
Tabla 51 Contenido proteoliacutetico (UCasmg) proteico (μg proteiacutenamg) y actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena)
de los extractos ensayados UCas unidades caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC) Media plusmn DE
Para todos los ensayos las soluciones de los extractos fueron preparadas por
resuspensioacuten de los liofilizados en agua destilada mientras que la bromelina fue redisuelta
en buffer fosfato soacutedico 002 M de pH 6
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
133
57 Resultados y discusioacuten
571 Ensayo de viabilidad
En la Figura 54 se exponen los resultados obtenidos del ensayo de viabilidad donde
pueden verse los porcentajes de ceacutelulas HepG2 viables luego de incubarlas durante 24 y 48
h con concentraciones crecientes de bromelina Bh Bb y Pm
Figura 54 Viabilidad de ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett plt005 plt001
plt0001 Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato
soacutedico 0002 M pH 6
Puede observarse que todos los preparados fueron capaces de disminuir la viabilidad
de las ceacutelulas HepG2 a las 48 h de incubacioacuten La bromelina fue la maacutes efectiva ya que por
un lado produjo disminucioacuten significativa con 10 μgmL en tanto que Bh Bb y Pm
requirieron una concentracioacuten de un orden de magnitud superior para mostrar un efecto
similar por otro lado fue la que mostroacute menos de ceacutelulas viables (asymp 40 frente al 65 de
los preparados) para las mayores concentraciones ensayadas A las 24 h de incubacioacuten si
bien las concentraciones maacutes altas de Bb y Pm disminuyeron el porcentaje de ceacutelulas
viables (75 y 71 respectivamente) no fueron significativos mientras que siacute lo fueron los
porcentajes de 100 μgmL de bromelina y 1000 μgmL de Bh (52 y 61 respectivamente)
572 Ensayos de adhesioacuten
En la Figura 55 se exponen los resultados del ensayo de adhesioacuten celular de las
ceacutelulas HepG2 luego de incubarlas durante 1 24 y 48 h con concentraciones crecientes de
bromelina Bh Bb y Pm En la Figura 56 se muestran microfotografiacuteas de las ceacutelulas HepG2
Bromelina
1 10 1000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Bb
18 180 18000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Bh
10 100 10000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Pm
10 100 10000
50
100
150
Control 24 h 48 h
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
134
luego de incubarlas durante 24 h con las concentraciones intermedias de bromelina Bh Bb
y Pm
Figura 55 Adhesioacuten celular de ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett plt001 plt0001
Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato soacutedico 0002 M
pH 6
Todos los preparados tuvieron efecto sobre la adhesioacuten celular Se observoacute una
eliminacioacuten de la adhesioacuten de las monocapas celulares a la superficie plaacutestica de los
pocillos Las ceacutelulas en suspensioacuten adoptaron una forma redondeada Desde la primera h de
incubacioacuten y para las mayores concentraciones ensayadas (100 μgmL de bromelina 1000
μgmL de Bh y de Pm y 1800 μgmL de Bb) se observaron los porcentajes de adhesioacuten maacutes
bajos (entre un 15 y un 30) los cuales no mostraron diferencias significativas (pgt005
Tukey) respecto de los de las 24 y 48 h siguientes de incubacioacuten Tal como sucedioacute en los
ensayos de viabilidad bromelina requirioacute una concentracioacuten de un orden de magnitud
inferior a la de las demaacutes preparaciones para lograr el mismo efecto sobre la adhesioacuten
Bromelina
1 10 1000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Bb
18 180 18000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Bh
10 100 10000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Pm
10 100 10000
50
100
150
Control 1 h 24 h 48 h
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
135
Figura 56 Microfotografiacuteas de campo claro representativas de ceacutelulas HepG2 luego de incubarlas durante 24 h
con los preparados proteoliacuteticos Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato soacutedico 0002 M pH 6
Si se comparan los porcentajes de ceacutelulas adheridas con los porcentajes de ceacutelulas
viables puede observarse que las disminuciones significativas en la viabilidad ocurren 24 h
despueacutes de una disminucioacuten significativa en la adhesioacuten excepto para 100 μgmL de Bh
indicando que la peacuterdida de adhesioacuten conlleva una peacuterdida de la viabilidad La concentracioacuten
de 100 μgmL de Bh mostroacute un menor porcentaje de ceacutelulas adheridas (36) respecto al
control a 1 h de incubacioacuten que no fue seguida de una disminucioacuten significativa de ceacutelulas
viables (85) a las 24 h de incubacioacuten Por otro lado 10 μgmL de Bh a las 48 h de
incubacioacuten mostroacute un porcentaje de ceacutelulas viables (85) que resultoacute ser una disminucioacuten
significativa mientras que el porcentaje de ceacutelulas adheridas 24 h antes (85) no lo fue sin
embargo no parece ser concluyente que la disminucioacuten de la viabilidad no sea precedida por
una disminucioacuten de la adhesioacuten en dicho caso si se toman en cuenta los valores
porcentuales absolutos de adhesioacuten y viabilidad
573 Efecto de la actividad proteoliacutetica sobre los porcentajes de viabilidad y
de adhesioacuten celular
Como se mencionoacute en la introduccioacuten el efecto antitumoral de bromelina es atribuido
preponderantemente a la actividad de sus proteasas (Salas et al 2008 Chobotova et al
2010) Con el fin de determinar si los efectos sobre la viabilidad y adhesioacuten celular medidos
tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los preparados se determinaron los
porcentajes de viabilidad y de adhesioacuten de los mismos tratados y no tratados con E-64 Se
usaron las concentraciones de Bromelina Bh Bb y Pm que mostraron mayores efectos
(100 1000 1800 y 1000 μgmL respectivamente) a las 24 y 48 h de incubacioacuten (Figura 57)
Control Bro (10 gml) Bb (180 gml) Bh (100 gml) Pm (100 gml)
10X
20X
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
136
Figura 57 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas sobre su accioacuten reductora de la viabilidad y la adhesioacuten de
ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett p lt 005 p lt 001 p lt 0001 ns no significativo Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control 4 μM de E-64 en buffer fosfato soacutedico 0002 M pH 6
Puede observarse que los preparados tratados con E-64 no tuvieron efecto
significativo sobre la viabilidad como tampoco sobre la adhesioacuten celular a las 24 y 48 h de
incubacioacuten salvo la concentracioacuten de 1000 μgmL de Pm para la cual se observoacute una
disminucioacuten significativa en el porcentaje de ceacutelulas adheridas (76) a las 24 h que sin
embargo es significativamente superior (p lt 0001 test de Tukey) al porcentaje de adhesioacuten
de Pm activo proteoliacuteticamente (16)
Puede concluirse que el efecto sobre la viabilidad y la adhesioacuten celular de bromelina
Bh y Bb a las 24 y 48 h de incubacioacuten y de Pm a las 48 h seriacutea debido a la actividad
proteoliacutetica de sus cisteiacutenendopeptidasas
A fin de realizar una comparacioacuten entre los distintos preparados en relacioacuten a su
actividad proteoliacutetica en la Tabla 52 se exponen los porcentajes de ceacutelulas viables (V) y
de ceacutelulas adheridas (A) luego de 48 h de incubacioacuten en funcioacuten del contenido de
unidades caseinoliacuteticas (UCasmL) de las concentraciones ensayadas para bromelina Bh
Bb y Pm
0
50
100
150
Sin E-64Con E-64
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Bromelina
(100 gml)
Bb
(1800 gml)
Bh
(1000 gml)
Pm
(1000 gml)
Control
nsns ns
nsns
ns
ns
ns
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
0
50
100
150
Control Sin E-64Con E-64
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Bromelina
(100 gml)
Bb
(1800 gml)
Bh
(1000 gml)
Pm
(1000 gml)
ns ns ns ns nsns
ns
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
137
Preparado proteoliacutetico
UCasmL (x10-3
) V A
Bromelina
065 plusmn 002 91 plusmn 2 91 plusmn 1
65 plusmn 02 69 plusmn 4 23 plusmn 4
65 plusmn 2 44 plusmn 3 20 plusmn 4
Bh
27 plusmn 05 86 plusmn 4 99 plusmn 1
27 plusmn 5 66 plusmn 1 30 plusmn 6
270 plusmn 25 63 plusmn 5 19 plusmn 2
Bb
27 plusmn 02 103 plusmn 4 99 plusmn 3
27 plusmn 2 78 plusmn 7 30 plusmn 7
270 plusmn 20 68 plusmn 3 21 plusmn 2
Pm
14 plusmn 01 95 plusmn 5 96 plusmn 2
14 plusmn 1 70 plusmn 1 31 plusmn 8
140 plusmn 10 65 plusmn 8 20 plusmn 2
Tabla 52 Porcentajes de ceacutelulas viables (V) y de ceacutelulas adheridas (A) en relacioacuten con la actividad proteoliacutetica (UCasmL) de bromelina Bh Bb y Pm luego de incubar ceacutelulas HepG2 durante 48 h Media plusmnSEM Resultados test de Dunnett p lt 005 p lt 001 p lt 0001
Se puede observar que bromelina requiere menos actividad proteoliacutetica que los
demaacutes preparados para mostrar efectos similares hecho que podriacutea deberse a que las
proteasas de bromelina actuacutean conjuntamente mostrando una mayor especificidad hacia
sustratos relacionados con la viabilidad y la adhesioacuten celular presentes en las ceacutelulas de
HepG2 que las proteasas presentes en Bh Bb y Pm A su vez Bh y Bb fueron menos
activas que Pm
La carcinogeacutenesis hepaacutetica estaacute asociada en parte a un cambio en el perfil de las
integrinas expresadas en la superficie del hepatocito las cuales juegan un papel
fundamental en la adhesioacuten y la migracioacuten celular contribuyendo al crecimiento y la invasioacuten
del tumor (Nejjari et al 1999 Massini 2007) Asiacute los bajos porcentajes de adhesioacuten de
ceacutelulas de HepG2 luego de tratarlas con bromelina Bh Bb y Pm permite suponer que
resultaraacuten efectivas para inhibir el crecimiento tumoral en CHC Ademaacutes abre un abanico de
posibles ensayos a realizar a fin de determinar cuaacuteles seriacutean las proteiacutenas superficiales
blanco para cada una de los preparados proteoliacuteticos
En este sentido es importante mencionar que uno de los mecanismos por el cual la
bromelina ejerceriacutea efecto antitumoral es su capacidad para clivar proteiacutenas de la superficie
celular CD44 un marcador de superficie presente en ceacutelulas inmunes y tumorales y que
estaacute asociado con el crecimiento tumoral y la metaacutestasis mostroacute ser sensible a la bromelina
en liacuteneas tumorales murinas y humanas resultando en una reduccioacuten de la invasioacuten y
adhesioacuten al sustrato (Chobotova et al 2010) Fastuosaiacutena otra proteasa cisteiacutenica aislada
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
138
de frutos de Bromelia fastuosa resultoacute activa frente a CD44 en ceacutelulas de melanoma murino
(Guimaratildees-Ferreira et al 2007) En un modelo de melanoma murino la mezcla de
papaiacutena tripsina y quimotripsina redujo la expresioacuten de CD44 y CD45 en el tumor lo cual
fue correlacionado con la supresioacuten del melanoma y la metaacutestasis (Wald et al 2001) Por
tanto dado que las ceacutelulas HepG2 expresan CD44 en su superficie se podriacutea sugerir que
bromelina asiacute como tambieacuten Bh Bb y Pm podriacutean ejercer sus efectos a traveacutes de esta
proteiacutena ademaacutes de las integrinas
La disminucioacuten de la viabilidad celular de HepG2 observada para los preparados
proteoliacuteticos constituye un paso inicial hacia la buacutesqueda de los posibles mecanismos que la
estariacutean mediando Determinar si ha habido arresto celular induccioacuten de apoptosis asiacute
como cuaacuteles son las viacuteas de sentildealizacioacuten involucradas si bien no han sido objetivos de esta
tesis se muestran como prometedores temas para futuros estudios En este sentido existe
evidencia de la capacidad de bromelina para inducir activadores de la apoptosis (p53 y Bax)
en papiloma cutaacuteneo en ratoacuten asiacute como reducir la actividad de reguladores de la
supervivencia celular como Akt y Erk esta uacuteltima de forma contexto celular dependiente
(Chobotova et al 2010) en ceacutelulas de melanoma y carcinoma epideacutermico humano ha
promovido el arresto del ciclo celular en la fase G2M conducieacutendolas a apoptosis (Bhui et
al 2011)
En la Tabla 52 puede observarse que un aumento en 10 veces de la concentracioacuten
de bromelina produjo un cambio importante en el porcentaje de ceacutelulas viables (de 69 a
44) mientras el porcentaje de adhesioacuten permanece aproximadamente constante (20) lo
cual estariacutea indicando que la bromelina podriacutea afectar la viabilidad celular
independientemente de la alteracioacuten de la adhesioacuten celular Esto es diferente a lo observado
en ceacutelulas de glioblastoma humano donde una reduccioacuten en la adhesioacuten la migracioacuten y la
invasioacuten asociada con la reduccioacuten de la integrina α3β1 y el CD44 en la superficie celular no
fue acompantildeada por una disminucioacuten de la viabilidad (Tysnes et al 2001) La aparente
diferencia en el efecto de la bromelina sobre ceacutelulas tumorales humanas podriacutea reflejar una
especificidad de accioacuten lo cual podriacutea hacerla maacutes eficiente como tratamiento frente a
algunos tipos de caacutencer que de otros hecho que hace necesario el estudio sobre mayor
nuacutemero de liacuteneas celulares tumorales humanas (Chobotova et al 2010)
La bromelina no ha sido probada frente a ceacutelulas de HepG2 asiacute como tampoco Bh
Bb y Pm para los cuales estos resultados son los primeros en relacioacuten a la buacutesqueda de
posibles efectos antitumorales Si bien queda una serie de aspectos por investigar
(mecanismos de accioacuten efectos sobre el crecimiento tumoral y metaacutestasis capacidad
migratoria citotoxicidad etc) el presente trabajo constituye un indicio de los potenciales
efectos terapeacuteuticos de proteasas cisteiacutenicas frente al carcinoma hepatocelular
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
139
58 Conclusiones
Extractos ricos en cisteinendopeptidasas de Bromelia hieronymi (Bh) B balansae
(Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) mostraron efecto reductor de la viabilidad y
la adhesioacuten de ceacutelulas de carcinoma hepatocelular (HepG2)
Bh Bb y Pm tuvieron efectos similares en relacioacuten al contenido de unidades
caseinoliacuteticas siendo menores a los mostrados por bromelina
Bh Bb y Pm al igual que bromelina perdieron la accioacuten reductora de viabilidad y
adhesioacuten celular al inhibir la actividad de las cisteinendopeptidasas
Nuevos estudios son necesarios para profundizar el conocimiento de los
mecanismos involucrados en los efectos medidos asiacute como para encontrar otras
acciones que resulten beneficiosas para la terapia de CHC
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
140
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6 CONCLUSIONES FINALES Y PERSPECTIVAS
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
142
El objetivo general del presente trabajo de tesis doctoral fue estudiar la posible
aplicacioacuten farmacoloacutegica de extractos de tres especies vegetales pertenecientes a la familia
Bromeliaceae Bromelia hieronymi Mez Bromelia balansae Mez y Pseudananas
macrodontes (Morr) Harms autoacutectonas del aacuterea que abarca el NEA y NOA Paraguay
Brasil Bolivia y Colombia Las tres especies habiacutean sido previamente estudiadas en el
LIProVe desde el punto de vista bioquiacutemico habieacutendose aislado y caracterizado diversas
endopeptidasas cisteiacutenicas a partir de sus frutos
A excepcioacuten del uso en medicina popular de B balansae para calmar la tos no
existen referencias sobre aplicaciones medicinales de las especies mencionadas Sin
embargo es abundante la informacioacuten sobre las propiedades antiinflamatorias
antitromboacuteticas inmunomoduladoras y antitumorales de la bromelina un extracto acuoso
obtenido a partir del ananaacute [Ananas comosus (L) Merr] especie tambieacuten perteneciente a la
familia Bromeliaceae y rica en endopeptidasas cisteiacutenicas a las que se atribuyen las
actividades farmacoloacutegicas citadas Por este motivo se decidioacute estudiar los efectos
antiinflamatorios antitumorales anticoagulantes fibrinoliacuteticos y fibrinogenoliacuteticos de
extractos acuosos parcialmente purificados por precipitacioacuten etanoacutelica obtenidos a partir de
frutos de B hieronymi (Bh) B balansae (Bb) y P macrodontes (Pm) en relacioacuten a la
actividad proteoliacutetica de los mismos
En base a los estudios realizados se ha arribado a las siguientes conclusiones
Bh Bb y Pm mostraron efecto antiinflamatorio en modelos animales de
inflamacioacuten aguda al ser administradas intraperitonealmente
En el modelo de inflamacioacuten aguda ensayado (edema de pata de rata inducida por
carragenina) dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica (asymp30 UCaskg) de Bh Pm y
bromelina mostraron efectos antiinflamatorios significativamente similares a 10 mgkg de
indometacina El efecto antiinflamatorio medido para Bb fue menor y en algunos ensayos fue
acompantildeado de signos de toxicidad
El efecto antiinflamatorio medido en este modelo fue dependiente de la actividad
caseinoliacutetica (UCas) de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb y bromelina mientras que soacutelo
parcialmente de las de Pm quedando por determinar si la actividad fibrinoliacutetica de Pm es
causal del efecto antiinflamatorio medido para 0 UCaskg de Pm
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
143
Los efectos antiinflamatorios de Bh Bb Pm y bromelina alcanzaron los maacuteximos
valores entre las 5 y las 7 h de inducido el estiacutemulo inflamatorio tiempos en que se alcanza
el maacuteximo valor de inflamacioacuten Teniendo en cuenta los mediadores involucrados en dicha
fase del modelo seriacutea posible que las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb y Pm ejercieran su
accioacuten sobre la COXPGs la NOSNO y la infiltracioacutenactividad de los neutroacutefilos para cuya
confirmacioacuten deberiacutean orientarse futuras investigaciones sobre el mecanismo de accioacuten de
las mismas en los efectos antiinflamatorios observados
Si bien en una magnitud menor dosis de asymp30 UCaskg de Bh Pm y bromelina
tambieacuten fueron efectivas como antiinflamatorios en el modelo de edema de pata de rata
inducido por serotonina no mostrando efecto significativo sobre el edema inducido por
histamina
Mediante el modelo de inflamacioacuten croacutenica en ratas test del granuloma inducido
por pellet de algodoacuten se observoacute un significativo efecto antiinflamatorio de Pm y
bromelina al ser administradas intraperitonealmente mientras que para Bh y Bb
no se obtuvieron resultados concluyentes
Dado que una dosis de asymp10 UCaskg de Pm mostroacute un efecto antiinflamatorio
equivalente al de una dosis de asymp30 UCaskg de bromelina y que ambos efectos fueron
dependientes de la actividad proteoliacutetica (UCas) las proteasas cisteiacutenicas de Pm mostrariacutean
una mayor especificidad que las de bromelina frente a los efectores proinflamatorios
Si bien los efectos antiinflamatorios de Pm y bromelina fueron significativamente
menores o similares al de dexametasona (3 mgkg) a las dosis ensayadas no mostraron
efectos adversos tiacutepicos de glucocorticoides tales como la peacuterdida de masa corporal y
reduccioacuten del peso del bazo causando significativa reduccioacuten del peso del timo pero entre 3
y 4 veces menos que la dexametasona (3 mgkg)
Los efectos antiinflamatorios medidos para dosis de asymp30 UCaskg de Bh y de Bb no
fueron reproducibles en posteriores ensayos
La accioacuten antiinflamatoria medida en el modelo del granuloma para todos los
preparados proteoliacuteticos fue acompantildeada de un significativo y leve efecto reductor del peso
del timo el cual a su vez fue dependiente de la actividad proteoliacutetica de las proteasas
cisteiacutenicas de Pm y bromelina Dilucidar si este hecho es indicativo de un mecanismo
subyacente de la accioacuten antiinflamatoria o es un efecto independiente de los preparados
proteoliacuteticos podriacutea ser objeto de futuras investigaciones
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
144
Bh Bb y Pm actuaron como anticoagulantes fibrinogenoliacuteticas y fibrinoliacuteticas
Bh Bb y Pm prolongaron los tiempos de protrombina (TP) y de tromboplastina parcial
activada (TTPa) de plasma humano en ensayos in vitro ademaacutes de alterar la consistencia
de los coaacutegulos formados respecto de un plasma no tratado con los preparados Ambos
efectos fueron totalmente dependientes de la actividad proteoliacutetica de las proteasas
cisteiacutenicas excepto los efectos de Bb sobre el TP y el TTPa y de Pm sobre el TTPa los
cuales dependieron parcialmente de las cisteiacutenendopeptidasas sugiriendo la presencia de
otros componentes anticoagulantes
El hecho de que una actividad proteoliacutetica (UCas) equivalente de bromelina Bh Bb y
Pm no produjera efectos anticoagulantes equivalentes da cuenta de las diferentes
especificidades con las que actuariacutea cada preparado sobre los distintos elementos del
sistema de coagulacioacuten
En los ensayos In vivo si bien dosis con equivalente actividad proteoliacutetica (65
UCaskg) de todos los preparados administrados intraperitonealmente prolongaron el TP y el
TTPa soacutelo Bb prolongoacute levemente el TP en forma estadiacutesticamente significativa mostrando
un valor de TP significativamente similar al de la bromelina
El efecto sobre el fibrinoacutegeno fue equivalente cuali y cuantitativamente para
equivalentes actividades caseinoliacuteticas (UCas) de Bh Bb Pm y bromelina siendo la
subunidad Aα del fibrinoacutegeno la maacutes susceptible de ser clivada lo cual podriacutea explicar la
alteracioacuten de la consistencia del coaacutegulo observada en los ensayos de medida de TP y
TTPa
Como agentes fibrinoliacuteticos Bh Bb y Pm tuvieron un comportamiento similar y
significativamente diferente al de bromelina la cual a su vez mostroacute un comportamiento
significativamente similar a la plasmina A equivalentes valores de actividad caseinoliacutetica
(UCas) la bromelina mostroacute mayor especificidad que Bh Bb y Pm frente a la fibrina
respecto a los componentes de la cascada de la coagulacioacuten
Los efectos fibrinogenoliacutetico anticoagulante y fibrinoliacutetico medidos para Bh Bb y Pm
los ubica como potenciales agentes antitromboacuteticos o tromboliacuteticos lo cual deberaacute ser
evaluado en modelos de trombosis Las relaciones establecidas entre dichos efectos y el
contenido proteoliacutetico de los preparados podraacuten ser de utilidad al momento de establecer
dosis asiacute como interpretar resultados en futuros ensayos de trombosis
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
145
En relacioacuten a la accioacuten antiinflamatoria la actividad fibrinoliacutetica de Bh Bb y Pm
puede contribuir al mecanismo de accioacuten anti-edema evaluado in vivo hecho que ya ha sido
corroborado para bromelina en tanto que para Bh Bb y Pm ello queda supeditado a futuras
investigaciones dirigidas a dilucidar los mecanismos subyacentes a los efectos
antiinflamatorios medidos
Bh Bb Pm y bromelina disminuyeron significativamente la viabilidad y la
adhesioacuten de ceacutelulas de carcinoma hepatocelular (HepG2)
Los efectos sobre la viabilidad y la adhesioacuten dependieron de la actividad proteoliacutetica
de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina siendo las proteasas de bromelina
las maacutes especiacuteficas en relacioacuten a las de Bh Bb y Pm
Estos resultados abren camino a futuros ensayos dirigidos no soacutelo a estudiar los
mecanismos de accioacuten a traveacutes de los cuales Bh Bb Pm y bromelina afectariacutean las ceacutelulas
de HepG2 sino tambieacuten para evaluar los efectos sobre otros modelos maacutes complejos
Los efectos antiinflamatorios asiacute como anticoagulantes y fibrinoliacuteticos de Bh Bb y Pm
constituyen cualidades con potenciales efectos terapeacuteuticos en el tratamiento sisteacutemico del
caacutencer delineando otra posible liacutenea de investigacioacuten futura
En siacutentesis el presente trabajo ha pretendido aportar informacioacuten novedosa acerca
de la posible importancia farmacoloacutegica de principios activos en este caso proteasas de tipo
cisteiacutenico presentes en plantas que crecen en nuestro paiacutes y que podriacutean enriquecer el no
demasiado extenso acervo de fitofaacutermacos en uso en este momento Por tratarse de
resultados preliminares seraacute necesario en caso de resultar de intereacutes la realizacioacuten de
estudios posteriores y de mayor complejidad que confirmen el potencial farmacoloacutegico de los
preparados estudiados en el marco de la seguridad en cuanto a los riesgos toxicoloacutegicos
que pueda presentar el uso de los mismos
Agradecimientos
A la Facultad de Ciencias Exactas de La Universidad Nacional de La Plata por haberme permitido
realizar mis estudios de grado y posgrado
Al Consejo Nacional de Investigaciones Cientiacuteficas y Teacutecnicas por brindarme las becas para la
realizacioacuten del presente Trabajo de Tesis
Al LIProVe y en especial al Dr Neacutestor O Caffini por ofrecerme el Lugar de Trabajo por su
predisposicioacuten para ayudarme y enorme paciencia para ensentildear
A la Secretariacutea de Poliacuteticas Universitarias del Ministerio de Educacioacuten de La Nacioacuten que a traveacutes del
Programa Inter-U me brindoacute los medios econoacutemicos para los viajes a San Luis donde realiceacute parte
del trabajo experimental aquiacute presentado
A Veroacutenica Laacutezaro quien actuoacute eficientemente en la gestioacuten del Programa Inter-U dentro de La
Facultad de Ciencias Exactas de La Universidad Nacional de La Plata
A la Dra Alejandra E Rotelli mi codirectora de beca por la ensentildeanza y direccioacuten de los ensayos con
modelos animales asiacute como por la colaboracioacuten en la realizacioacuten de los mismos en la Facultad de
Quiacutemica Bioquiacutemica y Farmacia de la Universidad Nacional de San Luis
A la Dra Mariacutea Fernanda Troncoso por la ensentildeanza y colaboracioacuten en la realizacioacuten de los ensayos
con ceacutelulas tumorales en el IQUIFIB Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica de la Universidad de Buenos
Aires y por la correccioacuten del capiacutetulo ldquoEfecto antitumoralrdquo
A la Bioq Mariana Marta Gonzalez de la Caacutetedra de Hematologiacutea de la Facultad de Ciencias Exactas
de la Universidad Nacional de La Plata por la ensentildeanza y colaboracioacuten en los ensayos de
coagulacioacuten y en la obtencioacuten de los pooles de plasma
A la Bioq Anabela Prospitti por la colaboracioacuten en la obtencioacuten de los pooles de plasma
A los Dres Mariana Gomez y Pastor Arenas quienes muy amablemente nos proporcionaron material
bibliograacutefico en relacioacuten a los usos de las bromeliaacuteceas en nuestro paiacutes
A los Dres Mariela Bruno y Marcelo Pardo quienes me ensentildearon los primeros pasos en las teacutecnicas y
metodologiacuteas para el estudio de las proteasas vegetales
En el plano afectivo
A M Fernanda Troncoso por toda su predisposicioacuten y calidez humana
A Mariana y Susana por la buena onda y el compantildeerismo durante las mantildeanas en el laboratorio de
Hematologiacutea
A los integrantes de la Caacutetedra de Farmacologiacutea de la Facultad de Quiacutemica Bioquiacutemica y Farmacia de
la Universidad Nacional de San Luis en especial a Graciela Ameacuterico Alejandra Lily Susana
Mariano y muy especialmente a Ale por la calidez humana el buen humor los brindis y las cenas los
paseos por el surrealismo puntano y los mates frente al arroyo
A los integrantes (algunos ex) del LIProVe en especial a Cacho (Caffini) Ana (Prospitti) Jose (Torres)
Ine (Martin) Martiacuten (Lazza) Euge (Tavarone) Suacute (Morcelle del Valle) Celes (Branda) Franco
(Bernabei) Claudia (Natalucci) y Laura (Lopez) por los tiempos compartidos el ldquosoporterdquo en
momentos difiacuteciles el buen humor y el compantildeerismo Gracias por la paciencia Cacho
A Meli Ana y Guille por simplemente COMPARTIR
A mis viejos mis hermanos a Alfon y Ernes por lo que aprendiacute y volviacute a aprender por las risas y los
abrazos
A Leo por el aguante (PArsquo CIENCIA) los horizontes (se hicieron anchos) y la certeza de que las
palabras no me alcanzaraacuten
Algunos de los resultados presentados en esta Tesis Doctoral han sido objeto de las
siguientes publicaciones yo comunicaciones en reuniones cientiacuteficas
Publicaciones
Errasti M E Caffini N O Pelzer L E amp Rotelli A E (2013) ldquoAnti-inflammatory
Activity of Bromelia hieronymi Comparison with Bromelainrdquo Planta Medica 79 207-
213
Mariacutea E Errasti Neacutestor O Caffini Lilian E Pelzer and Alejandra E Rotelli (2013)
ldquoEvaluation of anti-inflammatory activity of Pseudananas macrodontes (Morr) Harms
fruit extract (Bromeliaceae) in ratsrdquo Zeitschrift fuumlr Naturforschung C (aceptado y en
proceso de revisioacuten)
Comunicaciones en reuniones cientiacuteficas
Errasti ME Bruno MA Rotelli AE Caffini NO Pelzer LE ldquoAntiinflammatory
activity of a partially purified extract from Bromelia hieronymi fruitsrdquo XLI Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Rosario
Santa Fe Argentina 24 al 26 de Noviembre de 2009
Errasti ME Caffini NO Rotelli AE Pelzer L ldquoAccioacuten antiinflamatoria de un
extracto de frutos de Bromelia hieronymi en un modelo de inflamacioacuten croacutenica en
ratasrdquo XLII Reunioacuten Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental
(SAFE) Mar del Plata Buenos Aires Argentina 17 al 20 de Noviembre de 2010
Errasti ME Rotelli AE Gonzaacutelez MM ldquoEvaluacioacuten in vitro de la accioacuten fibrinoliacutetica
y sobre la coagulacioacuten sanguiacutenea de extractos de Bromeliaceasrdquo XLIII Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Tucumaacuten
Argentina 2 al 4 de Noviembre de 2011
Errasti ME Caffini NO Rotelli AE Pelzer L ldquoExtractos de Pseudananas
macrodontes y Bromelia balansae con accioacuten antiinflamatoria en un modelo de
inflamacioacuten croacutenica en ratasrdquo XLIII Reunioacuten Anual de la Sociedad Argentina de
Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Tucumaacuten Argentina 2 al 4 de Noviembre de
2011
Errasti ME Caffini NO Pelzer LE Rotelli AE ldquoRelacioacuten entre efecto
antiinflamatorio y accioacuten proteoliacutetica de extractos de Bromeliaceasrdquo XLIV Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Mendoza
Argentina 31 de Octubre al 2 de Noviembre de 2012
Errasti ME Caffini NO Troncoso MF ldquoAccioacuten de extractos de Bromeliaceas sobre
la adhesioacuten y viabilidad de ceacutelulas de carcinoma hepatocelularrdquo XLIV Reunioacuten Anual
de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Mendoza
Argentina 31 de Octubre al 2 de Noviembre de 2012
El motivo con que fueron construidas las guardas de la portada estaacute presente en tejidos elaborados con las fibras extraiacutedas de las hojas de Bromelia hieronymi (chaacuteguar) ambas actividades realizadas
por mujeres pertenecientes a la comunidad wichiacute (Sastre et al 2013)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
i
Indice
1 Introduccioacuten general y Objetivos
11 Productos Naturales Medicina Tradicional y Fitomedicinas 1
12 Generalidades de la familia Bromeliaceae 3
121 Importancia Usos 5
1211 Uso comestible 5
1212 Obtencioacuten de fibras 6
1213 Usos medicinales 7
13 Tipos de Proteasas Distribucioacuten y Rol en los Vegetales 9
131 Proteasas Tipos y sistemas de clasificacioacuten 9
1311 Sistema EC de clasificacioacuten de enzimas 10
1312 El Sistema MEROPS de clasificacioacuten de peptidasas 11
132 Distribucioacuten de proteasas en los seres vivos 12
133 Rol de las peptidasas en los vegetales 13
1331 Peptidasas cisteiacutenicas 14
14 Enzimas Proteoliacuteticas de Bromeliaceae 16
141 Endopeptidasas del ananaacute 16
1411 Bromelina de tallo 17
1412 Ananaiacutena 17
1413 Comosaiacutena 18
1414 Bromelina de fruto 18
142 Balansaiacutena 18
143 Hieronymaiacutenas 19
1431 Hieronymaiacutena I 19
1432 Hieronymaiacutena II 19
1433 Hieronymaiacutena III 20
144 Macrodontaiacutenas 20
15 Objetivos 21
16 Referencias 23
2 Material Vegetal
21 Material Vegetal Utilizado 28
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
ii
211 Bromelia hieronymi Mez 28
2111 Extracto parcialmente purificado de frutos de B hieronymi (Bh) 28
212 Bromelia balansae Mez 28
2121 Extracto parcialmente purificado de frutos de B balansae (Bb) 29
213 Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [=P sagenarius (Arruda) Camargo]29
2131 Extracto parcialmente purificado de frutos de P macrodontes (Pm) 29
214 Ananas comosus (L) Merr 30
215 Reactivos quiacutemicos 30
22 Caracterizacioacuten proteoliacutetica de los extractos parcialmente purificados (Bh Bb y Pm) y de bromelina 30
221 Teacutecnicas y metodologiacutea 30
2211 Dosaje de la actividad caseinoliacutetica 30
2212 Cuantificacioacuten del contenido proteico 31
2213 Isoelectroenfoque 31
2214 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 32
2215 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina 33
22151 Tratamiento con E-64 33
222 Resultados 33
2221 Perfiles de pI y de peso molecular de Bh Bb y Pm 33
2222 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina 35
23 Referencias 38
3 Efecto antiinflamatorio
31 Inflamacioacuten 39
311 Inflamacioacuten aguda 39
3111 Respuesta vascular 39
3112 Respuesta celular 40
3113 Mediadores quiacutemicos 40
312 Regulacioacuten y resolucioacuten de la inflamacioacuten 43
313 Inflamacioacuten croacutenica 44
314 Proteasas como antiinflamatorios 45
3141 Bromelina 46
31411 Efecto sobre los componentes de la coagulacioacuten 47
31412 Efecto sobre el sistema de calicreiacutenas 47
31413 Efecto sobre la viacutea de la COX y NOS 47
31414 Modulacioacuten de moleacuteculas de superficie celular 47
31415 Activacioacuten celular y produccioacuten de citoquinas 48
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
iii
32 Objetivos 49
33 Materiales y meacutetodos 50
331 Modelos de inflamacioacuten 50
3311 Modelos de inflamacioacuten aguda Edema de pata de rata 50
33111 Edema de pata inducido por carragenina 50
331111 Procedimiento experimental 51
33112 Edema de pata inducido por histamina 51
331121 Procedimiento experimental 51
33113 Edema de pata inducido por serotonina 52
331131 Procedimiento experimental 52
33114 Equipamiento medidas y caacutelculo del volumen de edema 52
3312 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma 53
331 21 Procedimiento experimental 53
3313 Caacutelculo del efecto antiinflamatorio y anaacutelisis estadiacutestico 53
332 Animales 54
333 Dosis 54
334 Material vegetal ensayado 54
34 Resultados y Discusioacuten 56
341 Modelos de inflamacioacuten aguda 56
3411 Edema de pata de rata inducido por carragenina 56
34111 Bromelia hieronymi 56
341111 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina 57
34112 Pseudananas macrodontes 59
341121 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm 60
34113 Bromelia balansae 61
341131 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb 61
3412 Otros modelos de inflamacioacuten aguda 63
34121 Edema de pata inducido por histamina en ratas 63
34122 Edema de pata inducido por serotonina en ratas 64
341221 Bromelia hieronymi 64
341222 Pseudananas macrodontes 65
342 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma 65
3421 Bromelia hieronymi 65
34211 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina
en el test del granuloma 67
3422 Pseudananas macrodontes y Bromelia balansae 69
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
iv
34221 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb en el
test del granuloma 70
34222 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm en el
test del granuloma 71
3423 Posible relacioacuten entre la actividad proteoliacutetica-accioacuten antiinflamatoria-
modulacioacuten sobre poblacioacuten linfocitaria T 74
35 Conclusiones 77
36 Referencias 78
4 Efecto anticoagulante fibrinogenoliacutetico y fibrinoliacutetico
41 Hemostasia 82
411 Vasoconstriccioacuten 82
412 Formacioacuten del trombo plaquetario 82
413 Coagulacioacuten 83
4131 Fase inicial 85
4132 Fase de amplificacioacuten 86
4133 Fase de propagacioacuten 86
4134 Formacioacuten de fibrina 87
4135 Regulacioacuten de la coagulacioacuten 89
414 Fibrinoacutelisis 90
42 Trombosis 91
421 Agentes para el tratamiento de la trombosis 93
4211 Proteasas vegetales como antitromboacuteticos 94
43 Objetivos 95
44 Materiales y meacutetodos 95
441 Efecto anticoagulante 95
4411 Ensayos in vitro 95
44111 Pool de plasma pobre en plaquetas 95
44112 Tiempo de protrombina (TP) 96
44113 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 97
44114 Efecto de la inhibicioacuten de la actividad proteoliacutetica sobre la
accioacuten anticoagulante 98
44115 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados 98
4412 Ensayos in vivo 98
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
v
44121 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados 99
442 Efecto fibrinogenoliacutetico 100
4421 Hidrolizados 100
4422 Tricina-SDS-PAGE 101
443 Efecto fibrinoliacutetico 102
4431 Placa de fibrina 102
4432 Caacutelculos y anaacutelisis de resultados 103
444 Material vegetal 104
45 Resultados y discusioacuten 105
451 Efecto anticoagulante 105
4511 Ensayos in vitro 105
45111 Tiempo de Protrombina (TP) 106
45112 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 108
45113 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de los preparados
proteoliacuteticos sobre su efecto anticoagulante 112
4512 Ensayos in vivo 114
452 Efecto fibrinogenoliacutetico 116
453 Efecto fibrinoliacutetico 119
46 Conclusiones 122
47 Referencias 123
5 Efecto antitumoral
51 Las causas de la aparicioacuten del caacutencer 125
52 Epidemiologiacutea del caacutencer 126
53 Carcinoma Hepatocelular 128
531 Factores de riesgo 128
532 Patogeacutenesis molecular 129
533 Tratamiento 129
54 Terapia enzimaacutetica sisteacutemica en pacientes con caacutencer 130
55 Objetivos 130
56Materiales y meacutetodos 131
561 Cultivo celular 131
562 Tratamientos 131
5621Evaluacioacuten de la viabilidad celular (Ensayo con MTS) 131
5622 Ensayo de adhesioacuten celular (Tincioacuten con cristal violeta) 132
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
vi
563 Anaacutelisis estadiacutestico 132
564 Material vegetal ensayado 132
57 Resultados y discusioacuten 133
571 Ensayo de viabilidad 133
572 Ensayos de adhesioacuten 133
573 Efecto de la actividad proteoliacutetica sobre los porcentajes de viabilidad
y de adhesioacuten celular 135
58 Conclusiones 139
59 Referencias 140
6 Conclusiones finales y perspectivas 142
Agradecimientos 146
1 INTRODUCCIOacuteN GENERAL Y OBJETIVOS
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
1
11 Productos Naturales Medicina Tradicional y Fitomedicinas
Los productos naturales en especial los de origen vegetal han sido una importante
fuente de agentes terapeacuteuticos Los medicamentos derivados de productos naturales
representan alrededor de un 25-30 de los agentes terapeacuteuticos actuales Si bien en las
uacuteltimas deacutecadas debido al avance de la quiacutemica combinatoria la investigacioacuten sobre
productos naturales en la industria farmaceacuteutica ha mostrado una desaceleracioacuten para
algunas enfermedades complejas los productos naturales todaviacutea constituyen una fuente
muy valiosa para la produccioacuten de nuevas entidades quiacutemicas ya que representan
estructuras seleccionados por mecanismos evolutivos durante millones de antildeos (Calixto
2005)
Los ldquoFitomedicamentosrdquo o ldquoFitomedicinasrdquo constituyen una categoriacutea especial de
drogas vegetales Una de las criacuteticas tradicionalmente formuladas a la Medicina Natural o
Medicina Tradicional es la falta de normalizacioacuten o estandarizacioacuten de los materiales
bioloacutegicos pero las fitomedicinas difieren de las asiacute llamadas ldquoplantas medicinalesrdquo en que
estaacuten normalizadas o estandarizadas lo que significa que ciertos compuestos que estaacuten
presentes en el material vegetal se han cuantificado y dilucidado con lo que en principio se
cuenta con un producto final de composicioacuten maacutes o menos constante (Israelsen 1993) en la
medida en que se respeten la eacutepoca y el lugar de recoleccioacuten (Bennett et al 1990)
En contraste con los millones de doacutelares y antildeos de investigacioacuten necesarios para
desarrollar un nuevo medicamento por siacutentesis o incluso desde el prototipo de una fuente
natural el desarrollo de fitofaacutermacos estandarizados exige menos presupuesto y parece ser
perfectamente factible en los paiacuteses en desarrollo Esta aacuterea estaacute recibiendo mucha
atencioacuten en Brasil y en la mayoriacutea de los paiacuteses de Ameacuterica Latina Por otra parte la
comercializacioacuten de las fitomedicinas se ha expandido en todo el mundo durante los uacuteltimos
antildeos especialmente en paiacuteses de Europa como Alemania Francia Italia Reino Unido
Espantildea y maacutes recientemente tambieacuten en los Estados Unidos de Ameacuterica (Calixto 2005)
El intereacutes por las plantas medicinales y las fitomedicinas adopta diferentes
caracteriacutesticas en las diferentes partes del mundo De acuerdo a la Organizacioacuten Mundial de
la Salud aproximadamente el 65-80 de la poblacioacuten de los paiacuteses en desarrollo como
consecuencia de la pobreza y de la imposibilidad de acceso a la medicina moderna
dependen esencialmente de las plantas para la Atencioacuten Primaria de la Salud (Calixto
2005) En todo el continente africano alrededor del 80 de sus habitantes utilizan
fitomedicinas especialmente en el tratamiento de enfermedades que resultan prevalentes
en la zona tales como el VIHSIDA el paludismo la anemia falciforme o drepanociacutetica la
diabetes y la hipertensioacuten Los defensores de las fitomedicinas argumentan que son maacutes
beneficiosas que sus equivalentes sinteacuteticos por ser seguras econoacutemicas aceptables
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
2
culturalmente y adecuadas para tratamientos croacutenicos sugiriendo que su uso deberiacutea
integrarse a la agenda de Salud de dichos paiacuteses (Okigbo amp Mmeka 2006)
La produccioacuten de plantas medicinales y aromaacuteticas tiene una larga tradicioacuten en varios
paiacuteses de Europa tales como el Reino Unido Italia Grecia Alemania Austria y Francia
mientras que en Finlandia Irlanda y Holanda se ha establecido a lo largo de las uacuteltimas
deacutecadas (Verlet amp Leclercq 1998) Desde la deacutecada del 90 se ha producido un
resurgimiento en el intereacutes y el uso de productos de plantas medicinales en Ameacuterica del
Norte y Europa Estudios sobre el uso de plantas medicinales por el puacuteblico norteamericano
han mostrado un aumento en el consumo de casi el 3 de la poblacioacuten en 1991 a maacutes del
37 en 1998 Un factor importante que sin duda contribuyoacute a dicho incremento fue la
promulgacioacuten en ese paiacutes de la legislacioacuten federal de 1994 (Dietary Supplement Health and
Education Act) que facilitoacute la produccioacuten y comercializacioacuten de productos fitomedicinales y
el consiguiente ingreso de varias compantildeiacuteas farmaceacuteuticas importantes en la produccioacuten de
fitomedicinas (Brevoort 1998) En los paiacuteses desarrollados se ha venido dando un aumento
en el uso de la medicina complementaria y alternativa dentro de la cual se incluyen las
fitomedicinas Esto podriacutea deberse ademaacutes de a la tradicioacuten al bajo costo y a una
preocupacioacuten creciente por los efectos adversos de los faacutermacos sinteacuteticos Por otro lado la
esperanza de vida maacutes larga en dichos paiacuteses ha dado como resultado un aumento de los
riesgos de desarrollar enfermedades croacutenicas y debilitantes (las enfermedades coronarias
el caacutencer y la diabetes) y para muchos pacientes la medicina alternativa parece ofrecer
medios menos agresivos para el tramiento de dichas enfermedades que la medicina
alopaacutetica (OMS 2002)
Las Farmacopeas de diversos paiacuteses han recogido en sus monografiacuteas algunas de
las plantas medicinales de mayor difusioacuten La legislacioacuten europea sobre medicamentos
tambieacuten aborda el uso medicinal de los productos procedentes de las plantas El Comiteacute de
Medicamentos a Base de Plantas (HPMC) se constituyoacute en la Agencia Europea de
Medicamentos (EMA) para proporcionar monografiacuteas y entradas de la lista de sustancias y
sus preparados a base de hierbas Mientras tanto se han publicado aproximadamente 100
monografiacuteas donde se define el estaacutendar cientiacutefico y regulatorio vigente para asegurar la
eficacia y la seguridad de las sustancias vegetales y preparados vegetales utilizados en los
medicamentos (Knoumlss amp Chinou 2012)
La Farmacopea de los Estados Unidos de Ameacuterica (USP 32 ndash NF 27) contiene 76
monografiacuteas relacionadas con productos de origen vegetal Si bien existe una farmacopea
herbolaria bastante completa editada con el tiacutetulo de American Herbal Pharmacopoeia eacutesta
no tiene caraacutecter oficial La Farmacopea Mexicana (FEUM) por su parte registra 56
productos vegetales de aplicacioacuten en medicina En la actualidad ambas Farmacopeas
contienen un nuacutemero reducido de monografiacuteas de productos vegetales en comparacioacuten al
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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que registran sus homoacutelogas europeas En el caso del coacutedigo mexicano esta ausencia es
auacuten maacutes pronunciada y fue en el antildeo 2000 cuando se inicia un cambio con la publicacioacuten de
la Farmacopea Herbolaria la cual forma parte de la FEUM Esta publicacioacuten marca el inicio
del rescate del arsenal terapeacuteutico conocido y usado en Meacutexico desde siglos atraacutes (Schifter
Aceves et al 2009)
En cuanto a la Farmacopea Argentina en 2008 se renovoacute su Comisioacuten Permanente
quien ya ha producido la uacuteltima versioacuten de la misma (Farmacopea Argentina VIIIa Edicioacuten)
disponible en la paacutegina de la Administracioacuten Nacional de Alimentos Medicamentos y
Tecnologiacutea Meacutedica (ANMAT) en cuatro voluacutemenes1 el tercero de los cuales contiene un
ldquoApartado de Fitoteraacutepicosrdquo que incluye 29 monografiacuteas (ANMAT 2011)
La flora argentina se encuentra representada por maacutes de 8000 especies de plantas
superiores De ellas alrededor de 1600 son utilizadas por la poblacioacuten como ldquoremedio
caserordquo (Rondina et al 2010) en especial por parte de los sectores sociales de menor
acceso a los sistemas de salud
Un estudio sobre el nuacutemero de trabajos publicados entre 1984 y 2004 en revistas
cientiacuteficas indexadas con referato da cuenta del avance que ha tenido en los uacuteltimos antildeos la
investigacioacuten sobre productos naturales (especiacuteficamente plantas) en Ameacuterica Latina siendo
Brasil y luego Meacutexico Argentina y Chile los paiacuteses con mayor nuacutemero de publicaciones Los
estudios de domesticacioacuten produccioacuten biotecnologiacutea y de mejora geneacutetica de las plantas
medicinales son otros campos de la ciencia que se desprenden de tales avances en el uso
de plantas medicinales en Ameacuterica Latina (Calixto 2005)
Latinoameacuterica contiene gran parte de la biodiversidad de todo el mundo pero a pesar
de ello nuestros paiacuteses nunca han podido utilizarla en beneficio de su propio desarrollo
Peor auacuten como consecuencia de la explotacioacuten sin control la mayor parte de las aacutereas
relevantes en cuanto a biodiversidad se ha reducido sensiblemente antildeo tras antildeo mas allaacute
de los esfuerzos esporaacutedicos de algunos gobiernos por preservarla Inclusive el
conocimiento de la medicina tradicional tambieacuten estaacute desapareciendo especialmente el
derivado de las comunidades indiacutegenas originarias (Calixto 2005)
12 Generalidades de la Familia Bromeliaceae
La familia Bromeliaceae estaacute constituida por casi 3700 especies incluidas en 57
geacuteneros Tradicionalmente la familia ha sido subdividida en tres subfamilias Pitcairnioideae
Tillandsioideae y Bromelioideae La subfamilia Pitcairnioideae incluye a las bromeliaacuteceas
maacutes ancestrales y muchas de sus especies recuerdan a la familia de las gramiacuteneas
(Poaceae) de la cual evolucionaron La mayoriacutea son terrestres contando con un sistema
1 httpwwwanmatgovarwebanmatfnaoctava_edicionasp
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
4
extenso de raiacutez La subfamilia Tillandsioideae formada mayoritariamente por especies
epiacutefitas se ha adaptado para sobrevivir en condiciones muy secas las semillas tienen alas
lo que las hace susceptibles de ser dispersadas por el viento y apeacutendices plumosos que les
permite adherirse sobre superficies rugosas Bromelioideae es la subfamilia maacutes diversa
La mayoriacutea de sus especies tambieacuten son epiacutefitas aunque algunas se han adaptado a las
condiciones terrestres Estaacuten compuestas de un arreglo foliar espiralado denominado
ldquorosetardquo donde las bases foliares se superponen parcialmente y pueden funcionar como un
reservorio hiacutedrico Generalmente tienen hojas espinosas y sus semillas son a menudo
distribuidas por los paacutejaros y animales que consumen sus frutos carnosos (Bromeliad
Society International) Pero en base a recientes estudios geneacuteticos (Givnish et al 2011) los
geacuteneros de la subfamilia Pitcairnioideae han sido reagrupados en 6 subfamilias con lo que
la situacioacuten taxonoacutemica actual de las Bromeliaceae es la que se muestra en la Tabla 11
Subfamilia Geacutenero
Brocchinioideae Brocchinia
Lindmanioideae Connellia Lindmania
Hechtioideae Hechtia
Navioideae Brewcaria Cottendorfia Navia Sequencia Steyerbromelia
Pitcairnioideae Deuterocohnia Dyckia Encholirium Fosterella Pepinia Pitcairnia
Puyoideae Puya
Tillandsioideae
Alcantarea Catopsis Glomeropitcairnia Guzmania Mezobromelia
RacinaeaTillandsia Vriesea Werauhia
Bromelioideae
Acanthostachys Aechmea Ananas Androlepis Araeococcus Billbergia
Bromelia Canistropsis Canistrum Cryptanthus Deinacanthon Disteganthus
Edmundoa Eduandrea Fascicularia Fernseea Greigia Hohenbergia
Hohenbergiopsis Lymania Neoglaziovia Neoregelia Nidularium Ochagavia
Orthophytum Portea Pseudaechmea Pseudananas Quesnelia Ronnbergia
Ursulaea Wittrockia
Tabla 11 Subfamilias y geacuteneros de Bromeliaceae (Bromeliad Society International) Los geacuteneros incluidos en
esta subfamilia se encontraban originalmente dentro de las Pitcairnioideae
Las Bromeliaceae poseen un rango de haacutebitat muy amplio desde desiertos caacutelidos y
secos hasta bosques lluviosos y friacuteas regiones montantildeosas mostrando un rango de altitud
que va desde el nivel del mar hasta los 4700 metros La mayoriacutea se distribuye en
Sudameacuterica con el nuacutemero maacutes grande de especies halladas en Brasil se extienden desde
Chile y Argentina a traveacutes de Centroameacuterica y el Caribe alcanzando el liacutemite norte en los
alrededores de Virginia en el sudeste de los EEUU (Smith 1934) Una uacutenica especie
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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(Pitcairnia feliciana) ha sido encontrada en el oeste de Aacutefrica (Figura 11) A la Argentina
llegan 13 geacuteneros y alrededor de 120 especies (Flora del Conosur Cataacutelogo de las Plantas
Vasculares)
Figura 11 Distribucioacuten mundial de especies de Bromeliaceae lthttpcommonswikimediaorgwikiImage
WorldBromeliadDistributionjpggt
121 Importancia Usos
En la actualidad los usos ornamentales y comestibles son los maacutes difundidos dentro
de las Bromeliaceae siendo el ananaacute o pintildea (Ananas comosus L) el fruto maacutes ampliamente
consumido en el mundo El primer registro que se tiene data de 1493 cuando Cristobal
Coloacuten vio a los indiacutegenas cultivar la especie en las Antillas y a su regreso a Espantildea la
introduce en el ldquoViejo Mundordquo (Bromeliad Society International)
En Latinoameacuterica diversas especies de Bromeliaceae han sido de gran importancia
para el hombre desde tiempos ancestrales En las distintas regiones se les ha dado un uso
particular que puede ser enmarcado en las siguientes categoriacuteas ceremonial comestible
textil medicinal ornamental y combustible entre otros Un estudio reciente (Hornung-Leoni
2011) que incluye 78 especies de Bromeliaceae en 19 paiacuteses latinoamericanos demostroacute
que 33 de ellas son empleadas en Meacutexico Venezuela Peruacute y Bolivia para rituales y
ceremonias de las cuales el 73 corresponde a especies del geacutenero Tillandsia El uso
ornamental involucra 12 especies principalmente de los geacuteneros Tillandsia Aechmea y
Guzmania en Argentina Chile Venezuela y Meacutexico mientras que 2 especies de Puya son
usadas en Peruacute y Ecuador como combustibles Los usos comestibles medicinales y para la
extraccioacuten de fibras han sido registrados para 24 19 y 17 especies respectivamente a lo
largo de numerosos paiacuteses y seraacuten detallados a continuacioacuten
1211 Uso comestible
Ademaacutes de Ananas comosus Bromelia pinguin es una de las especies maacutes usadas
como comestible Se consumen sus frutos raiacuteces semillas y flores tanto directamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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como para la preparacioacuten de dulces refrescos postres y guisos Su uso estaacute extendido
desde Meacutexico y las Antillas hasta el norte de Sudameacuterica y Ecuador Hojas de especies de
Tillandsia y Puya son empleadas para envolver bollos tipo ldquotamalesrdquo en Venezuela
Colombia y norte de los Andes Sudamericanos asiacute como tambieacuten se consumen brotes de
otras especies de Tillandsia en Bolivia y Argentina Los frutos de B balansae se comen
asados en algunas zonas de Brasil (Hornung-Leoni 2011)
Distintos grupos eacutetnicos del Chaco paraguayo y argentino consumen frutos maduros
cocidos o crudos de Bromelia serra y B balansae siendo sus semillas tambieacuten empleadas
a partir de las cuales se obtiene un polvo que se consume directamente o bien se utiliza
para hacer sopa Las partes vegetativas de B serra B hieronymi y Dickya ferox tambieacuten
son consumidas Si bien las partes maacutes usadas son las vainas foliares joacutevenes y el eje
vertical de las rosetas basales (Suaacuterez amp Montani 2010) el consumo de los brotes joacutevenes
(ejes laterales) de B hieronymi es una nueva modalidad entre los nintildeos (Arenas 2004)
1212 Obtencioacuten de fibras
El empleo de las Bromeliaceae para la extraccioacuten de fibras es de gran importancia
para el desarrollo de numerosas comunidades a lo largo del continente Las fibras son
destinadas a la fabricacioacuten de varios productos tanto para uso propio de las comunidades
como para su comercializacioacuten2 Hamacas bolsas de mano redes para la pesca puntas de
flecha sillas de montar cesteriacutea sacos cordeleriacutea para adornar vestimentas sombreros
zapatos sandalias y cinturones objetos para uso ceremonial son algunos de los ejemplos
Diversas especies del geacutenero Aechmea son usadas por distintos indiacutegenas en
Meacutexico y Ecuador principalmente A magdalenae a partir de la cual se obtiene una fibra
(conocida como ldquoixtlerdquo o ldquofibra de pitardquo) de gran resistencia usada en la fabricacioacuten de
elementos para la pesca La fibra obtenida de varias especies de Ananas spp
caracterizada por su flexibilidad es empleada para tejidos hamacas y cestas en Venezuela
Tillandsia usneoides es utilizada para rellenar colchones y como material de empaque en
Ecuador En Chile de las hojas de Puya chilensis se obtiene una fibra resistente empleada
para las redes de pesca Fibras duras son extraidas de B pinguin en Meacutexico y Nicaragua
(Hornung-Leoni 2011)
Las fibras de Bromelia hieronymi Mez (conocida como chaacuteguar) son utilizadas por
indiacutegenas del Gran Chaco En cambio el uso textil de B balansae Mez y B serra Griseb no
es certero ya que aunque en la bibliografiacutea consta el empleo de sus fibras por parte de
vilelas y tobas orientales no ha sido registrado en trabajos de campo recientes La fibra maacutes
apreciada por distintas etnias chaquentildeas es la obtenida a partir de Deinacanthon
urbanianum Mez que debido a su durabilidad y resistencia es usada para la elaboracioacuten de
2 Productos elaborados con fibras de ldquobromeliaacuteceas textilesrdquo por la comunidad Wichi (Sastre et al 2013)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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objetos para la pesca Sin embargo su escasez ha llevado a su reemplazo por B hieronymi
Nativos de filiacioacuten guaraniacute en el Paraguay oriental asiacute como los makaacute asentados en las
inmediaciones del riacuteo Paraguay usan como textil las fibras obtenidas de Pseudananas
sagenarius mientras que su uso por parte de nativos del Chaco consta soacutelo en la literatura
(Arenas 1997)
A pesar del uso difundido de las ldquoBromeliaacuteceas textilesrdquo entre numerosas
comunidades son pocas las empleadas como materia prima para la industria En Argentina
a fines del siglo XIX se iniciaron estudios teacutecnicos a fin de evaluar el uso de las
Bromeliaceae con fines textiles Industrias extractoras de fibras fueron instalaacutendose en
Corrientes Chaco Formosa Santiago del Estero y Tucumaacuten pero tuvieron corta duracioacuten
Sin embargo con la Segunda Guerra Mundial y el consecuente desabastecimiento de yute
caacutentildeamo y lino textil se reiniciaron las tareas exploratorias impulsadas por el Estado (Res Nordm
949-46 del Ministerio de Agricultura) llegaacutendose a hacer estudios de cultivos en campos de
experimentacioacuten en distintas provincias del norte Como resultado de tales estudios se
concluyoacute que las Bromeliaceae factibles de uso textil en orden creciente de importancia
industrial son Pseudananas sagenarius Bromelia hieronymi B balansae B serra
Deinacanthon urbanianum Dyckia ferox y Aechmea distichantha adjudicaacutendoles potencial
para la elaboracioacuten de telas tipo batista cuerdas para pescar y telas de arpillera entre otros
Las dificultades con el mercado asiacute como las deficiencias teacutecnicas en la explotacioacuten y la
maquinaria de extraccioacuten no posibilitaron el desarrollo de esta industria en Argentina
(Arenas 1997) En Brasil sin embargo existen pequentildeas industrias textiles extractoras de
fibras de B laciniosa y Neoglaziovia variegata (Hornung-Leoni 2011)
1213 Usos medicinales
Diversas especies del geacutenero Hechtia tienen importancia medicinal en Meacutexico H
glomerata ha sido empleada contra el catarro y la bronquitis las hojas masticadas o
hervidas de H melanocarpa se usan para el tratamiento de la diabetes mientras que el teacute
obtenido de hojas de H podantha es usado como diureacutetico Puya gummifera es empleada
en Ecuador para dolencias de rintildeoacuten mientras que en Chile empleaban como emoliente y
astringente las secreciones de sus inflorescencias producto de las picaduras de las larvas
de mariposas Tambieacuten en Chile es usada P berteroniana como emoliente e infusiones de
tallos y hojas de P chilensis se emplean como antiinflamatorio y para aliviar fiebre y
diarreas Las raiacuteces de Pitcairnia pungens son utilizadas como diureacutetico en Ecuador
(Hornung-Leoni 2011) En Argentina personas pertenecientes a comunidades Wichiacute de
Salta han sentildealado que diversas especies de Tillandsia pueden ser utilizadas para aliviar el
dolor causado por dislocaciones o fracturas (Suaacuterez amp Montani 2010) Tillandsia dasyliriifolia
y T elongata han sido empleadas contra el catarro y la bronquitis en Meacutexico en tanto que T
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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aeranthos (el ldquoclavel del airerdquo) es usada como antiespasmoacutedico y para el tratamiento de
afecciones oculares en Sudameacuterica (Hornung-Leoni 2011)
Dentro de las especies del geacutenero Bromelia B pinguin es conocida por sus
propiedades medicinales en Centroameacuterica Cuba y en algunas regiones de Meacutexico Su fruto
es usado como antihelmiacutentico pero tambieacuten como diureacutetico y antirreumaacutetico Las hojas de
B karatas son utilizadas en algunas regiones de Meacutexico como antiinflamatorio (Hornung-
Leoni 2011) En Brasil los frutos de B balansae son usados por la medicina popular como
jarabe para la tos (Coelho 2010) y el jugo de los frutos de B fastuosa (gravataacute) para el
tratamiento de la bronquitis y el asma (Guimaraes-Ferreira et al 2007)
El uso medicinal de Ananas comosus trasciende a las comunidades latinoamericanas
asentadas en las regiones en las cuales es autoacutectona Desde los tiempos de la colonizacioacuten
la pulpa se empleaba por las comunidades aboriacutegenes para tratar parasitosis intestinales
accioacuten que fue sustentada por los meacutedicos europeos de la eacutepoca (Patintildeo 2002) Tambieacuten
ha sido utilizada como coadyuvante de la digestioacuten (Hornung-Leoni 2011)
El extracto obtenido a partir de A comosus conocido como bromelina o bromelaiacutena
es comercializado desde mediados de la deacutecada del acute50 y desde entonces se han publicado
numerosos trabajos cientiacuteficos en relacioacuten a sus propiedades terapeacuteuticas antiinflamatoria
antitromboacutetica fibrinoliacutetica antitumoral antimetastaacutesica inmunomodulador promotora de la
absorcioacuten de antibioacuteticos debridante de heridas y cicatrizante (Maurer 2001) La bromelina
ha sido usada como agente antiinflamatorio y antiedematoso en casos de artritis lesiones
deportivas traumatismos edema posquiruacutergico quemaduras y como complementario a la
quimioterapia (Bhui 2012) Actualmente la bromelina es un producto medicinal popular para
el tratamiento de la inflamacioacuten y trastornos digestivos (Hornung-Leoni 2011) Es de libre
venta en farmacias y tiendas naturistas principalmente de Estados Unidos de Ameacuterica y
paiacuteses de Europa como un producto meacutedico sin licencia (Brien et al 2004) La
Administracioacuten de Drogas y Alimentos de EEUU (Food and Drug Administration FDA)
considera a la bromelina dentro del subcapiacutetulo correspondiente a los alimentos para
consumo humano y en tal caraacutecter es categorizada como GRAS (Generally Recognized as
Safe) No hace referencia a su utilizacioacuten como medicamento (FDA 2012) Por su parte la
Agencia Europea de Medicinas (European Medicines Agency) ha aprobado muy
recientemente un producto conteniendo bromelina para su uso como debridante de las
escaras producidas como consecuencia de quemaduras (European Medicines Agency
2012)
Si bien los extractos obtenidos tanto a partir de tallos como de frutos de A comosus
son una mezcla compleja de fosfatasas glucosidasas peroxidasas celulasas inhibidores
glicoproteiacutenas y carbohidratos (todos poco caracterizados) los componentes responsables
de sus acciones antihelmiacutentica antiedematosa antiinflamatoria fibrinoliacutetica antitromboacutetica
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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antitumoral debridante de heridas asiacute como aceleradora de la cicatrizacioacuten de heridas
parecieran ser las proteasas cisteiacutenicas presentes en grandes cantidades (Maurer 2001
Salas et al 2008)
13 Tipos de Proteasas Distribucioacuten y Rol en los Vegetales
131 Proteasas Tipos y sistemas de clasificacioacuten
Se conoce como proteasas a las enzimas que catalizan la degradacioacuten de las
proteiacutenas (proteoacutelisis) mediante la adicioacuten de una moleacutecula de agua en los enlaces
peptiacutedicos Aunque el Comiteacute de Nomenclatura de la Unioacuten Internacional de Bioquiacutemica y
Biologiacutea Molecular3 (NC-IUBMB) ha recomendado usar el teacutermino peptidasa para referirse a
estas enzimas en trabajos recientes se siguen utilizando alternativamente las
denominaciones proteasa enzima proteoliacutetica o proteinasa por lo que en la presente tesis
usaremos estos teacuterminos indistintamente
Un sistema de nomenclatura y clasificacioacuten de proteasas es fundamental para el
manejo de la informacioacuten A pesar de que existe una gran variedad de proteasas distribuidas
en los siete reinos (Archaea Bacteria Protozoa Fungi Planta Animalia y Virus) que
cumplen roles fisioloacutegicos muy distintos la existencia de caracteriacutesticas comunes permitioacute
establecer sistemas de clasificacioacuten Estos se basan en los mecanismos cataliacuteticos las
regiones de la cadena polipeptiacutedica sobre las que actuacutean las relaciones evolutivas y la
homologiacutea de sus secuencias
Antes del establecimiento de un organismo reconocido internacionalmente que fijara
pautas de clasificacioacuten y nomenclatura para las enzimas Hartley (1960) propuso clasificar
las proteasas teniendo en cuenta su mecanismo cataliacutetico Este criterio dio lugar a cuatro
clases o tipos cataliacuteticos de peptidasas seriacutenicas cisteiacutenicas aspaacuterticas y
metalopeptidasas La denominacioacuten hace referencia al grupo quiacutemico del sitio cataliacutetico
responsable de la actividad enzimaacutetica serina cisteiacutena aacutecido aspaacutertico e ioacuten metaacutelico
(frecuentemente Zn2+ Mn2+ Co2+) respectivamente Maacutes recientemente fueron incorporados
otros dos tipos las peptidasas glutaacutemicas (Kakudo et al 1992) y treoniacutenicas (Barrett et al
1998)
No obstante estas diferencias los seis tipos cataliacuteticos se pueden agrupar en dos
categoriacuteas las que forman complejos covalentes entre la enzima y el sustrato (peptidasas
seriacutenicas cisteiacutenicas y treoniacutenicas) donde el nucleoacutefilo del sitio cataliacutetico es parte de un
aminoaacutecido (serina cisteiacutena o treonina respectivamente) y las que no forman complejos
enzima-sustrato covalentes (peptidasas aspaacuterticas glutaacutemicas y metalopeptidasas) siendo
responsable del ataque nucleofiacutelico una moleacutecula de agua activada
3 lthttpwwwchemqmulacukiubmbgt
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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1311 Sistema EC de clasificacioacuten de enzimas
En 1961 quedoacute establecido el sistema de clasificacioacuten y nomenclatura de enzimas de
la Comisioacuten Internacional de Enzimas (Enzyme Commission EC) actualmente NC-IUBMB
Basaacutendose en el tipo de reaccioacuten que catalizan la EC agrupoacute las enzimas en seis clases y
les asignoacute un coacutedigo numeacuterico Oxidorreductasas (1) Transferasas (2) Hidrolasas (3)
Liasas (4) Isomerasas (5) y Ligasas (6)
Dentro de la clase 3 (hidrolasas) se agrupan las enzimas que catalizan la reaccioacuten de
escisioacuten de un enlace mediante la adicioacuten de una moleacutecula de agua Los productos de esta
reaccioacuten son dos moleacuteculas a una de las cuales se ha unido el hidroacutegeno y a la otra el
hidroxilo provenientes ambos de la hidroacutelisis del agua
R1-R2 + H2O R1-OH + R2-H
Hidrolasa
Las enzimas de la clase 3 se subagrupan en funcioacuten del enlace quiacutemico sobre el que
actuacutean Asiacute si el enlace entre R1 y R2 es el grupo amida de la unioacuten peptiacutedica las hidrolasas
que catalizan tal reaccioacuten son peptidasas y pertenecen a la subclase 34 (EC 34) la que a
su vez se divide en catorce sub-subclases como se muestra en la Tabla 12
Sub-subclases Descripcioacuten Cantidad
Exopeptidasas
EC 3411 Aminopeptidasas 26 76
EC 3413 Dipeptidasas 11 32
EC 3414 Dindash y trindashpeptidil-peptidasas 8 23
EC 3415 Peptidil-dipeptidasas 4 12
EC 3416 Carboxipeptidasas Tipo Serina 4 12
EC 3417 Metalocarboxipeptidasas 20 58
EC 3418 Carboxipeptidasas Tipo Cisteiacutena 1 03
EC 3419 Omega peptidasas 11 32
Endopeptidasas
EC 3421 Endopeptidasas Seriacutenicas 98 285
EC 3422 Endopeptidasas Cisteiacutenicas 98 285
EC 3423 Endopeptidasas Aspaacuterticas 41 119
EC 3424 Metaloendopeptidasas 20 58
EC 3425 Endopeptidasas Treoniacutenicas 2 06
EC 3499 Endopeptidasas de mecanismo desconocido 0 0
Total 344 100
Tabla 12 Sub-subclases de peptidasas (34) seguacuten el sistema EC (Consultado 12112012)
Las peptidasas EC 3411 a EC 3419 son exopeptidasas mientras que las EC 3421
a EC 3425 y EC3499 son endopeptidasas Las exopeptidasas hidrolizan
secuencialmente uno o maacutes aminoaacutecidos desde los extremos carboxilo (carboxipeptidasas)
amino (aminopeptidasas) o extremos sustituidos ciclados o unidos por uniones
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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isopeptiacutedicas (omegapeptidasas) Las que atacan el N-terminal pueden liberar un uacutenico
residuo aminoaciacutedico (aminopeptidasas EC 3411) o un di- o tripeacuteptido (di- y tripeptidil-
peptidasas EC 3414) A su vez las que actuacutean sobre el C-terminal pueden liberar un uacutenico
amino aacutecido (carboxipeptidasas EC 3416-18) o un dipeacuteptido (peptidil-dipeptidasas EC
3415)
Las endopeptidasas hidrolizan las uniones peptiacutedicas internas de la proteiacutena y si
actuacutean sobre pequentildeos peacuteptidos se denominan geneacutericamente oligopeptidasas (Barrett
2001)
Como puede observarse la clasificacioacuten propuesta por Hartley quedoacute incorporada en
el sistema EC Las carboxipeptidasas se agrupan seguacuten el mecanismo cataliacutetico en
metalocarboxipeptidasas (EC 3417) seriacutencarboxipeptidasas (EC 3416) y
cisteiacutencarboxipeptidasas (EC 3418) mientras que las endopeptidasas se agrupan en
seriacutenicas (EC 3421) cisteiacutenicas (EC 3422) aspaacuterticas (EC 3423) treoniacutenicas (EC
3425) y metaloendopeptidasas (EC 3424)
1312 El sistema MEROPS de clasificacioacuten de peptidasas
Desde mediados del siglo XX a la actualidad la Biologiacutea Molecular (BM) ha aportado
conocimientos no soacutelo referentes a los mecanismos de accioacuten de las enzimas sino tambieacuten
a sus estructuras La posibilidad de conocer las secuencias de aminoaacutecidos de las
proteiacutenas asiacute como su conformacioacuten espacial permitioacute establecer nuevos criterios de
clasificacioacuten de las enzimas que a su vez a la luz del Dogma Central de la BM refleja las
relaciones evolutivas entre ellas
Asiacute Rawlings y Barrett (1993) haciendo uso del gran nuacutemero de secuencias
aminoaciacutedicas de las que disponiacutean dieron a conocer un nuevo sistema de clasificacioacuten de
peptidasas basado en las similitudes estructurales de las proteiacutenas Seguacuten el grado de
homologiacutea las peptidasas fueron agrupadas en familias y eacutestas a su vez en clanes Para
1996 este sistema habiacutea dado lugar a la base de datos MEROPS4 Los tres niveles de
clasificacioacuten se definen a continuacioacuten
Clan Es un conjunto de familias cuyas peptidasas tienen un origen evolutivo comuacuten
que si bien no llega a evidenciarse por comparacioacuten de sus secuencias de aminoaacutecidos siacute
por las similitudes de sus estructuras terciarias Se construye por comparacioacuten de las
estructuras terciarias y cuando no estaacuten disponibles se comparan los ordenamientos de
aminoaacutecidos cataliacuteticos en la cadena polipeptiacutedica o las secuencias aminoaciacutedicas alrededor
de los aminoaacutecidos cataliacuteticos
Familia Se construye por comparacioacuten de la estructura primaria Estaacute constituida por
peptidasas cuyas secuencia de aminoaacutecidos que debe incluir la secuencia de la ldquounidad
4 lthttpmeropssangeracukgt
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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peptidasardquo (regioacuten de la proteiacutena responsable de la actividad cataliacutetica) presentan similitudes
estadiacutesticamente significativas
Peptidasa Cada proteiacutena con actividad peptidasa recibe un nombre y un
identificador (ID MEROPS) Se diferencian por su estructura funcioacuten bioloacutegica sustrato
mecanismo cataliacutetico y origen geneacutetico
Dentro de algunas familias se han detectado dos o maacutes grupos de peptidasas con
suficientes diferencias como para constituir una subfamilia Del mismo modo algunos clanes
han sido divididos en subclanes que contienen familias que evidencian una muy antigua
divergencia
El sistema MEROPS tambieacuten tuvo en cuenta la clasificacioacuten de Hartley ya que en la
asignacioacuten de los identificadores a las familias clanes y peptidasas se usaron letras que
hacen referencia al tipo cataliacutetico de las peptidasas que las integran S (seriacutenicas) C
(cisteiacutenicas) T (treoniacutenicas) A (aspaacuterticas) G (glutaacutemicas) M (metalopeptidasas) N
(asparagiacutenicas) y U (mecanismo desconocido)
La letra P es utilizada para identificar clanes que contienen familias de peptidasas de
maacutes de un tipo cataliacutetico El identificador de un clan se completa con una segunda letra
mayuacutescula asignada secuencialmente (por ejemplo clan CA) y el identificador para una
familia es completado con un nuacutemero (por ejemplo C1 la familia de la papaiacutena) El
identificador MEROPS para cada peptidasa individual comienza con el identificador de
familia y se completa con un nuacutemero decimal (por ejemplo C01005 para bromelaiacutena de
tallo) La versioacuten 97 de la base de datos actualizada al 1ordm de octubre de 2012 cuenta con
320834 secuencias de las cuales 113968 corresponden a peptidasas seriacutenicas 118637 a
metalopeptidasas 52745 a peptidasas cisteiacutenicas 14225 a peptidasas aspaacuterticas 11439 a
peptidasas treoniacutenicas 338 a peptidasas glutaacutemicas 3222 a peptidasas asparagiacutenicas
6256 a peptidasas de tipo cataliacutetico desconocido y 4 inclasificables La base contiene
ademaacutes 520 estructuras (Rawlings et al 2012)
132 Distribucioacuten de Proteasas en los Seres Vivos
En la Tabla 13 se consigna la distribucioacuten de las familias de proteasas en 8546
organismos de los distintos reinos Dentro del reino vegetal la mayoriacutea de las familias estaacuten
constituidas por peptidasas del tipo metaloproteasas (34101) seriacutenicas (22101) y
cisteiacutenicas (20101) Sin embargo el mayor nuacutemero de peptidasas registradas son las
seriacutenicas (29) seguidas por las aspaacuterticas (25) y las cisteiacutenicas (24) La mayoriacutea de las
proteasas cisteiacutenicas en plantas pertenecen a la familia de la papaiacutena (C1)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
13
Reino
Tipo de peptidasas Bacteria Archaea Protozoa Fungi Planta Animalia Virus
Aspaacuterticas 9 5 6 6 9 7 4
Cisteiacutenicas 27 11 20 16 20 22 30
Glutaacutemicas 2 1 - 1 - - 1
Metalopeptidasas 62 34 32 34 34 33 14
Seriacutenicas 25 18 20 16 22 25 18
Treoniacutenicas 1 1 1 1 1 1 -
Asparagiacutenicas 3 - - - - - 6
Distintos Tipos 20 13 15 13 14 18 25
Mecanismo Desconocido 7 4 2 1 1 3 2
Totales 156 87 96 88 101 109 100
Tabla 13 Distribucioacuten de familias de peptidasas de organismos de diferentes reinos en el sistema propuesto por MEROPS (httpmeropssangeracuk consultado 12112012)
133 Rol de las peptidasas en los vegetales
La proteoacutelisis es vital para las ceacutelulas Por un lado es necesaria para el recambio
proteico permitiendo que proteiacutenas dantildeadas mal plegadas o innecesarias sean eliminadas
a la vez que los aminoaacutecidos liberados sean utilizados para la siacutentesis de nuevas proteiacutenas
Por otro lado la degradacioacuten proteica en sitios especiacuteficos es una de las modificaciones
postraduccionales necesaria para que las proteiacutenas sean funcionalmente activas por
ejemplo para la activacioacuten de proenzimas o bien permitiendo el ensamblado de proteiacutenas y
su direccionamiento hacia distintos compartimientos celulares La degradacioacuten proteica
tambieacuten sirve como mecanismo de control celular si el sustrato son proteiacutenas regulatorias
La principal viacutea proteoliacutetica en las ceacutelulas eucariotas estaacute mediada por el sistema
ubiquitinaproteasoma la proteiacutena que debe ser degradada es marcada por unioacuten a la
ubiquitina facilitando la direccioacuten al complejo proteasomal efector de la hidroacutelisis
En las plantas el recambio proteico es considerado fundamental para el crecimiento
Ejemplos de ello son la degradacioacuten de proteiacutenas de reserva durante la germinacioacuten de las
semillas o la removilizacioacuten de proteiacutenas luego de la senescencia foliar con la relocalizacioacuten
de fuentes de N en los oacuterganos reproductivos Maacutes recientemente con la asociacioacuten
encontrada entre el sistema ubiquitinaproteasoma y la embriogeacutenesis la fotomorfogeacutenesis
los ritmos circadianos el desarrollo de flores y tricomas asiacute como la sentildealizacioacuten hormonal
la degradacioacuten selectiva de proteiacutenas ha tomado relevancia como mecanismo de regulacioacuten
de numerosos procesos de crecimiento y desarrollo en las plantas (Schaller 2004)
En Arabidopsis thaliana la primer planta en tener su genoma completamente
secuenciado se han encontrado maacutes de 600 genes de proteasas de todos los tipos
cataliacuteticos a excepcioacuten de las glutaacutemicas ademaacutes de 1300 genes asociados con el sistema
ubiquitina-proteasoma (Schaller 2004) Puesto que Arabidopsis es tomada como modelo
para el estudio fitobioloacutegico la falta de exclusividad del sistema proteasomal en la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
14
degradacioacuten proteica podriacutea ser extensible a otras especies vegetales El anaacutelisis en
alrededor de cien genomas ha demostrado que aproximadamente un 2 de todos los
productos geacutenicos son peptidasas evidenciaacutendose asiacute que se trata de uno de los grupos
funcionales de proteiacutenas maacutes grandes e importantes (Barrett et al 2004)
En el trabajo de revisioacuten y actualizacioacuten sobre el rol regulatorio de proteasas vegetales
Schaller (2004) cita referencias sobre proteasas (de todos los tipos cataliacuteticos a excepcioacuten
de las treoniacutenicas y las glutaacutemicas) claves para varios procesos bioloacutegicos de las plantas
destacaacutendose las funciones en la degradacioacuten proteica y movilizacioacuten de nitroacutegeno durante
la germinacioacuten de las semillas y la senescencia foliar el procesamiento de proteiacutenas de
reserva durante su acumulacioacuten en semillas diferentes eventos de la muerte celular
programada (iniciacioacuten regulacioacuten y autolisis) la resistencia a insectos y patoacutegenos la
digestioacuten de insectos en plantas carniacutevoras la sentildealizacioacuten por brasinoesteroides y en la
regulacioacuten de procesos de desarrollo y crecimiento tales como la diferenciacioacuten xilemaacutetica
la densidad de estomas y la formacioacuten lateral de raiacuteces del patroacuten embrionario y del
meristema apical entre otros
1331 Peptidasas cisteiacutenicas
Seguacuten el sistema MEROPS las peptidasas cisteiacutenicas estaacuten distribuidas en 76 familias
agrupadas en 13 clanes Dentro del reino Planta las proteasas cisteiacutenicas son una de las
maacutes conocidas por ser el tipo cataltico en que se centraron los primeros estudios sobre
proteasas vegetales En las plantas la mayoriacutea de las proteasas cisteiacutenicas pertenecen a
las familias de la papaiacutena (C1) y la legumaiacutena (C13) (Schaller 2004)
A nivel subcelular las proteasas cisteiacutenicas se localizan en vacuolas y en la pared
celular (Grudkowska amp Zagdańska 2004) sin embargo actividad tipo caspasa en plantas ha
sido detectada en el citosol pero no en vacuolas (Korthout et al 2000) En cuanto a su
distribucioacuten en la planta se han encontrado proteasas en praacutecticamente todos los oacuterganos
vegetales (Salas et al 2008)
Durante la maduracioacuten de las semillas las proteiacutenas de reserva son sintetizadas como
precursores que deben ser procesados para su ensamblado y acumulacioacuten (Jung et al
1998) Ese procesamiento ha sido atribuido a proteasas tipo legumaiacutenas conocidas como
enzimas de procesamiento vacuolar (VPE) (Hara-Nishimura et al 1998 Kinoshita et
al1999) Por otro lado dentro de las proteasas responsables de la degradacioacuten y
movilizacioacuten de proteiacutenas de reserva las cisteiacutenicas son las maacutes abundantes e incluye
ademaacutes de las legumaiacutenas a las del tipo papaiacutena (Grudkowska amp Zagdańska 2004)
Una caracteriacutestica de las proteasas cisteiacutenicas es que responden a estiacutemulos internos y
externos Ante el estreacutes abioacutetico la sequiacutea y el shock teacutermico algunas proteiacutenas son
dantildeadas o innecesarias hacieacutendose imprescindible la siacutentesis de nuevas proteiacutenas Este
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
15
recambio proteico conlleva un considerable aumento en la siacutentesis de proteasas cisteiacutenicas
hecho demostrado en las hojas de trigo ante el deacuteficit de agua Por otra parte los
aminoaacutecidos liberados actuacutean regulando la presioacuten osmoacutetica celular La induccioacuten de
proteasas cisteiacutenicas principalmente tipo papaiacutena y tipo caspasas acompantildea la muerte
celular programada la cual estaacute asociada con procesos de desarrollo y diferenciacioacuten
vegetal tales como la xilogeacutenesis y la senescencia asiacute como tambieacuten con las respuestas de
defensa (Grudkowska amp Zagdańska 2004)
Algunas proteiacutenas vegetales han sido clasificadas como proteiacutenas ldquoprescindiblesrdquo
puesto que algunas especies pueden sobrevivir sin ellas mientras que otras especies o
variedades dentro de la misma especie las producen en elevadas cantidades siendo poco
claro su rol fisioloacutegico en la planta Dentro de esta categoriacutea entran las proteasas presentes
en cantidades extremadamente altas principalmente en laacutetex y frutos caracteriacutesticas de
ciertas familias (Caricaceae Bromeliaceae y Moraceae) dado que si bien podriacutean
desempentildearse en la defensa contra la invasioacuten de patoacutegenos no se explica la variedad de
contenido proteoliacutetico entre especies altamente relacionadas (Adams amp Rinne 1981) En
estos casos las actividades proteoliacuteticas detectadas son al menos dos oacuterdenes de magnitud
mayores que las actividades encontradas en tejidos comparables de la mayoriacutea de otras
plantas (Glazer amp Smith 1971) Puesto que la siacutentesis acumulacioacuten y utilizacioacuten de las
proteiacutenas ldquoprescindiblesrdquo ocurre en determinados periacuteodos que podriacutean estar relacionados
con estadios del desarrollo de la planta se les ha asignado un posible rol como metabolitos
secundarios (Adams amp Rinne 1981) La sorprendente similitud bioquiacutemica (elevada
estabilidad amplia especificidad y baja tendencia autoliacutetica) de las proteasas cisteiacutenicas
muy abundantes no indicariacutea un ancestro comuacuten sino maacutes bien una convergencia evolutiva
como resultado de una funcioacuten defensiva comuacuten (Boller 1986)
La actividad de proteasas cisteiacutenicas frente a diferentes estiacutemulos puede ser elevada
al 90 de la actividad proteoliacutetica total (Grudkowska amp Zagdańska 2004) En el caso de
Carica papaya L se ha demostrado que la produccioacuten de heridas repetidas en los frutos
aumentan la cantidad de proteiacutenas y la actividad proteoliacutetica en el laacutetex de la papaya lo cual
estaacute acorde con el posible rol de estas proteasas en la defensa de la planta (Azarkan et al
2006)
El papel desempentildeado por las proteasas en las respuestas de defensa en plantas
desencadenadas por patoacutegenos y pestes estaacute comenzando a aclararse No soacutelo
intervendriacutean en la ejecucioacuten directa del patoacutegeno como es el caso de la papaiacutena y otras
proteasas tipo papaiacutena sino tambieacuten en la percepcioacuten por parte del organismo defensor y en
las cascadas de sentildealizacioacuten involucradas con las respuestas de defensa (van der Hoorn amp
Jones 2004)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
16
14 Enzimas Proteoliacuteticas de Bromeliaceae
Varias especies de la familia Bromeliaceae se caracterizan por poseer endopeptidasas
en cantidades superiores a las fisioloacutegicamente necesarias (Barrett 2001) A pesar del
elevado nuacutemero de integrantes de la familia Bromeliaceae es muy reducido el nuacutemero de
geacuteneros todos pertenecientes a la subfamilia Bromelioideae que han sido estudiados hasta
la fecha en busca de enzimas proteoliacuteticas (Ananas Bromelia Hohenbergia y
Pseudananas) siendo Ananas comosus L (el ldquoananaacuterdquo o ldquopintildeardquo) la especie maacutes estudiada a
partir de cuyos tallos se obtiene la bromelina (Heinicke amp Gortner 1957) Otras proteasas de
Bromeliaceae que han sido aisladas y caracterizadas incluyen a la hemisfericina a partir de
frutos de Bromelia hemispherica (Agundis et al 1977 Ochoa et al 1987) pinguinina
obtenida de frutos de Bromelia pinguin (Toro-Goyco et al 1980 Abreu Payrol et al 2008)
karatasina aislada de frutos de Bromelia plumieri (Montes et al 1990) macrodontaiacutena I y II
de frutos inmaduros de Pseudananas macrodontes (Morr) Harms (Brullo et al 1994
Natalucci et al 1996 Loacutepez et al 2000 y 2001 Brullo 2003) balansaiacutena I de frutos
inmaduros de Bromelia balansae Mez (Pardo et al 2000) hieronymaina I II y III aisladas de
frutos inmaduros de Bromelia hieronymi Mez (Bruno et al 2003 2006 2008) fastuosaiacutena
extraiacuteda de frutos inmaduros de Bromelia fastuosa (Cabral et al 2006) y penduliflorain I
obtenida a partir de frutos de Hohenbergia penduliflora (Peacuterez et al 2010) Tambieacuten se han
aislado proteasas de frutos de otras especies de Bromelia B serra (Caffini et al 1988) B
laciniosa (Buttazzoni et al 1984 Priolo et al 1986) B palmeris y B sylvestris (Cruz et al
1974 Hernaacutendez Arana et al 1983)
Dado que el presente trabajo de tesis doctoral estaacute centrado en el estudio de posibles
aplicaciones farmacoloacutegicas de las proteasas presentes en frutos de Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes en comparacioacuten con la bromelina a continuacioacuten se
brinda un resumen de las principales caracteriacutesticas bioquiacutemicas de las proteasas aisladas a
partir de esos materiales
141 Endopeptidasas del ananaacute
Las endopeptidasas del ananaacute son de tipo cisteiacutenicas y pertenecen a la superfamilia de
la papaiacutena (C01) Conocidas en su conjunto como ldquobromelinardquo teacutermino que se ha
reemplazado en los uacuteltimos antildeos por ldquobromelaiacutenardquo En el presente trabajo se utilizaraacute
indistintamente cualquiera de los dos teacuterminos Rowan et al (1990) denominan ldquobromelaiacutena
de tallordquo a la principal endopeptidasa del tallo de ananaacute y ldquobromelaiacutena de frutordquo a la principal
endopeptidasa de fruto Adicionalmente dos endopeptidasas menores (ananaiacutena y
comosaiacutena) fueron separadas del tallo de ananaacute (Rowan et al 1988 1990) Actualmente y
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
17
en base a estudios geneacuteticos se considera que existen dos tipos de bromelinas de fruto
denominas ldquom-tipo 1rdquo y ldquom-tipo 2rdquo (Rawlings et al 2008)
1411 Bromelina de tallo
La bromelina de tallo (EC 342232) es la proteasa predominante (casi el 90) en los
extractos de tallos de Ananas comosus y se trata de una uacutenica cadena polipeptiacutedica
glicosilada de 245 kDa (Harrach et al 1995) con un punto isoeleacutectrico (pI) de 955
(Murachi 1970) conteniendo siete residuos Cys (Napper et al 1994 Harrach et al 1995) y
tres puentes disulfuro La secuencia aminoaciacutedica completa ha sido deducida por Ritonja et
al (1989) siendo su masa molecular de 22831 Da Para expresar su maacutexima actividad la
enzima requiere la presencia de agentes reductores tales como cisteiacutena El pH oacuteptimo tanto
con sustratos sinteacuteticos como proteicos es amplio (Rowan amp Buttle 1994) A pesar de su
elevada actividad sobre distintos sustratos proteicos actuacutea eficientemente sobre sustratos
sinteacuteticos que contengan uniones Arg-Arg (Rowan et al 1988 Napper et al 1994)
Tambieacuten se ha comunicado una cierta preferencia de la enzima por aminoaacutecidos polares en
las posiciones P1 y P1acute5 (Napper et al 1994) Una caracteriacutestica distintiva de esta proteasa
es su relativamente deacutebil inhibicioacuten por E-64 y la carencia de inhibicioacuten por cistatina de pollo
lo que la diferencia de la mayoriacutea de las peptidasas de la familia C1 (Rowan et al 1990)
1412 Ananaiacutena
Rowan et al (1988) lograron purificar una enzima distinta a la bromelina de tallo a la
que denominaron ananaiacutena (EC 342231) y que representa el 5 de las proteiacutenas totales
del extracto de tallo de ananaacute A diferencia de la bromelina de tallo la ananaiacutena muestra
baja preferencia por sustratos sinteacuteticos que contengan Arg-Arg y alta actividad frente a Z-
Phe-Arg-NHMec y a Bz-Phe-Val-Arg-NHMec Ananaiacutena muestra mayor preferencia por
aminoaacutecidos polares en la posicioacuten P1acute mientras que el requerimiento para el sitio P1 es
mucho menos especiacutefico (Napper et al 1994) en tanto que en el sitio P2 manifiesta
preferencia por una cadena lateral hidrofoacutebica (Rowan et al 1990) El pH oacuteptimo tanto con
sustratos sinteacuteticos como proteicos es cercano a la neutralidad (Rowan amp Buttle 1994)
Ananaiacutena no es glicosilada estaacute formada por una cadena proteica simple de 235 kDa
(Rowan et al 1988 Napper et al 1994 Harrach et al 1995) y su pI es gt 10 (Rowan et al
1988 Harrach et al 1995) Tambieacuten contiene siete residuos Cys (Napper et al 1994) La
secuencia primaria de ananaiacutena ha sido determinada comprobaacutendose que incluye un
inserto entre los residuos 170 y 174 que no estaacute presente en bromelina de tallo ni en
5 En el modelo ideado por Schechter y Berger (1967) para describir la especificidad de corte de las peptidasas
los residuos de aminoaacutecido del sustrato (P) se unen a subsitios del sitio activo de la enzima (S) Estos residuos se numeran a partir del enlace a ser clivado hacia el extremo N-terminal como P1 P2 P3 etc en tanto que los que se encuentran hacia el C-terminal se denominan P1 P2 P3 etc Los subsitios de la proteasa actuacutean acomodando los residuos del sustrato y se numeran como S1 S2 S3 y S1 S2 S3 respectivamente
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papaiacutena y una serie de aminoaacutecidos hidrofoacutebicos adyacentes a la His-157 (Lee et al 1997)
El comportamiento de la enzima frente a los inhibidores es similar al de la papaiacutena ya que
es eficientemente inhibida tanto por cistatina de pollo como por E-64 (Rowan et al 1988)
1413 Comosaiacutena
Comosaiacutena es la endopeptidasa menos abundante del extracto de tallo de ananaacute y
representa menos del 1 de las proteiacutenas totales Se trata de una glicoproteiacutena de 245 kDa
y pI gt 10 conteniendo siete residuos Cys y tiene una composicioacuten similar en carbohidratos a
la bromelina de tallo pero es marcadamente diferente en su composicioacuten aminoaciacutedica
(Napper et al 1994) Tiene actividad sobre Z-Arg-Arg-NHMec (Rowan et al 1990) muestra
preferencia por residuos polares tanto en el sitio P1 como P1acute y es inhibida por E-64
(Napper et al 1994)
1414 Bromelina de fruto
La preparacioacuten denominada ldquobromelina de frutordquo (EC 342233) constituye el 30-40
de las proteiacutenas totales del fruto representa casi el 90 del material proteoliacuteticamente
activo (Murachi 1970) y al igual que la bromelina de tallo tiene un amplio pH oacuteptimo frente a
sustratos proteicos y sinteacuteticos (Rowan amp Buttle 1994) Se trata de una cadena polipeptiacutedica
simple de aproximadamente 25 kDa (Rowan et al 1990) cuyo pI es 46 y parece no
tratarse de una glicoproteiacutena (Ota et al 1985) La secuencia N-terminal es ideacutentica a la de
bromelina de tallo (Yamada et al 1976) pero es inmunoloacutegicamente distinta de eacutesta y de
ananaiacutena (Rowan et al 1990)Tiene preferencia por el sustrato sinteacutetico Bz-Phe-Val-Arg-
NHMec y no por Z-Arg-Arg-NHMec lo que la diferencia de la bromelina de tallo (Rowan et
al 1990)
142 Balansaiacutena
Utilizando frutos semimaduros de Bromelia balansae Mez Natalucci et al (1988)
obtienen una preparacioacuten proteoliacutetica activa en un rango de pH amplio (60ndash95) que se
resuelve en tres fracciones proteoliacuteticamente activas por cromatografiacutea de intercambio
ioacutenico Posteriormente Pardo et al (2000) estudiaron las proteasas presentes en frutos en
distintos estadios de maduracioacuten determinaacutendose un aumento en el nuacutemero de proteiacutenas
con diferente pI y un incremento en el contenido de proteiacutenas totales y de azuacutecares a
medida que avanza el grado de madurez La actividad caseinoliacutetica y la actividad especiacutefica
fueron mayores en los estadios de menor madurez Mediante purificacioacuten parcial por
precipitacioacuten etanoacutelica lograron retener el 92 de la actividad enzimaacutetica y el 83 de las
proteiacutenas iniciales eliminaacutendose el 45 de los azuacutecares contenidos en el extracto crudo
Dicha preparacioacuten mostroacute alta estabilidad teacutermica conservaacutendose un 80 de actividad
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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proteoliacutetica luego de ser incubada durante 2 h a 45 ordmC Una banda activa de pI 55
(balansaiacutena I) se encontroacute en cantidades apreciables durante todo el proceso de
maduracioacuten mientras que otra banda activa de pI 87 (balansaiacutena II) soacutelo pudo encontrarse
en cantidades apreciables en frutos maduros trataacutendose en ambos casos de
cisteiacutenendopeptidasas
El peso molecular de Balansaiacutena I determinado por espectrometriacutea de masas (MALDI-
TOF) fue de 23192 Da y por electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-
PAGE) fue 244 kDa su pH oacuteptimo frente a caseiacutena fue 87 y conservoacute maacutes del 80 de
actividad en el rango de pH 58 a 100 Balansaiacutena I mostroacute preferencia por los derivados
Ala y Gln de N-α-CBZ-p-Nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos seguido por los de Gly Tyr y Leu
La secuencia N-terminal muestra gran similitud con las proteasas del ananaacute (Pardo et al
2000)
143 Hieronymaiacutenas
A partir de frutos inmaduros de Bromelia hieronymi Mez Bruno et al (2002) obtienen
extractos parcialmente purificados por precipitacioacuten acetoacutenica (PAR) y etanoacutelica (PER)
conteniendo alta cantidad de proteiacutenas (91 en el PAR y 79 en el PER) y de actividad
caseinoliacutetica (90 en el PAR y 83 en el PER) respecto al extracto crudo de partida
mientras se eliminan la mayor parte de azuacutecares y fenoles Las enzimas presentes
resultaron ser cisteiacutenendopeptidasas Los preparados conservaron maacutes del 90 de la
actividad original cuando fueron preincubados a 37 ordmC y 55 ordmC durante 2 h y mostraron
actividad en un amplio rango de pH alcanzando el 80 de la actividad maacutexima entre los pH
7 y 10 Mediante isoelectroenfoque (IEF) se logran separar 6 bandas de pI 59 64 76 83
y gt 93
1431 Hieronymaiacutena I
Desde frutos inmaduros de B hieronymi Bruno et al (2003) logran aislar una fraccioacuten
a la que denominan ldquohieronymaiacutena Irdquo (pI gt93) cuya homogeneidad fue confirmada por
MALDI-TOF donde mostroacute una masa molecular de 24066 Da por SDS-PAGE mostrando
una banda de 25 kDa y por IEF La enzima de tipo cisteiacutenica presentoacute una actividad
caseinoliacutetica maacutexima en el rango de pH 85-95 y fue completamente inhibida por E-64 y
aacutecido iodoaceacutetico mientras que se incrementoacute por la adicioacuten de cisteiacutena 20 mM
1432 Hieronymaiacutena II
A partir del mismo material Bruno et al (2006) purifican una segunda proteasa
cisteiacutenica (hieronymaiacutena II) cuya homogeneidad fue confirmada por MALDI-TOF-TOF
mostrando un peso molecular de 23411 Da y por SDS-PAGE con un peso molecular de 25
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
20
kDa aunque por IEF se observaron dos isoformas de pI 76 y 83 La actividad caseinoliacutetica
maacutexima fue detectada en el rango de pH entre pH 75-90
1433 Hieronymaiacutena III
Una tercera endopeptidasa cisteiacutenica (hieronymaiacutena III) fue purificada desde frutos
inmaduros de B hieronymi (Bruno et al 2008) cuyo pH oacuteptimo sobre caseiacutena se encuentra
en el rango de pH 86-93 La masa molecular determinada por SDS-PAGE fue de 25 kDa y
por espectrometriacutea de masas de 23713 Da Mediante IEF se observaron dos bandas de pI
59 y 64
La actividad de las tres endopeptidasas frente a sustratos sinteacuteticos mostroacute
diferencias significativas Soacutelo hieronymaiacutena I pudo degradar PFLNA (un sustrato comuacuten
para proteasas de ananaacute) Z-Phe-Arg-p-nitroanilida fue hidrolizado por hieronymaiacutena I y II
mientras que Z-Arg-Arg-p-nitroanilida el sustrato sobre el que tiene alta afinidad bromelina
de tallo y comosaiacutena fue degradado soacutelo por hieronymaiacutena III Ademaacutes las tres
endopeptidasas mostraron diferentes especificidades sobre 5 de los 13 sustratos N-α-CBZ-
p-nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos ensayados el derivado de Ala fue preferido por
hieronymaiacutena I y II seguido por Gly y Asp respectivamente mientras que hieronymaiacutena III
clivoacute preferentemente el derivado de Lys seguido por Asp (Bruno et al 2008)
La comparacioacuten de la secuencia de los N-terminales de hieronymaiacutena II y III mostroacute
gran similitud entre siacute (93) y con las de la bromelina de tallo bromelina de fruto
comosaiacutena ananaiacutena y balansaiacutena I (70-90) (Bruno et al 2006 2008) Mientras que la
secuencia del N-terminal de hieronymaiacutena I mostroacute una similitud del oacuterden del 70 con la de
hieronymaiacutena II y balansaiacutena I y del 60 con las de hieronymaiacutena III bromelina de tallo
ananaiacutena y comosaiacutena (Bruno et al 2003 2008)
144 Macrodontaiacutenas
A partir de frutos de Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [= Pseudananas
sagenarius (Arruda) Camargo] se obtuvo un extracto parcialmente purificado por
precipitacioacuten acetoacutenica denominado macrodontaiacutena el cual fue activo en un amplio rango
de pH obtenieacutendose valores superiores al 75 de la actividad maacutexima entre pH 70 y 105
(caseiacutena) Macrodontaiacutena fue estable en el rango de pH de maacutexima actividad asiacute como en
condiciones de elevada fuerza ioacutenica Por el contrario a diferencia de otras fitoproteasas
macrodontaiacutena no fue demasiado termoestable ya que la actividad residual se redujo al
50 luego de ser incubada durante 2 h a 45 ordmC (Brullo 2003)
Desde macrodontaiacutena se lograron purificar dos endopeptidasas macrodontaiacutena I con
una masa molecular de 25 kDa (SDS-PAGE) y pI de 61 y macrodontaiacutena II con masa
molecular de 27 kDa (SDS-PAGE) y pI de 59 Macrodontaiacutena I exhibioacute un rango de pH
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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oacuteptimo entre pH 61 y 85 en tanto que en macrodontaiacutena II fue maacutes estrecho (pH 75-85)
La actividad de ambas proteasas sobre N-α-CBZ-p-nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos mostroacute
mayor afinidad hacia el derivado de Ala seguido por el de Gln y Tyr El E-64 inhibidor
especiacutefico del sitio activo de cisteiacutenproteinasas exhibioacute un comportamiento diferencial frente
a una y otra proteasa ya que produjo inhibicioacuten praacutecticamente total de macrodontaiacutena I
pero macrodontaiacutena II conservoacute un 15 de actividad residual hecho que podriacutea
relacionarse con una diferente geometriacutea del sitio activo como sugieren Ritonja et al (1989)
para bromelaiacutena de tallo (Brullo 2003) Macrodontaiacutena I y II fueron activas frente a Bz-Phe-
Val-Arg-NHMec pero no frente a Z-Arg-Arg-NHMec Las secuencias N-terminales de
macrodontaiacutena I y II revelan un 926 de identidad entre siacute un 80-90 con comosaiacutena
ananaiacutena bromelina de tallo y balansaiacutena I (Loacutepez et al 2001) un 70-80 con
hieronymaiacutena II y III y un 60 con hieronymaiacutena I (Bruno et al 2008)
Brullo (2003) determinoacute la estructura primaria de macrodontaiacutena I que demostroacute estar
compuesta por 213 aminoaacutecidos con un peso molecular calculado de 23486 Da valor
consistente con el dato aportado por la espectrometriacutea de masas (23459 Da) La
comparacioacuten con las secuencias completas de algunas fitoproteasas cisteiacutenicas reveloacute un
alto grado de identidad (alrededor del 70) con las de Ananas comosus con bromeliacutena de
fruto exhibioacute la mayor similitud (770 de identidad) seguida por ananaiacutena (con 719 de
identidad) y bromeliacutena de tallo (con 671 de identidad) Ademaacutes fue determinado el
caraacutecter no glicoproteacuteico de la enzima Al igual que en papaiacutena en macrodontaiacutena I existen
7 residuos Cys seis de los cuales participan de los tres puentes disulfuro presentes en la
estructura de esta clase de enzimas Dada la semejanza estructural entre varias proteasas
comparadas se concluye que macrodontaiacutena I integra el Clan CA de las proteasas
cisteiacutenicas que lidera papaiacutena (Brullo 2003)
15 Objetivos
Como se ha dicho el extracto acuoso obtenido del ananaacute [Ananas comosus (L)
Merr] conocido como bromelina ha mostrado tener tanto in vivo como in vitro efectos
antiedematoso antiinflamatorio antitumoral antitromboacutetico entre otras acciones
farmacoloacutegicas Pertenece al grupo de proteasas que son administradas oralmente en el
tratamiento sisteacutemico contra la inflamacioacuten las enfermedades relacionadas con la
coagulacioacuten sanguiacutenea y el caacutencer Su baja toxicidad permite que sea bien tolerada en
tratamientos largos Si bien su mecanismo de accioacuten auacuten no ha sido definitivamente
dilucidado sus efectos farmacoloacutegicos son adjudicados principalmente a sus
endopeptidasas cisteiacutenicas Actividades farmacoloacutegicas diversas han sido tambieacuten atribuidas
a fitoproteasas de tipo cisteiacutenicas pertenecientes a otras bromeliaacuteceas (Bromelia fastuosa)
asiacute como a especies pertenecientes a otras familias (Caricaceae Moraceae)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Algunas especies de la familia Bromeliaceae entre ellas Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes se caracterizan por producir grandes cantidades de
endopeptidasas cisteiacutenicas Crecen en amplias regiones de nuestro paiacutes (NEA y NOA) asiacute
como en Brasil Bolivia Paraguay y Colombia Excepto el uso de frutos de B balansae para
tratar la tos en una regioacuten de Brasil no se conocen usos medicinales para estas tres
especies A partir de sus frutos se han aislado y caracterizado en el LIProVe varias
proteasas de tipo cisteiacutenicas que sin embargo no han sido objeto de estudios
farmacoloacutegicos hasta este momento
Es propoacutesito del presente trabajo aportar al conocimiento en relacioacuten a los posibles
usos medicinales de especies de bromeliaacuteceas autoacutectonas de nuestro paiacutes no estudiadas
auacuten para dichos fines Bajo la suposicioacuten que las proteasas de Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes por pertenecer al mismo tipo cataliacutetico y a la misma
subfamilia vegetal podriacutean mostrar actividades bioloacutegicas similares a las proteasas de
Ananas comosus nos planteamos como objetivo general de la presente tesis
La buacutesqueda de posibles efectos farmacoloacutegicos de extractos ricos en
cisteiacutenendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi B balansae
y Pseudananas macrodontes y su comparacioacuten con bromelina
Y como objetivos especiacuteficos
Evaluar el efecto antiinflamatorio de los extractos de B hieronymi B balansae
y P macrodontes
Evaluar los efectos de los extractos de B hieronymi B balansae y P
macrodontes sobre algunos de los componentes de la hemostasia
Evaluar los extractos de B hieronymi B balansae y P macrodontes como
posibles agentes antitumorales
Tratar de establecer la posible relacioacuten entre los efectos medidos y la actividad
proteoliacutetica de las cisteiacutenendopeptidasas estudiadas
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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2 MATERIAL VEGETAL
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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21 Material Vegetal Utilizado
211 Bromelia hieronymi Mez
Crece en bosques xeroacutefitos de la provincia fitogeograacutefica chaquentildea Habita desde el
SE de Bolivia a traveacutes del Chaco paraguayo y argentino hasta las provincias de Tucumaacuten
Santiago del Estero y Chaco (Arenas 1997)
Frutos inmaduros fueron recogidos en los alrededores de la ciudad de Santiago del
Estero por el Ing Lucas Roic de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad
Nacional de Santiago del Estero Un ejemplar de referencia ha sido depositado en el
herbario de la Divisioacuten Plantas Vasculares de la Facultad de Ciencias Naturales y Museo de
la Universidad Nacional de La Plata Los frutos fueron lavados secados al aire y
almacenados en freezer a -20 ordmC hasta su uso
2111 Extracto parcialmente purificado de frutos de B hieronymi (Bh)
Aproximadamente 50 g de frutos congelados fueron cortados y triturados en una
procesadora durante 1 min en intervalos de 10 s con igual tiempo de espera con 250 mL de
buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 conteniendo EDTA y cisteiacutena 5 mM Luego de filtrar con
gasa se centrifugoacute durante 30 min a 4 ordmC y 12000 g El sobrenadante que constituye el
extracto crudo se fraccionoacute y almacenoacute a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue
realizada sobre bantildeo de hielo
A fin de eliminar compuestos fenoacutelicos y la mayoriacutea de los carbohidratos presentes
al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y en agitacioacuten suave se le adicionaron 4
voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC Luego de permitir la precipitacioacuten durante 30 min
a 4 ordmC se centrifugoacute a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC Se descartoacute el sobrenadante y el
precipitado fue secado al vaciacuteo durante 30 min el que finalmente fue resuspendido en buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Bruno 2007)
212 Bromelia balansae Mez
Frecuente en el sotobosque umbriacuteo es una planta asociada con el aacutembito fluvial Se
distribuye desde Colombia Amazonia Centro y Este de Brasil Regioacuten Oriental del
Paraguay hasta Corrientes y Misiones y las zonas riberentildeas de Formosa y Chaco en
Argentina (Arenas 1997)
El material estudiado proviene de la Provincia de Misiones (en la proximidad de
Posadas ruta 105 Km 28 a 33 entre los departamentos de San Joseacute y Fachinal) La
recoleccioacuten fue llevada a cabo por el Dr Aniacutebal Amat de la Facultad de Ciencias Exactas
Quiacutemicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones donde se encuentra
depositado un ejemplar de herbario Los frutos fueron lavados secados y almacenados a -
20 ordmC hasta su uso
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
29
2121 Extracto parcialmente purificado de frutos de B balansae (Bb)
Aproximadamente 40 g de frutos semimaduros congelados fueron cortados y
triturados en una procesadora 10 veces durante 10 s (con intervalos de 20 s) con 200 mL de
buffer fosfato soacutedico 01M de pH 7 conteniendo EDTA 5 mM y cisteiacutena 125 mM Luego de
filtrar la preparacioacuten resultante con gasa se la centrifugoacute a 12000 g durante 25 min a 4 ordmC y
el sobrenadante resultante que corresponde al extracto crudo fue fraccionado y
almacenado a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue realizada sobre bantildeo de
hielo
Al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y con agitacioacuten suave se le agregoacute un
volumen de etanol preenfriado a -20 ordmC y se lo dejoacute durante 30 min a 4 ordmC Luego se
centrifugoacute a 3000 g durante 30 min a 4 ordmC El sobrenadante en bantildeo de hielo fue tratado
con 3 voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC y luego de dejarlo durante 30 min a 4 ordmC fue
centrifugado a 3000 g durante 30 min a 4 ordmC Una vez eliminado el sobrenadante el
precipitado fue secado al vaciacuteo durante 45 min Finalmente fue resuspendido con buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Pardo 2004)
213 Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [= P sagenarius (Arruda) Camargo]
Vegeta en el interior de bosques huacutemedos y sombriacuteos es caracteriacutestico en bosques
de galeriacutea Se extiende desde el nordeste centro y este de Brasil a traveacutes del Paraguay
Oriental hasta la Mesopotamia argentina Se halla en toda la cuenca de los riacuteos Paraguay y
Paranaacute desde Bolivia hasta la altura del litoral santafecino (Arenas 1997)
Los frutos en estado semimaduro fueron recogidos en Santa Ana departamento de
Candelaria Provincia de Misiones por el Prof Aniacutebal Amat Un ejemplar de referencia ha
sido depositado en el herbario de la Facultad de Ciencias Exactas Quiacutemicas y Naturales de
la Universidad Nacional de Misiones Los frutos fueron lavados secados al aire y
almacenados a -20 ordmC hasta su uso
2131 Extracto parcialmente purificado de frutos de P macrodontes (Pm)
Aproximadamente 120 g de frutos semimaduros congelados y desprovistos de
semillas y bracteacuteolas fueron cortados y triturados en una procesadora durante 1 min (en
intervalos de 10 s con igual tiempo de espera) con 200 mL de buffer fosfato soacutedico 01M de
pH 6 conteniendo EDTA y cisteiacutena 5 mM Luego de filtrar la preparacioacuten resultante con gasa
se la centrifugoacute a 5000 g durante 30 min a 4 ordmC y el sobrenadante resultante (extracto crudo)
fue fraccionado y almacenado a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue realizada
sobre bantildeo de hielo
Al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y con agitacioacuten suave se le agregoacute un
volumen de etanol preenfriado a -20 ordmC y se lo dejoacute durante 30 min a 4 ordmC Luego se
centrifugoacute a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC El sobrenadante en bantildeo de hielo fue luego
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
30
tratado con 3 voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC y luego de dejarlo durante 120 min a
4 ordmC fue centrifugado a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC Una vez eliminado el sobrenadante
el precipitado fue secado al vaciacuteo durante 30 min Finalmente fue resuspendido con buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Brullo 2003)
214 Ananas comosus (L) Merr
Es una planta perenne nativa de Ameacuterica del Sur de escaso porte y con hojas duras
y lanceoladas de hasta 1 metro de largo fructifica una vez cada tres antildeos produciendo un
uacutenico fruto fragante y dulce muy apreciado en gastronomiacutea (Garciacutea Suaacuterez amp Serrano
2005)
Los efectos evaluados de los preparados proteoliacuteticos fueron comparados con los de
bromelina de tallo comercial (B4882 Sigma Aldrich)
215 Reactivos quiacutemicos
En todos los casos se usoacute etanol 96ordm calidad medicinal (Soria) EDTA (Invitrogen)
cisteiacutena (Sigma Aldrich) y fosfato soacutedico pureza 98 (Carlo Erba)
22 Caracterizacioacuten proteoliacutetica de los extractos parcialmente purificados (Bh Bb y Pm) y de bromelina
221 Teacutecnicas y metodologiacutea
2211 Dosaje de la actividad caseinoliacutetica
La preparacioacuten del sustrato se realizoacute suspendiendo 1 g de caseiacutena de leche bovina
(Sigma Aldrich) en 100 mL de solucioacuten buffer (Tris-HCl 01M pH 80) la suspensioacuten se
colocoacute en un bantildeo de agua que se llevoacute a ebullicioacuten y se mantuvo durante 20 min en esas
condiciones La solucioacuten resultante se filtroacute en caliente y una vez enfriada se agregoacute cisteiacutena
25 mM como activador de proteasas cisteiacutenicas
La mezcla de reaccioacuten se preparoacute con 11 mL de solucioacuten de caseiacutena al 1 y 01 mL
de solucioacuten del extracto en estudio La reaccioacuten fue llevada a cabo a 37 ordmC y detenida a los 2
min por la adicioacuten de 18 mL de aacutecido tricloroaceacutetico al 5 luego de lo cual los tubos fueron
centrifugados a 4000 g durante 30 min determinaacutendose la absorbancia de los
sobrenadantes a 280 nm medida a traveacutes de una celda de 1 cm de paso En todos los
casos fueron realizados ensayos en blanco agregando al preparado proteoliacutetico primero el
aacutecido tricloroaceacutetico y por uacuteltimo la solucioacuten de caseiacutena
Siguiendo el criterio de Sarath et al (1989) para expresar la actividad enzimaacutetica
cuando se utilizan sustratos proteicos se definioacute para este caso una unidad arbitraria
(Unidad caseinoliacutetica UCas) que corresponde a la cantidad de enzima requerida para
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
31
producir un incremento de una unidad de absorbancia a 280 nm al cabo de 1 min en las
condiciones de ensayo
2212 Cuantificacioacuten del contenido proteico
Se utilizoacute el meacutetodo de Bradford (1976) basado en que la unioacuten del Coomassie Blue G-
250 a la proteiacutena produce un corrimiento del maacuteximo de absorbancia de 465 nm (forma roja
del colorante libre) a 595 nm (forma azul del complejo colorante-proteiacutena) Las curvas de
calibracioacuten se confeccionaron utilizando seroalbuacutemina bovina (Sigma-Aldrich) en el rango de
02-12 mgmL para el ensayo estaacutendar y en el rango de 10-100 μgmL para el microensayo
2213 Isoelectroenfoque
Las bandas proteicas se determinaron por isoelectroenfoque (IEF) utilizando un equipo
Mini IEF Cell (Modelo 111 Bio Rad) Las muestras se precipitaron con 4 voluacutemenes de
acetona durante 30 min y luego de centrifugar a 16000 g durante 15 min el precipitado
resultante fue redisuelto con agua bidestilada
Los geles fueron preparados mezclando 20 mL de acrilamida-bisacrilamida (25T6
3C7) 20 mL de glicerol (25 pv) 05 mL de anfolitos Biolyte 3-10 (para Bh Bb y
bromelina) o Pharmalyte 4-65 (para Pm) y 55 mL de agua luego que dicha mezcla fue
degasificada se adicionaron 3 μL de TEMED y 60 μL de persulfato de amonio al 10
Las muestras (1-5 microL) se sembraron y se permitioacute que difundieran dentro del gel
durante 5 min Los electrodos fueron humedecidos con agua bidestilada y los geles se
apoyaron inmediatamente sobre los mismos El IEF fue llevado a cabo en tres etapas
sucesivas 15 min a 100 V 30 min a 200 V y finalmente 1 h a 450 V
Una vez concluida la corrida los geles fueron sumergidos durante 30 min en solucioacuten
fijadora (4 g de aacutecido sulfosaliciacutelico 30 mL de metanol 125 g de aacutecido tricloroaceacutetico y agua
csp 100 mL) Una vez fijados los geles fueron tratados durante 2 h con la solucioacuten
colorante (10 mL de aacutecido aceacutetico glacial 27 mL de etanol 40 mg de Coomassie Brilliant
Blue R-250 500 mg de CuSO4 y agua csp 100 mL) decolorados por tres lavados
sucesivos con solucioacuten decolorante I (7 mL de aacutecido aceacutetico glacial 12 mL de etanol 500
mg de CuSO4 y agua csp 100 mL) y finalmente sumergidos en solucioacuten decolorante II (7
mL de aacutecido aceacutetico glacial 12 mL de Etanol y agua csp 100 mL) hasta obtener un fondo
claro
6 T= (g acrilamida+g bisacrilamida) x 100 volumen total
7 C= g bisacrilamida x 100 (g acrilamida+g bisacrilamida)
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32
2214 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Para el moldeado de los geles y la realizacioacuten de la corrida electroforeacutetica se empleoacute
el equipo Mini Protean III (Bio-Rad) y se procedioacute de acuerdo a la teacutecnica de Laemmli (1970)
con modificaciones Los geles se prepararon con poliacrilamida al 16 (Tabla 21)
Reactivos Gel de apilamiento
(5) Gel de resolucioacuten
(16)
Acrilamida-Bisacrilamida (3008) 115 mL 4 mL
Buffer de resolucioacuten - 094 mL
Buffer de apilamiento 09 mL
H2O 453 mL 2425 mL
SDS al 10 70 μL 75 μL
PSA 10 52 μL 50 μL
TEMED 4 μL 4 μL
Tabla 21 Sistema de geles empleado Buffer de resolucioacuten Tris-HCl 3M pH 88 Buffer de apilamiento Tris-HCl
05M pH 68 PSA persulfato de amonio TEMED NNNacuteNacute-tetrametiletilendiamina
Las muestras fueron tratadas con el agregado de un volumen de buffer de muestra
(Tabla 22) previa adicioacuten de aacutecido iodoaceacutetico 1 mM (concentracioacuten final) llevadas a
ebullicioacuten durante 10 min y centrifugadas durante 10 min a 16000 g
Buffer de muestra
Tris 157 g
SDS 4 g
Glicerol 16 mL
Azul de bromofenol 4 mg
β-mercaptoetanol 25 μL
Llevar a pH 68 con HCl 1M
AD csp 100mL
Tabla 22 Composicioacuten del buffer de muestra El β-mercaptoetanol fue agregado durante el tratamiento de las
muestras
El buffer de reservorio (03 pv de Tris 01 pv de SDS y 144 pv de glicina) se
colocoacute en el reservorio catoacutedico hasta cubrir la parte superior del gel y en el anoacutedico hasta
una altura suficiente como para permitir que todo el electrodo haga contacto con eacutel
En las distintas calles se sembraron 10-15 μL de las muestras y 3 μL de los patrones
de peso molecular (LMW GE Healthcare) fosforilasa b (97 kDa) albuacutemina (66 kDa)
ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (30 kDa) inhibidor de tripsina (201 kDa) y α-
lactoalbuacutemina (144 kDa)
La intensidad de corriente fue de 30 mA durante el apilado y de 60 mA durante la
resolucioacuten hasta la finalizacioacuten de la corrida Inmediatamente despueacutes los geles fueron
removidos de las placas y dejados durante 30 min en solucioacuten fijadora (10 vv de aacutecido
aceacutetico 50 vv de metanol) Luego fueron coloreados con solucioacuten colorante (10 vv de
aacutecido aceacutetico 40 vv de metanol y 100 mg de Coomassie Brillant Blue R-250) y
decolorados con una solucioacuten de aacutecido aceacutetico al 10 vv
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33
2215 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina
Con el fin de determinar si los efectos medidos para los distintos preparados
proteoliacuteticos eran debidos a la accioacuten de sus proteasas cisteiacutenicas fue necesario evaluar el
efecto de los mismos preparados desprovistos de actividad proteoliacutetica
El meacutetodo de inhibicioacuten que se eligioacute fue tratar los preparados con E-64 (trans-
epoxisuccinil-L-leucilamido(4-guanidino)butano) un potente irreversible y selectivo inhibidor
de proteasas cisteiacutenicas El grupo trans-epoxisuccinil (resto activo) del E-64 se une
irreversiblemente al grupo tiol del sitio activo de muchas proteasas cisteiacutenicas tales como
papaiacutena y bromelina y no reacciona con los grupos tiol de otras enzimas no proteasas como
L-lactato deshidrogenasa (Barrett et al 1982) Dada esta gran especificidad y la baja
toxicidad que ha mostrado es considerado muy uacutetil para ensayos in vivo (Katunuma et al
1995)
22151 Tratamiento con E-64
Bh Bb y Pm fueron obtenidos seguacuten lo indicado previamente (2111 2121 y
2131 respectivamente) y antes de liofilizarlos diferentes aliacutecuotas de cada uno fueron
incubadas con soluciones de 5 10 30 60 80 y 100 μM (concentracioacuten en volumen de
mezcla) de E-64 (E3132 Sigma Aldrich) durante 30 min a 37 ordmC La solucioacuten de bromelina
fue preparada resuspendiendo el polvo comercial en buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 (30
mgml) y diferentes aliacutecuotas fueron incubadas con 60 100 130 150 y 250 μM de E-64 Los
blancos se incubaron de igual manera pero reemplazando el E-64 por igual volumen de
agua destilada Luego se determinoacute la actividad proteoliacutetica de cada aliacutecuota y se la
referencioacute a la actividad proteoliacutetica del preparado blanco a la que se consideroacute el 100
(actividad residual porcentual)
222 Resultados
2221 Perfiles de pI y de peso molecular de Bh Bb y Pm
El contenido proteico la actividad proteoliacutetica y la actividad especiacutefica de cada
preparado de Bh Bb y Pm evaluado se indican en cada capiacutetulo En la Figura 21 se
muestran los perfiles de pI obtenidos para cada preparado los cuales se correspondieron
con los reportados para los extractos parcialmente purificados de Bromelia hieronymi (Bruno
et al 2003) B balansae (Pardo et al 2000) y Pseudananas macrodontes (Loacutepez et al
2000)
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Figura 21 IEF A Bh bandas de pI 59 y 64 (Hironymaiacutena III) pI 76 y 83 (Hieronymaiacutena II) pH ge93
(Hieronymaiacutena I) B Bb banda de pI asymp 5 (Balansaiacutena I) bandas de pI 85 y 87 (balansaiacutena II) C Pm bandas de pI 57 59 (Macrodontaiacutena I) y 61 (Macrodontaiacutena II) D Bro (Bromelina de tallo) banda de pI gt93
La banda de pI asymp 46 para bromelina (Fig21 D) se corresponde a la bromelina de
fruto que estaacute presente en pequentildeas cantidades en los tallos de Ananas comosus (Hale et
al 2005)
En la Figura 22 se observan las bandas caracteriacutesticas todas ellas de alrededor de
25 kDa de las proteasas de Bh (asymp25 kDa) Bb (asymp24 kDa) y Pm (asymp26 kDa) La banda de asymp 29
kDa presente en Bh y la banda de asymp30 kDa contenida en Pm tambieacuten estaacuten presentes en los
extractos crudos respectivos y desaparecen cuando las corridas electroforeacuteticas se hacen
sin previa inhibicioacuten con aacutecido iodoaceacutetico comportamiento frecuente en el caso de
proteasas vegetales que actuacutean de inmediato sobre sus sustratos
Figura 22 SDS-PAGE de Bh Bb y Pm A la izquierda patrones de PM (kDa)
A B C D
Bh Bb Pm
144
201
300
450
660
970
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2222 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina
En la Figura 23 se muestra la actividad porcentual residual de Bh Bb Pm y
bromelina luego de incubarlos con distintas concentraciones de E-64 durante 30 min a 37
ordmC
Figura 23 Actividad residual () de la actividad especiacutefica de Bh Bb Pm y bromelina (Bro) Media plusmn
DE (n=3)
De las curvas de inhibicioacuten de la Figura 23 se obtuvo la concentracioacuten miacutenima de E-
64 que inhibe a cada preparado 30 μM para Bh 10 μM para Bb y Pm 150 μM para 30
mgmL de bromelina las cuales fueron aumentadas un 10 maacutes al momento de obtener los
preparados inhibidos para los distintos ensayos
Cuando los preparados fueron liofilizados (excepto bromelina) previo a la evaluacioacuten
de los distintos efectos se les midioacute la actividad proteoliacutetica y la concentracioacuten de proteiacutenas
Sin embargo se observoacute una aparente inconsistencia en la concentracioacuten de proteiacutenas
medidas la concentracioacuten de proteiacutenas del liofilizado inhibido fue un 15 30 y 70 respecto
de la concentracioacuten del liofilizado sin inhibir para Bh Bb y Pm respectivamente
Habitualmente el proceso de liofilizacioacuten no genera peacuterdida de proteiacutenas en este tipo de
preparaciones Para comprobar si ello se debiacutea a una destruccioacuten parcial de las proteasas
se analizoacute cada material liofilizado por SDS-PAGE lo que permitioacute mostrar la presencia de
las bandas esperadas con intensidad similar en los liofilizados activos e inhibidos
Debido a que Bh era el preparado que aparentemente ldquoperdiacuteardquo maacutes proteiacutenas se lo
eligioacute para hacer ensayos de inhibicioacuten y evitando la liofilizacioacuten determinar el contenido
proteico Para esto se repitioacute el procedimiento de inhibicioacuten descripto en 22151 con 10
30 y 60 μM de E-64 y a cada una de las aliacutecuotas de Bh se le determinoacute la concentracioacuten de
proteiacutenas la actividad proteoliacutetica y el perfil por SDS-PAGE
-5
15
35
55
75
95
0 50 100 150 200 250
Act
ivid
ad r
esi
du
al (
)
E-64 (μM)
Pm
Bb
Bh
Bro
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En la Figura 24 se muestran la actividad porcentual residual (A) y el contenido de
proteiacutenas (B) de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 durante 30
min a 37 ordmC
Figura 24 A Actividad porcentual residual () de la actividad proteoliacutetica y de la actividad especiacutefica de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 B Contenido proteico de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 Media plusmn DE (n=3)
Se observa una disminucioacuten en la concentracioacuten de proteiacutenas de Bh al aumentar la
concentracioacuten de E-64 Sin embargo en el SDS-PAGE de las distintas aliacutecuotas de Bh
(Figura 25) no se observa peacuterdida ni disminucioacuten de intensidad de las bandas principales de
Bh aun despueacutes de incubar Bh con 60 μM de E-64
Figura 25 SDS-PAGE Ec extracto crudo de B hieronymi 0 Bco 10 30 y 60 Bh luego de incubarlo con E-64 10 30 y 60 μM respectivamente P patrones de peso molecular (LMW Bio-Rad fosforilasa b 974 kDa seroalbuacutemina 662 kDa ovoalbuacutemina 45 kDa anhidrasa carboacutenica 31 kDa inhibidor de tripsina 215 kDa y lisozima 144 kDa
Por otro lado en la Figura 24 B se observa que luego de inhibir Bh con 30 μM de E-
64 (30) la concentracioacuten de proteiacutenas fue asymp14 de la concentracioacuten de proteiacutenas de Bh sin
inhibir (0) lo cual concuerda con la relacioacuten de proteiacutenas de los liofilizados activo e inhibido
observada para Bh
La aparente inconsistencia entre lo observado en la Figura 24 B y la Figura 25
podriacutea explicarse por la dependencia de la sensibilidad del meacutetodo de Bradford con la
composicioacuten de aminoaacutecidos en la superficie proteica (Lucarini amp Kilikian 1999) Si bien el
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 10 30 60
Pro
teiacuten
as (
mg
ml)
E-64 (μM)
A B
-2
18
38
58
78
98
0 5 10 30 60 80 100
Act
ivid
ad r
esi
du
al (
)
E-64 (μM)
Actividad caseinoliacutetica (Ucasml)
Actividad especiacutefica (Ucasmg)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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E-64 interacciona esencialmente con la cisteiacutena del sitio activo de las cisteiacutenendopeptidasas
el inhibidor parece inducir alguacuten cambio conformacional en las proteasas tratadas que afecta
fuertemente la reaccioacuten con el colorante No hemos encontrado referencia alguna a este
comportamiento en la bibliografiacutea consultada
A pesar de esta dificultad en la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas para
los distintos ensayos los preparados inhibidos se obtuvieron inhibieacutendolos seguacuten las
concentraciones de E-64 definidas en 2222 y luego se les midioacute la actividad caseinoliacutetica y
se realizoacute un IEF y un SDS-PAGE La inhibicioacuten fue llevada a cabo al momento previo de la
liofilizacioacuten para los preparados destinados a la evaluacioacuten del efecto antiinflamatorio
(Capiacutetulo 3) ya que los mismos fueron realizados en San Luis y se consideroacute maacutes adecuado
transportarlos ya inhibidos con la caracterizacioacuten ya hecha en el LIProVe En tanto que los
preparados destinados al resto de los ensayos (Capiacutetulos 4 y 5) fueron inhibidos luego de
ser liofilizados previamente a los ensayos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
38
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3 EFECTO
ANTIINFLAMATORIO
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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39
31 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al dantildeo
causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por cualquier agresor de naturaleza
bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica (Garciacutea Barreno 2008) Una respuesta inflamatoria
tiacutepica consta de cuatro componentes los inductores inflamatorios los sensores que los
detectan los mediadores inflamatorios inducidos por los sensores y los tejidos diana o
efectores que se ven afectados por los mediadores Dependiendo de la naturaleza de la
causa desencadenante diferentes combinaciones de los distintos componentes existentes
daraacuten lugar a diferentes respuestas inflamatorias Asiacute las respuestas inflamatorias a la
infeccioacuten y a la lesioacuten tisular esteacuteril tienen diferentes propoacutesitos la primera tiene por objeto
proteger al hueacutesped de la infeccioacuten y se puede acoplar con la induccioacuten de la inmunidad
adaptativa mientras que la segunda sirve principalmente para promover la reparacioacuten de los
tejidos (Medzhitov 2010)
311 Inflamacioacuten aguda
La inflamacioacuten aguda es la respuesta temprana de un tejido ante la lesioacuten es
inespeciacutefica de corta duracioacuten y se caracteriza por cambios en la microcirculacioacuten
exudacioacuten de liacutequido y migracioacuten de leucocitos desde los vasos sanguiacuteneos al aacuterea
afectada Desde el punto de vista cliacutenico se caracteriza por los cinco signos cardinales que
se manifiestan en el aacuterea dantildeada rubor (eritema) calor tumoracioacuten (edema) dolor y
functio laesa (peacuterdida de la funcioacuten por una combinacioacuten de los 4 puntos anteriores) Las
alteraciones morfoloacutegicas y funcionales son una manifestacioacuten de una serie compleja de
eventos interrelacionados respuesta vascular respuesta celular y cooperacioacuten tisular viacutea
mediadores quiacutemicos de la inflamacioacuten (Garciacutea Barreno 2008)
3111 Respuesta vascular
Luego de una vasoconstriccioacuten pasajera de las arteriolas en el sitio de agresioacuten le
sigue una vasodilatacioacuten de las arteriolas precapilares producida por la relajacioacuten del
muacutesculo liso vascular Estos cambios llevan a un aumento del flujo sanguiacuteneo en el aacuterea
lesionada causando rubor y calor
Ciertos mediadores son capaces de producir la contraccioacuten de las ceacutelulas
endoteliales de veacutenulas y capilares lo cual produce separacioacuten de las uniones intercelulares
de dichas ceacutelulas conduciendo a un aumento de la permeabilidad vascular y permitiendo
el pasaje de proteiacutenas y liacutequido al espacio extracelular Este escape neto de fluido se
denomina exudacioacuten Entre las proteiacutenas plasmaacuteticas que exudan estaacute el fibrinoacutegeno el
cual se deposita como fibrina sobre los tejidos extravasculares lo cual disminuye la
permeabilidad tisular evitando la reentrada del exudado al vaso que finalmente conduce a la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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40
formacioacuten del edema A raiacutez del aumento de la permeabilidad vascular se produce un
aumento de viscosidad sanguiacutenea y el flujo sanguiacuteneo comienza a disminuir permitiendo el
acercamiento de los leucocitos a la pared de los vasos (Roitt 2003)
3112 Respuesta celular
Si bien los tipos celulares presentes en los exudados dependeraacuten del agente
agresor la ceacutelula predominante es el polimorfonuclear (PMN) neutroacutefilo en especial en la
fase temprana de la inflamacioacuten Los leucocitos llegan al sitio lesionado mediante una serie
de pasos marginacioacuten adhesioacuten emigracioacuten y quimiotaxis a traveacutes de la pared vascular
A raiacutez del enlentecimiento del flujo sanguiacuteneo los leucocitos son desplazados hacia
la periferia del vaso lo cual junto al aumento de la viscosidad sanguiacutenea favorece la
marginacioacuten leucocitaria hacia la superficie endotelial Esto les permite adherirse a la
superficie endotelial de los vasos proceso incrementado durante la inflamacioacuten aguda por el
aumento en la expresioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten (CAM) en ceacutelulas endoteliales de las
veacutenulas (P y E-selectinas ICAM PAF etc) y en los leucocitos (MAC-1 LFA-1 PAF-R L-
selectinas etc) Los neutroacutefilos adheridos pueden atravesar el vaso sanguiacuteneo por las
uniones intercelulares y la membrana basal (diapeacutedesis) alcanzando el espacio intersticial
(emigracioacuten) desde donde se dirigen al sitio de inflamacioacuten inducidos por un gradiente de
concentracioacuten de factores quimiotaacutecticos (quimiotaxis) (Roitt 2003)
La fagocitosis llevada a cabo fundamentalmente por macroacutefagos y neutroacutefilos es la
internalizacioacuten y digestioacuten celular de partiacuteculas extrantildeas y requiere el reconocimiento el
englobamiento y la degradacioacuten de la partiacutecula Cuando se trata de un agente inerte y
grande el reconocimiento es directo Las opsoninas son sustancias que recubren la
partiacutecula y favorecen su fagocitosis La destruccioacuten del material se lleva a cabo por las
especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) las especies reactivas de nitroacutegeno y el sistema
halogenador ademaacutes de mecanismos independientes del oxiacutegeno tales como la proteinasa
3 la catepsina G la lisozima y la lactoferrina entre otros Estos efectores junto a los
productos de degradacioacuten son liberados al medio extracelular por lo que los dantildeos
colaterales a los tejidos del hueacutesped resultan inevitables (Nathan 2006)
3113 Mediadores quiacutemicos8
La respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso dispositivo de mediadores
que se organizan en complejas redes reguladoras (Garciacutea Barreno 2008) Se trata de
moleacuteculas solubles que difunden faacutecilmente y actuacutean sobre los receptores de los efectores
Los mediadores pueden provenir de los sistemas plasmaacuteticos (coagulacioacuten complemento
cininas) ser liberados desde graacutenulos almacenados en ceacutelulas (serotonina histamina) o ser
8 En este apartado aquellos paacuterrafos que no contienen citas fueron adaptados convenientemente de Rotelli
(2004)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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sintetizados inmediatamente cuando se requieren (eicosanoides) Teniendo en cuenta su
accioacuten y su origen se pueden clasificar como se indica en la Tabla 31
Tabla 31 Clasificacioacuten de mediadores de la inflamacioacuten seguacuten accioacuten y origen
La histamina es un mediador temprano de la inflamacioacuten aguda y es liberado desde
los graacutenulos almacenados en los mastocitos perivasculares luego de ser estimulados por
neuropeacuteptidos liberados desde las terminaciones nerviosas (Benoist amp Mathis 2002)
antiacutegenos IL-1 C3a y C5a (Roitt 2003) entre otros Su accioacuten es mediada por receptores
(H) ubicados a lo largo de todo el lecho vascular principalmente en ceacutelulas del muacutesculo liso
y ceacutelulas endoteliales Sobre el muacutesculo liso produce dilatacioacuten mientras que sobre las
ceacutelulas endoteliales produce contraccioacuten y por tanto aumenta la permeabilidad vascular
estimula la expresioacuten de P-selectinas aumentando la adhesioacuten leucocitaria y estimula la
siacutentesis de NO y prostaciclina (PGI2) ambas con efectos vasodilatadores (Brunton et al
2006)
La serotonina (5-hidroxitriptamina 5-HT) puede tener un efecto vasoconstrictor o
vasodilatador seguacuten el receptor sobre el cual actuacutee sin embargo durante la inflamacioacuten
aguda actuacutea tempranamente provocando vasodilatacioacuten con aumento de permeabilidad
aunque con menor potencia que la histamina
Los eicosanoides son las familias de prostaglandinas (PGs) leucotrienos (LTs) y
compuestos similares que derivan de aacutecidos grasos poliinsaturados esenciales de 20
aacutetomos de carbono Son sintetizados en la membrana celular por activacioacuten de la
fosfolipasa A2 o de la fosfolipasa C las cuales catalizan la liberacioacuten del precursor
eicosanoide (aacutecido araquidoacutenico) desde la membrana celular (Brunton et al 2006)
A partir del aacutecido araquidoacutenico se inician dos viacuteas principales de siacutentesis la viacutea de
la ciclooxigenasa (COX) la cual conduce a la formacioacuten de PGs prostaciclinas (PGIs) y
tromboxanos (TXAs) y la viacutea de la lipooxigenasa la cual conduce a la siacutentesis de LTs
Mediadores que incrementan la permeabilidad vascular en el edema inflamatorio
Vasoactivos derivados de ceacutelulas Vasoactivos derivados del plasma
-Aminas bioacutegenas serotonina histamina
-Eicosanoides
-Factor activador de plaquetas (PAF)
-Oxido niacutetrico (NO)
-Cininas
-Cascada de coagulacioacuten
-Sistema de complemento
Mediadores involucrados en el reclutamiento celular (Factores quimiotaacutecticos)
-C5a C3a
-Eicosanoides (LTB4)
-Quimiocinas
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
42
Existen dos isoformas de la COX COX-1 expresada de manera constitutiva en la mayoriacutea
de las ceacutelulas y COX-2 inducida por citocinas y factores de crecimiento entre otros
estiacutemulos
Los leucotrienos LTC4 y LTD4 aumentan la permeabilidad vascular aumentando el
exudado de plasma El LTB4 ademaacutes de aumentar la permeabilidad es un potente agente
quimiotaacutectico aumenta la adherencia y emigracioacuten de los neutroacutefilos a traveacutes del endotelio y
estimula la degranulacioacuten y la siacutentesis de superoacutexido en los PMNs
Mientras que la PGF2 es vasoconstrictora PGE2 y PGI2 son vasodilatadoras y
aumentan el edema y la infiltracioacuten de leucocitos en el aacuterea inflamada Sin embargo PGE2
puede actuar como inmunosupresor inhibe la liberacioacuten de los productos lisosomales de los
neutroacutefilos y macroacutefagos asiacute como la participacioacuten de leucocitos en reacciones de
hipersensibilidad tardiacutea (Brunton et al 2006)
El factor activador de plaquetas (PAF) ademaacutes de ser un potente estimulador de la
agregacioacuten y activacioacuten plaquetaria aumenta la permeabilidad vascular la quimiotaxis y la
adhesioacuten de neutroacutefilos al endotelio asiacute como la generacioacuten de superoacutexido y enzimas
lisosomales desde los PMNs Al actuar sobre receptores acoplados a proteiacutenas G activa las
fosfolipasas A2 y C estimulando la siacutentesis de TXA2 PGs y LTs La trombina e histamina
estimulan su expresioacuten en las ceacutelulas endoteliales Se sintetiza en mastocitos plaquetas
neutroacutefilos eosinoacutefilos monocitos y NK (ldquonatural killersrdquo)
El oacutexido niacutetrico (NO) es un potente vasodilatador potencia la citotoxicidad de los
fagocitos y activa las COX-1 y COX-2 (Salvemini et al 1993) Es sintetizado por dos
isoformas de la oacutexido niacutetrico sintasa (NOS) La NOS constitutiva (c-NOS) estaacute presente en
plaquetas y ceacutelulas endoteliales y produce pequentildeas cantidades de NO La NOS inducible
(i-NOS) se expresa en muacuteltiples ceacutelulas tales como neutroacutefilos macroacutefagos ceacutelulas
endoteliales y muacutesculo liso vascular Diversos agentes vasoactivos (serotonina histamina
bradicinina trombina y estiacutemulos fiacutesicos) estimulan la siacutentesis de NO en las ceacutelulas
endoteliales
Las cininas (bradicinina plasmaacutetica y calidina tisular) son peacuteptidos derivados por
accioacuten de calicreiacutenas del cininoacutegeno plasmaacutetico (cininoacutegeno de alto peso molecular) y del
cininoacutegeno tisular (cininoacutegeno de bajo peso molecular) La calicreiacutena plasmaacutetica es activada
a partir de la precalicreiacutena por accioacuten del factor XII el cual a su vez es activado por contacto
con superficies cargadas negativamente (colaacutegeno heparina productos plaquetarios etc)
Las cininas tienen propiedad vasodilatadora (sobre arteriolas) y vasoconstrictor (sobre
arterias y venas de gran calibre) asiacute como tambieacuten aumentan la permeabilidad en la
microcirculacioacuten y estimulan la siacutentesis de PGs por activacioacuten de fosfolipasas A2 y C En
macroacutefagos estimulan la liberacioacuten de la interleucina IL-1 y del factor de necrosis tumoral
(TNF-α) Uno de sus receptores (B1) es inducible por dantildeo tisular e inflamacioacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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El paso final de la coagulacioacuten es la formacioacuten de fibrina la cual no soacutelo frena el
sangrado permitiendo la reparacioacuten del aacuterea lesionada sino que tambieacuten forma una malla en
la que quedan atrapados los agentes agresores impidiendo su diseminacioacuten Por otro lado
durante la formacioacuten de la fibrina se liberan fibrinopeacuteptidos A y B desde el fibrinoacutegeno los
cuales actuacutean como quimiotaacutecticos de los PMNs y potencian los efectos de la bradicinina
El sistema del complemento estaacute formado por proteiacutenas plasmaacuteticas (C) que actuacutean
en forma de cascada en la que cada enzima activa la siguiente La activacioacuten es
desencadenada por complejos antiacutegeno-anticuerpo y productos bacterianos Como
consecuencia de su activacioacuten se forman productos con propiedad opsonizante
quimiotaacutectica y capacidad liacutetica sobre ceacutelulas diana Los productos C5a y C3a estimulan el
estallido respiratorio en los fagocitos desencadenan la liberacioacuten de mediadores (histamina
PAF IL-3 4 5 y 6 entre otros) asiacute como la siacutentesis de LTs PGs y TXs desde mastocitos y
basoacutefilos C5a y en menor medida C3a es un potente agente quimiotaacutectico de neutroacutefilos
ademaacutes de estimular la siacutentesis de eicosanoides C5a tambieacuten genera vasodilatacioacuten y
aumento de la permeabilidad capilar C5a y C3a tambieacuten se pueden formar por accioacuten de la
plasmina la calicreiacutena y enzimas leucocitarias
Bajo el estiacutemulo local el macroacutefago hiacutestico libera las citocinas IL-1 y TNF-α entre
otros mediadores las cuales actuacutean estimulando las ceacutelulas endoteliales (luego de la
trombina o la histamina) ceacutelulas epiteliales y fibroblastos a liberar quimiocinas (MCP-1) Las
quimiocinas actuacutean sobre diversos tipos leucocitarios conducieacutendolos al sitio inflamado IL-8
es un potente quimiotaacutectico para neutroacutefilos pero tambieacuten para linfocitos (Roitt 2003)
312 Regulacioacuten y resolucioacuten de la inflamacioacuten
La finalizacioacuten de la respuesta inflamatoria y la transicioacuten al estado homeostaacutetico es
un proceso activo y altamente regulado conocido como la resolucioacuten de la inflamacioacuten
(Medzhitov 2010) Entre los mecanismos reguladores identificados se pueden mencionar
proteiacutenas reguladoras del complemento el factor transformante β (TGF-β) las IL-4 y IL-10
la PGE2 y los glucocorticoides endoacutegenos que actuacutean regulando la proliferacioacuten y
activacioacuten de las ceacutelulas inflamatorias (Roitt 2003) las lipoxinas (producidas por la 15-
lipooxigenasa en los tejidos) inhiben el reclutamiento de neutroacutefilos y promueven el
reclutamiento de los monocitos que eliminan las ceacutelulas muertas e inician la reparacioacuten del
tejido las resolvinas y protectinas (derivadas del aacutecido eicosapentanoico y del
docosahexanoico) tienen un papel crucial en la resolucioacuten de la inflamacioacuten junto a las
lipoxinas (Medzhitov 2008) los fosfoliacutepidos de las membranas de las ceacutelulas endoteliales
vasculares oxidados por las ROS disminuyen la expresioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten
(Brash 1999)
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Dependiendo de la cantidad de tejido destruido y la naturaleza del agente agresor la
inflamacioacuten puede generar secuelas tales como la cicatrizacioacuten y la formacioacuten de abscesos
La cicatrizacioacuten ocurre cuando hay dantildeo sustancial al tejido conectivo yo el tejido
carece de la capacidad para regenerar ceacutelulas especializadas Los tejidos muertos y el
exudado inflamatorio agudo se reemplazan por un tejido conectivo vascular especializado
llamado tejido de granulacioacuten el cual produce gradualmente colaacutegeno para formar una
cicatriz fibrosa A pesar de la peacuterdida de algunas ceacutelulas especializadas y algo de distorsioacuten
arquitectoacutenica de la cicatriz fibrosa se restablece la integridad estructural
La formacioacuten de abscesos es un proceso que tiene lugar cuando la reaccioacuten
inflamatoria aguda no puede destruireliminar el agente agresor y continuacutea con un
componente de la inflamacioacuten croacutenica Esto es maacutes comuacuten en el caso de la infeccioacuten por
bacterias pioacutegenas (Woolf et al 2002)
313 Inflamacioacuten croacutenica
Cuando la inflamacioacuten se mantiene durante un tiempo prolongado (semanas o
meses) se habla de inflamacioacuten croacutenica en la que coexisten el dantildeo tisular y los intentos
de reparacioacuten Puede producirse por mantenimiento de la inflamacioacuten aguda (si no se
resuelve la causa) o bien empezar de manera progresiva y poco evidente sin las
manifestaciones de la inflamacioacuten aguda Este segundo caso es el responsable del dantildeo
tisular de algunas enfermedades como la artritis reumatoide la aterosclerosis la
tuberculosis y la fibrosis pulmonar Ademaacutes es importante en el desarrollo del caacutencer y en
enfermedades que anteriormente se consideraban exclusivamente degenerativas como el
Alzheimer Entre las causas de la inflamacioacuten croacutenica se pueden distinguir las infecciones
persistentes (micobacterias ciertos hongos virus y paraacutesitos) las enfermedades mediadas
por el sistema inmune (artritis reumatoide reacciones aleacutergicas enfermedad de Crohn y
esclerosis muacuteltiple) y la exposicioacuten prolongada a agentes toacutexicos (polvo de siacutelice fibras
suturas y cuerpos extrantildeos que no pueden ser removidos por fagocitosis) (Kumar 2009)
Ante la persistencia durante diacuteas del agente agresor los PMNs son reemplazados
por ceacutelulas mononucleares (macroacutefagos linfocitos y ceacutelulas plasmaacuteticas) si bien pueden
persistir algunos neutroacutefilos Los macroacutefagos presentan una morfologiacutea variable secretan
mediadores de inflamacioacuten regulan la actividad de linfocitos y favorecen la proliferacioacuten y el
desarrollo de fibroblastos y ceacutelulas endoteliales Durante la fase proliferativa de la
inflamacioacuten croacutenica los fibroblastos restauran la matriz del tejido conectivo dantildeado
conduciendo a la fibrosis en tanto que la proliferacioacuten de ceacutelulas endoteliales favorece la
formacioacuten de pequentildeos capilares (angiogeacutenesis)
Un tipo morfoloacutegico de la inflamacioacuten croacutenica es la inflamacioacuten granulomatosa
caracterizada por una coleccioacuten organizada de macroacutefagos los cuales forman ceacutelulas
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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epiteliodes o se fusionan formando ceacutelulas gigantes ante la imposibilidad de digerir el agente
fagocitado Independientemente de su causa los granulomas pueden contener otras ceacutelulas
(linfocitos neutroacutefilos eosinoacutefilos fibroblastos) ademaacutes de fibrosis (Mukhopadhyay et al
2012) El proceso de formacioacuten de granulomas se puede dividir en 4 fases (iniciacioacuten
acumulacioacuten efectora y de resolucioacuten) en las cuales las ceacutelulas T tienen un rol
importante Durante la iniciacioacuten los macroacutefagos son atraiacutedos por el estiacutemulo inflamatorio y
comienza a nuclear la lesioacuten granulomatosa Durante la acumulacioacuten ceacutelulas T CD4+ se
acumulan en el sitio y reclutan otras ceacutelulas efectoras incluyendo ceacutelulas T maacutes
macroacutefagos y en algunos casos eosinoacutefilos Durante la fase efectora las ceacutelulas intentan
reducir la carga de patoacutegenos Por uacuteltimo una vez que la amenaza del patoacutegeno ha sido
reducida o eliminada la infiltracioacuten celular se reduce y se induce la formacioacuten del tejido
cicatricial (Co et al 2004) Las infecciones micoacuteticas la tuberculosis la lepra y la presencia
de cuerpos extrantildeos (talco suturas etc) son algunas de las causas de la inflamacioacuten
granulomatosa
En la inflamacioacuten no granulomatosa las ceacutelulas se encuentran diseminadas Se
caracterizan por la acumulacioacuten de linfocitos sensibilizados por antiacutegenos ceacutelulas
plasmaacuteticas y macroacutefagos Puede observarse necrosis tisular y fibrosis Las causas maacutes
comunes son las infecciones virales croacutenicas y las enfermedades autoinmunes entre otras
(Rotelli 2004)
314 Proteasas como antiinflamatorios
El rol de las proteasas como agentes antiinflamatorios especialmente el de la
tripsina es considerado desde la deacutecada del 50 en varios estudios (Martin et al 1954
Cohen et al 1955) En 1957 Innerfield reporta el efecto antiinflamatorio de la tripsina
administrada intramuscularmente en pacientes con tromboflebitis con gran componente
edematoso Atribuye a la proteasa un aumento en la permeabilidad tisular una disminucioacuten
en la viscosidad de los exudados y la reversioacuten del edema asiacute como la superacioacuten de la
isquemia en los tejidos con inflamacioacuten aguda al eliminar las barreras exudativas
extravasculares al flujo sanguiacuteneo en los pequentildeos vasos comprimidos
Un antecedente importante en el estudio de la accioacuten antiedematosa de las
proteasas cisteiacutenicas es el trabajo de Netti et al (1972) quienes compararon los efectos de
proteasas y agentes antiinflamatorios conocidos sobre edemas inducidos por distintos
agentes flogiacutesticos en pata de rata Los porcentajes de inhibicioacuten de edema para ficina
bromelina al igual que para un concentrado de enzimas proteoliacuteticas pancreaacuteticas fueron
iguales o superiores a los de indometacina acido acetilsaliciacutelico y fenilbutazona mientras
que la papaiacutena a la concentracioacuten ensayada no fue efectiva frente a ninguacuten edema En los
modelos animales la viacutea de administracioacuten de las preparaciones proteoliacuteticas es en su
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
46
mayoriacutea oral aunque la eficacia antiedematosa de la bromelina administrada
intraperitonealmente tambieacuten ha sido comprobada (Smyth et al 1962 Uhlig amp Seifert
1981)
3141 Bromelina
Desde su introduccioacuten comercial en 1957 se han publicado resultados cientiacuteficos
que revelan los efectos antitromboacutetico fibrinoliacutetico y antiinflamatorio de la bromelina
evaluados mediante ensayos in vivo e in vitro (Maurer 2001) Ademaacutes de los modelos de
edema ya mencionados otros modelos experimentales de inflamacioacuten en los que la
bromelina ha sido efectiva son los siguientes encefalomielitis aleacutergica experimental (un
modelo experimental de la esclerosis muacuteltiple humana) asma aleacutergico pleuritis inducida por
carragenina enfermedades reumatoloacutegicas en ratoacuten arterioesclerosis inmunoloacutegicamente
mediada en aloinjertos aoacuterticos de rata y enfermedad inflamatoria intestinal en ratones IL-10-
- (Fitzhugh et al 2008 Secor et al 2012)
Una serie de estudios cliacutenicos controlados reportaron la eficacia de la bromelina
frente a edema inflamacioacuten dolor hematomas entre otros signos en sinusitis aguda
traumatismos en cara cabeza y extremidades inferiores tumefaccioacuten post-operatoria
inflamacioacuten e hinchazoacuten post-traumaacutetica y cirugiacutea oral (Maurer 2001)
El uso de la bromelina como antiinflamatorio o analgeacutesico en la artritis reumatoide fue
sugerido por Cohen amp Goldman (1964) Maacutes recientemente la bromelina ha sido evaluada
para la artrosis en varios estudios cliacutenicos abiertos o de equivalencia disentildeados para
determinar la efectividad comparativa y la seguridad respecto al tratamiento estaacutendar con
antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) Dichos estudios sugieren que la bromelina sola o
en complejos enzimaacuteticos (PHL9 WOB10 y WOB-N11) puede ser beneficiosa o tan eficaz
como el tratamiento con AINEs mostrando buena tolerabilidad y leves reacciones adversas
(principalmente siacutentomas gastrointestinales) Sin embargo la mayoriacutea de los estudios tienen
determinados problemas metodoloacutegicos que hacen difiacutecil extraer conclusiones definitivas
(Brien et al 2004 2006)
En un estudio de nivel II de medicina basada en la evidencia (EBM) se ha
demostrado que el tratamiento con bromelina en nintildeos con sinusitis aguda puede ser
considerada como segura y beneficiosa (Braun et al 2005)
El efecto antiinflamatorio de la bromelina puede ser explicado por su accioacuten sobre
distintos niveles del complejo proceso inflamatorio como se sentildeala a continuacioacuten
9 PHL Phlogenzyme contiene bromelina tripsina y rutina
10 WOB Wobenzyme contiene bromelina papaiacutena tripsina quimotripsina pancreatina lipase y amilasa
11 WOB-N contiene bromelina tripsina papaiacutena quimotripsina pancreatina y rutina
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31411 Efecto sobre los componentes de la coagulacioacuten
En el modelo edema de pata inducido por carragenina la accioacuten antiinflamatoria de
bromelina fue correlacionado con el aumento de la actividad fibrinoliacutetica seacuterica (Pirotta amp
Giuli-Morghen 1978) Ademaacutes la bromelina ha mostrado aumentar la concentracioacuten de
plasmina seacuterica (Smyth et al 1962) la activacioacuten de plasminoacutegeno a plasmina (Maurer et
al 2000) y disminuir el nivel seacuterico de fibrinoacutegeno (Livio et al 1978) Todos estos efectos
disminuiriacutean la deposicioacuten de fibrina en el aacuterea inflamada produciendo un aumento en la
permeabilidad tisular y vascular lo que promoveriacutea la reabsorcioacuten del fluido del edema
(Maurer 2001)
31412 Efecto sobre el sistema de calicreiacutenas
En el modelo de inflamacioacuten en ratas ldquobolsa de airerdquo inducido por caoliacuten la bromelina
redujo de manera dosis-dependiente el nivel de bradicinina en el sitio de inflamacioacuten y el
nivel de precalicreiacutena seacuterica los que fueron correlacionados con la reduccioacuten del exudado
plasmaacutetico (Kumakura et al 1988) explicando la accioacuten antiedematosa asiacute como
analgeacutesica de la bromelina
31413 Efecto sobre las viacuteas de la COX y la NOS
Los niveles de PGE2 asiacute como de sustancia P (un neuropeacuteptido asociado a la
percepcioacuten del dolor) se encontraron disminuidos en el exudado inflamatorio generado en
ratas por la implantacioacuten de esponjas embebidas en carragenina (Gaspani et al 2002) En
otro modelo inflamatorio la bromelina redujo de manera dosis-dependiente los niveles de
PGE2 y TXs junto con el volumen de exudado (Vellini et al 1986) Maacutes recientemente la
bromelina ha mostrado reducir la expresioacuten de la COX-2 y PGE2 por inhibicioacuten en la
translocacioacuten del factor nuclear kappa-B (NF-ĸB) en ceacutelulas tumorales asiacute como en modelos
experimentales de caacutencer (Chobotova et al 2010 Bhui et al 2012)
La administracioacuten oral de bromelina mejoroacute la disminucioacuten de la defecacioacuten en ratas
postoperatorias laparotomizadas al menos en parte mediante la inhibicioacuten de la
sobreexpresioacuten de la i-NOS del colon a traveacutes de la ruta del NF-kB (Wen et al 2006)
31414 Modulacioacuten de moleacuteculas de superficie celular
La bromelina ha mostrado remover moleacuteculas de superficie celular en leucocitos
(granulocitos monocitos y linfocitos) asociadas con la adhesioacuten y la activacioacuten leucocitaria
(Hale et al 2002) La reduccioacuten de la migracioacuten de neutroacutefilos en tres modelos murinos de
migracioacuten leucocitaria en cavidad intraperitoneal inflamada fue asociada a la remocioacuten de L-
selectina y principalmente de CD128 (receptor del quimioatractante IL-8) desde la superficie
leucocitaria lo que llevoacute a la eliminacioacuten de la adhesioacuten de alta afinidad mediada por
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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integrinas de los vasos sanguiacuteneos del sitio inflamado (Fitzhugh et al 2008) La bromelina
activa proteoliacuteticamente redujo la expresioacuten de CD25 (presente en la superficie de ceacutelulas T
activas que actuacutea como receptor del factor de proliferacioacuten IL-2) de manera dosis y tiempo
dependiente en ensayos in vitro y se propuso como mecanismo el clivaje proteoliacutetico de
CD25 desde la superficie celular (Secor et al 2009) Tambieacuten se ha sugerido que bromelina
podriacutea mediar su efecto antiinflamatorio actuando como moleacutecula de sentildealizacioacuten sobre los
receptores activados por proteasas (PAR) (Engwerda et al 2001 Muumlller et al 2012)
31415 Activacioacuten celular y produccioacuten de citoquinas
La bromelina mostroacute inhibir la transduccioacuten de sentildeales (viacutea MAPKERK-2) y la
produccioacuten de citoquinas (IL-4 IL-2 e IFN-γ) desde ceacutelulas T accioacuten que fue revertida al
inhibir la actividad proteoliacutetica de bromelina (Mynott et al 1999) En un modelo murino de la
enfermedad aleacutergica respiratoria ya establecida la bromelina redujo significativamente el
contenido de ceacutelulas T (CD4 y CD8) en el lavado bronqueoalveolar (BAL) sin afectar el
nuacutemero de ceacutelulas en el bazo o los ganglios linfaacuteticos hiliares ademaacutes de una disminucioacuten
de IL-4 IL-12 IL-17 asiacute como de IFN-α en el suero (Secor et al 2012)
La bromelina regula la produccioacuten de IFN-γTNF-α IL-1β e IL-6 de forma dependiente
de las condiciones inflamatorias La secrecioacuten de TNF-α IL-1β e IL-6 desde ceacutelulas
mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) obtenida de voluntarios sanos asiacute como de
macroacutefagos de ratoacuten seriacutea estimulada in vitro por la bromelina mediante un mecanismo
dependiente de IFN-γ Sin embargo en situaciones en las que las ceacutelulas inmunes ya han
sido estimuladas la bromeliacutena reduce la produccioacuten elevada de TNF-α IL-1β e IL-6 Por
ejemplo en presencia de lipopolisacaacuterido (LPS) un inductor de la reaccioacuten de inflamacioacuten
aguda bromelina reduce la expresioacuten de dichas citocinas desde PBMC (Chobotova et al
2010) Esta probable dualidad tambieacuten ha sido observada en modelos in vivo donde la
bromelina ha mostrado ser capaz tanto de mejorar como de inhibir las respuestas inmunes
dependientes de ceacutelulas T lo cual podriacutea depender del entorno inmunoloacutegico particular en el
que se la administra (Engwerda et al 2001)
Maacutes recientemente en un ensayo cliacutenico aleatorio controlado con placebo la
bromelina ha mostrado modular las respuestas celulares de linfocitos (cambio significativo
en el perfil circadiano de IFN-γ) despueacutes de su administracioacuten oral en voluntarios sanos
(Muumlller et al 2012)
Las evidencias experimentales dan cuenta de que la bromelina tendriacutea accioacuten sobre
muacuteltiples dianas y si bien su mecanismo antiinflamatorio no ha sido completamente
dilucidado numerosos efectos estaacuten mediados por su actividad proteoliacutetica (Pirotta amp Giuli-
Morghen 1978 Hale amp Haynes 1992 Mynott et al 1999 Hale et al 2002 Wen et al
2006 Hale et al 2005 Fitzhugh et al 2008 Secor et al 2009)
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32 Objetivos
Dentro del objetivo general de estudiar el posible efecto antiinflamatorio de los
extractos ricos en cisteiacutenendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) B
balansae (Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) se plantearon los siguientes objetivos
especiacuteficos
Evaluar el efecto de Bh Bb y Pm sobre la inflamacioacuten aguda y croacutenica empleando
modelos de inflamacioacuten en animales
Determinar si los efectos medidos tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los
extractos
Comparar los efectos de Bh Bb y Pm con los medidos para bromelina
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
50
33 Materiales y meacutetodos
331 Modelos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria provocada por distintos estiacutemulos (isquemia agentes
infecciosos injuria quiacutemica teacutermica o mecaacutenica interaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo) puede ser
medida por los signos cliacutenicos que la acompantildean eritema edema dolor e hiperalgesia Una
serie de mecanismos dan lugar a distintas fases en que puede caracterizarse al proceso
inflamatorio
-Fase aguda transitoria caracterizada por vasodilatacioacuten local e incremento de la
permeabilidad capilar
-Fase subaguda caracterizada por infiltracioacuten de leucocitos y ceacutelulas fagociacuteticas
-Fase croacutenica proliferativa en la cual aparece una degeneracioacuten del tejido y fibrosis
Diferentes modelos desarrollados en animales de experimentacioacuten permiten
reproducir dichas fases (Vogel 2002) proporcionando un meacutetodo necesario para el
descubrimiento del uso apropiado de nuevos agentes terapeacuteuticos (Willoughby 2003)
El efecto antiinflamatorio de los preparados proteoliacuteticos fue evaluado usando
modelos de inflamacioacuten aguda o subaguda (edema de pata de rata) y un modelo de
inflamacioacuten croacutenica proliferativa (test del granuloma)
3311 Modelos de inflamacioacuten aguda Edema de pata de rata
Este modelo se basa en medir la capacidad de los agentes antiinflamatorios de
inhibir el edema producido en la pata trasera de ratas o ratones luego de la inyeccioacuten de un
agente flogiacutestico El efecto antiinflamatorio medido asiacute como su duracioacuten dependen de la
sustancia empleada como agente flogiacutestico (Vogel 2002)
33111 Edema de pata inducido por carragenina
Los carragenanos son un grupo complejo de polisacaacuteridos formados por la repeticioacuten
de monoacutemeros de galactosa modificada y son de tres tipos principales lambda kappa y
iota En el modelo de edema de pata la carragenina tipo lambda es inyectada
subcutaacuteneamente en la pata trasera La respuesta inflamatoria generada se caracteriza por
edema hiperalgesia y eritema y se cuantifica por el aumento de tamantildeo de la pata a raiacutez del
edema formado el cual es maacuteximo alrededor de las 5 h posteriores a la inyeccioacuten de
carragenina (Morris 2003)
El incremento en el volumen del edema es dependiente del tiempo y su desarrollo ha
sido descripto como un proceso bifaacutesico (Vinegar et al 1969 Salvemini et al 1996) La
fase temprana (0-1 h) se caracteriza por la liberacioacuten de histamina e 5-hidroxitriptamina (5-
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
51
HT) y le sigue un corto periacuteodo (asymp15-25 h) en que se libera bradicinina (Di Rosa et al
1971) mientras que la fase tardiacutea (asymp25-10 h) ha sido correlacionada con la produccioacuten de
prostaglandinas (PGs) atribuida a la induccioacuten de la ciclooxigenasa inducible (COX-2)
(Seibert et al 1994) La infiltracioacuten y activacioacuten de neutroacutefilos contribuye a la respuesta
inflamatoria principalmente de la fase tardiacutea por liberacioacuten de radicales libres derivados del
oxiacutegeno (O2- radicales hidroxilo) El oacutexido niacutetrico (NO) producido por la oacutexido niacutetrico sintasa
constitutiva (c-NOS) en la primera fase y por la oacutexido niacutetrico sintasa inducible (i-NOS) en la
fase tardiacutea actuacutea como un potente vasodilatador y tendriacutea un rol clave en el mantenimiento
de la respuesta inflamatoria tardiacutea al aumentar la produccioacuten de PGs por activacioacuten de la
COX-2 (Salvemini et al 1996)
La inhibicioacuten del edema de pata inducido por carragenina ha demostrado ser
altamente predictivo de la accioacuten antiinflamatoria del faacutermaco en la enfermedad inflamatoria
humana y las dosis de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en este modelo se
correlacionan bien con la dosis eficaz en los pacientes (Morris 2003)
331111 Procedimiento experimental
En la pata trasera izquierda de cada animal se realizoacute una inyeccioacuten subplantar de
01 mL de carragenina lambda tipo IV (Sigma Aldrich) al 2 en solucioacuten fisioloacutegica Una
hora antes cada lote de animales recibioacute intraperitonealmente (05 mL) los preparados a
ensayar El lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 y como control positivo se
usoacute 10 mgml de indometacina (Sigma Aldrich) o 50 mgml de diclofenac soacutedico (Sigma
Aldrich) Los voluacutemenes de las patas traseras fueron medidos con un pletismoacutemetro a
distintos tiempos post-inyeccioacuten de carragenina (1 3 5 y 7 h)
Aquellos preparados que mostraron tener un efecto antiinflamatorio durante la
primera hora en el modelo de edema inducido por carragenina fueron probados en modelos
de edema inducido por mediadores de la fase temprana histamina y serotonina
33112 Edema de pata inducido por histamina
La histamina a traveacutes de sus receptores (H) distribuidos en el lecho vascular
produce vasodilatacioacuten e hiperpermeabilidad capilar Luego de ser administrada produce un
efecto vasodilatador de muy corta duracioacuten dando lugar a hiperemia enrojecimiento y
edema
331121 Procedimiento experimental
Los animales recibieron en la pata trasera izquierda una inyeccioacuten subplantar de 01
mL de histamina clorhidrato (Sigma Aldrich) al 01 en solucioacuten fisioloacutegica Una hora antes
a cada lote se le administroacute intraperitonealmente 05 mL de los preparados a ensayar y el
lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Mediante la utilizacioacuten de un
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
52
pletismoacutemetro se midioacute el volumen de edema a los 15 30 y 60 min despueacutes de la
administracioacuten de histamina (Rotelli 2004)
33113 Edema de pata inducido por serotonina
En la inflamacioacuten aguda la serotonina (o 5-HT) produce vasodilatacioacuten e
hiperpermeabilidad vascular aunque con menor potencia que la histamina
331131 Procedimiento experimental
Cada animal recibioacute en su pata trasera izquierda una inyeccioacuten subplantar de 01 mL
de serotonina clorhidrato (Sigma Aldrich) al 001 en solucioacuten fisioloacutegica Una hora antes
cada lote recibioacute intraperitonealmente 05 mL de los preparados a ensayar y el lote control
recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Mediante la utilizacioacuten de un pletismoacutemetro se
midioacute el volumen de edema a los 30 60 y 120 minutos posteriores a la administracioacuten de la
serotonina (Rotelli 2004)
33114 Equipamiento medidas y caacutelculo del volumen de edema
Las medidas del volumen de las patas traseras fueron realizadas mediante el uso de
un pletismoacutemetro (Ugo Basile 7140) que consiste en una celda conteniendo liacutequido en la
cual se sumerge la pata y un transductor que transforma el volumen de liacutequido desplazado
en una sentildeal eleacutectrica la cual se lee como volumen de la pata con una precisioacuten de 001
mL
La celda estaacute constituida por dos tubos interconectados en uno de los cuales se
sumerge la pata y el desplazamiento de agua producido genera un cambio en el nivel del
liacutequido en el segundo tubo donde se encuentra el transductor Este uacuteltimo consiste en dos
pares de electrodos de Pt-Ir Un par de electrodos (electrodo de nivel) mide la conductancia
y la conductividad del liacutequido Por estar los electrodos parcialmente sumergidos la
conductancia es proporcional al nivel del liacutequido y por lo tanto al volumen de la pata Un
segundo par de electrodos (electrodos de compensacioacuten) por estar totalmente sumergidos
soacutelo son sensibles a la conductividad y a traveacutes de un circuito electroacutenico corrigen la lectura
del electrodo de nivel de manera que la sentildeal resultante es proporcional a la conductancia y
por tanto al volumen sumergido El liacutequido contenido en la celda es una solucioacuten de NaCl al
5 conteniendo un agente tensioactivo (proporcionado por el fabricante) que minimiza el
menisco de lectura12
Ambas patas traseras fueron marcadas con una fibra indeleble por encima del
maleacuteolo lateral y cada una fue sumergida hasta hacer coincidir la marca con el menisco del
liacutequido momento en el cual se registroacute la medida del volumen Cada volumen fue medido
12
httpwwwugobasilecomcataloguecategorypain_and_inflammationproduct37140_plethysmometerhtml
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
53
por triplicado en todos los tiempos de medida El volumen de edema fue calculado por la
resta de los voluacutemenes promedio de ambas patas
3312 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma
Meier et al (1950) demostraron que el implante de algodones esteacuteriles en ratas
produciacutean granulomas de cuerpo extrantildeo caracterizados por tejido conectivo no
diferenciado ceacutelulas gigantes e infiltracioacuten de fluido Despueacutes de varios diacuteas el incremento
del peso del pellet implantado puede ser medido constituyendo una medida del tejido
granulomatoso y por lo tanto de la respuesta inflamatoria (Vogel 2002) Este meacutetodo ha
demostrado ser uacutetil para la demostracioacuten de la actividad farmacoloacutegica de los esteroides
como antiinflamatorios (Bailey et al 1982)
El desarrollo del edema implica distintos eventos Tempranamente en la vecindad
del algodoacuten se producen sustancias quimiotaacutecticas para neutroacutefilos y monocitos Durante los
primeros 5 diacuteas despueacutes de la implantacioacuten se demostroacute la continua acumulacioacuten de ceacutelulas
polimorfonucleares (PMNs) principalmente neutroacutefilos que penetraban al algodoacuten desde la
periferia Entre los diacuteas 5 y 7 los estudios histoloacutegicos mostraron que la amplia
vascularizacioacuten se llevaba a cabo con la formacioacuten de una caacutepsula fibrosa junto con una
infiltracioacuten masiva de la caacutepsula por las ceacutelulas mononucleares El aumento en el peso del
granuloma resulta significativo recieacuten a partir del diacutea 5 (Bailey et al 1982)
33121 Procedimiento experimental
Ratas hembra fueron anestesiadas por inyeccioacuten intraperitoneal de una mezcla
conteniendo 75 mgkg de ketamina clorhidrato (Holliday Scott SA) y 12 mgkg de xilacina
clorhidrato (Richmond Laboratories Vet Pharma) El granuloma fue inducido por el implante
subcutaacuteneo de un pellet de algodoacuten esteacuteril (50 mg) en el aacuterea dorsal Un diacutea despueacutes del
implante los animales fueron divididos en lotes de 6 animales e inyectados
intraperitonealmente (05 mL) con los preparados a ensayar Como control positivo se usoacute
un lote administrado con dexametasona fosfato soacutedico (adquirida a Norgreen y a Klonal) en
tanto que el lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 La administracioacuten fue
repetida diariamente durante los 5 diacuteas siguientes El 7mo diacutea las ratas fueron pesadas y
luego de sacrificarlas por dislocacioacuten cervical se les extrajo el granuloma el timo y el bazo
los cuales tambieacuten fueron pesados El aumento en el peso del algodoacuten introducido permitioacute
cuantificar el tejido inflamatorio (granulomatoso) depositado en el algodoacuten (Meier et al
1950)
3313 Caacutelculo del efecto antiinflamatorio y anaacutelisis estadiacutestico
Los datos obtenidos se analizaron estadiacutesticamente mediante ANOVA con posterior
comparacioacuten por las pruebas de Tukey o Dunnett El grado de significancia de las
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
54
diferencias entre los lotes fue evaluado con el paraacutemetro p consideraacutendose
estadiacutesticamente significativo un p lt 005 () Para el procesamiento de los datos se empleoacute
el programa GraphPad Prism Version 500 En los graacuteficos y en las tablas los resultados se
expresan como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de la media (SEM) En todos los casos
salvo excepciones que son especificadas el nuacutemero de reacuteplicas por experimento (n) fue = 6
Los porcentajes de inhibicioacuten de la inflamacioacuten como una medida de la accioacuten
antiinflamatoria fueron calculados con la siguiente foacutermula
inhibicioacuten = (1 - VT VC) x 100
siendo VC la medida promedio para el lote control (volumen para los modelos de edema de
pata de rata masa para el test del granuloma) y VT la medida promedio para el lote que fue
tratado con la droga en estudio La misma foacutermula fue usada para calcular los porcentajes
de reduccioacuten de las masas del timo y del bazo
332 Animales
En todos los ensayos de inflamacioacuten fueron empleadas ratas Wistar de ambos sexos
proporcionadas por el bioterio de la Universidad Nacional de San Luis En el laboratorio
fueron pesadas y distribuidas en lotes de 6 dejadas en jaulas y abastecidas con alimento y
agua ad libitum durante el periacuteodo de los ensayos Para los modelos de inflamacioacuten aguda
se emplearon animales de entre 170 y 220 g y luego de los ensayos fueron sacrificados
mediante una corriente de CO2 Los animales usados para los ensayos de inflamacioacuten
croacutenica pesaron entre 90 y 140 g y fueron sacrificados mediante dislocacioacuten cervical
333 Dosis
Las dosis de Bh Bb y Pm fueron preparadas resuspendiendo los liofilizados en agua
esteacuteril mientras que para preparar las dosis de bromelina se resuspendioacute el polvo comercial
en buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Todas las soluciones fueron preparadas en el
momento de administrarlas
334 Material vegetal ensayado
En la Tabla 32 se presentan los valores de actividad caseinoliacutetica y contenido
proteico por mg de liofilizado (UCasmg y μg proteiacutenamg respectivamente) asiacute como la
actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos parcialmente purificados obtenidos
por precipitacioacuten etanoacutelica a partir de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) Pseudananas
macrodontes (Pm) y Bromelia balansae (Bb) Debido a que se obtuvieron varios extractos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
55
para cada material vegetal (Bh1-5 Bb1-4 y Pm1-4) esto se indica en cada una de las tablas
en que se exponen los resultados obtenidos para cada experimento
Liofilizados UCasmg liofilizado μg proteiacutenamg liofilizado UCasmg proteiacutena
Bh1 0177 plusmn 0004dagger 18 plusmn 2
dagger 98
Bh2 0173 plusmn 0042dagger 21 plusmn 3
dagger 82
Bh3 019 plusmn 003dagger 18 plusmn 2
dagger 106
Bh4 020 plusmn 002dagger 21 plusmn 2
dagger 97
Bh5 020 plusmn 002 19 plusmn 2 9
Bh (Promedio total plusmn DE) 019 plusmn 002 20 plusmn 2 10 plusmn 1
Bb1 0161 plusmn 0006dagger 9 plusmn 1
dagger 17
Bb2 0164 plusmn 003dagger 9 plusmn 1
dagger 17
Bb3 0135 plusmn 0009dagger 13 plusmn 1
dagger 104
Bb4 017 plusmn 001 14 plusmn 1 12
Bb (Promedio total plusmn DE) 016 plusmn 002 11 plusmn 3 14plusmn 4
Pm1 017 plusmn 002 29 plusmn 4 59
Pm2 0187 plusmn 0009 30 plusmn 3 6
Pm3 025plusmn 003dagger 32 plusmn 4
dagger 9
Pm4 0125 plusmn 0013 25 plusmn 2 5
Pm (Promedio total plusmn DE) 018 plusmn 005 29 plusmn 3 6 plusmn 2
Bromelina (Sigma Aldrich) 063 plusmn 006 200 plusmn 20 32 plusmn 05
Tabla 32 Actividad caseinoliacutetica contenido proteico y actividad especiacutefica de los extractos parcialmente
purificados Media plusmn DE daggerError calculado como [Xmaacuteximo-Xmiacutenimo]2 siendo Xmaacuteximo y Xmiacutenimo valores promedios (n =
3) maacuteximo y miacutenimo respectivamente obtenidos de dos mediciones independientes UCas unidades
caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC)
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56
34 Resultados y Discusioacuten
341 Modelos de inflamacioacuten aguda
3411 Edema de pata de rata inducido por carragenina
34111 Bromelia hieronymi
En un trabajo previo (Boeris et al 2004) se encontroacute que en el modelo de edema de
pata de ratoacuten inducido por carragenina una dosis de 50 mgkg de un extracto parcialmente
purificado obtenido de frutos de Bromelia hieronymi presentaba efecto antiinflamatorio Esa
dosis fue evaluada en ratas como una primera aproximacioacuten a la determinacioacuten de una dosis
efectiva En la Tabla 33 se muestran los voluacutemenes de edema promedio y los porcentajes
de inhibicioacuten respecto al lote control medidos a 1 3 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina
de lotes tratados con 50 mgkg de Bh1 y con 50 mgkg de bromelina
Tabla 33 Efecto de Bh1 y bromelina en edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Tanto Bh como bromelina inhibieron significativamente la formacioacuten de edema en
alguno de los tiempos de medida Mientras Bh mostroacute actividad antiinflamatoria a las 3 h tal
como fue reportado (Boeris et al 2004) bromelina lo hizo a las 5 y 7 h post inyeccioacuten de
carragenina
A fin de corroborar si al aumentar la dosis de Bh se lograba efecto antiinflamatorio en
los otros tiempos de medida se ensayaron dosis de 100 y 200 mgkg Ademaacutes puesto que
la hipoacutetesis de partida fue que la actividad proteoliacutetica podriacutea ser la responsable de la accioacuten
antiinflamatoria de los extractos se tuvieron en cuenta las UCaskg administradas De la
Tabla 32 puede deducirse que una dosis de 200 mgkg de Bh1 equivale a un promedio de
35 UCaskg Con fines comparativos la dosis de bromelina se llevoacute a 55 mgkg (equivalente
a 35 UCaskg)
Tiempo
(h)
Control Bh1
50 mgkg Bromelina 50 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 025plusmn002 020plusmn002 20c 029plusmn007 -14c
3 052plusmn002 023plusmn003 56a 03plusmn01 33ca
5 11plusmn01 058plusmn009 45ca 04plusmn02 60a
7 127plusmn005 114plusmn006 10c 05plusmn02 60a
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
57
En los resultados expuestos en la Tabla 34 puede observarse que Bh mostroacute un
efecto antiinflamatorio significativo desde la primera hora en la cual inhibioacute la formacioacuten de
edema con una eficacia de alrededor del 35 alcanzando el maacuteximo valor a las 5 h con un
porcentaje de inhibicioacuten significativamente similar al de bromelina e indometacina (asymp 75)
Mientras que los porcentajes de inhibicioacuten de 100 y 200 mgkg de Bh fueron
significativamente equivalentes a los de la bromelina desde la primera hora hasta las 5 h a
las 7 h soacutelo la dosis de 200 mgkg mantuvo un efecto significativamente similar al de
bromelina (asymp 70) Dado que 55 mgkg de bromelina y 200 mgkg de Bh son equivalentes
en actividad proteoliacutetica (35-36 UCaskg) los resultados de la Tabla 34 estaacuten acordes con
la hipoacutetesis de que la actividad proteoliacutetica seriacutea responsable de la actividad antiinflamatoria
de los preparados enzimaacuteticos Para fortalecer esta hipoacutetesis se proboacute el efecto que tiene la
inhibicioacuten con E-64 de las proteasas cisteiacutenicas sobre la accioacuten antiinflamatoria exhibida por
Bh y bromelina
Tabla 34 Efecto de diferentes dosis de Bh1 bromelina e indometacina en edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
341111 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina
En la Tabla 35 se muestran los voluacutemenes de edema y los porcentajes de inhibicioacuten
respecto al lote control de lotes tratados con 150 mgkg de Bh4 y 150 mgkg de Bh4
incubado con E-64 (Bh4E-64) 50 mgkg de bromelina y 50 mgkg de bromelina incubada
con E-64 (BromelinaE-64) y 025 μmolkg de E-64 (equivalente a los μmoles contenidos en
las dosis de Bh4E-64 y bromelinaE-64)
Tiempo
(h)
Control
Bh1
50 mgkg
90plusmn02UCaskg
Bh1
100 mgkg
180plusmn04UCaskg
Bh1
200 mgkg
354plusmn08UCaskg
Bromelina
55 mgkg
35plusmn3UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 034plusmn001 024plusmn002 29bc 021plusmn003 38b 022plusmn002 35b 031plusmn005 9bc 030plusmn001 12bc
3 059plusmn006 052plusmn009 12c 027plusmn003 54ba 025plusmn002 58b
027plusmn005 54ba 050plusmn005 15ac
5 12plusmn01 07plusmn01 44a 029plusmn009 75b 026plusmn001 78b 028plusmn003 76b 040plusmn004 66ba
7 124plusmn009 09plusmn01 27ac 08plusmn01 40ad 038plusmn006 69b 032plusmn006 74b 053plusmn004 57bd
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Tiempo
(h)
Control
Bh4
150 mgkg
30plusmn3 UCaskg
Bh4E-64
150 mgkg
09plusmn01 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
BromelinaE-64
50 mgkg
4plusmn2 UCaskg
E-64
025 μmolKg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 042plusmn003 022plusmn002 48b 026plusmn004 38b 022plusmn003 48b 028plusmn002 33ba 040plusmn003 5ac
3 067plusmn007 020plusmn003 70b 04plusmn01 33cb 018plusmn002 73b
05plusmn01 25c 062plusmn006 75c
5 115plusmn008 033plusmn005 71b 10plusmn02 13c 020plusmn001 83b 09plusmn02 20c 103plusmn007 10c
7 144plusmn009 09plusmn02 34a 125plusmn006 13ac 028plusmn007 80b 13plusmn02 9c 120plusmn007 17c
Tabla 35 Efecto del tratamiento con E-64 de Bh y bromelina sobre la accioacuten inhibitoria de edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Puede observarse que Bh y bromelina tuvieron efecto antiinflamatorio a lo largo de
todo el ensayo mientras que BhE-64 y bromelinaE-64 soacutelo mostraron efecto significativo
en la primera h post inyeccioacuten de carragenina Auacuten cuando durante todo el ensayo los
porcentajes de inhibicioacuten de Bh fueron maacutes altos que los de BhE-64 soacutelo a las 5 h lo fue
estadiacutesticamente significativo (71 gt 13 plt005) Por su parte los porcentajes de
inhibicioacuten de bromelina fueron significativamente superiores a los de bromelinaE-64 a las 3
5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina E-64 no mostroacute efecto antiinflamatorio en ninguacuten
tiempo de medida
Dado que al eliminar la actividad proteoliacutetica de Bh y bromelina se observoacute una
peacuterdida de actividad antiinflamatoria desde las 3 h siendo maacutes evidente en los tiempos en
que Bh y bromelina muestran los maacuteximos porcentajes de inhibicioacuten (a las 5 h para Bh y a
las 5 y 7 h para bromelina) se podriacutea suponer que las cisteiacutenendopeptidasas seriacutean las
responsables de la actividad antiinflamatoria medida para Bh y bromelina a partir de las 3 h
post inyeccioacuten de carragenina Por otro lado teniendo en cuenta el rol secuencial de los
distintos mediadores de la inflamacioacuten descriptos para este modelo tambieacuten se podriacutea
suponer que las cisteiacutenendopeptidasas de Bh y bromelina inhibiriacutean la infiltracioacutenactividad
de neutroacutefilos o la siacutentesisaccioacuten de NO y PGs los cuales alcanzan picos de produccioacuten
entre las 3 y las 6 h post inyeccioacuten de carragenina (Salvemini et al 1996) Tanto la
inhibicioacuten de la migracioacuten de neutroacutefilos como de la produccioacuten de PGs y NO ya han sido
demostradas para la bromelina en otros modelos (Gaspani et al 2002 Wen et al 2006
Fitzhugh et al 2008 Kalra et al 2008 Bhui et al 2012)
Los bajos porcentajes de inhibicioacuten medidos en la primera hora post inyeccioacuten de
carragenina respecto a los de las siguientes horas para Bh (Tablas 33 34 y 35) y para
bromelina (Tabla 35) estariacutean indicando que Bh y bromelina tienen un bajo efecto inhibitorio
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
59
sobre los mediadores de la primera fase del modelo Aunque otra explicacioacuten posible es que
durante la primera hora auacuten no se haya alcanzado la concentracioacuten efectiva de los
compuestos activos en el sitio de accioacuten Sea cual fuere la causa de la informacioacuten
aportada en la Tabla 35 se puede concluir que los efectos antiinflamatorios de Bh y
bromelina en la primera hora no dependeriacutean de la actividad proteoliacutetica de las
cisteinendopeptidasas
34112 Pseudananas macrodontes
Los resultados obtenidos para Bh y bromelina fueron tenidos en cuenta para
establecer las dosis a ensayar de los extractos obtenidos a partir de frutos de Pseudananas
macrodontes (Pm) En la Tabla 36 se presentan los voluacutemenes y porcentajes de inhibicioacuten
de edema inducida por carragenina en el modelo de pata de rata a distintas horas para 90 y
180 mgkg de Pm1 (equivalentes a 15 y asymp 30 UCaskg respectivamente) 50 mgkg de
bromelina y 10 mgkg de indometacina
Tiempo
(h)
Control
Pm1
90 mgkg
15plusmn2 UCaskg
Pm1
180 mgkg
31plusmn4 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 027plusmn003 019plusmn002 28bc 012plusmn002 55b 018plusmn002 33bc 024plusmn002 11c
3 064plusmn007 035plusmn004 45ba 019plusmn002 70b 029plusmn003 55b
055plusmn006 14ca
5 114plusmn008 06plusmn02 46b 023plusmn002 80b 028plusmn002 75b 038plusmn003 67b
7 13plusmn01 08plusmn02 37a 020plusmn002 85b 045plusmn004 65d 055plusmn004 58ad
Tabla 36 Efecto de diferentes dosis de Pm1 bromelina e indometacina en edema de pata de rata inducido por
carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey p lt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Puede observarse que ambas dosis de Pm tuvieron efecto antiinflamatorio
significativo alcanzando los maacuteximos porcentajes de inhibicioacuten de edema entre las 3 y las 5
h para la menor dosis y entre las 5 y las 7 h para la mayor dosis Por lo tanto Pm es maacutes
efectivo en la fase tardiacutea propuesta para el modelo de edema inducido por carragenina
Si bien en este ensayo bromelina no alcanzoacute los porcentajes de inhibicioacuten medidos
en los anteriores experimentos (Tablas 34 y 35) puede verse que hasta las 5 h fueron
significativamente similares a los de Pm (180 mgkg) Teniendo en cuenta los valores de la
Tabla 32 se observa que la mayor dosis de Pm (180 mgkg) es equivalente en UCas (asymp 30
UCaskg) a las dosis probadas para bromelina y Bh4 (Tabla 35) mostrando los tres
preparados efectos similares Por otro lado los porcentajes de inhibicioacuten de la dosis de 90
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
60
mgkg de Pm (equivalente a 15 UCaskg) y de 100 mgkg de Bh1 (equivalente a 18
UCaskg) mostrados en la Tabla 34 son similares a excepcioacuten de los medidos a las 5 h
341121 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm
A fin de poner a prueba la hipoacutetesis de que la actividad proteoliacutetica es necesaria para
el efecto antiinflamatorio de Pm del mismo modo que para Bh y bromelina se midioacute el efecto
antiinflamatorio luego de inhibir las cisteiacutenendopeptidasas con E-64 (Tabla 37)
Tiempo
(h)
Control
Pm1
180 mgkg
31plusmn4 UCaskg
Pm1E-64
180 mgkg
04plusmn02 UCaskg
E-64
02 μmolkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 038plusmn003 017plusmn003 55b 028plusmn006 26ba 036plusmn003 5ca
3 060plusmn007 017plusmn002 72b 032plusmn006 47b 056plusmn006 7c
5 104plusmn008 021plusmn003 80b 066plusmn03 36cb 093plusmn007 11c
7 126plusmn01 021plusmn004 83a 09plusmn02 29b 108plusmn007 14cb
Tabla 37 Efecto del tratamiento con E-64 sobre el efecto antiinflamatorio de Pm en modelo de edema de pata
generado por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En la Tabla 37 se puede observar que los porcentajes de inhibicioacuten de Pm fueron
superiores a los de la misma dosis de Pm tratada con E-64 (PmE-64) llegando a ser poco
maacutes del doble a las 1 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina lo cual estariacutea indicando que
las cisteiacutenendopeptidasas contribuyen al efecto antiinflamatorio de Pm No obstante esta
contribucioacuten no parece ser la uacutenica puesto que tanto a las 3 como a las 7 h PmE-64 mostroacute
efecto antiinflamatorio significativo sugiriendo que otros componentes presentes en Pm
estariacutean actuando principalmente sobre la fase tardiacutea
Ante este resultado se hicieron ensayos posteriores a fin de dilucidar el posible
componente con actividad antiinflamatoria de Pm Si bien las UCasmg de PmE-64 fueron
0002 plusmn 0001 y por tanto la dosis de 180 mgkg equivalioacute a 04 UCaskg la primera
posibilidad que se evaluoacute es que en el caso de PmE-64 las proteasas no hubieran sido
completamente inhibidas En ensayos posteriores se evaluoacute la actividad fibrinoliacutetica (mm2)
de Pm1 mediante el ensayo de la placa de fibrina13 por tratarse de un meacutetodo muy sensible
(Jespersen amp Astrup 1983) y pudo determinarse que la dosis de Pm1 conteniacutea 658 (plusmn08)
x103 mm2kg mientras que la dosis de Pm1E-64 conteniacutea 206 (plusmn04) x103 mm2kg un 31
de la actividad fibrinoliacutetica de Pm1 Por lo tanto no puede descartase la posibilidad de que
13
Ver 443 (Capiacutetulo Efecto anticoagulante fibrinogenoliacutetico y fibrinoliacutetico)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
61
las proteasas sean las responsables de la actividad antiinflamatoria de PmE-64 De todos
modos dado que al inhibir las proteasas cisteiacutenicas de Pm (llevando la dosis a 04 UCaskg)
los porcentajes de inhibicioacuten de edema disminuyen aproximadamente un 50 respecto a los
de la dosis de 31 UCaskg de Pm podriacutea atribuirse actividad antiinflamatoria a las proteasas
cisteiacutenicas de Pm Dilucidar el grado de participacioacuten de las mismas en el proceso requeriraacute
ensayos ulteriores
34113 Bromelia balansae
Siguiendo el mismo razonamiento que para Pm las dosis a ensayar de los extractos
parcialmente purificados obtenidos a partir de frutos de B balansae (Bb) fueron definidas de
manera que contuvieran la misma actividad proteoliacutetica que las dosis efectivas de bromelina
y Bh (entre 10 y 35 UCaskg) En un primer ensayo se proboacute una dosis intermedia 120
mgkg de Bb1 equivalente a aproximadamente 20 UCaskg (Tabla 38)
Tiempo
(h)
Control
Bb1
120 mgkg
19plusmn1 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 027plusmn003 022plusmn004 19c 018plusmn002 33c 024plusmn002 11c
3 064plusmn007 03plusmn01 53b 029plusmn003 55b 055plusmn006 14cb
5 114plusmn008 05plusmn02 56b 028plusmn002 75b 038plusmn003 67b
7 13plusmn01 06plusmn02 51b 045plusmn004 65b 055plusmn004 58b
Tabla 38 Efecto de Bb bromelina e indometacina sobre el edema de pata generado por carragenina Los
voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6 excepto n=5 para el lote Bb1 a las 5 y 7 h) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En este caso entre las 3 y las 5 h una rata del lote tratado con Bb murioacute por lo que a
las 5 y 7 h el valor de n fue igual a 5 Como puede verse en la Tabla 38 Bb mostroacute
porcentajes de inhibicioacuten significativos a las 3 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina los
cuales no se diferenciaron estadiacutesticamente de los de bromelina asiacute como tampoco de los
de indometacina a las 5 y 7 h A la h post inyeccioacuten de carragenina ninguno de los
compuestos ensayados mostroacute porcentajes de inhibicioacuten significativos
341131 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb
En otro experimento (Tabla 39) se probaron dos dosis de Bb2 100 y 200 mgkg
equivalentes aproximadamente a 15 y 30 UCaskg respectivamente asiacute como 200 mgkg
de Bb2 tratado con E-64 (Bb2E-64)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
62
La dosis de 200 mgkg de Bb2 fue antiinflamatoria soacutelo a las 7 h post inyeccioacuten de
carragenina mostrando un porcentaje de inhibicioacuten significativamente similar al de
diclofenac soacutedico (50 mgkg) La misma dosis de Bb tratada con E-64 (Bb2E-64) no mostroacute
efecto antiinflamatorio aunque no se detectaron diferencias significativas entre los
porcentajes de inhibicioacuten de Bb2 y Bb2E-64 Las dosis de 100 mgkg de Bb2 y E-64 (025
μmolkg) no mostraron efecto significativo en ninguacuten tiempo de medida
Tabla 39 Efecto de diferentes dosis de Bb y BbE-64 sobre el edema de pata generado por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n = 6 excepto n=5 para el lote Bb2E-64 a partir de las 5 h) Test de Tukey plt 005 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Al comparar los resultados de la Tabla 39 con los de la Tabla 38 puede observarse
que si bien el efecto antiinflamatorio se sigue manifestando en la fase tardiacutea propuesta para
este modelo la dosis de 200 mgkg (33 plusmn 6 UCaskg) de Bb2 fue menos efectiva que la de
120 mgkg (19 plusmn 1 UCaskg) de Bb1 lo cual no seriacutea lo esperado si tenemos en cuenta la
actividad proteoliacutetica de ambas Sin embargo el tratamiento con el inhibidor E-64 produjo
una peacuterdida del efecto antiinflamatorio de Bb2 concordante con la hipoacutetesis de que la
actividad de las proteasas presentes en Bb es la causante de tal efecto Una caracteriacutestica
comuacuten de los valores de las Tablas 38 y 39 es la alta dispersioacuten de los voluacutemenes medidos
para los lotes tratados con Bb hecho que no se observa en los valores de los lotes
controles asiacute como tampoco en lotes tratados con diclofenac soacutedico e indometacina
Por otro lado es necesario mencionar que otros ensayos con Bb presentaron cierta
dificultad en relacioacuten a una posible toxicidad En un ensayo el 50 de los animales que
recibieron una dosis de Bb (Bb3 Tabla 32) equivalente a 35 UCaskg murieron entre las 3 y
las 6 h post inyeccioacuten de carragenina En otro ensayo en que se probaron dosis
equivalentes a 10 20 y 30 UCaskg varios animales de los tres lotes tratados mostraron
signos tiacutepicos de toxicidad (pasividad motora alteracioacuten respiratoria ereccioacuten pilomotora y
extremidades cianoacuteticas) a partir de la primera hora post inyeccioacuten de carragenina y entre
las 4 y 5 h murieron Por lo expuesto no deberiacutea descartarse la posibilidad de que Bb
Tiempo
(h)
Control
Bb2
100 mgkg
16plusmn3 UCaskg
Bb2
200 mgkg
33plusmn6 UCaskg
Bb2E-64
200 mgkg
05plusmn01 UCaskg
E-64
025 μmolkg
Diclofenac soacutedico
50 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 033plusmn003 028plusmn004 15c 033plusmn008 0c 043plusmn005 -30c 031plusmn007 6c 024plusmn003 27c
3 07plusmn01 09plusmn02 -19c 05plusmn01 32c 09plusmn01 -32c 06plusmn02 14c 035plusmn005 52c
5 14plusmn01 11plusmn03 24bc 08plusmn03 48bc 11plusmn02 23bc 09plusmn02 34bc 044plusmn007 69b
7 15plusmn01 11plusmn02 30bc 08plusmn02 48b 099plusmn007 35bc 10plusmn02 33bc 073plusmn008 52b
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
63
presente cierta toxicidad a las dosis ensayadas hecho que deberaacute comprobarse mediante
futuros ensayos de toxicidad
Sin dejar de lado las dificultades sentildealadas de los resultados obtenidos se puede
concluir que Bb muestra efecto antiinflamatorio significativo soacutelo sobre la fase tardiacutea del
modelo de edema de pata (Di Rosa et al 1971 Salvemini et al 1996) mostrando menores
porcentajes de inhibicioacuten que dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica de Bh Pm y
bromelina Ademaacutes el efecto antiinflamatorio de Bb podriacutea estar relacionado con la actividad
proteoliacutetica de sus cisteiacutenendopeptidasas
3412 Otros modelos de inflamacioacuten aguda
Como ya se ha mencionado la primera fase (0-1 h) del desarrollo de edema de pata
inducido por carragenina es mediada principalmente por histamina y serotonina (Di Rosa et
al 1971 Salvemini et al 1996) Para corroborar si el efecto inhibitorio de edema observado
en la primera h para Bh Pm y bromelina se debiacutea a un efecto inhibitorio sobre alguno de
estos mediadores se evaluaron las dosis efectivas de dichos preparados a esa h en los
modelos de edema de pata inducidos por histamina y por serotonina
34121 Edema de pata inducido por histamina en ratas
En la Tabla 310 se consignan los voluacutemenes de edema y los respectivos porcentajes
de inhibicioacuten de edema a los 15 30 y 60 min post inyeccioacuten de histamina Se evaluaron
dosis de Bh Pm y bromelina cuyos contenidos en UCas fueran equivalentes a las de las
dosis que en el modelo de edema inducido por carragenina fueron efectivas en la primera
hora esto es 200 mgkg de Bh2 (equivalente a 35 plusmn 8 UCaskg) 170 mgkg de Pm2
(equivalente a 32 plusmn 2 UCaskg) y 55 mgkg de bromelina (equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg)
Tiempo
(min)
Control
Bh2
200 mgkg
35plusmn8 UCaskg
Pm2
170 mgkg
32plusmn2 UCaskg
Bromelina
55 mgkg
35plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
15 039plusmn003 046plusmn003 -18c 038plusmn003 25c 045plusmn002 -15c
30 034plusmn003 041plusmn003 -21c 034plusmn003 0c 044plusmn003 -30c
60 032plusmn003 033plusmn004 -3c 031plusmn003 3c 042plusmn004 -31c
Tabla 310 Efecto de Bh Pm y bromelina sobre el edema inducido histamina Los voluacutemenes de edema son
expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
64
Puede observarse que ninguno de los compuestos probados fue efectivo a las dosis
probadas Por tanto es liacutecito suponer que los efectos antiinflamatorios medidos para Bh Pm
y bromelina en la primera hora post inyeccioacuten de carragenina no se deben a la inhibicioacuten de
la accioacuten de la histamina
La bibliografiacutea en relacioacuten al efecto de la bromelina sobre la inflamacioacuten mediada por
histamina es escasa Seguacuten Kumakura et al (1988) dosis crecientes de bromelina
administradas intravenosamente aumentaban el exudado plasmaacutetico inducido por histamina
a los 30 min en el modelo de ldquobolsa de airerdquo en ratas
34122 Edema de pata inducido por serotonina en ratas
341221 Bromelia hieronymi
En la Tabla 311 se exponen los voluacutemenes de edema y los porcentajes de inhibicioacuten
de edema a los 30 60 y 120 min post inyeccioacuten de serotonina para 100 y 200 mgkg de Bh2
(equivalentes a 17 plusmn 4 y 35 plusmn 8 UCaskg respectivamente) y para 55 mgkg de bromelina
(equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg)
Tiempo
(min)
Control
Bh2
100 mgkg
17plusmn4 UCaskg
Bh2
200 mgkg
35plusmn8 UCaskg
Bromelina
55 mgKg
35plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
30 122plusmn005 118plusmn005 33c 08plusmn01 37a 060plusmn009 51a
60 109plusmn004 116plusmn005 -6c 08plusmn01 28a
063plusmn008 42a
120 083plusmn004 070plusmn003 16ac 066plusmn007 20ac 057plusmn007 31a
Tabla 311 Efecto de Bh2 y bromelina sobre el edema inducido por serotonina Los voluacutemenes de edema son
expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
El efecto medido para bromelina es concordante con el reportado por Netti et al
(1972) quienes midieron un porcentaje de inhibicioacuten de asymp 40 a los 60 min post inyeccioacuten
de serotonina en ratas que recibieron por viacutea oral bromelina (100 mganimal) 4 h previas a la
inyeccioacuten de serotonina
Bh exhibioacute porcentajes de inhibicioacuten significativos a los 30 y 60 min soacutelo con la dosis
de 200 mgkg Si bien dichos valores fueron inferiores a los de la bromelina no fueron
significativamente diferentes Estos resultados estariacutean indicando que la inhibicioacuten que
ejercen Bh y bromelina sobre el edema inducido por carragenina estariacutea al menos en parte
mediada por un efecto inhibidor de la accioacuten de la serotonina
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
65
341222 Pseudananas macrodontes
En la Tabla 312 se muestra el efecto de una dosis de Pm2 (170 mgkg) equivalente
a 32 plusmn 2 UCaskg sobre el edema de pata inducido por serotonina Pm mostroacute un porcentaje
de inhibicioacuten significativo soacutelo a los 30 min Por lo tanto asiacute como en el caso de Bh y
bromelina parte del efecto antiinflamatorio evaluado a la hora post inyeccioacuten de carragenina
se podriacutea deber a un efecto inhibitorio sobre la accioacuten de la serotonina
Tiempo
(min)
Control
Pm2
170 mgkg
32plusmn2 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
30 105plusmn007 08plusmn01 29a 052plusmn003 50a
60 087plusmn007 07plusmn01 22ca 050plusmn004 42a
120 067plusmn006 06plusmn01 20c 046plusmn004 31c
Tabla 312 Efecto de Pm2 sobre el edema inducido por serotonina Los voluacutemenes de edema son expresados
como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
342 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma
Como primera aproximacioacuten en el modelo de inflamacioacuten croacutenica se probaron las
dosis de los preparados que mostraron efecto antiinflamatorio sobre el edema de pata
inducido por carragenina
Como control positivo se utilizoacute dexametasona la cual posee entre otros efectos
adversos tiacutepicos de los glucocorticoides efectos inmunosupresor y cataboacutelico Con el
objetivo de comparar dichos efectos con los de los preparados proteoliacuteticos se calcularon
como una medida del efecto inmunosupresor los porcentajes de reduccioacuten de las masas del
timo y del bazo (Ben Rhouma amp Sakly 1994 Hori et al 1996) mientras que el efecto
cataboacutelico fue medido calculando la peacuterdida de masa corporal (se pesaron los animales
antes y despueacutes del tratamiento y la diferencia de peso corporal fue comparada con los
controles)
3421 Bromelia hieronymi
En la Tabla 313 se exponen los resultados obtenidos para 90 y 180 mgkg de Bh3
(equivalentes a 17 plusmn 3 y 34 plusmn 5 UCaskg respectivamente) 55 mgkg de bromelina
(equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg) y dexametasona (3 mgkg) en el test del granuloma inducido
por pellet de algodoacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
66
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 054plusmn006 043plusmn002 078plusmn009
Bh3
(90 mgkg- 17plusmn3 UCaskg)
047plusmn002 13c 035plusmn002 18bc 09plusmn01 -9c
Bh3
(180 mgkg- 34plusmn5 UCaskg)
032plusmn001 41b 031plusmn002 28b 07plusmn01 7c
Bromelina
(55 mgkg- 35plusmn3 UCaskg )
036plusmn005 34b 031plusmn002 28b 077plusmn008 1c
Dexametasona (3 mgkg) 024plusmn001 55a 011plusmn002 74a 040plusmn004 49b
Tabla 313 Efecto de Bh3 bromelina y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de
algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
La dosis de 180 mgkg de Bh bromelina (55 mgkg) y dexametasona (3 mgkg)
resultaron antiinflamatorias Bh (180 mgkg) y bromelina mostraron porcentajes de inhibicioacuten
de granuloma significativamente similares pero ambos fueron significativamente inferiores al
de dexametasona En relacioacuten al efecto inmunosupresor mientras dexametasona causoacute
significativa reduccioacuten del peso de bazos y timos Bh (180 mgkg) y bromelina soacutelo redujeron
el peso de los timos mostrando porcentajes iguales (28) aunque significativamente
inferiores al de dexametasona (74) Por otra parte la dosis de 90 mgkg de Bh no fue
antiinflamatoria pero tampoco redujo los pesos de los bazos y los timos
En la Figura 31 se muestran los cambios de peso corporal
Figura 31 Efecto de Bh3 bromelina (Bro) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas
tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
-20
-10
0
10
20
30
b
b
a
cControl
Bh3 (173 UCaskg)
Bh3 (345 UCaskg)
Bro (353 UCaskg)
Dex (3 mgkg)
c
Ca
mb
io d
e p
es
o c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
67
Bh (180 mgkg) y bromelina no provocaron peacuterdida de masa corporal aun cuando la
ganancia en masa corporal (14 y 13 g respectivamente) fuera significativamente maacutes baja
que la del lote control (22 g) En cambio dexametasona provocoacute una significativa peacuterdida de
masa corporal (-14 g) respecto al control El lote tratado con la dosis de 90 mgkg de Bh no
mostroacute cambios respecto al lote control
Por lo tanto si bien Bh (180 mgkg) y bromelina (55 mgkg) fueron menos efectivas
que dexametasona (3 mgkg) para inhibir la formacioacuten del granuloma tambieacuten mostraron
menos efectos sobre bazos timos y masa corporal
Debido a la similitud en el contenido de UCas (asymp35 UCaskg) de las dosis de Bh (180
mgkg) y de bromelina (55 mgkg) que mostraron similares efectos en el test del granuloma
se proboacute si dichos efectos dependiacutean de la accioacuten de proteasas cisteiacutenicas
34211 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina en el test del
granuloma
A fin de determinar si la actividad proteoliacutetica de Bh y bromelina es causa de la
accioacuten antiinflamatoria evaluada en el test del granuloma se ensayaron Bh y bromelina con
y sin actividad proteoliacutetica (luego de inhibir con E-64) Los resultados se muestran en la
Tabla 314
Tabla 314 Efecto de Bh5 y bromelina con actividad proteoliacutetica y sin actividad proteoliacutetica (Bh5E-64 y bromelinaE-64) E-64 y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En el caso de bromelina puede observarse que al inhibir sus cisteiacutenendopeptidasas
con E-64 pierde su efecto antiinflamatorio el porcentaje de inhibicioacuten cambia de 24 a -8
dejando de ser significativo Lo mismo sucede con el efecto reductor sobre el peso de los
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Control 036 plusmn 002 043 plusmn 003 053 plusmn 008
Bromelina
(55 mgkg- 35plusmn3 UCaskg )
0272 plusmn 0006 24a 033 plusmn 002 23a 08 plusmn 02 -42c
BromelinaE-64
(55 mgkg- 2plusmn3 UCaskg)
039 plusmn 004 -8c 046 plusmn 003 -7c
065 plusmn 009 -23c
Bh5
(180 mgkg- 36plusmn4 UCaskg)
039 plusmn 001 -8c 042 plusmn 001 2c
082 plusmn 02 -55c
Bh5E-64
(180 mgkg- 1plusmn2 UCaskg)
040 plusmn 003 -11c 040 plusmn 002 7ca
06 plusmn 01 -19c
E-64
(03 μmolkg)
039 plusmn 004 -8c 0421 plusmn 0009 2c
06 plusmn 01 -15c
Dexametasona (3 mgkg) 0230 plusmn 0006 36a 0042 plusmn 0003 90b 033 plusmn 008 38c
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
68
timos el porcentaje de reduccioacuten para bromelina es de 23 mientras que para
bromelinaE-64 es de -7 Por tanto las cisteiacutenendopeptidasas no soacutelo estariacutean actuando
como antiinflamatorias sino tambieacuten ejerciendo un leve efecto reductor sobre el peso de los
timos En este ensayo el porcentaje de reduccioacuten del peso de los timos provocado por
bromelina fue aproximadamente 14 del de dexametasona mientras que los porcentajes de
inhibicioacuten del granuloma de ambas fueron significativamente similares E-64 (03 μmolkg) no
tuvo efecto sobre los granulomas asiacute como tampoco sobre los pesos de los timos y los
bazos
Los resultados obtenidos para Bh no permiten sacar ninguna conclusioacuten respecto al
rol que tendriacutean sus cisteiacutenendopeptidasas como antiinflamatorias puesto que a diferencia
de los datos consignados en la Tabla 313 Bh no tuvo efecto inhibidor significativo de los
granulomas asiacute como tampoco efecto reductor de los timos ademaacutes de no encontrarse
diferencia significativa entre Bh y BhE-64 Los efectos de Bh y BhE-64 fueron ensayados
una vez maacutes pero no pudieron extraerse resultados concluyentes Una posible explicacioacuten a
la dificultad en la reproducibilidad de los resultados para Bh probablemente obedezca a la
poca sensibilidad que el test de granuloma inducido por algodoacuten tiene especialmente para
antiinflamatorios no esteroideos (Bailey et al 1982)
En relacioacuten al efecto sobre el peso corporal no se observaron diferencias
significativas respecto al control para bromelina y para bromelina inhibida con E-64 El E-64
produjo una ganancia de masa corporal significativamente mayor que la de los controles
Pero ninguno de los compuestos probados a excepcioacuten de dexametasona produjeron
peacuterdida de masa corporal (Figura 32)
Figura 32 Efecto de Bh5 bromelina (Bro) y Bh5 y bromelina inhibidas con E-64 (Bh5E-64 y BroE-64
respectivamente) E-64 y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas tratadas durante el ensayo del test del granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
-20
-10
0
10
20
30
Control
Dex (3 mgkg)
Bh5 (364 UCaskg)Bh5E-64(12 UCaskg)
Bro (353 UCaskg)
BroE-64(23 UCaskg)
E-64 (03 molkg)c
cd
a
b b
d
c
Cam
bio
de p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
69
3422 Pseudananas macrodontes y Bromelia balansae
En un mismo ensayo se probaron dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica (asymp30
UCaskg) de Pm y Bb cuyos efectos fueron comparados con los de bromelina (50 mgkg
equivalente a asymp30 UCaskg) y dexametasona (3 mgkg) Como en todos los ensayos los
lotes estuvieron conformados por 6 animales excepto en el caso de Pm donde los datos
provienen de 4 animales ya que dos de ellos murieron luego de la tercera y cuarta dosis
Puede observarse en la Tabla 315 que Pm y Bb mostraron porcentajes de inhibicioacuten del
granuloma similares a los de bromelina Los porcentajes de reduccioacuten del timo para Pm y Bb
fueron significativamente similares entre siacute y si bien mayores no se diferenciaron
significativamente de los de bromelina
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 054plusmn003 038plusmn003 071plusmn007
Pm3
(130 mgkg- 33plusmn4 UCaskg)
036plusmn002 33ab 020plusmn001 47b 08plusmn01 -8c
Bb 4
(180 mgkg- 31plusmn2 UCaskg)
041plusmn004 24a 021plusmn001 45b 052plusmn007 27cb
Bromelina
(50 mgkg- 32plusmn3 UCaskg)
036plusmn002 33ab 028plusmn002 26b 070plusmn007 1c
Dexametasona (3 mgkg) 024plusmn001 56b 010plusmn002 74a 036plusmn004 49b
Tabla 315 Efecto de Pm3 Bb4 bromelina y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y
sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n = 6 excepto para Pm n=4) Test de Tukey p lt 005 p lt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Los porcentajes de reduccioacuten de los timos de los preparados proteoliacuteticos fueron
significativamente menores al de dexametasona y a diferencia de eacutesta no mostraron efecto
reductor significativo sobre el peso de los bazos
En la Figura 33 pueden observarse los cambios en los pesos corporales de los
animales tratados Si bien los animales de los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos
no aumentaron de peso en la misma cantidad que los del lote control no padecieron peacuterdida
de masa corporal como siacute ocurrioacute con los del lote tratado con dexametasona
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
70
Figura 33 Efecto de Pm Bb bromelina (Bro) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas
tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6 excepto para Pm n=4) Test de Tukey p lt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Los efectos de Pm y Bb sobre los distintos paraacutemetros evaluados en este modelo
fueron similares a los de Bh3 (Tabla 313) Sin embargo la muerte de dos animales del lote
tratado con Pm podriacutea estar indicando un efecto toacutexico del preparado
34221 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb en el test del granuloma
En la Tabla 316 se exponen los resultados obtenidos para 180 mgkg de Bb2
equivalente a 30 UCaskg y para 180 mgkg de Bb2 tratada con E-64 (Bb2E-64) Puede
observarse que Bb no mostroacute efecto inhibidor significativo sobre los granulomas y su
porcentaje de inhibicioacuten no se diferencioacute significativamente del de BbE-64 Tampoco se
observaron efectos significativos de Bb y BbE-64 sobre el peso de los timos
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 050plusmn003 036plusmn002 068plusmn003
Bb 2 (180 mgkg
30plusmn5 UCaskg)
052plusmn008 -4c 036plusmn003 0c 098plusmn005 -44a
Bb2E-64 (180 mgkg
006plusmn001 UCaskg)
039plusmn005 22c 028plusmn003 22c 095plusmn008 -40a
Dexametasona (3 mgkg) 0230plusmn0005 54a 0050plusmn0004 86a 034plusmn001 50b
Tabla 316 Efecto de Bb2 con actividad proteoliacutetica y sin actividad proteoliacutetica (Bb2E-64) y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey p lt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
-20
-10
0
10
20
30
ab
b
a
d
Control
Pm3 (334 UCaskg)
Bb4 (312 UCaskg)
Bro (323 UCaskg)Dex (3 mgkg)
c
Ca
mb
io d
e p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
71
A diferencia de lo observado para los preparados en los anteriores ensayos del test
del granuloma los bazos aumentaron significativamente de peso Este efecto fue
independiente de la actividad proteoliacutetica de Bb
En la Figura 34 se muestran los efectos de Bb y BbE-64 sobre los pesos corporales
de los animales Si bien los animales del lote tratado con Bb proteoliacuteticamente activo no
aumentaron de peso en la misma cantidad que los del lote control no mostraron peacuterdida de
masa corporal como siacute ocurrioacute con los del lote tratado con dexametasona
Siendo que la dosis de Bb2 tiene el mismo contenido de UCas (30) que la dosis de
Bb4 que siacute mostroacute efecto antiinflamatorio (Tabla 315) pudo existir alguacuten otro factor que no
se ha controlado y afectoacute a las medidas conduciendo a los resultados contradictorios de las
Tablas 315 y 316 Como se mencionoacute anteriormente la falta de reproducibilidad podriacutea
deberse a la baja sensibilidad del test del granuloma para compuestos no esteroideos
(Bailey et al 1982) Por otro lado Bb2 es el mismo preparado que mostroacute bajo porcentaje
de inhibicioacuten en el modelo de edema de pata inducido por carragenina (Tabla 39) El
aumento en el tamantildeo de los bazos podriacutea estar relacionado con el posible efecto toacutexico que
ha sido detectado en algunos de los ensayos en que se proboacute Bb y que podriacutea enmascarar
su accioacuten antiinflamatoria
Figura 34 Efecto de Bb y Bb inhibida con E-64 (BbE-64) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de
las ratas tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
34222 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm en el test del granuloma
Debido a que la dosis de 30 UCaskg de Pm pareciacutea mostrar cierta toxicidad
(ademaacutes del ensayo cuyos resultados se exponen en Tabla 315 en otro ensayo tambieacuten
murioacute 13 de los animales) se decidioacute bajar la dosis a 13 (equivalente a 10 UCaskg) Al
igual que para Bh y bromelina se ensayoacute el efecto que tiene la inhibicioacuten de las
cisteiacutenendopeptidasas presentes en Pm sobre su efecto antiinflamatorio en el test del
granuloma En la Tabla 317 se muestran los resultados obtenidos para 90 mgkg de Pm4
90 mgkg de Pm4 inhibido con E-64 (Pm4E-64) y dexametasona (3 mgkg)
-20
-10
0
10
20Control
Dex (3 mgKg)
Bb2 (305 UCaskg)
Bb2E-64 (006001 UCaskg)
a
bcb
c
Ca
mb
io d
e p
eso
co
rpo
ral (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Tabla 317 Efecto de Pm4 con y sin actividad proteoliacutetica (Pm4E-64) y dexametasona sobre el granuloma
inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Las dosis ensayadas de Pm en esta oportunidad no provocaron la muerte de los
animales tratados Si bien los porcentajes de inhibicioacuten de granuloma de Pm y de PmE-64
no se diferenciaron significativamente entre siacute el porcentaje de Pm fue estadiacutesticamente
significativo pero no asiacute el de PmE-64 lo cual estariacutea indicando que las
cisteiacutenendopeptidasas de Pm tendriacutean un rol antiinflamatorio en este modelo PmE-64 no
mostroacute actividad fibrinoliacutetica en el ensayo de la placa de fibrina6
De igual modo que para bromelina al inhibir las proteasas de Pm con E-64 no soacutelo
se pierde el efecto antiinflamatorio sino tambieacuten el efecto reductor sobre el peso de los
timos Si bien los porcentajes de reduccioacuten del peso de los timos de Pm y de PmE-64 no se
diferencian significativamente el porcentaje de reduccioacuten respecto al control de Pm es
significativo mientras que el de PmE-64 no
Por otro lado Pm y PmE-64 no redujeron significativamente los pesos de los bazos
al igual que todos los preparados proteoliacuteticos ensayados previamente
En la Figura 35 se observa que Pm y PmE-64 no afectaron significativamente la
ganancia de masa corporal de los animales tratados respecto a los del lote control
Figura 35 Efecto de Pm4 Pm4 inhibida con E-64 (PmE-64) y dexametasona (Dex) sobre los pesos
corporales de las ratas tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Control 050plusmn003 0 36plusmn002 068plusmn003
Pm4 (90 mgkg
11plusmn1 UCaskg)
037plusmn002 26a 026plusmn002 28b 08plusmn01 -23c
Pm4E-64 (90 mgkg
02plusmn01 UCaskg)
0417plusmn0009 17ac 031plusmn003 14cb 062plusmn007 9c
Dexametasona (3 mgkg) 0230plusmn0005 54b 005plusmn0004 86a 034plusmn001 50b
-20
-10
0
10
20
30Control
Dex (3 mgKg)
Pm4 (111 UCaskg)
Pm4E-64 (0201 UCaskg)
a
cc
c
Cam
bio
de p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
73
Pm4 mostroacute efectos similares a los de bromelina con una dosis que contuvo 3 veces
menos UCas que la dosis de bromelina usada como referencia (50-55 mgkg equivalente a
30-35 UCaskg) Para verificar si bromelina alcanza su efecto maacuteximo con una dosis de 10
UCaskg se evaluoacute la accioacuten antiinflamatoria de dosis equivalentes a 11 plusmn 1 31 plusmn 3 y 94 plusmn 9
UCaskg Simultaacuteneamente se midieron los porcentajes de reduccioacuten de los pesos de los
timos y los bazos y se registroacute la ganancia de peso corporal Los resultados se muestran en
la Figura 36 excepto los porcentajes de reduccioacuten de los pesos de los bazos y los cambios
de peso corporal ya que no fueron estadiacutesticamente significativos para ninguna de las
dosis
Figura 36 Porcentajes de inhibicioacuten de granuloma y porcentajes de reduccioacuten de timos para 17 50 y 150 mgkg
de bromelina equivalentes a 11 31 y 94 UCaskg mp masa del granuloma o timo del animal tratado con el preparado mc masa del granuloma o timo del animal del lote control Test de Dunnettt p lt 005 p lt 001 p lt 0001 Media plusmn SEM
Como puede observarse en la figura 36 la dosis de bromelina equivalente a 11 plusmn 1
UCaskg mostroacute un porcentaje de inhibicioacuten de 15 que no resultoacute ser estadiacutesticamente
significativo mientras que la dosis equivalente a 31 plusmn 3 UCaskg mostroacute un porcentaje de
inhibicioacuten similar a los de ensayos anteriores (25-30) Queda de este modo comprobado
que las dosis equivalentes en UCas de Pm4 y bromelina no muestran efectos
antiinflamatorios equivalentes
La UCas es una medida de la actividad hidroliacutetica de la proteasa frente a la caseiacutena
un sustrato con muacuteltiples puntos de corte Igual cantidad de UCas significa igual intensidad
de eficacia proteoliacutetica pero nada indica acerca de la especificidad de la enzima activa
Probablemente la dosis de Pm con igual UCas que la de bromelina tiene maacutes especificidad
hacia los blancos involucrados en el mecanismo de inflamacioacuten que subyacen en el modelo
del granuloma
10 30 900
20
40
60
Granuloma Timo
)x100mm(1 cp
UCaskg
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
74
3423 Posible relacioacuten entre la actividad proteoliacutetica-accioacuten antiinflamatoria-
modulacioacuten sobre poblacioacuten linfocitaria T
En la Figura 36 tambieacuten se puede observar que el aumento en el porcentaje de
inhibicioacuten del granuloma se acompantildea de un aumento en el porcentaje de reduccioacuten del
peso de los timos
Para todos los preparados en que se detectoacute efecto antiinflamatorio significativo
tambieacuten se acompantildeoacute de un efecto significativo sobre el peso de los timos y para Pm y
bromelina ambos dependieron de la actividad proteoliacutetica A modo de resumen en la Figura
37 se muestran graficados los pesos de granulomas en funcioacuten de los pesos de los timos
de los animales tratados con los preparados asiacute como con dexametasona (3 mgkg) a lo
largo del presente trabajo
Figura 37 Relacioacuten peso del granuloma - peso del timo para todos los preparados ensayados Los valores fueron calculados dividiendo el peso promedio del granuloma o timo del lote tratado por el peso promedio del granuloma o timo respectivamente del lote control y expresados como la media plusmn SEM Unidades arbitrarias (ua) Las liacuteneas de puntos representan el liacutemite por debajo del cual los valores se diferencian estadiacutesticamente de los controles (ANOVA Tukey plt005)
Puede observarse maacutes claramente que soacutelo los preparados que redujeron
significativamente el peso de los granulomas (valores por debajo de la liacutenea de puntos
horizontal) disminuyeron significativamente el peso de los timos (valores a la izquierda de la
liacutenea de puntos vertical)
Bromelia balansae (Bb)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bb2E-64(006001 UCaskg)
Bb2(305 UCaskg)
Bb4(312 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Pseudananas macrodontes (Pm)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Pm4(111 UCaskg)
Pm4E-64(0201 UCaskg)
Pm3(334 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Bromelina (Bro)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bro(333 UCaskg)
BroE-64(23 UCaskg)
Bro(101 UCaskg)
Bro(949 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Bromelia hieronymi (Bh)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bh5(364 UCaskg)
Bh5E-64(105 UCaskg)
Bh3(173 UCaskg)
Bh3(345 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
75
A partir de dichas observaciones se podriacutea considerar que parte del mecanismo de
accioacuten antiinflamatorio involucrariacutea la accioacuten moduladora sobre la poblacioacuten de linfocitos T
siendo dependiente de la actividad proteoliacutetica para Pm y bromelina
Ademaacutes de los efectos directos de bromelina sobre los linfocitos T ya mencionados
tales como la inhibicioacuten en la transduccioacuten de sentildeales (Mynott et al 1999) y la regulacioacuten en
la activacioacuten mediado por la remocioacuten de moleacuteculas de la superficie celular (Hale et al
2002) en varios modelos animales la accioacuten reguladora sobre la poblacioacuten linfocitaria T ha
sido asociado al efecto antiinflamatorio de la bromelina En un modelo murino de asma
aleacutergica inducida por ovoalbuacutemina la bromelina administrada intraperitonealmente pudo
atenuar el desarrollo de la enfermedad disminuyendo significativamente las ceacutelulas T CD4+
activadas en particular CD4+CD25+ las ceacutelulas T CD8+ y la relacioacuten CD4+CD8+ en el BAL
(Secor et al 2005) Luego se demostroacute in vitro que bromelina cliva proteoliacuteticamente CD25
desde la superficie de los linfocitos T activos (Secor et al 2009) Por su parte Targoni et al
(1999) reportan que una mezcla de enzimas que contiene bromelina inhibe la
encefalomielitis aleacutergica experimental murina un modelo de enfermedad autoinmune
mediada por ceacutelulas T Este efecto se atribuyoacute a la escisioacuten proteoliacutetica de las moleacuteculas
accesorias CD4 CD44 y CD80 que median las interacciones de ceacutelulas T y ceacutelulas
presentadoras de antiacutegenos En una serie de ensayos in vitro e in vivo Engwerda et al
(2001) concluyen que la bromelina puede simultaacuteneamente mejorar e inhibir las respuestas
mediadas por linfocitos T a traveacutes de una accioacuten estimulante sobre las ceacutelulas accesorias y
una accioacuten inhibidora directa sobre las ceacutelulas T
Es sabido que en el timo los progenitores linfoides tiacutemicos maduran y se diferencian
en linfocitos T inmunocompetentes a traveacutes de un proceso complejo mediado por
quimocinas interleucinas moleacuteculas de adhesioacuten factores de crecimiento y
fundamentalmente por la interaccioacuten entre las ceacutelulas del estroma intratiacutemico (ceacutelulas
epiteliales ceacutelulas dendriacuteticas interdigitadas y macroacutefagos) y los linfocitos (Fainboim amp
Geffner 2008) Durante su paso por el timo el precursor pasa por distintos estadiacuteos de
diferenciacioacuten que se reflejan por la expresioacuten de distintas moleacuteculas de superficie entre
ellas CD25 y CD44 las cuales han mostrado ser sensibles a la accioacuten de la bromelina como
ya se ha mencionado Por otro lado los timocitos proliferan activamente durante la
diferenciacioacuten sin embargo mediante el proceso de seleccioacuten tiacutemica soacutelo aproximadamente
un 2 de los timocitos originados en el timo murino son rescatados de la apoptosis y
pueden emigrar a la periferia como linfocitos T maduros (Kanwar et al 2008)
Teniendo en cuenta 1) que la bromelina es capaz de afectar la poblacioacuten linfocitaria
T y que esto seriacutea mediado por su accioacuten proteoliacutetica sobre las moleacuteculas de superficie
celular 2) que se ha postulado para la bromelina la capacidad de modular la relacioacuten entre
ceacutelulas accesorias y linfocitos T 3) que el proceso de maduracioacuten de los timocitos es
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
76
mediado por diferentes moleacuteculas de superficie celular en su interaccioacuten con el estroma
tiacutemico 4) que una intensa proliferacioacuten linfocitaria acompantildea el proceso de diferenciacioacuten y
5) la asociacioacuten entre el efecto antiinflamatorio y efecto reductor del peso del timo medidos
para los preparados en especial la posible dependencia entre dichos efectos y la actividad
proteoliacutetica de Pm y bromelina se podriacutea interpretar que los preparados alterariacutean los
complejos mecanismos de interaccioacuten celular entre las ceacutelulas del estroma tiacutemico y los
timocitos afectando la proliferacioacuten de los linfocitos T y dando lugar a una poblacioacuten
linfocitaria T perifeacuterica deficiente cuali yo cuantitativamente para intervenir en la respuesta
inflamatoria
Sin embargo esta hipoacutetesis es deacutebil dada las escasas evidencias sobre las que se
sustenta Por empezar un cambio en el peso del timo no indica cuaacuteles son los tejidos
afectados por lo que una evaluacioacuten histoloacutegica permitiriacutea determinar si la disminucioacuten del
peso se debe a la reduccioacuten en la poblacioacuten de ceacutelulas linfoideas ademaacutes de identificar
alteraciones en la arquitectura del oacutergano Por otro lado no es claro el rol que tendriacutean los
linfocitos T en la inflamacioacuten que se desarrolla en el modelo del granuloma inducido por el
pellet de algodoacuten Si bien el desarrollo de la inflamacioacuten granulomatosa es en general un
proceso en el que los linfocitos T tendriacutean un rol predominante los granulomas generados
por cuerpo extrantildeo como es el caso del pellet de algodoacuten estaacuten compuestos casi
exclusivamente por macroacutefagos al menos durante las fases de iniciacioacuten y acumulacioacuten (Co
et al 2004) siendo muy escasas las ceacutelulas linfociacuteticas (Ohtani 2013)
Dado el perfil de actividad de muacuteltiples blancos que caracteriza a la bromelina (Muumlller
et al 2012 Chobotova et al 2010) y probablemente a los preparados proteoliacuteticos
ensayados en el presente trabajo es muy posible que los efectos antiinflamatorio y sobre el
peso de los timos sean independientes entre siacute aunque ambos dependientes de la actividad
proteoliacutetica tanto en el caso de Pm como de bromelina
Dado que los mecanismos de accioacuten que subyacen a los efectos medidos no han
sido objeto de estudio del presente trabajo doctoral futuras investigaciones permitiriacutean
profundizar el conocimiento del rol que cumplen las proteasas de bromelina y especialmente
de Pm que hasta entonces no habiacutean sido estudiadas farmacoloacutegicamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
77
35 Conclusiones
Bh Bb Pm y bromelina mostraron efecto antiinflamatorio frente a la inflamacioacuten
aguda (edema de pata de rata inducido por carragenina)
Dosis de Bh Pm y bromelina equivalentes en actividad proteoliacutetica mostraron
porcentajes de inhibicioacuten de edema similares entre siacute y con el de indometacina (10
mgkg) actuando predominantemente sobre la fase tardiacutea (3-7h) propuesta para el
modelo edema de pata inducido por carragenina
Bb actuoacute soacutelo sobre la fase tardiacutea propuesta para el modelo edema de pata de rata
inducido por carragenina mostrando porcentajes de inhibicioacuten de edema inferiores a
los de dosis de Bh Pm y bromelina con equivalente actividad proteoliacutetica
Proteasas cisteiacutenicas de Bb Pm y principalmente de Bh y bromelina seriacutean las
causales del efecto antiinflamatorio sobre la inflamacioacuten aguda (edema de pata de
rata inducido por carragenina) y actuariacutean sobre la fase tardiacutea del modelo (3-7h)
En algunos de los ensayos de edema de pata de rata Bb mostroacute signos de toxicidad
Bh Pm y bromelina mostraron efecto antiinflamatorio frente al modelo de inflamacioacuten
aguda edema de pata de rata inducido por serotonina
A las dosis ensayadas Bh Pm y bromelina no inhibieron el edema de pata de rata
inducido por histamina
Una dosis de Pm con 3 veces menos de actividad proteoliacutetica que una dosis de
bromelina mostraron efectos antiinflamatorios significativamente similares sobre el
modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma inducido por algodoacuten
Los efectos antiinflamatorios de Pm y bromelina en el test del granuloma inducido por
algodoacuten dependeriacutean de la actividad proteoliacutetica de sus proteasas cisteiacutenicas
Los efectos antiinflamatorios de dosis equivalentes a 30 UCaskg de Bh y Bb no
fueron reproducibles en el modelo de inflamacioacuten croacutenica
Los efectos antiinflamatorios medidos para los preparados proteoliacuteticos en el modelo
del test del granuloma inducido por algodoacuten fueron acompantildeados de un significativo
y leve efecto reductor del peso del timo de los animales tratados
Los efectos reductores del peso del timo fueron dependientes de la actividad
proteoliacutetica de las proteasas cisteiacutenicas de Pm y de bromelina
Los efectos antiinflamatorios de los preparados proteoliacuteticos fueron significativamente
menores al de dexametasona (3 mgkg)
A diferencia de la dexametasona ninguno de los preparados redujo
significativamente el peso del bazo como tampoco produjeron peacuterdida de masa
corporal mientras que los porcentajes de reduccioacuten del peso del timo fueron
significativamente menores al de dexametasona
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
78
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ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
82
41 Hemostasia
En los vertebrados la sangre fluye con una presioacuten relativamente elevada por
conductos que conforman un compartimento cerrado Sin embargo frente a una injuria vascular
la peacuterdida de sangre desde dicho compartimento es limitada El conjunto de mecanismos
fisioloacutegicos que mantienen la sangre fluida e impiden su fuga se denomina hemostasia En ella
intervienen la pared de los vasos sanguiacuteneos componentes celulares (plaquetas) y solubles
(factores plasmaacuteticos de la coagulacioacuten) de la sangre el flujo sanguiacuteneo y de manera
indirecta el almohadillado celuloadiposo y conjuntivo que rodeando el aparato vascular lo
protege por fuera (Castillo et al 1994)
Se denomina hemostasia correctora a la que actuacutea evitando la peacuterdida de sangre
cuando una lesioacuten afecta la integridad de la pared vascular y puede dividirse en cuatro fases
1 Vasoconstriccioacuten localizada
2 Formacioacuten de un agregado plaquetario sobre el aacuterea lesionada
3 Coagulacioacuten (formacioacuten de fibrina)
4 Fibrinoacutelisis (degradacioacuten y remodelacioacuten del coaacutegulo de fibrina)
Puesto que parte de los objetivos de esta tesis se refieren al efecto de los preparados
proteoliacuteticos sobre las fases 3 y 4 las fases 1 y 2 soacutelo seraacuten someramente expuestas
411 Vasoconstriccioacuten
Luego de la lesioacuten vascular se produce una vasoconstriccioacuten en el aacuterea afectada que
conduce al enlentecimiento del flujo sanguiacuteneo Esto favorece la interaccioacuten entre las plaquetas
y los factores de la coagulacioacuten con el endotelio iniciando las fases 2 y 3 Inicialmente y durante
los primeros segundos la vasoconstriccioacuten es debida a una estimulacioacuten simpaacutetica en la
musculatura lisa del vaso y es sostenida probablemente por la serotonina la adrenalina y el
tromboxano A2 (TXA2) liberados desde las plaquetas activadas (Castillo et al 1994)
412 Formacioacuten del trombo plaquetario
En condiciones fisioloacutegicas el trombo plaquetario se forma en el aacuterea lesionada y consta
de varias etapas que involucran la adhesioacuten la activacioacuten y la agregacioacuten plaquetaria
Las plaquetas se adhieren a la pared vascular a traveacutes del subendotelio que queda
expuesto por la lesioacuten Las proteiacutenas que median la unioacuten son fundamentalmente el colaacutegeno
subendotelial el factor de von Willebrand (FvW) y la fibronectina mientras que los receptores
plaquetarios involucrados son glicoproteiacutenas de membrana la GPVI las integrinas GPIaIIa
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
83
(α2β1) y GPIIbIIIa (αIIbβ3) y el complejo Ib-V-IX La consecuencia inmediata de la adhesioacuten es la
activacioacuten plaquetaria que se caracteriza por a) cambio de forma discoide a esfeacuterica con
emisioacuten de pseudoacutepodos y b) contraccioacuten dependiente de Ca+2 intracitoplasmaacutetico la cual
determina el proceso de agregacioacuten plaquetaria Durante el proceso de activacioacuten se
desencadenan reacciones metaboacutelicas asiacute como se generan yo liberan agonistas que
amplifican el proceso tales como ADP y TXA2 Algunos agonistas de la activacioacuten plaquetaria
son el colaacutegeno la adrenalina la noradrenalina la serotonina y el PAF (Castillo et al 1994)
El ADP es liberado desde los graacutenulos densos junto a la serotonina al medio
extracelular e induce la activacioacuten de plaquetas por unioacuten a receptores de membrana El TXA2
sintetizado a partir del aacutecido araquidoacutenico (AA) por las viacuteas de la ciclooxigenasa (COX) y la
tromboxano sintetasa es un potente agregante plaquetario y vasoconstrictor El AA es liberado
desde la membrana plaquetaria por la fosfolipasa A2 activada por la unioacuten de agonistas a sus
receptores Otros agonistas desencadenan el metabolismo del fosfatidilinositol conduciendo a
la activacioacuten de proteincinasa C (PKC) que junto a otras cinasas intervienen en varios procesos
de la activacioacuten plaquetaria (Martinuzzo et al 2003)
La agregacioacuten plaquetaria consiste en la unioacuten de plaquetas entre siacute iniciada por la
unioacuten de plaquetas circulantes a las plaquetas ya adheridas al subendotelio Esta unioacuten es
mediada por el FvW y el fibrinoacutegeno el receptor plaquetario es la integrina GPIIbIIIa que es
expresada en la membrana luego de cambios conformacionales dependientes de Ca+2 y
fosforilaciones mediadas por cinasas (Martinuzzo et al 2003) La trombina induce la activacioacuten
y la agregacioacuten plaquetaria provocando la liberacioacuten de ADP y la siacutentesis de TXA2 (Castillo et
al 1994) Una consecuencia de la activacioacuten plaquetaria es la exposicioacuten de fosfoliacutepidos
anioacutenicos en la membrana cruciales para el proceso de coagulacioacuten (Martinuzzo et al 2003)
413 Coagulacioacuten
La coagulacioacuten plasmaacutetica consiste en la transformacioacuten catalizada por la trombina del
fibrinoacutegeno soluble en una red de fibras (fibrina) proceso que intensifica y asegura la
hemostasia temporal iniciada con la vasoconstriccioacuten y desarrollada por las plaquetas Se
produce como resultado de una serie de reacciones en cascada en la que sucesivamente una
proenzima inactiva (zimoacutegeno) es convertida en enzima activa la cual a su vez activa otra
proenzima Los componentes de esta cascada son denominados factores de coagulacioacuten
(Tabla 41) y se clasifican en tres grupos dependientes de la vitamina K sensibles a trombina y
de contacto Los factores dependientes de la vitamina K se caracterizan por poseer un
aminoaacutecido particular el aacutecido γ-carboxiglutaacutemico obtenido por la carboxilacioacuten del aacutecido
glutaacutemico mediada por la vitamina K (Castillo et al 1994)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
84
Factor Nombre sinoacutenimos Peso molecular
(kDa)
Vida media
(h) Grupo
FI Fibrinoacutegeno 340 100-150 T
FII Protrombina 72 50-80 K
FIII Factor tisular (FT)
tromboplastina tisular 44
FIV Calcio
FV Proacelerina 290-400 24 T
FVII Proconvertina 63 6 K
FVIII Factor antihemoliacutetico A 240 12 T
FIX Factor antihemoliacutetico B 554 24 K
FX Factor Stuart 55 25-60 K
FXI Antecedente tromboplastiacutenico
del plasma (PTA) 160 40-80 C
FXII Factor Hageman 90 50-70 C
FXIII Factor estabilizante
de la fibrina 320 150 T
Precalicreiacutena 88 35 C
cininoacutegeno de alto peso
molecular (HMWK)
120 150 C
FvW Factor de von Willebrand 500-20000 24
Tabla 41 Factores de coagulacioacuten Pesos moleculares vida media en plasma y grupo al que pertenecen K
vitamina K-dependientes T trombina sensibles C de contacto
La cascada de coagulacioacuten fue claacutesicamente descripta como dos viacuteas de activacioacuten de
zimoacutegenos que confluiacutean activando el FX y una viacutea comuacuten en la que el FX convertiacutea la
protrombina en trombina y eacutesta el fibrinoacutegeno en fibrina (Figura 41) En este modelo la viacutea
intriacutenseca es desencadenada por contacto del FXII con una superficie cargada negativamente
(por exposicioacuten de un epitelio distinto al vascular) e involucra ademaacutes a los factores FXI FIX
FVIII precalicreiacutena y HMWK La viacutea extriacutenseca desencadenada por la exposicioacuten del FT (por
una lesioacuten tisular) a la circulacioacuten involucra a FVII (Castillo et al 1994) Las plaquetas
activadas intervienen aportando su superficie fosfolipiacutedica (factor plaquetario III) que actuacutea
como catalizador en la etapa final de la viacutea intriacutenseca y en la viacutea comuacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Figura 41 Modelo claacutesico de la cascada de coagulacioacuten La coagulacioacuten se puede iniciar con la liberacioacuten del FT (Viacutea extriacutenseca) yo con el contacto del FXII con una superficie cargada negativamente (Viacutea intriacutenseca) Ambas viacuteas confluyen activando el FX a FXa el que desencadena la viacutea comuacuten que finaliza con la formacioacuten de fibrina Los factores representados como ciacuterculos actuacutean como cofactores para los factores que actuacutean como enzimas (estrellas)
en las reacciones sentildealadas La superficie fosfolipiacutedica es representada como un oacutevalo celeste
Maacutes recientemente se ha propuesto otro modelo de coagulacioacuten en el cual a) el FT es
el principal desencadenante de la coagulacioacuten b) la amplificacioacuten generada por la trombina es
considerada esencial para el desarrollo del coaacutegulo estable y c) existe interdependencia entre
los factores plasmaacuteticos y los elementos celulares (Figura 42) En este modelo la cascada de
coagulacioacuten es vista como un proceso gradual y superpuesto de activaciones proteoliacuteticas en
tres fases inicial de amplificacioacuten y de propagacioacuten en cuyas dos uacuteltimas fases la superficie
celular es fundamental para localizar la formacioacuten del coaacutegulo sobre la superficie dantildeada Las
dos viacuteas claacutesicas se unen a traveacutes del complejo FTFVIIa (viacutea extriacutenseca) el cual es capaz de
activar el factor de la viacutea intriacutenseca FIX (Adams amp Bird 2009)
4131 Fase inicial
La exposicioacuten del FT a la sangre por dantildeo o activacioacuten del endotelio actuacutea como
desencadenante de la coagulacioacuten activando el FVII circulante a FVIIa junto con el cual forma
el complejo tenasa del factor extriacutenseco (FTFVIIa) sobre la superficie fosfolipiacutedica de la
membrana celular Este complejo activa el FX a FXa y el FIX a FIXa (Adams amp Bird 2009) Si el
FXa permanece en la superficie puede unirse al FVa y activar el FII generando cantidades
picomolares de trombina (FIIa) (Martinuzzo et al 2003)
La duracioacuten de esta fase depende de la concentracioacuten del complejo FTFVIIa y del
inhibidor de la viacutea del factor tisular (TFPI) el cual forma un complejo FTFVIIaFXaTFPI capaz
VIacuteA INTRIacuteNSECA
Superficie dantildeada(carga negativa)
FXII
FXIIa
HMWK FXI
FXIa
FIX
FIXa
FX
FXa
FVIIIa
Ca+2
Trauma
Fosfo
liacutepid
os FT
FVIIa
FVII
VIacuteA EXTRIacuteNSECA
Protrombina
Trombina
Fibrinoacutegeno
Fibrina
VIacuteA COMUacuteN
Fosfo
liacutepid
osCa+2
FVa
Calicreiacutena
Precalicreiacutena
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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de limitar la formacioacuten de FXa La expresioacuten del FT tambieacuten puede ser inducido en plaquetas y
monocitos asiacute como en micropartiacuteculas circulantes (MP) derivadas de las ceacutelulas en las que se
expresa (Adams amp Bird 2009)
Resulta importante sentildealar que la fase de contacto de la viacutea intriacutenseca en la que
intervienen el FXII la precalicreiacutena y el HMWK no es requerida para iniciar la cascada si bien
es fundamental para los estudios in vitro de la coagulacioacuten (Furie amp Furie 2008)
4132 Fase de amplificacioacuten
Las pequentildeas cantidades generadas de trombina pueden activar al FV y al FVIII los
cuales actuacutean como cofactores de los complejos protrombinasa (FVaFXa) y tenasa intriacutenseca
(FVIIIaFIXa) formados junto a Ca+2 sobre superficies fosfolipiacutedicas pertenecientes
principalmente a las plaquetas La amplificacioacuten de la coagulacioacuten estaacute dada por el incremento
en la produccioacuten del FXa por parte del complejo tenasa intriacutenseca (entre 50 y 100 veces maacutes
que la generada por el complejo FTFVIIa) y de trombina (Adams amp Bird 2009) El FVIII se
asocia al FvW el que mediante su interaccioacuten con la glicoproteiacutena Ib-V-IX se une a la plaqueta
haciendo maacutes eficiente la activacioacuten del FVIII por la trombina (Martinuzzo et al 2003)
Otro efecto amplificador es la activacioacuten del FXI a FXIa por parte de la trombina en
presencia de Ca+2 y protrombina lo que permite al FXIa localizarse en la superficie plaquetaria y
activar maacutes FIX La trombina activa las plaquetas mediante la unioacuten al PAR-1 (receptor activado
por proteasas) lo que a su vez induce la degranulacioacuten de graacutenulos α la expresioacuten de FVa
sobre la membrana y la activacioacuten de GPIIbIIIa estimulando la agregacioacuten plaquetaria y
activando la superficie plaquetaria al inducir la exposicioacuten de fosfoliacutepidos anioacutenicos
(fosfatidilserina) sobre la misma Las plaquetas activadas por trombina muy probablemente
sean las activadas por colaacutegeno durante la adhesioacuten plaquetaria y tienen una gran afinidad para
unir en su superficie los complejos protrombinasa y tenasa intriacutenseca (Adams amp Bird 2009)
4133 Fase de propagacioacuten
Durante la fase de amplificacioacuten se generan plaquetas activadas capaces de unir los
complejos cataliacuteticos maacutes eficientes para la produccioacuten de trombina la cual a su vez activa a las
plaquetas y a los factores y cofactores que componen esos complejos La fase de propagacioacuten
se basa en el reclutamiento de esas plaquetas activadas en el sitio de injuria El resultado de
estas reacciones es la produccioacuten ldquoexplosivardquo de trombina suficiente como para transformar el
fibrinoacutegeno en fibrina y generar un coaacutegulo estable (Adams amp Bird 2009)
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Figura 42 Modelo de la coagulacioacuten con base celular 1 La coagulacioacuten se inicia sobre la ceacutelula portadora del FT originando pequentildeas cantidades de trombina MP micropartiacuteculas circulantes MB membrana basal del endotelio Plt plaquetas 2 La pequentildea cantidad de trombina generada permite activar cofactores plaquetas y FXI formaacutendose sobre las plaquetas los efectivos complejos tenasa intriacutenseco (FVIIIaFIXa) y protrombinasa (FVaFX) que amplifican las reacciones productoras de trombina PS fosfatidilserina 3 Durante la fase de propagacioacuten la cantidad de trombina requerida para la formacioacuten del coaacutegulo se forma desde la superficie de las plaquetas localizadas en el sitio de injuria (Modificado de Adams amp Bird 2009)
4134 Formacioacuten de la fibrina
Puesto que la fibrina se construye a partir de los cambios estructurales que produce la
trombina sobre el fibrinoacutegeno es conveniente describir brevemente la estructura de este uacuteltimo
El fibrinoacutegeno es una glicoproteiacutena fibrosa de gran tamantildeo (340 kDa) compuesta por un diacutemero
de tres cadenas polipeptiacutedicas Aα Bβ y γ unidas por 29 puentes disulfuro (Figura 43) En
cuanto a su estructura terciaria se pueden identificar una regioacuten nodular central (E) y dos
regiones nodulares finales (D)
Figura 43 Estructura molecular del fibrinoacutegeno humano basado en la estructura cristalograacutefica obtenida por rayos X (Kollman et al 2009) las regiones α-C y sus cadenas conectoras no pueden ser resueltas por cristalografiacutea de rayos
X por lo que se muestran esquemaacuteticamente Los fibrinopeacuteptidos son esquematizados para destacar su interaccioacuten con α-C (Tomado de Guthold amp Cho 2011 y parcialmente modificado)
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La regioacuten E estaacute formada por los extremos amino terminal unidos por puentes disulfuro
de las seis cadenas Las regiones D estaacuten formadas por los extremos globulares carboxilo
terminales de las cadenas Bβ (β-C) y γ (γ-C) los que a su vez estaacuten formados por tres
dominios Los extremos carboxilo terminales de las cadenas Aα (α-C) se extienden desde el
extremo de la moleacutecula e interactuacutean entre siacute y con el centro (Weisel 2005) Los segmentos
centrales de las tres cadenas se enroscan formando una triple α-heacutelice (regioacuten coiled-coil) que
proporciona flexibilidad y estabilidad mecaacutenica a la moleacutecula uniendo las regiones D a la regioacuten
E (Lauricella 2007)
Se han identificado funciones para varias de las regiones del fibrinoacutegeno la regioacuten E
posee sitios de unioacuten de diferentes afinidades para la trombina el extremo carboxilo terminal de
una variante de la cadena γ (γ`) une trombina y FXIII la regioacuten D aporta sitios DD que
contribuyen a la alineacioacuten de los monoacutemeros de fibrina y sitios DA (en γ-C) o DB (en β-C) donde
se insertaraacuten los sitios A y B (regioacuten E) respectivamente de monoacutemeros vecinos (Figura 44)
finalmente el sitio γXL de la cadena γ interviene en el ensamblado de la fibrina y facilita la accioacuten
del FXIII (Lauricella 2007)
Figura 44 Formacioacuten de fibrina Esquemas de la moleacutecula de fibrinoacutegeno y de la formacioacuten de los distintos niveles estructurales de la fibrina (Tabla de la derecha) luego de la accioacuten de la trombina y del FXIIIa (Estructuras de fibrinoacutegeno y fibras parcialmente modificadas de Undas amp Arieumlns 2011)
TROMBINA
TROMBINA
Fibrinopeacuteptidos A
Fibrinopeacuteptidos B
MICROFIBRA
FIBRA
FIBRINA INSOLUBLE
FIBRINOacuteGENO
Monoacutemero de fibrina
NIVEL
POLIMERO
NIVEL
GEL
(Agregados de microfibras)
(Red tridimensional con distintos grados de ramificaciones)
(Presencia de entrecruzamientos)FXIIIa
FIBRINA SOLUBLE
FXIII
TROMBINACa
++
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La trombina cliva cuatro enlaces especiacuteficos Arg-Gly de los extremos amino terminales
de Aα y Bβ en la regioacuten E desde los cuales se liberan los fibrinopeacuteptidos A y B
respectivamente y se exponen nuevos sitios (A y B respectivamente) en las cadenas clivadas
del ahora monoacutemero de fibrina
La polimerizacioacuten ocurre en varias etapas conduciendo a distintos niveles estructurales
La unioacuten entre monoacutemeros por interacciones de sus sitios A y B (regioacuten E) con sitios DA y DB
(regiones D) de otros monoacutemeros asiacute como las interacciones entre regiones D (a traveacutes de los
sitios DD) de monoacutemeros contiguos que contribuyen a la elongacioacuten del poliacutemero da lugar a la
formacioacuten de microfibras (o protofibras) estabilizadas por interacciones E-D (Lauricella 2007)
La liberacioacuten del fibrinopeacuteptido B produce tal cambio conformacional que los dominios α-C se
disocian de la regioacuten E y quedan disponibles para las interacciones intermoleculares que
favorecen la agregacioacuten bilateral de las microfibras dando lugar a fibras maacutes gruesas ademaacutes
de contribuir a la estabilidad y a las propiedades mecaacutenicas del coaacutegulo (Weisel 2007 Zhmurov
et al 2011) A su vez las fibras se asocian generando ramificaciones que conforman una red
tridimensional (fibrina soluble) La red es finalmente estabilizada (fibrina insoluble) por el FXIIIa
una transglutaminasa activada por trombina en presencia de Ca+2 El FXIIIa forma puentes
amida entre un grupo amino de residuos de lisina y un grupo carbonilo de residuos de glutamina
dando lugar a entrecruzamientos en la red que pueden ser entre dos cadenas γ dos Aα o una
γ con una Aα La fibrina estabilizada es maacutes resistente a la fibrinoacutelisis (Lauricella 2007)
4135 Regulacioacuten de la coagulacioacuten
Numerosas proteiacutenas cumplen con la funcioacuten regulatoria de la coagulacioacuten actuando en
los distintos niveles El FT es regulado por el inhibidor de la viacutea del factor tisular (TFPI) el que
es expresado por el endotelio y las plaquetas asiacute como por otras ceacutelulas y circula unido a LDL
TFPI tambieacuten neutraliza la actividad del FXa e inhibe el complejo FTFVIIa
La antitrombina el principal inhibidor de la coagulacioacuten es un inhibidor de
serinoproteasas tales como FXa FXIa FIXa y calicreiacutena y se sintetiza en el endotelio Por
actuar preferencialmente sobre las enzimas libres contribuye a limitar la coagulacioacuten en la
regioacuten de lesioacuten (Adams amp Bird 2009)
El cofactor II de heparina es un inhibidor de trombina que requiere la presencia de
dermataacuten sulfato o heparina para acelerar su reaccioacuten Los FVa y FVIIIa son inactivados por la
proteiacutena C activa (APC) actuando como cofactor la proteiacutena S La activacioacuten de la proteiacutena C es
llevada a cabo por la trombina unida a la trombomodulina del endotelio mientras que la APC es
inhibida por α1-antitripsina (α1-AT) y por α2-macroglobulina (α2-MG) asiacute como por el inhibidor de
proteiacutena C (PCI) La α1-AT inhibe tambieacuten FXIa calicreiacutena y trombina La α2-MG es un inhibidor
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de amplio espectro ya que inhibe la plasmina la tripsina la calicreiacutena y la elastasa entre otras
ademaacutes de trombina El FXa y el FXIa son inhibidos por el inhibidor de proteasas dependiente
de proteiacutena Z (ZPI) una proteiacutena K-dependiente usando como cofactor la proteiacutena Z
(Martinuzzo et al 2003)
El endotelio actuacutea regulando la hemostasia manteniendo las caracteriacutesticas no
trombogeacutenicas de la cara luminal en contacto con la sangre a traveacutes de la siacutentesis de heparaacuten y
dermataacuten sulfato componentes del sistema de la proteiacutena C antiagregantes plaquetarios como
prostaciclina G2 (PGI2) y oacutexido niacutetrico (NO) entre otros Mientras que ante estiacutemulos
trombogeacutenicos se sintetizan factores prohemostaacuteticos (FvW FT FV)
414 Fibrinoacutelisis
La deposicioacuten de fibrina induce el sistema fibrinoliacutetico que de manera controlada
remueve o remodela el coaacutegulo a traveacutes de la fibrinoacutelisis evitando el depoacutesito indeseado de
fibrina El sistema fibrinoliacutetico estaacute compuesto por zimoacutegenos activadores e inhibidores y a
traveacutes de diferentes mecanismos activa el plasminoacutegeno (Plg) a plasmina que actuacutea
proteoliacuteticamente sobre la fibrina La fibrinoacutelisis estaacute regulada por la concentracioacuten de los
activadores de Plg los cuales tienen una lenta difusioacuten a coaacutegulos ya formados por lo que es
importante su presencia durante la formacioacuten de la red de fibrina de manera que queden
incorporados al coaacutegulo Los principales activadores del Plg son el activador tisular del
plasminoacutegeno (t-PA) y el activador de tipo uroquinasa (u-PA) ademaacutes de algunos activadores
exoacutegenos como la estreptoquinasa generada por estreptococos β-hemoliacuteticos (Martinuzzo et
al 2003)
El t-PA es sintetizado en el endotelio y liberado en respuesta a trombina histamina
bradicinina interleucinas estreacutes y eacutestasis venoso (Martinuzzo et al 2003) entre otros La baja
afinidad del t-PA circulante por el Plg aumenta en presencia de fibrina que es capaz de fijarlo
al igual que al Plg sobre su estructura Asiacute la fibrina promueve la formacioacuten de plasmina sobre
su superficie favoreciendo una lisis local y no una generalizada
El u-PA es secretado por ceacutelulas endoteliales renales y tumorales Se sintetiza en forma
de simple cadena (scu-PA) conocida como prouroquinasa (activa el Plg sobre la fibrina) que
puede ser activada a su forma de doble cadena (tcu-PA) por accioacuten de la plasmina o por los
factores de la fase de contacto (precalicreiacutena HMWK FXII) siendo capaz de actuar sobre el Plg
en fase fluida (Martinuzzo et al 2003)
La plasmina degrada la fibrina (estabilizada por el FXIIIa) liberando fragmentos de
distintos pesos moleculares que en su mayoriacutea incluyen al diacutemero DD (contiene las regiones D
de monoacutemeros contiguos unidos covalentemente) La accioacuten de la plasmina sobre el fibrinoacutegeno
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produce fragmentos X Y D y E similares a los que genera al actuar sobre la fibrina no
estabilizada salvo por la ausencia de los fibrinopeacuteptidos A y B (Figura 45)
Figura 45 Productos de degradacioacuten del fibrinoacutegeno y de la fibrina Las flechas rojas indican puntos de corte de la
plasmina las barras negras representan los entrecruzamientos en la fibrina formados por el FXIIIa (Estructuras de
fibrinoacutegeno y fibrina parcialmente modificadas de Undas amp Arieumlns 2011)
La plasmina tambieacuten es capaz de degradar otras proteiacutenas plasmaacuteticas como el FII el
FV el FVIII cininas componentes del complemento asiacute como tambieacuten activar metaloproteasas
que intervienen en la degradacioacuten de la matriz extracelular Por esto es importante la regulacioacuten
de la fibrinoacutelisis que se da tanto a nivel de la plasmina como de los activadores del Plg
(Martinuzzo et al 2003)
La plasmina circulante es inhibida por unioacuten de la α2-antiplasmina (α2-AP) que no soacutelo
afecta el sitio activo sino tambieacuten los sitios de unioacuten a la fibrina Los inhibidores de los
activadores de Plg (PAI) se encuentran en altas concentraciones en sangre y actuacutean formando
complejos covalentes ya sea con el t-PA como con el u-PA
Por su parte la trombina inhibe la fibrinoacutelisis mediante la activacioacuten del inhibidor de la
fibrinoacutelisis activable por trombina (TAFI) El TAFIa remueve residuos Lys de la fibrina
eliminando los sitios de unioacuten al Plg requeridos para la activacioacuten por el t-PA (Adams amp Bird
2009)
42 Trombosis (Korin 2003)
La trombosis es la presencia intravascular de material fibrino-plaquetario con variable
contenido de hematiacutees y leucocitos y puede ser una respuesta fisioloacutegica (trombo hemostaacutetico)
Fibrinoacutegeno
Fragmento X
Fragmento DFragmento Y
Fragmento D Fragmento E
Fragmento (DD)EFragmento (DD)
Fragmento DYYD
Fibrina estabilizada
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92
tal como ya ha sido descripto o ser la consecuencia de una activacioacuten patoloacutegica e inapropiada
del sistema de coagulacioacuten
El trombo patoloacutegico puede ser parcial o totalmente oclusivo hecho que puede llevar a
una isquemia de grado variable y consecuente peacuterdida de la funcioacuten vital del oacutergano ademaacutes
de la posibilidad de embolizacioacuten distal y la consecuente embolia pulmonar Seguacuten donde se
asienten los trombos se dividen en venosos arteriales cardiacuteacos y de microcirculacioacuten
La trombosis venosa se caracteriza por la presencia de trombos compuestos
principalmente por hematiacutees y fibrina (trombos rojos) Los factores desencadenantes maacutes
importantes son la disminucioacuten de la velocidad del flujo sanguiacuteneo (anestesias incapacidad
motora aumento de viscosidad sanguiacutenea etc) y cambios en los sistemas de coagulacioacuten y
fibrinoacutelisis (descenso de inhibidores aumento en la concentracioacuten de factores hipofuncioacuten
fibrinoliacutetica etc) Asiacute actuacutean como factores de riesgo los estados post-operatorios las
neoplasias las plejiacuteas los estados trombofiacutelicos y la edad creciente Cuando la trombosis se
localiza en el sistema venoso profundo suele estar asociada con el riesgo de embolia pulmonar
y constituyen los polos cliacutenicos del tromboembolismo venoso (TEV)
El TEV es tratado y prevenido con anticoagulacioacuten (heparinas no fraccionadas
heparinas de bajo peso molecular o dicumariacutenicos) Casos de TEV severos requieren de un
tratamiento tromboliacutetico
La trombosis arterial se produce en zonas de alta velocidad de flujo sanguiacuteneo y los
trombos se componen fundamentalmente de agregado plaquetario y fibrina y en menor
medida de hematiacutees y leucocitos (trombos blancos) Es consecuencia de alteraciones en la
pared vascular (placas ateromatosas) y puede conducir a accidentes cerebrovasculares y
sindromes coronarios agudos entre otras complicaciones
Los factores que pueden desencadenar la trombosis arterial son un endotelio
disfuncional alteraciones en el flujo sanguiacuteneo y la activacioacuten del sistema de coagulacioacuten
mediado por la exposicioacuten del FT Paralelamente se produce reclutamiento activacioacuten y
agregacioacuten plaquetaria asiacute como la activacioacuten del sistema fibrinoliacutetico el que es regulado por el
PAI-1 depositado en la placa ademaacutes del TAFI y la α2-AP La trombogenicidad de una placa es
una funcioacuten del contenido de FT el cual determina la velocidad de produccioacuten de trombina El
FT presente en las placas proviene de las micropartiacuteculas (MP) derivadas de macroacutefagos
linfocitos y ceacutelulas musculares lisas activadas por citoquinas asiacute como de las membranas de
neutroacutefilos y monocitos que invaden la placa por quimiotaxis y adhesioacuten todo ello favorecido por
el endotelio disfuncional Asiacute el nivel de inflamacioacuten tambieacuten contribuye al desarrollo de la
trombosis arterial Por otro lado el colaacutegeno presente en la placa es un desencadenante de la
activacioacuten plaquetaria El tratamiento depende de la localizacioacuten y compromiso del oacutergano
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
93
afectado para lo cual se usan heparinas aspirina inhibidores de la GPIIbIIIa y tromboliacuteticos
entre otros Dado que la aterotrombosis es una enfermedad multifactorial y multigeacutenica se
asocian muacuteltiples factores de riesgo que deben ser tenidos en cuenta para un tratamiento maacutes
adecuado A los factores de riesgo claacutesicos (diabetes obesidad tabaquismo hiperlipidemia
etc) se han empezado a evaluar otros tales como niveles altos de fibrinoacutegeno indicadores de
inflamacioacuten variantes de glicoproteiacutenas plaquetarias niveles de PAI-1 y polimorfismos de APO
entre otros
421 Agentes para el tratamiento de la trombosis
El tratamiento de los desoacuterdenes tromboacuteticos requieren de tres grupos de faacutermacos
anticoagulantes antiagregantes plaquetarios y fibrinoliacuteticos (Tabla 42) Dado que los blancos
de accioacuten son componentes del sistema hemostaacutetico la desventaja que comparten es el riesgo
a la hemorragia El antitromboacutetico ideal seriacutea aquel que inhibe la trombosis y evita el riesgo de
hemorragia (Furie amp Furie 2008)
Anticoagulantes Antiagregantes plaquetarios Fibrinoliacuteticos
Heparina no fraccionada (HNF)
Heparina de bajo peso molecular
(HBPM)
Inhibidores de trombina (ej
argatroban bivalirudina hirudina)
Anticoagulantes orales
Aspirina
Inhibidores de GPIIbIIIa (ej
abciximab eptifibatide tirofiban)
Bloqueador del receptor de ADP (ej
Ticlopidina clopidogrel)
Inhibidores de TXA2 sintasa
Antagonistas de TXA2
Estreptoquinasa
Activadores del plasminoacutegeno tisular
recombinantes (r-TPAs)
Tabla 42 Agentes para el tratamiento de la trombosis
Los desoacuterdenes cardiovasculares representan la principal causa de muerte en el mundo
asiacute como en la Argentina (WHO) Aunque la trombosis sigue siendo la viacutea final de enfermedad y
muerte en algunas de las enfermedades maacutes comunes tales como infarto de miocardio
accidente cerebrovascular y caacutencer todos los agentes farmacoloacutegicos disponibles para su
prevencioacuten o tratamiento han estado en uso durante deacutecadas o han sido reemplazados con
nuevas variantes que ofrecen una modesta mejora incremental (Furie amp Furie 2008)
En los uacuteltimos antildeos una serie de combinaciones de anticoagulantes antiagregantes
plaquetarios y agentes fibrinoliacuteticos se han probado en ensayos cliacutenicos en pacientes con
siacutendromes coronarios agudos dando lugar a cambios en la praacutectica cliacutenica y mejoras en la
morbilidad y mortalidad de los pacientes (Merli 2007)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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En cuanto a los agentes fibrinoliacuteticos la estreptoquinasa sigue siendo un medicamento
efectivo para disolver coaacutegulos estando indicada en el tratamiento de algunos casos de infarto
de miocardio (Sikri amp Bardia 2007) Sin embargo la estreptoquinasa y la u-PA activan no soacutelo
el Plg unido a fibrina sino tambieacuten el Plg circulante generando plasmina libre la cual es capaz
de degradar otras proteiacutenas plasmaacuteticas ademaacutes de contribuir a eventos proinflamatorios
(Syrovets et al 2012) Durante la uacuteltima deacutecada la atencioacuten se ha centrado en la mejora de la
potencia eficacia y facilidad de administracioacuten de los agentes fibrinoliacuteticos En este sentido se
han desarrollado variantes recombinates de los PAs que preferencialmente activan el Plg unido
a fibrina (Collen 1996)
La buacutesqueda de enzimas fibrinoliacuteticas alternativas llevoacute hace 70 antildeos al descubrimiento
de los venenos de serpiente como agentes de disolucioacuten intravascular para coaacutegulos La
alfimeprasa una variante recombinante del veneno se caracteriza por tener un efecto directo
sobre la fibrina y es raacutepidamente inhibida al ser unida por α2-MG (Anoacutenimo 2008)
4211 Proteasas vegetales como antitromboacuteticos
La bromelina ha mostrado ser un agente fibrinoliacutetico in vivo e in vitro no soacutelo actuacutea
directamente sobre la fibrina tambieacuten activa el Plg y aumenta la concentracioacuten de plasmina Por
otro lado y en relacioacuten a su efecto antimetastaacutesico es capaz de disminuir la expresioacuten de uPAR
(receptor de u-PA) en ceacutelulas tumorales (Maurer 2001) En un modelo inflamatorio animal
bromelina incrementoacute la actividad fibrinoliacutetica seacuterica de manera dosis dependiente (Pirotta amp de
Giuli-Morghen 1978)
En un modelo de trombosis in vivo la administracioacuten oral de esta proteasa disminuyoacute la
formacioacuten de trombos (13 en arteriolas y 5 en veacutenulas) mientras que in vitro redujo la
adhesioacuten al endotelio de plaquetas humanas activadas por trombina Por otro lado el
tratamiento de plaquetas humanas con bromelina redujo la agregacioacuten inducida por trombina
(Metzig et al 1999) y por ADP (Glaumlser amp Hilberg 2006)
El tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
fueron prolongados significativamente luego de la administracioacuten oral de bromelina en ratas
(Livio et al 1978) En el mismo estudio se observoacute inhibicioacuten en la agregacioacuten plaquetaria La
administracioacuten oral de bromelina durante 10 diacuteas en personas sanas no afectoacute el TP aunque siacute
levemente el TTPa pero dentro de rangos normales (Eckert et al 1999)
Maacutes recientemente Bilheiro et al (2013) reportaron que una fraccioacuten rica en
cisteiacutenendopeptidasas aislada del laacutetex de Carica candarmarcensis manifestoacute efecto
fibrinoliacutetico fibrinogenoliacutetico y tromboliacutetico actividad inhibitoria de la agregacioacuten plaquetaria
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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95
inducida por ADP asiacute como la prolongacioacuten del TP TT y TTPa Todos estos efectos fueron
dosis dependiente y cesaron al agregar inhibidores de cisteiacutenproteasas
43 Objetivos
Dentro del objetivo general de investigar la posible aplicacioacuten como agentes para el
tratamiento de la trombosis de los extractos parcialmente purificados obtenidos de frutos de
Bromelia hieronymi (Bh) B balanasae (Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) se plantearon
como objetivos especiacuteficos
Evaluar y comparar los posibles efectos de Bh Bb y Pm sobre la coagulacioacuten
sanguiacutenea el fibrinoacutegeno y la fibrina
Determinar si los efectos medidos tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los
extractos
Comparar los efectos de Bh Bb y Pm con los medidos para bromelina
44 Materiales y meacutetodos
441 Efecto anticoagulante
Para medir el efecto de los preparados sobre la coagulacioacuten sanguiacutenea se realizaron dos
pruebas globales de la coagulacioacuten el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de
tromboplastina parcial activado (TTPa) Las pruebas globales se caracterizan por ser raacutepidas y
sencillas y aunque sus resultados pueden indicar una alteracioacuten no identifican el componente
afectado (Duboscq 2003)
Los valores del TP y del TTPa se obtuvieron a partir de ensayos in vitro e in vivo Los
ensayos in vitro se realizaron midiendo el TP y el TTPa de un pool de plasma humano pobre en
plaquetas antes y despueacutes de ser incubado con distintas concentraciones de los preparados
proteoliacuteticos mientras que los ensayos in vivo consistieron en medir el TP y el TTPa de plasmas
obtenidos de ratas Wistar tratadas con los preparados proteoliacuteticos
4411 Ensayos in vitro
44111 Pool de plasma pobre en plaquetas
El pool fue elaborado con 15 muestras de plasma pobre en plaquetas (ppp) obtenidas de
dadores voluntarios adultos de entre 30 y 65 antildeos que no hubieran consumido aspirina u otros
faacutermacos con accioacuten anticoagulante en los 10 diacuteas previos El ppp fue obtenido del
sobrenadante luego de centrifugar sangre anticoagulada con citrato de sodio al 38 (relacioacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
96
sangrecitrato de sodio = 91) durante 10 min a 3000 g El pool fue conservado en freezer a -20
ordmC durante su elaboracioacuten (1 semana) y una vez terminado fue fraccionado en tubos de plaacutestico
y conservado a -80 ordmC hasta su uso (2 meses)
44112 Tiempo de protrombina (TP)
El TP o tiempo de Quick se basa en la medida del tiempo de coagulacioacuten de un plasma
decalcificado en presencia de tromboplastina tisular y Ca+2 El teacutermino tromboplastina tisular
hace referencia a una mezcla de tromboplastina o factor tisular (FT) y fosfoliacutepidos (Duboscq
2003)
Esta prueba permite evaluar la viacutea extriacutenseca del modelo claacutesico de la coagulacioacuten ya
que es sensible a cambios en los niveles del FVII ademaacutes de los otros factores vitamina K-
dependientes (FII y FX) y del FV El nivel de fibrinoacutegeno debe estar muy disminuido (menos del
50 de la concentracioacuten normal en plasma) para alterar el TP Es un ensayo esencial para el
monitoreo de pacientes bajo tratamiento con anticoagulantes orales (Duboscq 2003)
Para la medida del TP se usoacute el kit comercial Soluplastin (Wiener lab Group) que
contiene tromboplastina tisular de cerebro de conejo En la Tabla 43 se esquematiza el
protocolo seguido el cual fue adaptado del procedimiento establecido por el kit
Mezcla de reaccioacuten (MR)
100 μL de ppp + 10 μL de muestra1
en tubo de plaacutestico
Reactivo
(Tromboplastina CaCl2 NaCl)
200 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubacioacuten a 37 ordmC (diferentes tiempos) Incubacioacuten a 37 ordmC durante 2 min
2 Agregar 100 μL de MR al tubo con reactivo y en simultaacuteneo iniciar el cronometraje
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 43 Protocolo experimental para la medida del TP 1 Preparado proteoliacutetico o solucioacuten control (buffer fosfato
soacutedico 01M pH 6)
El coaacutegulo fue detectado ldquopescaacutendolordquo mediante un ansa de acero inoxidable los
valores de TP medidos para el pool de ppp tratado con los distintos preparados proteoliacuteticos
(TPp) fueron expresados en s y se compararon con los medidos para los controles (TPc)
obtenidos al mezclar el pool de ppp con buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 (buffer de
resuspensioacuten de la bromelina y de los precipitados etanoacutelicos de cada uno de los extractos
ensayados)
En cuanto a los valores de referencia seguacuten informacioacuten del proveedor del reactivo el
intervalo de los valores de TP de individuos normales adultos oscila entre 10 y 14 s aunque
dichos valores dependen de los reactivos y del procedimiento Tiempos prolongados indican un
estado de hipocoagulabilidad por deficiencia tanto de factores de la viacutea extriacutenseca como de
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
97
vitamina K y por presencia de inhibidores mientras que tiempos acortados se asocian a estados
de hipercoagulabilidad Altas concentraciones (gt 50 μgmL) de productos de degradacioacuten de
fibrina asiacute como enfermedad hepaacutetica son algunas causas de prolongados valores de TP
(Duboscq 2003)
44113 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
El ensayo consiste en medir el tiempo de coagulacioacuten del plasma decalcificado en
presencia de un exceso de tromboplastina parcial un activador y Ca+2 El teacutermino
tromboplastina parcial se refiere a la porcioacuten fosfolipiacutedica en la que se encuentra anclada la
tromboplastina (o FT) El activador proporciona la superficie cargada negativamente
desencadenante de la fase de contacto generalmente tierra de diatomeas celite o caoliacuten
(Duboscq 2003)
Esta prueba sirve para detectar anormalidades en la viacutea intriacutenseca del modelo claacutesico
ya sea por deficiencia de factores procoagulantes como por la presencia de inhibidores por ser
sensible frente a deficiencias de los factores FXII FXI FIX y FVIII como tambieacuten frente a
deficiencias severas de fibrinoacutegeno FII FV y FX Es usada para monitorear el tratamiento
terapeacuteutico con heparina no fraccionada y con acenocumarol (Duboscq 2003)
Se utilizoacute el kit comercial APTTest (Wiener lab Group) que utiliza cefalina como
tromboplastina parcial y tierra de diatomeas como activador En la Tabla 44 se esquematiza el
protocolo seguido en los ensayos el cual fue adaptado del procedimiento establecido por el kit
Mezcla de reaccioacuten (MR)
100 μL de pool de ppp + 10 μL de muestra1 en tubo
de plaacutestico
Reactivo
(Cefalina + tierra de diatomeas)
100 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubar de MR a 37 ordmC (diferentes tiempos)
2 Agregar 100 μL de MR al tubo con reactivo e incubar a 37 ordmC durante 3 min
3 Agregar 100 μL de CaCl2 0025 molL (precalentado a 37 ordmC) iniciar simultaacuteneamente el cronometraje y homogeneizar
4 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 44 Protocolo experimental para la medida del TTPa1 Preparado proteoliacutetico o control (buffer fosfato soacutedico
01 M pH 6)
El coaacutegulo fue detectado ldquopescaacutendolordquo mediante un ansa de acero inoxidable Los
tiempos de tromboplastina parcial activada medidos para el pool de ppp tratado con las distintas
preparaciones proteoliacuteticas (TTPap) fueron expresados en s y se compararon con los medidos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
98
para los controles (TTPac) los que se obtuvieron al mezclar el pool de ppp con buffer fosfato
soacutedico 01M de pH 6
Los valores de TTPa dependen fuertemente de los reactivos y del sistema de deteccioacuten
utilizado por lo cual es importante comparar los resultados obtenidos de la muestra ensayada
con la de un control usando un mismo lote de reactivo Seguacuten informacioacuten del proveedor del
reactivo el intervalo de los valores de TTPa de individuos normales adultos oscila entre 33 y 48
s y los tiempos que se diferencian en maacutes de 6 s de un plasma control deberaacuten ser
considerados anormales Tiempos prolongados indican un estado de hipocoagulabilidad
(deficiencia de factores o presencia de inhibidores) en tanto que los tiempos acortados
corresponderiacutean a un estado de hipercoagulabilidad aunque en este caso es aconsejable tomar
una nueva muestra pues la muestra podriacutea haber sido activada in vitro (Duboscq 2003)
44114 Efecto de la inhibicioacuten de la actividad proteoliacutetica sobre la accioacuten anticoagulante
Las soluciones de Bh Bb Pm y bromelina que extendieron el TP y el TTPa del pool de
ppp por encima de 180 s fueron incubadas durante 30 min a 37 ordmC con 035 mM de E-64 Luego
de verificar la peacuterdida de la actividad proteoliacutetica de dichas soluciones se volvioacute a determinar los
valores de TP y de TTPa siguiendo los protocolos de las tablas 33 y 34 respectivamente La
solucioacuten control para ambos ensayos fue buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 conteniendo 035
mM de E-64
44115 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados
Los datos fueron analizados estadiacutesticamente mediante ANOVA y posterior test de
Dunnett Cuando se compararon soacutelo dos grupos se utilizoacute la prueba t (no pareada) Un p lt
005 () fue considerado significativo Los caacutelculos fueron realizados con el programa
GraphPadPrism version 50
Para todos los preparados proteoliacuteticos las soluciones y diluciones ensayadas fueron
elaboradas n veces (indicado en cada caso) y a cada una de ellas se les midioacute el TP y el TTPa
por duplicado (intraensayo) Los resultados son expresados como el promedio de los valores
promedio intraensayo plusmn desviacioacuten estaacutendar (DE)
4412 Ensayos in vivo
Los resultados obtenidos en los ensayos in vitro se usaron para estimar las dosis que
pudieran resultar efectivas como anticoagulantes en los ensayos in vivo Para estos ensayos
ratas Wistar de ambos sexos y pesos entre 150 y 240 g fueron divididas en lotes de 6 animales
(3 hembras y 3 machos) Cada lote recibioacute intraperitonealmente los preparados proteoliacuteticos el
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
99
lote control no recibioacute tratamiento Previo a la extraccioacuten sanguiacutenea los animales fueron
anestesiados con una mezcla de 75 mgkg de ketamina clorhidrato (Holliday Scott SA) y 12
mgkg de xilacina clorhidrato (Richmond Laboratories Vet Pharma) administrada
intraperitonealmente La extraccioacuten fue realizada por puncioacuten cardiacuteaca y la sangre obtenida fue
mezclada con citrato soacutedico al 38 en una relacioacuten sangreanticoagulante = 91 se centrifugoacute
durante 10 min a 3000 g y el sobrenadante (ppp) fue separado en tubos de plaacutestico que se
almacenaron en freezer a -20 ordmC hasta el momento de medida del TP y del TTPa En la tabla
45 se esquematiza el protocolo seguido para las determinaciones del TP y del TTPa del ppp de
cada animal seguacuten indicaciones de los respectivos kits comerciales (Wiener lab Group)
TP
Plasma pobre en plaquetas (ppp)
100 μL en tubo de plaacutestico
Reactivo (Tromboplastina CaCl2 NaCl)
200 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubacioacuten a 37 ordmC durante 2 min
2 Agregar 100 μL de ppp al tubo con reactivo y en simultaacuteneo iniciar el cronometraje
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
TTPa
Plasma pobre en plaquetas (ppp)
100 μL
Reactivo
(Cefalina + tierra de diatomeas)
100 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Agregar 100 μL de ppp al tubo con reactivo e incubar a 37 ordmC durante 3 min
2 Agregar 100 μL de CaCl2 0025 moll (precalentado a 37 ordmC) en simultaacuteneo iniciar el cronometraje y homogeneizar
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 45 Protocolos experimentales para las medidas del TP y del TTPa
Tanto el TP como el TTPa de cada animal corresponden al promedio de los valores
obtenidos en dos determinaciones
44121 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados
Los datos obtenidos se analizaron estadiacutesticamente mediante ANOVA seguido por el
test de Tukey y las diferencias entre los grupos fueron consideradas significativas para un
plt005 () Los caacutelculos fueron efectuados con el programa GraphPadPrism version 50 Los
resultados se expresan como el promedio plusmn SEM
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
100
442 Efecto fibrinogenoliacutetico
El efecto de los preparados proteoliacuteticos sobre el fibrinoacutegeno fue evaluado mediante el
registro electroforeacutetico por la teacutecnica de tricina-SDS-PAGE de los hidrolizados obtenidos al
incubar las mezclas de dichos compuestos
4421 Hidrolizados
Se utilizoacute como sustrato proteico el fibrinoacutegeno bovino (F8630 Sigma Aldrich)
solubilizado en buffer Tris-HCl 0025M pH 8 Las mezclas de reaccioacuten se hicieron de manera
que la concentracioacuten final de fibrinoacutegeno fuera mayor o igual a 1 mgmL a fin de poder detectar
la proteiacutena remanente tras el desarrollo de la electroforesis mientras que las concentraciones
de los preparados proteoliacuteticos se fueron variando en funcioacuten de los perfiles obtenidos Las
mezclas se incubaron a 37 ordmC durante diferentes tiempos y las reacciones fueron finalizadas por
el agregado de aacutecido iodoaceacutetico (inhibidor de cisteiacutenendopeptidasas) y de buffer de muestra
(BM) Finalmente fueron llevadas a ebullicioacuten durante 5 min El procedimiento se resume en la
Tabla 46 y la composicioacuten del buffer de muestra en la Tabla 47
Tabla 46 Finalizacioacuten de la reaccioacuten y preparacioacuten de los hidrolizados resultantes para la corrida electroforeacutetica
Buffer de muestra
Tris 157 g
SDS 4 g
Glicerol 16 mL
Azul de bromofenol 4 mg
β-mercaptoetanol 25 μL
Llevar a pH 68 con HCl 1M
AD csp 100mL
Tabla 47 Composicioacuten del buffer de muestra (BM) AD agua destilada β-mercaptoetanol fue agregado en el
momento de tratar los hidrolizados
Para los blancos de reaccioacuten se respetaron las mismas cantidades de la Tabla 46 pero
se cambioacute el orden en que se agregaron los reactivos (Tabla 48)
Tratamiento de los hidrolizados
1) Hidrolizados 25 μL
2) Acido iodoaceacutetico (11 mM) 5 μL
3) BM 25 μL
4) Llevar a ebullicioacuten 5 min
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
101
Tabla 48 Procedimiento para la preparacioacuten de blancos de reaccioacuten Los voluacutemenes de la solucioacuten del
preparado proteoliacutetico (E) y del fibrinoacutegeno (S) fueron tales que S+E = 25 μL
Las muestras resultantes se conservaron en freezer a -20ordmC hasta el momento de la
siembra
4422 Tricina-SDS-PAGE
Esta teacutecnica electroforeacutetica es muy adecuada para la separacioacuten de polipeacuteptidos y
proteiacutenas en el rango de 1 a 100 kDa y es la preferida para la resolucioacuten de proteiacutenas con pesos
moleculares maacutes pequentildeos que 30 kDa (Schaumlgger 2006) La tricina es utilizada como ion de
arrastre en el buffer catoacutedico permitiendo una mayor resolucioacuten de proteiacutenas pequentildeas a
concentraciones menores de acrilamida que en el caso del buffer Tris-glicina utilizado en la
teacutecnica ideada por Laemmli (1970) La electroforesis con tricina permite una mejor resolucioacuten de
polipeacuteptidos sobre todo en el rango de 5 y 20 kDa sin la necesidad del uso de urea (Schaumlgger
amp von Jagow 1987)
Para el moldeado de geles y la corrida electroforeacutetica se empleoacute el equipo Mini-Protean
III (Bio-Rad) Debido a que el PM de la cadena maacutes grande del fibrinoacutegeno (Aα) es de alrededor
de 65 kDa se eligioacute el sistema de geles que permite resolver mezclas proteicas en el rango 5-
100 kDa que consiste en un gel de resolucioacuten con 10 de T14 y 3 de C15 y en un gel de
apilamiento con 4 de T y 3 de C (Tabla 49)
Las muestras obtenidas seguacuten lo indicado en 4421 fueron centrifugadas durante 10
min a 16000 g y el sobrenadante fue sembrado (5 μL) sobre el buffer catoacutedico (Tris 01M
Tricina 01M SDS 01) contenido en las calles
14
T= (g acrilamida+g bisacrilamida) x 100 volumen total 15
C= g bisacrilamida x 100 (g acrilamida+g bisacrilamida)
Blancos de reaccioacuten
1) Volumen de solucioacuten del preparado proteoliacutetico
E μL
2) Acido iodoaceacutetico (11 mM) 5 μL
3) BM 25 μL
4) Volumen de solucioacuten de fibrinoacutegeno S μL
5) Llevar a ebullicioacuten 5 minutos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
102
Reactivos Gel de apilamiento 4T y 3C
Gel de resolucioacuten 10T y 3C
AcrilBis (4815) 06 mL 2 mL
Buffer del gel 100 mL 33 mL
H2O 34 mL 47 mL
PSA 10 40 μL 50 μL
TEMED 4 μL 5 μL
Tabla 49 Sistema de geles empleado (rango 5-100kDa) Buffer del gel Tris-HCl 3M pH 845 conteniendo SDS 03
PSA persulfato de amonio TEMED NNNacuteNacute-tetrametiletilendiamina
En los reservorios anoacutedicos y catoacutedicos de la celda electroforeacutetica se colocaron buffer
anoacutedico (Tris-HCl 02M pH 89) y buffer catoacutedico respectivamente
La electroforesis fue desarrollada sin refrigeracioacuten El voltaje inicial fue de 30 V y se
mantuvo constante durante el paso de las muestras por el gel de apilamiento cuando las
muestras entraron al gel de resolucioacuten se lo aumentoacute a 100 V valor que se mantuvo constante
hasta que el frente de colorante alcanzoacute el fondo del gel Inmediatamente despueacutes los geles
fueron removidos de las placas y las bandas proteicas visualizadas mediante tincioacuten con
Coomassie para lo cual los geles se dejaron durante 30 min en solucioacuten fijadora (10 vv de
aacutecido aceacutetico 50 vv de metanol) Luego fueron coloreados con solucioacuten colorante (10 vv
de aacutecido aceacutetico 40 vv de metanol y 100 mg de Coomassie Brillant Blue R-250) y
decolorados con una solucioacuten de aacutecido aceacutetico al 10 vv Una vez secos fueron escaneados y
las imaacutegenes reducidas a un tamantildeo y resolucioacuten adecuados en un programa de procesamiento
de imaacutegenes (Adobe Photoshop y Aldus Photostyler) Luego se utilizoacute un software especial
(Scion Image 1998 URL httpwwwscioncorpcom) que convierte la intensidad de color de las
bandas presentes en los geles en datos numeacutericos permitiendo realizar densitogramas de las
calles sembradas
443 Efecto fibrinoliacutetico
4431 Placa de fibrina
A fin de evaluar la actividad fibrinoliacutetica de los preparados proteoliacuteticos se desarrolloacute el
ensayo de la placa de fibrina Este ensayo altamente reproducible y sensible consiste en
depositar gotas de la solucioacuten en ensayo sobre un coaacutegulo de fibrina formado en una placa de
Petri y determinar la cantidad de fibrina degradada midiendo las aacutereas de las zonas lisadas
despueacutes de incubar la placa a 37 ordmC sobre una superficie nivelada en una caacutemara huacutemeda
(Jespersen amp Astrup 1983)
Se siguioacute la teacutecnica desarrollada por Dametto et al (2000) con algunas modificaciones
seguacuten la cual 4 mL de fibrinoacutegeno al 05 en el buffer de reaccioacuten (barbital 0045 M pH 775
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
103
conteniendo CaCl2 166 mM MgCl2 07 mM y NaCl 92 mM) fueron mezclados con 4 mL de una
solucioacuten de agarosa al 2 preparada en el mismo buffer y 02 mL de 20 unidades NIHmL de
trombina todos a 42 ordmC La mezcla fue depositada en una placa de Petri (15 x 9 cm)
homogeneizada mediante movimientos circulares y dejada 1 h a temperatura ambiente para
permitir la correcta formacioacuten y estabilizacioacuten de la fibrina Sobre la superficie del coaacutegulo se
sembraron 10 μL por muestra y luego de incubar en atmoacutesfera huacutemeda a 37ordmC durante 14 h se
midieron 2 diaacutemetros perpendiculares para cada aacuterea de lisis
Se utilizoacute fibrinoacutegeno bovino (F8630 Sigma Aldrich) y trombina bovina (T7513 Sigma
Aldrich) mientras que como control se empleoacute plasmina humana (P1867 Sigma Aldrich) La
concentracioacuten de trombina usada en el ensayo fue obtenida por dilucioacuten de una solucioacuten stock
de trombina (100 unidades NIHmL en solucioacuten de 09 de NaCl y 01 de seroalbuacutemina
bovina) con el buffer de reaccioacuten
4432 Caacutelculos y anaacutelisis de resultados
El aacuterea de la zona circular lisada durante el periacuteodo de incubacioacuten es proporcional a la
cantidad de producto (fibrina lisada) formado enzimaacuteticamente y por tanto una medida de la
actividad fibrinoliacutetica de la solucioacuten sembrada la cual fue estimada como el producto de 2
diaacutemetros perpendiculares (mm2) de la zona lisada (Jespersen amp Astrup 1983) La relacioacuten
entre la concentracioacuten de la enzima (C) y la actividad fibrinoliacutetica (A) tal como fue definida es
A = kCa siendo k y a constantes
Puesto que a es diferente de 1 esta relacioacuten no es una funcioacuten lineal Sin embargo
aplicando logaritmos a ambos miembros de la relacioacuten se obtiene
log A = b + alog C siendo b = log k
Lo cual permite estimar los paraacutemetros k y a de forma maacutes precisa mejorando la
precisioacuten del ensayo El paraacutemetro b expresa la actividad fibrinoliacutetica (como log k) cuando la
concentracioacuten es 1 mientras que el paraacutemetro a expresa impliacutecitamente el mecanismo del
ensayo (Jespersen amp Astrup 1983)
La actividad fibrinoliacutetica fue medida por triplicado para una serie de diluciones de cada
preparado proteoliacutetico y se graficaron las relaciones doble logariacutetmicas entre A y C Los
paraacutemetros de correlacioacuten calculados mediante el programa GraphPadPrism version 50
sirvieron para comparar las actividades fibrinoliacuteticas de los distintos preparados ademaacutes de
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
104
encontrar una correlacioacuten entre la actividad caseinoliacutetica y la actividad fibrinoliacutetica para cada una
de ellas
444 Material vegetal
El contenido proteoliacutetico (UCasmg) y proteico (μg proteiacutenamg) asiacute como la actividad
especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos utilizados se presenta en la Tabla 410
Liofilizados UCasmg μg proteiacutenamg UCasmg proteiacutena
Bh 0275 plusmn 0005 27 plusmn 2 10
Pm 0166 plusmn 0009 34 plusmn 3 5
Bb 0155 plusmn 0008 11 plusmn 1 14
Bromelina (Sigma Aldrich) 068 plusmn 004 205 plusmn 2 33
Tabla 410 Contenido proteoliacutetico (UCasmg) proteico (μg proteiacutenamg) y actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos ensayados UCas unidades caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC) Media plusmn DE
Para todos los ensayos las soluciones de los extractos fueron preparadas por
resuspensioacuten de los liofilizados en agua destilada mientras que la bromelina fue redisuelta en
buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
105
45 Resultados y discusioacuten
451 Efecto anticoagulante 4511 Ensayos in vitro
Con el objetivo de determinar las concentraciones tiempos y voluacutemenes a incubar se
realizaron ensayos preliminares con un uacutenico ppp a partir de cuyos resultados (no mostrados)
se decidioacute que el tiempo de incubacioacuten fuera de 2 min Durante los ensayos con el pool de ppp
las concentraciones que no mostraron resultados concluyentes a los 2 min tambieacuten fueron
ensayadas incubando durante 10 min
Debido a que no todas las concentraciones fueron replicadas en igual nuacutemero eacuteste (n)
se indica en la tabla junto con el valor de la desviacioacuten estaacutendar (DE) Como se mencionoacute cada
replicado corresponde a un ensayo independiente y es el promedio de dos medidas realizadas
dentro de cada ensayo Cuando el coaacutegulo no fue detectado dentro de los 180 s desde el inicio
del cronometraje dichas medidas (indicadas como nc) no fueron tenidas en cuenta para el
anaacutelisis estadiacutestico y por tanto no se contabilizaron dentro del valor de n se decidioacute considerar
este tiempo como un efecto maacuteximo
En las tablas aparecen las concentraciones finales es decir referidas al volumen de
mezcla (pool de ppp + preparado proteoliacutetico)
En la mayoriacutea de los casos ademaacutes de diferencias significativas de los valores de TP y
de TTPa respecto a los del control se detectaron coaacutegulos con una consistencia diferente a la
del coaacutegulo obtenido a partir del pool de ppp sin tratamiento proteoliacutetico Por este motivo se
elaboroacute una escala que contempla las diferentes caracteriacutesticas de los coaacutegulos formados
(Tabla 411) En algunos casos se observoacute que el tiempo en que se detecta el hilo de fibrina
(primer indicio de la formacioacuten de fibrina) difiere maacutes del 5 del tiempo en que se detecta el
coaacutegulo de fibrina En este caso se tomoacute como tiempo de coagulacioacuten el promedio de ambos
tiempos y el hecho fue indicado con la letra D
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
106
Caracteriacutestica del coaacutegulo Nuacutemero de referencia
asignado
Filamentoso (carece del volumen y del aspecto
ldquogelatinosordquo del coaacutegulo normal)
I
Muy fraccionado (maacutes de 6 ldquosubcoaacutegulosrdquo) II
Fraccionado (menos de 6 ldquosubcoaacutegulosrdquo) III
Coaacutegulo uacutenico pero de menor solidez que el del pool
de ppp no tratado (imposibilidad de levantarlo con el ansa)
IV
Tabla 411 Escala en que fueron agrupados los coaacutegulos con caracteriacutesticas diferentes de los normales
45111 Tiempo de Protrombina (TP)
En la Tabla 412 se exponen los valores de TP de un pool de ppp luego de incubarlo con
distintas concentraciones de bromelina a 37 ordmC durante 2 min
Bromelina
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
14 gt180 2
13 82 2 37 I (23) nc (13)
11 615 4 8 D (24)
09 38 4 8 D (24)
065 20 3 1
0 165 4 05
Tabla 412 TP para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones bromelina Resultados del test de
Dunnett plt001 plt0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo
nuacutemero de referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada)
nc TPgt180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
La prolongacioacuten significativa del TP fue acompantildeada con alteracioacuten ya sea en el
intervalo de deteccioacuten del coaacutegulo (D) como en la caracteriacutestica del coaacutegulo (I)
En la tabla 413 se muestran los valores de TP del pool de ppp despueacutes de incubarlo con
distintas concentraciones de Bh a 37 ordmC Luego de incubar el pool de ppp con 35 mgmL
durante 2 min se obtuvieron valores y caracteriacutesticas de coaacutegulo muy dispares entre los
replicados Por esta razoacuten se ensayoacute tambieacuten el tiempo de incubacioacuten de 10 min para 35
mgmL y 25 mgmL suponiendo que quizaacutes Bh requiriera mayor tiempo para llegar a un
equilibrio
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
107
Bh (Incubacioacuten 2 min) Bh (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE Caracteriacutestica del coaacutegulo TP (s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
55 62 2 23 I (23) nc (13)
35 437 4 13 I (24)IV (24)D 345 3 9 I (13)
25 20 3 35 IV 22 3 3 IV
15 175 3 2
0 167 3 06 165 3 06 165
Tabla 413 TP para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bh Resultados test de
Dunnett plt001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo nuacutemero de
referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TPgt180
s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
Sin embargo puede observarse que no ha habido variacioacuten significativa luego de
incubar 10 min respecto de los valores obtenidos al incubar 2 min Al igual que lo observado
para bromelina la prolongacioacuten significativa del TP fue acompantildeado por una alteracioacuten en la
caracteriacutestica del coaacutegulo
En la tabla 414 se muestran los valores de TP del pool de ppp luego de incubarlo con
distintas concentraciones de Bb a 37 ordmC
Bb (Incubacioacuten 2 min) Bb (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TP
(s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
85 58 2 0 I (23) nc (13)
75 58 1 0 I (13) nc (23)
73 437 3 55 46 3 4 I (13)
65 29 3 4
0 15 3 1 16 3 06
Tabla 414 TP para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bb n nuacutemero de replicados
DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo nuacutemero de referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la
frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TPgt180 s Resultados test de Dunnett (Bb incubacioacuten 2
min) plt005 plt0001 Resultado t-test (Bb incubacioacuten 10 min) plt0001
No se observan cambios significativos entre los valores de TP del pool de ppp incubado
a 2 y 10 min para una misma concentracioacuten Sin embargo hay un gran cambio en relacioacuten a la
caracteriacutestica del coaacutegulo cuando se variacutea muy poco la concentracioacuten (de 73 a 75 mgmL) En
este caso siacute hay una concentracioacuten que variacutea significativamente el TP sin alterar (al menos
visiblemente) la caracteriacutestica del coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
108
En la tabla 415 se exponen los valores de TP del pool de ppp luego de incubarlo con
Pm durante 2 min a 37 ordmC No se ha observado alteracioacuten visible en la caracteriacutestica del
coaacutegulo aunque siacute en el intervalo de deteccioacuten del coaacutegulo (D) y al igual que ocurre con Bb
existe una concentracioacuten que provoca una variacioacuten significativa del TP sin alterar la
caracteriacutestica del coaacutegulo
Pm
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
9 gt180 2
8 551 5 10 D (45)
78 563 4 45 D (34)
65 323 3 35
55 215 2 05
0 153 3 07
Tabla 415 TP para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de Pm Resultados test de Dunnett
p lt 005 p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo D diferencia
temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica
mencionada)
45112 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
Los valores de TTPa del pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min a 37 ordmC con
distintas concentraciones de bromelina se muestran en la Tabla 416 La concentracioacuten a partir
de la cual se observa una prolongacioacuten significativa del TTPa es similar a la miacutenima
concentracioacuten que prolonga el TP (asymp 09 mgmL) Si bien se observaron diferencias entre el
tiempo en que se detecta el hilo y el coaacutegulo (D) no se visualizaron cambios en la caracteriacutestica
del coaacutegulo respecto a la de un coaacutegulo normal
Bromelina
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
10 gt180 2
085 523 6 8 D (26)
050 343 3 07
0 364 5 3
Tabla 416 TTPa para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de bromelina Resultados test de
Dunnett p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
109
El TTPa del pool de ppp incubado con distintas concentraciones de Bh durante 2 min a
37 ordmC (Tabla 417) fue prolongado significativamente con concentraciones similares a las que
prolongaron el TP Al igual que lo observado en el ensayo para determinar el TP las
concentraciones que prolongaron el TTPa tambieacuten produjeron cambios visibles en la
caracteriacutestica del coaacutegulo
Bh (Incubacioacuten 2 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
38 gt180 3
35 74 4 8 II (34)I(14)
33 534 5 3 IV D (35)
3 457 3 9 IV
0 397 3 06
Tabla 417 TTPa para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de Bh Resultado test de Dunnett
p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica
la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
En la tabla 418 se presentan los valores de TTPa del pool de ppp luego de incubarlo
con distintas concentraciones de Bb durante 2 y 10 min En comparacioacuten con los resultados del
ensayo de medida de TP puede observarse que las concentraciones que prolongaron
significativamente los TTPas estaacuten dentro del rango de concentraciones que prolongaron los
TPs Sin embargo se observoacute cambio en la caracteriacutestica del coaacutegulo cuando hubo
prolongacioacuten significativa de los tiempos
Bb (Incubacioacuten 2 min) Bb (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DS
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TTPa
(s) n DS
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
85 765 2 5 I nc (13) 70 2 9 I nc (13)
75 58 3 7 IIID (23) 60 3 9 II D (13)
65 45 1 IV
55 407 3 3 IV
0 403 3 2 403 3 2
Tabla 418 TTPa para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bb n nuacutemero de
replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada
de la caracteriacutestica mencionada) nc TTPa gt 180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo Bb
(Incubacioacuten 2 min) plt001 (Dunnett) Bb (Incubacioacuten 10 min) plt005 (t-test)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
110
Los tiempos medidos a los 2 y 10 min no fueron significativamente diferentes mientras
que las caracteriacutesticas de los coaacutegulos formados apenas variaron (de III a II)
Luego de incubar el pool con diferentes concentraciones de Pm durante 2 min no se
encontroacute una concentracioacuten que prolongara significativamente el TTPa antes de que lo hiciera
con un TTPa gt 180 s Siacute se observaron cambios en la caracteriacutestica de los coaacutegulos formados
luego de incubar el pool con cada concentracioacuten ensayada (Tabla 419) Cuando se incuboacute
durante 10 min la concentracioacuten de 45 mgmL prolongoacute significativamente el TTPa que resultoacute
ser mayor al TTPa luego de incubar el pool durante 2 min con la misma concentracioacuten Si se
comparan las tablas 415 y 419 se puede observar que la concentracioacuten que prolongoacute maacutes allaacute
de 180 s el TP fue aproximadamente dos veces mayor que la necesaria para prolongar a maacutes
de 180 s el TTPa lo cual estariacutea indicando una mayor especificidad de Pm hacia alguno de los
componentes de la viacutea intriacutenseca que de la extriacutenseca
Pm (Incubacioacuten 2 min) Pm (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) N DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
5 60 2 0 I nc (13)
45 433 3 4 III D (23) 757 3 13 II D (23)
4 362 3 3 IV D (23)
25 362 2 04 D
0 41 3 06 41 3 07
Tabla 419 TTPa para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Pm Resultados t- test p
lt 005 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la
frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TTPa gt 180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de
hilo y coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
111
Para facilitar la comparacioacuten de los efectos de los preparados proteoliacuteticos sobre el TP y
el TTPa se graficaron las relaciones TPpTPc y TTPapTTPac en funcioacuten de la actividad
proteoliacutetica (UCas) de los preparados (Figura 46)
Figura 46 Tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) del pool de ppp luego de
incubarlo con los preparados (TPp TTPap respectivamente) respecto a los tiempos del control (TPc TTPac
respectivamente) en funcioacuten de las UCasmL de bromelina (Bro) y de los preparados de Bromelia balanse (Bb) B
hieronymi (Bh) y Pseudananaacutes macrodontes (Pm) Media plusmn SEM Las liacuteneas verticales con la flecha correspondiente
indican la miacutenima concentracioacuten del preparado respectivo en que no se detecta el coaacutegulo antes de 180 s
El hecho de que la caracteriacutestica del coaacutegulo (I II III IV) variara en relacioacuten a la
concentracioacuten y al preparado con el cual se incuboacute ademaacutes de la alteracioacuten en el intervalo de
deteccioacuten del coaacutegulo (D) dificultoacute las medidas de los tiempos y aportoacute una variabilidad
cualitativa que afectoacute la variabilidad de los tiempos principalmente cuando fueron cercanos al
nc Esto dificultoacute la comparacioacuten entre los efectos de los preparados asiacute como establecer
00 05 10 15
2
4
6
Bro
Bh
Bb
Pm
088 116 15215
I
D
D
DIV
I
IV
I DD
UCasmL
TP
pT
Pc
00 05 10 1505
10
15
20
25
30
Bro
Bh
Bb
Pm
083 132068 104
I
DIII
IV
D
II
IVIV
DIV
DIII
I
DIVD
UCasmL
TT
Pa
pT
TP
ac
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
112
concentraciones efectivas pero de todos modos no impidioacute obtener algunas conclusiones tal
como se indica a continuacioacuten
En todos los casos de un corto rango de concentraciones que alteraron
progresivamente la caracteriacutestica normal del coaacutegulo se pasoacute bruscamente a TP y TTPa
prolongados a maacutes de 10 y 4 veces respectivamente
Para todos los preparados hubo alguna concentracioacuten que ademaacutes de prolongar el TP y
el TTPa modificoacute la caracteriacutestica del coagulo o afectoacute el intervalo de deteccioacuten del mismo (D)
Esto podriacutea estar indicando un efecto directo sobre la estructura de la fibrina yo puesto que
eacutesta depende fuertemente de la concentracioacuten asiacute como de la estructura del fibrinoacutegeno
(Lauricella 2007) tambieacuten sobre la del fibrinoacutegeno Dado que la creciente evidencia apoya el
concepto de que las caracteriacutesticas estructurales de la fibrina pueden representar un nuevo
factor de riesgo para el tromboembolismo arterial y venoso (Undas amp Arieumlns 2011) el
acompantildeamiento de alteraciones en el coaacutegulo al efecto anticoagulante puede resultar una
desventaja De todos modos esto soacutelo podraacute ser determinado mediante estudios que empleen
modelos de trombosis
Otra informacioacuten que se puede obtener de la Figura 46 es que teniendo en cuenta las
actividades proteoliacuteticas de cada preparado la bromelina ha sido la maacutes potente Se requirieron
088 (plusmn 005) 116 (plusmn 006) 15 (plusmn 008) y 152 (plusmn 003) UCasmL de bromelina Bb Pm y Bh
respectivamente para prolongar el TP a maacutes de 180 s yo producir un coaacutegulo Tipo I En tanto
que para prolongar el TTPa a maacutes de 180 s (yo coaacutegulo Tipo I) se requirieron 068 (plusmn 004)
083 (plusmn 004) 104 (plusmn 002) y 132 (plusmn 007) UCasmL de bromelina Pm Bh y Bb
respectivamente Pareceriacutea existir cierta especificidad de cada preparado proteoliacutetico hacia una
u otra viacutea del modelo claacutesico de la coagulacioacuten Por ejemplo 083 UCasmL de Pm son
suficientes para prolongar el TTPa a maacutes de 180 s mientras que el mismo efecto sobre el TP
requirioacute 152 UCasmL de Pm Algo similar ocurre para los demaacutes preparados
Probablemente estas diferencias se pudieron deber a componentes diferentes a las
proteasas cisteiacutenicas presentes en los preparados Para poner a prueba dicha suposicioacuten y
determinar si el efecto anticoagulante es debido a la accioacuten de proteasas cisteiacutenicas se
determinoacute el TP y el TTPa del pool de ppp luego de incubarlo con soluciones de los preparados
tratados y no tratados con E-64
45113 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de los preparados proteoliacuteticos
sobre su efecto anticoagulante
En las Figuras 47 y 48 se muestran el TP y el TTPa respectivamente del pool de ppp
luego de incubarlo durante 2 min a 37 ordmC con las soluciones de bromelina Bh Bb y Pm antes y
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
113
despueacutes de inhibir sus cisteiacutenendopeptidasas Las concentraciones ensayadas fueron un 10
mayor que aquellas que prolongaban el TP y el TTPa por encima de 180 s En la Tabla 420 se
muestran los valores de actividad caseinoliacutetica de las soluciones de bromelina Bh Pm y Bb
antes y despueacutes de tratarlas con E-64 (035 mM) El TP y el TTPa del control fue obtenido luego
de incubar durante 2 min a 37 ordmC 100 μL del pool de ppp con 10 μL de 035 mM de E-64 en
buffer fosfato soacutedico 01M pH 6
Figura 47 TP de un pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min con Bro (155 mgmL) Bh (6 mgmL) Bb (95 mgmL) y Pm (95 mgmL) inactivas (Con E-64) y activas (Sin E-64) proteoliacuteticamente Valores expresados como la media plusmn DE (n = 3) excepto para los grupos Sin E-64 cuyos TP fueron mayores a 180 s Resultado test de Dunnett entre el grupo Con E-64 y el grupo Control p lt 005
Figura 48 TTPa de un pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min con Bro (11 mgmL) Bh (45 mgmL) Bb (95 mgmL) y Pm (65 mgmL) inactivas (Con E-64) y activas (Sin E-64) proteoliacuteticamente Valores expresados como la media plusmn DE (n=3) excepto para los grupos Sin E-64 cuyos TTPa fueron mayores a 180 s Resultado test de Dunnett entre el grupo Con E-64 y el grupo Control p lt 001 p lt 0001
0
50
100
150
Sin E-64Con E-64Control
Bro(155 mgmL)
Bh(6 mgmL)
Bb(95 mgmL)
Pm(95 mgmL)
180
TP
(s)
0
50
100
150
Con E-64
Control
Sin E-64
180
Bro(11 mgmL)
Bh(45 mgmL)
Bb(95 mgmL)
Pm(65 mgmL)
TT
Pa (
s)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
114
Puede observarse que la prolongacioacuten del TP y del TTPa del pool de ppp luego de
incubarlo con cada preparado es debida preponderantemente a la actividad proteoliacutetica de
proteasas cisteiacutenicas Sin embargo el efecto anticoagulante de Bb y Pm no revirtioacute
completamente cuando sus proteasas fueron inhibidas lo cual podriacutea indicar la presencia de
otro componente anticoagulante presente en los preparados Esto es maacutes notable para el TTPa
medido luego de incubar el pool con Pm sin actividad proteoliacutetica (TTPapTTPac igual a 215) lo
cual sumado a que el TP no es afectado por Pm inhibido es coherente con el hecho de que se
requiere mayor UCasmL para prolongar el TP que para prolongar el TTPa Bb inhibido tambieacuten
prolongoacute significativamente el TP y el TTPa aunque las relaciones TPpTPc y TTPapTTPac
fueron maacutes bajas (13 y 14 respectivamente) Un dato importante es que la caracteriacutestica de
los coaacutegulos formados a partir del pool tratado con los preparados inhibidos no mostroacute
diferencias respecto a la caracteriacutestica de un coaacutegulo normal Esto estariacutea indicando que las
alteraciones observadas (I II III IV D) en los coaacutegulos formados desde el pool tratado con los
preparados se debieron a la accioacuten de las proteasas
Liofilizados Solucioacuten (mgmL) Sin E-64 (UCasmL) Con E-64 (UCasmL)
Bro 204 14 plusmn 02 -045 plusmn 027
Bh 100 273 plusmn 04 -03 plusmn 02
Bb 160 244 plusmn 06 -06 plusmn 03
Pm 100 165 plusmn 01 -02 plusmn 01
Tabla 420 Actividad proteoliacutetica frente al sustrato caseiacutena de las soluciones de Bro Bh Bb y Pm antes (Sin E-64) y
despueacutes (Con E-64) de ser tratadas con 035 mM de E-64 durante 30 min a 37ordmC Los valores son expresadas como la media plusmn DE (n = 3) UCas unidades caseinoliacuteticas a 37 ordmC en buffer Tris-ClH 01M pH 75
Otra causa posible que pudiera explicar el efecto anticoagulante de los preparados
tratados con E-64 es que haya quedado una actividad proteoliacutetica remanente que no haya sido
detectada por el ensayo de actividad caseinoliacutetca Puesto que la teacutecnica de la placa de fibrina
es muy sensible tambieacuten se evaluoacute la actividad fibrinoliacutetica de las soluciones de bromelina Bh
Bb y Pm inhibidas con E-64 Sin embargo tampoco pudo detectarse actividad frente a fibrina
4512 Ensayos in vivo
Las dosis de bromelina Bh Bb y Pm administradas a los animales fueron estimadas
teniendo en cuenta los resultados de los ensayos in vitro y la relacioacuten plasmapeso corporal
establecida para ratas Wistar por Bijsterbosch et al (1981) seguacuten la cual
volumen de plasma (mL) = 00291PC(g) + 254 donde PC es el peso corporal
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
115
Como primera aproximacioacuten se definioacute una misma dosis en UCaskg de bromelina Bh
Bb y Pm a fin de poder compararlas La dosis que se eligioacute fue aquella que en los ensayos in
vitro para todos los preparados evaluados prolongara el TP y el TTPa maacutes de 180 s De la
informacioacuten provista por la figura 46 se puede concluir que a partir de la concentracioacuten de 155
UCasmL de plasma se cumple con dicho requisito Por tanto se optoacute por una dosis de 2
UCasmL de plasma equivalente a 633 UCaskg de animal (aplicando la ecuacioacuten antes
mencionada) que fue redondeada a 65 UCaskg
En la Figura 49 se exponen los valores de TP y de TTPa de ppp extraiacutedos luego de 4 h
de la administracioacuten intraperitoneal de los preparados proteoliacuteticos El tiempo de 4 h fue
establecido de experimentos previos con bromelina
Figura 49 TP y TTPa de ppp obtenido de ratas Wistar luego de 4h de la administracioacuten intraperitoneal de 65 UCaskg de bromelina (Bro) Bh Bb y Pm Valores expresados como la media plusmn SEM Nuacutemero de replicados (n) 6 (Control Bh Pm) 5 (Bro y Bb) Tukeyacutes test p lt 005 p lt 001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt005
Aunque todos los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos mostraron valores
prolongados de TP y de TTPa respecto a los de los lotes controles soacutelo fueron significativos
(plt005) los tiempos de los lotes tratados con bromelina y el TP del lote tratado con Bb los
cuales significaron alrededor de un 20 de los tiempos del lote control Por otra parte los
tiempos de los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos no se diferenciaron
significativamente entre siacute Tampoco se detectaron alteraciones en los coaacutegulos durante las
medidas de TP y de TTPa
Los resultados obtenidos en los experimentos in vivo e in vitro (Figura 46) coinciden en
que la bromelina ha sido la maacutes efectiva frente a TTPa y a TP y en que Bb es maacutes efectivo para
prolongar el TP que el TTPa De todos modos debe tenerse en cuenta que estos resultados
soacutelo sirven como una primera aproximacioacuten en la determinacioacuten de dosis efectivas
Control Bro Bh Bb Pm 0
10
20
30aa
cca ca
TP
(s)
Control Bro Bh Bb Pm 0
10
20
30
ca
a
cca
ca
TT
Pa (
s)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
116
452 Efecto fibrinogenoliacutetico
En la Figura 410 se muestran las electroforesis junto al densitograma respectivo de los
hidrolizados obtenidos luego de incubar 200 μL de fibrinoacutegeno bovino 12 mgmL con 075 μL de
cada preparado proteoliacutetico equivalente a 1 UCasmL durante 2 30 60 90 120 y 180 min a 37
ordmC El tiempo 0 min corresponde al blanco de reaccioacuten resultante de inactivar el preparado
proteoliacutetico con iodoaceacutetico y buffer de muestra antes de mezclarlo con la solucioacuten de
fibrinoacutegeno
La similitud entre los perfiles electroforeacuteticos obtenidos con todos los preparados estariacutea
indicando una similar actividad proteoliacutetica frente al fibrinoacutegeno ya sea por la preferencia de
sustrato como por la velocidad de reaccioacuten La primera subunidad en ser degradada
completamente fue Aα hecho observado para todos los preparados a los 2 min de incubacioacuten
Le siguioacute Bβ a los 30 min mientras que la subunidad γ fue la maacutes resistente permaneciendo
intacta durante 180 min de incubacioacuten con cada preparado Otra caracteriacutestica comuacuten
observada en todas las electroforesis fue la presencia de un polipeacuteptido de alrededor de 30
kDa aunque en menor cantidad luego de incubar con Bh que probablemente sea producto de
degradacioacuten de la subunidad Bβ puesto que aparece luego de su desaparicioacuten
Para determinar si la resistencia de la subunidad γ a ser degradada por los preparados
es absoluta se incuboacute el fibrinoacutegeno con una concentracioacuten mayor de cada preparado de
manera de aumentar en 100 veces la relacioacuten enzimasustrato Los perfiles electroforeacuteticos
obtenidos luego de incubar 68 μL de fibrinoacutegeno 34 mgmL con 7 μL de 10 UCasmL de cada
preparado durante 10 y 120 min a 37 ordmC se muestran en la Figura 411
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
117
Figura 410 Tricina-SDS-PAGE de fibrinoacutegeno bovino antes (calle 2) y luego de incubarlo a 37ordmC durante 2 30 60 90 120 y 180 min (calles 4 5 6 7 8 y 9 respectivamente) con bromelina (Bro) Bh Bb y Pm Calle 3 blanco de reaccioacuten (0 min) Calle 1 patrones de peso molecular (Bio-Rad) A la derecha de cada electroforesis se encuentra el densitograma respectivo Son indicadas con flechas las subunidades Aα (α) Bβ (β) y γ del fibrinoacutegeno
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Bro
a b g
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Bh
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)Bb
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Pm
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
118
Figura 411 Tricina-SDS-PAGE de fibrinoacutegeno bovino antes (calle 2) y luego de incubarlo a 37ordmC durante 10 y 120
min con bromelina (Bro) Bh Bb y Pm (calles 3 4 5 y 6 respectivamente) Calle 1 patrones de peso molecular (Bio-Rad) A la derecha de cada electroforesis se encuentra el densitograma respectivo Son indicadas con flechas las subunidades Aα Bβ y γ del fibrinoacutegeno
Puede observarse que hubo una disminucioacuten en la banda correspondiente a la
subunidad γ a partir de los 10 min de incubacioacuten con cada preparado y que siguioacute disminuyendo
hasta casi desaparecer a los 120 min lo cual confirma que si bien la subunidad γ es altamente
resistente a la accioacuten de las proteasas finalmente es susceptible de ser degradada
A diferencia de lo observado en los ensayos de medidas del efecto anticoagulante la
misma cantidad de UCasmL de cada preparado tuvo un efecto similar sobre el fibrinoacutegeno
Esto puede deberse a que en el plasma cada preparado puede actuar tambieacuten sobre otros
componentes del sistema hemostaacutetico como asiacute tambieacuten pueden ser inhibidos de manera
diferente por α2-MG
Si bien el efecto fibrinogenoliacutetico fue evaluado usando fibrinoacutegeno bovino dada la
escasa diferencia estructural y funcional entre los fibrinoacutegenos de diferentes especies (Weisel
2005) el efecto sobre la subunidad Aα puede servir para explicar la alteracioacuten del coaacutegulo
formado luego de incubar el pool de ppp con los preparados La regioacuten C-α de Aα una vez
producida la liberacioacuten de los fibrinopeacuteptidos A y B produce la agregacioacuten lateral de microfibras
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
10 min
120 min
a b g
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) Bro(4) Bh
(5) Bb(6) Pm
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(4) Bh
(5) Bb(6) Pm
(3) Bro
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
119
de fibrina contribuyendo al espesor de la fibra la resistencia a la traccioacuten de la fibrina (Undas amp
Arieumlns 2011) y la rigidez macroscopia observada (Purohit et al 2011)
Por otro lado dado que el fibrinoacutegeno une las plaquetas favoreciendo la agregacioacuten
plaquetaria se podriacutea suponer que Bh Bb y Pm a traveacutes de su accioacuten fibrinogenoliacutetica
afectaraacuten dicho proceso
453 Efecto fibrinoliacutetico
El efecto de los preparados sobre la fibrina fue evaluado mediante el ensayo de la placa
de fibrina En la Figura 412 se muestran los graacuteficos en escala doble logariacutetmica de
(a) la actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la actividad caseinoliacutetica (UCasmL) y
(b) la actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas (μgmL)
Figura 412 Ensayo de la placa de fibrina a Actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la actividad
caseinoliacutetica (UCasmL) y b actividad fibrinoliacutetica en funcioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas (μgmL) de bromelina (Bro) Bh Bb Pm y plasmina en escala doble logariacutetmica (Log-Log) Valores expresados como la media plusmn DE
En las tablas 421 y 422 se muestran los paraacutemetros de correlacioacuten lineal
(GraphPadPrism) determinados para cada preparado seguacuten la relacioacuten log A = b + alog C
siendo A la actividad fibrinoliacutetica y C la concentracioacuten del preparado (Jespersen amp Astrup
1983)
Actividad fibrinoliacutetica-Actividad caseinoliacutetica
Paraacutemetros Bro Bh
Bb
Pm
a 022c plusmn 002 063
a plusmn 003 063
a plusmn 004 052
b plusmn 002
b 417 plusmn 001 369 plusmn 002 368 plusmn 003 378plusmn 002
r2
09017 09775 09639 09767
N 12 14 11 13
Tabla 421 Paraacutemetros de correlacioacuten lineal de la relacioacuten Log-Log entre actividad fibrinoliacutetica y actividad
caseinoliacutetica a pendiente b Log A (cuando C=1 UCasmL) N nuacutemero de puntos Letras superiacutendices distintas indican diferencias significativas (p lt 005)
a b
-05 00 05 10 1530
35
40
45
50
Actividad caseinoliacutetica (UCasmL)
Ac
tiv
ida
d f
ibri
no
liacuteti
ca
(m
m2m
L)
1 2 3 430
35
40
45
50
Pm
Bh
Bro
Plasmina
Bb
Concentracioacuten de proteiacutenas (gmL)
Ac
tiv
ida
d f
ibri
no
liacuteti
ca
(m
m2m
L)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Actividad fibrinoliacutetica-Proteiacutenas
Paraacutemetros Bro Bh Bb
Pm Plasmina
a 022c plusmn 002 062
b plusmn 004 062
b plusmn 004 052
b plusmn 002 023
c plusmn 002
b 363 plusmn 007 24 plusmn 01 26 plusmn 01 261plusmn 006 388plusmn 003
r2
08884 09586 09624 09812 09575
N 12 14 11 13 8
Tabla 422 Paraacutemetros de correlacioacuten lineal de la relacioacuten Log-Log entre actividad fibrinoliacutetica y proteiacutenas a
pendiente b Log A (cuando C=1 μgmL) N nuacutemero de puntos Letras superiacutendices distintas indican diferencias significativas (p lt 005)
Tanto para la relacioacuten entre actividad fibrinoliacutetica y actividad caseinoliacutetica como para la
relacioacuten entre actividad fibrinoliacutetica y proteiacutenas puede observarse que la pendiente a y la
ordenada al origen b de Bh Bb y Pm fueron similares entre siacute y diferentes significativamente de
las de bromelina En la tabla 422 se puede observar que bromelina y plasmina tuvieron
similares pendientes a lo cual permite expresar la actividad fibrinoliacutetica de la bromelina en
unidades de plasmina (Jespersen amp Astrup 1983) En este caso 1 μg de bromelina equivale a
007 μg de plasmina humana (P1867 Sigma Adrich)
La existencia de diferentes pendientes estariacutea indicando diferentes mecanismos
intriacutensecos (Jespersen amp Astrup 1983) En este sentido un factor que puede estar influyendo en
el valor del aacuterea de lisis ademaacutes de la actividad proteoliacutetica es la difusioacuten de las proteasas en
la red de fibrina Puesto que todas las proteasas tienen pesos moleculares similares (entre 22 y
25 kDa) y que las soluciones ensayadas de Bh Bb y Pm se prepararon al disolver el liofilizado
(a partir de una solucioacuten de buffer fosfato soacutedico 01M pH 6) en agua mientras que la bromelina
se disolvioacute en buffer de placa (barbital 0045 M pH 775 NaCl 92 mM) se supuso que el medio
de resuspensioacuten podriacutea estar influyendo Sin embargo no se encontraron diferencias
significativas entre las aacutereas de lisis medidas para bromelina disuelta en diferentes molaridades
del buffer fosfato soacutedico de pH 6 (BF) respecto al aacuterea medida para la bromelina disuelta en el
buffer de placa (BP) como asiacute tampoco se hallaron diferencias significativas entre las
pendientes y las ordenadas al origen de las curvas de actividad fibrinolitica en relacioacuten a la
concentracioacuten de bromelina disuelta en BF o BP (Figura 413)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
121
Figura 413 Efecto del buffer de resuspensioacuten sobre la actividad fibrinoliacutetica de bromelina A Actividad fibrinoliacutetica (mm
2mL) en funcioacuten de la concentracioacuten (mgmL) en escala doble logariacutetmica BF buffer fosfato soacutedico 01 M pH 6
B Actividad fibrinoliacutetica (mm2gota sembrada) para 35 mgmL de bromelina disuelta en diferentes molaridades de BF
de pH 6 Valores expresados como la media plusmn DE
Por lo tanto puede concluirse que bromelina demuestra poseer una mayor actividad
fibrinoliacutetica que Bh Bb y Pm para concentraciones menores a 10 UCasmL mientras que para
concentraciones mayores a 10 UCasmL Bh Bb y Pm tendriacutean mayor actividad fibrinoliacutetica que
bromelina
Una comparacioacuten de la actividad fibrinoliacutetica (412 a) y del efecto anticoagulante (Figura
46) de los preparados permite observar que para prolongar el TP y el TTPa a maacutes de 180 s
bromelina requirioacute aproximadamente 3 veces maacutes de actividad fibrinoliacutetica (entre 136 x103 y
144 x103 mm2mL) que Bh Bb y Pm (entre 52 x103 y 64 x103 mm2mL) Expresado en otros
teacuterminos bromelina muestra mayor efecto fibrinoliacutetico que Bh Bb y Pm sin afectar el TP y el
TTPa lo cual podriacutea llevar a suponer que resultariacutea maacutes ventajosa como agente fibrinoliacutetico
para el tratamiento de algunos de los desoacuterdenes tromboacuteticos (Merli 2007) Sin embargo se
trata de una comparacioacuten entre dos sistemas distintos que tampoco presentan la complejidad
de una trombosis Futuros ensayos fundamentalmente en modelos in vivo son necesarios para
afianzar o descartar estos resultados preliminares
Actividad fibrinoliacutetica de Bromelina (35mgmL)Efecto del buffer de resuspensioacuten
005M 02M 04M Buffer de placa0
50
100
150
200
250
Buffer fosfato soacutedico pH 6
Buffer de resuspensioacuten
mm
2
BromelinaEfecto del buffer de resuspensioacuten
00 05 10 1540
41
42
43
44
45
BF (01M)
BP (005 M)
Concentracioacuten (mgmL)
Acti
vid
ad
fib
rin
oliacuteti
ca (
mm
2m
L)
A B
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
122
46 Conclusiones
Todos los preparados mostraron actividad anticoagulante en los ensayos in vitro efectos
completamente atribuibles a la accioacuten proteoliacutetica de las cisteiacutenendopeptidasas
presentes en Bh y Bro pero parcialmente a las cisteiacutenendopeptidasas de Pm y Bb
Bromelina Bh y Pm fueron maacutes efectivas para prolongar el TTPa de un pool de ppp que
el TP mientras que Bb fue maacutes efectiva para prolongar el TP que el TTPa
Para todos los preparados el efecto sobre el TP y sobre el TTPa fue acompantildeado de un
efecto sobre la caracteriacutestica del coaacutegulo formado (filamentoso fraccionado fraacutegil) el
cual revirtioacute cuando las proteasas fueron inhibidas con E-64
En los ensayos in vivo soacutelo bromelina y Bb con dosis equivalentes en unidades
caseinoliacuteticas tuvieron un leve efecto anticoagulante
Todos los preparados con unidades caseinoliacuteticas equivalentes degradaron el
fibrinoacutegeno con una cineacutetica similar siendo la subunidad Aα la primera en ser degradada
y γ la maacutes resistente
Todos los preparados mostraron accioacuten fibrinoliacutetica siendo maacutes efectiva la bromelina
para concentraciones menores a 10 UCasmL
La bromelina mostroacute un comportamiento similar frente a la fibrina que la plasmina
Los resultados obtenidos en los ensayos permiten concluir que Bh Pm y en especial Bb
podriacutean tener un potencial efecto antitromboacutetico y tromboliacutetico hecho que deberaacute
evaluarse en otros modelos experimentales
Los resultados obtenidos para Bh Pm y Bb pueden ser de utilidad para el disentildeo de
futuros ensayos a los fines de establecer su efectividad como agentes para el
tratamiento de trombosis
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
125
51 Las causas de la aparicioacuten del caacutencer
El caacutencer sigue siendo una de las enfermedades que maacutes preocupan a la
humanidad auacuten cuando no ocupe el primer lugar entre las principales causas de muerte en
el mundo Si bien la ciencia ha ido aportando sucesivos conocimientos en diferentes
aspectos hecho que ha permitido incrementar los mecanismos de prevencioacuten y de
tratamiento se encuentra auacuten sin respuesta la pregunta relacionada con las verdaderas
causas de la enfermedad (Gibbs 2003) Una explicacioacuten posible es que una ceacutelula debe
adquirir habilidades extraordinarias para convertirse en ceacutelula maligna hace poco maacutes de
una deacutecada Hahn amp Weinberg (2002) describieron las condiciones que debe reunir una
ceacutelula normal para convertirse en canceriacutegena a las que denominaron ldquolos seis
superpoderes diaboacutelicos del caacutencerrdquo ilustrados en la Figura 51 y que se describen a
continuacioacuten
1 Crecimiento en ausencia de sentildeales La mayoriacutea de las ceacutelulas normales esperan un
mensaje externo antes de comenzar a dividirse Las ceacutelulas cancerosas a menudo
falsifican sus propios mensajes pro-crecimiento
2 Crecimiento a pesar de oacuterdenes de detencioacuten A medida que el tumor se expande
comprime al tejido adyacente el cual enviacutea mensajes quiacutemicos que normalmente
detienen la divisioacuten celular Las ceacutelulas malignas ignoran tales oacuterdenes asiacute como los de
sus propios mecanismos internos de envejecimiento
3 Evasioacuten de los mecanismos de autodestruccioacuten En las ceacutelulas sanas el dantildeo geneacutetico
por encima de un nivel criacutetico usualmente activa un programa suicida Las ceacutelulas
cancerosas eluden este mecanismo aunque a veces algunos agentes del sistema
inmune pueden obligar a las ceacutelulas cancerosas a autodestruirse
4 Construccioacuten de nuevos vasos sanguiacuteneos Los tumores necesitan oxiacutegeno y nutrientes
para sobrevivir que obtienen obligando a que los vasos sanguiacuteneos vecinos formen
nuevas ramas que se desarrollen a lo largo de la masa tumoral en crecimiento
5 Inmortalidad efectiva Las ceacutelulas sanas usualmente no se dividen maacutes de 70 veces pero
las ceacutelulas malignas necesitan un nuacutemero mayor de divisiones para formar tumores El
envejecimiento celular parece estar relacionado con los teloacutemeros ubicados a ambos
extremos de cada cromosoma La telomerasa permite mantener la longitud normal de los
teloacutemeros solamente en ceacutelulas sexuales no en el resto de las ceacutelulas del organismo Sin
embargo las ceacutelulas canceriacutegenas son capaces de desarrollar actividad telomeraacutesica lo
que praacutecticamente las torna inmortales
6 Poder para invadir otros tejidos y extenderse a otros oacuterganos Cuando las ceacutelulas
cancerosas logran deshabilitar el circuito celular que las confina a una parte especiacutefica
del oacutergano en el cual se generaron se manifiesta la capacidad de invadir los tejidos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
126
cercanos y provocar metaacutestasis en partes lejanas de su ubicacioacuten original lo que le da al
caacutencer su caraacutecter letal
Figura 51 Ilustracioacuten de las seis principales capacidades desarrolladas por las ceacutelulas caacutenceriacutegenas (tomado de
Hanahan amp Weinberg 2011)
A favor de la manifestacioacuten de estas caracteriacutesticas de las ceacutelulas tumorales juega un
rol fundamental la inestabilidad del genoma que genera la diversidad geneacutetica que facilita
su aparicioacuten asiacute como la inflamacioacuten que tambieacuten fomenta muacuteltiples funciones distintivas
Como resultado del avance conceptual en la uacuteltima deacutecada se han antildeadido dos nuevas
caracteriacutesticas a las seis capacidades de las ceacutelulas tumorales antes sentildealadas
involucradas en la patogeacutenesis de algunos y quizaacutes de todos los tipos de caacutencer la
reprogramacioacuten del metabolismo energeacutetico y la capacidad de evadir la destruccioacuten inmune
La primera de ellas consiste en la capacidad de modificar o reprogramar el metabolismo
celular con el fin de apoyar maacutes eficazmente la proliferacioacuten neoplaacutesica La segunda permite
que las ceacutelulas cancerosas puedan evadir la destruccioacuten inmunoloacutegica en particular por
linfocitos T y B macroacutefagos y ceacutelulas asesinas naturales (ldquonatural killersrdquo) Por otra parte la
inflamacioacuten generada por las ceacutelulas inmunes disentildeadas para combatir las infecciones
quizaacutes pueda dar apoyo accidental a las muacuteltiples capacidades de las ceacutelulas tumorales
Pero ademaacutes de las ceacutelulas cancerosas los tumores muestran otra dimensioacuten de
complejidad ya que poseen un repertorio de ldquoceacutelulas reclutadasrdquo ostensiblemente normales
pero que contribuyen a la adquisicioacuten de los rasgos caracteriacutesticos mediante la creacioacuten del
microambiente del tumor (Hanahan amp Weinberg 2011)
52 Epidemiologiacutea del caacutencer
Como se ha mencionado el caacutencer es una de las principales causas de muerte en el
mundo Seguacuten un informe del antildeo 2008 de la Agencia Internacional de Investigacioacuten sobre
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
127
el Caacutencer (IARCWHO 2008) esta enfermedad produjo 76 millones de muertes (alrededor
del 13 del total) de las cuales aproximadamente el 70 ocurrieron en paiacuteses de bajo y
medianos recursos Sin embargo si se evaluacutean las tasas estandarizadas por edad (ASR) de
muerte por caacutencer (excluyendo el caacutencer de piel con histologiacutea distinta al melanoma) cada
100000 habitantes eacutestas no pueden ser correlacionadas con el nivel de ingreso de los
paiacuteses (Figura 52)
Figura 52 Tasa estandarizada por edad (ASR) de mortalidad por caacutencer para ambos sexos cada 100000 habitantes distribuidas por paiacuteses estimadas en el 2008 Fuente IARCWHO 2008
Puede verse que Argentina en relacioacuten al resto del mundo se encuentra en un nivel
medio-alto de mortalidad por caacutencer De acuerdo a un estudio de la Organizacioacuten Mundial
de la Salud (WHO 2011) en nuestro paiacutes el caacutencer representa la segunda causa de muerte
(20) despueacutes de las producidas por las enfermedades cardiovasculares (33) Respecto
a la incidencia de caacutencer (IARCWHO 2008) Argentina ocupa el mismo nivel (medio-alto)
seguacuten las ASR de incidencia de caacutencer cada 100000 habitantes (Figura 53)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
128
Figura 53 Tasa estandarizada por edad (ASR) de incidencia de caacutencer para ambos sexos cada 100000
habitantes distribuidas por paiacuteses estimadas en el 2008 Fuente Fuente IARCWHO 2008
53 Carcinoma Hepatocelular
Dentro de los distintos tipos de caacutencer el carcinoma hepatocelular (CHC) tiene la
seacuteptima ASR de incidencia y la cuarta ASR de mortalidad maacutes alta en el mundo ambas
calculadas al 2008 cada 100000 habitantes y para ambos sexos constituyendo la tercer
causa de muerte por caacutencer Por su parte en Argentina la ASR de incidencia y de mortalidad
ocupan los lugares 16deg y 12deg respectivamente lo cual la ubica en el grupo de paiacuteses con
nivel medio-bajo de incidencia de CHC Tomando el nivel de ingresos de los paiacuteses seguacuten el
Banco Mundial los paiacuteses con niveles de ingresos bajo o medio-bajo son los que
presentaron una mayor ARS de incidencia de CHC (GHOWHO 2008)
531 Factores de riesgo
La heterogeneidad en la incidencia mundial refleja las variaciones en los principales
factores de riesgo de CHC En Asia oriental y en Aacutefrica subsahariana el factor de riesgo
dominante es la infeccioacuten croacutenica con el virus de la hepatitis B (HBV) junto con la exposicioacuten
a la aflotoxina B1 responsables del 80 de los casos de CHC En cambio en Ameacuterica del
Norte Europa y Japoacuten el principal factor de riesgo es la infeccioacuten con el virus de la hepatitis
C junto con la ingesta de alcohol (Forner et al 2012)
En el 70-90 de los pacientes el CHC se desarrolla dentro de una enfermedad
hepaacutetica croacutenica subyacente La infeccioacuten croacutenica con HBV constituye el factor de riesgo
maacutes frecuente el cual se da en maacutes del 50 de los casos con CHC En pacientes con
cirrosis el CHC constituye la principal causa de muerte (Forner et al 2012) Otros factores
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
129
de riesgo son la enfermedad del hiacutegado graso no alcohoacutelico y la diabetes (Stickel amp
Hellerbrand 2010)
532 Patogeacutenesis molecular
El CHC es un tumor epitelial desarrollado a partir de los hepatocitos La
hepatocarcinogeacutenesis es un proceso complejo de muacuteltiples pasos durante el cual se alteran
varias cascadas de sentildealizacioacuten relacionadas con la supervivencia y la proliferacioacuten celular
generando un perfil molecular heterogeacuteneo En maacutes del 50 de los casos de CHC las viacuteas
de sentildealizacioacuten Ras y del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) son activadas
mientras que en el 40-50 la viacutea del MTOR (mammalian Target of Rapamycin complejo
sensible a rapamicina) es interrumpida La viacutea de sentildealizacioacuten del receptor del factor de
crecimiento tipo insulina (IGF1R) se activoacute en 20 de los CHC tempranos mientras que la
desregulacioacuten de la viacutea de c-MET y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es un
evento comuacuten La viacutea de sentildealizacioacuten Wnt es activada en un tercio de los CHC La alta
vascularizacioacuten y actividad angiogeacutenica presente en el CHC estaacute asociada a las viacuteas de
sentildealizacioacuten del factor de crecimiento endotelio vascular (VEGFA) la angiopoyetina 2
(ANGPT2) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (Forner et al 2012)
Las dos mutaciones maacutes frecuentes ocurren en el gen supresor de tumor TP53 (en
alrededor del 25-40 de los casos) y en el gen para β catenina CTNNB1 que se da en
aproximadamente el 25 de los casos y predomina en los CHC relacionados con la
infeccioacuten de HCV (Forner et al 2012)
533 Tratamiento
A pesar de ser un problema de salud mundial importante en los uacuteltimos decenios no
se han producidos avances significativos en el pronoacutestico de la mayoriacutea de los pacientes
(Asghar amp Meyer 2012) La deteccioacuten temprana y el posterior tratamiento es la uacutenica opcioacuten
para alcanzar una supervivencia sin enfermedad a largo plazo Un tratamiento precoz
efectivo estaacute asociado con una supervivencia media superior a los 5 antildeos (Forner et al
2012) Existen varios tratamientos que deberaacuten ser elegidos en relacioacuten al pronoacutestico del
paciente (Llovet et al 1999) Sin embargo no existen suficientes estudios cliacutenicos que
comparen los distintos tratamientos principalmente en el caso de pacientes con un estadio
temprano de la enfermedad (Forner et al 2012)
La reseccioacuten quiruacutergica la ablacioacuten y el trasplante tienen potencial curativo y son las
opciones terapeacuteuticas en la fase temprana de la enfermedad Sin embargo en Occidente y
Japoacuten pudieron ser aplicados solamente en un 30 de los pacientes (Llovet et al 2008)
Ademaacutes la recurrencia representa un serio inconveniente para la reseccioacuten y la ablacioacuten
Los uacutenicos tratamientos no curativos que proporcionan supervivencia son la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
130
quimioembolizacioacuten transarterial (TACE) aplicada en pacientes con grandes caacutenceres o
enfermedad multifocal y el Sorafenib una droga administrada oralmente en pacientes con
CHC avanzado (Forner et al 2012)
54 Terapia enzimaacutetica sisteacutemica en pacientes con caacutencer
Con el propoacutesito de evaluar el beneficio de la administracioacuten de mezclas de enzimas
proteoliacuteticas tales como tripsina quimotripsina papaiacutena o bromelina (terapia enzimaacutetica
sisteacutemica) como complementaria en pacientes que sufren de caacutencer de mama colorrectal y
plasmocitoma se llevaron a cabo estudios de cohorte que representan el nivel IIB de la
medicina basada en evidencia (EBM) aceptados por la Unioacuten Europea para mostrar la
seguridad y la eficacia de los tratamientos meacutedicos Estos estudios demostraron que la
terapia enzimaacutetica sisteacutemica disminuyoacute significativamente los efectos secundarios inducidos
por el tumor y la terapia estabilizoacute la calidad de vida y prolongaron la sobrevida (Beuth
2008)
En cuanto a la bromelina existe abundante evidencia de su efecto anti caacutencer
especialmente en modelos celulares y animales asiacute como en ensayos cliacutenicos Sin
embargo como agente terapeacuteutico para el tratamiento del caacutencer no ha sido objeto de
estudios cliacutenicos controlados aleatorios (Chobotova et al 2010) La actividad anti caacutencer es
atribuida a la actividad proteoliacutetica de sus proteasas las cuales permanecen funcionalmente
intactas luego de ser absorbidas por el tracto gastrointestinal (Maurer 2001) La baja
toxicidad de la bromelina (Moss et al 1963) ha permitido la administracioacuten oral de dosis
altas durante largos periacuteodos y ser bien tolerada (Maurer 2001 Brien et al 2004)
55 Objetivos
Dentro del objetivo general de evaluar el posible efecto antitumoral de los preparados
proteoliacuteticos obtenidos a partir de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) B balansae (Bb) y
Pseudananas macrodontes (Pm) asiacute como de bromelina (Bro) se plantearon los siguientes
objetivos especiacuteficos
Evaluar el efecto de Bh Bb Pm y Bro sobre la viabilidad de ceacutelulas de
hepatocarcinoma humano
Evaluar el efecto de Bh Bb Pm y Bro sobre la adhesioacuten de ceacutelulas de
hepatocarcinoma humano
Comparar los efectos medidos de los preparados y de la bromelina en relacioacuten a la
actividad proteoliacutetica
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
131
56 Materiales y meacutetodos
561 Cultivo celular
Se empleoacute una liacutenea celular de hepatocarcinoma primario humano HepG2 C3A
(ATCC) la cual fue mantenida en medio esencial Dulbecco con alta glucosa (Gibco)
suplementado con suero fetal bovino (SFB) inactivado con calor (Natocor Argentina) al 10
conteniendo 50 UmL de penicilina y 50 μgmL de estreptomocina a 37 ordmC en una atmoacutesfera
humidificada con 5 de CO2 Las ceacutelulas fueron incubadas junto al medio de cultivo en
policubetas de 96 pocillos durante 24 h a fin de permitir su adhesioacuten
562 Tratamientos
Las ceacutelulas crecidas en monocapa a una densidad de 15000 ceacutelulaspocillo fueron
incubadas en 90 μL del medio de cultivo libre de SFB y 10 μL de la solucioacuten del preparado
proteoliacutetico Se ensayaron diferentes concentraciones de cada uno y distintos tiempos de
incubacioacuten luego de los cuales se midioacute la viabilidad y la adhesioacuten celular Como control se
usoacute buffer fosfato soacutedico 002M pH 6 el cual a su vez se ensayoacute frente a agua como
control
Con el objetivo de determinar si los efectos medidos fueron debido a la actividad
proteoliacutetica se hicieron ensayos de adhesioacuten y viabilidad incubando las ceacutelulas con los
preparados proteoliacuteticos tratados y no tratados con solucioacuten 40 μM de E-64 En estos
ensayos el control fue una solucioacuten 40 μM de E-64 en buffer fosfato soacutedico 002 M pH 6
5621 Evaluacioacuten de la viabilidad celular (Ensayo con MTS)
La viabilidad celular fue evaluada mediante un ensayo colorimeacutetrico utilizando el kit
Cell Titer 96 AQueous Non-Radiactive Cell Proliferation Assay (Promega Corp USA) Este
ensayo se basa en que el metabolismo de las ceacutelulas viables produce compuestos
reductores que pueden reducir un derivado de tetrazolio 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-
carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS) en presencia de metosulfonato de
fenazina (PMS) a formazaacuten un producto soluble y coloreado (Buttke et al 1993) Por lo
tanto la cantidad de formazaacuten formado seraacute proporcional al nuacutemero de ceacutelulas viables El
PMS actuacutea como acoplador de electrones entre el producto metaboacutelico y el MTS
Luego de los distintos tratamientos 100 μL de MTS y PMS fueron incorporados al
cultivo celular y despueacutes de incubarlos durante 30 min a 37 ordmC se midioacute la absorbancia a 490
nm en un lector de ELISA (Metertech 960) que es considerada como proporcional al
nuacutemero de ceacutelulas viables Los resultados fueron expuestos como porcentajes de ceacutelulas
viables respecto a los controles
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
132
5622 Ensayo de adhesioacuten celular (Tincioacuten con cristal violeta)
Luego de la incubacioacuten con los distintos preparados proteoliacuteticos el medio de cada
pocillo se descartoacute a fin de eliminar las ceacutelulas no adheridas se lavoacute con solucioacuten salina de
buffer fosfato (PBS) y se agregoacute formaldehido al 37 durante 15 min a temperatura
ambiente para fijar las ceacutelulas adheridas Posteriormente se incuboacute con colorante cristal
violeta al 05 en aacutecido aceacutetico al 3 durante 20 min Luego se lavoacute exhaustivamente y se
agregoacute SDS al 1 para disolver el colorante Finalmente se midioacute la absorbancia a 600 nm
utilizando un lector de ELISA (Metertech 960) que es considerada proporcional al nuacutemero
de ceacutelulas adheridas (Martiacutenez et al 2004) Los resultados fueron expresados como
porcentajes de ceacutelulas adheridas respecto al control
563 Anaacutelisis estadiacutestico
Todos los ensayos fueron realizados por triplicado en tres ensayos independientes
Los promedios de cada ensayo fueron considerados medidas independientes y las
diferencias de las medias de los grupos de tratamiento y del grupo control fueron evaluadas
mediante ANOVA seguido del test de Dunnett Un p lt 005 () fue considerado significativo
Los valores son expresados como la media plusmn SEM
564 Material vegetal ensayado
El contenido proteoliacutetico (UCasmg) y proteico (μg proteiacutenamg) asiacute como la actividad
especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos utilizados se presenta en la Tabla 51
Liofilizados UCasmg μg proteiacutenamg UCasmg proteiacutena
Bh 027 plusmn 005 27 plusmn 2 10
Pm 014 plusmn 001 33 plusmn 3 42
Bb 015 plusmn 001 11 plusmn 1 14
Bromelina (Sigma Aldrich) 065 plusmn 002 209 plusmn 2 31
Tabla 51 Contenido proteoliacutetico (UCasmg) proteico (μg proteiacutenamg) y actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena)
de los extractos ensayados UCas unidades caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC) Media plusmn DE
Para todos los ensayos las soluciones de los extractos fueron preparadas por
resuspensioacuten de los liofilizados en agua destilada mientras que la bromelina fue redisuelta
en buffer fosfato soacutedico 002 M de pH 6
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
133
57 Resultados y discusioacuten
571 Ensayo de viabilidad
En la Figura 54 se exponen los resultados obtenidos del ensayo de viabilidad donde
pueden verse los porcentajes de ceacutelulas HepG2 viables luego de incubarlas durante 24 y 48
h con concentraciones crecientes de bromelina Bh Bb y Pm
Figura 54 Viabilidad de ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett plt005 plt001
plt0001 Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato
soacutedico 0002 M pH 6
Puede observarse que todos los preparados fueron capaces de disminuir la viabilidad
de las ceacutelulas HepG2 a las 48 h de incubacioacuten La bromelina fue la maacutes efectiva ya que por
un lado produjo disminucioacuten significativa con 10 μgmL en tanto que Bh Bb y Pm
requirieron una concentracioacuten de un orden de magnitud superior para mostrar un efecto
similar por otro lado fue la que mostroacute menos de ceacutelulas viables (asymp 40 frente al 65 de
los preparados) para las mayores concentraciones ensayadas A las 24 h de incubacioacuten si
bien las concentraciones maacutes altas de Bb y Pm disminuyeron el porcentaje de ceacutelulas
viables (75 y 71 respectivamente) no fueron significativos mientras que siacute lo fueron los
porcentajes de 100 μgmL de bromelina y 1000 μgmL de Bh (52 y 61 respectivamente)
572 Ensayos de adhesioacuten
En la Figura 55 se exponen los resultados del ensayo de adhesioacuten celular de las
ceacutelulas HepG2 luego de incubarlas durante 1 24 y 48 h con concentraciones crecientes de
bromelina Bh Bb y Pm En la Figura 56 se muestran microfotografiacuteas de las ceacutelulas HepG2
Bromelina
1 10 1000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Bb
18 180 18000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Bh
10 100 10000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Pm
10 100 10000
50
100
150
Control 24 h 48 h
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
134
luego de incubarlas durante 24 h con las concentraciones intermedias de bromelina Bh Bb
y Pm
Figura 55 Adhesioacuten celular de ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett plt001 plt0001
Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato soacutedico 0002 M
pH 6
Todos los preparados tuvieron efecto sobre la adhesioacuten celular Se observoacute una
eliminacioacuten de la adhesioacuten de las monocapas celulares a la superficie plaacutestica de los
pocillos Las ceacutelulas en suspensioacuten adoptaron una forma redondeada Desde la primera h de
incubacioacuten y para las mayores concentraciones ensayadas (100 μgmL de bromelina 1000
μgmL de Bh y de Pm y 1800 μgmL de Bb) se observaron los porcentajes de adhesioacuten maacutes
bajos (entre un 15 y un 30) los cuales no mostraron diferencias significativas (pgt005
Tukey) respecto de los de las 24 y 48 h siguientes de incubacioacuten Tal como sucedioacute en los
ensayos de viabilidad bromelina requirioacute una concentracioacuten de un orden de magnitud
inferior a la de las demaacutes preparaciones para lograr el mismo efecto sobre la adhesioacuten
Bromelina
1 10 1000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Bb
18 180 18000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Bh
10 100 10000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Pm
10 100 10000
50
100
150
Control 1 h 24 h 48 h
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
135
Figura 56 Microfotografiacuteas de campo claro representativas de ceacutelulas HepG2 luego de incubarlas durante 24 h
con los preparados proteoliacuteticos Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato soacutedico 0002 M pH 6
Si se comparan los porcentajes de ceacutelulas adheridas con los porcentajes de ceacutelulas
viables puede observarse que las disminuciones significativas en la viabilidad ocurren 24 h
despueacutes de una disminucioacuten significativa en la adhesioacuten excepto para 100 μgmL de Bh
indicando que la peacuterdida de adhesioacuten conlleva una peacuterdida de la viabilidad La concentracioacuten
de 100 μgmL de Bh mostroacute un menor porcentaje de ceacutelulas adheridas (36) respecto al
control a 1 h de incubacioacuten que no fue seguida de una disminucioacuten significativa de ceacutelulas
viables (85) a las 24 h de incubacioacuten Por otro lado 10 μgmL de Bh a las 48 h de
incubacioacuten mostroacute un porcentaje de ceacutelulas viables (85) que resultoacute ser una disminucioacuten
significativa mientras que el porcentaje de ceacutelulas adheridas 24 h antes (85) no lo fue sin
embargo no parece ser concluyente que la disminucioacuten de la viabilidad no sea precedida por
una disminucioacuten de la adhesioacuten en dicho caso si se toman en cuenta los valores
porcentuales absolutos de adhesioacuten y viabilidad
573 Efecto de la actividad proteoliacutetica sobre los porcentajes de viabilidad y
de adhesioacuten celular
Como se mencionoacute en la introduccioacuten el efecto antitumoral de bromelina es atribuido
preponderantemente a la actividad de sus proteasas (Salas et al 2008 Chobotova et al
2010) Con el fin de determinar si los efectos sobre la viabilidad y adhesioacuten celular medidos
tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los preparados se determinaron los
porcentajes de viabilidad y de adhesioacuten de los mismos tratados y no tratados con E-64 Se
usaron las concentraciones de Bromelina Bh Bb y Pm que mostraron mayores efectos
(100 1000 1800 y 1000 μgmL respectivamente) a las 24 y 48 h de incubacioacuten (Figura 57)
Control Bro (10 gml) Bb (180 gml) Bh (100 gml) Pm (100 gml)
10X
20X
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
136
Figura 57 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas sobre su accioacuten reductora de la viabilidad y la adhesioacuten de
ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett p lt 005 p lt 001 p lt 0001 ns no significativo Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control 4 μM de E-64 en buffer fosfato soacutedico 0002 M pH 6
Puede observarse que los preparados tratados con E-64 no tuvieron efecto
significativo sobre la viabilidad como tampoco sobre la adhesioacuten celular a las 24 y 48 h de
incubacioacuten salvo la concentracioacuten de 1000 μgmL de Pm para la cual se observoacute una
disminucioacuten significativa en el porcentaje de ceacutelulas adheridas (76) a las 24 h que sin
embargo es significativamente superior (p lt 0001 test de Tukey) al porcentaje de adhesioacuten
de Pm activo proteoliacuteticamente (16)
Puede concluirse que el efecto sobre la viabilidad y la adhesioacuten celular de bromelina
Bh y Bb a las 24 y 48 h de incubacioacuten y de Pm a las 48 h seriacutea debido a la actividad
proteoliacutetica de sus cisteiacutenendopeptidasas
A fin de realizar una comparacioacuten entre los distintos preparados en relacioacuten a su
actividad proteoliacutetica en la Tabla 52 se exponen los porcentajes de ceacutelulas viables (V) y
de ceacutelulas adheridas (A) luego de 48 h de incubacioacuten en funcioacuten del contenido de
unidades caseinoliacuteticas (UCasmL) de las concentraciones ensayadas para bromelina Bh
Bb y Pm
0
50
100
150
Sin E-64Con E-64
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Bromelina
(100 gml)
Bb
(1800 gml)
Bh
(1000 gml)
Pm
(1000 gml)
Control
nsns ns
nsns
ns
ns
ns
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
0
50
100
150
Control Sin E-64Con E-64
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Bromelina
(100 gml)
Bb
(1800 gml)
Bh
(1000 gml)
Pm
(1000 gml)
ns ns ns ns nsns
ns
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
137
Preparado proteoliacutetico
UCasmL (x10-3
) V A
Bromelina
065 plusmn 002 91 plusmn 2 91 plusmn 1
65 plusmn 02 69 plusmn 4 23 plusmn 4
65 plusmn 2 44 plusmn 3 20 plusmn 4
Bh
27 plusmn 05 86 plusmn 4 99 plusmn 1
27 plusmn 5 66 plusmn 1 30 plusmn 6
270 plusmn 25 63 plusmn 5 19 plusmn 2
Bb
27 plusmn 02 103 plusmn 4 99 plusmn 3
27 plusmn 2 78 plusmn 7 30 plusmn 7
270 plusmn 20 68 plusmn 3 21 plusmn 2
Pm
14 plusmn 01 95 plusmn 5 96 plusmn 2
14 plusmn 1 70 plusmn 1 31 plusmn 8
140 plusmn 10 65 plusmn 8 20 plusmn 2
Tabla 52 Porcentajes de ceacutelulas viables (V) y de ceacutelulas adheridas (A) en relacioacuten con la actividad proteoliacutetica (UCasmL) de bromelina Bh Bb y Pm luego de incubar ceacutelulas HepG2 durante 48 h Media plusmnSEM Resultados test de Dunnett p lt 005 p lt 001 p lt 0001
Se puede observar que bromelina requiere menos actividad proteoliacutetica que los
demaacutes preparados para mostrar efectos similares hecho que podriacutea deberse a que las
proteasas de bromelina actuacutean conjuntamente mostrando una mayor especificidad hacia
sustratos relacionados con la viabilidad y la adhesioacuten celular presentes en las ceacutelulas de
HepG2 que las proteasas presentes en Bh Bb y Pm A su vez Bh y Bb fueron menos
activas que Pm
La carcinogeacutenesis hepaacutetica estaacute asociada en parte a un cambio en el perfil de las
integrinas expresadas en la superficie del hepatocito las cuales juegan un papel
fundamental en la adhesioacuten y la migracioacuten celular contribuyendo al crecimiento y la invasioacuten
del tumor (Nejjari et al 1999 Massini 2007) Asiacute los bajos porcentajes de adhesioacuten de
ceacutelulas de HepG2 luego de tratarlas con bromelina Bh Bb y Pm permite suponer que
resultaraacuten efectivas para inhibir el crecimiento tumoral en CHC Ademaacutes abre un abanico de
posibles ensayos a realizar a fin de determinar cuaacuteles seriacutean las proteiacutenas superficiales
blanco para cada una de los preparados proteoliacuteticos
En este sentido es importante mencionar que uno de los mecanismos por el cual la
bromelina ejerceriacutea efecto antitumoral es su capacidad para clivar proteiacutenas de la superficie
celular CD44 un marcador de superficie presente en ceacutelulas inmunes y tumorales y que
estaacute asociado con el crecimiento tumoral y la metaacutestasis mostroacute ser sensible a la bromelina
en liacuteneas tumorales murinas y humanas resultando en una reduccioacuten de la invasioacuten y
adhesioacuten al sustrato (Chobotova et al 2010) Fastuosaiacutena otra proteasa cisteiacutenica aislada
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
138
de frutos de Bromelia fastuosa resultoacute activa frente a CD44 en ceacutelulas de melanoma murino
(Guimaratildees-Ferreira et al 2007) En un modelo de melanoma murino la mezcla de
papaiacutena tripsina y quimotripsina redujo la expresioacuten de CD44 y CD45 en el tumor lo cual
fue correlacionado con la supresioacuten del melanoma y la metaacutestasis (Wald et al 2001) Por
tanto dado que las ceacutelulas HepG2 expresan CD44 en su superficie se podriacutea sugerir que
bromelina asiacute como tambieacuten Bh Bb y Pm podriacutean ejercer sus efectos a traveacutes de esta
proteiacutena ademaacutes de las integrinas
La disminucioacuten de la viabilidad celular de HepG2 observada para los preparados
proteoliacuteticos constituye un paso inicial hacia la buacutesqueda de los posibles mecanismos que la
estariacutean mediando Determinar si ha habido arresto celular induccioacuten de apoptosis asiacute
como cuaacuteles son las viacuteas de sentildealizacioacuten involucradas si bien no han sido objetivos de esta
tesis se muestran como prometedores temas para futuros estudios En este sentido existe
evidencia de la capacidad de bromelina para inducir activadores de la apoptosis (p53 y Bax)
en papiloma cutaacuteneo en ratoacuten asiacute como reducir la actividad de reguladores de la
supervivencia celular como Akt y Erk esta uacuteltima de forma contexto celular dependiente
(Chobotova et al 2010) en ceacutelulas de melanoma y carcinoma epideacutermico humano ha
promovido el arresto del ciclo celular en la fase G2M conducieacutendolas a apoptosis (Bhui et
al 2011)
En la Tabla 52 puede observarse que un aumento en 10 veces de la concentracioacuten
de bromelina produjo un cambio importante en el porcentaje de ceacutelulas viables (de 69 a
44) mientras el porcentaje de adhesioacuten permanece aproximadamente constante (20) lo
cual estariacutea indicando que la bromelina podriacutea afectar la viabilidad celular
independientemente de la alteracioacuten de la adhesioacuten celular Esto es diferente a lo observado
en ceacutelulas de glioblastoma humano donde una reduccioacuten en la adhesioacuten la migracioacuten y la
invasioacuten asociada con la reduccioacuten de la integrina α3β1 y el CD44 en la superficie celular no
fue acompantildeada por una disminucioacuten de la viabilidad (Tysnes et al 2001) La aparente
diferencia en el efecto de la bromelina sobre ceacutelulas tumorales humanas podriacutea reflejar una
especificidad de accioacuten lo cual podriacutea hacerla maacutes eficiente como tratamiento frente a
algunos tipos de caacutencer que de otros hecho que hace necesario el estudio sobre mayor
nuacutemero de liacuteneas celulares tumorales humanas (Chobotova et al 2010)
La bromelina no ha sido probada frente a ceacutelulas de HepG2 asiacute como tampoco Bh
Bb y Pm para los cuales estos resultados son los primeros en relacioacuten a la buacutesqueda de
posibles efectos antitumorales Si bien queda una serie de aspectos por investigar
(mecanismos de accioacuten efectos sobre el crecimiento tumoral y metaacutestasis capacidad
migratoria citotoxicidad etc) el presente trabajo constituye un indicio de los potenciales
efectos terapeacuteuticos de proteasas cisteiacutenicas frente al carcinoma hepatocelular
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
139
58 Conclusiones
Extractos ricos en cisteinendopeptidasas de Bromelia hieronymi (Bh) B balansae
(Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) mostraron efecto reductor de la viabilidad y
la adhesioacuten de ceacutelulas de carcinoma hepatocelular (HepG2)
Bh Bb y Pm tuvieron efectos similares en relacioacuten al contenido de unidades
caseinoliacuteticas siendo menores a los mostrados por bromelina
Bh Bb y Pm al igual que bromelina perdieron la accioacuten reductora de viabilidad y
adhesioacuten celular al inhibir la actividad de las cisteinendopeptidasas
Nuevos estudios son necesarios para profundizar el conocimiento de los
mecanismos involucrados en los efectos medidos asiacute como para encontrar otras
acciones que resulten beneficiosas para la terapia de CHC
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
140
59 Referencias
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6 CONCLUSIONES FINALES Y PERSPECTIVAS
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
142
El objetivo general del presente trabajo de tesis doctoral fue estudiar la posible
aplicacioacuten farmacoloacutegica de extractos de tres especies vegetales pertenecientes a la familia
Bromeliaceae Bromelia hieronymi Mez Bromelia balansae Mez y Pseudananas
macrodontes (Morr) Harms autoacutectonas del aacuterea que abarca el NEA y NOA Paraguay
Brasil Bolivia y Colombia Las tres especies habiacutean sido previamente estudiadas en el
LIProVe desde el punto de vista bioquiacutemico habieacutendose aislado y caracterizado diversas
endopeptidasas cisteiacutenicas a partir de sus frutos
A excepcioacuten del uso en medicina popular de B balansae para calmar la tos no
existen referencias sobre aplicaciones medicinales de las especies mencionadas Sin
embargo es abundante la informacioacuten sobre las propiedades antiinflamatorias
antitromboacuteticas inmunomoduladoras y antitumorales de la bromelina un extracto acuoso
obtenido a partir del ananaacute [Ananas comosus (L) Merr] especie tambieacuten perteneciente a la
familia Bromeliaceae y rica en endopeptidasas cisteiacutenicas a las que se atribuyen las
actividades farmacoloacutegicas citadas Por este motivo se decidioacute estudiar los efectos
antiinflamatorios antitumorales anticoagulantes fibrinoliacuteticos y fibrinogenoliacuteticos de
extractos acuosos parcialmente purificados por precipitacioacuten etanoacutelica obtenidos a partir de
frutos de B hieronymi (Bh) B balansae (Bb) y P macrodontes (Pm) en relacioacuten a la
actividad proteoliacutetica de los mismos
En base a los estudios realizados se ha arribado a las siguientes conclusiones
Bh Bb y Pm mostraron efecto antiinflamatorio en modelos animales de
inflamacioacuten aguda al ser administradas intraperitonealmente
En el modelo de inflamacioacuten aguda ensayado (edema de pata de rata inducida por
carragenina) dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica (asymp30 UCaskg) de Bh Pm y
bromelina mostraron efectos antiinflamatorios significativamente similares a 10 mgkg de
indometacina El efecto antiinflamatorio medido para Bb fue menor y en algunos ensayos fue
acompantildeado de signos de toxicidad
El efecto antiinflamatorio medido en este modelo fue dependiente de la actividad
caseinoliacutetica (UCas) de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb y bromelina mientras que soacutelo
parcialmente de las de Pm quedando por determinar si la actividad fibrinoliacutetica de Pm es
causal del efecto antiinflamatorio medido para 0 UCaskg de Pm
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
143
Los efectos antiinflamatorios de Bh Bb Pm y bromelina alcanzaron los maacuteximos
valores entre las 5 y las 7 h de inducido el estiacutemulo inflamatorio tiempos en que se alcanza
el maacuteximo valor de inflamacioacuten Teniendo en cuenta los mediadores involucrados en dicha
fase del modelo seriacutea posible que las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb y Pm ejercieran su
accioacuten sobre la COXPGs la NOSNO y la infiltracioacutenactividad de los neutroacutefilos para cuya
confirmacioacuten deberiacutean orientarse futuras investigaciones sobre el mecanismo de accioacuten de
las mismas en los efectos antiinflamatorios observados
Si bien en una magnitud menor dosis de asymp30 UCaskg de Bh Pm y bromelina
tambieacuten fueron efectivas como antiinflamatorios en el modelo de edema de pata de rata
inducido por serotonina no mostrando efecto significativo sobre el edema inducido por
histamina
Mediante el modelo de inflamacioacuten croacutenica en ratas test del granuloma inducido
por pellet de algodoacuten se observoacute un significativo efecto antiinflamatorio de Pm y
bromelina al ser administradas intraperitonealmente mientras que para Bh y Bb
no se obtuvieron resultados concluyentes
Dado que una dosis de asymp10 UCaskg de Pm mostroacute un efecto antiinflamatorio
equivalente al de una dosis de asymp30 UCaskg de bromelina y que ambos efectos fueron
dependientes de la actividad proteoliacutetica (UCas) las proteasas cisteiacutenicas de Pm mostrariacutean
una mayor especificidad que las de bromelina frente a los efectores proinflamatorios
Si bien los efectos antiinflamatorios de Pm y bromelina fueron significativamente
menores o similares al de dexametasona (3 mgkg) a las dosis ensayadas no mostraron
efectos adversos tiacutepicos de glucocorticoides tales como la peacuterdida de masa corporal y
reduccioacuten del peso del bazo causando significativa reduccioacuten del peso del timo pero entre 3
y 4 veces menos que la dexametasona (3 mgkg)
Los efectos antiinflamatorios medidos para dosis de asymp30 UCaskg de Bh y de Bb no
fueron reproducibles en posteriores ensayos
La accioacuten antiinflamatoria medida en el modelo del granuloma para todos los
preparados proteoliacuteticos fue acompantildeada de un significativo y leve efecto reductor del peso
del timo el cual a su vez fue dependiente de la actividad proteoliacutetica de las proteasas
cisteiacutenicas de Pm y bromelina Dilucidar si este hecho es indicativo de un mecanismo
subyacente de la accioacuten antiinflamatoria o es un efecto independiente de los preparados
proteoliacuteticos podriacutea ser objeto de futuras investigaciones
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
144
Bh Bb y Pm actuaron como anticoagulantes fibrinogenoliacuteticas y fibrinoliacuteticas
Bh Bb y Pm prolongaron los tiempos de protrombina (TP) y de tromboplastina parcial
activada (TTPa) de plasma humano en ensayos in vitro ademaacutes de alterar la consistencia
de los coaacutegulos formados respecto de un plasma no tratado con los preparados Ambos
efectos fueron totalmente dependientes de la actividad proteoliacutetica de las proteasas
cisteiacutenicas excepto los efectos de Bb sobre el TP y el TTPa y de Pm sobre el TTPa los
cuales dependieron parcialmente de las cisteiacutenendopeptidasas sugiriendo la presencia de
otros componentes anticoagulantes
El hecho de que una actividad proteoliacutetica (UCas) equivalente de bromelina Bh Bb y
Pm no produjera efectos anticoagulantes equivalentes da cuenta de las diferentes
especificidades con las que actuariacutea cada preparado sobre los distintos elementos del
sistema de coagulacioacuten
En los ensayos In vivo si bien dosis con equivalente actividad proteoliacutetica (65
UCaskg) de todos los preparados administrados intraperitonealmente prolongaron el TP y el
TTPa soacutelo Bb prolongoacute levemente el TP en forma estadiacutesticamente significativa mostrando
un valor de TP significativamente similar al de la bromelina
El efecto sobre el fibrinoacutegeno fue equivalente cuali y cuantitativamente para
equivalentes actividades caseinoliacuteticas (UCas) de Bh Bb Pm y bromelina siendo la
subunidad Aα del fibrinoacutegeno la maacutes susceptible de ser clivada lo cual podriacutea explicar la
alteracioacuten de la consistencia del coaacutegulo observada en los ensayos de medida de TP y
TTPa
Como agentes fibrinoliacuteticos Bh Bb y Pm tuvieron un comportamiento similar y
significativamente diferente al de bromelina la cual a su vez mostroacute un comportamiento
significativamente similar a la plasmina A equivalentes valores de actividad caseinoliacutetica
(UCas) la bromelina mostroacute mayor especificidad que Bh Bb y Pm frente a la fibrina
respecto a los componentes de la cascada de la coagulacioacuten
Los efectos fibrinogenoliacutetico anticoagulante y fibrinoliacutetico medidos para Bh Bb y Pm
los ubica como potenciales agentes antitromboacuteticos o tromboliacuteticos lo cual deberaacute ser
evaluado en modelos de trombosis Las relaciones establecidas entre dichos efectos y el
contenido proteoliacutetico de los preparados podraacuten ser de utilidad al momento de establecer
dosis asiacute como interpretar resultados en futuros ensayos de trombosis
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
145
En relacioacuten a la accioacuten antiinflamatoria la actividad fibrinoliacutetica de Bh Bb y Pm
puede contribuir al mecanismo de accioacuten anti-edema evaluado in vivo hecho que ya ha sido
corroborado para bromelina en tanto que para Bh Bb y Pm ello queda supeditado a futuras
investigaciones dirigidas a dilucidar los mecanismos subyacentes a los efectos
antiinflamatorios medidos
Bh Bb Pm y bromelina disminuyeron significativamente la viabilidad y la
adhesioacuten de ceacutelulas de carcinoma hepatocelular (HepG2)
Los efectos sobre la viabilidad y la adhesioacuten dependieron de la actividad proteoliacutetica
de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina siendo las proteasas de bromelina
las maacutes especiacuteficas en relacioacuten a las de Bh Bb y Pm
Estos resultados abren camino a futuros ensayos dirigidos no soacutelo a estudiar los
mecanismos de accioacuten a traveacutes de los cuales Bh Bb Pm y bromelina afectariacutean las ceacutelulas
de HepG2 sino tambieacuten para evaluar los efectos sobre otros modelos maacutes complejos
Los efectos antiinflamatorios asiacute como anticoagulantes y fibrinoliacuteticos de Bh Bb y Pm
constituyen cualidades con potenciales efectos terapeacuteuticos en el tratamiento sisteacutemico del
caacutencer delineando otra posible liacutenea de investigacioacuten futura
En siacutentesis el presente trabajo ha pretendido aportar informacioacuten novedosa acerca
de la posible importancia farmacoloacutegica de principios activos en este caso proteasas de tipo
cisteiacutenico presentes en plantas que crecen en nuestro paiacutes y que podriacutean enriquecer el no
demasiado extenso acervo de fitofaacutermacos en uso en este momento Por tratarse de
resultados preliminares seraacute necesario en caso de resultar de intereacutes la realizacioacuten de
estudios posteriores y de mayor complejidad que confirmen el potencial farmacoloacutegico de los
preparados estudiados en el marco de la seguridad en cuanto a los riesgos toxicoloacutegicos
que pueda presentar el uso de los mismos
Agradecimientos
A la Facultad de Ciencias Exactas de La Universidad Nacional de La Plata por haberme permitido
realizar mis estudios de grado y posgrado
Al Consejo Nacional de Investigaciones Cientiacuteficas y Teacutecnicas por brindarme las becas para la
realizacioacuten del presente Trabajo de Tesis
Al LIProVe y en especial al Dr Neacutestor O Caffini por ofrecerme el Lugar de Trabajo por su
predisposicioacuten para ayudarme y enorme paciencia para ensentildear
A la Secretariacutea de Poliacuteticas Universitarias del Ministerio de Educacioacuten de La Nacioacuten que a traveacutes del
Programa Inter-U me brindoacute los medios econoacutemicos para los viajes a San Luis donde realiceacute parte
del trabajo experimental aquiacute presentado
A Veroacutenica Laacutezaro quien actuoacute eficientemente en la gestioacuten del Programa Inter-U dentro de La
Facultad de Ciencias Exactas de La Universidad Nacional de La Plata
A la Dra Alejandra E Rotelli mi codirectora de beca por la ensentildeanza y direccioacuten de los ensayos con
modelos animales asiacute como por la colaboracioacuten en la realizacioacuten de los mismos en la Facultad de
Quiacutemica Bioquiacutemica y Farmacia de la Universidad Nacional de San Luis
A la Dra Mariacutea Fernanda Troncoso por la ensentildeanza y colaboracioacuten en la realizacioacuten de los ensayos
con ceacutelulas tumorales en el IQUIFIB Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica de la Universidad de Buenos
Aires y por la correccioacuten del capiacutetulo ldquoEfecto antitumoralrdquo
A la Bioq Mariana Marta Gonzalez de la Caacutetedra de Hematologiacutea de la Facultad de Ciencias Exactas
de la Universidad Nacional de La Plata por la ensentildeanza y colaboracioacuten en los ensayos de
coagulacioacuten y en la obtencioacuten de los pooles de plasma
A la Bioq Anabela Prospitti por la colaboracioacuten en la obtencioacuten de los pooles de plasma
A los Dres Mariana Gomez y Pastor Arenas quienes muy amablemente nos proporcionaron material
bibliograacutefico en relacioacuten a los usos de las bromeliaacuteceas en nuestro paiacutes
A los Dres Mariela Bruno y Marcelo Pardo quienes me ensentildearon los primeros pasos en las teacutecnicas y
metodologiacuteas para el estudio de las proteasas vegetales
En el plano afectivo
A M Fernanda Troncoso por toda su predisposicioacuten y calidez humana
A Mariana y Susana por la buena onda y el compantildeerismo durante las mantildeanas en el laboratorio de
Hematologiacutea
A los integrantes de la Caacutetedra de Farmacologiacutea de la Facultad de Quiacutemica Bioquiacutemica y Farmacia de
la Universidad Nacional de San Luis en especial a Graciela Ameacuterico Alejandra Lily Susana
Mariano y muy especialmente a Ale por la calidez humana el buen humor los brindis y las cenas los
paseos por el surrealismo puntano y los mates frente al arroyo
A los integrantes (algunos ex) del LIProVe en especial a Cacho (Caffini) Ana (Prospitti) Jose (Torres)
Ine (Martin) Martiacuten (Lazza) Euge (Tavarone) Suacute (Morcelle del Valle) Celes (Branda) Franco
(Bernabei) Claudia (Natalucci) y Laura (Lopez) por los tiempos compartidos el ldquosoporterdquo en
momentos difiacuteciles el buen humor y el compantildeerismo Gracias por la paciencia Cacho
A Meli Ana y Guille por simplemente COMPARTIR
A mis viejos mis hermanos a Alfon y Ernes por lo que aprendiacute y volviacute a aprender por las risas y los
abrazos
A Leo por el aguante (PArsquo CIENCIA) los horizontes (se hicieron anchos) y la certeza de que las
palabras no me alcanzaraacuten
Algunos de los resultados presentados en esta Tesis Doctoral han sido objeto de las
siguientes publicaciones yo comunicaciones en reuniones cientiacuteficas
Publicaciones
Errasti M E Caffini N O Pelzer L E amp Rotelli A E (2013) ldquoAnti-inflammatory
Activity of Bromelia hieronymi Comparison with Bromelainrdquo Planta Medica 79 207-
213
Mariacutea E Errasti Neacutestor O Caffini Lilian E Pelzer and Alejandra E Rotelli (2013)
ldquoEvaluation of anti-inflammatory activity of Pseudananas macrodontes (Morr) Harms
fruit extract (Bromeliaceae) in ratsrdquo Zeitschrift fuumlr Naturforschung C (aceptado y en
proceso de revisioacuten)
Comunicaciones en reuniones cientiacuteficas
Errasti ME Bruno MA Rotelli AE Caffini NO Pelzer LE ldquoAntiinflammatory
activity of a partially purified extract from Bromelia hieronymi fruitsrdquo XLI Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Rosario
Santa Fe Argentina 24 al 26 de Noviembre de 2009
Errasti ME Caffini NO Rotelli AE Pelzer L ldquoAccioacuten antiinflamatoria de un
extracto de frutos de Bromelia hieronymi en un modelo de inflamacioacuten croacutenica en
ratasrdquo XLII Reunioacuten Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental
(SAFE) Mar del Plata Buenos Aires Argentina 17 al 20 de Noviembre de 2010
Errasti ME Rotelli AE Gonzaacutelez MM ldquoEvaluacioacuten in vitro de la accioacuten fibrinoliacutetica
y sobre la coagulacioacuten sanguiacutenea de extractos de Bromeliaceasrdquo XLIII Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Tucumaacuten
Argentina 2 al 4 de Noviembre de 2011
Errasti ME Caffini NO Rotelli AE Pelzer L ldquoExtractos de Pseudananas
macrodontes y Bromelia balansae con accioacuten antiinflamatoria en un modelo de
inflamacioacuten croacutenica en ratasrdquo XLIII Reunioacuten Anual de la Sociedad Argentina de
Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Tucumaacuten Argentina 2 al 4 de Noviembre de
2011
Errasti ME Caffini NO Pelzer LE Rotelli AE ldquoRelacioacuten entre efecto
antiinflamatorio y accioacuten proteoliacutetica de extractos de Bromeliaceasrdquo XLIV Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Mendoza
Argentina 31 de Octubre al 2 de Noviembre de 2012
Errasti ME Caffini NO Troncoso MF ldquoAccioacuten de extractos de Bromeliaceas sobre
la adhesioacuten y viabilidad de ceacutelulas de carcinoma hepatocelularrdquo XLIV Reunioacuten Anual
de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Mendoza
Argentina 31 de Octubre al 2 de Noviembre de 2012
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
i
Indice
1 Introduccioacuten general y Objetivos
11 Productos Naturales Medicina Tradicional y Fitomedicinas 1
12 Generalidades de la familia Bromeliaceae 3
121 Importancia Usos 5
1211 Uso comestible 5
1212 Obtencioacuten de fibras 6
1213 Usos medicinales 7
13 Tipos de Proteasas Distribucioacuten y Rol en los Vegetales 9
131 Proteasas Tipos y sistemas de clasificacioacuten 9
1311 Sistema EC de clasificacioacuten de enzimas 10
1312 El Sistema MEROPS de clasificacioacuten de peptidasas 11
132 Distribucioacuten de proteasas en los seres vivos 12
133 Rol de las peptidasas en los vegetales 13
1331 Peptidasas cisteiacutenicas 14
14 Enzimas Proteoliacuteticas de Bromeliaceae 16
141 Endopeptidasas del ananaacute 16
1411 Bromelina de tallo 17
1412 Ananaiacutena 17
1413 Comosaiacutena 18
1414 Bromelina de fruto 18
142 Balansaiacutena 18
143 Hieronymaiacutenas 19
1431 Hieronymaiacutena I 19
1432 Hieronymaiacutena II 19
1433 Hieronymaiacutena III 20
144 Macrodontaiacutenas 20
15 Objetivos 21
16 Referencias 23
2 Material Vegetal
21 Material Vegetal Utilizado 28
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
ii
211 Bromelia hieronymi Mez 28
2111 Extracto parcialmente purificado de frutos de B hieronymi (Bh) 28
212 Bromelia balansae Mez 28
2121 Extracto parcialmente purificado de frutos de B balansae (Bb) 29
213 Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [=P sagenarius (Arruda) Camargo]29
2131 Extracto parcialmente purificado de frutos de P macrodontes (Pm) 29
214 Ananas comosus (L) Merr 30
215 Reactivos quiacutemicos 30
22 Caracterizacioacuten proteoliacutetica de los extractos parcialmente purificados (Bh Bb y Pm) y de bromelina 30
221 Teacutecnicas y metodologiacutea 30
2211 Dosaje de la actividad caseinoliacutetica 30
2212 Cuantificacioacuten del contenido proteico 31
2213 Isoelectroenfoque 31
2214 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 32
2215 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina 33
22151 Tratamiento con E-64 33
222 Resultados 33
2221 Perfiles de pI y de peso molecular de Bh Bb y Pm 33
2222 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina 35
23 Referencias 38
3 Efecto antiinflamatorio
31 Inflamacioacuten 39
311 Inflamacioacuten aguda 39
3111 Respuesta vascular 39
3112 Respuesta celular 40
3113 Mediadores quiacutemicos 40
312 Regulacioacuten y resolucioacuten de la inflamacioacuten 43
313 Inflamacioacuten croacutenica 44
314 Proteasas como antiinflamatorios 45
3141 Bromelina 46
31411 Efecto sobre los componentes de la coagulacioacuten 47
31412 Efecto sobre el sistema de calicreiacutenas 47
31413 Efecto sobre la viacutea de la COX y NOS 47
31414 Modulacioacuten de moleacuteculas de superficie celular 47
31415 Activacioacuten celular y produccioacuten de citoquinas 48
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
iii
32 Objetivos 49
33 Materiales y meacutetodos 50
331 Modelos de inflamacioacuten 50
3311 Modelos de inflamacioacuten aguda Edema de pata de rata 50
33111 Edema de pata inducido por carragenina 50
331111 Procedimiento experimental 51
33112 Edema de pata inducido por histamina 51
331121 Procedimiento experimental 51
33113 Edema de pata inducido por serotonina 52
331131 Procedimiento experimental 52
33114 Equipamiento medidas y caacutelculo del volumen de edema 52
3312 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma 53
331 21 Procedimiento experimental 53
3313 Caacutelculo del efecto antiinflamatorio y anaacutelisis estadiacutestico 53
332 Animales 54
333 Dosis 54
334 Material vegetal ensayado 54
34 Resultados y Discusioacuten 56
341 Modelos de inflamacioacuten aguda 56
3411 Edema de pata de rata inducido por carragenina 56
34111 Bromelia hieronymi 56
341111 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina 57
34112 Pseudananas macrodontes 59
341121 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm 60
34113 Bromelia balansae 61
341131 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb 61
3412 Otros modelos de inflamacioacuten aguda 63
34121 Edema de pata inducido por histamina en ratas 63
34122 Edema de pata inducido por serotonina en ratas 64
341221 Bromelia hieronymi 64
341222 Pseudananas macrodontes 65
342 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma 65
3421 Bromelia hieronymi 65
34211 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina
en el test del granuloma 67
3422 Pseudananas macrodontes y Bromelia balansae 69
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
iv
34221 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb en el
test del granuloma 70
34222 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm en el
test del granuloma 71
3423 Posible relacioacuten entre la actividad proteoliacutetica-accioacuten antiinflamatoria-
modulacioacuten sobre poblacioacuten linfocitaria T 74
35 Conclusiones 77
36 Referencias 78
4 Efecto anticoagulante fibrinogenoliacutetico y fibrinoliacutetico
41 Hemostasia 82
411 Vasoconstriccioacuten 82
412 Formacioacuten del trombo plaquetario 82
413 Coagulacioacuten 83
4131 Fase inicial 85
4132 Fase de amplificacioacuten 86
4133 Fase de propagacioacuten 86
4134 Formacioacuten de fibrina 87
4135 Regulacioacuten de la coagulacioacuten 89
414 Fibrinoacutelisis 90
42 Trombosis 91
421 Agentes para el tratamiento de la trombosis 93
4211 Proteasas vegetales como antitromboacuteticos 94
43 Objetivos 95
44 Materiales y meacutetodos 95
441 Efecto anticoagulante 95
4411 Ensayos in vitro 95
44111 Pool de plasma pobre en plaquetas 95
44112 Tiempo de protrombina (TP) 96
44113 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 97
44114 Efecto de la inhibicioacuten de la actividad proteoliacutetica sobre la
accioacuten anticoagulante 98
44115 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados 98
4412 Ensayos in vivo 98
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
v
44121 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados 99
442 Efecto fibrinogenoliacutetico 100
4421 Hidrolizados 100
4422 Tricina-SDS-PAGE 101
443 Efecto fibrinoliacutetico 102
4431 Placa de fibrina 102
4432 Caacutelculos y anaacutelisis de resultados 103
444 Material vegetal 104
45 Resultados y discusioacuten 105
451 Efecto anticoagulante 105
4511 Ensayos in vitro 105
45111 Tiempo de Protrombina (TP) 106
45112 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 108
45113 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de los preparados
proteoliacuteticos sobre su efecto anticoagulante 112
4512 Ensayos in vivo 114
452 Efecto fibrinogenoliacutetico 116
453 Efecto fibrinoliacutetico 119
46 Conclusiones 122
47 Referencias 123
5 Efecto antitumoral
51 Las causas de la aparicioacuten del caacutencer 125
52 Epidemiologiacutea del caacutencer 126
53 Carcinoma Hepatocelular 128
531 Factores de riesgo 128
532 Patogeacutenesis molecular 129
533 Tratamiento 129
54 Terapia enzimaacutetica sisteacutemica en pacientes con caacutencer 130
55 Objetivos 130
56Materiales y meacutetodos 131
561 Cultivo celular 131
562 Tratamientos 131
5621Evaluacioacuten de la viabilidad celular (Ensayo con MTS) 131
5622 Ensayo de adhesioacuten celular (Tincioacuten con cristal violeta) 132
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
vi
563 Anaacutelisis estadiacutestico 132
564 Material vegetal ensayado 132
57 Resultados y discusioacuten 133
571 Ensayo de viabilidad 133
572 Ensayos de adhesioacuten 133
573 Efecto de la actividad proteoliacutetica sobre los porcentajes de viabilidad
y de adhesioacuten celular 135
58 Conclusiones 139
59 Referencias 140
6 Conclusiones finales y perspectivas 142
Agradecimientos 146
1 INTRODUCCIOacuteN GENERAL Y OBJETIVOS
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
1
11 Productos Naturales Medicina Tradicional y Fitomedicinas
Los productos naturales en especial los de origen vegetal han sido una importante
fuente de agentes terapeacuteuticos Los medicamentos derivados de productos naturales
representan alrededor de un 25-30 de los agentes terapeacuteuticos actuales Si bien en las
uacuteltimas deacutecadas debido al avance de la quiacutemica combinatoria la investigacioacuten sobre
productos naturales en la industria farmaceacuteutica ha mostrado una desaceleracioacuten para
algunas enfermedades complejas los productos naturales todaviacutea constituyen una fuente
muy valiosa para la produccioacuten de nuevas entidades quiacutemicas ya que representan
estructuras seleccionados por mecanismos evolutivos durante millones de antildeos (Calixto
2005)
Los ldquoFitomedicamentosrdquo o ldquoFitomedicinasrdquo constituyen una categoriacutea especial de
drogas vegetales Una de las criacuteticas tradicionalmente formuladas a la Medicina Natural o
Medicina Tradicional es la falta de normalizacioacuten o estandarizacioacuten de los materiales
bioloacutegicos pero las fitomedicinas difieren de las asiacute llamadas ldquoplantas medicinalesrdquo en que
estaacuten normalizadas o estandarizadas lo que significa que ciertos compuestos que estaacuten
presentes en el material vegetal se han cuantificado y dilucidado con lo que en principio se
cuenta con un producto final de composicioacuten maacutes o menos constante (Israelsen 1993) en la
medida en que se respeten la eacutepoca y el lugar de recoleccioacuten (Bennett et al 1990)
En contraste con los millones de doacutelares y antildeos de investigacioacuten necesarios para
desarrollar un nuevo medicamento por siacutentesis o incluso desde el prototipo de una fuente
natural el desarrollo de fitofaacutermacos estandarizados exige menos presupuesto y parece ser
perfectamente factible en los paiacuteses en desarrollo Esta aacuterea estaacute recibiendo mucha
atencioacuten en Brasil y en la mayoriacutea de los paiacuteses de Ameacuterica Latina Por otra parte la
comercializacioacuten de las fitomedicinas se ha expandido en todo el mundo durante los uacuteltimos
antildeos especialmente en paiacuteses de Europa como Alemania Francia Italia Reino Unido
Espantildea y maacutes recientemente tambieacuten en los Estados Unidos de Ameacuterica (Calixto 2005)
El intereacutes por las plantas medicinales y las fitomedicinas adopta diferentes
caracteriacutesticas en las diferentes partes del mundo De acuerdo a la Organizacioacuten Mundial de
la Salud aproximadamente el 65-80 de la poblacioacuten de los paiacuteses en desarrollo como
consecuencia de la pobreza y de la imposibilidad de acceso a la medicina moderna
dependen esencialmente de las plantas para la Atencioacuten Primaria de la Salud (Calixto
2005) En todo el continente africano alrededor del 80 de sus habitantes utilizan
fitomedicinas especialmente en el tratamiento de enfermedades que resultan prevalentes
en la zona tales como el VIHSIDA el paludismo la anemia falciforme o drepanociacutetica la
diabetes y la hipertensioacuten Los defensores de las fitomedicinas argumentan que son maacutes
beneficiosas que sus equivalentes sinteacuteticos por ser seguras econoacutemicas aceptables
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
2
culturalmente y adecuadas para tratamientos croacutenicos sugiriendo que su uso deberiacutea
integrarse a la agenda de Salud de dichos paiacuteses (Okigbo amp Mmeka 2006)
La produccioacuten de plantas medicinales y aromaacuteticas tiene una larga tradicioacuten en varios
paiacuteses de Europa tales como el Reino Unido Italia Grecia Alemania Austria y Francia
mientras que en Finlandia Irlanda y Holanda se ha establecido a lo largo de las uacuteltimas
deacutecadas (Verlet amp Leclercq 1998) Desde la deacutecada del 90 se ha producido un
resurgimiento en el intereacutes y el uso de productos de plantas medicinales en Ameacuterica del
Norte y Europa Estudios sobre el uso de plantas medicinales por el puacuteblico norteamericano
han mostrado un aumento en el consumo de casi el 3 de la poblacioacuten en 1991 a maacutes del
37 en 1998 Un factor importante que sin duda contribuyoacute a dicho incremento fue la
promulgacioacuten en ese paiacutes de la legislacioacuten federal de 1994 (Dietary Supplement Health and
Education Act) que facilitoacute la produccioacuten y comercializacioacuten de productos fitomedicinales y
el consiguiente ingreso de varias compantildeiacuteas farmaceacuteuticas importantes en la produccioacuten de
fitomedicinas (Brevoort 1998) En los paiacuteses desarrollados se ha venido dando un aumento
en el uso de la medicina complementaria y alternativa dentro de la cual se incluyen las
fitomedicinas Esto podriacutea deberse ademaacutes de a la tradicioacuten al bajo costo y a una
preocupacioacuten creciente por los efectos adversos de los faacutermacos sinteacuteticos Por otro lado la
esperanza de vida maacutes larga en dichos paiacuteses ha dado como resultado un aumento de los
riesgos de desarrollar enfermedades croacutenicas y debilitantes (las enfermedades coronarias
el caacutencer y la diabetes) y para muchos pacientes la medicina alternativa parece ofrecer
medios menos agresivos para el tramiento de dichas enfermedades que la medicina
alopaacutetica (OMS 2002)
Las Farmacopeas de diversos paiacuteses han recogido en sus monografiacuteas algunas de
las plantas medicinales de mayor difusioacuten La legislacioacuten europea sobre medicamentos
tambieacuten aborda el uso medicinal de los productos procedentes de las plantas El Comiteacute de
Medicamentos a Base de Plantas (HPMC) se constituyoacute en la Agencia Europea de
Medicamentos (EMA) para proporcionar monografiacuteas y entradas de la lista de sustancias y
sus preparados a base de hierbas Mientras tanto se han publicado aproximadamente 100
monografiacuteas donde se define el estaacutendar cientiacutefico y regulatorio vigente para asegurar la
eficacia y la seguridad de las sustancias vegetales y preparados vegetales utilizados en los
medicamentos (Knoumlss amp Chinou 2012)
La Farmacopea de los Estados Unidos de Ameacuterica (USP 32 ndash NF 27) contiene 76
monografiacuteas relacionadas con productos de origen vegetal Si bien existe una farmacopea
herbolaria bastante completa editada con el tiacutetulo de American Herbal Pharmacopoeia eacutesta
no tiene caraacutecter oficial La Farmacopea Mexicana (FEUM) por su parte registra 56
productos vegetales de aplicacioacuten en medicina En la actualidad ambas Farmacopeas
contienen un nuacutemero reducido de monografiacuteas de productos vegetales en comparacioacuten al
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
3
que registran sus homoacutelogas europeas En el caso del coacutedigo mexicano esta ausencia es
auacuten maacutes pronunciada y fue en el antildeo 2000 cuando se inicia un cambio con la publicacioacuten de
la Farmacopea Herbolaria la cual forma parte de la FEUM Esta publicacioacuten marca el inicio
del rescate del arsenal terapeacuteutico conocido y usado en Meacutexico desde siglos atraacutes (Schifter
Aceves et al 2009)
En cuanto a la Farmacopea Argentina en 2008 se renovoacute su Comisioacuten Permanente
quien ya ha producido la uacuteltima versioacuten de la misma (Farmacopea Argentina VIIIa Edicioacuten)
disponible en la paacutegina de la Administracioacuten Nacional de Alimentos Medicamentos y
Tecnologiacutea Meacutedica (ANMAT) en cuatro voluacutemenes1 el tercero de los cuales contiene un
ldquoApartado de Fitoteraacutepicosrdquo que incluye 29 monografiacuteas (ANMAT 2011)
La flora argentina se encuentra representada por maacutes de 8000 especies de plantas
superiores De ellas alrededor de 1600 son utilizadas por la poblacioacuten como ldquoremedio
caserordquo (Rondina et al 2010) en especial por parte de los sectores sociales de menor
acceso a los sistemas de salud
Un estudio sobre el nuacutemero de trabajos publicados entre 1984 y 2004 en revistas
cientiacuteficas indexadas con referato da cuenta del avance que ha tenido en los uacuteltimos antildeos la
investigacioacuten sobre productos naturales (especiacuteficamente plantas) en Ameacuterica Latina siendo
Brasil y luego Meacutexico Argentina y Chile los paiacuteses con mayor nuacutemero de publicaciones Los
estudios de domesticacioacuten produccioacuten biotecnologiacutea y de mejora geneacutetica de las plantas
medicinales son otros campos de la ciencia que se desprenden de tales avances en el uso
de plantas medicinales en Ameacuterica Latina (Calixto 2005)
Latinoameacuterica contiene gran parte de la biodiversidad de todo el mundo pero a pesar
de ello nuestros paiacuteses nunca han podido utilizarla en beneficio de su propio desarrollo
Peor auacuten como consecuencia de la explotacioacuten sin control la mayor parte de las aacutereas
relevantes en cuanto a biodiversidad se ha reducido sensiblemente antildeo tras antildeo mas allaacute
de los esfuerzos esporaacutedicos de algunos gobiernos por preservarla Inclusive el
conocimiento de la medicina tradicional tambieacuten estaacute desapareciendo especialmente el
derivado de las comunidades indiacutegenas originarias (Calixto 2005)
12 Generalidades de la Familia Bromeliaceae
La familia Bromeliaceae estaacute constituida por casi 3700 especies incluidas en 57
geacuteneros Tradicionalmente la familia ha sido subdividida en tres subfamilias Pitcairnioideae
Tillandsioideae y Bromelioideae La subfamilia Pitcairnioideae incluye a las bromeliaacuteceas
maacutes ancestrales y muchas de sus especies recuerdan a la familia de las gramiacuteneas
(Poaceae) de la cual evolucionaron La mayoriacutea son terrestres contando con un sistema
1 httpwwwanmatgovarwebanmatfnaoctava_edicionasp
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
4
extenso de raiacutez La subfamilia Tillandsioideae formada mayoritariamente por especies
epiacutefitas se ha adaptado para sobrevivir en condiciones muy secas las semillas tienen alas
lo que las hace susceptibles de ser dispersadas por el viento y apeacutendices plumosos que les
permite adherirse sobre superficies rugosas Bromelioideae es la subfamilia maacutes diversa
La mayoriacutea de sus especies tambieacuten son epiacutefitas aunque algunas se han adaptado a las
condiciones terrestres Estaacuten compuestas de un arreglo foliar espiralado denominado
ldquorosetardquo donde las bases foliares se superponen parcialmente y pueden funcionar como un
reservorio hiacutedrico Generalmente tienen hojas espinosas y sus semillas son a menudo
distribuidas por los paacutejaros y animales que consumen sus frutos carnosos (Bromeliad
Society International) Pero en base a recientes estudios geneacuteticos (Givnish et al 2011) los
geacuteneros de la subfamilia Pitcairnioideae han sido reagrupados en 6 subfamilias con lo que
la situacioacuten taxonoacutemica actual de las Bromeliaceae es la que se muestra en la Tabla 11
Subfamilia Geacutenero
Brocchinioideae Brocchinia
Lindmanioideae Connellia Lindmania
Hechtioideae Hechtia
Navioideae Brewcaria Cottendorfia Navia Sequencia Steyerbromelia
Pitcairnioideae Deuterocohnia Dyckia Encholirium Fosterella Pepinia Pitcairnia
Puyoideae Puya
Tillandsioideae
Alcantarea Catopsis Glomeropitcairnia Guzmania Mezobromelia
RacinaeaTillandsia Vriesea Werauhia
Bromelioideae
Acanthostachys Aechmea Ananas Androlepis Araeococcus Billbergia
Bromelia Canistropsis Canistrum Cryptanthus Deinacanthon Disteganthus
Edmundoa Eduandrea Fascicularia Fernseea Greigia Hohenbergia
Hohenbergiopsis Lymania Neoglaziovia Neoregelia Nidularium Ochagavia
Orthophytum Portea Pseudaechmea Pseudananas Quesnelia Ronnbergia
Ursulaea Wittrockia
Tabla 11 Subfamilias y geacuteneros de Bromeliaceae (Bromeliad Society International) Los geacuteneros incluidos en
esta subfamilia se encontraban originalmente dentro de las Pitcairnioideae
Las Bromeliaceae poseen un rango de haacutebitat muy amplio desde desiertos caacutelidos y
secos hasta bosques lluviosos y friacuteas regiones montantildeosas mostrando un rango de altitud
que va desde el nivel del mar hasta los 4700 metros La mayoriacutea se distribuye en
Sudameacuterica con el nuacutemero maacutes grande de especies halladas en Brasil se extienden desde
Chile y Argentina a traveacutes de Centroameacuterica y el Caribe alcanzando el liacutemite norte en los
alrededores de Virginia en el sudeste de los EEUU (Smith 1934) Una uacutenica especie
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
5
(Pitcairnia feliciana) ha sido encontrada en el oeste de Aacutefrica (Figura 11) A la Argentina
llegan 13 geacuteneros y alrededor de 120 especies (Flora del Conosur Cataacutelogo de las Plantas
Vasculares)
Figura 11 Distribucioacuten mundial de especies de Bromeliaceae lthttpcommonswikimediaorgwikiImage
WorldBromeliadDistributionjpggt
121 Importancia Usos
En la actualidad los usos ornamentales y comestibles son los maacutes difundidos dentro
de las Bromeliaceae siendo el ananaacute o pintildea (Ananas comosus L) el fruto maacutes ampliamente
consumido en el mundo El primer registro que se tiene data de 1493 cuando Cristobal
Coloacuten vio a los indiacutegenas cultivar la especie en las Antillas y a su regreso a Espantildea la
introduce en el ldquoViejo Mundordquo (Bromeliad Society International)
En Latinoameacuterica diversas especies de Bromeliaceae han sido de gran importancia
para el hombre desde tiempos ancestrales En las distintas regiones se les ha dado un uso
particular que puede ser enmarcado en las siguientes categoriacuteas ceremonial comestible
textil medicinal ornamental y combustible entre otros Un estudio reciente (Hornung-Leoni
2011) que incluye 78 especies de Bromeliaceae en 19 paiacuteses latinoamericanos demostroacute
que 33 de ellas son empleadas en Meacutexico Venezuela Peruacute y Bolivia para rituales y
ceremonias de las cuales el 73 corresponde a especies del geacutenero Tillandsia El uso
ornamental involucra 12 especies principalmente de los geacuteneros Tillandsia Aechmea y
Guzmania en Argentina Chile Venezuela y Meacutexico mientras que 2 especies de Puya son
usadas en Peruacute y Ecuador como combustibles Los usos comestibles medicinales y para la
extraccioacuten de fibras han sido registrados para 24 19 y 17 especies respectivamente a lo
largo de numerosos paiacuteses y seraacuten detallados a continuacioacuten
1211 Uso comestible
Ademaacutes de Ananas comosus Bromelia pinguin es una de las especies maacutes usadas
como comestible Se consumen sus frutos raiacuteces semillas y flores tanto directamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
6
como para la preparacioacuten de dulces refrescos postres y guisos Su uso estaacute extendido
desde Meacutexico y las Antillas hasta el norte de Sudameacuterica y Ecuador Hojas de especies de
Tillandsia y Puya son empleadas para envolver bollos tipo ldquotamalesrdquo en Venezuela
Colombia y norte de los Andes Sudamericanos asiacute como tambieacuten se consumen brotes de
otras especies de Tillandsia en Bolivia y Argentina Los frutos de B balansae se comen
asados en algunas zonas de Brasil (Hornung-Leoni 2011)
Distintos grupos eacutetnicos del Chaco paraguayo y argentino consumen frutos maduros
cocidos o crudos de Bromelia serra y B balansae siendo sus semillas tambieacuten empleadas
a partir de las cuales se obtiene un polvo que se consume directamente o bien se utiliza
para hacer sopa Las partes vegetativas de B serra B hieronymi y Dickya ferox tambieacuten
son consumidas Si bien las partes maacutes usadas son las vainas foliares joacutevenes y el eje
vertical de las rosetas basales (Suaacuterez amp Montani 2010) el consumo de los brotes joacutevenes
(ejes laterales) de B hieronymi es una nueva modalidad entre los nintildeos (Arenas 2004)
1212 Obtencioacuten de fibras
El empleo de las Bromeliaceae para la extraccioacuten de fibras es de gran importancia
para el desarrollo de numerosas comunidades a lo largo del continente Las fibras son
destinadas a la fabricacioacuten de varios productos tanto para uso propio de las comunidades
como para su comercializacioacuten2 Hamacas bolsas de mano redes para la pesca puntas de
flecha sillas de montar cesteriacutea sacos cordeleriacutea para adornar vestimentas sombreros
zapatos sandalias y cinturones objetos para uso ceremonial son algunos de los ejemplos
Diversas especies del geacutenero Aechmea son usadas por distintos indiacutegenas en
Meacutexico y Ecuador principalmente A magdalenae a partir de la cual se obtiene una fibra
(conocida como ldquoixtlerdquo o ldquofibra de pitardquo) de gran resistencia usada en la fabricacioacuten de
elementos para la pesca La fibra obtenida de varias especies de Ananas spp
caracterizada por su flexibilidad es empleada para tejidos hamacas y cestas en Venezuela
Tillandsia usneoides es utilizada para rellenar colchones y como material de empaque en
Ecuador En Chile de las hojas de Puya chilensis se obtiene una fibra resistente empleada
para las redes de pesca Fibras duras son extraidas de B pinguin en Meacutexico y Nicaragua
(Hornung-Leoni 2011)
Las fibras de Bromelia hieronymi Mez (conocida como chaacuteguar) son utilizadas por
indiacutegenas del Gran Chaco En cambio el uso textil de B balansae Mez y B serra Griseb no
es certero ya que aunque en la bibliografiacutea consta el empleo de sus fibras por parte de
vilelas y tobas orientales no ha sido registrado en trabajos de campo recientes La fibra maacutes
apreciada por distintas etnias chaquentildeas es la obtenida a partir de Deinacanthon
urbanianum Mez que debido a su durabilidad y resistencia es usada para la elaboracioacuten de
2 Productos elaborados con fibras de ldquobromeliaacuteceas textilesrdquo por la comunidad Wichi (Sastre et al 2013)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
7
objetos para la pesca Sin embargo su escasez ha llevado a su reemplazo por B hieronymi
Nativos de filiacioacuten guaraniacute en el Paraguay oriental asiacute como los makaacute asentados en las
inmediaciones del riacuteo Paraguay usan como textil las fibras obtenidas de Pseudananas
sagenarius mientras que su uso por parte de nativos del Chaco consta soacutelo en la literatura
(Arenas 1997)
A pesar del uso difundido de las ldquoBromeliaacuteceas textilesrdquo entre numerosas
comunidades son pocas las empleadas como materia prima para la industria En Argentina
a fines del siglo XIX se iniciaron estudios teacutecnicos a fin de evaluar el uso de las
Bromeliaceae con fines textiles Industrias extractoras de fibras fueron instalaacutendose en
Corrientes Chaco Formosa Santiago del Estero y Tucumaacuten pero tuvieron corta duracioacuten
Sin embargo con la Segunda Guerra Mundial y el consecuente desabastecimiento de yute
caacutentildeamo y lino textil se reiniciaron las tareas exploratorias impulsadas por el Estado (Res Nordm
949-46 del Ministerio de Agricultura) llegaacutendose a hacer estudios de cultivos en campos de
experimentacioacuten en distintas provincias del norte Como resultado de tales estudios se
concluyoacute que las Bromeliaceae factibles de uso textil en orden creciente de importancia
industrial son Pseudananas sagenarius Bromelia hieronymi B balansae B serra
Deinacanthon urbanianum Dyckia ferox y Aechmea distichantha adjudicaacutendoles potencial
para la elaboracioacuten de telas tipo batista cuerdas para pescar y telas de arpillera entre otros
Las dificultades con el mercado asiacute como las deficiencias teacutecnicas en la explotacioacuten y la
maquinaria de extraccioacuten no posibilitaron el desarrollo de esta industria en Argentina
(Arenas 1997) En Brasil sin embargo existen pequentildeas industrias textiles extractoras de
fibras de B laciniosa y Neoglaziovia variegata (Hornung-Leoni 2011)
1213 Usos medicinales
Diversas especies del geacutenero Hechtia tienen importancia medicinal en Meacutexico H
glomerata ha sido empleada contra el catarro y la bronquitis las hojas masticadas o
hervidas de H melanocarpa se usan para el tratamiento de la diabetes mientras que el teacute
obtenido de hojas de H podantha es usado como diureacutetico Puya gummifera es empleada
en Ecuador para dolencias de rintildeoacuten mientras que en Chile empleaban como emoliente y
astringente las secreciones de sus inflorescencias producto de las picaduras de las larvas
de mariposas Tambieacuten en Chile es usada P berteroniana como emoliente e infusiones de
tallos y hojas de P chilensis se emplean como antiinflamatorio y para aliviar fiebre y
diarreas Las raiacuteces de Pitcairnia pungens son utilizadas como diureacutetico en Ecuador
(Hornung-Leoni 2011) En Argentina personas pertenecientes a comunidades Wichiacute de
Salta han sentildealado que diversas especies de Tillandsia pueden ser utilizadas para aliviar el
dolor causado por dislocaciones o fracturas (Suaacuterez amp Montani 2010) Tillandsia dasyliriifolia
y T elongata han sido empleadas contra el catarro y la bronquitis en Meacutexico en tanto que T
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
8
aeranthos (el ldquoclavel del airerdquo) es usada como antiespasmoacutedico y para el tratamiento de
afecciones oculares en Sudameacuterica (Hornung-Leoni 2011)
Dentro de las especies del geacutenero Bromelia B pinguin es conocida por sus
propiedades medicinales en Centroameacuterica Cuba y en algunas regiones de Meacutexico Su fruto
es usado como antihelmiacutentico pero tambieacuten como diureacutetico y antirreumaacutetico Las hojas de
B karatas son utilizadas en algunas regiones de Meacutexico como antiinflamatorio (Hornung-
Leoni 2011) En Brasil los frutos de B balansae son usados por la medicina popular como
jarabe para la tos (Coelho 2010) y el jugo de los frutos de B fastuosa (gravataacute) para el
tratamiento de la bronquitis y el asma (Guimaraes-Ferreira et al 2007)
El uso medicinal de Ananas comosus trasciende a las comunidades latinoamericanas
asentadas en las regiones en las cuales es autoacutectona Desde los tiempos de la colonizacioacuten
la pulpa se empleaba por las comunidades aboriacutegenes para tratar parasitosis intestinales
accioacuten que fue sustentada por los meacutedicos europeos de la eacutepoca (Patintildeo 2002) Tambieacuten
ha sido utilizada como coadyuvante de la digestioacuten (Hornung-Leoni 2011)
El extracto obtenido a partir de A comosus conocido como bromelina o bromelaiacutena
es comercializado desde mediados de la deacutecada del acute50 y desde entonces se han publicado
numerosos trabajos cientiacuteficos en relacioacuten a sus propiedades terapeacuteuticas antiinflamatoria
antitromboacutetica fibrinoliacutetica antitumoral antimetastaacutesica inmunomodulador promotora de la
absorcioacuten de antibioacuteticos debridante de heridas y cicatrizante (Maurer 2001) La bromelina
ha sido usada como agente antiinflamatorio y antiedematoso en casos de artritis lesiones
deportivas traumatismos edema posquiruacutergico quemaduras y como complementario a la
quimioterapia (Bhui 2012) Actualmente la bromelina es un producto medicinal popular para
el tratamiento de la inflamacioacuten y trastornos digestivos (Hornung-Leoni 2011) Es de libre
venta en farmacias y tiendas naturistas principalmente de Estados Unidos de Ameacuterica y
paiacuteses de Europa como un producto meacutedico sin licencia (Brien et al 2004) La
Administracioacuten de Drogas y Alimentos de EEUU (Food and Drug Administration FDA)
considera a la bromelina dentro del subcapiacutetulo correspondiente a los alimentos para
consumo humano y en tal caraacutecter es categorizada como GRAS (Generally Recognized as
Safe) No hace referencia a su utilizacioacuten como medicamento (FDA 2012) Por su parte la
Agencia Europea de Medicinas (European Medicines Agency) ha aprobado muy
recientemente un producto conteniendo bromelina para su uso como debridante de las
escaras producidas como consecuencia de quemaduras (European Medicines Agency
2012)
Si bien los extractos obtenidos tanto a partir de tallos como de frutos de A comosus
son una mezcla compleja de fosfatasas glucosidasas peroxidasas celulasas inhibidores
glicoproteiacutenas y carbohidratos (todos poco caracterizados) los componentes responsables
de sus acciones antihelmiacutentica antiedematosa antiinflamatoria fibrinoliacutetica antitromboacutetica
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
9
antitumoral debridante de heridas asiacute como aceleradora de la cicatrizacioacuten de heridas
parecieran ser las proteasas cisteiacutenicas presentes en grandes cantidades (Maurer 2001
Salas et al 2008)
13 Tipos de Proteasas Distribucioacuten y Rol en los Vegetales
131 Proteasas Tipos y sistemas de clasificacioacuten
Se conoce como proteasas a las enzimas que catalizan la degradacioacuten de las
proteiacutenas (proteoacutelisis) mediante la adicioacuten de una moleacutecula de agua en los enlaces
peptiacutedicos Aunque el Comiteacute de Nomenclatura de la Unioacuten Internacional de Bioquiacutemica y
Biologiacutea Molecular3 (NC-IUBMB) ha recomendado usar el teacutermino peptidasa para referirse a
estas enzimas en trabajos recientes se siguen utilizando alternativamente las
denominaciones proteasa enzima proteoliacutetica o proteinasa por lo que en la presente tesis
usaremos estos teacuterminos indistintamente
Un sistema de nomenclatura y clasificacioacuten de proteasas es fundamental para el
manejo de la informacioacuten A pesar de que existe una gran variedad de proteasas distribuidas
en los siete reinos (Archaea Bacteria Protozoa Fungi Planta Animalia y Virus) que
cumplen roles fisioloacutegicos muy distintos la existencia de caracteriacutesticas comunes permitioacute
establecer sistemas de clasificacioacuten Estos se basan en los mecanismos cataliacuteticos las
regiones de la cadena polipeptiacutedica sobre las que actuacutean las relaciones evolutivas y la
homologiacutea de sus secuencias
Antes del establecimiento de un organismo reconocido internacionalmente que fijara
pautas de clasificacioacuten y nomenclatura para las enzimas Hartley (1960) propuso clasificar
las proteasas teniendo en cuenta su mecanismo cataliacutetico Este criterio dio lugar a cuatro
clases o tipos cataliacuteticos de peptidasas seriacutenicas cisteiacutenicas aspaacuterticas y
metalopeptidasas La denominacioacuten hace referencia al grupo quiacutemico del sitio cataliacutetico
responsable de la actividad enzimaacutetica serina cisteiacutena aacutecido aspaacutertico e ioacuten metaacutelico
(frecuentemente Zn2+ Mn2+ Co2+) respectivamente Maacutes recientemente fueron incorporados
otros dos tipos las peptidasas glutaacutemicas (Kakudo et al 1992) y treoniacutenicas (Barrett et al
1998)
No obstante estas diferencias los seis tipos cataliacuteticos se pueden agrupar en dos
categoriacuteas las que forman complejos covalentes entre la enzima y el sustrato (peptidasas
seriacutenicas cisteiacutenicas y treoniacutenicas) donde el nucleoacutefilo del sitio cataliacutetico es parte de un
aminoaacutecido (serina cisteiacutena o treonina respectivamente) y las que no forman complejos
enzima-sustrato covalentes (peptidasas aspaacuterticas glutaacutemicas y metalopeptidasas) siendo
responsable del ataque nucleofiacutelico una moleacutecula de agua activada
3 lthttpwwwchemqmulacukiubmbgt
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
10
1311 Sistema EC de clasificacioacuten de enzimas
En 1961 quedoacute establecido el sistema de clasificacioacuten y nomenclatura de enzimas de
la Comisioacuten Internacional de Enzimas (Enzyme Commission EC) actualmente NC-IUBMB
Basaacutendose en el tipo de reaccioacuten que catalizan la EC agrupoacute las enzimas en seis clases y
les asignoacute un coacutedigo numeacuterico Oxidorreductasas (1) Transferasas (2) Hidrolasas (3)
Liasas (4) Isomerasas (5) y Ligasas (6)
Dentro de la clase 3 (hidrolasas) se agrupan las enzimas que catalizan la reaccioacuten de
escisioacuten de un enlace mediante la adicioacuten de una moleacutecula de agua Los productos de esta
reaccioacuten son dos moleacuteculas a una de las cuales se ha unido el hidroacutegeno y a la otra el
hidroxilo provenientes ambos de la hidroacutelisis del agua
R1-R2 + H2O R1-OH + R2-H
Hidrolasa
Las enzimas de la clase 3 se subagrupan en funcioacuten del enlace quiacutemico sobre el que
actuacutean Asiacute si el enlace entre R1 y R2 es el grupo amida de la unioacuten peptiacutedica las hidrolasas
que catalizan tal reaccioacuten son peptidasas y pertenecen a la subclase 34 (EC 34) la que a
su vez se divide en catorce sub-subclases como se muestra en la Tabla 12
Sub-subclases Descripcioacuten Cantidad
Exopeptidasas
EC 3411 Aminopeptidasas 26 76
EC 3413 Dipeptidasas 11 32
EC 3414 Dindash y trindashpeptidil-peptidasas 8 23
EC 3415 Peptidil-dipeptidasas 4 12
EC 3416 Carboxipeptidasas Tipo Serina 4 12
EC 3417 Metalocarboxipeptidasas 20 58
EC 3418 Carboxipeptidasas Tipo Cisteiacutena 1 03
EC 3419 Omega peptidasas 11 32
Endopeptidasas
EC 3421 Endopeptidasas Seriacutenicas 98 285
EC 3422 Endopeptidasas Cisteiacutenicas 98 285
EC 3423 Endopeptidasas Aspaacuterticas 41 119
EC 3424 Metaloendopeptidasas 20 58
EC 3425 Endopeptidasas Treoniacutenicas 2 06
EC 3499 Endopeptidasas de mecanismo desconocido 0 0
Total 344 100
Tabla 12 Sub-subclases de peptidasas (34) seguacuten el sistema EC (Consultado 12112012)
Las peptidasas EC 3411 a EC 3419 son exopeptidasas mientras que las EC 3421
a EC 3425 y EC3499 son endopeptidasas Las exopeptidasas hidrolizan
secuencialmente uno o maacutes aminoaacutecidos desde los extremos carboxilo (carboxipeptidasas)
amino (aminopeptidasas) o extremos sustituidos ciclados o unidos por uniones
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
11
isopeptiacutedicas (omegapeptidasas) Las que atacan el N-terminal pueden liberar un uacutenico
residuo aminoaciacutedico (aminopeptidasas EC 3411) o un di- o tripeacuteptido (di- y tripeptidil-
peptidasas EC 3414) A su vez las que actuacutean sobre el C-terminal pueden liberar un uacutenico
amino aacutecido (carboxipeptidasas EC 3416-18) o un dipeacuteptido (peptidil-dipeptidasas EC
3415)
Las endopeptidasas hidrolizan las uniones peptiacutedicas internas de la proteiacutena y si
actuacutean sobre pequentildeos peacuteptidos se denominan geneacutericamente oligopeptidasas (Barrett
2001)
Como puede observarse la clasificacioacuten propuesta por Hartley quedoacute incorporada en
el sistema EC Las carboxipeptidasas se agrupan seguacuten el mecanismo cataliacutetico en
metalocarboxipeptidasas (EC 3417) seriacutencarboxipeptidasas (EC 3416) y
cisteiacutencarboxipeptidasas (EC 3418) mientras que las endopeptidasas se agrupan en
seriacutenicas (EC 3421) cisteiacutenicas (EC 3422) aspaacuterticas (EC 3423) treoniacutenicas (EC
3425) y metaloendopeptidasas (EC 3424)
1312 El sistema MEROPS de clasificacioacuten de peptidasas
Desde mediados del siglo XX a la actualidad la Biologiacutea Molecular (BM) ha aportado
conocimientos no soacutelo referentes a los mecanismos de accioacuten de las enzimas sino tambieacuten
a sus estructuras La posibilidad de conocer las secuencias de aminoaacutecidos de las
proteiacutenas asiacute como su conformacioacuten espacial permitioacute establecer nuevos criterios de
clasificacioacuten de las enzimas que a su vez a la luz del Dogma Central de la BM refleja las
relaciones evolutivas entre ellas
Asiacute Rawlings y Barrett (1993) haciendo uso del gran nuacutemero de secuencias
aminoaciacutedicas de las que disponiacutean dieron a conocer un nuevo sistema de clasificacioacuten de
peptidasas basado en las similitudes estructurales de las proteiacutenas Seguacuten el grado de
homologiacutea las peptidasas fueron agrupadas en familias y eacutestas a su vez en clanes Para
1996 este sistema habiacutea dado lugar a la base de datos MEROPS4 Los tres niveles de
clasificacioacuten se definen a continuacioacuten
Clan Es un conjunto de familias cuyas peptidasas tienen un origen evolutivo comuacuten
que si bien no llega a evidenciarse por comparacioacuten de sus secuencias de aminoaacutecidos siacute
por las similitudes de sus estructuras terciarias Se construye por comparacioacuten de las
estructuras terciarias y cuando no estaacuten disponibles se comparan los ordenamientos de
aminoaacutecidos cataliacuteticos en la cadena polipeptiacutedica o las secuencias aminoaciacutedicas alrededor
de los aminoaacutecidos cataliacuteticos
Familia Se construye por comparacioacuten de la estructura primaria Estaacute constituida por
peptidasas cuyas secuencia de aminoaacutecidos que debe incluir la secuencia de la ldquounidad
4 lthttpmeropssangeracukgt
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
12
peptidasardquo (regioacuten de la proteiacutena responsable de la actividad cataliacutetica) presentan similitudes
estadiacutesticamente significativas
Peptidasa Cada proteiacutena con actividad peptidasa recibe un nombre y un
identificador (ID MEROPS) Se diferencian por su estructura funcioacuten bioloacutegica sustrato
mecanismo cataliacutetico y origen geneacutetico
Dentro de algunas familias se han detectado dos o maacutes grupos de peptidasas con
suficientes diferencias como para constituir una subfamilia Del mismo modo algunos clanes
han sido divididos en subclanes que contienen familias que evidencian una muy antigua
divergencia
El sistema MEROPS tambieacuten tuvo en cuenta la clasificacioacuten de Hartley ya que en la
asignacioacuten de los identificadores a las familias clanes y peptidasas se usaron letras que
hacen referencia al tipo cataliacutetico de las peptidasas que las integran S (seriacutenicas) C
(cisteiacutenicas) T (treoniacutenicas) A (aspaacuterticas) G (glutaacutemicas) M (metalopeptidasas) N
(asparagiacutenicas) y U (mecanismo desconocido)
La letra P es utilizada para identificar clanes que contienen familias de peptidasas de
maacutes de un tipo cataliacutetico El identificador de un clan se completa con una segunda letra
mayuacutescula asignada secuencialmente (por ejemplo clan CA) y el identificador para una
familia es completado con un nuacutemero (por ejemplo C1 la familia de la papaiacutena) El
identificador MEROPS para cada peptidasa individual comienza con el identificador de
familia y se completa con un nuacutemero decimal (por ejemplo C01005 para bromelaiacutena de
tallo) La versioacuten 97 de la base de datos actualizada al 1ordm de octubre de 2012 cuenta con
320834 secuencias de las cuales 113968 corresponden a peptidasas seriacutenicas 118637 a
metalopeptidasas 52745 a peptidasas cisteiacutenicas 14225 a peptidasas aspaacuterticas 11439 a
peptidasas treoniacutenicas 338 a peptidasas glutaacutemicas 3222 a peptidasas asparagiacutenicas
6256 a peptidasas de tipo cataliacutetico desconocido y 4 inclasificables La base contiene
ademaacutes 520 estructuras (Rawlings et al 2012)
132 Distribucioacuten de Proteasas en los Seres Vivos
En la Tabla 13 se consigna la distribucioacuten de las familias de proteasas en 8546
organismos de los distintos reinos Dentro del reino vegetal la mayoriacutea de las familias estaacuten
constituidas por peptidasas del tipo metaloproteasas (34101) seriacutenicas (22101) y
cisteiacutenicas (20101) Sin embargo el mayor nuacutemero de peptidasas registradas son las
seriacutenicas (29) seguidas por las aspaacuterticas (25) y las cisteiacutenicas (24) La mayoriacutea de las
proteasas cisteiacutenicas en plantas pertenecen a la familia de la papaiacutena (C1)
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13
Reino
Tipo de peptidasas Bacteria Archaea Protozoa Fungi Planta Animalia Virus
Aspaacuterticas 9 5 6 6 9 7 4
Cisteiacutenicas 27 11 20 16 20 22 30
Glutaacutemicas 2 1 - 1 - - 1
Metalopeptidasas 62 34 32 34 34 33 14
Seriacutenicas 25 18 20 16 22 25 18
Treoniacutenicas 1 1 1 1 1 1 -
Asparagiacutenicas 3 - - - - - 6
Distintos Tipos 20 13 15 13 14 18 25
Mecanismo Desconocido 7 4 2 1 1 3 2
Totales 156 87 96 88 101 109 100
Tabla 13 Distribucioacuten de familias de peptidasas de organismos de diferentes reinos en el sistema propuesto por MEROPS (httpmeropssangeracuk consultado 12112012)
133 Rol de las peptidasas en los vegetales
La proteoacutelisis es vital para las ceacutelulas Por un lado es necesaria para el recambio
proteico permitiendo que proteiacutenas dantildeadas mal plegadas o innecesarias sean eliminadas
a la vez que los aminoaacutecidos liberados sean utilizados para la siacutentesis de nuevas proteiacutenas
Por otro lado la degradacioacuten proteica en sitios especiacuteficos es una de las modificaciones
postraduccionales necesaria para que las proteiacutenas sean funcionalmente activas por
ejemplo para la activacioacuten de proenzimas o bien permitiendo el ensamblado de proteiacutenas y
su direccionamiento hacia distintos compartimientos celulares La degradacioacuten proteica
tambieacuten sirve como mecanismo de control celular si el sustrato son proteiacutenas regulatorias
La principal viacutea proteoliacutetica en las ceacutelulas eucariotas estaacute mediada por el sistema
ubiquitinaproteasoma la proteiacutena que debe ser degradada es marcada por unioacuten a la
ubiquitina facilitando la direccioacuten al complejo proteasomal efector de la hidroacutelisis
En las plantas el recambio proteico es considerado fundamental para el crecimiento
Ejemplos de ello son la degradacioacuten de proteiacutenas de reserva durante la germinacioacuten de las
semillas o la removilizacioacuten de proteiacutenas luego de la senescencia foliar con la relocalizacioacuten
de fuentes de N en los oacuterganos reproductivos Maacutes recientemente con la asociacioacuten
encontrada entre el sistema ubiquitinaproteasoma y la embriogeacutenesis la fotomorfogeacutenesis
los ritmos circadianos el desarrollo de flores y tricomas asiacute como la sentildealizacioacuten hormonal
la degradacioacuten selectiva de proteiacutenas ha tomado relevancia como mecanismo de regulacioacuten
de numerosos procesos de crecimiento y desarrollo en las plantas (Schaller 2004)
En Arabidopsis thaliana la primer planta en tener su genoma completamente
secuenciado se han encontrado maacutes de 600 genes de proteasas de todos los tipos
cataliacuteticos a excepcioacuten de las glutaacutemicas ademaacutes de 1300 genes asociados con el sistema
ubiquitina-proteasoma (Schaller 2004) Puesto que Arabidopsis es tomada como modelo
para el estudio fitobioloacutegico la falta de exclusividad del sistema proteasomal en la
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14
degradacioacuten proteica podriacutea ser extensible a otras especies vegetales El anaacutelisis en
alrededor de cien genomas ha demostrado que aproximadamente un 2 de todos los
productos geacutenicos son peptidasas evidenciaacutendose asiacute que se trata de uno de los grupos
funcionales de proteiacutenas maacutes grandes e importantes (Barrett et al 2004)
En el trabajo de revisioacuten y actualizacioacuten sobre el rol regulatorio de proteasas vegetales
Schaller (2004) cita referencias sobre proteasas (de todos los tipos cataliacuteticos a excepcioacuten
de las treoniacutenicas y las glutaacutemicas) claves para varios procesos bioloacutegicos de las plantas
destacaacutendose las funciones en la degradacioacuten proteica y movilizacioacuten de nitroacutegeno durante
la germinacioacuten de las semillas y la senescencia foliar el procesamiento de proteiacutenas de
reserva durante su acumulacioacuten en semillas diferentes eventos de la muerte celular
programada (iniciacioacuten regulacioacuten y autolisis) la resistencia a insectos y patoacutegenos la
digestioacuten de insectos en plantas carniacutevoras la sentildealizacioacuten por brasinoesteroides y en la
regulacioacuten de procesos de desarrollo y crecimiento tales como la diferenciacioacuten xilemaacutetica
la densidad de estomas y la formacioacuten lateral de raiacuteces del patroacuten embrionario y del
meristema apical entre otros
1331 Peptidasas cisteiacutenicas
Seguacuten el sistema MEROPS las peptidasas cisteiacutenicas estaacuten distribuidas en 76 familias
agrupadas en 13 clanes Dentro del reino Planta las proteasas cisteiacutenicas son una de las
maacutes conocidas por ser el tipo cataltico en que se centraron los primeros estudios sobre
proteasas vegetales En las plantas la mayoriacutea de las proteasas cisteiacutenicas pertenecen a
las familias de la papaiacutena (C1) y la legumaiacutena (C13) (Schaller 2004)
A nivel subcelular las proteasas cisteiacutenicas se localizan en vacuolas y en la pared
celular (Grudkowska amp Zagdańska 2004) sin embargo actividad tipo caspasa en plantas ha
sido detectada en el citosol pero no en vacuolas (Korthout et al 2000) En cuanto a su
distribucioacuten en la planta se han encontrado proteasas en praacutecticamente todos los oacuterganos
vegetales (Salas et al 2008)
Durante la maduracioacuten de las semillas las proteiacutenas de reserva son sintetizadas como
precursores que deben ser procesados para su ensamblado y acumulacioacuten (Jung et al
1998) Ese procesamiento ha sido atribuido a proteasas tipo legumaiacutenas conocidas como
enzimas de procesamiento vacuolar (VPE) (Hara-Nishimura et al 1998 Kinoshita et
al1999) Por otro lado dentro de las proteasas responsables de la degradacioacuten y
movilizacioacuten de proteiacutenas de reserva las cisteiacutenicas son las maacutes abundantes e incluye
ademaacutes de las legumaiacutenas a las del tipo papaiacutena (Grudkowska amp Zagdańska 2004)
Una caracteriacutestica de las proteasas cisteiacutenicas es que responden a estiacutemulos internos y
externos Ante el estreacutes abioacutetico la sequiacutea y el shock teacutermico algunas proteiacutenas son
dantildeadas o innecesarias hacieacutendose imprescindible la siacutentesis de nuevas proteiacutenas Este
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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recambio proteico conlleva un considerable aumento en la siacutentesis de proteasas cisteiacutenicas
hecho demostrado en las hojas de trigo ante el deacuteficit de agua Por otra parte los
aminoaacutecidos liberados actuacutean regulando la presioacuten osmoacutetica celular La induccioacuten de
proteasas cisteiacutenicas principalmente tipo papaiacutena y tipo caspasas acompantildea la muerte
celular programada la cual estaacute asociada con procesos de desarrollo y diferenciacioacuten
vegetal tales como la xilogeacutenesis y la senescencia asiacute como tambieacuten con las respuestas de
defensa (Grudkowska amp Zagdańska 2004)
Algunas proteiacutenas vegetales han sido clasificadas como proteiacutenas ldquoprescindiblesrdquo
puesto que algunas especies pueden sobrevivir sin ellas mientras que otras especies o
variedades dentro de la misma especie las producen en elevadas cantidades siendo poco
claro su rol fisioloacutegico en la planta Dentro de esta categoriacutea entran las proteasas presentes
en cantidades extremadamente altas principalmente en laacutetex y frutos caracteriacutesticas de
ciertas familias (Caricaceae Bromeliaceae y Moraceae) dado que si bien podriacutean
desempentildearse en la defensa contra la invasioacuten de patoacutegenos no se explica la variedad de
contenido proteoliacutetico entre especies altamente relacionadas (Adams amp Rinne 1981) En
estos casos las actividades proteoliacuteticas detectadas son al menos dos oacuterdenes de magnitud
mayores que las actividades encontradas en tejidos comparables de la mayoriacutea de otras
plantas (Glazer amp Smith 1971) Puesto que la siacutentesis acumulacioacuten y utilizacioacuten de las
proteiacutenas ldquoprescindiblesrdquo ocurre en determinados periacuteodos que podriacutean estar relacionados
con estadios del desarrollo de la planta se les ha asignado un posible rol como metabolitos
secundarios (Adams amp Rinne 1981) La sorprendente similitud bioquiacutemica (elevada
estabilidad amplia especificidad y baja tendencia autoliacutetica) de las proteasas cisteiacutenicas
muy abundantes no indicariacutea un ancestro comuacuten sino maacutes bien una convergencia evolutiva
como resultado de una funcioacuten defensiva comuacuten (Boller 1986)
La actividad de proteasas cisteiacutenicas frente a diferentes estiacutemulos puede ser elevada
al 90 de la actividad proteoliacutetica total (Grudkowska amp Zagdańska 2004) En el caso de
Carica papaya L se ha demostrado que la produccioacuten de heridas repetidas en los frutos
aumentan la cantidad de proteiacutenas y la actividad proteoliacutetica en el laacutetex de la papaya lo cual
estaacute acorde con el posible rol de estas proteasas en la defensa de la planta (Azarkan et al
2006)
El papel desempentildeado por las proteasas en las respuestas de defensa en plantas
desencadenadas por patoacutegenos y pestes estaacute comenzando a aclararse No soacutelo
intervendriacutean en la ejecucioacuten directa del patoacutegeno como es el caso de la papaiacutena y otras
proteasas tipo papaiacutena sino tambieacuten en la percepcioacuten por parte del organismo defensor y en
las cascadas de sentildealizacioacuten involucradas con las respuestas de defensa (van der Hoorn amp
Jones 2004)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
16
14 Enzimas Proteoliacuteticas de Bromeliaceae
Varias especies de la familia Bromeliaceae se caracterizan por poseer endopeptidasas
en cantidades superiores a las fisioloacutegicamente necesarias (Barrett 2001) A pesar del
elevado nuacutemero de integrantes de la familia Bromeliaceae es muy reducido el nuacutemero de
geacuteneros todos pertenecientes a la subfamilia Bromelioideae que han sido estudiados hasta
la fecha en busca de enzimas proteoliacuteticas (Ananas Bromelia Hohenbergia y
Pseudananas) siendo Ananas comosus L (el ldquoananaacuterdquo o ldquopintildeardquo) la especie maacutes estudiada a
partir de cuyos tallos se obtiene la bromelina (Heinicke amp Gortner 1957) Otras proteasas de
Bromeliaceae que han sido aisladas y caracterizadas incluyen a la hemisfericina a partir de
frutos de Bromelia hemispherica (Agundis et al 1977 Ochoa et al 1987) pinguinina
obtenida de frutos de Bromelia pinguin (Toro-Goyco et al 1980 Abreu Payrol et al 2008)
karatasina aislada de frutos de Bromelia plumieri (Montes et al 1990) macrodontaiacutena I y II
de frutos inmaduros de Pseudananas macrodontes (Morr) Harms (Brullo et al 1994
Natalucci et al 1996 Loacutepez et al 2000 y 2001 Brullo 2003) balansaiacutena I de frutos
inmaduros de Bromelia balansae Mez (Pardo et al 2000) hieronymaina I II y III aisladas de
frutos inmaduros de Bromelia hieronymi Mez (Bruno et al 2003 2006 2008) fastuosaiacutena
extraiacuteda de frutos inmaduros de Bromelia fastuosa (Cabral et al 2006) y penduliflorain I
obtenida a partir de frutos de Hohenbergia penduliflora (Peacuterez et al 2010) Tambieacuten se han
aislado proteasas de frutos de otras especies de Bromelia B serra (Caffini et al 1988) B
laciniosa (Buttazzoni et al 1984 Priolo et al 1986) B palmeris y B sylvestris (Cruz et al
1974 Hernaacutendez Arana et al 1983)
Dado que el presente trabajo de tesis doctoral estaacute centrado en el estudio de posibles
aplicaciones farmacoloacutegicas de las proteasas presentes en frutos de Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes en comparacioacuten con la bromelina a continuacioacuten se
brinda un resumen de las principales caracteriacutesticas bioquiacutemicas de las proteasas aisladas a
partir de esos materiales
141 Endopeptidasas del ananaacute
Las endopeptidasas del ananaacute son de tipo cisteiacutenicas y pertenecen a la superfamilia de
la papaiacutena (C01) Conocidas en su conjunto como ldquobromelinardquo teacutermino que se ha
reemplazado en los uacuteltimos antildeos por ldquobromelaiacutenardquo En el presente trabajo se utilizaraacute
indistintamente cualquiera de los dos teacuterminos Rowan et al (1990) denominan ldquobromelaiacutena
de tallordquo a la principal endopeptidasa del tallo de ananaacute y ldquobromelaiacutena de frutordquo a la principal
endopeptidasa de fruto Adicionalmente dos endopeptidasas menores (ananaiacutena y
comosaiacutena) fueron separadas del tallo de ananaacute (Rowan et al 1988 1990) Actualmente y
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
17
en base a estudios geneacuteticos se considera que existen dos tipos de bromelinas de fruto
denominas ldquom-tipo 1rdquo y ldquom-tipo 2rdquo (Rawlings et al 2008)
1411 Bromelina de tallo
La bromelina de tallo (EC 342232) es la proteasa predominante (casi el 90) en los
extractos de tallos de Ananas comosus y se trata de una uacutenica cadena polipeptiacutedica
glicosilada de 245 kDa (Harrach et al 1995) con un punto isoeleacutectrico (pI) de 955
(Murachi 1970) conteniendo siete residuos Cys (Napper et al 1994 Harrach et al 1995) y
tres puentes disulfuro La secuencia aminoaciacutedica completa ha sido deducida por Ritonja et
al (1989) siendo su masa molecular de 22831 Da Para expresar su maacutexima actividad la
enzima requiere la presencia de agentes reductores tales como cisteiacutena El pH oacuteptimo tanto
con sustratos sinteacuteticos como proteicos es amplio (Rowan amp Buttle 1994) A pesar de su
elevada actividad sobre distintos sustratos proteicos actuacutea eficientemente sobre sustratos
sinteacuteticos que contengan uniones Arg-Arg (Rowan et al 1988 Napper et al 1994)
Tambieacuten se ha comunicado una cierta preferencia de la enzima por aminoaacutecidos polares en
las posiciones P1 y P1acute5 (Napper et al 1994) Una caracteriacutestica distintiva de esta proteasa
es su relativamente deacutebil inhibicioacuten por E-64 y la carencia de inhibicioacuten por cistatina de pollo
lo que la diferencia de la mayoriacutea de las peptidasas de la familia C1 (Rowan et al 1990)
1412 Ananaiacutena
Rowan et al (1988) lograron purificar una enzima distinta a la bromelina de tallo a la
que denominaron ananaiacutena (EC 342231) y que representa el 5 de las proteiacutenas totales
del extracto de tallo de ananaacute A diferencia de la bromelina de tallo la ananaiacutena muestra
baja preferencia por sustratos sinteacuteticos que contengan Arg-Arg y alta actividad frente a Z-
Phe-Arg-NHMec y a Bz-Phe-Val-Arg-NHMec Ananaiacutena muestra mayor preferencia por
aminoaacutecidos polares en la posicioacuten P1acute mientras que el requerimiento para el sitio P1 es
mucho menos especiacutefico (Napper et al 1994) en tanto que en el sitio P2 manifiesta
preferencia por una cadena lateral hidrofoacutebica (Rowan et al 1990) El pH oacuteptimo tanto con
sustratos sinteacuteticos como proteicos es cercano a la neutralidad (Rowan amp Buttle 1994)
Ananaiacutena no es glicosilada estaacute formada por una cadena proteica simple de 235 kDa
(Rowan et al 1988 Napper et al 1994 Harrach et al 1995) y su pI es gt 10 (Rowan et al
1988 Harrach et al 1995) Tambieacuten contiene siete residuos Cys (Napper et al 1994) La
secuencia primaria de ananaiacutena ha sido determinada comprobaacutendose que incluye un
inserto entre los residuos 170 y 174 que no estaacute presente en bromelina de tallo ni en
5 En el modelo ideado por Schechter y Berger (1967) para describir la especificidad de corte de las peptidasas
los residuos de aminoaacutecido del sustrato (P) se unen a subsitios del sitio activo de la enzima (S) Estos residuos se numeran a partir del enlace a ser clivado hacia el extremo N-terminal como P1 P2 P3 etc en tanto que los que se encuentran hacia el C-terminal se denominan P1 P2 P3 etc Los subsitios de la proteasa actuacutean acomodando los residuos del sustrato y se numeran como S1 S2 S3 y S1 S2 S3 respectivamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
18
papaiacutena y una serie de aminoaacutecidos hidrofoacutebicos adyacentes a la His-157 (Lee et al 1997)
El comportamiento de la enzima frente a los inhibidores es similar al de la papaiacutena ya que
es eficientemente inhibida tanto por cistatina de pollo como por E-64 (Rowan et al 1988)
1413 Comosaiacutena
Comosaiacutena es la endopeptidasa menos abundante del extracto de tallo de ananaacute y
representa menos del 1 de las proteiacutenas totales Se trata de una glicoproteiacutena de 245 kDa
y pI gt 10 conteniendo siete residuos Cys y tiene una composicioacuten similar en carbohidratos a
la bromelina de tallo pero es marcadamente diferente en su composicioacuten aminoaciacutedica
(Napper et al 1994) Tiene actividad sobre Z-Arg-Arg-NHMec (Rowan et al 1990) muestra
preferencia por residuos polares tanto en el sitio P1 como P1acute y es inhibida por E-64
(Napper et al 1994)
1414 Bromelina de fruto
La preparacioacuten denominada ldquobromelina de frutordquo (EC 342233) constituye el 30-40
de las proteiacutenas totales del fruto representa casi el 90 del material proteoliacuteticamente
activo (Murachi 1970) y al igual que la bromelina de tallo tiene un amplio pH oacuteptimo frente a
sustratos proteicos y sinteacuteticos (Rowan amp Buttle 1994) Se trata de una cadena polipeptiacutedica
simple de aproximadamente 25 kDa (Rowan et al 1990) cuyo pI es 46 y parece no
tratarse de una glicoproteiacutena (Ota et al 1985) La secuencia N-terminal es ideacutentica a la de
bromelina de tallo (Yamada et al 1976) pero es inmunoloacutegicamente distinta de eacutesta y de
ananaiacutena (Rowan et al 1990)Tiene preferencia por el sustrato sinteacutetico Bz-Phe-Val-Arg-
NHMec y no por Z-Arg-Arg-NHMec lo que la diferencia de la bromelina de tallo (Rowan et
al 1990)
142 Balansaiacutena
Utilizando frutos semimaduros de Bromelia balansae Mez Natalucci et al (1988)
obtienen una preparacioacuten proteoliacutetica activa en un rango de pH amplio (60ndash95) que se
resuelve en tres fracciones proteoliacuteticamente activas por cromatografiacutea de intercambio
ioacutenico Posteriormente Pardo et al (2000) estudiaron las proteasas presentes en frutos en
distintos estadios de maduracioacuten determinaacutendose un aumento en el nuacutemero de proteiacutenas
con diferente pI y un incremento en el contenido de proteiacutenas totales y de azuacutecares a
medida que avanza el grado de madurez La actividad caseinoliacutetica y la actividad especiacutefica
fueron mayores en los estadios de menor madurez Mediante purificacioacuten parcial por
precipitacioacuten etanoacutelica lograron retener el 92 de la actividad enzimaacutetica y el 83 de las
proteiacutenas iniciales eliminaacutendose el 45 de los azuacutecares contenidos en el extracto crudo
Dicha preparacioacuten mostroacute alta estabilidad teacutermica conservaacutendose un 80 de actividad
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
19
proteoliacutetica luego de ser incubada durante 2 h a 45 ordmC Una banda activa de pI 55
(balansaiacutena I) se encontroacute en cantidades apreciables durante todo el proceso de
maduracioacuten mientras que otra banda activa de pI 87 (balansaiacutena II) soacutelo pudo encontrarse
en cantidades apreciables en frutos maduros trataacutendose en ambos casos de
cisteiacutenendopeptidasas
El peso molecular de Balansaiacutena I determinado por espectrometriacutea de masas (MALDI-
TOF) fue de 23192 Da y por electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-
PAGE) fue 244 kDa su pH oacuteptimo frente a caseiacutena fue 87 y conservoacute maacutes del 80 de
actividad en el rango de pH 58 a 100 Balansaiacutena I mostroacute preferencia por los derivados
Ala y Gln de N-α-CBZ-p-Nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos seguido por los de Gly Tyr y Leu
La secuencia N-terminal muestra gran similitud con las proteasas del ananaacute (Pardo et al
2000)
143 Hieronymaiacutenas
A partir de frutos inmaduros de Bromelia hieronymi Mez Bruno et al (2002) obtienen
extractos parcialmente purificados por precipitacioacuten acetoacutenica (PAR) y etanoacutelica (PER)
conteniendo alta cantidad de proteiacutenas (91 en el PAR y 79 en el PER) y de actividad
caseinoliacutetica (90 en el PAR y 83 en el PER) respecto al extracto crudo de partida
mientras se eliminan la mayor parte de azuacutecares y fenoles Las enzimas presentes
resultaron ser cisteiacutenendopeptidasas Los preparados conservaron maacutes del 90 de la
actividad original cuando fueron preincubados a 37 ordmC y 55 ordmC durante 2 h y mostraron
actividad en un amplio rango de pH alcanzando el 80 de la actividad maacutexima entre los pH
7 y 10 Mediante isoelectroenfoque (IEF) se logran separar 6 bandas de pI 59 64 76 83
y gt 93
1431 Hieronymaiacutena I
Desde frutos inmaduros de B hieronymi Bruno et al (2003) logran aislar una fraccioacuten
a la que denominan ldquohieronymaiacutena Irdquo (pI gt93) cuya homogeneidad fue confirmada por
MALDI-TOF donde mostroacute una masa molecular de 24066 Da por SDS-PAGE mostrando
una banda de 25 kDa y por IEF La enzima de tipo cisteiacutenica presentoacute una actividad
caseinoliacutetica maacutexima en el rango de pH 85-95 y fue completamente inhibida por E-64 y
aacutecido iodoaceacutetico mientras que se incrementoacute por la adicioacuten de cisteiacutena 20 mM
1432 Hieronymaiacutena II
A partir del mismo material Bruno et al (2006) purifican una segunda proteasa
cisteiacutenica (hieronymaiacutena II) cuya homogeneidad fue confirmada por MALDI-TOF-TOF
mostrando un peso molecular de 23411 Da y por SDS-PAGE con un peso molecular de 25
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
20
kDa aunque por IEF se observaron dos isoformas de pI 76 y 83 La actividad caseinoliacutetica
maacutexima fue detectada en el rango de pH entre pH 75-90
1433 Hieronymaiacutena III
Una tercera endopeptidasa cisteiacutenica (hieronymaiacutena III) fue purificada desde frutos
inmaduros de B hieronymi (Bruno et al 2008) cuyo pH oacuteptimo sobre caseiacutena se encuentra
en el rango de pH 86-93 La masa molecular determinada por SDS-PAGE fue de 25 kDa y
por espectrometriacutea de masas de 23713 Da Mediante IEF se observaron dos bandas de pI
59 y 64
La actividad de las tres endopeptidasas frente a sustratos sinteacuteticos mostroacute
diferencias significativas Soacutelo hieronymaiacutena I pudo degradar PFLNA (un sustrato comuacuten
para proteasas de ananaacute) Z-Phe-Arg-p-nitroanilida fue hidrolizado por hieronymaiacutena I y II
mientras que Z-Arg-Arg-p-nitroanilida el sustrato sobre el que tiene alta afinidad bromelina
de tallo y comosaiacutena fue degradado soacutelo por hieronymaiacutena III Ademaacutes las tres
endopeptidasas mostraron diferentes especificidades sobre 5 de los 13 sustratos N-α-CBZ-
p-nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos ensayados el derivado de Ala fue preferido por
hieronymaiacutena I y II seguido por Gly y Asp respectivamente mientras que hieronymaiacutena III
clivoacute preferentemente el derivado de Lys seguido por Asp (Bruno et al 2008)
La comparacioacuten de la secuencia de los N-terminales de hieronymaiacutena II y III mostroacute
gran similitud entre siacute (93) y con las de la bromelina de tallo bromelina de fruto
comosaiacutena ananaiacutena y balansaiacutena I (70-90) (Bruno et al 2006 2008) Mientras que la
secuencia del N-terminal de hieronymaiacutena I mostroacute una similitud del oacuterden del 70 con la de
hieronymaiacutena II y balansaiacutena I y del 60 con las de hieronymaiacutena III bromelina de tallo
ananaiacutena y comosaiacutena (Bruno et al 2003 2008)
144 Macrodontaiacutenas
A partir de frutos de Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [= Pseudananas
sagenarius (Arruda) Camargo] se obtuvo un extracto parcialmente purificado por
precipitacioacuten acetoacutenica denominado macrodontaiacutena el cual fue activo en un amplio rango
de pH obtenieacutendose valores superiores al 75 de la actividad maacutexima entre pH 70 y 105
(caseiacutena) Macrodontaiacutena fue estable en el rango de pH de maacutexima actividad asiacute como en
condiciones de elevada fuerza ioacutenica Por el contrario a diferencia de otras fitoproteasas
macrodontaiacutena no fue demasiado termoestable ya que la actividad residual se redujo al
50 luego de ser incubada durante 2 h a 45 ordmC (Brullo 2003)
Desde macrodontaiacutena se lograron purificar dos endopeptidasas macrodontaiacutena I con
una masa molecular de 25 kDa (SDS-PAGE) y pI de 61 y macrodontaiacutena II con masa
molecular de 27 kDa (SDS-PAGE) y pI de 59 Macrodontaiacutena I exhibioacute un rango de pH
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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oacuteptimo entre pH 61 y 85 en tanto que en macrodontaiacutena II fue maacutes estrecho (pH 75-85)
La actividad de ambas proteasas sobre N-α-CBZ-p-nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos mostroacute
mayor afinidad hacia el derivado de Ala seguido por el de Gln y Tyr El E-64 inhibidor
especiacutefico del sitio activo de cisteiacutenproteinasas exhibioacute un comportamiento diferencial frente
a una y otra proteasa ya que produjo inhibicioacuten praacutecticamente total de macrodontaiacutena I
pero macrodontaiacutena II conservoacute un 15 de actividad residual hecho que podriacutea
relacionarse con una diferente geometriacutea del sitio activo como sugieren Ritonja et al (1989)
para bromelaiacutena de tallo (Brullo 2003) Macrodontaiacutena I y II fueron activas frente a Bz-Phe-
Val-Arg-NHMec pero no frente a Z-Arg-Arg-NHMec Las secuencias N-terminales de
macrodontaiacutena I y II revelan un 926 de identidad entre siacute un 80-90 con comosaiacutena
ananaiacutena bromelina de tallo y balansaiacutena I (Loacutepez et al 2001) un 70-80 con
hieronymaiacutena II y III y un 60 con hieronymaiacutena I (Bruno et al 2008)
Brullo (2003) determinoacute la estructura primaria de macrodontaiacutena I que demostroacute estar
compuesta por 213 aminoaacutecidos con un peso molecular calculado de 23486 Da valor
consistente con el dato aportado por la espectrometriacutea de masas (23459 Da) La
comparacioacuten con las secuencias completas de algunas fitoproteasas cisteiacutenicas reveloacute un
alto grado de identidad (alrededor del 70) con las de Ananas comosus con bromeliacutena de
fruto exhibioacute la mayor similitud (770 de identidad) seguida por ananaiacutena (con 719 de
identidad) y bromeliacutena de tallo (con 671 de identidad) Ademaacutes fue determinado el
caraacutecter no glicoproteacuteico de la enzima Al igual que en papaiacutena en macrodontaiacutena I existen
7 residuos Cys seis de los cuales participan de los tres puentes disulfuro presentes en la
estructura de esta clase de enzimas Dada la semejanza estructural entre varias proteasas
comparadas se concluye que macrodontaiacutena I integra el Clan CA de las proteasas
cisteiacutenicas que lidera papaiacutena (Brullo 2003)
15 Objetivos
Como se ha dicho el extracto acuoso obtenido del ananaacute [Ananas comosus (L)
Merr] conocido como bromelina ha mostrado tener tanto in vivo como in vitro efectos
antiedematoso antiinflamatorio antitumoral antitromboacutetico entre otras acciones
farmacoloacutegicas Pertenece al grupo de proteasas que son administradas oralmente en el
tratamiento sisteacutemico contra la inflamacioacuten las enfermedades relacionadas con la
coagulacioacuten sanguiacutenea y el caacutencer Su baja toxicidad permite que sea bien tolerada en
tratamientos largos Si bien su mecanismo de accioacuten auacuten no ha sido definitivamente
dilucidado sus efectos farmacoloacutegicos son adjudicados principalmente a sus
endopeptidasas cisteiacutenicas Actividades farmacoloacutegicas diversas han sido tambieacuten atribuidas
a fitoproteasas de tipo cisteiacutenicas pertenecientes a otras bromeliaacuteceas (Bromelia fastuosa)
asiacute como a especies pertenecientes a otras familias (Caricaceae Moraceae)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
22
Algunas especies de la familia Bromeliaceae entre ellas Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes se caracterizan por producir grandes cantidades de
endopeptidasas cisteiacutenicas Crecen en amplias regiones de nuestro paiacutes (NEA y NOA) asiacute
como en Brasil Bolivia Paraguay y Colombia Excepto el uso de frutos de B balansae para
tratar la tos en una regioacuten de Brasil no se conocen usos medicinales para estas tres
especies A partir de sus frutos se han aislado y caracterizado en el LIProVe varias
proteasas de tipo cisteiacutenicas que sin embargo no han sido objeto de estudios
farmacoloacutegicos hasta este momento
Es propoacutesito del presente trabajo aportar al conocimiento en relacioacuten a los posibles
usos medicinales de especies de bromeliaacuteceas autoacutectonas de nuestro paiacutes no estudiadas
auacuten para dichos fines Bajo la suposicioacuten que las proteasas de Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes por pertenecer al mismo tipo cataliacutetico y a la misma
subfamilia vegetal podriacutean mostrar actividades bioloacutegicas similares a las proteasas de
Ananas comosus nos planteamos como objetivo general de la presente tesis
La buacutesqueda de posibles efectos farmacoloacutegicos de extractos ricos en
cisteiacutenendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi B balansae
y Pseudananas macrodontes y su comparacioacuten con bromelina
Y como objetivos especiacuteficos
Evaluar el efecto antiinflamatorio de los extractos de B hieronymi B balansae
y P macrodontes
Evaluar los efectos de los extractos de B hieronymi B balansae y P
macrodontes sobre algunos de los componentes de la hemostasia
Evaluar los extractos de B hieronymi B balansae y P macrodontes como
posibles agentes antitumorales
Tratar de establecer la posible relacioacuten entre los efectos medidos y la actividad
proteoliacutetica de las cisteiacutenendopeptidasas estudiadas
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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2 MATERIAL VEGETAL
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
28
21 Material Vegetal Utilizado
211 Bromelia hieronymi Mez
Crece en bosques xeroacutefitos de la provincia fitogeograacutefica chaquentildea Habita desde el
SE de Bolivia a traveacutes del Chaco paraguayo y argentino hasta las provincias de Tucumaacuten
Santiago del Estero y Chaco (Arenas 1997)
Frutos inmaduros fueron recogidos en los alrededores de la ciudad de Santiago del
Estero por el Ing Lucas Roic de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad
Nacional de Santiago del Estero Un ejemplar de referencia ha sido depositado en el
herbario de la Divisioacuten Plantas Vasculares de la Facultad de Ciencias Naturales y Museo de
la Universidad Nacional de La Plata Los frutos fueron lavados secados al aire y
almacenados en freezer a -20 ordmC hasta su uso
2111 Extracto parcialmente purificado de frutos de B hieronymi (Bh)
Aproximadamente 50 g de frutos congelados fueron cortados y triturados en una
procesadora durante 1 min en intervalos de 10 s con igual tiempo de espera con 250 mL de
buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 conteniendo EDTA y cisteiacutena 5 mM Luego de filtrar con
gasa se centrifugoacute durante 30 min a 4 ordmC y 12000 g El sobrenadante que constituye el
extracto crudo se fraccionoacute y almacenoacute a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue
realizada sobre bantildeo de hielo
A fin de eliminar compuestos fenoacutelicos y la mayoriacutea de los carbohidratos presentes
al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y en agitacioacuten suave se le adicionaron 4
voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC Luego de permitir la precipitacioacuten durante 30 min
a 4 ordmC se centrifugoacute a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC Se descartoacute el sobrenadante y el
precipitado fue secado al vaciacuteo durante 30 min el que finalmente fue resuspendido en buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Bruno 2007)
212 Bromelia balansae Mez
Frecuente en el sotobosque umbriacuteo es una planta asociada con el aacutembito fluvial Se
distribuye desde Colombia Amazonia Centro y Este de Brasil Regioacuten Oriental del
Paraguay hasta Corrientes y Misiones y las zonas riberentildeas de Formosa y Chaco en
Argentina (Arenas 1997)
El material estudiado proviene de la Provincia de Misiones (en la proximidad de
Posadas ruta 105 Km 28 a 33 entre los departamentos de San Joseacute y Fachinal) La
recoleccioacuten fue llevada a cabo por el Dr Aniacutebal Amat de la Facultad de Ciencias Exactas
Quiacutemicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones donde se encuentra
depositado un ejemplar de herbario Los frutos fueron lavados secados y almacenados a -
20 ordmC hasta su uso
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
29
2121 Extracto parcialmente purificado de frutos de B balansae (Bb)
Aproximadamente 40 g de frutos semimaduros congelados fueron cortados y
triturados en una procesadora 10 veces durante 10 s (con intervalos de 20 s) con 200 mL de
buffer fosfato soacutedico 01M de pH 7 conteniendo EDTA 5 mM y cisteiacutena 125 mM Luego de
filtrar la preparacioacuten resultante con gasa se la centrifugoacute a 12000 g durante 25 min a 4 ordmC y
el sobrenadante resultante que corresponde al extracto crudo fue fraccionado y
almacenado a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue realizada sobre bantildeo de
hielo
Al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y con agitacioacuten suave se le agregoacute un
volumen de etanol preenfriado a -20 ordmC y se lo dejoacute durante 30 min a 4 ordmC Luego se
centrifugoacute a 3000 g durante 30 min a 4 ordmC El sobrenadante en bantildeo de hielo fue tratado
con 3 voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC y luego de dejarlo durante 30 min a 4 ordmC fue
centrifugado a 3000 g durante 30 min a 4 ordmC Una vez eliminado el sobrenadante el
precipitado fue secado al vaciacuteo durante 45 min Finalmente fue resuspendido con buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Pardo 2004)
213 Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [= P sagenarius (Arruda) Camargo]
Vegeta en el interior de bosques huacutemedos y sombriacuteos es caracteriacutestico en bosques
de galeriacutea Se extiende desde el nordeste centro y este de Brasil a traveacutes del Paraguay
Oriental hasta la Mesopotamia argentina Se halla en toda la cuenca de los riacuteos Paraguay y
Paranaacute desde Bolivia hasta la altura del litoral santafecino (Arenas 1997)
Los frutos en estado semimaduro fueron recogidos en Santa Ana departamento de
Candelaria Provincia de Misiones por el Prof Aniacutebal Amat Un ejemplar de referencia ha
sido depositado en el herbario de la Facultad de Ciencias Exactas Quiacutemicas y Naturales de
la Universidad Nacional de Misiones Los frutos fueron lavados secados al aire y
almacenados a -20 ordmC hasta su uso
2131 Extracto parcialmente purificado de frutos de P macrodontes (Pm)
Aproximadamente 120 g de frutos semimaduros congelados y desprovistos de
semillas y bracteacuteolas fueron cortados y triturados en una procesadora durante 1 min (en
intervalos de 10 s con igual tiempo de espera) con 200 mL de buffer fosfato soacutedico 01M de
pH 6 conteniendo EDTA y cisteiacutena 5 mM Luego de filtrar la preparacioacuten resultante con gasa
se la centrifugoacute a 5000 g durante 30 min a 4 ordmC y el sobrenadante resultante (extracto crudo)
fue fraccionado y almacenado a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue realizada
sobre bantildeo de hielo
Al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y con agitacioacuten suave se le agregoacute un
volumen de etanol preenfriado a -20 ordmC y se lo dejoacute durante 30 min a 4 ordmC Luego se
centrifugoacute a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC El sobrenadante en bantildeo de hielo fue luego
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
30
tratado con 3 voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC y luego de dejarlo durante 120 min a
4 ordmC fue centrifugado a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC Una vez eliminado el sobrenadante
el precipitado fue secado al vaciacuteo durante 30 min Finalmente fue resuspendido con buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Brullo 2003)
214 Ananas comosus (L) Merr
Es una planta perenne nativa de Ameacuterica del Sur de escaso porte y con hojas duras
y lanceoladas de hasta 1 metro de largo fructifica una vez cada tres antildeos produciendo un
uacutenico fruto fragante y dulce muy apreciado en gastronomiacutea (Garciacutea Suaacuterez amp Serrano
2005)
Los efectos evaluados de los preparados proteoliacuteticos fueron comparados con los de
bromelina de tallo comercial (B4882 Sigma Aldrich)
215 Reactivos quiacutemicos
En todos los casos se usoacute etanol 96ordm calidad medicinal (Soria) EDTA (Invitrogen)
cisteiacutena (Sigma Aldrich) y fosfato soacutedico pureza 98 (Carlo Erba)
22 Caracterizacioacuten proteoliacutetica de los extractos parcialmente purificados (Bh Bb y Pm) y de bromelina
221 Teacutecnicas y metodologiacutea
2211 Dosaje de la actividad caseinoliacutetica
La preparacioacuten del sustrato se realizoacute suspendiendo 1 g de caseiacutena de leche bovina
(Sigma Aldrich) en 100 mL de solucioacuten buffer (Tris-HCl 01M pH 80) la suspensioacuten se
colocoacute en un bantildeo de agua que se llevoacute a ebullicioacuten y se mantuvo durante 20 min en esas
condiciones La solucioacuten resultante se filtroacute en caliente y una vez enfriada se agregoacute cisteiacutena
25 mM como activador de proteasas cisteiacutenicas
La mezcla de reaccioacuten se preparoacute con 11 mL de solucioacuten de caseiacutena al 1 y 01 mL
de solucioacuten del extracto en estudio La reaccioacuten fue llevada a cabo a 37 ordmC y detenida a los 2
min por la adicioacuten de 18 mL de aacutecido tricloroaceacutetico al 5 luego de lo cual los tubos fueron
centrifugados a 4000 g durante 30 min determinaacutendose la absorbancia de los
sobrenadantes a 280 nm medida a traveacutes de una celda de 1 cm de paso En todos los
casos fueron realizados ensayos en blanco agregando al preparado proteoliacutetico primero el
aacutecido tricloroaceacutetico y por uacuteltimo la solucioacuten de caseiacutena
Siguiendo el criterio de Sarath et al (1989) para expresar la actividad enzimaacutetica
cuando se utilizan sustratos proteicos se definioacute para este caso una unidad arbitraria
(Unidad caseinoliacutetica UCas) que corresponde a la cantidad de enzima requerida para
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
31
producir un incremento de una unidad de absorbancia a 280 nm al cabo de 1 min en las
condiciones de ensayo
2212 Cuantificacioacuten del contenido proteico
Se utilizoacute el meacutetodo de Bradford (1976) basado en que la unioacuten del Coomassie Blue G-
250 a la proteiacutena produce un corrimiento del maacuteximo de absorbancia de 465 nm (forma roja
del colorante libre) a 595 nm (forma azul del complejo colorante-proteiacutena) Las curvas de
calibracioacuten se confeccionaron utilizando seroalbuacutemina bovina (Sigma-Aldrich) en el rango de
02-12 mgmL para el ensayo estaacutendar y en el rango de 10-100 μgmL para el microensayo
2213 Isoelectroenfoque
Las bandas proteicas se determinaron por isoelectroenfoque (IEF) utilizando un equipo
Mini IEF Cell (Modelo 111 Bio Rad) Las muestras se precipitaron con 4 voluacutemenes de
acetona durante 30 min y luego de centrifugar a 16000 g durante 15 min el precipitado
resultante fue redisuelto con agua bidestilada
Los geles fueron preparados mezclando 20 mL de acrilamida-bisacrilamida (25T6
3C7) 20 mL de glicerol (25 pv) 05 mL de anfolitos Biolyte 3-10 (para Bh Bb y
bromelina) o Pharmalyte 4-65 (para Pm) y 55 mL de agua luego que dicha mezcla fue
degasificada se adicionaron 3 μL de TEMED y 60 μL de persulfato de amonio al 10
Las muestras (1-5 microL) se sembraron y se permitioacute que difundieran dentro del gel
durante 5 min Los electrodos fueron humedecidos con agua bidestilada y los geles se
apoyaron inmediatamente sobre los mismos El IEF fue llevado a cabo en tres etapas
sucesivas 15 min a 100 V 30 min a 200 V y finalmente 1 h a 450 V
Una vez concluida la corrida los geles fueron sumergidos durante 30 min en solucioacuten
fijadora (4 g de aacutecido sulfosaliciacutelico 30 mL de metanol 125 g de aacutecido tricloroaceacutetico y agua
csp 100 mL) Una vez fijados los geles fueron tratados durante 2 h con la solucioacuten
colorante (10 mL de aacutecido aceacutetico glacial 27 mL de etanol 40 mg de Coomassie Brilliant
Blue R-250 500 mg de CuSO4 y agua csp 100 mL) decolorados por tres lavados
sucesivos con solucioacuten decolorante I (7 mL de aacutecido aceacutetico glacial 12 mL de etanol 500
mg de CuSO4 y agua csp 100 mL) y finalmente sumergidos en solucioacuten decolorante II (7
mL de aacutecido aceacutetico glacial 12 mL de Etanol y agua csp 100 mL) hasta obtener un fondo
claro
6 T= (g acrilamida+g bisacrilamida) x 100 volumen total
7 C= g bisacrilamida x 100 (g acrilamida+g bisacrilamida)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
32
2214 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Para el moldeado de los geles y la realizacioacuten de la corrida electroforeacutetica se empleoacute
el equipo Mini Protean III (Bio-Rad) y se procedioacute de acuerdo a la teacutecnica de Laemmli (1970)
con modificaciones Los geles se prepararon con poliacrilamida al 16 (Tabla 21)
Reactivos Gel de apilamiento
(5) Gel de resolucioacuten
(16)
Acrilamida-Bisacrilamida (3008) 115 mL 4 mL
Buffer de resolucioacuten - 094 mL
Buffer de apilamiento 09 mL
H2O 453 mL 2425 mL
SDS al 10 70 μL 75 μL
PSA 10 52 μL 50 μL
TEMED 4 μL 4 μL
Tabla 21 Sistema de geles empleado Buffer de resolucioacuten Tris-HCl 3M pH 88 Buffer de apilamiento Tris-HCl
05M pH 68 PSA persulfato de amonio TEMED NNNacuteNacute-tetrametiletilendiamina
Las muestras fueron tratadas con el agregado de un volumen de buffer de muestra
(Tabla 22) previa adicioacuten de aacutecido iodoaceacutetico 1 mM (concentracioacuten final) llevadas a
ebullicioacuten durante 10 min y centrifugadas durante 10 min a 16000 g
Buffer de muestra
Tris 157 g
SDS 4 g
Glicerol 16 mL
Azul de bromofenol 4 mg
β-mercaptoetanol 25 μL
Llevar a pH 68 con HCl 1M
AD csp 100mL
Tabla 22 Composicioacuten del buffer de muestra El β-mercaptoetanol fue agregado durante el tratamiento de las
muestras
El buffer de reservorio (03 pv de Tris 01 pv de SDS y 144 pv de glicina) se
colocoacute en el reservorio catoacutedico hasta cubrir la parte superior del gel y en el anoacutedico hasta
una altura suficiente como para permitir que todo el electrodo haga contacto con eacutel
En las distintas calles se sembraron 10-15 μL de las muestras y 3 μL de los patrones
de peso molecular (LMW GE Healthcare) fosforilasa b (97 kDa) albuacutemina (66 kDa)
ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (30 kDa) inhibidor de tripsina (201 kDa) y α-
lactoalbuacutemina (144 kDa)
La intensidad de corriente fue de 30 mA durante el apilado y de 60 mA durante la
resolucioacuten hasta la finalizacioacuten de la corrida Inmediatamente despueacutes los geles fueron
removidos de las placas y dejados durante 30 min en solucioacuten fijadora (10 vv de aacutecido
aceacutetico 50 vv de metanol) Luego fueron coloreados con solucioacuten colorante (10 vv de
aacutecido aceacutetico 40 vv de metanol y 100 mg de Coomassie Brillant Blue R-250) y
decolorados con una solucioacuten de aacutecido aceacutetico al 10 vv
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
33
2215 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina
Con el fin de determinar si los efectos medidos para los distintos preparados
proteoliacuteticos eran debidos a la accioacuten de sus proteasas cisteiacutenicas fue necesario evaluar el
efecto de los mismos preparados desprovistos de actividad proteoliacutetica
El meacutetodo de inhibicioacuten que se eligioacute fue tratar los preparados con E-64 (trans-
epoxisuccinil-L-leucilamido(4-guanidino)butano) un potente irreversible y selectivo inhibidor
de proteasas cisteiacutenicas El grupo trans-epoxisuccinil (resto activo) del E-64 se une
irreversiblemente al grupo tiol del sitio activo de muchas proteasas cisteiacutenicas tales como
papaiacutena y bromelina y no reacciona con los grupos tiol de otras enzimas no proteasas como
L-lactato deshidrogenasa (Barrett et al 1982) Dada esta gran especificidad y la baja
toxicidad que ha mostrado es considerado muy uacutetil para ensayos in vivo (Katunuma et al
1995)
22151 Tratamiento con E-64
Bh Bb y Pm fueron obtenidos seguacuten lo indicado previamente (2111 2121 y
2131 respectivamente) y antes de liofilizarlos diferentes aliacutecuotas de cada uno fueron
incubadas con soluciones de 5 10 30 60 80 y 100 μM (concentracioacuten en volumen de
mezcla) de E-64 (E3132 Sigma Aldrich) durante 30 min a 37 ordmC La solucioacuten de bromelina
fue preparada resuspendiendo el polvo comercial en buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 (30
mgml) y diferentes aliacutecuotas fueron incubadas con 60 100 130 150 y 250 μM de E-64 Los
blancos se incubaron de igual manera pero reemplazando el E-64 por igual volumen de
agua destilada Luego se determinoacute la actividad proteoliacutetica de cada aliacutecuota y se la
referencioacute a la actividad proteoliacutetica del preparado blanco a la que se consideroacute el 100
(actividad residual porcentual)
222 Resultados
2221 Perfiles de pI y de peso molecular de Bh Bb y Pm
El contenido proteico la actividad proteoliacutetica y la actividad especiacutefica de cada
preparado de Bh Bb y Pm evaluado se indican en cada capiacutetulo En la Figura 21 se
muestran los perfiles de pI obtenidos para cada preparado los cuales se correspondieron
con los reportados para los extractos parcialmente purificados de Bromelia hieronymi (Bruno
et al 2003) B balansae (Pardo et al 2000) y Pseudananas macrodontes (Loacutepez et al
2000)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Figura 21 IEF A Bh bandas de pI 59 y 64 (Hironymaiacutena III) pI 76 y 83 (Hieronymaiacutena II) pH ge93
(Hieronymaiacutena I) B Bb banda de pI asymp 5 (Balansaiacutena I) bandas de pI 85 y 87 (balansaiacutena II) C Pm bandas de pI 57 59 (Macrodontaiacutena I) y 61 (Macrodontaiacutena II) D Bro (Bromelina de tallo) banda de pI gt93
La banda de pI asymp 46 para bromelina (Fig21 D) se corresponde a la bromelina de
fruto que estaacute presente en pequentildeas cantidades en los tallos de Ananas comosus (Hale et
al 2005)
En la Figura 22 se observan las bandas caracteriacutesticas todas ellas de alrededor de
25 kDa de las proteasas de Bh (asymp25 kDa) Bb (asymp24 kDa) y Pm (asymp26 kDa) La banda de asymp 29
kDa presente en Bh y la banda de asymp30 kDa contenida en Pm tambieacuten estaacuten presentes en los
extractos crudos respectivos y desaparecen cuando las corridas electroforeacuteticas se hacen
sin previa inhibicioacuten con aacutecido iodoaceacutetico comportamiento frecuente en el caso de
proteasas vegetales que actuacutean de inmediato sobre sus sustratos
Figura 22 SDS-PAGE de Bh Bb y Pm A la izquierda patrones de PM (kDa)
A B C D
Bh Bb Pm
144
201
300
450
660
970
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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2222 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina
En la Figura 23 se muestra la actividad porcentual residual de Bh Bb Pm y
bromelina luego de incubarlos con distintas concentraciones de E-64 durante 30 min a 37
ordmC
Figura 23 Actividad residual () de la actividad especiacutefica de Bh Bb Pm y bromelina (Bro) Media plusmn
DE (n=3)
De las curvas de inhibicioacuten de la Figura 23 se obtuvo la concentracioacuten miacutenima de E-
64 que inhibe a cada preparado 30 μM para Bh 10 μM para Bb y Pm 150 μM para 30
mgmL de bromelina las cuales fueron aumentadas un 10 maacutes al momento de obtener los
preparados inhibidos para los distintos ensayos
Cuando los preparados fueron liofilizados (excepto bromelina) previo a la evaluacioacuten
de los distintos efectos se les midioacute la actividad proteoliacutetica y la concentracioacuten de proteiacutenas
Sin embargo se observoacute una aparente inconsistencia en la concentracioacuten de proteiacutenas
medidas la concentracioacuten de proteiacutenas del liofilizado inhibido fue un 15 30 y 70 respecto
de la concentracioacuten del liofilizado sin inhibir para Bh Bb y Pm respectivamente
Habitualmente el proceso de liofilizacioacuten no genera peacuterdida de proteiacutenas en este tipo de
preparaciones Para comprobar si ello se debiacutea a una destruccioacuten parcial de las proteasas
se analizoacute cada material liofilizado por SDS-PAGE lo que permitioacute mostrar la presencia de
las bandas esperadas con intensidad similar en los liofilizados activos e inhibidos
Debido a que Bh era el preparado que aparentemente ldquoperdiacuteardquo maacutes proteiacutenas se lo
eligioacute para hacer ensayos de inhibicioacuten y evitando la liofilizacioacuten determinar el contenido
proteico Para esto se repitioacute el procedimiento de inhibicioacuten descripto en 22151 con 10
30 y 60 μM de E-64 y a cada una de las aliacutecuotas de Bh se le determinoacute la concentracioacuten de
proteiacutenas la actividad proteoliacutetica y el perfil por SDS-PAGE
-5
15
35
55
75
95
0 50 100 150 200 250
Act
ivid
ad r
esi
du
al (
)
E-64 (μM)
Pm
Bb
Bh
Bro
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
36
En la Figura 24 se muestran la actividad porcentual residual (A) y el contenido de
proteiacutenas (B) de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 durante 30
min a 37 ordmC
Figura 24 A Actividad porcentual residual () de la actividad proteoliacutetica y de la actividad especiacutefica de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 B Contenido proteico de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 Media plusmn DE (n=3)
Se observa una disminucioacuten en la concentracioacuten de proteiacutenas de Bh al aumentar la
concentracioacuten de E-64 Sin embargo en el SDS-PAGE de las distintas aliacutecuotas de Bh
(Figura 25) no se observa peacuterdida ni disminucioacuten de intensidad de las bandas principales de
Bh aun despueacutes de incubar Bh con 60 μM de E-64
Figura 25 SDS-PAGE Ec extracto crudo de B hieronymi 0 Bco 10 30 y 60 Bh luego de incubarlo con E-64 10 30 y 60 μM respectivamente P patrones de peso molecular (LMW Bio-Rad fosforilasa b 974 kDa seroalbuacutemina 662 kDa ovoalbuacutemina 45 kDa anhidrasa carboacutenica 31 kDa inhibidor de tripsina 215 kDa y lisozima 144 kDa
Por otro lado en la Figura 24 B se observa que luego de inhibir Bh con 30 μM de E-
64 (30) la concentracioacuten de proteiacutenas fue asymp14 de la concentracioacuten de proteiacutenas de Bh sin
inhibir (0) lo cual concuerda con la relacioacuten de proteiacutenas de los liofilizados activo e inhibido
observada para Bh
La aparente inconsistencia entre lo observado en la Figura 24 B y la Figura 25
podriacutea explicarse por la dependencia de la sensibilidad del meacutetodo de Bradford con la
composicioacuten de aminoaacutecidos en la superficie proteica (Lucarini amp Kilikian 1999) Si bien el
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 10 30 60
Pro
teiacuten
as (
mg
ml)
E-64 (μM)
A B
-2
18
38
58
78
98
0 5 10 30 60 80 100
Act
ivid
ad r
esi
du
al (
)
E-64 (μM)
Actividad caseinoliacutetica (Ucasml)
Actividad especiacutefica (Ucasmg)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
37
E-64 interacciona esencialmente con la cisteiacutena del sitio activo de las cisteiacutenendopeptidasas
el inhibidor parece inducir alguacuten cambio conformacional en las proteasas tratadas que afecta
fuertemente la reaccioacuten con el colorante No hemos encontrado referencia alguna a este
comportamiento en la bibliografiacutea consultada
A pesar de esta dificultad en la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas para
los distintos ensayos los preparados inhibidos se obtuvieron inhibieacutendolos seguacuten las
concentraciones de E-64 definidas en 2222 y luego se les midioacute la actividad caseinoliacutetica y
se realizoacute un IEF y un SDS-PAGE La inhibicioacuten fue llevada a cabo al momento previo de la
liofilizacioacuten para los preparados destinados a la evaluacioacuten del efecto antiinflamatorio
(Capiacutetulo 3) ya que los mismos fueron realizados en San Luis y se consideroacute maacutes adecuado
transportarlos ya inhibidos con la caracterizacioacuten ya hecha en el LIProVe En tanto que los
preparados destinados al resto de los ensayos (Capiacutetulos 4 y 5) fueron inhibidos luego de
ser liofilizados previamente a los ensayos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
38
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3 EFECTO
ANTIINFLAMATORIO
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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31 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al dantildeo
causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por cualquier agresor de naturaleza
bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica (Garciacutea Barreno 2008) Una respuesta inflamatoria
tiacutepica consta de cuatro componentes los inductores inflamatorios los sensores que los
detectan los mediadores inflamatorios inducidos por los sensores y los tejidos diana o
efectores que se ven afectados por los mediadores Dependiendo de la naturaleza de la
causa desencadenante diferentes combinaciones de los distintos componentes existentes
daraacuten lugar a diferentes respuestas inflamatorias Asiacute las respuestas inflamatorias a la
infeccioacuten y a la lesioacuten tisular esteacuteril tienen diferentes propoacutesitos la primera tiene por objeto
proteger al hueacutesped de la infeccioacuten y se puede acoplar con la induccioacuten de la inmunidad
adaptativa mientras que la segunda sirve principalmente para promover la reparacioacuten de los
tejidos (Medzhitov 2010)
311 Inflamacioacuten aguda
La inflamacioacuten aguda es la respuesta temprana de un tejido ante la lesioacuten es
inespeciacutefica de corta duracioacuten y se caracteriza por cambios en la microcirculacioacuten
exudacioacuten de liacutequido y migracioacuten de leucocitos desde los vasos sanguiacuteneos al aacuterea
afectada Desde el punto de vista cliacutenico se caracteriza por los cinco signos cardinales que
se manifiestan en el aacuterea dantildeada rubor (eritema) calor tumoracioacuten (edema) dolor y
functio laesa (peacuterdida de la funcioacuten por una combinacioacuten de los 4 puntos anteriores) Las
alteraciones morfoloacutegicas y funcionales son una manifestacioacuten de una serie compleja de
eventos interrelacionados respuesta vascular respuesta celular y cooperacioacuten tisular viacutea
mediadores quiacutemicos de la inflamacioacuten (Garciacutea Barreno 2008)
3111 Respuesta vascular
Luego de una vasoconstriccioacuten pasajera de las arteriolas en el sitio de agresioacuten le
sigue una vasodilatacioacuten de las arteriolas precapilares producida por la relajacioacuten del
muacutesculo liso vascular Estos cambios llevan a un aumento del flujo sanguiacuteneo en el aacuterea
lesionada causando rubor y calor
Ciertos mediadores son capaces de producir la contraccioacuten de las ceacutelulas
endoteliales de veacutenulas y capilares lo cual produce separacioacuten de las uniones intercelulares
de dichas ceacutelulas conduciendo a un aumento de la permeabilidad vascular y permitiendo
el pasaje de proteiacutenas y liacutequido al espacio extracelular Este escape neto de fluido se
denomina exudacioacuten Entre las proteiacutenas plasmaacuteticas que exudan estaacute el fibrinoacutegeno el
cual se deposita como fibrina sobre los tejidos extravasculares lo cual disminuye la
permeabilidad tisular evitando la reentrada del exudado al vaso que finalmente conduce a la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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formacioacuten del edema A raiacutez del aumento de la permeabilidad vascular se produce un
aumento de viscosidad sanguiacutenea y el flujo sanguiacuteneo comienza a disminuir permitiendo el
acercamiento de los leucocitos a la pared de los vasos (Roitt 2003)
3112 Respuesta celular
Si bien los tipos celulares presentes en los exudados dependeraacuten del agente
agresor la ceacutelula predominante es el polimorfonuclear (PMN) neutroacutefilo en especial en la
fase temprana de la inflamacioacuten Los leucocitos llegan al sitio lesionado mediante una serie
de pasos marginacioacuten adhesioacuten emigracioacuten y quimiotaxis a traveacutes de la pared vascular
A raiacutez del enlentecimiento del flujo sanguiacuteneo los leucocitos son desplazados hacia
la periferia del vaso lo cual junto al aumento de la viscosidad sanguiacutenea favorece la
marginacioacuten leucocitaria hacia la superficie endotelial Esto les permite adherirse a la
superficie endotelial de los vasos proceso incrementado durante la inflamacioacuten aguda por el
aumento en la expresioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten (CAM) en ceacutelulas endoteliales de las
veacutenulas (P y E-selectinas ICAM PAF etc) y en los leucocitos (MAC-1 LFA-1 PAF-R L-
selectinas etc) Los neutroacutefilos adheridos pueden atravesar el vaso sanguiacuteneo por las
uniones intercelulares y la membrana basal (diapeacutedesis) alcanzando el espacio intersticial
(emigracioacuten) desde donde se dirigen al sitio de inflamacioacuten inducidos por un gradiente de
concentracioacuten de factores quimiotaacutecticos (quimiotaxis) (Roitt 2003)
La fagocitosis llevada a cabo fundamentalmente por macroacutefagos y neutroacutefilos es la
internalizacioacuten y digestioacuten celular de partiacuteculas extrantildeas y requiere el reconocimiento el
englobamiento y la degradacioacuten de la partiacutecula Cuando se trata de un agente inerte y
grande el reconocimiento es directo Las opsoninas son sustancias que recubren la
partiacutecula y favorecen su fagocitosis La destruccioacuten del material se lleva a cabo por las
especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) las especies reactivas de nitroacutegeno y el sistema
halogenador ademaacutes de mecanismos independientes del oxiacutegeno tales como la proteinasa
3 la catepsina G la lisozima y la lactoferrina entre otros Estos efectores junto a los
productos de degradacioacuten son liberados al medio extracelular por lo que los dantildeos
colaterales a los tejidos del hueacutesped resultan inevitables (Nathan 2006)
3113 Mediadores quiacutemicos8
La respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso dispositivo de mediadores
que se organizan en complejas redes reguladoras (Garciacutea Barreno 2008) Se trata de
moleacuteculas solubles que difunden faacutecilmente y actuacutean sobre los receptores de los efectores
Los mediadores pueden provenir de los sistemas plasmaacuteticos (coagulacioacuten complemento
cininas) ser liberados desde graacutenulos almacenados en ceacutelulas (serotonina histamina) o ser
8 En este apartado aquellos paacuterrafos que no contienen citas fueron adaptados convenientemente de Rotelli
(2004)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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41
sintetizados inmediatamente cuando se requieren (eicosanoides) Teniendo en cuenta su
accioacuten y su origen se pueden clasificar como se indica en la Tabla 31
Tabla 31 Clasificacioacuten de mediadores de la inflamacioacuten seguacuten accioacuten y origen
La histamina es un mediador temprano de la inflamacioacuten aguda y es liberado desde
los graacutenulos almacenados en los mastocitos perivasculares luego de ser estimulados por
neuropeacuteptidos liberados desde las terminaciones nerviosas (Benoist amp Mathis 2002)
antiacutegenos IL-1 C3a y C5a (Roitt 2003) entre otros Su accioacuten es mediada por receptores
(H) ubicados a lo largo de todo el lecho vascular principalmente en ceacutelulas del muacutesculo liso
y ceacutelulas endoteliales Sobre el muacutesculo liso produce dilatacioacuten mientras que sobre las
ceacutelulas endoteliales produce contraccioacuten y por tanto aumenta la permeabilidad vascular
estimula la expresioacuten de P-selectinas aumentando la adhesioacuten leucocitaria y estimula la
siacutentesis de NO y prostaciclina (PGI2) ambas con efectos vasodilatadores (Brunton et al
2006)
La serotonina (5-hidroxitriptamina 5-HT) puede tener un efecto vasoconstrictor o
vasodilatador seguacuten el receptor sobre el cual actuacutee sin embargo durante la inflamacioacuten
aguda actuacutea tempranamente provocando vasodilatacioacuten con aumento de permeabilidad
aunque con menor potencia que la histamina
Los eicosanoides son las familias de prostaglandinas (PGs) leucotrienos (LTs) y
compuestos similares que derivan de aacutecidos grasos poliinsaturados esenciales de 20
aacutetomos de carbono Son sintetizados en la membrana celular por activacioacuten de la
fosfolipasa A2 o de la fosfolipasa C las cuales catalizan la liberacioacuten del precursor
eicosanoide (aacutecido araquidoacutenico) desde la membrana celular (Brunton et al 2006)
A partir del aacutecido araquidoacutenico se inician dos viacuteas principales de siacutentesis la viacutea de
la ciclooxigenasa (COX) la cual conduce a la formacioacuten de PGs prostaciclinas (PGIs) y
tromboxanos (TXAs) y la viacutea de la lipooxigenasa la cual conduce a la siacutentesis de LTs
Mediadores que incrementan la permeabilidad vascular en el edema inflamatorio
Vasoactivos derivados de ceacutelulas Vasoactivos derivados del plasma
-Aminas bioacutegenas serotonina histamina
-Eicosanoides
-Factor activador de plaquetas (PAF)
-Oxido niacutetrico (NO)
-Cininas
-Cascada de coagulacioacuten
-Sistema de complemento
Mediadores involucrados en el reclutamiento celular (Factores quimiotaacutecticos)
-C5a C3a
-Eicosanoides (LTB4)
-Quimiocinas
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Existen dos isoformas de la COX COX-1 expresada de manera constitutiva en la mayoriacutea
de las ceacutelulas y COX-2 inducida por citocinas y factores de crecimiento entre otros
estiacutemulos
Los leucotrienos LTC4 y LTD4 aumentan la permeabilidad vascular aumentando el
exudado de plasma El LTB4 ademaacutes de aumentar la permeabilidad es un potente agente
quimiotaacutectico aumenta la adherencia y emigracioacuten de los neutroacutefilos a traveacutes del endotelio y
estimula la degranulacioacuten y la siacutentesis de superoacutexido en los PMNs
Mientras que la PGF2 es vasoconstrictora PGE2 y PGI2 son vasodilatadoras y
aumentan el edema y la infiltracioacuten de leucocitos en el aacuterea inflamada Sin embargo PGE2
puede actuar como inmunosupresor inhibe la liberacioacuten de los productos lisosomales de los
neutroacutefilos y macroacutefagos asiacute como la participacioacuten de leucocitos en reacciones de
hipersensibilidad tardiacutea (Brunton et al 2006)
El factor activador de plaquetas (PAF) ademaacutes de ser un potente estimulador de la
agregacioacuten y activacioacuten plaquetaria aumenta la permeabilidad vascular la quimiotaxis y la
adhesioacuten de neutroacutefilos al endotelio asiacute como la generacioacuten de superoacutexido y enzimas
lisosomales desde los PMNs Al actuar sobre receptores acoplados a proteiacutenas G activa las
fosfolipasas A2 y C estimulando la siacutentesis de TXA2 PGs y LTs La trombina e histamina
estimulan su expresioacuten en las ceacutelulas endoteliales Se sintetiza en mastocitos plaquetas
neutroacutefilos eosinoacutefilos monocitos y NK (ldquonatural killersrdquo)
El oacutexido niacutetrico (NO) es un potente vasodilatador potencia la citotoxicidad de los
fagocitos y activa las COX-1 y COX-2 (Salvemini et al 1993) Es sintetizado por dos
isoformas de la oacutexido niacutetrico sintasa (NOS) La NOS constitutiva (c-NOS) estaacute presente en
plaquetas y ceacutelulas endoteliales y produce pequentildeas cantidades de NO La NOS inducible
(i-NOS) se expresa en muacuteltiples ceacutelulas tales como neutroacutefilos macroacutefagos ceacutelulas
endoteliales y muacutesculo liso vascular Diversos agentes vasoactivos (serotonina histamina
bradicinina trombina y estiacutemulos fiacutesicos) estimulan la siacutentesis de NO en las ceacutelulas
endoteliales
Las cininas (bradicinina plasmaacutetica y calidina tisular) son peacuteptidos derivados por
accioacuten de calicreiacutenas del cininoacutegeno plasmaacutetico (cininoacutegeno de alto peso molecular) y del
cininoacutegeno tisular (cininoacutegeno de bajo peso molecular) La calicreiacutena plasmaacutetica es activada
a partir de la precalicreiacutena por accioacuten del factor XII el cual a su vez es activado por contacto
con superficies cargadas negativamente (colaacutegeno heparina productos plaquetarios etc)
Las cininas tienen propiedad vasodilatadora (sobre arteriolas) y vasoconstrictor (sobre
arterias y venas de gran calibre) asiacute como tambieacuten aumentan la permeabilidad en la
microcirculacioacuten y estimulan la siacutentesis de PGs por activacioacuten de fosfolipasas A2 y C En
macroacutefagos estimulan la liberacioacuten de la interleucina IL-1 y del factor de necrosis tumoral
(TNF-α) Uno de sus receptores (B1) es inducible por dantildeo tisular e inflamacioacuten
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El paso final de la coagulacioacuten es la formacioacuten de fibrina la cual no soacutelo frena el
sangrado permitiendo la reparacioacuten del aacuterea lesionada sino que tambieacuten forma una malla en
la que quedan atrapados los agentes agresores impidiendo su diseminacioacuten Por otro lado
durante la formacioacuten de la fibrina se liberan fibrinopeacuteptidos A y B desde el fibrinoacutegeno los
cuales actuacutean como quimiotaacutecticos de los PMNs y potencian los efectos de la bradicinina
El sistema del complemento estaacute formado por proteiacutenas plasmaacuteticas (C) que actuacutean
en forma de cascada en la que cada enzima activa la siguiente La activacioacuten es
desencadenada por complejos antiacutegeno-anticuerpo y productos bacterianos Como
consecuencia de su activacioacuten se forman productos con propiedad opsonizante
quimiotaacutectica y capacidad liacutetica sobre ceacutelulas diana Los productos C5a y C3a estimulan el
estallido respiratorio en los fagocitos desencadenan la liberacioacuten de mediadores (histamina
PAF IL-3 4 5 y 6 entre otros) asiacute como la siacutentesis de LTs PGs y TXs desde mastocitos y
basoacutefilos C5a y en menor medida C3a es un potente agente quimiotaacutectico de neutroacutefilos
ademaacutes de estimular la siacutentesis de eicosanoides C5a tambieacuten genera vasodilatacioacuten y
aumento de la permeabilidad capilar C5a y C3a tambieacuten se pueden formar por accioacuten de la
plasmina la calicreiacutena y enzimas leucocitarias
Bajo el estiacutemulo local el macroacutefago hiacutestico libera las citocinas IL-1 y TNF-α entre
otros mediadores las cuales actuacutean estimulando las ceacutelulas endoteliales (luego de la
trombina o la histamina) ceacutelulas epiteliales y fibroblastos a liberar quimiocinas (MCP-1) Las
quimiocinas actuacutean sobre diversos tipos leucocitarios conducieacutendolos al sitio inflamado IL-8
es un potente quimiotaacutectico para neutroacutefilos pero tambieacuten para linfocitos (Roitt 2003)
312 Regulacioacuten y resolucioacuten de la inflamacioacuten
La finalizacioacuten de la respuesta inflamatoria y la transicioacuten al estado homeostaacutetico es
un proceso activo y altamente regulado conocido como la resolucioacuten de la inflamacioacuten
(Medzhitov 2010) Entre los mecanismos reguladores identificados se pueden mencionar
proteiacutenas reguladoras del complemento el factor transformante β (TGF-β) las IL-4 y IL-10
la PGE2 y los glucocorticoides endoacutegenos que actuacutean regulando la proliferacioacuten y
activacioacuten de las ceacutelulas inflamatorias (Roitt 2003) las lipoxinas (producidas por la 15-
lipooxigenasa en los tejidos) inhiben el reclutamiento de neutroacutefilos y promueven el
reclutamiento de los monocitos que eliminan las ceacutelulas muertas e inician la reparacioacuten del
tejido las resolvinas y protectinas (derivadas del aacutecido eicosapentanoico y del
docosahexanoico) tienen un papel crucial en la resolucioacuten de la inflamacioacuten junto a las
lipoxinas (Medzhitov 2008) los fosfoliacutepidos de las membranas de las ceacutelulas endoteliales
vasculares oxidados por las ROS disminuyen la expresioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten
(Brash 1999)
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Dependiendo de la cantidad de tejido destruido y la naturaleza del agente agresor la
inflamacioacuten puede generar secuelas tales como la cicatrizacioacuten y la formacioacuten de abscesos
La cicatrizacioacuten ocurre cuando hay dantildeo sustancial al tejido conectivo yo el tejido
carece de la capacidad para regenerar ceacutelulas especializadas Los tejidos muertos y el
exudado inflamatorio agudo se reemplazan por un tejido conectivo vascular especializado
llamado tejido de granulacioacuten el cual produce gradualmente colaacutegeno para formar una
cicatriz fibrosa A pesar de la peacuterdida de algunas ceacutelulas especializadas y algo de distorsioacuten
arquitectoacutenica de la cicatriz fibrosa se restablece la integridad estructural
La formacioacuten de abscesos es un proceso que tiene lugar cuando la reaccioacuten
inflamatoria aguda no puede destruireliminar el agente agresor y continuacutea con un
componente de la inflamacioacuten croacutenica Esto es maacutes comuacuten en el caso de la infeccioacuten por
bacterias pioacutegenas (Woolf et al 2002)
313 Inflamacioacuten croacutenica
Cuando la inflamacioacuten se mantiene durante un tiempo prolongado (semanas o
meses) se habla de inflamacioacuten croacutenica en la que coexisten el dantildeo tisular y los intentos
de reparacioacuten Puede producirse por mantenimiento de la inflamacioacuten aguda (si no se
resuelve la causa) o bien empezar de manera progresiva y poco evidente sin las
manifestaciones de la inflamacioacuten aguda Este segundo caso es el responsable del dantildeo
tisular de algunas enfermedades como la artritis reumatoide la aterosclerosis la
tuberculosis y la fibrosis pulmonar Ademaacutes es importante en el desarrollo del caacutencer y en
enfermedades que anteriormente se consideraban exclusivamente degenerativas como el
Alzheimer Entre las causas de la inflamacioacuten croacutenica se pueden distinguir las infecciones
persistentes (micobacterias ciertos hongos virus y paraacutesitos) las enfermedades mediadas
por el sistema inmune (artritis reumatoide reacciones aleacutergicas enfermedad de Crohn y
esclerosis muacuteltiple) y la exposicioacuten prolongada a agentes toacutexicos (polvo de siacutelice fibras
suturas y cuerpos extrantildeos que no pueden ser removidos por fagocitosis) (Kumar 2009)
Ante la persistencia durante diacuteas del agente agresor los PMNs son reemplazados
por ceacutelulas mononucleares (macroacutefagos linfocitos y ceacutelulas plasmaacuteticas) si bien pueden
persistir algunos neutroacutefilos Los macroacutefagos presentan una morfologiacutea variable secretan
mediadores de inflamacioacuten regulan la actividad de linfocitos y favorecen la proliferacioacuten y el
desarrollo de fibroblastos y ceacutelulas endoteliales Durante la fase proliferativa de la
inflamacioacuten croacutenica los fibroblastos restauran la matriz del tejido conectivo dantildeado
conduciendo a la fibrosis en tanto que la proliferacioacuten de ceacutelulas endoteliales favorece la
formacioacuten de pequentildeos capilares (angiogeacutenesis)
Un tipo morfoloacutegico de la inflamacioacuten croacutenica es la inflamacioacuten granulomatosa
caracterizada por una coleccioacuten organizada de macroacutefagos los cuales forman ceacutelulas
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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epiteliodes o se fusionan formando ceacutelulas gigantes ante la imposibilidad de digerir el agente
fagocitado Independientemente de su causa los granulomas pueden contener otras ceacutelulas
(linfocitos neutroacutefilos eosinoacutefilos fibroblastos) ademaacutes de fibrosis (Mukhopadhyay et al
2012) El proceso de formacioacuten de granulomas se puede dividir en 4 fases (iniciacioacuten
acumulacioacuten efectora y de resolucioacuten) en las cuales las ceacutelulas T tienen un rol
importante Durante la iniciacioacuten los macroacutefagos son atraiacutedos por el estiacutemulo inflamatorio y
comienza a nuclear la lesioacuten granulomatosa Durante la acumulacioacuten ceacutelulas T CD4+ se
acumulan en el sitio y reclutan otras ceacutelulas efectoras incluyendo ceacutelulas T maacutes
macroacutefagos y en algunos casos eosinoacutefilos Durante la fase efectora las ceacutelulas intentan
reducir la carga de patoacutegenos Por uacuteltimo una vez que la amenaza del patoacutegeno ha sido
reducida o eliminada la infiltracioacuten celular se reduce y se induce la formacioacuten del tejido
cicatricial (Co et al 2004) Las infecciones micoacuteticas la tuberculosis la lepra y la presencia
de cuerpos extrantildeos (talco suturas etc) son algunas de las causas de la inflamacioacuten
granulomatosa
En la inflamacioacuten no granulomatosa las ceacutelulas se encuentran diseminadas Se
caracterizan por la acumulacioacuten de linfocitos sensibilizados por antiacutegenos ceacutelulas
plasmaacuteticas y macroacutefagos Puede observarse necrosis tisular y fibrosis Las causas maacutes
comunes son las infecciones virales croacutenicas y las enfermedades autoinmunes entre otras
(Rotelli 2004)
314 Proteasas como antiinflamatorios
El rol de las proteasas como agentes antiinflamatorios especialmente el de la
tripsina es considerado desde la deacutecada del 50 en varios estudios (Martin et al 1954
Cohen et al 1955) En 1957 Innerfield reporta el efecto antiinflamatorio de la tripsina
administrada intramuscularmente en pacientes con tromboflebitis con gran componente
edematoso Atribuye a la proteasa un aumento en la permeabilidad tisular una disminucioacuten
en la viscosidad de los exudados y la reversioacuten del edema asiacute como la superacioacuten de la
isquemia en los tejidos con inflamacioacuten aguda al eliminar las barreras exudativas
extravasculares al flujo sanguiacuteneo en los pequentildeos vasos comprimidos
Un antecedente importante en el estudio de la accioacuten antiedematosa de las
proteasas cisteiacutenicas es el trabajo de Netti et al (1972) quienes compararon los efectos de
proteasas y agentes antiinflamatorios conocidos sobre edemas inducidos por distintos
agentes flogiacutesticos en pata de rata Los porcentajes de inhibicioacuten de edema para ficina
bromelina al igual que para un concentrado de enzimas proteoliacuteticas pancreaacuteticas fueron
iguales o superiores a los de indometacina acido acetilsaliciacutelico y fenilbutazona mientras
que la papaiacutena a la concentracioacuten ensayada no fue efectiva frente a ninguacuten edema En los
modelos animales la viacutea de administracioacuten de las preparaciones proteoliacuteticas es en su
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
46
mayoriacutea oral aunque la eficacia antiedematosa de la bromelina administrada
intraperitonealmente tambieacuten ha sido comprobada (Smyth et al 1962 Uhlig amp Seifert
1981)
3141 Bromelina
Desde su introduccioacuten comercial en 1957 se han publicado resultados cientiacuteficos
que revelan los efectos antitromboacutetico fibrinoliacutetico y antiinflamatorio de la bromelina
evaluados mediante ensayos in vivo e in vitro (Maurer 2001) Ademaacutes de los modelos de
edema ya mencionados otros modelos experimentales de inflamacioacuten en los que la
bromelina ha sido efectiva son los siguientes encefalomielitis aleacutergica experimental (un
modelo experimental de la esclerosis muacuteltiple humana) asma aleacutergico pleuritis inducida por
carragenina enfermedades reumatoloacutegicas en ratoacuten arterioesclerosis inmunoloacutegicamente
mediada en aloinjertos aoacuterticos de rata y enfermedad inflamatoria intestinal en ratones IL-10-
- (Fitzhugh et al 2008 Secor et al 2012)
Una serie de estudios cliacutenicos controlados reportaron la eficacia de la bromelina
frente a edema inflamacioacuten dolor hematomas entre otros signos en sinusitis aguda
traumatismos en cara cabeza y extremidades inferiores tumefaccioacuten post-operatoria
inflamacioacuten e hinchazoacuten post-traumaacutetica y cirugiacutea oral (Maurer 2001)
El uso de la bromelina como antiinflamatorio o analgeacutesico en la artritis reumatoide fue
sugerido por Cohen amp Goldman (1964) Maacutes recientemente la bromelina ha sido evaluada
para la artrosis en varios estudios cliacutenicos abiertos o de equivalencia disentildeados para
determinar la efectividad comparativa y la seguridad respecto al tratamiento estaacutendar con
antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) Dichos estudios sugieren que la bromelina sola o
en complejos enzimaacuteticos (PHL9 WOB10 y WOB-N11) puede ser beneficiosa o tan eficaz
como el tratamiento con AINEs mostrando buena tolerabilidad y leves reacciones adversas
(principalmente siacutentomas gastrointestinales) Sin embargo la mayoriacutea de los estudios tienen
determinados problemas metodoloacutegicos que hacen difiacutecil extraer conclusiones definitivas
(Brien et al 2004 2006)
En un estudio de nivel II de medicina basada en la evidencia (EBM) se ha
demostrado que el tratamiento con bromelina en nintildeos con sinusitis aguda puede ser
considerada como segura y beneficiosa (Braun et al 2005)
El efecto antiinflamatorio de la bromelina puede ser explicado por su accioacuten sobre
distintos niveles del complejo proceso inflamatorio como se sentildeala a continuacioacuten
9 PHL Phlogenzyme contiene bromelina tripsina y rutina
10 WOB Wobenzyme contiene bromelina papaiacutena tripsina quimotripsina pancreatina lipase y amilasa
11 WOB-N contiene bromelina tripsina papaiacutena quimotripsina pancreatina y rutina
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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31411 Efecto sobre los componentes de la coagulacioacuten
En el modelo edema de pata inducido por carragenina la accioacuten antiinflamatoria de
bromelina fue correlacionado con el aumento de la actividad fibrinoliacutetica seacuterica (Pirotta amp
Giuli-Morghen 1978) Ademaacutes la bromelina ha mostrado aumentar la concentracioacuten de
plasmina seacuterica (Smyth et al 1962) la activacioacuten de plasminoacutegeno a plasmina (Maurer et
al 2000) y disminuir el nivel seacuterico de fibrinoacutegeno (Livio et al 1978) Todos estos efectos
disminuiriacutean la deposicioacuten de fibrina en el aacuterea inflamada produciendo un aumento en la
permeabilidad tisular y vascular lo que promoveriacutea la reabsorcioacuten del fluido del edema
(Maurer 2001)
31412 Efecto sobre el sistema de calicreiacutenas
En el modelo de inflamacioacuten en ratas ldquobolsa de airerdquo inducido por caoliacuten la bromelina
redujo de manera dosis-dependiente el nivel de bradicinina en el sitio de inflamacioacuten y el
nivel de precalicreiacutena seacuterica los que fueron correlacionados con la reduccioacuten del exudado
plasmaacutetico (Kumakura et al 1988) explicando la accioacuten antiedematosa asiacute como
analgeacutesica de la bromelina
31413 Efecto sobre las viacuteas de la COX y la NOS
Los niveles de PGE2 asiacute como de sustancia P (un neuropeacuteptido asociado a la
percepcioacuten del dolor) se encontraron disminuidos en el exudado inflamatorio generado en
ratas por la implantacioacuten de esponjas embebidas en carragenina (Gaspani et al 2002) En
otro modelo inflamatorio la bromelina redujo de manera dosis-dependiente los niveles de
PGE2 y TXs junto con el volumen de exudado (Vellini et al 1986) Maacutes recientemente la
bromelina ha mostrado reducir la expresioacuten de la COX-2 y PGE2 por inhibicioacuten en la
translocacioacuten del factor nuclear kappa-B (NF-ĸB) en ceacutelulas tumorales asiacute como en modelos
experimentales de caacutencer (Chobotova et al 2010 Bhui et al 2012)
La administracioacuten oral de bromelina mejoroacute la disminucioacuten de la defecacioacuten en ratas
postoperatorias laparotomizadas al menos en parte mediante la inhibicioacuten de la
sobreexpresioacuten de la i-NOS del colon a traveacutes de la ruta del NF-kB (Wen et al 2006)
31414 Modulacioacuten de moleacuteculas de superficie celular
La bromelina ha mostrado remover moleacuteculas de superficie celular en leucocitos
(granulocitos monocitos y linfocitos) asociadas con la adhesioacuten y la activacioacuten leucocitaria
(Hale et al 2002) La reduccioacuten de la migracioacuten de neutroacutefilos en tres modelos murinos de
migracioacuten leucocitaria en cavidad intraperitoneal inflamada fue asociada a la remocioacuten de L-
selectina y principalmente de CD128 (receptor del quimioatractante IL-8) desde la superficie
leucocitaria lo que llevoacute a la eliminacioacuten de la adhesioacuten de alta afinidad mediada por
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
48
integrinas de los vasos sanguiacuteneos del sitio inflamado (Fitzhugh et al 2008) La bromelina
activa proteoliacuteticamente redujo la expresioacuten de CD25 (presente en la superficie de ceacutelulas T
activas que actuacutea como receptor del factor de proliferacioacuten IL-2) de manera dosis y tiempo
dependiente en ensayos in vitro y se propuso como mecanismo el clivaje proteoliacutetico de
CD25 desde la superficie celular (Secor et al 2009) Tambieacuten se ha sugerido que bromelina
podriacutea mediar su efecto antiinflamatorio actuando como moleacutecula de sentildealizacioacuten sobre los
receptores activados por proteasas (PAR) (Engwerda et al 2001 Muumlller et al 2012)
31415 Activacioacuten celular y produccioacuten de citoquinas
La bromelina mostroacute inhibir la transduccioacuten de sentildeales (viacutea MAPKERK-2) y la
produccioacuten de citoquinas (IL-4 IL-2 e IFN-γ) desde ceacutelulas T accioacuten que fue revertida al
inhibir la actividad proteoliacutetica de bromelina (Mynott et al 1999) En un modelo murino de la
enfermedad aleacutergica respiratoria ya establecida la bromelina redujo significativamente el
contenido de ceacutelulas T (CD4 y CD8) en el lavado bronqueoalveolar (BAL) sin afectar el
nuacutemero de ceacutelulas en el bazo o los ganglios linfaacuteticos hiliares ademaacutes de una disminucioacuten
de IL-4 IL-12 IL-17 asiacute como de IFN-α en el suero (Secor et al 2012)
La bromelina regula la produccioacuten de IFN-γTNF-α IL-1β e IL-6 de forma dependiente
de las condiciones inflamatorias La secrecioacuten de TNF-α IL-1β e IL-6 desde ceacutelulas
mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) obtenida de voluntarios sanos asiacute como de
macroacutefagos de ratoacuten seriacutea estimulada in vitro por la bromelina mediante un mecanismo
dependiente de IFN-γ Sin embargo en situaciones en las que las ceacutelulas inmunes ya han
sido estimuladas la bromeliacutena reduce la produccioacuten elevada de TNF-α IL-1β e IL-6 Por
ejemplo en presencia de lipopolisacaacuterido (LPS) un inductor de la reaccioacuten de inflamacioacuten
aguda bromelina reduce la expresioacuten de dichas citocinas desde PBMC (Chobotova et al
2010) Esta probable dualidad tambieacuten ha sido observada en modelos in vivo donde la
bromelina ha mostrado ser capaz tanto de mejorar como de inhibir las respuestas inmunes
dependientes de ceacutelulas T lo cual podriacutea depender del entorno inmunoloacutegico particular en el
que se la administra (Engwerda et al 2001)
Maacutes recientemente en un ensayo cliacutenico aleatorio controlado con placebo la
bromelina ha mostrado modular las respuestas celulares de linfocitos (cambio significativo
en el perfil circadiano de IFN-γ) despueacutes de su administracioacuten oral en voluntarios sanos
(Muumlller et al 2012)
Las evidencias experimentales dan cuenta de que la bromelina tendriacutea accioacuten sobre
muacuteltiples dianas y si bien su mecanismo antiinflamatorio no ha sido completamente
dilucidado numerosos efectos estaacuten mediados por su actividad proteoliacutetica (Pirotta amp Giuli-
Morghen 1978 Hale amp Haynes 1992 Mynott et al 1999 Hale et al 2002 Wen et al
2006 Hale et al 2005 Fitzhugh et al 2008 Secor et al 2009)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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32 Objetivos
Dentro del objetivo general de estudiar el posible efecto antiinflamatorio de los
extractos ricos en cisteiacutenendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) B
balansae (Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) se plantearon los siguientes objetivos
especiacuteficos
Evaluar el efecto de Bh Bb y Pm sobre la inflamacioacuten aguda y croacutenica empleando
modelos de inflamacioacuten en animales
Determinar si los efectos medidos tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los
extractos
Comparar los efectos de Bh Bb y Pm con los medidos para bromelina
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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33 Materiales y meacutetodos
331 Modelos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria provocada por distintos estiacutemulos (isquemia agentes
infecciosos injuria quiacutemica teacutermica o mecaacutenica interaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo) puede ser
medida por los signos cliacutenicos que la acompantildean eritema edema dolor e hiperalgesia Una
serie de mecanismos dan lugar a distintas fases en que puede caracterizarse al proceso
inflamatorio
-Fase aguda transitoria caracterizada por vasodilatacioacuten local e incremento de la
permeabilidad capilar
-Fase subaguda caracterizada por infiltracioacuten de leucocitos y ceacutelulas fagociacuteticas
-Fase croacutenica proliferativa en la cual aparece una degeneracioacuten del tejido y fibrosis
Diferentes modelos desarrollados en animales de experimentacioacuten permiten
reproducir dichas fases (Vogel 2002) proporcionando un meacutetodo necesario para el
descubrimiento del uso apropiado de nuevos agentes terapeacuteuticos (Willoughby 2003)
El efecto antiinflamatorio de los preparados proteoliacuteticos fue evaluado usando
modelos de inflamacioacuten aguda o subaguda (edema de pata de rata) y un modelo de
inflamacioacuten croacutenica proliferativa (test del granuloma)
3311 Modelos de inflamacioacuten aguda Edema de pata de rata
Este modelo se basa en medir la capacidad de los agentes antiinflamatorios de
inhibir el edema producido en la pata trasera de ratas o ratones luego de la inyeccioacuten de un
agente flogiacutestico El efecto antiinflamatorio medido asiacute como su duracioacuten dependen de la
sustancia empleada como agente flogiacutestico (Vogel 2002)
33111 Edema de pata inducido por carragenina
Los carragenanos son un grupo complejo de polisacaacuteridos formados por la repeticioacuten
de monoacutemeros de galactosa modificada y son de tres tipos principales lambda kappa y
iota En el modelo de edema de pata la carragenina tipo lambda es inyectada
subcutaacuteneamente en la pata trasera La respuesta inflamatoria generada se caracteriza por
edema hiperalgesia y eritema y se cuantifica por el aumento de tamantildeo de la pata a raiacutez del
edema formado el cual es maacuteximo alrededor de las 5 h posteriores a la inyeccioacuten de
carragenina (Morris 2003)
El incremento en el volumen del edema es dependiente del tiempo y su desarrollo ha
sido descripto como un proceso bifaacutesico (Vinegar et al 1969 Salvemini et al 1996) La
fase temprana (0-1 h) se caracteriza por la liberacioacuten de histamina e 5-hidroxitriptamina (5-
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
51
HT) y le sigue un corto periacuteodo (asymp15-25 h) en que se libera bradicinina (Di Rosa et al
1971) mientras que la fase tardiacutea (asymp25-10 h) ha sido correlacionada con la produccioacuten de
prostaglandinas (PGs) atribuida a la induccioacuten de la ciclooxigenasa inducible (COX-2)
(Seibert et al 1994) La infiltracioacuten y activacioacuten de neutroacutefilos contribuye a la respuesta
inflamatoria principalmente de la fase tardiacutea por liberacioacuten de radicales libres derivados del
oxiacutegeno (O2- radicales hidroxilo) El oacutexido niacutetrico (NO) producido por la oacutexido niacutetrico sintasa
constitutiva (c-NOS) en la primera fase y por la oacutexido niacutetrico sintasa inducible (i-NOS) en la
fase tardiacutea actuacutea como un potente vasodilatador y tendriacutea un rol clave en el mantenimiento
de la respuesta inflamatoria tardiacutea al aumentar la produccioacuten de PGs por activacioacuten de la
COX-2 (Salvemini et al 1996)
La inhibicioacuten del edema de pata inducido por carragenina ha demostrado ser
altamente predictivo de la accioacuten antiinflamatoria del faacutermaco en la enfermedad inflamatoria
humana y las dosis de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en este modelo se
correlacionan bien con la dosis eficaz en los pacientes (Morris 2003)
331111 Procedimiento experimental
En la pata trasera izquierda de cada animal se realizoacute una inyeccioacuten subplantar de
01 mL de carragenina lambda tipo IV (Sigma Aldrich) al 2 en solucioacuten fisioloacutegica Una
hora antes cada lote de animales recibioacute intraperitonealmente (05 mL) los preparados a
ensayar El lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 y como control positivo se
usoacute 10 mgml de indometacina (Sigma Aldrich) o 50 mgml de diclofenac soacutedico (Sigma
Aldrich) Los voluacutemenes de las patas traseras fueron medidos con un pletismoacutemetro a
distintos tiempos post-inyeccioacuten de carragenina (1 3 5 y 7 h)
Aquellos preparados que mostraron tener un efecto antiinflamatorio durante la
primera hora en el modelo de edema inducido por carragenina fueron probados en modelos
de edema inducido por mediadores de la fase temprana histamina y serotonina
33112 Edema de pata inducido por histamina
La histamina a traveacutes de sus receptores (H) distribuidos en el lecho vascular
produce vasodilatacioacuten e hiperpermeabilidad capilar Luego de ser administrada produce un
efecto vasodilatador de muy corta duracioacuten dando lugar a hiperemia enrojecimiento y
edema
331121 Procedimiento experimental
Los animales recibieron en la pata trasera izquierda una inyeccioacuten subplantar de 01
mL de histamina clorhidrato (Sigma Aldrich) al 01 en solucioacuten fisioloacutegica Una hora antes
a cada lote se le administroacute intraperitonealmente 05 mL de los preparados a ensayar y el
lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Mediante la utilizacioacuten de un
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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pletismoacutemetro se midioacute el volumen de edema a los 15 30 y 60 min despueacutes de la
administracioacuten de histamina (Rotelli 2004)
33113 Edema de pata inducido por serotonina
En la inflamacioacuten aguda la serotonina (o 5-HT) produce vasodilatacioacuten e
hiperpermeabilidad vascular aunque con menor potencia que la histamina
331131 Procedimiento experimental
Cada animal recibioacute en su pata trasera izquierda una inyeccioacuten subplantar de 01 mL
de serotonina clorhidrato (Sigma Aldrich) al 001 en solucioacuten fisioloacutegica Una hora antes
cada lote recibioacute intraperitonealmente 05 mL de los preparados a ensayar y el lote control
recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Mediante la utilizacioacuten de un pletismoacutemetro se
midioacute el volumen de edema a los 30 60 y 120 minutos posteriores a la administracioacuten de la
serotonina (Rotelli 2004)
33114 Equipamiento medidas y caacutelculo del volumen de edema
Las medidas del volumen de las patas traseras fueron realizadas mediante el uso de
un pletismoacutemetro (Ugo Basile 7140) que consiste en una celda conteniendo liacutequido en la
cual se sumerge la pata y un transductor que transforma el volumen de liacutequido desplazado
en una sentildeal eleacutectrica la cual se lee como volumen de la pata con una precisioacuten de 001
mL
La celda estaacute constituida por dos tubos interconectados en uno de los cuales se
sumerge la pata y el desplazamiento de agua producido genera un cambio en el nivel del
liacutequido en el segundo tubo donde se encuentra el transductor Este uacuteltimo consiste en dos
pares de electrodos de Pt-Ir Un par de electrodos (electrodo de nivel) mide la conductancia
y la conductividad del liacutequido Por estar los electrodos parcialmente sumergidos la
conductancia es proporcional al nivel del liacutequido y por lo tanto al volumen de la pata Un
segundo par de electrodos (electrodos de compensacioacuten) por estar totalmente sumergidos
soacutelo son sensibles a la conductividad y a traveacutes de un circuito electroacutenico corrigen la lectura
del electrodo de nivel de manera que la sentildeal resultante es proporcional a la conductancia y
por tanto al volumen sumergido El liacutequido contenido en la celda es una solucioacuten de NaCl al
5 conteniendo un agente tensioactivo (proporcionado por el fabricante) que minimiza el
menisco de lectura12
Ambas patas traseras fueron marcadas con una fibra indeleble por encima del
maleacuteolo lateral y cada una fue sumergida hasta hacer coincidir la marca con el menisco del
liacutequido momento en el cual se registroacute la medida del volumen Cada volumen fue medido
12
httpwwwugobasilecomcataloguecategorypain_and_inflammationproduct37140_plethysmometerhtml
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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por triplicado en todos los tiempos de medida El volumen de edema fue calculado por la
resta de los voluacutemenes promedio de ambas patas
3312 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma
Meier et al (1950) demostraron que el implante de algodones esteacuteriles en ratas
produciacutean granulomas de cuerpo extrantildeo caracterizados por tejido conectivo no
diferenciado ceacutelulas gigantes e infiltracioacuten de fluido Despueacutes de varios diacuteas el incremento
del peso del pellet implantado puede ser medido constituyendo una medida del tejido
granulomatoso y por lo tanto de la respuesta inflamatoria (Vogel 2002) Este meacutetodo ha
demostrado ser uacutetil para la demostracioacuten de la actividad farmacoloacutegica de los esteroides
como antiinflamatorios (Bailey et al 1982)
El desarrollo del edema implica distintos eventos Tempranamente en la vecindad
del algodoacuten se producen sustancias quimiotaacutecticas para neutroacutefilos y monocitos Durante los
primeros 5 diacuteas despueacutes de la implantacioacuten se demostroacute la continua acumulacioacuten de ceacutelulas
polimorfonucleares (PMNs) principalmente neutroacutefilos que penetraban al algodoacuten desde la
periferia Entre los diacuteas 5 y 7 los estudios histoloacutegicos mostraron que la amplia
vascularizacioacuten se llevaba a cabo con la formacioacuten de una caacutepsula fibrosa junto con una
infiltracioacuten masiva de la caacutepsula por las ceacutelulas mononucleares El aumento en el peso del
granuloma resulta significativo recieacuten a partir del diacutea 5 (Bailey et al 1982)
33121 Procedimiento experimental
Ratas hembra fueron anestesiadas por inyeccioacuten intraperitoneal de una mezcla
conteniendo 75 mgkg de ketamina clorhidrato (Holliday Scott SA) y 12 mgkg de xilacina
clorhidrato (Richmond Laboratories Vet Pharma) El granuloma fue inducido por el implante
subcutaacuteneo de un pellet de algodoacuten esteacuteril (50 mg) en el aacuterea dorsal Un diacutea despueacutes del
implante los animales fueron divididos en lotes de 6 animales e inyectados
intraperitonealmente (05 mL) con los preparados a ensayar Como control positivo se usoacute
un lote administrado con dexametasona fosfato soacutedico (adquirida a Norgreen y a Klonal) en
tanto que el lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 La administracioacuten fue
repetida diariamente durante los 5 diacuteas siguientes El 7mo diacutea las ratas fueron pesadas y
luego de sacrificarlas por dislocacioacuten cervical se les extrajo el granuloma el timo y el bazo
los cuales tambieacuten fueron pesados El aumento en el peso del algodoacuten introducido permitioacute
cuantificar el tejido inflamatorio (granulomatoso) depositado en el algodoacuten (Meier et al
1950)
3313 Caacutelculo del efecto antiinflamatorio y anaacutelisis estadiacutestico
Los datos obtenidos se analizaron estadiacutesticamente mediante ANOVA con posterior
comparacioacuten por las pruebas de Tukey o Dunnett El grado de significancia de las
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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diferencias entre los lotes fue evaluado con el paraacutemetro p consideraacutendose
estadiacutesticamente significativo un p lt 005 () Para el procesamiento de los datos se empleoacute
el programa GraphPad Prism Version 500 En los graacuteficos y en las tablas los resultados se
expresan como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de la media (SEM) En todos los casos
salvo excepciones que son especificadas el nuacutemero de reacuteplicas por experimento (n) fue = 6
Los porcentajes de inhibicioacuten de la inflamacioacuten como una medida de la accioacuten
antiinflamatoria fueron calculados con la siguiente foacutermula
inhibicioacuten = (1 - VT VC) x 100
siendo VC la medida promedio para el lote control (volumen para los modelos de edema de
pata de rata masa para el test del granuloma) y VT la medida promedio para el lote que fue
tratado con la droga en estudio La misma foacutermula fue usada para calcular los porcentajes
de reduccioacuten de las masas del timo y del bazo
332 Animales
En todos los ensayos de inflamacioacuten fueron empleadas ratas Wistar de ambos sexos
proporcionadas por el bioterio de la Universidad Nacional de San Luis En el laboratorio
fueron pesadas y distribuidas en lotes de 6 dejadas en jaulas y abastecidas con alimento y
agua ad libitum durante el periacuteodo de los ensayos Para los modelos de inflamacioacuten aguda
se emplearon animales de entre 170 y 220 g y luego de los ensayos fueron sacrificados
mediante una corriente de CO2 Los animales usados para los ensayos de inflamacioacuten
croacutenica pesaron entre 90 y 140 g y fueron sacrificados mediante dislocacioacuten cervical
333 Dosis
Las dosis de Bh Bb y Pm fueron preparadas resuspendiendo los liofilizados en agua
esteacuteril mientras que para preparar las dosis de bromelina se resuspendioacute el polvo comercial
en buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Todas las soluciones fueron preparadas en el
momento de administrarlas
334 Material vegetal ensayado
En la Tabla 32 se presentan los valores de actividad caseinoliacutetica y contenido
proteico por mg de liofilizado (UCasmg y μg proteiacutenamg respectivamente) asiacute como la
actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos parcialmente purificados obtenidos
por precipitacioacuten etanoacutelica a partir de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) Pseudananas
macrodontes (Pm) y Bromelia balansae (Bb) Debido a que se obtuvieron varios extractos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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para cada material vegetal (Bh1-5 Bb1-4 y Pm1-4) esto se indica en cada una de las tablas
en que se exponen los resultados obtenidos para cada experimento
Liofilizados UCasmg liofilizado μg proteiacutenamg liofilizado UCasmg proteiacutena
Bh1 0177 plusmn 0004dagger 18 plusmn 2
dagger 98
Bh2 0173 plusmn 0042dagger 21 plusmn 3
dagger 82
Bh3 019 plusmn 003dagger 18 plusmn 2
dagger 106
Bh4 020 plusmn 002dagger 21 plusmn 2
dagger 97
Bh5 020 plusmn 002 19 plusmn 2 9
Bh (Promedio total plusmn DE) 019 plusmn 002 20 plusmn 2 10 plusmn 1
Bb1 0161 plusmn 0006dagger 9 plusmn 1
dagger 17
Bb2 0164 plusmn 003dagger 9 plusmn 1
dagger 17
Bb3 0135 plusmn 0009dagger 13 plusmn 1
dagger 104
Bb4 017 plusmn 001 14 plusmn 1 12
Bb (Promedio total plusmn DE) 016 plusmn 002 11 plusmn 3 14plusmn 4
Pm1 017 plusmn 002 29 plusmn 4 59
Pm2 0187 plusmn 0009 30 plusmn 3 6
Pm3 025plusmn 003dagger 32 plusmn 4
dagger 9
Pm4 0125 plusmn 0013 25 plusmn 2 5
Pm (Promedio total plusmn DE) 018 plusmn 005 29 plusmn 3 6 plusmn 2
Bromelina (Sigma Aldrich) 063 plusmn 006 200 plusmn 20 32 plusmn 05
Tabla 32 Actividad caseinoliacutetica contenido proteico y actividad especiacutefica de los extractos parcialmente
purificados Media plusmn DE daggerError calculado como [Xmaacuteximo-Xmiacutenimo]2 siendo Xmaacuteximo y Xmiacutenimo valores promedios (n =
3) maacuteximo y miacutenimo respectivamente obtenidos de dos mediciones independientes UCas unidades
caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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34 Resultados y Discusioacuten
341 Modelos de inflamacioacuten aguda
3411 Edema de pata de rata inducido por carragenina
34111 Bromelia hieronymi
En un trabajo previo (Boeris et al 2004) se encontroacute que en el modelo de edema de
pata de ratoacuten inducido por carragenina una dosis de 50 mgkg de un extracto parcialmente
purificado obtenido de frutos de Bromelia hieronymi presentaba efecto antiinflamatorio Esa
dosis fue evaluada en ratas como una primera aproximacioacuten a la determinacioacuten de una dosis
efectiva En la Tabla 33 se muestran los voluacutemenes de edema promedio y los porcentajes
de inhibicioacuten respecto al lote control medidos a 1 3 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina
de lotes tratados con 50 mgkg de Bh1 y con 50 mgkg de bromelina
Tabla 33 Efecto de Bh1 y bromelina en edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Tanto Bh como bromelina inhibieron significativamente la formacioacuten de edema en
alguno de los tiempos de medida Mientras Bh mostroacute actividad antiinflamatoria a las 3 h tal
como fue reportado (Boeris et al 2004) bromelina lo hizo a las 5 y 7 h post inyeccioacuten de
carragenina
A fin de corroborar si al aumentar la dosis de Bh se lograba efecto antiinflamatorio en
los otros tiempos de medida se ensayaron dosis de 100 y 200 mgkg Ademaacutes puesto que
la hipoacutetesis de partida fue que la actividad proteoliacutetica podriacutea ser la responsable de la accioacuten
antiinflamatoria de los extractos se tuvieron en cuenta las UCaskg administradas De la
Tabla 32 puede deducirse que una dosis de 200 mgkg de Bh1 equivale a un promedio de
35 UCaskg Con fines comparativos la dosis de bromelina se llevoacute a 55 mgkg (equivalente
a 35 UCaskg)
Tiempo
(h)
Control Bh1
50 mgkg Bromelina 50 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 025plusmn002 020plusmn002 20c 029plusmn007 -14c
3 052plusmn002 023plusmn003 56a 03plusmn01 33ca
5 11plusmn01 058plusmn009 45ca 04plusmn02 60a
7 127plusmn005 114plusmn006 10c 05plusmn02 60a
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
57
En los resultados expuestos en la Tabla 34 puede observarse que Bh mostroacute un
efecto antiinflamatorio significativo desde la primera hora en la cual inhibioacute la formacioacuten de
edema con una eficacia de alrededor del 35 alcanzando el maacuteximo valor a las 5 h con un
porcentaje de inhibicioacuten significativamente similar al de bromelina e indometacina (asymp 75)
Mientras que los porcentajes de inhibicioacuten de 100 y 200 mgkg de Bh fueron
significativamente equivalentes a los de la bromelina desde la primera hora hasta las 5 h a
las 7 h soacutelo la dosis de 200 mgkg mantuvo un efecto significativamente similar al de
bromelina (asymp 70) Dado que 55 mgkg de bromelina y 200 mgkg de Bh son equivalentes
en actividad proteoliacutetica (35-36 UCaskg) los resultados de la Tabla 34 estaacuten acordes con
la hipoacutetesis de que la actividad proteoliacutetica seriacutea responsable de la actividad antiinflamatoria
de los preparados enzimaacuteticos Para fortalecer esta hipoacutetesis se proboacute el efecto que tiene la
inhibicioacuten con E-64 de las proteasas cisteiacutenicas sobre la accioacuten antiinflamatoria exhibida por
Bh y bromelina
Tabla 34 Efecto de diferentes dosis de Bh1 bromelina e indometacina en edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
341111 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina
En la Tabla 35 se muestran los voluacutemenes de edema y los porcentajes de inhibicioacuten
respecto al lote control de lotes tratados con 150 mgkg de Bh4 y 150 mgkg de Bh4
incubado con E-64 (Bh4E-64) 50 mgkg de bromelina y 50 mgkg de bromelina incubada
con E-64 (BromelinaE-64) y 025 μmolkg de E-64 (equivalente a los μmoles contenidos en
las dosis de Bh4E-64 y bromelinaE-64)
Tiempo
(h)
Control
Bh1
50 mgkg
90plusmn02UCaskg
Bh1
100 mgkg
180plusmn04UCaskg
Bh1
200 mgkg
354plusmn08UCaskg
Bromelina
55 mgkg
35plusmn3UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 034plusmn001 024plusmn002 29bc 021plusmn003 38b 022plusmn002 35b 031plusmn005 9bc 030plusmn001 12bc
3 059plusmn006 052plusmn009 12c 027plusmn003 54ba 025plusmn002 58b
027plusmn005 54ba 050plusmn005 15ac
5 12plusmn01 07plusmn01 44a 029plusmn009 75b 026plusmn001 78b 028plusmn003 76b 040plusmn004 66ba
7 124plusmn009 09plusmn01 27ac 08plusmn01 40ad 038plusmn006 69b 032plusmn006 74b 053plusmn004 57bd
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
58
Tiempo
(h)
Control
Bh4
150 mgkg
30plusmn3 UCaskg
Bh4E-64
150 mgkg
09plusmn01 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
BromelinaE-64
50 mgkg
4plusmn2 UCaskg
E-64
025 μmolKg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 042plusmn003 022plusmn002 48b 026plusmn004 38b 022plusmn003 48b 028plusmn002 33ba 040plusmn003 5ac
3 067plusmn007 020plusmn003 70b 04plusmn01 33cb 018plusmn002 73b
05plusmn01 25c 062plusmn006 75c
5 115plusmn008 033plusmn005 71b 10plusmn02 13c 020plusmn001 83b 09plusmn02 20c 103plusmn007 10c
7 144plusmn009 09plusmn02 34a 125plusmn006 13ac 028plusmn007 80b 13plusmn02 9c 120plusmn007 17c
Tabla 35 Efecto del tratamiento con E-64 de Bh y bromelina sobre la accioacuten inhibitoria de edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Puede observarse que Bh y bromelina tuvieron efecto antiinflamatorio a lo largo de
todo el ensayo mientras que BhE-64 y bromelinaE-64 soacutelo mostraron efecto significativo
en la primera h post inyeccioacuten de carragenina Auacuten cuando durante todo el ensayo los
porcentajes de inhibicioacuten de Bh fueron maacutes altos que los de BhE-64 soacutelo a las 5 h lo fue
estadiacutesticamente significativo (71 gt 13 plt005) Por su parte los porcentajes de
inhibicioacuten de bromelina fueron significativamente superiores a los de bromelinaE-64 a las 3
5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina E-64 no mostroacute efecto antiinflamatorio en ninguacuten
tiempo de medida
Dado que al eliminar la actividad proteoliacutetica de Bh y bromelina se observoacute una
peacuterdida de actividad antiinflamatoria desde las 3 h siendo maacutes evidente en los tiempos en
que Bh y bromelina muestran los maacuteximos porcentajes de inhibicioacuten (a las 5 h para Bh y a
las 5 y 7 h para bromelina) se podriacutea suponer que las cisteiacutenendopeptidasas seriacutean las
responsables de la actividad antiinflamatoria medida para Bh y bromelina a partir de las 3 h
post inyeccioacuten de carragenina Por otro lado teniendo en cuenta el rol secuencial de los
distintos mediadores de la inflamacioacuten descriptos para este modelo tambieacuten se podriacutea
suponer que las cisteiacutenendopeptidasas de Bh y bromelina inhibiriacutean la infiltracioacutenactividad
de neutroacutefilos o la siacutentesisaccioacuten de NO y PGs los cuales alcanzan picos de produccioacuten
entre las 3 y las 6 h post inyeccioacuten de carragenina (Salvemini et al 1996) Tanto la
inhibicioacuten de la migracioacuten de neutroacutefilos como de la produccioacuten de PGs y NO ya han sido
demostradas para la bromelina en otros modelos (Gaspani et al 2002 Wen et al 2006
Fitzhugh et al 2008 Kalra et al 2008 Bhui et al 2012)
Los bajos porcentajes de inhibicioacuten medidos en la primera hora post inyeccioacuten de
carragenina respecto a los de las siguientes horas para Bh (Tablas 33 34 y 35) y para
bromelina (Tabla 35) estariacutean indicando que Bh y bromelina tienen un bajo efecto inhibitorio
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
59
sobre los mediadores de la primera fase del modelo Aunque otra explicacioacuten posible es que
durante la primera hora auacuten no se haya alcanzado la concentracioacuten efectiva de los
compuestos activos en el sitio de accioacuten Sea cual fuere la causa de la informacioacuten
aportada en la Tabla 35 se puede concluir que los efectos antiinflamatorios de Bh y
bromelina en la primera hora no dependeriacutean de la actividad proteoliacutetica de las
cisteinendopeptidasas
34112 Pseudananas macrodontes
Los resultados obtenidos para Bh y bromelina fueron tenidos en cuenta para
establecer las dosis a ensayar de los extractos obtenidos a partir de frutos de Pseudananas
macrodontes (Pm) En la Tabla 36 se presentan los voluacutemenes y porcentajes de inhibicioacuten
de edema inducida por carragenina en el modelo de pata de rata a distintas horas para 90 y
180 mgkg de Pm1 (equivalentes a 15 y asymp 30 UCaskg respectivamente) 50 mgkg de
bromelina y 10 mgkg de indometacina
Tiempo
(h)
Control
Pm1
90 mgkg
15plusmn2 UCaskg
Pm1
180 mgkg
31plusmn4 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 027plusmn003 019plusmn002 28bc 012plusmn002 55b 018plusmn002 33bc 024plusmn002 11c
3 064plusmn007 035plusmn004 45ba 019plusmn002 70b 029plusmn003 55b
055plusmn006 14ca
5 114plusmn008 06plusmn02 46b 023plusmn002 80b 028plusmn002 75b 038plusmn003 67b
7 13plusmn01 08plusmn02 37a 020plusmn002 85b 045plusmn004 65d 055plusmn004 58ad
Tabla 36 Efecto de diferentes dosis de Pm1 bromelina e indometacina en edema de pata de rata inducido por
carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey p lt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Puede observarse que ambas dosis de Pm tuvieron efecto antiinflamatorio
significativo alcanzando los maacuteximos porcentajes de inhibicioacuten de edema entre las 3 y las 5
h para la menor dosis y entre las 5 y las 7 h para la mayor dosis Por lo tanto Pm es maacutes
efectivo en la fase tardiacutea propuesta para el modelo de edema inducido por carragenina
Si bien en este ensayo bromelina no alcanzoacute los porcentajes de inhibicioacuten medidos
en los anteriores experimentos (Tablas 34 y 35) puede verse que hasta las 5 h fueron
significativamente similares a los de Pm (180 mgkg) Teniendo en cuenta los valores de la
Tabla 32 se observa que la mayor dosis de Pm (180 mgkg) es equivalente en UCas (asymp 30
UCaskg) a las dosis probadas para bromelina y Bh4 (Tabla 35) mostrando los tres
preparados efectos similares Por otro lado los porcentajes de inhibicioacuten de la dosis de 90
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
60
mgkg de Pm (equivalente a 15 UCaskg) y de 100 mgkg de Bh1 (equivalente a 18
UCaskg) mostrados en la Tabla 34 son similares a excepcioacuten de los medidos a las 5 h
341121 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm
A fin de poner a prueba la hipoacutetesis de que la actividad proteoliacutetica es necesaria para
el efecto antiinflamatorio de Pm del mismo modo que para Bh y bromelina se midioacute el efecto
antiinflamatorio luego de inhibir las cisteiacutenendopeptidasas con E-64 (Tabla 37)
Tiempo
(h)
Control
Pm1
180 mgkg
31plusmn4 UCaskg
Pm1E-64
180 mgkg
04plusmn02 UCaskg
E-64
02 μmolkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 038plusmn003 017plusmn003 55b 028plusmn006 26ba 036plusmn003 5ca
3 060plusmn007 017plusmn002 72b 032plusmn006 47b 056plusmn006 7c
5 104plusmn008 021plusmn003 80b 066plusmn03 36cb 093plusmn007 11c
7 126plusmn01 021plusmn004 83a 09plusmn02 29b 108plusmn007 14cb
Tabla 37 Efecto del tratamiento con E-64 sobre el efecto antiinflamatorio de Pm en modelo de edema de pata
generado por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En la Tabla 37 se puede observar que los porcentajes de inhibicioacuten de Pm fueron
superiores a los de la misma dosis de Pm tratada con E-64 (PmE-64) llegando a ser poco
maacutes del doble a las 1 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina lo cual estariacutea indicando que
las cisteiacutenendopeptidasas contribuyen al efecto antiinflamatorio de Pm No obstante esta
contribucioacuten no parece ser la uacutenica puesto que tanto a las 3 como a las 7 h PmE-64 mostroacute
efecto antiinflamatorio significativo sugiriendo que otros componentes presentes en Pm
estariacutean actuando principalmente sobre la fase tardiacutea
Ante este resultado se hicieron ensayos posteriores a fin de dilucidar el posible
componente con actividad antiinflamatoria de Pm Si bien las UCasmg de PmE-64 fueron
0002 plusmn 0001 y por tanto la dosis de 180 mgkg equivalioacute a 04 UCaskg la primera
posibilidad que se evaluoacute es que en el caso de PmE-64 las proteasas no hubieran sido
completamente inhibidas En ensayos posteriores se evaluoacute la actividad fibrinoliacutetica (mm2)
de Pm1 mediante el ensayo de la placa de fibrina13 por tratarse de un meacutetodo muy sensible
(Jespersen amp Astrup 1983) y pudo determinarse que la dosis de Pm1 conteniacutea 658 (plusmn08)
x103 mm2kg mientras que la dosis de Pm1E-64 conteniacutea 206 (plusmn04) x103 mm2kg un 31
de la actividad fibrinoliacutetica de Pm1 Por lo tanto no puede descartase la posibilidad de que
13
Ver 443 (Capiacutetulo Efecto anticoagulante fibrinogenoliacutetico y fibrinoliacutetico)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
61
las proteasas sean las responsables de la actividad antiinflamatoria de PmE-64 De todos
modos dado que al inhibir las proteasas cisteiacutenicas de Pm (llevando la dosis a 04 UCaskg)
los porcentajes de inhibicioacuten de edema disminuyen aproximadamente un 50 respecto a los
de la dosis de 31 UCaskg de Pm podriacutea atribuirse actividad antiinflamatoria a las proteasas
cisteiacutenicas de Pm Dilucidar el grado de participacioacuten de las mismas en el proceso requeriraacute
ensayos ulteriores
34113 Bromelia balansae
Siguiendo el mismo razonamiento que para Pm las dosis a ensayar de los extractos
parcialmente purificados obtenidos a partir de frutos de B balansae (Bb) fueron definidas de
manera que contuvieran la misma actividad proteoliacutetica que las dosis efectivas de bromelina
y Bh (entre 10 y 35 UCaskg) En un primer ensayo se proboacute una dosis intermedia 120
mgkg de Bb1 equivalente a aproximadamente 20 UCaskg (Tabla 38)
Tiempo
(h)
Control
Bb1
120 mgkg
19plusmn1 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 027plusmn003 022plusmn004 19c 018plusmn002 33c 024plusmn002 11c
3 064plusmn007 03plusmn01 53b 029plusmn003 55b 055plusmn006 14cb
5 114plusmn008 05plusmn02 56b 028plusmn002 75b 038plusmn003 67b
7 13plusmn01 06plusmn02 51b 045plusmn004 65b 055plusmn004 58b
Tabla 38 Efecto de Bb bromelina e indometacina sobre el edema de pata generado por carragenina Los
voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6 excepto n=5 para el lote Bb1 a las 5 y 7 h) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En este caso entre las 3 y las 5 h una rata del lote tratado con Bb murioacute por lo que a
las 5 y 7 h el valor de n fue igual a 5 Como puede verse en la Tabla 38 Bb mostroacute
porcentajes de inhibicioacuten significativos a las 3 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina los
cuales no se diferenciaron estadiacutesticamente de los de bromelina asiacute como tampoco de los
de indometacina a las 5 y 7 h A la h post inyeccioacuten de carragenina ninguno de los
compuestos ensayados mostroacute porcentajes de inhibicioacuten significativos
341131 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb
En otro experimento (Tabla 39) se probaron dos dosis de Bb2 100 y 200 mgkg
equivalentes aproximadamente a 15 y 30 UCaskg respectivamente asiacute como 200 mgkg
de Bb2 tratado con E-64 (Bb2E-64)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
62
La dosis de 200 mgkg de Bb2 fue antiinflamatoria soacutelo a las 7 h post inyeccioacuten de
carragenina mostrando un porcentaje de inhibicioacuten significativamente similar al de
diclofenac soacutedico (50 mgkg) La misma dosis de Bb tratada con E-64 (Bb2E-64) no mostroacute
efecto antiinflamatorio aunque no se detectaron diferencias significativas entre los
porcentajes de inhibicioacuten de Bb2 y Bb2E-64 Las dosis de 100 mgkg de Bb2 y E-64 (025
μmolkg) no mostraron efecto significativo en ninguacuten tiempo de medida
Tabla 39 Efecto de diferentes dosis de Bb y BbE-64 sobre el edema de pata generado por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n = 6 excepto n=5 para el lote Bb2E-64 a partir de las 5 h) Test de Tukey plt 005 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Al comparar los resultados de la Tabla 39 con los de la Tabla 38 puede observarse
que si bien el efecto antiinflamatorio se sigue manifestando en la fase tardiacutea propuesta para
este modelo la dosis de 200 mgkg (33 plusmn 6 UCaskg) de Bb2 fue menos efectiva que la de
120 mgkg (19 plusmn 1 UCaskg) de Bb1 lo cual no seriacutea lo esperado si tenemos en cuenta la
actividad proteoliacutetica de ambas Sin embargo el tratamiento con el inhibidor E-64 produjo
una peacuterdida del efecto antiinflamatorio de Bb2 concordante con la hipoacutetesis de que la
actividad de las proteasas presentes en Bb es la causante de tal efecto Una caracteriacutestica
comuacuten de los valores de las Tablas 38 y 39 es la alta dispersioacuten de los voluacutemenes medidos
para los lotes tratados con Bb hecho que no se observa en los valores de los lotes
controles asiacute como tampoco en lotes tratados con diclofenac soacutedico e indometacina
Por otro lado es necesario mencionar que otros ensayos con Bb presentaron cierta
dificultad en relacioacuten a una posible toxicidad En un ensayo el 50 de los animales que
recibieron una dosis de Bb (Bb3 Tabla 32) equivalente a 35 UCaskg murieron entre las 3 y
las 6 h post inyeccioacuten de carragenina En otro ensayo en que se probaron dosis
equivalentes a 10 20 y 30 UCaskg varios animales de los tres lotes tratados mostraron
signos tiacutepicos de toxicidad (pasividad motora alteracioacuten respiratoria ereccioacuten pilomotora y
extremidades cianoacuteticas) a partir de la primera hora post inyeccioacuten de carragenina y entre
las 4 y 5 h murieron Por lo expuesto no deberiacutea descartarse la posibilidad de que Bb
Tiempo
(h)
Control
Bb2
100 mgkg
16plusmn3 UCaskg
Bb2
200 mgkg
33plusmn6 UCaskg
Bb2E-64
200 mgkg
05plusmn01 UCaskg
E-64
025 μmolkg
Diclofenac soacutedico
50 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 033plusmn003 028plusmn004 15c 033plusmn008 0c 043plusmn005 -30c 031plusmn007 6c 024plusmn003 27c
3 07plusmn01 09plusmn02 -19c 05plusmn01 32c 09plusmn01 -32c 06plusmn02 14c 035plusmn005 52c
5 14plusmn01 11plusmn03 24bc 08plusmn03 48bc 11plusmn02 23bc 09plusmn02 34bc 044plusmn007 69b
7 15plusmn01 11plusmn02 30bc 08plusmn02 48b 099plusmn007 35bc 10plusmn02 33bc 073plusmn008 52b
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
63
presente cierta toxicidad a las dosis ensayadas hecho que deberaacute comprobarse mediante
futuros ensayos de toxicidad
Sin dejar de lado las dificultades sentildealadas de los resultados obtenidos se puede
concluir que Bb muestra efecto antiinflamatorio significativo soacutelo sobre la fase tardiacutea del
modelo de edema de pata (Di Rosa et al 1971 Salvemini et al 1996) mostrando menores
porcentajes de inhibicioacuten que dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica de Bh Pm y
bromelina Ademaacutes el efecto antiinflamatorio de Bb podriacutea estar relacionado con la actividad
proteoliacutetica de sus cisteiacutenendopeptidasas
3412 Otros modelos de inflamacioacuten aguda
Como ya se ha mencionado la primera fase (0-1 h) del desarrollo de edema de pata
inducido por carragenina es mediada principalmente por histamina y serotonina (Di Rosa et
al 1971 Salvemini et al 1996) Para corroborar si el efecto inhibitorio de edema observado
en la primera h para Bh Pm y bromelina se debiacutea a un efecto inhibitorio sobre alguno de
estos mediadores se evaluaron las dosis efectivas de dichos preparados a esa h en los
modelos de edema de pata inducidos por histamina y por serotonina
34121 Edema de pata inducido por histamina en ratas
En la Tabla 310 se consignan los voluacutemenes de edema y los respectivos porcentajes
de inhibicioacuten de edema a los 15 30 y 60 min post inyeccioacuten de histamina Se evaluaron
dosis de Bh Pm y bromelina cuyos contenidos en UCas fueran equivalentes a las de las
dosis que en el modelo de edema inducido por carragenina fueron efectivas en la primera
hora esto es 200 mgkg de Bh2 (equivalente a 35 plusmn 8 UCaskg) 170 mgkg de Pm2
(equivalente a 32 plusmn 2 UCaskg) y 55 mgkg de bromelina (equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg)
Tiempo
(min)
Control
Bh2
200 mgkg
35plusmn8 UCaskg
Pm2
170 mgkg
32plusmn2 UCaskg
Bromelina
55 mgkg
35plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
15 039plusmn003 046plusmn003 -18c 038plusmn003 25c 045plusmn002 -15c
30 034plusmn003 041plusmn003 -21c 034plusmn003 0c 044plusmn003 -30c
60 032plusmn003 033plusmn004 -3c 031plusmn003 3c 042plusmn004 -31c
Tabla 310 Efecto de Bh Pm y bromelina sobre el edema inducido histamina Los voluacutemenes de edema son
expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
64
Puede observarse que ninguno de los compuestos probados fue efectivo a las dosis
probadas Por tanto es liacutecito suponer que los efectos antiinflamatorios medidos para Bh Pm
y bromelina en la primera hora post inyeccioacuten de carragenina no se deben a la inhibicioacuten de
la accioacuten de la histamina
La bibliografiacutea en relacioacuten al efecto de la bromelina sobre la inflamacioacuten mediada por
histamina es escasa Seguacuten Kumakura et al (1988) dosis crecientes de bromelina
administradas intravenosamente aumentaban el exudado plasmaacutetico inducido por histamina
a los 30 min en el modelo de ldquobolsa de airerdquo en ratas
34122 Edema de pata inducido por serotonina en ratas
341221 Bromelia hieronymi
En la Tabla 311 se exponen los voluacutemenes de edema y los porcentajes de inhibicioacuten
de edema a los 30 60 y 120 min post inyeccioacuten de serotonina para 100 y 200 mgkg de Bh2
(equivalentes a 17 plusmn 4 y 35 plusmn 8 UCaskg respectivamente) y para 55 mgkg de bromelina
(equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg)
Tiempo
(min)
Control
Bh2
100 mgkg
17plusmn4 UCaskg
Bh2
200 mgkg
35plusmn8 UCaskg
Bromelina
55 mgKg
35plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
30 122plusmn005 118plusmn005 33c 08plusmn01 37a 060plusmn009 51a
60 109plusmn004 116plusmn005 -6c 08plusmn01 28a
063plusmn008 42a
120 083plusmn004 070plusmn003 16ac 066plusmn007 20ac 057plusmn007 31a
Tabla 311 Efecto de Bh2 y bromelina sobre el edema inducido por serotonina Los voluacutemenes de edema son
expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
El efecto medido para bromelina es concordante con el reportado por Netti et al
(1972) quienes midieron un porcentaje de inhibicioacuten de asymp 40 a los 60 min post inyeccioacuten
de serotonina en ratas que recibieron por viacutea oral bromelina (100 mganimal) 4 h previas a la
inyeccioacuten de serotonina
Bh exhibioacute porcentajes de inhibicioacuten significativos a los 30 y 60 min soacutelo con la dosis
de 200 mgkg Si bien dichos valores fueron inferiores a los de la bromelina no fueron
significativamente diferentes Estos resultados estariacutean indicando que la inhibicioacuten que
ejercen Bh y bromelina sobre el edema inducido por carragenina estariacutea al menos en parte
mediada por un efecto inhibidor de la accioacuten de la serotonina
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
65
341222 Pseudananas macrodontes
En la Tabla 312 se muestra el efecto de una dosis de Pm2 (170 mgkg) equivalente
a 32 plusmn 2 UCaskg sobre el edema de pata inducido por serotonina Pm mostroacute un porcentaje
de inhibicioacuten significativo soacutelo a los 30 min Por lo tanto asiacute como en el caso de Bh y
bromelina parte del efecto antiinflamatorio evaluado a la hora post inyeccioacuten de carragenina
se podriacutea deber a un efecto inhibitorio sobre la accioacuten de la serotonina
Tiempo
(min)
Control
Pm2
170 mgkg
32plusmn2 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
30 105plusmn007 08plusmn01 29a 052plusmn003 50a
60 087plusmn007 07plusmn01 22ca 050plusmn004 42a
120 067plusmn006 06plusmn01 20c 046plusmn004 31c
Tabla 312 Efecto de Pm2 sobre el edema inducido por serotonina Los voluacutemenes de edema son expresados
como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
342 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma
Como primera aproximacioacuten en el modelo de inflamacioacuten croacutenica se probaron las
dosis de los preparados que mostraron efecto antiinflamatorio sobre el edema de pata
inducido por carragenina
Como control positivo se utilizoacute dexametasona la cual posee entre otros efectos
adversos tiacutepicos de los glucocorticoides efectos inmunosupresor y cataboacutelico Con el
objetivo de comparar dichos efectos con los de los preparados proteoliacuteticos se calcularon
como una medida del efecto inmunosupresor los porcentajes de reduccioacuten de las masas del
timo y del bazo (Ben Rhouma amp Sakly 1994 Hori et al 1996) mientras que el efecto
cataboacutelico fue medido calculando la peacuterdida de masa corporal (se pesaron los animales
antes y despueacutes del tratamiento y la diferencia de peso corporal fue comparada con los
controles)
3421 Bromelia hieronymi
En la Tabla 313 se exponen los resultados obtenidos para 90 y 180 mgkg de Bh3
(equivalentes a 17 plusmn 3 y 34 plusmn 5 UCaskg respectivamente) 55 mgkg de bromelina
(equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg) y dexametasona (3 mgkg) en el test del granuloma inducido
por pellet de algodoacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
66
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 054plusmn006 043plusmn002 078plusmn009
Bh3
(90 mgkg- 17plusmn3 UCaskg)
047plusmn002 13c 035plusmn002 18bc 09plusmn01 -9c
Bh3
(180 mgkg- 34plusmn5 UCaskg)
032plusmn001 41b 031plusmn002 28b 07plusmn01 7c
Bromelina
(55 mgkg- 35plusmn3 UCaskg )
036plusmn005 34b 031plusmn002 28b 077plusmn008 1c
Dexametasona (3 mgkg) 024plusmn001 55a 011plusmn002 74a 040plusmn004 49b
Tabla 313 Efecto de Bh3 bromelina y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de
algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
La dosis de 180 mgkg de Bh bromelina (55 mgkg) y dexametasona (3 mgkg)
resultaron antiinflamatorias Bh (180 mgkg) y bromelina mostraron porcentajes de inhibicioacuten
de granuloma significativamente similares pero ambos fueron significativamente inferiores al
de dexametasona En relacioacuten al efecto inmunosupresor mientras dexametasona causoacute
significativa reduccioacuten del peso de bazos y timos Bh (180 mgkg) y bromelina soacutelo redujeron
el peso de los timos mostrando porcentajes iguales (28) aunque significativamente
inferiores al de dexametasona (74) Por otra parte la dosis de 90 mgkg de Bh no fue
antiinflamatoria pero tampoco redujo los pesos de los bazos y los timos
En la Figura 31 se muestran los cambios de peso corporal
Figura 31 Efecto de Bh3 bromelina (Bro) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas
tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
-20
-10
0
10
20
30
b
b
a
cControl
Bh3 (173 UCaskg)
Bh3 (345 UCaskg)
Bro (353 UCaskg)
Dex (3 mgkg)
c
Ca
mb
io d
e p
es
o c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
67
Bh (180 mgkg) y bromelina no provocaron peacuterdida de masa corporal aun cuando la
ganancia en masa corporal (14 y 13 g respectivamente) fuera significativamente maacutes baja
que la del lote control (22 g) En cambio dexametasona provocoacute una significativa peacuterdida de
masa corporal (-14 g) respecto al control El lote tratado con la dosis de 90 mgkg de Bh no
mostroacute cambios respecto al lote control
Por lo tanto si bien Bh (180 mgkg) y bromelina (55 mgkg) fueron menos efectivas
que dexametasona (3 mgkg) para inhibir la formacioacuten del granuloma tambieacuten mostraron
menos efectos sobre bazos timos y masa corporal
Debido a la similitud en el contenido de UCas (asymp35 UCaskg) de las dosis de Bh (180
mgkg) y de bromelina (55 mgkg) que mostraron similares efectos en el test del granuloma
se proboacute si dichos efectos dependiacutean de la accioacuten de proteasas cisteiacutenicas
34211 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina en el test del
granuloma
A fin de determinar si la actividad proteoliacutetica de Bh y bromelina es causa de la
accioacuten antiinflamatoria evaluada en el test del granuloma se ensayaron Bh y bromelina con
y sin actividad proteoliacutetica (luego de inhibir con E-64) Los resultados se muestran en la
Tabla 314
Tabla 314 Efecto de Bh5 y bromelina con actividad proteoliacutetica y sin actividad proteoliacutetica (Bh5E-64 y bromelinaE-64) E-64 y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En el caso de bromelina puede observarse que al inhibir sus cisteiacutenendopeptidasas
con E-64 pierde su efecto antiinflamatorio el porcentaje de inhibicioacuten cambia de 24 a -8
dejando de ser significativo Lo mismo sucede con el efecto reductor sobre el peso de los
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Control 036 plusmn 002 043 plusmn 003 053 plusmn 008
Bromelina
(55 mgkg- 35plusmn3 UCaskg )
0272 plusmn 0006 24a 033 plusmn 002 23a 08 plusmn 02 -42c
BromelinaE-64
(55 mgkg- 2plusmn3 UCaskg)
039 plusmn 004 -8c 046 plusmn 003 -7c
065 plusmn 009 -23c
Bh5
(180 mgkg- 36plusmn4 UCaskg)
039 plusmn 001 -8c 042 plusmn 001 2c
082 plusmn 02 -55c
Bh5E-64
(180 mgkg- 1plusmn2 UCaskg)
040 plusmn 003 -11c 040 plusmn 002 7ca
06 plusmn 01 -19c
E-64
(03 μmolkg)
039 plusmn 004 -8c 0421 plusmn 0009 2c
06 plusmn 01 -15c
Dexametasona (3 mgkg) 0230 plusmn 0006 36a 0042 plusmn 0003 90b 033 plusmn 008 38c
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
68
timos el porcentaje de reduccioacuten para bromelina es de 23 mientras que para
bromelinaE-64 es de -7 Por tanto las cisteiacutenendopeptidasas no soacutelo estariacutean actuando
como antiinflamatorias sino tambieacuten ejerciendo un leve efecto reductor sobre el peso de los
timos En este ensayo el porcentaje de reduccioacuten del peso de los timos provocado por
bromelina fue aproximadamente 14 del de dexametasona mientras que los porcentajes de
inhibicioacuten del granuloma de ambas fueron significativamente similares E-64 (03 μmolkg) no
tuvo efecto sobre los granulomas asiacute como tampoco sobre los pesos de los timos y los
bazos
Los resultados obtenidos para Bh no permiten sacar ninguna conclusioacuten respecto al
rol que tendriacutean sus cisteiacutenendopeptidasas como antiinflamatorias puesto que a diferencia
de los datos consignados en la Tabla 313 Bh no tuvo efecto inhibidor significativo de los
granulomas asiacute como tampoco efecto reductor de los timos ademaacutes de no encontrarse
diferencia significativa entre Bh y BhE-64 Los efectos de Bh y BhE-64 fueron ensayados
una vez maacutes pero no pudieron extraerse resultados concluyentes Una posible explicacioacuten a
la dificultad en la reproducibilidad de los resultados para Bh probablemente obedezca a la
poca sensibilidad que el test de granuloma inducido por algodoacuten tiene especialmente para
antiinflamatorios no esteroideos (Bailey et al 1982)
En relacioacuten al efecto sobre el peso corporal no se observaron diferencias
significativas respecto al control para bromelina y para bromelina inhibida con E-64 El E-64
produjo una ganancia de masa corporal significativamente mayor que la de los controles
Pero ninguno de los compuestos probados a excepcioacuten de dexametasona produjeron
peacuterdida de masa corporal (Figura 32)
Figura 32 Efecto de Bh5 bromelina (Bro) y Bh5 y bromelina inhibidas con E-64 (Bh5E-64 y BroE-64
respectivamente) E-64 y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas tratadas durante el ensayo del test del granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
-20
-10
0
10
20
30
Control
Dex (3 mgkg)
Bh5 (364 UCaskg)Bh5E-64(12 UCaskg)
Bro (353 UCaskg)
BroE-64(23 UCaskg)
E-64 (03 molkg)c
cd
a
b b
d
c
Cam
bio
de p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
69
3422 Pseudananas macrodontes y Bromelia balansae
En un mismo ensayo se probaron dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica (asymp30
UCaskg) de Pm y Bb cuyos efectos fueron comparados con los de bromelina (50 mgkg
equivalente a asymp30 UCaskg) y dexametasona (3 mgkg) Como en todos los ensayos los
lotes estuvieron conformados por 6 animales excepto en el caso de Pm donde los datos
provienen de 4 animales ya que dos de ellos murieron luego de la tercera y cuarta dosis
Puede observarse en la Tabla 315 que Pm y Bb mostraron porcentajes de inhibicioacuten del
granuloma similares a los de bromelina Los porcentajes de reduccioacuten del timo para Pm y Bb
fueron significativamente similares entre siacute y si bien mayores no se diferenciaron
significativamente de los de bromelina
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 054plusmn003 038plusmn003 071plusmn007
Pm3
(130 mgkg- 33plusmn4 UCaskg)
036plusmn002 33ab 020plusmn001 47b 08plusmn01 -8c
Bb 4
(180 mgkg- 31plusmn2 UCaskg)
041plusmn004 24a 021plusmn001 45b 052plusmn007 27cb
Bromelina
(50 mgkg- 32plusmn3 UCaskg)
036plusmn002 33ab 028plusmn002 26b 070plusmn007 1c
Dexametasona (3 mgkg) 024plusmn001 56b 010plusmn002 74a 036plusmn004 49b
Tabla 315 Efecto de Pm3 Bb4 bromelina y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y
sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n = 6 excepto para Pm n=4) Test de Tukey p lt 005 p lt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Los porcentajes de reduccioacuten de los timos de los preparados proteoliacuteticos fueron
significativamente menores al de dexametasona y a diferencia de eacutesta no mostraron efecto
reductor significativo sobre el peso de los bazos
En la Figura 33 pueden observarse los cambios en los pesos corporales de los
animales tratados Si bien los animales de los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos
no aumentaron de peso en la misma cantidad que los del lote control no padecieron peacuterdida
de masa corporal como siacute ocurrioacute con los del lote tratado con dexametasona
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
70
Figura 33 Efecto de Pm Bb bromelina (Bro) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas
tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6 excepto para Pm n=4) Test de Tukey p lt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Los efectos de Pm y Bb sobre los distintos paraacutemetros evaluados en este modelo
fueron similares a los de Bh3 (Tabla 313) Sin embargo la muerte de dos animales del lote
tratado con Pm podriacutea estar indicando un efecto toacutexico del preparado
34221 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb en el test del granuloma
En la Tabla 316 se exponen los resultados obtenidos para 180 mgkg de Bb2
equivalente a 30 UCaskg y para 180 mgkg de Bb2 tratada con E-64 (Bb2E-64) Puede
observarse que Bb no mostroacute efecto inhibidor significativo sobre los granulomas y su
porcentaje de inhibicioacuten no se diferencioacute significativamente del de BbE-64 Tampoco se
observaron efectos significativos de Bb y BbE-64 sobre el peso de los timos
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 050plusmn003 036plusmn002 068plusmn003
Bb 2 (180 mgkg
30plusmn5 UCaskg)
052plusmn008 -4c 036plusmn003 0c 098plusmn005 -44a
Bb2E-64 (180 mgkg
006plusmn001 UCaskg)
039plusmn005 22c 028plusmn003 22c 095plusmn008 -40a
Dexametasona (3 mgkg) 0230plusmn0005 54a 0050plusmn0004 86a 034plusmn001 50b
Tabla 316 Efecto de Bb2 con actividad proteoliacutetica y sin actividad proteoliacutetica (Bb2E-64) y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey p lt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
-20
-10
0
10
20
30
ab
b
a
d
Control
Pm3 (334 UCaskg)
Bb4 (312 UCaskg)
Bro (323 UCaskg)Dex (3 mgkg)
c
Ca
mb
io d
e p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
71
A diferencia de lo observado para los preparados en los anteriores ensayos del test
del granuloma los bazos aumentaron significativamente de peso Este efecto fue
independiente de la actividad proteoliacutetica de Bb
En la Figura 34 se muestran los efectos de Bb y BbE-64 sobre los pesos corporales
de los animales Si bien los animales del lote tratado con Bb proteoliacuteticamente activo no
aumentaron de peso en la misma cantidad que los del lote control no mostraron peacuterdida de
masa corporal como siacute ocurrioacute con los del lote tratado con dexametasona
Siendo que la dosis de Bb2 tiene el mismo contenido de UCas (30) que la dosis de
Bb4 que siacute mostroacute efecto antiinflamatorio (Tabla 315) pudo existir alguacuten otro factor que no
se ha controlado y afectoacute a las medidas conduciendo a los resultados contradictorios de las
Tablas 315 y 316 Como se mencionoacute anteriormente la falta de reproducibilidad podriacutea
deberse a la baja sensibilidad del test del granuloma para compuestos no esteroideos
(Bailey et al 1982) Por otro lado Bb2 es el mismo preparado que mostroacute bajo porcentaje
de inhibicioacuten en el modelo de edema de pata inducido por carragenina (Tabla 39) El
aumento en el tamantildeo de los bazos podriacutea estar relacionado con el posible efecto toacutexico que
ha sido detectado en algunos de los ensayos en que se proboacute Bb y que podriacutea enmascarar
su accioacuten antiinflamatoria
Figura 34 Efecto de Bb y Bb inhibida con E-64 (BbE-64) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de
las ratas tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
34222 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm en el test del granuloma
Debido a que la dosis de 30 UCaskg de Pm pareciacutea mostrar cierta toxicidad
(ademaacutes del ensayo cuyos resultados se exponen en Tabla 315 en otro ensayo tambieacuten
murioacute 13 de los animales) se decidioacute bajar la dosis a 13 (equivalente a 10 UCaskg) Al
igual que para Bh y bromelina se ensayoacute el efecto que tiene la inhibicioacuten de las
cisteiacutenendopeptidasas presentes en Pm sobre su efecto antiinflamatorio en el test del
granuloma En la Tabla 317 se muestran los resultados obtenidos para 90 mgkg de Pm4
90 mgkg de Pm4 inhibido con E-64 (Pm4E-64) y dexametasona (3 mgkg)
-20
-10
0
10
20Control
Dex (3 mgKg)
Bb2 (305 UCaskg)
Bb2E-64 (006001 UCaskg)
a
bcb
c
Ca
mb
io d
e p
eso
co
rpo
ral (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
72
Tabla 317 Efecto de Pm4 con y sin actividad proteoliacutetica (Pm4E-64) y dexametasona sobre el granuloma
inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Las dosis ensayadas de Pm en esta oportunidad no provocaron la muerte de los
animales tratados Si bien los porcentajes de inhibicioacuten de granuloma de Pm y de PmE-64
no se diferenciaron significativamente entre siacute el porcentaje de Pm fue estadiacutesticamente
significativo pero no asiacute el de PmE-64 lo cual estariacutea indicando que las
cisteiacutenendopeptidasas de Pm tendriacutean un rol antiinflamatorio en este modelo PmE-64 no
mostroacute actividad fibrinoliacutetica en el ensayo de la placa de fibrina6
De igual modo que para bromelina al inhibir las proteasas de Pm con E-64 no soacutelo
se pierde el efecto antiinflamatorio sino tambieacuten el efecto reductor sobre el peso de los
timos Si bien los porcentajes de reduccioacuten del peso de los timos de Pm y de PmE-64 no se
diferencian significativamente el porcentaje de reduccioacuten respecto al control de Pm es
significativo mientras que el de PmE-64 no
Por otro lado Pm y PmE-64 no redujeron significativamente los pesos de los bazos
al igual que todos los preparados proteoliacuteticos ensayados previamente
En la Figura 35 se observa que Pm y PmE-64 no afectaron significativamente la
ganancia de masa corporal de los animales tratados respecto a los del lote control
Figura 35 Efecto de Pm4 Pm4 inhibida con E-64 (PmE-64) y dexametasona (Dex) sobre los pesos
corporales de las ratas tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Control 050plusmn003 0 36plusmn002 068plusmn003
Pm4 (90 mgkg
11plusmn1 UCaskg)
037plusmn002 26a 026plusmn002 28b 08plusmn01 -23c
Pm4E-64 (90 mgkg
02plusmn01 UCaskg)
0417plusmn0009 17ac 031plusmn003 14cb 062plusmn007 9c
Dexametasona (3 mgkg) 0230plusmn0005 54b 005plusmn0004 86a 034plusmn001 50b
-20
-10
0
10
20
30Control
Dex (3 mgKg)
Pm4 (111 UCaskg)
Pm4E-64 (0201 UCaskg)
a
cc
c
Cam
bio
de p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
73
Pm4 mostroacute efectos similares a los de bromelina con una dosis que contuvo 3 veces
menos UCas que la dosis de bromelina usada como referencia (50-55 mgkg equivalente a
30-35 UCaskg) Para verificar si bromelina alcanza su efecto maacuteximo con una dosis de 10
UCaskg se evaluoacute la accioacuten antiinflamatoria de dosis equivalentes a 11 plusmn 1 31 plusmn 3 y 94 plusmn 9
UCaskg Simultaacuteneamente se midieron los porcentajes de reduccioacuten de los pesos de los
timos y los bazos y se registroacute la ganancia de peso corporal Los resultados se muestran en
la Figura 36 excepto los porcentajes de reduccioacuten de los pesos de los bazos y los cambios
de peso corporal ya que no fueron estadiacutesticamente significativos para ninguna de las
dosis
Figura 36 Porcentajes de inhibicioacuten de granuloma y porcentajes de reduccioacuten de timos para 17 50 y 150 mgkg
de bromelina equivalentes a 11 31 y 94 UCaskg mp masa del granuloma o timo del animal tratado con el preparado mc masa del granuloma o timo del animal del lote control Test de Dunnettt p lt 005 p lt 001 p lt 0001 Media plusmn SEM
Como puede observarse en la figura 36 la dosis de bromelina equivalente a 11 plusmn 1
UCaskg mostroacute un porcentaje de inhibicioacuten de 15 que no resultoacute ser estadiacutesticamente
significativo mientras que la dosis equivalente a 31 plusmn 3 UCaskg mostroacute un porcentaje de
inhibicioacuten similar a los de ensayos anteriores (25-30) Queda de este modo comprobado
que las dosis equivalentes en UCas de Pm4 y bromelina no muestran efectos
antiinflamatorios equivalentes
La UCas es una medida de la actividad hidroliacutetica de la proteasa frente a la caseiacutena
un sustrato con muacuteltiples puntos de corte Igual cantidad de UCas significa igual intensidad
de eficacia proteoliacutetica pero nada indica acerca de la especificidad de la enzima activa
Probablemente la dosis de Pm con igual UCas que la de bromelina tiene maacutes especificidad
hacia los blancos involucrados en el mecanismo de inflamacioacuten que subyacen en el modelo
del granuloma
10 30 900
20
40
60
Granuloma Timo
)x100mm(1 cp
UCaskg
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
74
3423 Posible relacioacuten entre la actividad proteoliacutetica-accioacuten antiinflamatoria-
modulacioacuten sobre poblacioacuten linfocitaria T
En la Figura 36 tambieacuten se puede observar que el aumento en el porcentaje de
inhibicioacuten del granuloma se acompantildea de un aumento en el porcentaje de reduccioacuten del
peso de los timos
Para todos los preparados en que se detectoacute efecto antiinflamatorio significativo
tambieacuten se acompantildeoacute de un efecto significativo sobre el peso de los timos y para Pm y
bromelina ambos dependieron de la actividad proteoliacutetica A modo de resumen en la Figura
37 se muestran graficados los pesos de granulomas en funcioacuten de los pesos de los timos
de los animales tratados con los preparados asiacute como con dexametasona (3 mgkg) a lo
largo del presente trabajo
Figura 37 Relacioacuten peso del granuloma - peso del timo para todos los preparados ensayados Los valores fueron calculados dividiendo el peso promedio del granuloma o timo del lote tratado por el peso promedio del granuloma o timo respectivamente del lote control y expresados como la media plusmn SEM Unidades arbitrarias (ua) Las liacuteneas de puntos representan el liacutemite por debajo del cual los valores se diferencian estadiacutesticamente de los controles (ANOVA Tukey plt005)
Puede observarse maacutes claramente que soacutelo los preparados que redujeron
significativamente el peso de los granulomas (valores por debajo de la liacutenea de puntos
horizontal) disminuyeron significativamente el peso de los timos (valores a la izquierda de la
liacutenea de puntos vertical)
Bromelia balansae (Bb)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bb2E-64(006001 UCaskg)
Bb2(305 UCaskg)
Bb4(312 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Pseudananas macrodontes (Pm)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Pm4(111 UCaskg)
Pm4E-64(0201 UCaskg)
Pm3(334 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Bromelina (Bro)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bro(333 UCaskg)
BroE-64(23 UCaskg)
Bro(101 UCaskg)
Bro(949 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Bromelia hieronymi (Bh)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bh5(364 UCaskg)
Bh5E-64(105 UCaskg)
Bh3(173 UCaskg)
Bh3(345 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
75
A partir de dichas observaciones se podriacutea considerar que parte del mecanismo de
accioacuten antiinflamatorio involucrariacutea la accioacuten moduladora sobre la poblacioacuten de linfocitos T
siendo dependiente de la actividad proteoliacutetica para Pm y bromelina
Ademaacutes de los efectos directos de bromelina sobre los linfocitos T ya mencionados
tales como la inhibicioacuten en la transduccioacuten de sentildeales (Mynott et al 1999) y la regulacioacuten en
la activacioacuten mediado por la remocioacuten de moleacuteculas de la superficie celular (Hale et al
2002) en varios modelos animales la accioacuten reguladora sobre la poblacioacuten linfocitaria T ha
sido asociado al efecto antiinflamatorio de la bromelina En un modelo murino de asma
aleacutergica inducida por ovoalbuacutemina la bromelina administrada intraperitonealmente pudo
atenuar el desarrollo de la enfermedad disminuyendo significativamente las ceacutelulas T CD4+
activadas en particular CD4+CD25+ las ceacutelulas T CD8+ y la relacioacuten CD4+CD8+ en el BAL
(Secor et al 2005) Luego se demostroacute in vitro que bromelina cliva proteoliacuteticamente CD25
desde la superficie de los linfocitos T activos (Secor et al 2009) Por su parte Targoni et al
(1999) reportan que una mezcla de enzimas que contiene bromelina inhibe la
encefalomielitis aleacutergica experimental murina un modelo de enfermedad autoinmune
mediada por ceacutelulas T Este efecto se atribuyoacute a la escisioacuten proteoliacutetica de las moleacuteculas
accesorias CD4 CD44 y CD80 que median las interacciones de ceacutelulas T y ceacutelulas
presentadoras de antiacutegenos En una serie de ensayos in vitro e in vivo Engwerda et al
(2001) concluyen que la bromelina puede simultaacuteneamente mejorar e inhibir las respuestas
mediadas por linfocitos T a traveacutes de una accioacuten estimulante sobre las ceacutelulas accesorias y
una accioacuten inhibidora directa sobre las ceacutelulas T
Es sabido que en el timo los progenitores linfoides tiacutemicos maduran y se diferencian
en linfocitos T inmunocompetentes a traveacutes de un proceso complejo mediado por
quimocinas interleucinas moleacuteculas de adhesioacuten factores de crecimiento y
fundamentalmente por la interaccioacuten entre las ceacutelulas del estroma intratiacutemico (ceacutelulas
epiteliales ceacutelulas dendriacuteticas interdigitadas y macroacutefagos) y los linfocitos (Fainboim amp
Geffner 2008) Durante su paso por el timo el precursor pasa por distintos estadiacuteos de
diferenciacioacuten que se reflejan por la expresioacuten de distintas moleacuteculas de superficie entre
ellas CD25 y CD44 las cuales han mostrado ser sensibles a la accioacuten de la bromelina como
ya se ha mencionado Por otro lado los timocitos proliferan activamente durante la
diferenciacioacuten sin embargo mediante el proceso de seleccioacuten tiacutemica soacutelo aproximadamente
un 2 de los timocitos originados en el timo murino son rescatados de la apoptosis y
pueden emigrar a la periferia como linfocitos T maduros (Kanwar et al 2008)
Teniendo en cuenta 1) que la bromelina es capaz de afectar la poblacioacuten linfocitaria
T y que esto seriacutea mediado por su accioacuten proteoliacutetica sobre las moleacuteculas de superficie
celular 2) que se ha postulado para la bromelina la capacidad de modular la relacioacuten entre
ceacutelulas accesorias y linfocitos T 3) que el proceso de maduracioacuten de los timocitos es
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
76
mediado por diferentes moleacuteculas de superficie celular en su interaccioacuten con el estroma
tiacutemico 4) que una intensa proliferacioacuten linfocitaria acompantildea el proceso de diferenciacioacuten y
5) la asociacioacuten entre el efecto antiinflamatorio y efecto reductor del peso del timo medidos
para los preparados en especial la posible dependencia entre dichos efectos y la actividad
proteoliacutetica de Pm y bromelina se podriacutea interpretar que los preparados alterariacutean los
complejos mecanismos de interaccioacuten celular entre las ceacutelulas del estroma tiacutemico y los
timocitos afectando la proliferacioacuten de los linfocitos T y dando lugar a una poblacioacuten
linfocitaria T perifeacuterica deficiente cuali yo cuantitativamente para intervenir en la respuesta
inflamatoria
Sin embargo esta hipoacutetesis es deacutebil dada las escasas evidencias sobre las que se
sustenta Por empezar un cambio en el peso del timo no indica cuaacuteles son los tejidos
afectados por lo que una evaluacioacuten histoloacutegica permitiriacutea determinar si la disminucioacuten del
peso se debe a la reduccioacuten en la poblacioacuten de ceacutelulas linfoideas ademaacutes de identificar
alteraciones en la arquitectura del oacutergano Por otro lado no es claro el rol que tendriacutean los
linfocitos T en la inflamacioacuten que se desarrolla en el modelo del granuloma inducido por el
pellet de algodoacuten Si bien el desarrollo de la inflamacioacuten granulomatosa es en general un
proceso en el que los linfocitos T tendriacutean un rol predominante los granulomas generados
por cuerpo extrantildeo como es el caso del pellet de algodoacuten estaacuten compuestos casi
exclusivamente por macroacutefagos al menos durante las fases de iniciacioacuten y acumulacioacuten (Co
et al 2004) siendo muy escasas las ceacutelulas linfociacuteticas (Ohtani 2013)
Dado el perfil de actividad de muacuteltiples blancos que caracteriza a la bromelina (Muumlller
et al 2012 Chobotova et al 2010) y probablemente a los preparados proteoliacuteticos
ensayados en el presente trabajo es muy posible que los efectos antiinflamatorio y sobre el
peso de los timos sean independientes entre siacute aunque ambos dependientes de la actividad
proteoliacutetica tanto en el caso de Pm como de bromelina
Dado que los mecanismos de accioacuten que subyacen a los efectos medidos no han
sido objeto de estudio del presente trabajo doctoral futuras investigaciones permitiriacutean
profundizar el conocimiento del rol que cumplen las proteasas de bromelina y especialmente
de Pm que hasta entonces no habiacutean sido estudiadas farmacoloacutegicamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
77
35 Conclusiones
Bh Bb Pm y bromelina mostraron efecto antiinflamatorio frente a la inflamacioacuten
aguda (edema de pata de rata inducido por carragenina)
Dosis de Bh Pm y bromelina equivalentes en actividad proteoliacutetica mostraron
porcentajes de inhibicioacuten de edema similares entre siacute y con el de indometacina (10
mgkg) actuando predominantemente sobre la fase tardiacutea (3-7h) propuesta para el
modelo edema de pata inducido por carragenina
Bb actuoacute soacutelo sobre la fase tardiacutea propuesta para el modelo edema de pata de rata
inducido por carragenina mostrando porcentajes de inhibicioacuten de edema inferiores a
los de dosis de Bh Pm y bromelina con equivalente actividad proteoliacutetica
Proteasas cisteiacutenicas de Bb Pm y principalmente de Bh y bromelina seriacutean las
causales del efecto antiinflamatorio sobre la inflamacioacuten aguda (edema de pata de
rata inducido por carragenina) y actuariacutean sobre la fase tardiacutea del modelo (3-7h)
En algunos de los ensayos de edema de pata de rata Bb mostroacute signos de toxicidad
Bh Pm y bromelina mostraron efecto antiinflamatorio frente al modelo de inflamacioacuten
aguda edema de pata de rata inducido por serotonina
A las dosis ensayadas Bh Pm y bromelina no inhibieron el edema de pata de rata
inducido por histamina
Una dosis de Pm con 3 veces menos de actividad proteoliacutetica que una dosis de
bromelina mostraron efectos antiinflamatorios significativamente similares sobre el
modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma inducido por algodoacuten
Los efectos antiinflamatorios de Pm y bromelina en el test del granuloma inducido por
algodoacuten dependeriacutean de la actividad proteoliacutetica de sus proteasas cisteiacutenicas
Los efectos antiinflamatorios de dosis equivalentes a 30 UCaskg de Bh y Bb no
fueron reproducibles en el modelo de inflamacioacuten croacutenica
Los efectos antiinflamatorios medidos para los preparados proteoliacuteticos en el modelo
del test del granuloma inducido por algodoacuten fueron acompantildeados de un significativo
y leve efecto reductor del peso del timo de los animales tratados
Los efectos reductores del peso del timo fueron dependientes de la actividad
proteoliacutetica de las proteasas cisteiacutenicas de Pm y de bromelina
Los efectos antiinflamatorios de los preparados proteoliacuteticos fueron significativamente
menores al de dexametasona (3 mgkg)
A diferencia de la dexametasona ninguno de los preparados redujo
significativamente el peso del bazo como tampoco produjeron peacuterdida de masa
corporal mientras que los porcentajes de reduccioacuten del peso del timo fueron
significativamente menores al de dexametasona
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
78
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4 EFECTO ANTICOAGULANTE
FIBRINOGENOLIacuteTICO Y
FIBRINOLIacuteTICO
Sangre humana 120 segundos despueacutes del inicio del proceso de coagulacioacuten ()
() Martin Oeggerli disponible en httpwwwmicronautchshopblood-clotting
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
82
41 Hemostasia
En los vertebrados la sangre fluye con una presioacuten relativamente elevada por
conductos que conforman un compartimento cerrado Sin embargo frente a una injuria vascular
la peacuterdida de sangre desde dicho compartimento es limitada El conjunto de mecanismos
fisioloacutegicos que mantienen la sangre fluida e impiden su fuga se denomina hemostasia En ella
intervienen la pared de los vasos sanguiacuteneos componentes celulares (plaquetas) y solubles
(factores plasmaacuteticos de la coagulacioacuten) de la sangre el flujo sanguiacuteneo y de manera
indirecta el almohadillado celuloadiposo y conjuntivo que rodeando el aparato vascular lo
protege por fuera (Castillo et al 1994)
Se denomina hemostasia correctora a la que actuacutea evitando la peacuterdida de sangre
cuando una lesioacuten afecta la integridad de la pared vascular y puede dividirse en cuatro fases
1 Vasoconstriccioacuten localizada
2 Formacioacuten de un agregado plaquetario sobre el aacuterea lesionada
3 Coagulacioacuten (formacioacuten de fibrina)
4 Fibrinoacutelisis (degradacioacuten y remodelacioacuten del coaacutegulo de fibrina)
Puesto que parte de los objetivos de esta tesis se refieren al efecto de los preparados
proteoliacuteticos sobre las fases 3 y 4 las fases 1 y 2 soacutelo seraacuten someramente expuestas
411 Vasoconstriccioacuten
Luego de la lesioacuten vascular se produce una vasoconstriccioacuten en el aacuterea afectada que
conduce al enlentecimiento del flujo sanguiacuteneo Esto favorece la interaccioacuten entre las plaquetas
y los factores de la coagulacioacuten con el endotelio iniciando las fases 2 y 3 Inicialmente y durante
los primeros segundos la vasoconstriccioacuten es debida a una estimulacioacuten simpaacutetica en la
musculatura lisa del vaso y es sostenida probablemente por la serotonina la adrenalina y el
tromboxano A2 (TXA2) liberados desde las plaquetas activadas (Castillo et al 1994)
412 Formacioacuten del trombo plaquetario
En condiciones fisioloacutegicas el trombo plaquetario se forma en el aacuterea lesionada y consta
de varias etapas que involucran la adhesioacuten la activacioacuten y la agregacioacuten plaquetaria
Las plaquetas se adhieren a la pared vascular a traveacutes del subendotelio que queda
expuesto por la lesioacuten Las proteiacutenas que median la unioacuten son fundamentalmente el colaacutegeno
subendotelial el factor de von Willebrand (FvW) y la fibronectina mientras que los receptores
plaquetarios involucrados son glicoproteiacutenas de membrana la GPVI las integrinas GPIaIIa
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
83
(α2β1) y GPIIbIIIa (αIIbβ3) y el complejo Ib-V-IX La consecuencia inmediata de la adhesioacuten es la
activacioacuten plaquetaria que se caracteriza por a) cambio de forma discoide a esfeacuterica con
emisioacuten de pseudoacutepodos y b) contraccioacuten dependiente de Ca+2 intracitoplasmaacutetico la cual
determina el proceso de agregacioacuten plaquetaria Durante el proceso de activacioacuten se
desencadenan reacciones metaboacutelicas asiacute como se generan yo liberan agonistas que
amplifican el proceso tales como ADP y TXA2 Algunos agonistas de la activacioacuten plaquetaria
son el colaacutegeno la adrenalina la noradrenalina la serotonina y el PAF (Castillo et al 1994)
El ADP es liberado desde los graacutenulos densos junto a la serotonina al medio
extracelular e induce la activacioacuten de plaquetas por unioacuten a receptores de membrana El TXA2
sintetizado a partir del aacutecido araquidoacutenico (AA) por las viacuteas de la ciclooxigenasa (COX) y la
tromboxano sintetasa es un potente agregante plaquetario y vasoconstrictor El AA es liberado
desde la membrana plaquetaria por la fosfolipasa A2 activada por la unioacuten de agonistas a sus
receptores Otros agonistas desencadenan el metabolismo del fosfatidilinositol conduciendo a
la activacioacuten de proteincinasa C (PKC) que junto a otras cinasas intervienen en varios procesos
de la activacioacuten plaquetaria (Martinuzzo et al 2003)
La agregacioacuten plaquetaria consiste en la unioacuten de plaquetas entre siacute iniciada por la
unioacuten de plaquetas circulantes a las plaquetas ya adheridas al subendotelio Esta unioacuten es
mediada por el FvW y el fibrinoacutegeno el receptor plaquetario es la integrina GPIIbIIIa que es
expresada en la membrana luego de cambios conformacionales dependientes de Ca+2 y
fosforilaciones mediadas por cinasas (Martinuzzo et al 2003) La trombina induce la activacioacuten
y la agregacioacuten plaquetaria provocando la liberacioacuten de ADP y la siacutentesis de TXA2 (Castillo et
al 1994) Una consecuencia de la activacioacuten plaquetaria es la exposicioacuten de fosfoliacutepidos
anioacutenicos en la membrana cruciales para el proceso de coagulacioacuten (Martinuzzo et al 2003)
413 Coagulacioacuten
La coagulacioacuten plasmaacutetica consiste en la transformacioacuten catalizada por la trombina del
fibrinoacutegeno soluble en una red de fibras (fibrina) proceso que intensifica y asegura la
hemostasia temporal iniciada con la vasoconstriccioacuten y desarrollada por las plaquetas Se
produce como resultado de una serie de reacciones en cascada en la que sucesivamente una
proenzima inactiva (zimoacutegeno) es convertida en enzima activa la cual a su vez activa otra
proenzima Los componentes de esta cascada son denominados factores de coagulacioacuten
(Tabla 41) y se clasifican en tres grupos dependientes de la vitamina K sensibles a trombina y
de contacto Los factores dependientes de la vitamina K se caracterizan por poseer un
aminoaacutecido particular el aacutecido γ-carboxiglutaacutemico obtenido por la carboxilacioacuten del aacutecido
glutaacutemico mediada por la vitamina K (Castillo et al 1994)
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84
Factor Nombre sinoacutenimos Peso molecular
(kDa)
Vida media
(h) Grupo
FI Fibrinoacutegeno 340 100-150 T
FII Protrombina 72 50-80 K
FIII Factor tisular (FT)
tromboplastina tisular 44
FIV Calcio
FV Proacelerina 290-400 24 T
FVII Proconvertina 63 6 K
FVIII Factor antihemoliacutetico A 240 12 T
FIX Factor antihemoliacutetico B 554 24 K
FX Factor Stuart 55 25-60 K
FXI Antecedente tromboplastiacutenico
del plasma (PTA) 160 40-80 C
FXII Factor Hageman 90 50-70 C
FXIII Factor estabilizante
de la fibrina 320 150 T
Precalicreiacutena 88 35 C
cininoacutegeno de alto peso
molecular (HMWK)
120 150 C
FvW Factor de von Willebrand 500-20000 24
Tabla 41 Factores de coagulacioacuten Pesos moleculares vida media en plasma y grupo al que pertenecen K
vitamina K-dependientes T trombina sensibles C de contacto
La cascada de coagulacioacuten fue claacutesicamente descripta como dos viacuteas de activacioacuten de
zimoacutegenos que confluiacutean activando el FX y una viacutea comuacuten en la que el FX convertiacutea la
protrombina en trombina y eacutesta el fibrinoacutegeno en fibrina (Figura 41) En este modelo la viacutea
intriacutenseca es desencadenada por contacto del FXII con una superficie cargada negativamente
(por exposicioacuten de un epitelio distinto al vascular) e involucra ademaacutes a los factores FXI FIX
FVIII precalicreiacutena y HMWK La viacutea extriacutenseca desencadenada por la exposicioacuten del FT (por
una lesioacuten tisular) a la circulacioacuten involucra a FVII (Castillo et al 1994) Las plaquetas
activadas intervienen aportando su superficie fosfolipiacutedica (factor plaquetario III) que actuacutea
como catalizador en la etapa final de la viacutea intriacutenseca y en la viacutea comuacuten
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Figura 41 Modelo claacutesico de la cascada de coagulacioacuten La coagulacioacuten se puede iniciar con la liberacioacuten del FT (Viacutea extriacutenseca) yo con el contacto del FXII con una superficie cargada negativamente (Viacutea intriacutenseca) Ambas viacuteas confluyen activando el FX a FXa el que desencadena la viacutea comuacuten que finaliza con la formacioacuten de fibrina Los factores representados como ciacuterculos actuacutean como cofactores para los factores que actuacutean como enzimas (estrellas)
en las reacciones sentildealadas La superficie fosfolipiacutedica es representada como un oacutevalo celeste
Maacutes recientemente se ha propuesto otro modelo de coagulacioacuten en el cual a) el FT es
el principal desencadenante de la coagulacioacuten b) la amplificacioacuten generada por la trombina es
considerada esencial para el desarrollo del coaacutegulo estable y c) existe interdependencia entre
los factores plasmaacuteticos y los elementos celulares (Figura 42) En este modelo la cascada de
coagulacioacuten es vista como un proceso gradual y superpuesto de activaciones proteoliacuteticas en
tres fases inicial de amplificacioacuten y de propagacioacuten en cuyas dos uacuteltimas fases la superficie
celular es fundamental para localizar la formacioacuten del coaacutegulo sobre la superficie dantildeada Las
dos viacuteas claacutesicas se unen a traveacutes del complejo FTFVIIa (viacutea extriacutenseca) el cual es capaz de
activar el factor de la viacutea intriacutenseca FIX (Adams amp Bird 2009)
4131 Fase inicial
La exposicioacuten del FT a la sangre por dantildeo o activacioacuten del endotelio actuacutea como
desencadenante de la coagulacioacuten activando el FVII circulante a FVIIa junto con el cual forma
el complejo tenasa del factor extriacutenseco (FTFVIIa) sobre la superficie fosfolipiacutedica de la
membrana celular Este complejo activa el FX a FXa y el FIX a FIXa (Adams amp Bird 2009) Si el
FXa permanece en la superficie puede unirse al FVa y activar el FII generando cantidades
picomolares de trombina (FIIa) (Martinuzzo et al 2003)
La duracioacuten de esta fase depende de la concentracioacuten del complejo FTFVIIa y del
inhibidor de la viacutea del factor tisular (TFPI) el cual forma un complejo FTFVIIaFXaTFPI capaz
VIacuteA INTRIacuteNSECA
Superficie dantildeada(carga negativa)
FXII
FXIIa
HMWK FXI
FXIa
FIX
FIXa
FX
FXa
FVIIIa
Ca+2
Trauma
Fosfo
liacutepid
os FT
FVIIa
FVII
VIacuteA EXTRIacuteNSECA
Protrombina
Trombina
Fibrinoacutegeno
Fibrina
VIacuteA COMUacuteN
Fosfo
liacutepid
osCa+2
FVa
Calicreiacutena
Precalicreiacutena
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de limitar la formacioacuten de FXa La expresioacuten del FT tambieacuten puede ser inducido en plaquetas y
monocitos asiacute como en micropartiacuteculas circulantes (MP) derivadas de las ceacutelulas en las que se
expresa (Adams amp Bird 2009)
Resulta importante sentildealar que la fase de contacto de la viacutea intriacutenseca en la que
intervienen el FXII la precalicreiacutena y el HMWK no es requerida para iniciar la cascada si bien
es fundamental para los estudios in vitro de la coagulacioacuten (Furie amp Furie 2008)
4132 Fase de amplificacioacuten
Las pequentildeas cantidades generadas de trombina pueden activar al FV y al FVIII los
cuales actuacutean como cofactores de los complejos protrombinasa (FVaFXa) y tenasa intriacutenseca
(FVIIIaFIXa) formados junto a Ca+2 sobre superficies fosfolipiacutedicas pertenecientes
principalmente a las plaquetas La amplificacioacuten de la coagulacioacuten estaacute dada por el incremento
en la produccioacuten del FXa por parte del complejo tenasa intriacutenseca (entre 50 y 100 veces maacutes
que la generada por el complejo FTFVIIa) y de trombina (Adams amp Bird 2009) El FVIII se
asocia al FvW el que mediante su interaccioacuten con la glicoproteiacutena Ib-V-IX se une a la plaqueta
haciendo maacutes eficiente la activacioacuten del FVIII por la trombina (Martinuzzo et al 2003)
Otro efecto amplificador es la activacioacuten del FXI a FXIa por parte de la trombina en
presencia de Ca+2 y protrombina lo que permite al FXIa localizarse en la superficie plaquetaria y
activar maacutes FIX La trombina activa las plaquetas mediante la unioacuten al PAR-1 (receptor activado
por proteasas) lo que a su vez induce la degranulacioacuten de graacutenulos α la expresioacuten de FVa
sobre la membrana y la activacioacuten de GPIIbIIIa estimulando la agregacioacuten plaquetaria y
activando la superficie plaquetaria al inducir la exposicioacuten de fosfoliacutepidos anioacutenicos
(fosfatidilserina) sobre la misma Las plaquetas activadas por trombina muy probablemente
sean las activadas por colaacutegeno durante la adhesioacuten plaquetaria y tienen una gran afinidad para
unir en su superficie los complejos protrombinasa y tenasa intriacutenseca (Adams amp Bird 2009)
4133 Fase de propagacioacuten
Durante la fase de amplificacioacuten se generan plaquetas activadas capaces de unir los
complejos cataliacuteticos maacutes eficientes para la produccioacuten de trombina la cual a su vez activa a las
plaquetas y a los factores y cofactores que componen esos complejos La fase de propagacioacuten
se basa en el reclutamiento de esas plaquetas activadas en el sitio de injuria El resultado de
estas reacciones es la produccioacuten ldquoexplosivardquo de trombina suficiente como para transformar el
fibrinoacutegeno en fibrina y generar un coaacutegulo estable (Adams amp Bird 2009)
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Figura 42 Modelo de la coagulacioacuten con base celular 1 La coagulacioacuten se inicia sobre la ceacutelula portadora del FT originando pequentildeas cantidades de trombina MP micropartiacuteculas circulantes MB membrana basal del endotelio Plt plaquetas 2 La pequentildea cantidad de trombina generada permite activar cofactores plaquetas y FXI formaacutendose sobre las plaquetas los efectivos complejos tenasa intriacutenseco (FVIIIaFIXa) y protrombinasa (FVaFX) que amplifican las reacciones productoras de trombina PS fosfatidilserina 3 Durante la fase de propagacioacuten la cantidad de trombina requerida para la formacioacuten del coaacutegulo se forma desde la superficie de las plaquetas localizadas en el sitio de injuria (Modificado de Adams amp Bird 2009)
4134 Formacioacuten de la fibrina
Puesto que la fibrina se construye a partir de los cambios estructurales que produce la
trombina sobre el fibrinoacutegeno es conveniente describir brevemente la estructura de este uacuteltimo
El fibrinoacutegeno es una glicoproteiacutena fibrosa de gran tamantildeo (340 kDa) compuesta por un diacutemero
de tres cadenas polipeptiacutedicas Aα Bβ y γ unidas por 29 puentes disulfuro (Figura 43) En
cuanto a su estructura terciaria se pueden identificar una regioacuten nodular central (E) y dos
regiones nodulares finales (D)
Figura 43 Estructura molecular del fibrinoacutegeno humano basado en la estructura cristalograacutefica obtenida por rayos X (Kollman et al 2009) las regiones α-C y sus cadenas conectoras no pueden ser resueltas por cristalografiacutea de rayos
X por lo que se muestran esquemaacuteticamente Los fibrinopeacuteptidos son esquematizados para destacar su interaccioacuten con α-C (Tomado de Guthold amp Cho 2011 y parcialmente modificado)
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La regioacuten E estaacute formada por los extremos amino terminal unidos por puentes disulfuro
de las seis cadenas Las regiones D estaacuten formadas por los extremos globulares carboxilo
terminales de las cadenas Bβ (β-C) y γ (γ-C) los que a su vez estaacuten formados por tres
dominios Los extremos carboxilo terminales de las cadenas Aα (α-C) se extienden desde el
extremo de la moleacutecula e interactuacutean entre siacute y con el centro (Weisel 2005) Los segmentos
centrales de las tres cadenas se enroscan formando una triple α-heacutelice (regioacuten coiled-coil) que
proporciona flexibilidad y estabilidad mecaacutenica a la moleacutecula uniendo las regiones D a la regioacuten
E (Lauricella 2007)
Se han identificado funciones para varias de las regiones del fibrinoacutegeno la regioacuten E
posee sitios de unioacuten de diferentes afinidades para la trombina el extremo carboxilo terminal de
una variante de la cadena γ (γ`) une trombina y FXIII la regioacuten D aporta sitios DD que
contribuyen a la alineacioacuten de los monoacutemeros de fibrina y sitios DA (en γ-C) o DB (en β-C) donde
se insertaraacuten los sitios A y B (regioacuten E) respectivamente de monoacutemeros vecinos (Figura 44)
finalmente el sitio γXL de la cadena γ interviene en el ensamblado de la fibrina y facilita la accioacuten
del FXIII (Lauricella 2007)
Figura 44 Formacioacuten de fibrina Esquemas de la moleacutecula de fibrinoacutegeno y de la formacioacuten de los distintos niveles estructurales de la fibrina (Tabla de la derecha) luego de la accioacuten de la trombina y del FXIIIa (Estructuras de fibrinoacutegeno y fibras parcialmente modificadas de Undas amp Arieumlns 2011)
TROMBINA
TROMBINA
Fibrinopeacuteptidos A
Fibrinopeacuteptidos B
MICROFIBRA
FIBRA
FIBRINA INSOLUBLE
FIBRINOacuteGENO
Monoacutemero de fibrina
NIVEL
POLIMERO
NIVEL
GEL
(Agregados de microfibras)
(Red tridimensional con distintos grados de ramificaciones)
(Presencia de entrecruzamientos)FXIIIa
FIBRINA SOLUBLE
FXIII
TROMBINACa
++
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La trombina cliva cuatro enlaces especiacuteficos Arg-Gly de los extremos amino terminales
de Aα y Bβ en la regioacuten E desde los cuales se liberan los fibrinopeacuteptidos A y B
respectivamente y se exponen nuevos sitios (A y B respectivamente) en las cadenas clivadas
del ahora monoacutemero de fibrina
La polimerizacioacuten ocurre en varias etapas conduciendo a distintos niveles estructurales
La unioacuten entre monoacutemeros por interacciones de sus sitios A y B (regioacuten E) con sitios DA y DB
(regiones D) de otros monoacutemeros asiacute como las interacciones entre regiones D (a traveacutes de los
sitios DD) de monoacutemeros contiguos que contribuyen a la elongacioacuten del poliacutemero da lugar a la
formacioacuten de microfibras (o protofibras) estabilizadas por interacciones E-D (Lauricella 2007)
La liberacioacuten del fibrinopeacuteptido B produce tal cambio conformacional que los dominios α-C se
disocian de la regioacuten E y quedan disponibles para las interacciones intermoleculares que
favorecen la agregacioacuten bilateral de las microfibras dando lugar a fibras maacutes gruesas ademaacutes
de contribuir a la estabilidad y a las propiedades mecaacutenicas del coaacutegulo (Weisel 2007 Zhmurov
et al 2011) A su vez las fibras se asocian generando ramificaciones que conforman una red
tridimensional (fibrina soluble) La red es finalmente estabilizada (fibrina insoluble) por el FXIIIa
una transglutaminasa activada por trombina en presencia de Ca+2 El FXIIIa forma puentes
amida entre un grupo amino de residuos de lisina y un grupo carbonilo de residuos de glutamina
dando lugar a entrecruzamientos en la red que pueden ser entre dos cadenas γ dos Aα o una
γ con una Aα La fibrina estabilizada es maacutes resistente a la fibrinoacutelisis (Lauricella 2007)
4135 Regulacioacuten de la coagulacioacuten
Numerosas proteiacutenas cumplen con la funcioacuten regulatoria de la coagulacioacuten actuando en
los distintos niveles El FT es regulado por el inhibidor de la viacutea del factor tisular (TFPI) el que
es expresado por el endotelio y las plaquetas asiacute como por otras ceacutelulas y circula unido a LDL
TFPI tambieacuten neutraliza la actividad del FXa e inhibe el complejo FTFVIIa
La antitrombina el principal inhibidor de la coagulacioacuten es un inhibidor de
serinoproteasas tales como FXa FXIa FIXa y calicreiacutena y se sintetiza en el endotelio Por
actuar preferencialmente sobre las enzimas libres contribuye a limitar la coagulacioacuten en la
regioacuten de lesioacuten (Adams amp Bird 2009)
El cofactor II de heparina es un inhibidor de trombina que requiere la presencia de
dermataacuten sulfato o heparina para acelerar su reaccioacuten Los FVa y FVIIIa son inactivados por la
proteiacutena C activa (APC) actuando como cofactor la proteiacutena S La activacioacuten de la proteiacutena C es
llevada a cabo por la trombina unida a la trombomodulina del endotelio mientras que la APC es
inhibida por α1-antitripsina (α1-AT) y por α2-macroglobulina (α2-MG) asiacute como por el inhibidor de
proteiacutena C (PCI) La α1-AT inhibe tambieacuten FXIa calicreiacutena y trombina La α2-MG es un inhibidor
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90
de amplio espectro ya que inhibe la plasmina la tripsina la calicreiacutena y la elastasa entre otras
ademaacutes de trombina El FXa y el FXIa son inhibidos por el inhibidor de proteasas dependiente
de proteiacutena Z (ZPI) una proteiacutena K-dependiente usando como cofactor la proteiacutena Z
(Martinuzzo et al 2003)
El endotelio actuacutea regulando la hemostasia manteniendo las caracteriacutesticas no
trombogeacutenicas de la cara luminal en contacto con la sangre a traveacutes de la siacutentesis de heparaacuten y
dermataacuten sulfato componentes del sistema de la proteiacutena C antiagregantes plaquetarios como
prostaciclina G2 (PGI2) y oacutexido niacutetrico (NO) entre otros Mientras que ante estiacutemulos
trombogeacutenicos se sintetizan factores prohemostaacuteticos (FvW FT FV)
414 Fibrinoacutelisis
La deposicioacuten de fibrina induce el sistema fibrinoliacutetico que de manera controlada
remueve o remodela el coaacutegulo a traveacutes de la fibrinoacutelisis evitando el depoacutesito indeseado de
fibrina El sistema fibrinoliacutetico estaacute compuesto por zimoacutegenos activadores e inhibidores y a
traveacutes de diferentes mecanismos activa el plasminoacutegeno (Plg) a plasmina que actuacutea
proteoliacuteticamente sobre la fibrina La fibrinoacutelisis estaacute regulada por la concentracioacuten de los
activadores de Plg los cuales tienen una lenta difusioacuten a coaacutegulos ya formados por lo que es
importante su presencia durante la formacioacuten de la red de fibrina de manera que queden
incorporados al coaacutegulo Los principales activadores del Plg son el activador tisular del
plasminoacutegeno (t-PA) y el activador de tipo uroquinasa (u-PA) ademaacutes de algunos activadores
exoacutegenos como la estreptoquinasa generada por estreptococos β-hemoliacuteticos (Martinuzzo et
al 2003)
El t-PA es sintetizado en el endotelio y liberado en respuesta a trombina histamina
bradicinina interleucinas estreacutes y eacutestasis venoso (Martinuzzo et al 2003) entre otros La baja
afinidad del t-PA circulante por el Plg aumenta en presencia de fibrina que es capaz de fijarlo
al igual que al Plg sobre su estructura Asiacute la fibrina promueve la formacioacuten de plasmina sobre
su superficie favoreciendo una lisis local y no una generalizada
El u-PA es secretado por ceacutelulas endoteliales renales y tumorales Se sintetiza en forma
de simple cadena (scu-PA) conocida como prouroquinasa (activa el Plg sobre la fibrina) que
puede ser activada a su forma de doble cadena (tcu-PA) por accioacuten de la plasmina o por los
factores de la fase de contacto (precalicreiacutena HMWK FXII) siendo capaz de actuar sobre el Plg
en fase fluida (Martinuzzo et al 2003)
La plasmina degrada la fibrina (estabilizada por el FXIIIa) liberando fragmentos de
distintos pesos moleculares que en su mayoriacutea incluyen al diacutemero DD (contiene las regiones D
de monoacutemeros contiguos unidos covalentemente) La accioacuten de la plasmina sobre el fibrinoacutegeno
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
91
produce fragmentos X Y D y E similares a los que genera al actuar sobre la fibrina no
estabilizada salvo por la ausencia de los fibrinopeacuteptidos A y B (Figura 45)
Figura 45 Productos de degradacioacuten del fibrinoacutegeno y de la fibrina Las flechas rojas indican puntos de corte de la
plasmina las barras negras representan los entrecruzamientos en la fibrina formados por el FXIIIa (Estructuras de
fibrinoacutegeno y fibrina parcialmente modificadas de Undas amp Arieumlns 2011)
La plasmina tambieacuten es capaz de degradar otras proteiacutenas plasmaacuteticas como el FII el
FV el FVIII cininas componentes del complemento asiacute como tambieacuten activar metaloproteasas
que intervienen en la degradacioacuten de la matriz extracelular Por esto es importante la regulacioacuten
de la fibrinoacutelisis que se da tanto a nivel de la plasmina como de los activadores del Plg
(Martinuzzo et al 2003)
La plasmina circulante es inhibida por unioacuten de la α2-antiplasmina (α2-AP) que no soacutelo
afecta el sitio activo sino tambieacuten los sitios de unioacuten a la fibrina Los inhibidores de los
activadores de Plg (PAI) se encuentran en altas concentraciones en sangre y actuacutean formando
complejos covalentes ya sea con el t-PA como con el u-PA
Por su parte la trombina inhibe la fibrinoacutelisis mediante la activacioacuten del inhibidor de la
fibrinoacutelisis activable por trombina (TAFI) El TAFIa remueve residuos Lys de la fibrina
eliminando los sitios de unioacuten al Plg requeridos para la activacioacuten por el t-PA (Adams amp Bird
2009)
42 Trombosis (Korin 2003)
La trombosis es la presencia intravascular de material fibrino-plaquetario con variable
contenido de hematiacutees y leucocitos y puede ser una respuesta fisioloacutegica (trombo hemostaacutetico)
Fibrinoacutegeno
Fragmento X
Fragmento DFragmento Y
Fragmento D Fragmento E
Fragmento (DD)EFragmento (DD)
Fragmento DYYD
Fibrina estabilizada
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
92
tal como ya ha sido descripto o ser la consecuencia de una activacioacuten patoloacutegica e inapropiada
del sistema de coagulacioacuten
El trombo patoloacutegico puede ser parcial o totalmente oclusivo hecho que puede llevar a
una isquemia de grado variable y consecuente peacuterdida de la funcioacuten vital del oacutergano ademaacutes
de la posibilidad de embolizacioacuten distal y la consecuente embolia pulmonar Seguacuten donde se
asienten los trombos se dividen en venosos arteriales cardiacuteacos y de microcirculacioacuten
La trombosis venosa se caracteriza por la presencia de trombos compuestos
principalmente por hematiacutees y fibrina (trombos rojos) Los factores desencadenantes maacutes
importantes son la disminucioacuten de la velocidad del flujo sanguiacuteneo (anestesias incapacidad
motora aumento de viscosidad sanguiacutenea etc) y cambios en los sistemas de coagulacioacuten y
fibrinoacutelisis (descenso de inhibidores aumento en la concentracioacuten de factores hipofuncioacuten
fibrinoliacutetica etc) Asiacute actuacutean como factores de riesgo los estados post-operatorios las
neoplasias las plejiacuteas los estados trombofiacutelicos y la edad creciente Cuando la trombosis se
localiza en el sistema venoso profundo suele estar asociada con el riesgo de embolia pulmonar
y constituyen los polos cliacutenicos del tromboembolismo venoso (TEV)
El TEV es tratado y prevenido con anticoagulacioacuten (heparinas no fraccionadas
heparinas de bajo peso molecular o dicumariacutenicos) Casos de TEV severos requieren de un
tratamiento tromboliacutetico
La trombosis arterial se produce en zonas de alta velocidad de flujo sanguiacuteneo y los
trombos se componen fundamentalmente de agregado plaquetario y fibrina y en menor
medida de hematiacutees y leucocitos (trombos blancos) Es consecuencia de alteraciones en la
pared vascular (placas ateromatosas) y puede conducir a accidentes cerebrovasculares y
sindromes coronarios agudos entre otras complicaciones
Los factores que pueden desencadenar la trombosis arterial son un endotelio
disfuncional alteraciones en el flujo sanguiacuteneo y la activacioacuten del sistema de coagulacioacuten
mediado por la exposicioacuten del FT Paralelamente se produce reclutamiento activacioacuten y
agregacioacuten plaquetaria asiacute como la activacioacuten del sistema fibrinoliacutetico el que es regulado por el
PAI-1 depositado en la placa ademaacutes del TAFI y la α2-AP La trombogenicidad de una placa es
una funcioacuten del contenido de FT el cual determina la velocidad de produccioacuten de trombina El
FT presente en las placas proviene de las micropartiacuteculas (MP) derivadas de macroacutefagos
linfocitos y ceacutelulas musculares lisas activadas por citoquinas asiacute como de las membranas de
neutroacutefilos y monocitos que invaden la placa por quimiotaxis y adhesioacuten todo ello favorecido por
el endotelio disfuncional Asiacute el nivel de inflamacioacuten tambieacuten contribuye al desarrollo de la
trombosis arterial Por otro lado el colaacutegeno presente en la placa es un desencadenante de la
activacioacuten plaquetaria El tratamiento depende de la localizacioacuten y compromiso del oacutergano
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
93
afectado para lo cual se usan heparinas aspirina inhibidores de la GPIIbIIIa y tromboliacuteticos
entre otros Dado que la aterotrombosis es una enfermedad multifactorial y multigeacutenica se
asocian muacuteltiples factores de riesgo que deben ser tenidos en cuenta para un tratamiento maacutes
adecuado A los factores de riesgo claacutesicos (diabetes obesidad tabaquismo hiperlipidemia
etc) se han empezado a evaluar otros tales como niveles altos de fibrinoacutegeno indicadores de
inflamacioacuten variantes de glicoproteiacutenas plaquetarias niveles de PAI-1 y polimorfismos de APO
entre otros
421 Agentes para el tratamiento de la trombosis
El tratamiento de los desoacuterdenes tromboacuteticos requieren de tres grupos de faacutermacos
anticoagulantes antiagregantes plaquetarios y fibrinoliacuteticos (Tabla 42) Dado que los blancos
de accioacuten son componentes del sistema hemostaacutetico la desventaja que comparten es el riesgo
a la hemorragia El antitromboacutetico ideal seriacutea aquel que inhibe la trombosis y evita el riesgo de
hemorragia (Furie amp Furie 2008)
Anticoagulantes Antiagregantes plaquetarios Fibrinoliacuteticos
Heparina no fraccionada (HNF)
Heparina de bajo peso molecular
(HBPM)
Inhibidores de trombina (ej
argatroban bivalirudina hirudina)
Anticoagulantes orales
Aspirina
Inhibidores de GPIIbIIIa (ej
abciximab eptifibatide tirofiban)
Bloqueador del receptor de ADP (ej
Ticlopidina clopidogrel)
Inhibidores de TXA2 sintasa
Antagonistas de TXA2
Estreptoquinasa
Activadores del plasminoacutegeno tisular
recombinantes (r-TPAs)
Tabla 42 Agentes para el tratamiento de la trombosis
Los desoacuterdenes cardiovasculares representan la principal causa de muerte en el mundo
asiacute como en la Argentina (WHO) Aunque la trombosis sigue siendo la viacutea final de enfermedad y
muerte en algunas de las enfermedades maacutes comunes tales como infarto de miocardio
accidente cerebrovascular y caacutencer todos los agentes farmacoloacutegicos disponibles para su
prevencioacuten o tratamiento han estado en uso durante deacutecadas o han sido reemplazados con
nuevas variantes que ofrecen una modesta mejora incremental (Furie amp Furie 2008)
En los uacuteltimos antildeos una serie de combinaciones de anticoagulantes antiagregantes
plaquetarios y agentes fibrinoliacuteticos se han probado en ensayos cliacutenicos en pacientes con
siacutendromes coronarios agudos dando lugar a cambios en la praacutectica cliacutenica y mejoras en la
morbilidad y mortalidad de los pacientes (Merli 2007)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
94
En cuanto a los agentes fibrinoliacuteticos la estreptoquinasa sigue siendo un medicamento
efectivo para disolver coaacutegulos estando indicada en el tratamiento de algunos casos de infarto
de miocardio (Sikri amp Bardia 2007) Sin embargo la estreptoquinasa y la u-PA activan no soacutelo
el Plg unido a fibrina sino tambieacuten el Plg circulante generando plasmina libre la cual es capaz
de degradar otras proteiacutenas plasmaacuteticas ademaacutes de contribuir a eventos proinflamatorios
(Syrovets et al 2012) Durante la uacuteltima deacutecada la atencioacuten se ha centrado en la mejora de la
potencia eficacia y facilidad de administracioacuten de los agentes fibrinoliacuteticos En este sentido se
han desarrollado variantes recombinates de los PAs que preferencialmente activan el Plg unido
a fibrina (Collen 1996)
La buacutesqueda de enzimas fibrinoliacuteticas alternativas llevoacute hace 70 antildeos al descubrimiento
de los venenos de serpiente como agentes de disolucioacuten intravascular para coaacutegulos La
alfimeprasa una variante recombinante del veneno se caracteriza por tener un efecto directo
sobre la fibrina y es raacutepidamente inhibida al ser unida por α2-MG (Anoacutenimo 2008)
4211 Proteasas vegetales como antitromboacuteticos
La bromelina ha mostrado ser un agente fibrinoliacutetico in vivo e in vitro no soacutelo actuacutea
directamente sobre la fibrina tambieacuten activa el Plg y aumenta la concentracioacuten de plasmina Por
otro lado y en relacioacuten a su efecto antimetastaacutesico es capaz de disminuir la expresioacuten de uPAR
(receptor de u-PA) en ceacutelulas tumorales (Maurer 2001) En un modelo inflamatorio animal
bromelina incrementoacute la actividad fibrinoliacutetica seacuterica de manera dosis dependiente (Pirotta amp de
Giuli-Morghen 1978)
En un modelo de trombosis in vivo la administracioacuten oral de esta proteasa disminuyoacute la
formacioacuten de trombos (13 en arteriolas y 5 en veacutenulas) mientras que in vitro redujo la
adhesioacuten al endotelio de plaquetas humanas activadas por trombina Por otro lado el
tratamiento de plaquetas humanas con bromelina redujo la agregacioacuten inducida por trombina
(Metzig et al 1999) y por ADP (Glaumlser amp Hilberg 2006)
El tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
fueron prolongados significativamente luego de la administracioacuten oral de bromelina en ratas
(Livio et al 1978) En el mismo estudio se observoacute inhibicioacuten en la agregacioacuten plaquetaria La
administracioacuten oral de bromelina durante 10 diacuteas en personas sanas no afectoacute el TP aunque siacute
levemente el TTPa pero dentro de rangos normales (Eckert et al 1999)
Maacutes recientemente Bilheiro et al (2013) reportaron que una fraccioacuten rica en
cisteiacutenendopeptidasas aislada del laacutetex de Carica candarmarcensis manifestoacute efecto
fibrinoliacutetico fibrinogenoliacutetico y tromboliacutetico actividad inhibitoria de la agregacioacuten plaquetaria
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
95
inducida por ADP asiacute como la prolongacioacuten del TP TT y TTPa Todos estos efectos fueron
dosis dependiente y cesaron al agregar inhibidores de cisteiacutenproteasas
43 Objetivos
Dentro del objetivo general de investigar la posible aplicacioacuten como agentes para el
tratamiento de la trombosis de los extractos parcialmente purificados obtenidos de frutos de
Bromelia hieronymi (Bh) B balanasae (Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) se plantearon
como objetivos especiacuteficos
Evaluar y comparar los posibles efectos de Bh Bb y Pm sobre la coagulacioacuten
sanguiacutenea el fibrinoacutegeno y la fibrina
Determinar si los efectos medidos tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los
extractos
Comparar los efectos de Bh Bb y Pm con los medidos para bromelina
44 Materiales y meacutetodos
441 Efecto anticoagulante
Para medir el efecto de los preparados sobre la coagulacioacuten sanguiacutenea se realizaron dos
pruebas globales de la coagulacioacuten el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de
tromboplastina parcial activado (TTPa) Las pruebas globales se caracterizan por ser raacutepidas y
sencillas y aunque sus resultados pueden indicar una alteracioacuten no identifican el componente
afectado (Duboscq 2003)
Los valores del TP y del TTPa se obtuvieron a partir de ensayos in vitro e in vivo Los
ensayos in vitro se realizaron midiendo el TP y el TTPa de un pool de plasma humano pobre en
plaquetas antes y despueacutes de ser incubado con distintas concentraciones de los preparados
proteoliacuteticos mientras que los ensayos in vivo consistieron en medir el TP y el TTPa de plasmas
obtenidos de ratas Wistar tratadas con los preparados proteoliacuteticos
4411 Ensayos in vitro
44111 Pool de plasma pobre en plaquetas
El pool fue elaborado con 15 muestras de plasma pobre en plaquetas (ppp) obtenidas de
dadores voluntarios adultos de entre 30 y 65 antildeos que no hubieran consumido aspirina u otros
faacutermacos con accioacuten anticoagulante en los 10 diacuteas previos El ppp fue obtenido del
sobrenadante luego de centrifugar sangre anticoagulada con citrato de sodio al 38 (relacioacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
96
sangrecitrato de sodio = 91) durante 10 min a 3000 g El pool fue conservado en freezer a -20
ordmC durante su elaboracioacuten (1 semana) y una vez terminado fue fraccionado en tubos de plaacutestico
y conservado a -80 ordmC hasta su uso (2 meses)
44112 Tiempo de protrombina (TP)
El TP o tiempo de Quick se basa en la medida del tiempo de coagulacioacuten de un plasma
decalcificado en presencia de tromboplastina tisular y Ca+2 El teacutermino tromboplastina tisular
hace referencia a una mezcla de tromboplastina o factor tisular (FT) y fosfoliacutepidos (Duboscq
2003)
Esta prueba permite evaluar la viacutea extriacutenseca del modelo claacutesico de la coagulacioacuten ya
que es sensible a cambios en los niveles del FVII ademaacutes de los otros factores vitamina K-
dependientes (FII y FX) y del FV El nivel de fibrinoacutegeno debe estar muy disminuido (menos del
50 de la concentracioacuten normal en plasma) para alterar el TP Es un ensayo esencial para el
monitoreo de pacientes bajo tratamiento con anticoagulantes orales (Duboscq 2003)
Para la medida del TP se usoacute el kit comercial Soluplastin (Wiener lab Group) que
contiene tromboplastina tisular de cerebro de conejo En la Tabla 43 se esquematiza el
protocolo seguido el cual fue adaptado del procedimiento establecido por el kit
Mezcla de reaccioacuten (MR)
100 μL de ppp + 10 μL de muestra1
en tubo de plaacutestico
Reactivo
(Tromboplastina CaCl2 NaCl)
200 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubacioacuten a 37 ordmC (diferentes tiempos) Incubacioacuten a 37 ordmC durante 2 min
2 Agregar 100 μL de MR al tubo con reactivo y en simultaacuteneo iniciar el cronometraje
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 43 Protocolo experimental para la medida del TP 1 Preparado proteoliacutetico o solucioacuten control (buffer fosfato
soacutedico 01M pH 6)
El coaacutegulo fue detectado ldquopescaacutendolordquo mediante un ansa de acero inoxidable los
valores de TP medidos para el pool de ppp tratado con los distintos preparados proteoliacuteticos
(TPp) fueron expresados en s y se compararon con los medidos para los controles (TPc)
obtenidos al mezclar el pool de ppp con buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 (buffer de
resuspensioacuten de la bromelina y de los precipitados etanoacutelicos de cada uno de los extractos
ensayados)
En cuanto a los valores de referencia seguacuten informacioacuten del proveedor del reactivo el
intervalo de los valores de TP de individuos normales adultos oscila entre 10 y 14 s aunque
dichos valores dependen de los reactivos y del procedimiento Tiempos prolongados indican un
estado de hipocoagulabilidad por deficiencia tanto de factores de la viacutea extriacutenseca como de
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
97
vitamina K y por presencia de inhibidores mientras que tiempos acortados se asocian a estados
de hipercoagulabilidad Altas concentraciones (gt 50 μgmL) de productos de degradacioacuten de
fibrina asiacute como enfermedad hepaacutetica son algunas causas de prolongados valores de TP
(Duboscq 2003)
44113 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
El ensayo consiste en medir el tiempo de coagulacioacuten del plasma decalcificado en
presencia de un exceso de tromboplastina parcial un activador y Ca+2 El teacutermino
tromboplastina parcial se refiere a la porcioacuten fosfolipiacutedica en la que se encuentra anclada la
tromboplastina (o FT) El activador proporciona la superficie cargada negativamente
desencadenante de la fase de contacto generalmente tierra de diatomeas celite o caoliacuten
(Duboscq 2003)
Esta prueba sirve para detectar anormalidades en la viacutea intriacutenseca del modelo claacutesico
ya sea por deficiencia de factores procoagulantes como por la presencia de inhibidores por ser
sensible frente a deficiencias de los factores FXII FXI FIX y FVIII como tambieacuten frente a
deficiencias severas de fibrinoacutegeno FII FV y FX Es usada para monitorear el tratamiento
terapeacuteutico con heparina no fraccionada y con acenocumarol (Duboscq 2003)
Se utilizoacute el kit comercial APTTest (Wiener lab Group) que utiliza cefalina como
tromboplastina parcial y tierra de diatomeas como activador En la Tabla 44 se esquematiza el
protocolo seguido en los ensayos el cual fue adaptado del procedimiento establecido por el kit
Mezcla de reaccioacuten (MR)
100 μL de pool de ppp + 10 μL de muestra1 en tubo
de plaacutestico
Reactivo
(Cefalina + tierra de diatomeas)
100 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubar de MR a 37 ordmC (diferentes tiempos)
2 Agregar 100 μL de MR al tubo con reactivo e incubar a 37 ordmC durante 3 min
3 Agregar 100 μL de CaCl2 0025 molL (precalentado a 37 ordmC) iniciar simultaacuteneamente el cronometraje y homogeneizar
4 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 44 Protocolo experimental para la medida del TTPa1 Preparado proteoliacutetico o control (buffer fosfato soacutedico
01 M pH 6)
El coaacutegulo fue detectado ldquopescaacutendolordquo mediante un ansa de acero inoxidable Los
tiempos de tromboplastina parcial activada medidos para el pool de ppp tratado con las distintas
preparaciones proteoliacuteticas (TTPap) fueron expresados en s y se compararon con los medidos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
98
para los controles (TTPac) los que se obtuvieron al mezclar el pool de ppp con buffer fosfato
soacutedico 01M de pH 6
Los valores de TTPa dependen fuertemente de los reactivos y del sistema de deteccioacuten
utilizado por lo cual es importante comparar los resultados obtenidos de la muestra ensayada
con la de un control usando un mismo lote de reactivo Seguacuten informacioacuten del proveedor del
reactivo el intervalo de los valores de TTPa de individuos normales adultos oscila entre 33 y 48
s y los tiempos que se diferencian en maacutes de 6 s de un plasma control deberaacuten ser
considerados anormales Tiempos prolongados indican un estado de hipocoagulabilidad
(deficiencia de factores o presencia de inhibidores) en tanto que los tiempos acortados
corresponderiacutean a un estado de hipercoagulabilidad aunque en este caso es aconsejable tomar
una nueva muestra pues la muestra podriacutea haber sido activada in vitro (Duboscq 2003)
44114 Efecto de la inhibicioacuten de la actividad proteoliacutetica sobre la accioacuten anticoagulante
Las soluciones de Bh Bb Pm y bromelina que extendieron el TP y el TTPa del pool de
ppp por encima de 180 s fueron incubadas durante 30 min a 37 ordmC con 035 mM de E-64 Luego
de verificar la peacuterdida de la actividad proteoliacutetica de dichas soluciones se volvioacute a determinar los
valores de TP y de TTPa siguiendo los protocolos de las tablas 33 y 34 respectivamente La
solucioacuten control para ambos ensayos fue buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 conteniendo 035
mM de E-64
44115 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados
Los datos fueron analizados estadiacutesticamente mediante ANOVA y posterior test de
Dunnett Cuando se compararon soacutelo dos grupos se utilizoacute la prueba t (no pareada) Un p lt
005 () fue considerado significativo Los caacutelculos fueron realizados con el programa
GraphPadPrism version 50
Para todos los preparados proteoliacuteticos las soluciones y diluciones ensayadas fueron
elaboradas n veces (indicado en cada caso) y a cada una de ellas se les midioacute el TP y el TTPa
por duplicado (intraensayo) Los resultados son expresados como el promedio de los valores
promedio intraensayo plusmn desviacioacuten estaacutendar (DE)
4412 Ensayos in vivo
Los resultados obtenidos en los ensayos in vitro se usaron para estimar las dosis que
pudieran resultar efectivas como anticoagulantes en los ensayos in vivo Para estos ensayos
ratas Wistar de ambos sexos y pesos entre 150 y 240 g fueron divididas en lotes de 6 animales
(3 hembras y 3 machos) Cada lote recibioacute intraperitonealmente los preparados proteoliacuteticos el
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
99
lote control no recibioacute tratamiento Previo a la extraccioacuten sanguiacutenea los animales fueron
anestesiados con una mezcla de 75 mgkg de ketamina clorhidrato (Holliday Scott SA) y 12
mgkg de xilacina clorhidrato (Richmond Laboratories Vet Pharma) administrada
intraperitonealmente La extraccioacuten fue realizada por puncioacuten cardiacuteaca y la sangre obtenida fue
mezclada con citrato soacutedico al 38 en una relacioacuten sangreanticoagulante = 91 se centrifugoacute
durante 10 min a 3000 g y el sobrenadante (ppp) fue separado en tubos de plaacutestico que se
almacenaron en freezer a -20 ordmC hasta el momento de medida del TP y del TTPa En la tabla
45 se esquematiza el protocolo seguido para las determinaciones del TP y del TTPa del ppp de
cada animal seguacuten indicaciones de los respectivos kits comerciales (Wiener lab Group)
TP
Plasma pobre en plaquetas (ppp)
100 μL en tubo de plaacutestico
Reactivo (Tromboplastina CaCl2 NaCl)
200 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubacioacuten a 37 ordmC durante 2 min
2 Agregar 100 μL de ppp al tubo con reactivo y en simultaacuteneo iniciar el cronometraje
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
TTPa
Plasma pobre en plaquetas (ppp)
100 μL
Reactivo
(Cefalina + tierra de diatomeas)
100 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Agregar 100 μL de ppp al tubo con reactivo e incubar a 37 ordmC durante 3 min
2 Agregar 100 μL de CaCl2 0025 moll (precalentado a 37 ordmC) en simultaacuteneo iniciar el cronometraje y homogeneizar
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 45 Protocolos experimentales para las medidas del TP y del TTPa
Tanto el TP como el TTPa de cada animal corresponden al promedio de los valores
obtenidos en dos determinaciones
44121 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados
Los datos obtenidos se analizaron estadiacutesticamente mediante ANOVA seguido por el
test de Tukey y las diferencias entre los grupos fueron consideradas significativas para un
plt005 () Los caacutelculos fueron efectuados con el programa GraphPadPrism version 50 Los
resultados se expresan como el promedio plusmn SEM
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
100
442 Efecto fibrinogenoliacutetico
El efecto de los preparados proteoliacuteticos sobre el fibrinoacutegeno fue evaluado mediante el
registro electroforeacutetico por la teacutecnica de tricina-SDS-PAGE de los hidrolizados obtenidos al
incubar las mezclas de dichos compuestos
4421 Hidrolizados
Se utilizoacute como sustrato proteico el fibrinoacutegeno bovino (F8630 Sigma Aldrich)
solubilizado en buffer Tris-HCl 0025M pH 8 Las mezclas de reaccioacuten se hicieron de manera
que la concentracioacuten final de fibrinoacutegeno fuera mayor o igual a 1 mgmL a fin de poder detectar
la proteiacutena remanente tras el desarrollo de la electroforesis mientras que las concentraciones
de los preparados proteoliacuteticos se fueron variando en funcioacuten de los perfiles obtenidos Las
mezclas se incubaron a 37 ordmC durante diferentes tiempos y las reacciones fueron finalizadas por
el agregado de aacutecido iodoaceacutetico (inhibidor de cisteiacutenendopeptidasas) y de buffer de muestra
(BM) Finalmente fueron llevadas a ebullicioacuten durante 5 min El procedimiento se resume en la
Tabla 46 y la composicioacuten del buffer de muestra en la Tabla 47
Tabla 46 Finalizacioacuten de la reaccioacuten y preparacioacuten de los hidrolizados resultantes para la corrida electroforeacutetica
Buffer de muestra
Tris 157 g
SDS 4 g
Glicerol 16 mL
Azul de bromofenol 4 mg
β-mercaptoetanol 25 μL
Llevar a pH 68 con HCl 1M
AD csp 100mL
Tabla 47 Composicioacuten del buffer de muestra (BM) AD agua destilada β-mercaptoetanol fue agregado en el
momento de tratar los hidrolizados
Para los blancos de reaccioacuten se respetaron las mismas cantidades de la Tabla 46 pero
se cambioacute el orden en que se agregaron los reactivos (Tabla 48)
Tratamiento de los hidrolizados
1) Hidrolizados 25 μL
2) Acido iodoaceacutetico (11 mM) 5 μL
3) BM 25 μL
4) Llevar a ebullicioacuten 5 min
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101
Tabla 48 Procedimiento para la preparacioacuten de blancos de reaccioacuten Los voluacutemenes de la solucioacuten del
preparado proteoliacutetico (E) y del fibrinoacutegeno (S) fueron tales que S+E = 25 μL
Las muestras resultantes se conservaron en freezer a -20ordmC hasta el momento de la
siembra
4422 Tricina-SDS-PAGE
Esta teacutecnica electroforeacutetica es muy adecuada para la separacioacuten de polipeacuteptidos y
proteiacutenas en el rango de 1 a 100 kDa y es la preferida para la resolucioacuten de proteiacutenas con pesos
moleculares maacutes pequentildeos que 30 kDa (Schaumlgger 2006) La tricina es utilizada como ion de
arrastre en el buffer catoacutedico permitiendo una mayor resolucioacuten de proteiacutenas pequentildeas a
concentraciones menores de acrilamida que en el caso del buffer Tris-glicina utilizado en la
teacutecnica ideada por Laemmli (1970) La electroforesis con tricina permite una mejor resolucioacuten de
polipeacuteptidos sobre todo en el rango de 5 y 20 kDa sin la necesidad del uso de urea (Schaumlgger
amp von Jagow 1987)
Para el moldeado de geles y la corrida electroforeacutetica se empleoacute el equipo Mini-Protean
III (Bio-Rad) Debido a que el PM de la cadena maacutes grande del fibrinoacutegeno (Aα) es de alrededor
de 65 kDa se eligioacute el sistema de geles que permite resolver mezclas proteicas en el rango 5-
100 kDa que consiste en un gel de resolucioacuten con 10 de T14 y 3 de C15 y en un gel de
apilamiento con 4 de T y 3 de C (Tabla 49)
Las muestras obtenidas seguacuten lo indicado en 4421 fueron centrifugadas durante 10
min a 16000 g y el sobrenadante fue sembrado (5 μL) sobre el buffer catoacutedico (Tris 01M
Tricina 01M SDS 01) contenido en las calles
14
T= (g acrilamida+g bisacrilamida) x 100 volumen total 15
C= g bisacrilamida x 100 (g acrilamida+g bisacrilamida)
Blancos de reaccioacuten
1) Volumen de solucioacuten del preparado proteoliacutetico
E μL
2) Acido iodoaceacutetico (11 mM) 5 μL
3) BM 25 μL
4) Volumen de solucioacuten de fibrinoacutegeno S μL
5) Llevar a ebullicioacuten 5 minutos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
102
Reactivos Gel de apilamiento 4T y 3C
Gel de resolucioacuten 10T y 3C
AcrilBis (4815) 06 mL 2 mL
Buffer del gel 100 mL 33 mL
H2O 34 mL 47 mL
PSA 10 40 μL 50 μL
TEMED 4 μL 5 μL
Tabla 49 Sistema de geles empleado (rango 5-100kDa) Buffer del gel Tris-HCl 3M pH 845 conteniendo SDS 03
PSA persulfato de amonio TEMED NNNacuteNacute-tetrametiletilendiamina
En los reservorios anoacutedicos y catoacutedicos de la celda electroforeacutetica se colocaron buffer
anoacutedico (Tris-HCl 02M pH 89) y buffer catoacutedico respectivamente
La electroforesis fue desarrollada sin refrigeracioacuten El voltaje inicial fue de 30 V y se
mantuvo constante durante el paso de las muestras por el gel de apilamiento cuando las
muestras entraron al gel de resolucioacuten se lo aumentoacute a 100 V valor que se mantuvo constante
hasta que el frente de colorante alcanzoacute el fondo del gel Inmediatamente despueacutes los geles
fueron removidos de las placas y las bandas proteicas visualizadas mediante tincioacuten con
Coomassie para lo cual los geles se dejaron durante 30 min en solucioacuten fijadora (10 vv de
aacutecido aceacutetico 50 vv de metanol) Luego fueron coloreados con solucioacuten colorante (10 vv
de aacutecido aceacutetico 40 vv de metanol y 100 mg de Coomassie Brillant Blue R-250) y
decolorados con una solucioacuten de aacutecido aceacutetico al 10 vv Una vez secos fueron escaneados y
las imaacutegenes reducidas a un tamantildeo y resolucioacuten adecuados en un programa de procesamiento
de imaacutegenes (Adobe Photoshop y Aldus Photostyler) Luego se utilizoacute un software especial
(Scion Image 1998 URL httpwwwscioncorpcom) que convierte la intensidad de color de las
bandas presentes en los geles en datos numeacutericos permitiendo realizar densitogramas de las
calles sembradas
443 Efecto fibrinoliacutetico
4431 Placa de fibrina
A fin de evaluar la actividad fibrinoliacutetica de los preparados proteoliacuteticos se desarrolloacute el
ensayo de la placa de fibrina Este ensayo altamente reproducible y sensible consiste en
depositar gotas de la solucioacuten en ensayo sobre un coaacutegulo de fibrina formado en una placa de
Petri y determinar la cantidad de fibrina degradada midiendo las aacutereas de las zonas lisadas
despueacutes de incubar la placa a 37 ordmC sobre una superficie nivelada en una caacutemara huacutemeda
(Jespersen amp Astrup 1983)
Se siguioacute la teacutecnica desarrollada por Dametto et al (2000) con algunas modificaciones
seguacuten la cual 4 mL de fibrinoacutegeno al 05 en el buffer de reaccioacuten (barbital 0045 M pH 775
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
103
conteniendo CaCl2 166 mM MgCl2 07 mM y NaCl 92 mM) fueron mezclados con 4 mL de una
solucioacuten de agarosa al 2 preparada en el mismo buffer y 02 mL de 20 unidades NIHmL de
trombina todos a 42 ordmC La mezcla fue depositada en una placa de Petri (15 x 9 cm)
homogeneizada mediante movimientos circulares y dejada 1 h a temperatura ambiente para
permitir la correcta formacioacuten y estabilizacioacuten de la fibrina Sobre la superficie del coaacutegulo se
sembraron 10 μL por muestra y luego de incubar en atmoacutesfera huacutemeda a 37ordmC durante 14 h se
midieron 2 diaacutemetros perpendiculares para cada aacuterea de lisis
Se utilizoacute fibrinoacutegeno bovino (F8630 Sigma Aldrich) y trombina bovina (T7513 Sigma
Aldrich) mientras que como control se empleoacute plasmina humana (P1867 Sigma Aldrich) La
concentracioacuten de trombina usada en el ensayo fue obtenida por dilucioacuten de una solucioacuten stock
de trombina (100 unidades NIHmL en solucioacuten de 09 de NaCl y 01 de seroalbuacutemina
bovina) con el buffer de reaccioacuten
4432 Caacutelculos y anaacutelisis de resultados
El aacuterea de la zona circular lisada durante el periacuteodo de incubacioacuten es proporcional a la
cantidad de producto (fibrina lisada) formado enzimaacuteticamente y por tanto una medida de la
actividad fibrinoliacutetica de la solucioacuten sembrada la cual fue estimada como el producto de 2
diaacutemetros perpendiculares (mm2) de la zona lisada (Jespersen amp Astrup 1983) La relacioacuten
entre la concentracioacuten de la enzima (C) y la actividad fibrinoliacutetica (A) tal como fue definida es
A = kCa siendo k y a constantes
Puesto que a es diferente de 1 esta relacioacuten no es una funcioacuten lineal Sin embargo
aplicando logaritmos a ambos miembros de la relacioacuten se obtiene
log A = b + alog C siendo b = log k
Lo cual permite estimar los paraacutemetros k y a de forma maacutes precisa mejorando la
precisioacuten del ensayo El paraacutemetro b expresa la actividad fibrinoliacutetica (como log k) cuando la
concentracioacuten es 1 mientras que el paraacutemetro a expresa impliacutecitamente el mecanismo del
ensayo (Jespersen amp Astrup 1983)
La actividad fibrinoliacutetica fue medida por triplicado para una serie de diluciones de cada
preparado proteoliacutetico y se graficaron las relaciones doble logariacutetmicas entre A y C Los
paraacutemetros de correlacioacuten calculados mediante el programa GraphPadPrism version 50
sirvieron para comparar las actividades fibrinoliacuteticas de los distintos preparados ademaacutes de
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
104
encontrar una correlacioacuten entre la actividad caseinoliacutetica y la actividad fibrinoliacutetica para cada una
de ellas
444 Material vegetal
El contenido proteoliacutetico (UCasmg) y proteico (μg proteiacutenamg) asiacute como la actividad
especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos utilizados se presenta en la Tabla 410
Liofilizados UCasmg μg proteiacutenamg UCasmg proteiacutena
Bh 0275 plusmn 0005 27 plusmn 2 10
Pm 0166 plusmn 0009 34 plusmn 3 5
Bb 0155 plusmn 0008 11 plusmn 1 14
Bromelina (Sigma Aldrich) 068 plusmn 004 205 plusmn 2 33
Tabla 410 Contenido proteoliacutetico (UCasmg) proteico (μg proteiacutenamg) y actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos ensayados UCas unidades caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC) Media plusmn DE
Para todos los ensayos las soluciones de los extractos fueron preparadas por
resuspensioacuten de los liofilizados en agua destilada mientras que la bromelina fue redisuelta en
buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6
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105
45 Resultados y discusioacuten
451 Efecto anticoagulante 4511 Ensayos in vitro
Con el objetivo de determinar las concentraciones tiempos y voluacutemenes a incubar se
realizaron ensayos preliminares con un uacutenico ppp a partir de cuyos resultados (no mostrados)
se decidioacute que el tiempo de incubacioacuten fuera de 2 min Durante los ensayos con el pool de ppp
las concentraciones que no mostraron resultados concluyentes a los 2 min tambieacuten fueron
ensayadas incubando durante 10 min
Debido a que no todas las concentraciones fueron replicadas en igual nuacutemero eacuteste (n)
se indica en la tabla junto con el valor de la desviacioacuten estaacutendar (DE) Como se mencionoacute cada
replicado corresponde a un ensayo independiente y es el promedio de dos medidas realizadas
dentro de cada ensayo Cuando el coaacutegulo no fue detectado dentro de los 180 s desde el inicio
del cronometraje dichas medidas (indicadas como nc) no fueron tenidas en cuenta para el
anaacutelisis estadiacutestico y por tanto no se contabilizaron dentro del valor de n se decidioacute considerar
este tiempo como un efecto maacuteximo
En las tablas aparecen las concentraciones finales es decir referidas al volumen de
mezcla (pool de ppp + preparado proteoliacutetico)
En la mayoriacutea de los casos ademaacutes de diferencias significativas de los valores de TP y
de TTPa respecto a los del control se detectaron coaacutegulos con una consistencia diferente a la
del coaacutegulo obtenido a partir del pool de ppp sin tratamiento proteoliacutetico Por este motivo se
elaboroacute una escala que contempla las diferentes caracteriacutesticas de los coaacutegulos formados
(Tabla 411) En algunos casos se observoacute que el tiempo en que se detecta el hilo de fibrina
(primer indicio de la formacioacuten de fibrina) difiere maacutes del 5 del tiempo en que se detecta el
coaacutegulo de fibrina En este caso se tomoacute como tiempo de coagulacioacuten el promedio de ambos
tiempos y el hecho fue indicado con la letra D
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106
Caracteriacutestica del coaacutegulo Nuacutemero de referencia
asignado
Filamentoso (carece del volumen y del aspecto
ldquogelatinosordquo del coaacutegulo normal)
I
Muy fraccionado (maacutes de 6 ldquosubcoaacutegulosrdquo) II
Fraccionado (menos de 6 ldquosubcoaacutegulosrdquo) III
Coaacutegulo uacutenico pero de menor solidez que el del pool
de ppp no tratado (imposibilidad de levantarlo con el ansa)
IV
Tabla 411 Escala en que fueron agrupados los coaacutegulos con caracteriacutesticas diferentes de los normales
45111 Tiempo de Protrombina (TP)
En la Tabla 412 se exponen los valores de TP de un pool de ppp luego de incubarlo con
distintas concentraciones de bromelina a 37 ordmC durante 2 min
Bromelina
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
14 gt180 2
13 82 2 37 I (23) nc (13)
11 615 4 8 D (24)
09 38 4 8 D (24)
065 20 3 1
0 165 4 05
Tabla 412 TP para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones bromelina Resultados del test de
Dunnett plt001 plt0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo
nuacutemero de referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada)
nc TPgt180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
La prolongacioacuten significativa del TP fue acompantildeada con alteracioacuten ya sea en el
intervalo de deteccioacuten del coaacutegulo (D) como en la caracteriacutestica del coaacutegulo (I)
En la tabla 413 se muestran los valores de TP del pool de ppp despueacutes de incubarlo con
distintas concentraciones de Bh a 37 ordmC Luego de incubar el pool de ppp con 35 mgmL
durante 2 min se obtuvieron valores y caracteriacutesticas de coaacutegulo muy dispares entre los
replicados Por esta razoacuten se ensayoacute tambieacuten el tiempo de incubacioacuten de 10 min para 35
mgmL y 25 mgmL suponiendo que quizaacutes Bh requiriera mayor tiempo para llegar a un
equilibrio
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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107
Bh (Incubacioacuten 2 min) Bh (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE Caracteriacutestica del coaacutegulo TP (s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
55 62 2 23 I (23) nc (13)
35 437 4 13 I (24)IV (24)D 345 3 9 I (13)
25 20 3 35 IV 22 3 3 IV
15 175 3 2
0 167 3 06 165 3 06 165
Tabla 413 TP para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bh Resultados test de
Dunnett plt001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo nuacutemero de
referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TPgt180
s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
Sin embargo puede observarse que no ha habido variacioacuten significativa luego de
incubar 10 min respecto de los valores obtenidos al incubar 2 min Al igual que lo observado
para bromelina la prolongacioacuten significativa del TP fue acompantildeado por una alteracioacuten en la
caracteriacutestica del coaacutegulo
En la tabla 414 se muestran los valores de TP del pool de ppp luego de incubarlo con
distintas concentraciones de Bb a 37 ordmC
Bb (Incubacioacuten 2 min) Bb (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TP
(s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
85 58 2 0 I (23) nc (13)
75 58 1 0 I (13) nc (23)
73 437 3 55 46 3 4 I (13)
65 29 3 4
0 15 3 1 16 3 06
Tabla 414 TP para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bb n nuacutemero de replicados
DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo nuacutemero de referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la
frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TPgt180 s Resultados test de Dunnett (Bb incubacioacuten 2
min) plt005 plt0001 Resultado t-test (Bb incubacioacuten 10 min) plt0001
No se observan cambios significativos entre los valores de TP del pool de ppp incubado
a 2 y 10 min para una misma concentracioacuten Sin embargo hay un gran cambio en relacioacuten a la
caracteriacutestica del coaacutegulo cuando se variacutea muy poco la concentracioacuten (de 73 a 75 mgmL) En
este caso siacute hay una concentracioacuten que variacutea significativamente el TP sin alterar (al menos
visiblemente) la caracteriacutestica del coaacutegulo
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108
En la tabla 415 se exponen los valores de TP del pool de ppp luego de incubarlo con
Pm durante 2 min a 37 ordmC No se ha observado alteracioacuten visible en la caracteriacutestica del
coaacutegulo aunque siacute en el intervalo de deteccioacuten del coaacutegulo (D) y al igual que ocurre con Bb
existe una concentracioacuten que provoca una variacioacuten significativa del TP sin alterar la
caracteriacutestica del coaacutegulo
Pm
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
9 gt180 2
8 551 5 10 D (45)
78 563 4 45 D (34)
65 323 3 35
55 215 2 05
0 153 3 07
Tabla 415 TP para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de Pm Resultados test de Dunnett
p lt 005 p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo D diferencia
temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica
mencionada)
45112 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
Los valores de TTPa del pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min a 37 ordmC con
distintas concentraciones de bromelina se muestran en la Tabla 416 La concentracioacuten a partir
de la cual se observa una prolongacioacuten significativa del TTPa es similar a la miacutenima
concentracioacuten que prolonga el TP (asymp 09 mgmL) Si bien se observaron diferencias entre el
tiempo en que se detecta el hilo y el coaacutegulo (D) no se visualizaron cambios en la caracteriacutestica
del coaacutegulo respecto a la de un coaacutegulo normal
Bromelina
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
10 gt180 2
085 523 6 8 D (26)
050 343 3 07
0 364 5 3
Tabla 416 TTPa para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de bromelina Resultados test de
Dunnett p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
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109
El TTPa del pool de ppp incubado con distintas concentraciones de Bh durante 2 min a
37 ordmC (Tabla 417) fue prolongado significativamente con concentraciones similares a las que
prolongaron el TP Al igual que lo observado en el ensayo para determinar el TP las
concentraciones que prolongaron el TTPa tambieacuten produjeron cambios visibles en la
caracteriacutestica del coaacutegulo
Bh (Incubacioacuten 2 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
38 gt180 3
35 74 4 8 II (34)I(14)
33 534 5 3 IV D (35)
3 457 3 9 IV
0 397 3 06
Tabla 417 TTPa para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de Bh Resultado test de Dunnett
p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica
la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
En la tabla 418 se presentan los valores de TTPa del pool de ppp luego de incubarlo
con distintas concentraciones de Bb durante 2 y 10 min En comparacioacuten con los resultados del
ensayo de medida de TP puede observarse que las concentraciones que prolongaron
significativamente los TTPas estaacuten dentro del rango de concentraciones que prolongaron los
TPs Sin embargo se observoacute cambio en la caracteriacutestica del coaacutegulo cuando hubo
prolongacioacuten significativa de los tiempos
Bb (Incubacioacuten 2 min) Bb (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DS
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TTPa
(s) n DS
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
85 765 2 5 I nc (13) 70 2 9 I nc (13)
75 58 3 7 IIID (23) 60 3 9 II D (13)
65 45 1 IV
55 407 3 3 IV
0 403 3 2 403 3 2
Tabla 418 TTPa para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bb n nuacutemero de
replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada
de la caracteriacutestica mencionada) nc TTPa gt 180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo Bb
(Incubacioacuten 2 min) plt001 (Dunnett) Bb (Incubacioacuten 10 min) plt005 (t-test)
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110
Los tiempos medidos a los 2 y 10 min no fueron significativamente diferentes mientras
que las caracteriacutesticas de los coaacutegulos formados apenas variaron (de III a II)
Luego de incubar el pool con diferentes concentraciones de Pm durante 2 min no se
encontroacute una concentracioacuten que prolongara significativamente el TTPa antes de que lo hiciera
con un TTPa gt 180 s Siacute se observaron cambios en la caracteriacutestica de los coaacutegulos formados
luego de incubar el pool con cada concentracioacuten ensayada (Tabla 419) Cuando se incuboacute
durante 10 min la concentracioacuten de 45 mgmL prolongoacute significativamente el TTPa que resultoacute
ser mayor al TTPa luego de incubar el pool durante 2 min con la misma concentracioacuten Si se
comparan las tablas 415 y 419 se puede observar que la concentracioacuten que prolongoacute maacutes allaacute
de 180 s el TP fue aproximadamente dos veces mayor que la necesaria para prolongar a maacutes
de 180 s el TTPa lo cual estariacutea indicando una mayor especificidad de Pm hacia alguno de los
componentes de la viacutea intriacutenseca que de la extriacutenseca
Pm (Incubacioacuten 2 min) Pm (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) N DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
5 60 2 0 I nc (13)
45 433 3 4 III D (23) 757 3 13 II D (23)
4 362 3 3 IV D (23)
25 362 2 04 D
0 41 3 06 41 3 07
Tabla 419 TTPa para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Pm Resultados t- test p
lt 005 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la
frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TTPa gt 180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de
hilo y coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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111
Para facilitar la comparacioacuten de los efectos de los preparados proteoliacuteticos sobre el TP y
el TTPa se graficaron las relaciones TPpTPc y TTPapTTPac en funcioacuten de la actividad
proteoliacutetica (UCas) de los preparados (Figura 46)
Figura 46 Tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) del pool de ppp luego de
incubarlo con los preparados (TPp TTPap respectivamente) respecto a los tiempos del control (TPc TTPac
respectivamente) en funcioacuten de las UCasmL de bromelina (Bro) y de los preparados de Bromelia balanse (Bb) B
hieronymi (Bh) y Pseudananaacutes macrodontes (Pm) Media plusmn SEM Las liacuteneas verticales con la flecha correspondiente
indican la miacutenima concentracioacuten del preparado respectivo en que no se detecta el coaacutegulo antes de 180 s
El hecho de que la caracteriacutestica del coaacutegulo (I II III IV) variara en relacioacuten a la
concentracioacuten y al preparado con el cual se incuboacute ademaacutes de la alteracioacuten en el intervalo de
deteccioacuten del coaacutegulo (D) dificultoacute las medidas de los tiempos y aportoacute una variabilidad
cualitativa que afectoacute la variabilidad de los tiempos principalmente cuando fueron cercanos al
nc Esto dificultoacute la comparacioacuten entre los efectos de los preparados asiacute como establecer
00 05 10 15
2
4
6
Bro
Bh
Bb
Pm
088 116 15215
I
D
D
DIV
I
IV
I DD
UCasmL
TP
pT
Pc
00 05 10 1505
10
15
20
25
30
Bro
Bh
Bb
Pm
083 132068 104
I
DIII
IV
D
II
IVIV
DIV
DIII
I
DIVD
UCasmL
TT
Pa
pT
TP
ac
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112
concentraciones efectivas pero de todos modos no impidioacute obtener algunas conclusiones tal
como se indica a continuacioacuten
En todos los casos de un corto rango de concentraciones que alteraron
progresivamente la caracteriacutestica normal del coaacutegulo se pasoacute bruscamente a TP y TTPa
prolongados a maacutes de 10 y 4 veces respectivamente
Para todos los preparados hubo alguna concentracioacuten que ademaacutes de prolongar el TP y
el TTPa modificoacute la caracteriacutestica del coagulo o afectoacute el intervalo de deteccioacuten del mismo (D)
Esto podriacutea estar indicando un efecto directo sobre la estructura de la fibrina yo puesto que
eacutesta depende fuertemente de la concentracioacuten asiacute como de la estructura del fibrinoacutegeno
(Lauricella 2007) tambieacuten sobre la del fibrinoacutegeno Dado que la creciente evidencia apoya el
concepto de que las caracteriacutesticas estructurales de la fibrina pueden representar un nuevo
factor de riesgo para el tromboembolismo arterial y venoso (Undas amp Arieumlns 2011) el
acompantildeamiento de alteraciones en el coaacutegulo al efecto anticoagulante puede resultar una
desventaja De todos modos esto soacutelo podraacute ser determinado mediante estudios que empleen
modelos de trombosis
Otra informacioacuten que se puede obtener de la Figura 46 es que teniendo en cuenta las
actividades proteoliacuteticas de cada preparado la bromelina ha sido la maacutes potente Se requirieron
088 (plusmn 005) 116 (plusmn 006) 15 (plusmn 008) y 152 (plusmn 003) UCasmL de bromelina Bb Pm y Bh
respectivamente para prolongar el TP a maacutes de 180 s yo producir un coaacutegulo Tipo I En tanto
que para prolongar el TTPa a maacutes de 180 s (yo coaacutegulo Tipo I) se requirieron 068 (plusmn 004)
083 (plusmn 004) 104 (plusmn 002) y 132 (plusmn 007) UCasmL de bromelina Pm Bh y Bb
respectivamente Pareceriacutea existir cierta especificidad de cada preparado proteoliacutetico hacia una
u otra viacutea del modelo claacutesico de la coagulacioacuten Por ejemplo 083 UCasmL de Pm son
suficientes para prolongar el TTPa a maacutes de 180 s mientras que el mismo efecto sobre el TP
requirioacute 152 UCasmL de Pm Algo similar ocurre para los demaacutes preparados
Probablemente estas diferencias se pudieron deber a componentes diferentes a las
proteasas cisteiacutenicas presentes en los preparados Para poner a prueba dicha suposicioacuten y
determinar si el efecto anticoagulante es debido a la accioacuten de proteasas cisteiacutenicas se
determinoacute el TP y el TTPa del pool de ppp luego de incubarlo con soluciones de los preparados
tratados y no tratados con E-64
45113 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de los preparados proteoliacuteticos
sobre su efecto anticoagulante
En las Figuras 47 y 48 se muestran el TP y el TTPa respectivamente del pool de ppp
luego de incubarlo durante 2 min a 37 ordmC con las soluciones de bromelina Bh Bb y Pm antes y
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
113
despueacutes de inhibir sus cisteiacutenendopeptidasas Las concentraciones ensayadas fueron un 10
mayor que aquellas que prolongaban el TP y el TTPa por encima de 180 s En la Tabla 420 se
muestran los valores de actividad caseinoliacutetica de las soluciones de bromelina Bh Pm y Bb
antes y despueacutes de tratarlas con E-64 (035 mM) El TP y el TTPa del control fue obtenido luego
de incubar durante 2 min a 37 ordmC 100 μL del pool de ppp con 10 μL de 035 mM de E-64 en
buffer fosfato soacutedico 01M pH 6
Figura 47 TP de un pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min con Bro (155 mgmL) Bh (6 mgmL) Bb (95 mgmL) y Pm (95 mgmL) inactivas (Con E-64) y activas (Sin E-64) proteoliacuteticamente Valores expresados como la media plusmn DE (n = 3) excepto para los grupos Sin E-64 cuyos TP fueron mayores a 180 s Resultado test de Dunnett entre el grupo Con E-64 y el grupo Control p lt 005
Figura 48 TTPa de un pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min con Bro (11 mgmL) Bh (45 mgmL) Bb (95 mgmL) y Pm (65 mgmL) inactivas (Con E-64) y activas (Sin E-64) proteoliacuteticamente Valores expresados como la media plusmn DE (n=3) excepto para los grupos Sin E-64 cuyos TTPa fueron mayores a 180 s Resultado test de Dunnett entre el grupo Con E-64 y el grupo Control p lt 001 p lt 0001
0
50
100
150
Sin E-64Con E-64Control
Bro(155 mgmL)
Bh(6 mgmL)
Bb(95 mgmL)
Pm(95 mgmL)
180
TP
(s)
0
50
100
150
Con E-64
Control
Sin E-64
180
Bro(11 mgmL)
Bh(45 mgmL)
Bb(95 mgmL)
Pm(65 mgmL)
TT
Pa (
s)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
114
Puede observarse que la prolongacioacuten del TP y del TTPa del pool de ppp luego de
incubarlo con cada preparado es debida preponderantemente a la actividad proteoliacutetica de
proteasas cisteiacutenicas Sin embargo el efecto anticoagulante de Bb y Pm no revirtioacute
completamente cuando sus proteasas fueron inhibidas lo cual podriacutea indicar la presencia de
otro componente anticoagulante presente en los preparados Esto es maacutes notable para el TTPa
medido luego de incubar el pool con Pm sin actividad proteoliacutetica (TTPapTTPac igual a 215) lo
cual sumado a que el TP no es afectado por Pm inhibido es coherente con el hecho de que se
requiere mayor UCasmL para prolongar el TP que para prolongar el TTPa Bb inhibido tambieacuten
prolongoacute significativamente el TP y el TTPa aunque las relaciones TPpTPc y TTPapTTPac
fueron maacutes bajas (13 y 14 respectivamente) Un dato importante es que la caracteriacutestica de
los coaacutegulos formados a partir del pool tratado con los preparados inhibidos no mostroacute
diferencias respecto a la caracteriacutestica de un coaacutegulo normal Esto estariacutea indicando que las
alteraciones observadas (I II III IV D) en los coaacutegulos formados desde el pool tratado con los
preparados se debieron a la accioacuten de las proteasas
Liofilizados Solucioacuten (mgmL) Sin E-64 (UCasmL) Con E-64 (UCasmL)
Bro 204 14 plusmn 02 -045 plusmn 027
Bh 100 273 plusmn 04 -03 plusmn 02
Bb 160 244 plusmn 06 -06 plusmn 03
Pm 100 165 plusmn 01 -02 plusmn 01
Tabla 420 Actividad proteoliacutetica frente al sustrato caseiacutena de las soluciones de Bro Bh Bb y Pm antes (Sin E-64) y
despueacutes (Con E-64) de ser tratadas con 035 mM de E-64 durante 30 min a 37ordmC Los valores son expresadas como la media plusmn DE (n = 3) UCas unidades caseinoliacuteticas a 37 ordmC en buffer Tris-ClH 01M pH 75
Otra causa posible que pudiera explicar el efecto anticoagulante de los preparados
tratados con E-64 es que haya quedado una actividad proteoliacutetica remanente que no haya sido
detectada por el ensayo de actividad caseinoliacutetca Puesto que la teacutecnica de la placa de fibrina
es muy sensible tambieacuten se evaluoacute la actividad fibrinoliacutetica de las soluciones de bromelina Bh
Bb y Pm inhibidas con E-64 Sin embargo tampoco pudo detectarse actividad frente a fibrina
4512 Ensayos in vivo
Las dosis de bromelina Bh Bb y Pm administradas a los animales fueron estimadas
teniendo en cuenta los resultados de los ensayos in vitro y la relacioacuten plasmapeso corporal
establecida para ratas Wistar por Bijsterbosch et al (1981) seguacuten la cual
volumen de plasma (mL) = 00291PC(g) + 254 donde PC es el peso corporal
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
115
Como primera aproximacioacuten se definioacute una misma dosis en UCaskg de bromelina Bh
Bb y Pm a fin de poder compararlas La dosis que se eligioacute fue aquella que en los ensayos in
vitro para todos los preparados evaluados prolongara el TP y el TTPa maacutes de 180 s De la
informacioacuten provista por la figura 46 se puede concluir que a partir de la concentracioacuten de 155
UCasmL de plasma se cumple con dicho requisito Por tanto se optoacute por una dosis de 2
UCasmL de plasma equivalente a 633 UCaskg de animal (aplicando la ecuacioacuten antes
mencionada) que fue redondeada a 65 UCaskg
En la Figura 49 se exponen los valores de TP y de TTPa de ppp extraiacutedos luego de 4 h
de la administracioacuten intraperitoneal de los preparados proteoliacuteticos El tiempo de 4 h fue
establecido de experimentos previos con bromelina
Figura 49 TP y TTPa de ppp obtenido de ratas Wistar luego de 4h de la administracioacuten intraperitoneal de 65 UCaskg de bromelina (Bro) Bh Bb y Pm Valores expresados como la media plusmn SEM Nuacutemero de replicados (n) 6 (Control Bh Pm) 5 (Bro y Bb) Tukeyacutes test p lt 005 p lt 001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt005
Aunque todos los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos mostraron valores
prolongados de TP y de TTPa respecto a los de los lotes controles soacutelo fueron significativos
(plt005) los tiempos de los lotes tratados con bromelina y el TP del lote tratado con Bb los
cuales significaron alrededor de un 20 de los tiempos del lote control Por otra parte los
tiempos de los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos no se diferenciaron
significativamente entre siacute Tampoco se detectaron alteraciones en los coaacutegulos durante las
medidas de TP y de TTPa
Los resultados obtenidos en los experimentos in vivo e in vitro (Figura 46) coinciden en
que la bromelina ha sido la maacutes efectiva frente a TTPa y a TP y en que Bb es maacutes efectivo para
prolongar el TP que el TTPa De todos modos debe tenerse en cuenta que estos resultados
soacutelo sirven como una primera aproximacioacuten en la determinacioacuten de dosis efectivas
Control Bro Bh Bb Pm 0
10
20
30aa
cca ca
TP
(s)
Control Bro Bh Bb Pm 0
10
20
30
ca
a
cca
ca
TT
Pa (
s)
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452 Efecto fibrinogenoliacutetico
En la Figura 410 se muestran las electroforesis junto al densitograma respectivo de los
hidrolizados obtenidos luego de incubar 200 μL de fibrinoacutegeno bovino 12 mgmL con 075 μL de
cada preparado proteoliacutetico equivalente a 1 UCasmL durante 2 30 60 90 120 y 180 min a 37
ordmC El tiempo 0 min corresponde al blanco de reaccioacuten resultante de inactivar el preparado
proteoliacutetico con iodoaceacutetico y buffer de muestra antes de mezclarlo con la solucioacuten de
fibrinoacutegeno
La similitud entre los perfiles electroforeacuteticos obtenidos con todos los preparados estariacutea
indicando una similar actividad proteoliacutetica frente al fibrinoacutegeno ya sea por la preferencia de
sustrato como por la velocidad de reaccioacuten La primera subunidad en ser degradada
completamente fue Aα hecho observado para todos los preparados a los 2 min de incubacioacuten
Le siguioacute Bβ a los 30 min mientras que la subunidad γ fue la maacutes resistente permaneciendo
intacta durante 180 min de incubacioacuten con cada preparado Otra caracteriacutestica comuacuten
observada en todas las electroforesis fue la presencia de un polipeacuteptido de alrededor de 30
kDa aunque en menor cantidad luego de incubar con Bh que probablemente sea producto de
degradacioacuten de la subunidad Bβ puesto que aparece luego de su desaparicioacuten
Para determinar si la resistencia de la subunidad γ a ser degradada por los preparados
es absoluta se incuboacute el fibrinoacutegeno con una concentracioacuten mayor de cada preparado de
manera de aumentar en 100 veces la relacioacuten enzimasustrato Los perfiles electroforeacuteticos
obtenidos luego de incubar 68 μL de fibrinoacutegeno 34 mgmL con 7 μL de 10 UCasmL de cada
preparado durante 10 y 120 min a 37 ordmC se muestran en la Figura 411
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Figura 410 Tricina-SDS-PAGE de fibrinoacutegeno bovino antes (calle 2) y luego de incubarlo a 37ordmC durante 2 30 60 90 120 y 180 min (calles 4 5 6 7 8 y 9 respectivamente) con bromelina (Bro) Bh Bb y Pm Calle 3 blanco de reaccioacuten (0 min) Calle 1 patrones de peso molecular (Bio-Rad) A la derecha de cada electroforesis se encuentra el densitograma respectivo Son indicadas con flechas las subunidades Aα (α) Bβ (β) y γ del fibrinoacutegeno
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Bro
a b g
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Bh
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)Bb
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Pm
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
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Figura 411 Tricina-SDS-PAGE de fibrinoacutegeno bovino antes (calle 2) y luego de incubarlo a 37ordmC durante 10 y 120
min con bromelina (Bro) Bh Bb y Pm (calles 3 4 5 y 6 respectivamente) Calle 1 patrones de peso molecular (Bio-Rad) A la derecha de cada electroforesis se encuentra el densitograma respectivo Son indicadas con flechas las subunidades Aα Bβ y γ del fibrinoacutegeno
Puede observarse que hubo una disminucioacuten en la banda correspondiente a la
subunidad γ a partir de los 10 min de incubacioacuten con cada preparado y que siguioacute disminuyendo
hasta casi desaparecer a los 120 min lo cual confirma que si bien la subunidad γ es altamente
resistente a la accioacuten de las proteasas finalmente es susceptible de ser degradada
A diferencia de lo observado en los ensayos de medidas del efecto anticoagulante la
misma cantidad de UCasmL de cada preparado tuvo un efecto similar sobre el fibrinoacutegeno
Esto puede deberse a que en el plasma cada preparado puede actuar tambieacuten sobre otros
componentes del sistema hemostaacutetico como asiacute tambieacuten pueden ser inhibidos de manera
diferente por α2-MG
Si bien el efecto fibrinogenoliacutetico fue evaluado usando fibrinoacutegeno bovino dada la
escasa diferencia estructural y funcional entre los fibrinoacutegenos de diferentes especies (Weisel
2005) el efecto sobre la subunidad Aα puede servir para explicar la alteracioacuten del coaacutegulo
formado luego de incubar el pool de ppp con los preparados La regioacuten C-α de Aα una vez
producida la liberacioacuten de los fibrinopeacuteptidos A y B produce la agregacioacuten lateral de microfibras
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
10 min
120 min
a b g
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) Bro(4) Bh
(5) Bb(6) Pm
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(4) Bh
(5) Bb(6) Pm
(3) Bro
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de fibrina contribuyendo al espesor de la fibra la resistencia a la traccioacuten de la fibrina (Undas amp
Arieumlns 2011) y la rigidez macroscopia observada (Purohit et al 2011)
Por otro lado dado que el fibrinoacutegeno une las plaquetas favoreciendo la agregacioacuten
plaquetaria se podriacutea suponer que Bh Bb y Pm a traveacutes de su accioacuten fibrinogenoliacutetica
afectaraacuten dicho proceso
453 Efecto fibrinoliacutetico
El efecto de los preparados sobre la fibrina fue evaluado mediante el ensayo de la placa
de fibrina En la Figura 412 se muestran los graacuteficos en escala doble logariacutetmica de
(a) la actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la actividad caseinoliacutetica (UCasmL) y
(b) la actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas (μgmL)
Figura 412 Ensayo de la placa de fibrina a Actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la actividad
caseinoliacutetica (UCasmL) y b actividad fibrinoliacutetica en funcioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas (μgmL) de bromelina (Bro) Bh Bb Pm y plasmina en escala doble logariacutetmica (Log-Log) Valores expresados como la media plusmn DE
En las tablas 421 y 422 se muestran los paraacutemetros de correlacioacuten lineal
(GraphPadPrism) determinados para cada preparado seguacuten la relacioacuten log A = b + alog C
siendo A la actividad fibrinoliacutetica y C la concentracioacuten del preparado (Jespersen amp Astrup
1983)
Actividad fibrinoliacutetica-Actividad caseinoliacutetica
Paraacutemetros Bro Bh
Bb
Pm
a 022c plusmn 002 063
a plusmn 003 063
a plusmn 004 052
b plusmn 002
b 417 plusmn 001 369 plusmn 002 368 plusmn 003 378plusmn 002
r2
09017 09775 09639 09767
N 12 14 11 13
Tabla 421 Paraacutemetros de correlacioacuten lineal de la relacioacuten Log-Log entre actividad fibrinoliacutetica y actividad
caseinoliacutetica a pendiente b Log A (cuando C=1 UCasmL) N nuacutemero de puntos Letras superiacutendices distintas indican diferencias significativas (p lt 005)
a b
-05 00 05 10 1530
35
40
45
50
Actividad caseinoliacutetica (UCasmL)
Ac
tiv
ida
d f
ibri
no
liacuteti
ca
(m
m2m
L)
1 2 3 430
35
40
45
50
Pm
Bh
Bro
Plasmina
Bb
Concentracioacuten de proteiacutenas (gmL)
Ac
tiv
ida
d f
ibri
no
liacuteti
ca
(m
m2m
L)
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Actividad fibrinoliacutetica-Proteiacutenas
Paraacutemetros Bro Bh Bb
Pm Plasmina
a 022c plusmn 002 062
b plusmn 004 062
b plusmn 004 052
b plusmn 002 023
c plusmn 002
b 363 plusmn 007 24 plusmn 01 26 plusmn 01 261plusmn 006 388plusmn 003
r2
08884 09586 09624 09812 09575
N 12 14 11 13 8
Tabla 422 Paraacutemetros de correlacioacuten lineal de la relacioacuten Log-Log entre actividad fibrinoliacutetica y proteiacutenas a
pendiente b Log A (cuando C=1 μgmL) N nuacutemero de puntos Letras superiacutendices distintas indican diferencias significativas (p lt 005)
Tanto para la relacioacuten entre actividad fibrinoliacutetica y actividad caseinoliacutetica como para la
relacioacuten entre actividad fibrinoliacutetica y proteiacutenas puede observarse que la pendiente a y la
ordenada al origen b de Bh Bb y Pm fueron similares entre siacute y diferentes significativamente de
las de bromelina En la tabla 422 se puede observar que bromelina y plasmina tuvieron
similares pendientes a lo cual permite expresar la actividad fibrinoliacutetica de la bromelina en
unidades de plasmina (Jespersen amp Astrup 1983) En este caso 1 μg de bromelina equivale a
007 μg de plasmina humana (P1867 Sigma Adrich)
La existencia de diferentes pendientes estariacutea indicando diferentes mecanismos
intriacutensecos (Jespersen amp Astrup 1983) En este sentido un factor que puede estar influyendo en
el valor del aacuterea de lisis ademaacutes de la actividad proteoliacutetica es la difusioacuten de las proteasas en
la red de fibrina Puesto que todas las proteasas tienen pesos moleculares similares (entre 22 y
25 kDa) y que las soluciones ensayadas de Bh Bb y Pm se prepararon al disolver el liofilizado
(a partir de una solucioacuten de buffer fosfato soacutedico 01M pH 6) en agua mientras que la bromelina
se disolvioacute en buffer de placa (barbital 0045 M pH 775 NaCl 92 mM) se supuso que el medio
de resuspensioacuten podriacutea estar influyendo Sin embargo no se encontraron diferencias
significativas entre las aacutereas de lisis medidas para bromelina disuelta en diferentes molaridades
del buffer fosfato soacutedico de pH 6 (BF) respecto al aacuterea medida para la bromelina disuelta en el
buffer de placa (BP) como asiacute tampoco se hallaron diferencias significativas entre las
pendientes y las ordenadas al origen de las curvas de actividad fibrinolitica en relacioacuten a la
concentracioacuten de bromelina disuelta en BF o BP (Figura 413)
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Figura 413 Efecto del buffer de resuspensioacuten sobre la actividad fibrinoliacutetica de bromelina A Actividad fibrinoliacutetica (mm
2mL) en funcioacuten de la concentracioacuten (mgmL) en escala doble logariacutetmica BF buffer fosfato soacutedico 01 M pH 6
B Actividad fibrinoliacutetica (mm2gota sembrada) para 35 mgmL de bromelina disuelta en diferentes molaridades de BF
de pH 6 Valores expresados como la media plusmn DE
Por lo tanto puede concluirse que bromelina demuestra poseer una mayor actividad
fibrinoliacutetica que Bh Bb y Pm para concentraciones menores a 10 UCasmL mientras que para
concentraciones mayores a 10 UCasmL Bh Bb y Pm tendriacutean mayor actividad fibrinoliacutetica que
bromelina
Una comparacioacuten de la actividad fibrinoliacutetica (412 a) y del efecto anticoagulante (Figura
46) de los preparados permite observar que para prolongar el TP y el TTPa a maacutes de 180 s
bromelina requirioacute aproximadamente 3 veces maacutes de actividad fibrinoliacutetica (entre 136 x103 y
144 x103 mm2mL) que Bh Bb y Pm (entre 52 x103 y 64 x103 mm2mL) Expresado en otros
teacuterminos bromelina muestra mayor efecto fibrinoliacutetico que Bh Bb y Pm sin afectar el TP y el
TTPa lo cual podriacutea llevar a suponer que resultariacutea maacutes ventajosa como agente fibrinoliacutetico
para el tratamiento de algunos de los desoacuterdenes tromboacuteticos (Merli 2007) Sin embargo se
trata de una comparacioacuten entre dos sistemas distintos que tampoco presentan la complejidad
de una trombosis Futuros ensayos fundamentalmente en modelos in vivo son necesarios para
afianzar o descartar estos resultados preliminares
Actividad fibrinoliacutetica de Bromelina (35mgmL)Efecto del buffer de resuspensioacuten
005M 02M 04M Buffer de placa0
50
100
150
200
250
Buffer fosfato soacutedico pH 6
Buffer de resuspensioacuten
mm
2
BromelinaEfecto del buffer de resuspensioacuten
00 05 10 1540
41
42
43
44
45
BF (01M)
BP (005 M)
Concentracioacuten (mgmL)
Acti
vid
ad
fib
rin
oliacuteti
ca (
mm
2m
L)
A B
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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46 Conclusiones
Todos los preparados mostraron actividad anticoagulante en los ensayos in vitro efectos
completamente atribuibles a la accioacuten proteoliacutetica de las cisteiacutenendopeptidasas
presentes en Bh y Bro pero parcialmente a las cisteiacutenendopeptidasas de Pm y Bb
Bromelina Bh y Pm fueron maacutes efectivas para prolongar el TTPa de un pool de ppp que
el TP mientras que Bb fue maacutes efectiva para prolongar el TP que el TTPa
Para todos los preparados el efecto sobre el TP y sobre el TTPa fue acompantildeado de un
efecto sobre la caracteriacutestica del coaacutegulo formado (filamentoso fraccionado fraacutegil) el
cual revirtioacute cuando las proteasas fueron inhibidas con E-64
En los ensayos in vivo soacutelo bromelina y Bb con dosis equivalentes en unidades
caseinoliacuteticas tuvieron un leve efecto anticoagulante
Todos los preparados con unidades caseinoliacuteticas equivalentes degradaron el
fibrinoacutegeno con una cineacutetica similar siendo la subunidad Aα la primera en ser degradada
y γ la maacutes resistente
Todos los preparados mostraron accioacuten fibrinoliacutetica siendo maacutes efectiva la bromelina
para concentraciones menores a 10 UCasmL
La bromelina mostroacute un comportamiento similar frente a la fibrina que la plasmina
Los resultados obtenidos en los ensayos permiten concluir que Bh Pm y en especial Bb
podriacutean tener un potencial efecto antitromboacutetico y tromboliacutetico hecho que deberaacute
evaluarse en otros modelos experimentales
Los resultados obtenidos para Bh Pm y Bb pueden ser de utilidad para el disentildeo de
futuros ensayos a los fines de establecer su efectividad como agentes para el
tratamiento de trombosis
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
123
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ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
125
51 Las causas de la aparicioacuten del caacutencer
El caacutencer sigue siendo una de las enfermedades que maacutes preocupan a la
humanidad auacuten cuando no ocupe el primer lugar entre las principales causas de muerte en
el mundo Si bien la ciencia ha ido aportando sucesivos conocimientos en diferentes
aspectos hecho que ha permitido incrementar los mecanismos de prevencioacuten y de
tratamiento se encuentra auacuten sin respuesta la pregunta relacionada con las verdaderas
causas de la enfermedad (Gibbs 2003) Una explicacioacuten posible es que una ceacutelula debe
adquirir habilidades extraordinarias para convertirse en ceacutelula maligna hace poco maacutes de
una deacutecada Hahn amp Weinberg (2002) describieron las condiciones que debe reunir una
ceacutelula normal para convertirse en canceriacutegena a las que denominaron ldquolos seis
superpoderes diaboacutelicos del caacutencerrdquo ilustrados en la Figura 51 y que se describen a
continuacioacuten
1 Crecimiento en ausencia de sentildeales La mayoriacutea de las ceacutelulas normales esperan un
mensaje externo antes de comenzar a dividirse Las ceacutelulas cancerosas a menudo
falsifican sus propios mensajes pro-crecimiento
2 Crecimiento a pesar de oacuterdenes de detencioacuten A medida que el tumor se expande
comprime al tejido adyacente el cual enviacutea mensajes quiacutemicos que normalmente
detienen la divisioacuten celular Las ceacutelulas malignas ignoran tales oacuterdenes asiacute como los de
sus propios mecanismos internos de envejecimiento
3 Evasioacuten de los mecanismos de autodestruccioacuten En las ceacutelulas sanas el dantildeo geneacutetico
por encima de un nivel criacutetico usualmente activa un programa suicida Las ceacutelulas
cancerosas eluden este mecanismo aunque a veces algunos agentes del sistema
inmune pueden obligar a las ceacutelulas cancerosas a autodestruirse
4 Construccioacuten de nuevos vasos sanguiacuteneos Los tumores necesitan oxiacutegeno y nutrientes
para sobrevivir que obtienen obligando a que los vasos sanguiacuteneos vecinos formen
nuevas ramas que se desarrollen a lo largo de la masa tumoral en crecimiento
5 Inmortalidad efectiva Las ceacutelulas sanas usualmente no se dividen maacutes de 70 veces pero
las ceacutelulas malignas necesitan un nuacutemero mayor de divisiones para formar tumores El
envejecimiento celular parece estar relacionado con los teloacutemeros ubicados a ambos
extremos de cada cromosoma La telomerasa permite mantener la longitud normal de los
teloacutemeros solamente en ceacutelulas sexuales no en el resto de las ceacutelulas del organismo Sin
embargo las ceacutelulas canceriacutegenas son capaces de desarrollar actividad telomeraacutesica lo
que praacutecticamente las torna inmortales
6 Poder para invadir otros tejidos y extenderse a otros oacuterganos Cuando las ceacutelulas
cancerosas logran deshabilitar el circuito celular que las confina a una parte especiacutefica
del oacutergano en el cual se generaron se manifiesta la capacidad de invadir los tejidos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
126
cercanos y provocar metaacutestasis en partes lejanas de su ubicacioacuten original lo que le da al
caacutencer su caraacutecter letal
Figura 51 Ilustracioacuten de las seis principales capacidades desarrolladas por las ceacutelulas caacutenceriacutegenas (tomado de
Hanahan amp Weinberg 2011)
A favor de la manifestacioacuten de estas caracteriacutesticas de las ceacutelulas tumorales juega un
rol fundamental la inestabilidad del genoma que genera la diversidad geneacutetica que facilita
su aparicioacuten asiacute como la inflamacioacuten que tambieacuten fomenta muacuteltiples funciones distintivas
Como resultado del avance conceptual en la uacuteltima deacutecada se han antildeadido dos nuevas
caracteriacutesticas a las seis capacidades de las ceacutelulas tumorales antes sentildealadas
involucradas en la patogeacutenesis de algunos y quizaacutes de todos los tipos de caacutencer la
reprogramacioacuten del metabolismo energeacutetico y la capacidad de evadir la destruccioacuten inmune
La primera de ellas consiste en la capacidad de modificar o reprogramar el metabolismo
celular con el fin de apoyar maacutes eficazmente la proliferacioacuten neoplaacutesica La segunda permite
que las ceacutelulas cancerosas puedan evadir la destruccioacuten inmunoloacutegica en particular por
linfocitos T y B macroacutefagos y ceacutelulas asesinas naturales (ldquonatural killersrdquo) Por otra parte la
inflamacioacuten generada por las ceacutelulas inmunes disentildeadas para combatir las infecciones
quizaacutes pueda dar apoyo accidental a las muacuteltiples capacidades de las ceacutelulas tumorales
Pero ademaacutes de las ceacutelulas cancerosas los tumores muestran otra dimensioacuten de
complejidad ya que poseen un repertorio de ldquoceacutelulas reclutadasrdquo ostensiblemente normales
pero que contribuyen a la adquisicioacuten de los rasgos caracteriacutesticos mediante la creacioacuten del
microambiente del tumor (Hanahan amp Weinberg 2011)
52 Epidemiologiacutea del caacutencer
Como se ha mencionado el caacutencer es una de las principales causas de muerte en el
mundo Seguacuten un informe del antildeo 2008 de la Agencia Internacional de Investigacioacuten sobre
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
127
el Caacutencer (IARCWHO 2008) esta enfermedad produjo 76 millones de muertes (alrededor
del 13 del total) de las cuales aproximadamente el 70 ocurrieron en paiacuteses de bajo y
medianos recursos Sin embargo si se evaluacutean las tasas estandarizadas por edad (ASR) de
muerte por caacutencer (excluyendo el caacutencer de piel con histologiacutea distinta al melanoma) cada
100000 habitantes eacutestas no pueden ser correlacionadas con el nivel de ingreso de los
paiacuteses (Figura 52)
Figura 52 Tasa estandarizada por edad (ASR) de mortalidad por caacutencer para ambos sexos cada 100000 habitantes distribuidas por paiacuteses estimadas en el 2008 Fuente IARCWHO 2008
Puede verse que Argentina en relacioacuten al resto del mundo se encuentra en un nivel
medio-alto de mortalidad por caacutencer De acuerdo a un estudio de la Organizacioacuten Mundial
de la Salud (WHO 2011) en nuestro paiacutes el caacutencer representa la segunda causa de muerte
(20) despueacutes de las producidas por las enfermedades cardiovasculares (33) Respecto
a la incidencia de caacutencer (IARCWHO 2008) Argentina ocupa el mismo nivel (medio-alto)
seguacuten las ASR de incidencia de caacutencer cada 100000 habitantes (Figura 53)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
128
Figura 53 Tasa estandarizada por edad (ASR) de incidencia de caacutencer para ambos sexos cada 100000
habitantes distribuidas por paiacuteses estimadas en el 2008 Fuente Fuente IARCWHO 2008
53 Carcinoma Hepatocelular
Dentro de los distintos tipos de caacutencer el carcinoma hepatocelular (CHC) tiene la
seacuteptima ASR de incidencia y la cuarta ASR de mortalidad maacutes alta en el mundo ambas
calculadas al 2008 cada 100000 habitantes y para ambos sexos constituyendo la tercer
causa de muerte por caacutencer Por su parte en Argentina la ASR de incidencia y de mortalidad
ocupan los lugares 16deg y 12deg respectivamente lo cual la ubica en el grupo de paiacuteses con
nivel medio-bajo de incidencia de CHC Tomando el nivel de ingresos de los paiacuteses seguacuten el
Banco Mundial los paiacuteses con niveles de ingresos bajo o medio-bajo son los que
presentaron una mayor ARS de incidencia de CHC (GHOWHO 2008)
531 Factores de riesgo
La heterogeneidad en la incidencia mundial refleja las variaciones en los principales
factores de riesgo de CHC En Asia oriental y en Aacutefrica subsahariana el factor de riesgo
dominante es la infeccioacuten croacutenica con el virus de la hepatitis B (HBV) junto con la exposicioacuten
a la aflotoxina B1 responsables del 80 de los casos de CHC En cambio en Ameacuterica del
Norte Europa y Japoacuten el principal factor de riesgo es la infeccioacuten con el virus de la hepatitis
C junto con la ingesta de alcohol (Forner et al 2012)
En el 70-90 de los pacientes el CHC se desarrolla dentro de una enfermedad
hepaacutetica croacutenica subyacente La infeccioacuten croacutenica con HBV constituye el factor de riesgo
maacutes frecuente el cual se da en maacutes del 50 de los casos con CHC En pacientes con
cirrosis el CHC constituye la principal causa de muerte (Forner et al 2012) Otros factores
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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129
de riesgo son la enfermedad del hiacutegado graso no alcohoacutelico y la diabetes (Stickel amp
Hellerbrand 2010)
532 Patogeacutenesis molecular
El CHC es un tumor epitelial desarrollado a partir de los hepatocitos La
hepatocarcinogeacutenesis es un proceso complejo de muacuteltiples pasos durante el cual se alteran
varias cascadas de sentildealizacioacuten relacionadas con la supervivencia y la proliferacioacuten celular
generando un perfil molecular heterogeacuteneo En maacutes del 50 de los casos de CHC las viacuteas
de sentildealizacioacuten Ras y del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) son activadas
mientras que en el 40-50 la viacutea del MTOR (mammalian Target of Rapamycin complejo
sensible a rapamicina) es interrumpida La viacutea de sentildealizacioacuten del receptor del factor de
crecimiento tipo insulina (IGF1R) se activoacute en 20 de los CHC tempranos mientras que la
desregulacioacuten de la viacutea de c-MET y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es un
evento comuacuten La viacutea de sentildealizacioacuten Wnt es activada en un tercio de los CHC La alta
vascularizacioacuten y actividad angiogeacutenica presente en el CHC estaacute asociada a las viacuteas de
sentildealizacioacuten del factor de crecimiento endotelio vascular (VEGFA) la angiopoyetina 2
(ANGPT2) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (Forner et al 2012)
Las dos mutaciones maacutes frecuentes ocurren en el gen supresor de tumor TP53 (en
alrededor del 25-40 de los casos) y en el gen para β catenina CTNNB1 que se da en
aproximadamente el 25 de los casos y predomina en los CHC relacionados con la
infeccioacuten de HCV (Forner et al 2012)
533 Tratamiento
A pesar de ser un problema de salud mundial importante en los uacuteltimos decenios no
se han producidos avances significativos en el pronoacutestico de la mayoriacutea de los pacientes
(Asghar amp Meyer 2012) La deteccioacuten temprana y el posterior tratamiento es la uacutenica opcioacuten
para alcanzar una supervivencia sin enfermedad a largo plazo Un tratamiento precoz
efectivo estaacute asociado con una supervivencia media superior a los 5 antildeos (Forner et al
2012) Existen varios tratamientos que deberaacuten ser elegidos en relacioacuten al pronoacutestico del
paciente (Llovet et al 1999) Sin embargo no existen suficientes estudios cliacutenicos que
comparen los distintos tratamientos principalmente en el caso de pacientes con un estadio
temprano de la enfermedad (Forner et al 2012)
La reseccioacuten quiruacutergica la ablacioacuten y el trasplante tienen potencial curativo y son las
opciones terapeacuteuticas en la fase temprana de la enfermedad Sin embargo en Occidente y
Japoacuten pudieron ser aplicados solamente en un 30 de los pacientes (Llovet et al 2008)
Ademaacutes la recurrencia representa un serio inconveniente para la reseccioacuten y la ablacioacuten
Los uacutenicos tratamientos no curativos que proporcionan supervivencia son la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
130
quimioembolizacioacuten transarterial (TACE) aplicada en pacientes con grandes caacutenceres o
enfermedad multifocal y el Sorafenib una droga administrada oralmente en pacientes con
CHC avanzado (Forner et al 2012)
54 Terapia enzimaacutetica sisteacutemica en pacientes con caacutencer
Con el propoacutesito de evaluar el beneficio de la administracioacuten de mezclas de enzimas
proteoliacuteticas tales como tripsina quimotripsina papaiacutena o bromelina (terapia enzimaacutetica
sisteacutemica) como complementaria en pacientes que sufren de caacutencer de mama colorrectal y
plasmocitoma se llevaron a cabo estudios de cohorte que representan el nivel IIB de la
medicina basada en evidencia (EBM) aceptados por la Unioacuten Europea para mostrar la
seguridad y la eficacia de los tratamientos meacutedicos Estos estudios demostraron que la
terapia enzimaacutetica sisteacutemica disminuyoacute significativamente los efectos secundarios inducidos
por el tumor y la terapia estabilizoacute la calidad de vida y prolongaron la sobrevida (Beuth
2008)
En cuanto a la bromelina existe abundante evidencia de su efecto anti caacutencer
especialmente en modelos celulares y animales asiacute como en ensayos cliacutenicos Sin
embargo como agente terapeacuteutico para el tratamiento del caacutencer no ha sido objeto de
estudios cliacutenicos controlados aleatorios (Chobotova et al 2010) La actividad anti caacutencer es
atribuida a la actividad proteoliacutetica de sus proteasas las cuales permanecen funcionalmente
intactas luego de ser absorbidas por el tracto gastrointestinal (Maurer 2001) La baja
toxicidad de la bromelina (Moss et al 1963) ha permitido la administracioacuten oral de dosis
altas durante largos periacuteodos y ser bien tolerada (Maurer 2001 Brien et al 2004)
55 Objetivos
Dentro del objetivo general de evaluar el posible efecto antitumoral de los preparados
proteoliacuteticos obtenidos a partir de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) B balansae (Bb) y
Pseudananas macrodontes (Pm) asiacute como de bromelina (Bro) se plantearon los siguientes
objetivos especiacuteficos
Evaluar el efecto de Bh Bb Pm y Bro sobre la viabilidad de ceacutelulas de
hepatocarcinoma humano
Evaluar el efecto de Bh Bb Pm y Bro sobre la adhesioacuten de ceacutelulas de
hepatocarcinoma humano
Comparar los efectos medidos de los preparados y de la bromelina en relacioacuten a la
actividad proteoliacutetica
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
131
56 Materiales y meacutetodos
561 Cultivo celular
Se empleoacute una liacutenea celular de hepatocarcinoma primario humano HepG2 C3A
(ATCC) la cual fue mantenida en medio esencial Dulbecco con alta glucosa (Gibco)
suplementado con suero fetal bovino (SFB) inactivado con calor (Natocor Argentina) al 10
conteniendo 50 UmL de penicilina y 50 μgmL de estreptomocina a 37 ordmC en una atmoacutesfera
humidificada con 5 de CO2 Las ceacutelulas fueron incubadas junto al medio de cultivo en
policubetas de 96 pocillos durante 24 h a fin de permitir su adhesioacuten
562 Tratamientos
Las ceacutelulas crecidas en monocapa a una densidad de 15000 ceacutelulaspocillo fueron
incubadas en 90 μL del medio de cultivo libre de SFB y 10 μL de la solucioacuten del preparado
proteoliacutetico Se ensayaron diferentes concentraciones de cada uno y distintos tiempos de
incubacioacuten luego de los cuales se midioacute la viabilidad y la adhesioacuten celular Como control se
usoacute buffer fosfato soacutedico 002M pH 6 el cual a su vez se ensayoacute frente a agua como
control
Con el objetivo de determinar si los efectos medidos fueron debido a la actividad
proteoliacutetica se hicieron ensayos de adhesioacuten y viabilidad incubando las ceacutelulas con los
preparados proteoliacuteticos tratados y no tratados con solucioacuten 40 μM de E-64 En estos
ensayos el control fue una solucioacuten 40 μM de E-64 en buffer fosfato soacutedico 002 M pH 6
5621 Evaluacioacuten de la viabilidad celular (Ensayo con MTS)
La viabilidad celular fue evaluada mediante un ensayo colorimeacutetrico utilizando el kit
Cell Titer 96 AQueous Non-Radiactive Cell Proliferation Assay (Promega Corp USA) Este
ensayo se basa en que el metabolismo de las ceacutelulas viables produce compuestos
reductores que pueden reducir un derivado de tetrazolio 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-
carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS) en presencia de metosulfonato de
fenazina (PMS) a formazaacuten un producto soluble y coloreado (Buttke et al 1993) Por lo
tanto la cantidad de formazaacuten formado seraacute proporcional al nuacutemero de ceacutelulas viables El
PMS actuacutea como acoplador de electrones entre el producto metaboacutelico y el MTS
Luego de los distintos tratamientos 100 μL de MTS y PMS fueron incorporados al
cultivo celular y despueacutes de incubarlos durante 30 min a 37 ordmC se midioacute la absorbancia a 490
nm en un lector de ELISA (Metertech 960) que es considerada como proporcional al
nuacutemero de ceacutelulas viables Los resultados fueron expuestos como porcentajes de ceacutelulas
viables respecto a los controles
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
132
5622 Ensayo de adhesioacuten celular (Tincioacuten con cristal violeta)
Luego de la incubacioacuten con los distintos preparados proteoliacuteticos el medio de cada
pocillo se descartoacute a fin de eliminar las ceacutelulas no adheridas se lavoacute con solucioacuten salina de
buffer fosfato (PBS) y se agregoacute formaldehido al 37 durante 15 min a temperatura
ambiente para fijar las ceacutelulas adheridas Posteriormente se incuboacute con colorante cristal
violeta al 05 en aacutecido aceacutetico al 3 durante 20 min Luego se lavoacute exhaustivamente y se
agregoacute SDS al 1 para disolver el colorante Finalmente se midioacute la absorbancia a 600 nm
utilizando un lector de ELISA (Metertech 960) que es considerada proporcional al nuacutemero
de ceacutelulas adheridas (Martiacutenez et al 2004) Los resultados fueron expresados como
porcentajes de ceacutelulas adheridas respecto al control
563 Anaacutelisis estadiacutestico
Todos los ensayos fueron realizados por triplicado en tres ensayos independientes
Los promedios de cada ensayo fueron considerados medidas independientes y las
diferencias de las medias de los grupos de tratamiento y del grupo control fueron evaluadas
mediante ANOVA seguido del test de Dunnett Un p lt 005 () fue considerado significativo
Los valores son expresados como la media plusmn SEM
564 Material vegetal ensayado
El contenido proteoliacutetico (UCasmg) y proteico (μg proteiacutenamg) asiacute como la actividad
especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos utilizados se presenta en la Tabla 51
Liofilizados UCasmg μg proteiacutenamg UCasmg proteiacutena
Bh 027 plusmn 005 27 plusmn 2 10
Pm 014 plusmn 001 33 plusmn 3 42
Bb 015 plusmn 001 11 plusmn 1 14
Bromelina (Sigma Aldrich) 065 plusmn 002 209 plusmn 2 31
Tabla 51 Contenido proteoliacutetico (UCasmg) proteico (μg proteiacutenamg) y actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena)
de los extractos ensayados UCas unidades caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC) Media plusmn DE
Para todos los ensayos las soluciones de los extractos fueron preparadas por
resuspensioacuten de los liofilizados en agua destilada mientras que la bromelina fue redisuelta
en buffer fosfato soacutedico 002 M de pH 6
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
133
57 Resultados y discusioacuten
571 Ensayo de viabilidad
En la Figura 54 se exponen los resultados obtenidos del ensayo de viabilidad donde
pueden verse los porcentajes de ceacutelulas HepG2 viables luego de incubarlas durante 24 y 48
h con concentraciones crecientes de bromelina Bh Bb y Pm
Figura 54 Viabilidad de ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett plt005 plt001
plt0001 Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato
soacutedico 0002 M pH 6
Puede observarse que todos los preparados fueron capaces de disminuir la viabilidad
de las ceacutelulas HepG2 a las 48 h de incubacioacuten La bromelina fue la maacutes efectiva ya que por
un lado produjo disminucioacuten significativa con 10 μgmL en tanto que Bh Bb y Pm
requirieron una concentracioacuten de un orden de magnitud superior para mostrar un efecto
similar por otro lado fue la que mostroacute menos de ceacutelulas viables (asymp 40 frente al 65 de
los preparados) para las mayores concentraciones ensayadas A las 24 h de incubacioacuten si
bien las concentraciones maacutes altas de Bb y Pm disminuyeron el porcentaje de ceacutelulas
viables (75 y 71 respectivamente) no fueron significativos mientras que siacute lo fueron los
porcentajes de 100 μgmL de bromelina y 1000 μgmL de Bh (52 y 61 respectivamente)
572 Ensayos de adhesioacuten
En la Figura 55 se exponen los resultados del ensayo de adhesioacuten celular de las
ceacutelulas HepG2 luego de incubarlas durante 1 24 y 48 h con concentraciones crecientes de
bromelina Bh Bb y Pm En la Figura 56 se muestran microfotografiacuteas de las ceacutelulas HepG2
Bromelina
1 10 1000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Bb
18 180 18000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Bh
10 100 10000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Pm
10 100 10000
50
100
150
Control 24 h 48 h
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
134
luego de incubarlas durante 24 h con las concentraciones intermedias de bromelina Bh Bb
y Pm
Figura 55 Adhesioacuten celular de ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett plt001 plt0001
Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato soacutedico 0002 M
pH 6
Todos los preparados tuvieron efecto sobre la adhesioacuten celular Se observoacute una
eliminacioacuten de la adhesioacuten de las monocapas celulares a la superficie plaacutestica de los
pocillos Las ceacutelulas en suspensioacuten adoptaron una forma redondeada Desde la primera h de
incubacioacuten y para las mayores concentraciones ensayadas (100 μgmL de bromelina 1000
μgmL de Bh y de Pm y 1800 μgmL de Bb) se observaron los porcentajes de adhesioacuten maacutes
bajos (entre un 15 y un 30) los cuales no mostraron diferencias significativas (pgt005
Tukey) respecto de los de las 24 y 48 h siguientes de incubacioacuten Tal como sucedioacute en los
ensayos de viabilidad bromelina requirioacute una concentracioacuten de un orden de magnitud
inferior a la de las demaacutes preparaciones para lograr el mismo efecto sobre la adhesioacuten
Bromelina
1 10 1000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Bb
18 180 18000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Bh
10 100 10000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Pm
10 100 10000
50
100
150
Control 1 h 24 h 48 h
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Figura 56 Microfotografiacuteas de campo claro representativas de ceacutelulas HepG2 luego de incubarlas durante 24 h
con los preparados proteoliacuteticos Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato soacutedico 0002 M pH 6
Si se comparan los porcentajes de ceacutelulas adheridas con los porcentajes de ceacutelulas
viables puede observarse que las disminuciones significativas en la viabilidad ocurren 24 h
despueacutes de una disminucioacuten significativa en la adhesioacuten excepto para 100 μgmL de Bh
indicando que la peacuterdida de adhesioacuten conlleva una peacuterdida de la viabilidad La concentracioacuten
de 100 μgmL de Bh mostroacute un menor porcentaje de ceacutelulas adheridas (36) respecto al
control a 1 h de incubacioacuten que no fue seguida de una disminucioacuten significativa de ceacutelulas
viables (85) a las 24 h de incubacioacuten Por otro lado 10 μgmL de Bh a las 48 h de
incubacioacuten mostroacute un porcentaje de ceacutelulas viables (85) que resultoacute ser una disminucioacuten
significativa mientras que el porcentaje de ceacutelulas adheridas 24 h antes (85) no lo fue sin
embargo no parece ser concluyente que la disminucioacuten de la viabilidad no sea precedida por
una disminucioacuten de la adhesioacuten en dicho caso si se toman en cuenta los valores
porcentuales absolutos de adhesioacuten y viabilidad
573 Efecto de la actividad proteoliacutetica sobre los porcentajes de viabilidad y
de adhesioacuten celular
Como se mencionoacute en la introduccioacuten el efecto antitumoral de bromelina es atribuido
preponderantemente a la actividad de sus proteasas (Salas et al 2008 Chobotova et al
2010) Con el fin de determinar si los efectos sobre la viabilidad y adhesioacuten celular medidos
tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los preparados se determinaron los
porcentajes de viabilidad y de adhesioacuten de los mismos tratados y no tratados con E-64 Se
usaron las concentraciones de Bromelina Bh Bb y Pm que mostraron mayores efectos
(100 1000 1800 y 1000 μgmL respectivamente) a las 24 y 48 h de incubacioacuten (Figura 57)
Control Bro (10 gml) Bb (180 gml) Bh (100 gml) Pm (100 gml)
10X
20X
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
136
Figura 57 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas sobre su accioacuten reductora de la viabilidad y la adhesioacuten de
ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett p lt 005 p lt 001 p lt 0001 ns no significativo Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control 4 μM de E-64 en buffer fosfato soacutedico 0002 M pH 6
Puede observarse que los preparados tratados con E-64 no tuvieron efecto
significativo sobre la viabilidad como tampoco sobre la adhesioacuten celular a las 24 y 48 h de
incubacioacuten salvo la concentracioacuten de 1000 μgmL de Pm para la cual se observoacute una
disminucioacuten significativa en el porcentaje de ceacutelulas adheridas (76) a las 24 h que sin
embargo es significativamente superior (p lt 0001 test de Tukey) al porcentaje de adhesioacuten
de Pm activo proteoliacuteticamente (16)
Puede concluirse que el efecto sobre la viabilidad y la adhesioacuten celular de bromelina
Bh y Bb a las 24 y 48 h de incubacioacuten y de Pm a las 48 h seriacutea debido a la actividad
proteoliacutetica de sus cisteiacutenendopeptidasas
A fin de realizar una comparacioacuten entre los distintos preparados en relacioacuten a su
actividad proteoliacutetica en la Tabla 52 se exponen los porcentajes de ceacutelulas viables (V) y
de ceacutelulas adheridas (A) luego de 48 h de incubacioacuten en funcioacuten del contenido de
unidades caseinoliacuteticas (UCasmL) de las concentraciones ensayadas para bromelina Bh
Bb y Pm
0
50
100
150
Sin E-64Con E-64
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Bromelina
(100 gml)
Bb
(1800 gml)
Bh
(1000 gml)
Pm
(1000 gml)
Control
nsns ns
nsns
ns
ns
ns
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
0
50
100
150
Control Sin E-64Con E-64
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Bromelina
(100 gml)
Bb
(1800 gml)
Bh
(1000 gml)
Pm
(1000 gml)
ns ns ns ns nsns
ns
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
137
Preparado proteoliacutetico
UCasmL (x10-3
) V A
Bromelina
065 plusmn 002 91 plusmn 2 91 plusmn 1
65 plusmn 02 69 plusmn 4 23 plusmn 4
65 plusmn 2 44 plusmn 3 20 plusmn 4
Bh
27 plusmn 05 86 plusmn 4 99 plusmn 1
27 plusmn 5 66 plusmn 1 30 plusmn 6
270 plusmn 25 63 plusmn 5 19 plusmn 2
Bb
27 plusmn 02 103 plusmn 4 99 plusmn 3
27 plusmn 2 78 plusmn 7 30 plusmn 7
270 plusmn 20 68 plusmn 3 21 plusmn 2
Pm
14 plusmn 01 95 plusmn 5 96 plusmn 2
14 plusmn 1 70 plusmn 1 31 plusmn 8
140 plusmn 10 65 plusmn 8 20 plusmn 2
Tabla 52 Porcentajes de ceacutelulas viables (V) y de ceacutelulas adheridas (A) en relacioacuten con la actividad proteoliacutetica (UCasmL) de bromelina Bh Bb y Pm luego de incubar ceacutelulas HepG2 durante 48 h Media plusmnSEM Resultados test de Dunnett p lt 005 p lt 001 p lt 0001
Se puede observar que bromelina requiere menos actividad proteoliacutetica que los
demaacutes preparados para mostrar efectos similares hecho que podriacutea deberse a que las
proteasas de bromelina actuacutean conjuntamente mostrando una mayor especificidad hacia
sustratos relacionados con la viabilidad y la adhesioacuten celular presentes en las ceacutelulas de
HepG2 que las proteasas presentes en Bh Bb y Pm A su vez Bh y Bb fueron menos
activas que Pm
La carcinogeacutenesis hepaacutetica estaacute asociada en parte a un cambio en el perfil de las
integrinas expresadas en la superficie del hepatocito las cuales juegan un papel
fundamental en la adhesioacuten y la migracioacuten celular contribuyendo al crecimiento y la invasioacuten
del tumor (Nejjari et al 1999 Massini 2007) Asiacute los bajos porcentajes de adhesioacuten de
ceacutelulas de HepG2 luego de tratarlas con bromelina Bh Bb y Pm permite suponer que
resultaraacuten efectivas para inhibir el crecimiento tumoral en CHC Ademaacutes abre un abanico de
posibles ensayos a realizar a fin de determinar cuaacuteles seriacutean las proteiacutenas superficiales
blanco para cada una de los preparados proteoliacuteticos
En este sentido es importante mencionar que uno de los mecanismos por el cual la
bromelina ejerceriacutea efecto antitumoral es su capacidad para clivar proteiacutenas de la superficie
celular CD44 un marcador de superficie presente en ceacutelulas inmunes y tumorales y que
estaacute asociado con el crecimiento tumoral y la metaacutestasis mostroacute ser sensible a la bromelina
en liacuteneas tumorales murinas y humanas resultando en una reduccioacuten de la invasioacuten y
adhesioacuten al sustrato (Chobotova et al 2010) Fastuosaiacutena otra proteasa cisteiacutenica aislada
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
138
de frutos de Bromelia fastuosa resultoacute activa frente a CD44 en ceacutelulas de melanoma murino
(Guimaratildees-Ferreira et al 2007) En un modelo de melanoma murino la mezcla de
papaiacutena tripsina y quimotripsina redujo la expresioacuten de CD44 y CD45 en el tumor lo cual
fue correlacionado con la supresioacuten del melanoma y la metaacutestasis (Wald et al 2001) Por
tanto dado que las ceacutelulas HepG2 expresan CD44 en su superficie se podriacutea sugerir que
bromelina asiacute como tambieacuten Bh Bb y Pm podriacutean ejercer sus efectos a traveacutes de esta
proteiacutena ademaacutes de las integrinas
La disminucioacuten de la viabilidad celular de HepG2 observada para los preparados
proteoliacuteticos constituye un paso inicial hacia la buacutesqueda de los posibles mecanismos que la
estariacutean mediando Determinar si ha habido arresto celular induccioacuten de apoptosis asiacute
como cuaacuteles son las viacuteas de sentildealizacioacuten involucradas si bien no han sido objetivos de esta
tesis se muestran como prometedores temas para futuros estudios En este sentido existe
evidencia de la capacidad de bromelina para inducir activadores de la apoptosis (p53 y Bax)
en papiloma cutaacuteneo en ratoacuten asiacute como reducir la actividad de reguladores de la
supervivencia celular como Akt y Erk esta uacuteltima de forma contexto celular dependiente
(Chobotova et al 2010) en ceacutelulas de melanoma y carcinoma epideacutermico humano ha
promovido el arresto del ciclo celular en la fase G2M conducieacutendolas a apoptosis (Bhui et
al 2011)
En la Tabla 52 puede observarse que un aumento en 10 veces de la concentracioacuten
de bromelina produjo un cambio importante en el porcentaje de ceacutelulas viables (de 69 a
44) mientras el porcentaje de adhesioacuten permanece aproximadamente constante (20) lo
cual estariacutea indicando que la bromelina podriacutea afectar la viabilidad celular
independientemente de la alteracioacuten de la adhesioacuten celular Esto es diferente a lo observado
en ceacutelulas de glioblastoma humano donde una reduccioacuten en la adhesioacuten la migracioacuten y la
invasioacuten asociada con la reduccioacuten de la integrina α3β1 y el CD44 en la superficie celular no
fue acompantildeada por una disminucioacuten de la viabilidad (Tysnes et al 2001) La aparente
diferencia en el efecto de la bromelina sobre ceacutelulas tumorales humanas podriacutea reflejar una
especificidad de accioacuten lo cual podriacutea hacerla maacutes eficiente como tratamiento frente a
algunos tipos de caacutencer que de otros hecho que hace necesario el estudio sobre mayor
nuacutemero de liacuteneas celulares tumorales humanas (Chobotova et al 2010)
La bromelina no ha sido probada frente a ceacutelulas de HepG2 asiacute como tampoco Bh
Bb y Pm para los cuales estos resultados son los primeros en relacioacuten a la buacutesqueda de
posibles efectos antitumorales Si bien queda una serie de aspectos por investigar
(mecanismos de accioacuten efectos sobre el crecimiento tumoral y metaacutestasis capacidad
migratoria citotoxicidad etc) el presente trabajo constituye un indicio de los potenciales
efectos terapeacuteuticos de proteasas cisteiacutenicas frente al carcinoma hepatocelular
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
139
58 Conclusiones
Extractos ricos en cisteinendopeptidasas de Bromelia hieronymi (Bh) B balansae
(Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) mostraron efecto reductor de la viabilidad y
la adhesioacuten de ceacutelulas de carcinoma hepatocelular (HepG2)
Bh Bb y Pm tuvieron efectos similares en relacioacuten al contenido de unidades
caseinoliacuteticas siendo menores a los mostrados por bromelina
Bh Bb y Pm al igual que bromelina perdieron la accioacuten reductora de viabilidad y
adhesioacuten celular al inhibir la actividad de las cisteinendopeptidasas
Nuevos estudios son necesarios para profundizar el conocimiento de los
mecanismos involucrados en los efectos medidos asiacute como para encontrar otras
acciones que resulten beneficiosas para la terapia de CHC
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
140
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6 CONCLUSIONES FINALES Y PERSPECTIVAS
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
142
El objetivo general del presente trabajo de tesis doctoral fue estudiar la posible
aplicacioacuten farmacoloacutegica de extractos de tres especies vegetales pertenecientes a la familia
Bromeliaceae Bromelia hieronymi Mez Bromelia balansae Mez y Pseudananas
macrodontes (Morr) Harms autoacutectonas del aacuterea que abarca el NEA y NOA Paraguay
Brasil Bolivia y Colombia Las tres especies habiacutean sido previamente estudiadas en el
LIProVe desde el punto de vista bioquiacutemico habieacutendose aislado y caracterizado diversas
endopeptidasas cisteiacutenicas a partir de sus frutos
A excepcioacuten del uso en medicina popular de B balansae para calmar la tos no
existen referencias sobre aplicaciones medicinales de las especies mencionadas Sin
embargo es abundante la informacioacuten sobre las propiedades antiinflamatorias
antitromboacuteticas inmunomoduladoras y antitumorales de la bromelina un extracto acuoso
obtenido a partir del ananaacute [Ananas comosus (L) Merr] especie tambieacuten perteneciente a la
familia Bromeliaceae y rica en endopeptidasas cisteiacutenicas a las que se atribuyen las
actividades farmacoloacutegicas citadas Por este motivo se decidioacute estudiar los efectos
antiinflamatorios antitumorales anticoagulantes fibrinoliacuteticos y fibrinogenoliacuteticos de
extractos acuosos parcialmente purificados por precipitacioacuten etanoacutelica obtenidos a partir de
frutos de B hieronymi (Bh) B balansae (Bb) y P macrodontes (Pm) en relacioacuten a la
actividad proteoliacutetica de los mismos
En base a los estudios realizados se ha arribado a las siguientes conclusiones
Bh Bb y Pm mostraron efecto antiinflamatorio en modelos animales de
inflamacioacuten aguda al ser administradas intraperitonealmente
En el modelo de inflamacioacuten aguda ensayado (edema de pata de rata inducida por
carragenina) dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica (asymp30 UCaskg) de Bh Pm y
bromelina mostraron efectos antiinflamatorios significativamente similares a 10 mgkg de
indometacina El efecto antiinflamatorio medido para Bb fue menor y en algunos ensayos fue
acompantildeado de signos de toxicidad
El efecto antiinflamatorio medido en este modelo fue dependiente de la actividad
caseinoliacutetica (UCas) de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb y bromelina mientras que soacutelo
parcialmente de las de Pm quedando por determinar si la actividad fibrinoliacutetica de Pm es
causal del efecto antiinflamatorio medido para 0 UCaskg de Pm
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
143
Los efectos antiinflamatorios de Bh Bb Pm y bromelina alcanzaron los maacuteximos
valores entre las 5 y las 7 h de inducido el estiacutemulo inflamatorio tiempos en que se alcanza
el maacuteximo valor de inflamacioacuten Teniendo en cuenta los mediadores involucrados en dicha
fase del modelo seriacutea posible que las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb y Pm ejercieran su
accioacuten sobre la COXPGs la NOSNO y la infiltracioacutenactividad de los neutroacutefilos para cuya
confirmacioacuten deberiacutean orientarse futuras investigaciones sobre el mecanismo de accioacuten de
las mismas en los efectos antiinflamatorios observados
Si bien en una magnitud menor dosis de asymp30 UCaskg de Bh Pm y bromelina
tambieacuten fueron efectivas como antiinflamatorios en el modelo de edema de pata de rata
inducido por serotonina no mostrando efecto significativo sobre el edema inducido por
histamina
Mediante el modelo de inflamacioacuten croacutenica en ratas test del granuloma inducido
por pellet de algodoacuten se observoacute un significativo efecto antiinflamatorio de Pm y
bromelina al ser administradas intraperitonealmente mientras que para Bh y Bb
no se obtuvieron resultados concluyentes
Dado que una dosis de asymp10 UCaskg de Pm mostroacute un efecto antiinflamatorio
equivalente al de una dosis de asymp30 UCaskg de bromelina y que ambos efectos fueron
dependientes de la actividad proteoliacutetica (UCas) las proteasas cisteiacutenicas de Pm mostrariacutean
una mayor especificidad que las de bromelina frente a los efectores proinflamatorios
Si bien los efectos antiinflamatorios de Pm y bromelina fueron significativamente
menores o similares al de dexametasona (3 mgkg) a las dosis ensayadas no mostraron
efectos adversos tiacutepicos de glucocorticoides tales como la peacuterdida de masa corporal y
reduccioacuten del peso del bazo causando significativa reduccioacuten del peso del timo pero entre 3
y 4 veces menos que la dexametasona (3 mgkg)
Los efectos antiinflamatorios medidos para dosis de asymp30 UCaskg de Bh y de Bb no
fueron reproducibles en posteriores ensayos
La accioacuten antiinflamatoria medida en el modelo del granuloma para todos los
preparados proteoliacuteticos fue acompantildeada de un significativo y leve efecto reductor del peso
del timo el cual a su vez fue dependiente de la actividad proteoliacutetica de las proteasas
cisteiacutenicas de Pm y bromelina Dilucidar si este hecho es indicativo de un mecanismo
subyacente de la accioacuten antiinflamatoria o es un efecto independiente de los preparados
proteoliacuteticos podriacutea ser objeto de futuras investigaciones
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
144
Bh Bb y Pm actuaron como anticoagulantes fibrinogenoliacuteticas y fibrinoliacuteticas
Bh Bb y Pm prolongaron los tiempos de protrombina (TP) y de tromboplastina parcial
activada (TTPa) de plasma humano en ensayos in vitro ademaacutes de alterar la consistencia
de los coaacutegulos formados respecto de un plasma no tratado con los preparados Ambos
efectos fueron totalmente dependientes de la actividad proteoliacutetica de las proteasas
cisteiacutenicas excepto los efectos de Bb sobre el TP y el TTPa y de Pm sobre el TTPa los
cuales dependieron parcialmente de las cisteiacutenendopeptidasas sugiriendo la presencia de
otros componentes anticoagulantes
El hecho de que una actividad proteoliacutetica (UCas) equivalente de bromelina Bh Bb y
Pm no produjera efectos anticoagulantes equivalentes da cuenta de las diferentes
especificidades con las que actuariacutea cada preparado sobre los distintos elementos del
sistema de coagulacioacuten
En los ensayos In vivo si bien dosis con equivalente actividad proteoliacutetica (65
UCaskg) de todos los preparados administrados intraperitonealmente prolongaron el TP y el
TTPa soacutelo Bb prolongoacute levemente el TP en forma estadiacutesticamente significativa mostrando
un valor de TP significativamente similar al de la bromelina
El efecto sobre el fibrinoacutegeno fue equivalente cuali y cuantitativamente para
equivalentes actividades caseinoliacuteticas (UCas) de Bh Bb Pm y bromelina siendo la
subunidad Aα del fibrinoacutegeno la maacutes susceptible de ser clivada lo cual podriacutea explicar la
alteracioacuten de la consistencia del coaacutegulo observada en los ensayos de medida de TP y
TTPa
Como agentes fibrinoliacuteticos Bh Bb y Pm tuvieron un comportamiento similar y
significativamente diferente al de bromelina la cual a su vez mostroacute un comportamiento
significativamente similar a la plasmina A equivalentes valores de actividad caseinoliacutetica
(UCas) la bromelina mostroacute mayor especificidad que Bh Bb y Pm frente a la fibrina
respecto a los componentes de la cascada de la coagulacioacuten
Los efectos fibrinogenoliacutetico anticoagulante y fibrinoliacutetico medidos para Bh Bb y Pm
los ubica como potenciales agentes antitromboacuteticos o tromboliacuteticos lo cual deberaacute ser
evaluado en modelos de trombosis Las relaciones establecidas entre dichos efectos y el
contenido proteoliacutetico de los preparados podraacuten ser de utilidad al momento de establecer
dosis asiacute como interpretar resultados en futuros ensayos de trombosis
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
145
En relacioacuten a la accioacuten antiinflamatoria la actividad fibrinoliacutetica de Bh Bb y Pm
puede contribuir al mecanismo de accioacuten anti-edema evaluado in vivo hecho que ya ha sido
corroborado para bromelina en tanto que para Bh Bb y Pm ello queda supeditado a futuras
investigaciones dirigidas a dilucidar los mecanismos subyacentes a los efectos
antiinflamatorios medidos
Bh Bb Pm y bromelina disminuyeron significativamente la viabilidad y la
adhesioacuten de ceacutelulas de carcinoma hepatocelular (HepG2)
Los efectos sobre la viabilidad y la adhesioacuten dependieron de la actividad proteoliacutetica
de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina siendo las proteasas de bromelina
las maacutes especiacuteficas en relacioacuten a las de Bh Bb y Pm
Estos resultados abren camino a futuros ensayos dirigidos no soacutelo a estudiar los
mecanismos de accioacuten a traveacutes de los cuales Bh Bb Pm y bromelina afectariacutean las ceacutelulas
de HepG2 sino tambieacuten para evaluar los efectos sobre otros modelos maacutes complejos
Los efectos antiinflamatorios asiacute como anticoagulantes y fibrinoliacuteticos de Bh Bb y Pm
constituyen cualidades con potenciales efectos terapeacuteuticos en el tratamiento sisteacutemico del
caacutencer delineando otra posible liacutenea de investigacioacuten futura
En siacutentesis el presente trabajo ha pretendido aportar informacioacuten novedosa acerca
de la posible importancia farmacoloacutegica de principios activos en este caso proteasas de tipo
cisteiacutenico presentes en plantas que crecen en nuestro paiacutes y que podriacutean enriquecer el no
demasiado extenso acervo de fitofaacutermacos en uso en este momento Por tratarse de
resultados preliminares seraacute necesario en caso de resultar de intereacutes la realizacioacuten de
estudios posteriores y de mayor complejidad que confirmen el potencial farmacoloacutegico de los
preparados estudiados en el marco de la seguridad en cuanto a los riesgos toxicoloacutegicos
que pueda presentar el uso de los mismos
Agradecimientos
A la Facultad de Ciencias Exactas de La Universidad Nacional de La Plata por haberme permitido
realizar mis estudios de grado y posgrado
Al Consejo Nacional de Investigaciones Cientiacuteficas y Teacutecnicas por brindarme las becas para la
realizacioacuten del presente Trabajo de Tesis
Al LIProVe y en especial al Dr Neacutestor O Caffini por ofrecerme el Lugar de Trabajo por su
predisposicioacuten para ayudarme y enorme paciencia para ensentildear
A la Secretariacutea de Poliacuteticas Universitarias del Ministerio de Educacioacuten de La Nacioacuten que a traveacutes del
Programa Inter-U me brindoacute los medios econoacutemicos para los viajes a San Luis donde realiceacute parte
del trabajo experimental aquiacute presentado
A Veroacutenica Laacutezaro quien actuoacute eficientemente en la gestioacuten del Programa Inter-U dentro de La
Facultad de Ciencias Exactas de La Universidad Nacional de La Plata
A la Dra Alejandra E Rotelli mi codirectora de beca por la ensentildeanza y direccioacuten de los ensayos con
modelos animales asiacute como por la colaboracioacuten en la realizacioacuten de los mismos en la Facultad de
Quiacutemica Bioquiacutemica y Farmacia de la Universidad Nacional de San Luis
A la Dra Mariacutea Fernanda Troncoso por la ensentildeanza y colaboracioacuten en la realizacioacuten de los ensayos
con ceacutelulas tumorales en el IQUIFIB Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica de la Universidad de Buenos
Aires y por la correccioacuten del capiacutetulo ldquoEfecto antitumoralrdquo
A la Bioq Mariana Marta Gonzalez de la Caacutetedra de Hematologiacutea de la Facultad de Ciencias Exactas
de la Universidad Nacional de La Plata por la ensentildeanza y colaboracioacuten en los ensayos de
coagulacioacuten y en la obtencioacuten de los pooles de plasma
A la Bioq Anabela Prospitti por la colaboracioacuten en la obtencioacuten de los pooles de plasma
A los Dres Mariana Gomez y Pastor Arenas quienes muy amablemente nos proporcionaron material
bibliograacutefico en relacioacuten a los usos de las bromeliaacuteceas en nuestro paiacutes
A los Dres Mariela Bruno y Marcelo Pardo quienes me ensentildearon los primeros pasos en las teacutecnicas y
metodologiacuteas para el estudio de las proteasas vegetales
En el plano afectivo
A M Fernanda Troncoso por toda su predisposicioacuten y calidez humana
A Mariana y Susana por la buena onda y el compantildeerismo durante las mantildeanas en el laboratorio de
Hematologiacutea
A los integrantes de la Caacutetedra de Farmacologiacutea de la Facultad de Quiacutemica Bioquiacutemica y Farmacia de
la Universidad Nacional de San Luis en especial a Graciela Ameacuterico Alejandra Lily Susana
Mariano y muy especialmente a Ale por la calidez humana el buen humor los brindis y las cenas los
paseos por el surrealismo puntano y los mates frente al arroyo
A los integrantes (algunos ex) del LIProVe en especial a Cacho (Caffini) Ana (Prospitti) Jose (Torres)
Ine (Martin) Martiacuten (Lazza) Euge (Tavarone) Suacute (Morcelle del Valle) Celes (Branda) Franco
(Bernabei) Claudia (Natalucci) y Laura (Lopez) por los tiempos compartidos el ldquosoporterdquo en
momentos difiacuteciles el buen humor y el compantildeerismo Gracias por la paciencia Cacho
A Meli Ana y Guille por simplemente COMPARTIR
A mis viejos mis hermanos a Alfon y Ernes por lo que aprendiacute y volviacute a aprender por las risas y los
abrazos
A Leo por el aguante (PArsquo CIENCIA) los horizontes (se hicieron anchos) y la certeza de que las
palabras no me alcanzaraacuten
Algunos de los resultados presentados en esta Tesis Doctoral han sido objeto de las
siguientes publicaciones yo comunicaciones en reuniones cientiacuteficas
Publicaciones
Errasti M E Caffini N O Pelzer L E amp Rotelli A E (2013) ldquoAnti-inflammatory
Activity of Bromelia hieronymi Comparison with Bromelainrdquo Planta Medica 79 207-
213
Mariacutea E Errasti Neacutestor O Caffini Lilian E Pelzer and Alejandra E Rotelli (2013)
ldquoEvaluation of anti-inflammatory activity of Pseudananas macrodontes (Morr) Harms
fruit extract (Bromeliaceae) in ratsrdquo Zeitschrift fuumlr Naturforschung C (aceptado y en
proceso de revisioacuten)
Comunicaciones en reuniones cientiacuteficas
Errasti ME Bruno MA Rotelli AE Caffini NO Pelzer LE ldquoAntiinflammatory
activity of a partially purified extract from Bromelia hieronymi fruitsrdquo XLI Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Rosario
Santa Fe Argentina 24 al 26 de Noviembre de 2009
Errasti ME Caffini NO Rotelli AE Pelzer L ldquoAccioacuten antiinflamatoria de un
extracto de frutos de Bromelia hieronymi en un modelo de inflamacioacuten croacutenica en
ratasrdquo XLII Reunioacuten Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental
(SAFE) Mar del Plata Buenos Aires Argentina 17 al 20 de Noviembre de 2010
Errasti ME Rotelli AE Gonzaacutelez MM ldquoEvaluacioacuten in vitro de la accioacuten fibrinoliacutetica
y sobre la coagulacioacuten sanguiacutenea de extractos de Bromeliaceasrdquo XLIII Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Tucumaacuten
Argentina 2 al 4 de Noviembre de 2011
Errasti ME Caffini NO Rotelli AE Pelzer L ldquoExtractos de Pseudananas
macrodontes y Bromelia balansae con accioacuten antiinflamatoria en un modelo de
inflamacioacuten croacutenica en ratasrdquo XLIII Reunioacuten Anual de la Sociedad Argentina de
Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Tucumaacuten Argentina 2 al 4 de Noviembre de
2011
Errasti ME Caffini NO Pelzer LE Rotelli AE ldquoRelacioacuten entre efecto
antiinflamatorio y accioacuten proteoliacutetica de extractos de Bromeliaceasrdquo XLIV Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Mendoza
Argentina 31 de Octubre al 2 de Noviembre de 2012
Errasti ME Caffini NO Troncoso MF ldquoAccioacuten de extractos de Bromeliaceas sobre
la adhesioacuten y viabilidad de ceacutelulas de carcinoma hepatocelularrdquo XLIV Reunioacuten Anual
de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Mendoza
Argentina 31 de Octubre al 2 de Noviembre de 2012
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
ii
211 Bromelia hieronymi Mez 28
2111 Extracto parcialmente purificado de frutos de B hieronymi (Bh) 28
212 Bromelia balansae Mez 28
2121 Extracto parcialmente purificado de frutos de B balansae (Bb) 29
213 Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [=P sagenarius (Arruda) Camargo]29
2131 Extracto parcialmente purificado de frutos de P macrodontes (Pm) 29
214 Ananas comosus (L) Merr 30
215 Reactivos quiacutemicos 30
22 Caracterizacioacuten proteoliacutetica de los extractos parcialmente purificados (Bh Bb y Pm) y de bromelina 30
221 Teacutecnicas y metodologiacutea 30
2211 Dosaje de la actividad caseinoliacutetica 30
2212 Cuantificacioacuten del contenido proteico 31
2213 Isoelectroenfoque 31
2214 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 32
2215 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina 33
22151 Tratamiento con E-64 33
222 Resultados 33
2221 Perfiles de pI y de peso molecular de Bh Bb y Pm 33
2222 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina 35
23 Referencias 38
3 Efecto antiinflamatorio
31 Inflamacioacuten 39
311 Inflamacioacuten aguda 39
3111 Respuesta vascular 39
3112 Respuesta celular 40
3113 Mediadores quiacutemicos 40
312 Regulacioacuten y resolucioacuten de la inflamacioacuten 43
313 Inflamacioacuten croacutenica 44
314 Proteasas como antiinflamatorios 45
3141 Bromelina 46
31411 Efecto sobre los componentes de la coagulacioacuten 47
31412 Efecto sobre el sistema de calicreiacutenas 47
31413 Efecto sobre la viacutea de la COX y NOS 47
31414 Modulacioacuten de moleacuteculas de superficie celular 47
31415 Activacioacuten celular y produccioacuten de citoquinas 48
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
iii
32 Objetivos 49
33 Materiales y meacutetodos 50
331 Modelos de inflamacioacuten 50
3311 Modelos de inflamacioacuten aguda Edema de pata de rata 50
33111 Edema de pata inducido por carragenina 50
331111 Procedimiento experimental 51
33112 Edema de pata inducido por histamina 51
331121 Procedimiento experimental 51
33113 Edema de pata inducido por serotonina 52
331131 Procedimiento experimental 52
33114 Equipamiento medidas y caacutelculo del volumen de edema 52
3312 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma 53
331 21 Procedimiento experimental 53
3313 Caacutelculo del efecto antiinflamatorio y anaacutelisis estadiacutestico 53
332 Animales 54
333 Dosis 54
334 Material vegetal ensayado 54
34 Resultados y Discusioacuten 56
341 Modelos de inflamacioacuten aguda 56
3411 Edema de pata de rata inducido por carragenina 56
34111 Bromelia hieronymi 56
341111 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina 57
34112 Pseudananas macrodontes 59
341121 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm 60
34113 Bromelia balansae 61
341131 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb 61
3412 Otros modelos de inflamacioacuten aguda 63
34121 Edema de pata inducido por histamina en ratas 63
34122 Edema de pata inducido por serotonina en ratas 64
341221 Bromelia hieronymi 64
341222 Pseudananas macrodontes 65
342 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma 65
3421 Bromelia hieronymi 65
34211 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina
en el test del granuloma 67
3422 Pseudananas macrodontes y Bromelia balansae 69
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
iv
34221 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb en el
test del granuloma 70
34222 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm en el
test del granuloma 71
3423 Posible relacioacuten entre la actividad proteoliacutetica-accioacuten antiinflamatoria-
modulacioacuten sobre poblacioacuten linfocitaria T 74
35 Conclusiones 77
36 Referencias 78
4 Efecto anticoagulante fibrinogenoliacutetico y fibrinoliacutetico
41 Hemostasia 82
411 Vasoconstriccioacuten 82
412 Formacioacuten del trombo plaquetario 82
413 Coagulacioacuten 83
4131 Fase inicial 85
4132 Fase de amplificacioacuten 86
4133 Fase de propagacioacuten 86
4134 Formacioacuten de fibrina 87
4135 Regulacioacuten de la coagulacioacuten 89
414 Fibrinoacutelisis 90
42 Trombosis 91
421 Agentes para el tratamiento de la trombosis 93
4211 Proteasas vegetales como antitromboacuteticos 94
43 Objetivos 95
44 Materiales y meacutetodos 95
441 Efecto anticoagulante 95
4411 Ensayos in vitro 95
44111 Pool de plasma pobre en plaquetas 95
44112 Tiempo de protrombina (TP) 96
44113 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 97
44114 Efecto de la inhibicioacuten de la actividad proteoliacutetica sobre la
accioacuten anticoagulante 98
44115 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados 98
4412 Ensayos in vivo 98
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
v
44121 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados 99
442 Efecto fibrinogenoliacutetico 100
4421 Hidrolizados 100
4422 Tricina-SDS-PAGE 101
443 Efecto fibrinoliacutetico 102
4431 Placa de fibrina 102
4432 Caacutelculos y anaacutelisis de resultados 103
444 Material vegetal 104
45 Resultados y discusioacuten 105
451 Efecto anticoagulante 105
4511 Ensayos in vitro 105
45111 Tiempo de Protrombina (TP) 106
45112 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 108
45113 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de los preparados
proteoliacuteticos sobre su efecto anticoagulante 112
4512 Ensayos in vivo 114
452 Efecto fibrinogenoliacutetico 116
453 Efecto fibrinoliacutetico 119
46 Conclusiones 122
47 Referencias 123
5 Efecto antitumoral
51 Las causas de la aparicioacuten del caacutencer 125
52 Epidemiologiacutea del caacutencer 126
53 Carcinoma Hepatocelular 128
531 Factores de riesgo 128
532 Patogeacutenesis molecular 129
533 Tratamiento 129
54 Terapia enzimaacutetica sisteacutemica en pacientes con caacutencer 130
55 Objetivos 130
56Materiales y meacutetodos 131
561 Cultivo celular 131
562 Tratamientos 131
5621Evaluacioacuten de la viabilidad celular (Ensayo con MTS) 131
5622 Ensayo de adhesioacuten celular (Tincioacuten con cristal violeta) 132
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
vi
563 Anaacutelisis estadiacutestico 132
564 Material vegetal ensayado 132
57 Resultados y discusioacuten 133
571 Ensayo de viabilidad 133
572 Ensayos de adhesioacuten 133
573 Efecto de la actividad proteoliacutetica sobre los porcentajes de viabilidad
y de adhesioacuten celular 135
58 Conclusiones 139
59 Referencias 140
6 Conclusiones finales y perspectivas 142
Agradecimientos 146
1 INTRODUCCIOacuteN GENERAL Y OBJETIVOS
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
1
11 Productos Naturales Medicina Tradicional y Fitomedicinas
Los productos naturales en especial los de origen vegetal han sido una importante
fuente de agentes terapeacuteuticos Los medicamentos derivados de productos naturales
representan alrededor de un 25-30 de los agentes terapeacuteuticos actuales Si bien en las
uacuteltimas deacutecadas debido al avance de la quiacutemica combinatoria la investigacioacuten sobre
productos naturales en la industria farmaceacuteutica ha mostrado una desaceleracioacuten para
algunas enfermedades complejas los productos naturales todaviacutea constituyen una fuente
muy valiosa para la produccioacuten de nuevas entidades quiacutemicas ya que representan
estructuras seleccionados por mecanismos evolutivos durante millones de antildeos (Calixto
2005)
Los ldquoFitomedicamentosrdquo o ldquoFitomedicinasrdquo constituyen una categoriacutea especial de
drogas vegetales Una de las criacuteticas tradicionalmente formuladas a la Medicina Natural o
Medicina Tradicional es la falta de normalizacioacuten o estandarizacioacuten de los materiales
bioloacutegicos pero las fitomedicinas difieren de las asiacute llamadas ldquoplantas medicinalesrdquo en que
estaacuten normalizadas o estandarizadas lo que significa que ciertos compuestos que estaacuten
presentes en el material vegetal se han cuantificado y dilucidado con lo que en principio se
cuenta con un producto final de composicioacuten maacutes o menos constante (Israelsen 1993) en la
medida en que se respeten la eacutepoca y el lugar de recoleccioacuten (Bennett et al 1990)
En contraste con los millones de doacutelares y antildeos de investigacioacuten necesarios para
desarrollar un nuevo medicamento por siacutentesis o incluso desde el prototipo de una fuente
natural el desarrollo de fitofaacutermacos estandarizados exige menos presupuesto y parece ser
perfectamente factible en los paiacuteses en desarrollo Esta aacuterea estaacute recibiendo mucha
atencioacuten en Brasil y en la mayoriacutea de los paiacuteses de Ameacuterica Latina Por otra parte la
comercializacioacuten de las fitomedicinas se ha expandido en todo el mundo durante los uacuteltimos
antildeos especialmente en paiacuteses de Europa como Alemania Francia Italia Reino Unido
Espantildea y maacutes recientemente tambieacuten en los Estados Unidos de Ameacuterica (Calixto 2005)
El intereacutes por las plantas medicinales y las fitomedicinas adopta diferentes
caracteriacutesticas en las diferentes partes del mundo De acuerdo a la Organizacioacuten Mundial de
la Salud aproximadamente el 65-80 de la poblacioacuten de los paiacuteses en desarrollo como
consecuencia de la pobreza y de la imposibilidad de acceso a la medicina moderna
dependen esencialmente de las plantas para la Atencioacuten Primaria de la Salud (Calixto
2005) En todo el continente africano alrededor del 80 de sus habitantes utilizan
fitomedicinas especialmente en el tratamiento de enfermedades que resultan prevalentes
en la zona tales como el VIHSIDA el paludismo la anemia falciforme o drepanociacutetica la
diabetes y la hipertensioacuten Los defensores de las fitomedicinas argumentan que son maacutes
beneficiosas que sus equivalentes sinteacuteticos por ser seguras econoacutemicas aceptables
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
2
culturalmente y adecuadas para tratamientos croacutenicos sugiriendo que su uso deberiacutea
integrarse a la agenda de Salud de dichos paiacuteses (Okigbo amp Mmeka 2006)
La produccioacuten de plantas medicinales y aromaacuteticas tiene una larga tradicioacuten en varios
paiacuteses de Europa tales como el Reino Unido Italia Grecia Alemania Austria y Francia
mientras que en Finlandia Irlanda y Holanda se ha establecido a lo largo de las uacuteltimas
deacutecadas (Verlet amp Leclercq 1998) Desde la deacutecada del 90 se ha producido un
resurgimiento en el intereacutes y el uso de productos de plantas medicinales en Ameacuterica del
Norte y Europa Estudios sobre el uso de plantas medicinales por el puacuteblico norteamericano
han mostrado un aumento en el consumo de casi el 3 de la poblacioacuten en 1991 a maacutes del
37 en 1998 Un factor importante que sin duda contribuyoacute a dicho incremento fue la
promulgacioacuten en ese paiacutes de la legislacioacuten federal de 1994 (Dietary Supplement Health and
Education Act) que facilitoacute la produccioacuten y comercializacioacuten de productos fitomedicinales y
el consiguiente ingreso de varias compantildeiacuteas farmaceacuteuticas importantes en la produccioacuten de
fitomedicinas (Brevoort 1998) En los paiacuteses desarrollados se ha venido dando un aumento
en el uso de la medicina complementaria y alternativa dentro de la cual se incluyen las
fitomedicinas Esto podriacutea deberse ademaacutes de a la tradicioacuten al bajo costo y a una
preocupacioacuten creciente por los efectos adversos de los faacutermacos sinteacuteticos Por otro lado la
esperanza de vida maacutes larga en dichos paiacuteses ha dado como resultado un aumento de los
riesgos de desarrollar enfermedades croacutenicas y debilitantes (las enfermedades coronarias
el caacutencer y la diabetes) y para muchos pacientes la medicina alternativa parece ofrecer
medios menos agresivos para el tramiento de dichas enfermedades que la medicina
alopaacutetica (OMS 2002)
Las Farmacopeas de diversos paiacuteses han recogido en sus monografiacuteas algunas de
las plantas medicinales de mayor difusioacuten La legislacioacuten europea sobre medicamentos
tambieacuten aborda el uso medicinal de los productos procedentes de las plantas El Comiteacute de
Medicamentos a Base de Plantas (HPMC) se constituyoacute en la Agencia Europea de
Medicamentos (EMA) para proporcionar monografiacuteas y entradas de la lista de sustancias y
sus preparados a base de hierbas Mientras tanto se han publicado aproximadamente 100
monografiacuteas donde se define el estaacutendar cientiacutefico y regulatorio vigente para asegurar la
eficacia y la seguridad de las sustancias vegetales y preparados vegetales utilizados en los
medicamentos (Knoumlss amp Chinou 2012)
La Farmacopea de los Estados Unidos de Ameacuterica (USP 32 ndash NF 27) contiene 76
monografiacuteas relacionadas con productos de origen vegetal Si bien existe una farmacopea
herbolaria bastante completa editada con el tiacutetulo de American Herbal Pharmacopoeia eacutesta
no tiene caraacutecter oficial La Farmacopea Mexicana (FEUM) por su parte registra 56
productos vegetales de aplicacioacuten en medicina En la actualidad ambas Farmacopeas
contienen un nuacutemero reducido de monografiacuteas de productos vegetales en comparacioacuten al
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
3
que registran sus homoacutelogas europeas En el caso del coacutedigo mexicano esta ausencia es
auacuten maacutes pronunciada y fue en el antildeo 2000 cuando se inicia un cambio con la publicacioacuten de
la Farmacopea Herbolaria la cual forma parte de la FEUM Esta publicacioacuten marca el inicio
del rescate del arsenal terapeacuteutico conocido y usado en Meacutexico desde siglos atraacutes (Schifter
Aceves et al 2009)
En cuanto a la Farmacopea Argentina en 2008 se renovoacute su Comisioacuten Permanente
quien ya ha producido la uacuteltima versioacuten de la misma (Farmacopea Argentina VIIIa Edicioacuten)
disponible en la paacutegina de la Administracioacuten Nacional de Alimentos Medicamentos y
Tecnologiacutea Meacutedica (ANMAT) en cuatro voluacutemenes1 el tercero de los cuales contiene un
ldquoApartado de Fitoteraacutepicosrdquo que incluye 29 monografiacuteas (ANMAT 2011)
La flora argentina se encuentra representada por maacutes de 8000 especies de plantas
superiores De ellas alrededor de 1600 son utilizadas por la poblacioacuten como ldquoremedio
caserordquo (Rondina et al 2010) en especial por parte de los sectores sociales de menor
acceso a los sistemas de salud
Un estudio sobre el nuacutemero de trabajos publicados entre 1984 y 2004 en revistas
cientiacuteficas indexadas con referato da cuenta del avance que ha tenido en los uacuteltimos antildeos la
investigacioacuten sobre productos naturales (especiacuteficamente plantas) en Ameacuterica Latina siendo
Brasil y luego Meacutexico Argentina y Chile los paiacuteses con mayor nuacutemero de publicaciones Los
estudios de domesticacioacuten produccioacuten biotecnologiacutea y de mejora geneacutetica de las plantas
medicinales son otros campos de la ciencia que se desprenden de tales avances en el uso
de plantas medicinales en Ameacuterica Latina (Calixto 2005)
Latinoameacuterica contiene gran parte de la biodiversidad de todo el mundo pero a pesar
de ello nuestros paiacuteses nunca han podido utilizarla en beneficio de su propio desarrollo
Peor auacuten como consecuencia de la explotacioacuten sin control la mayor parte de las aacutereas
relevantes en cuanto a biodiversidad se ha reducido sensiblemente antildeo tras antildeo mas allaacute
de los esfuerzos esporaacutedicos de algunos gobiernos por preservarla Inclusive el
conocimiento de la medicina tradicional tambieacuten estaacute desapareciendo especialmente el
derivado de las comunidades indiacutegenas originarias (Calixto 2005)
12 Generalidades de la Familia Bromeliaceae
La familia Bromeliaceae estaacute constituida por casi 3700 especies incluidas en 57
geacuteneros Tradicionalmente la familia ha sido subdividida en tres subfamilias Pitcairnioideae
Tillandsioideae y Bromelioideae La subfamilia Pitcairnioideae incluye a las bromeliaacuteceas
maacutes ancestrales y muchas de sus especies recuerdan a la familia de las gramiacuteneas
(Poaceae) de la cual evolucionaron La mayoriacutea son terrestres contando con un sistema
1 httpwwwanmatgovarwebanmatfnaoctava_edicionasp
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
4
extenso de raiacutez La subfamilia Tillandsioideae formada mayoritariamente por especies
epiacutefitas se ha adaptado para sobrevivir en condiciones muy secas las semillas tienen alas
lo que las hace susceptibles de ser dispersadas por el viento y apeacutendices plumosos que les
permite adherirse sobre superficies rugosas Bromelioideae es la subfamilia maacutes diversa
La mayoriacutea de sus especies tambieacuten son epiacutefitas aunque algunas se han adaptado a las
condiciones terrestres Estaacuten compuestas de un arreglo foliar espiralado denominado
ldquorosetardquo donde las bases foliares se superponen parcialmente y pueden funcionar como un
reservorio hiacutedrico Generalmente tienen hojas espinosas y sus semillas son a menudo
distribuidas por los paacutejaros y animales que consumen sus frutos carnosos (Bromeliad
Society International) Pero en base a recientes estudios geneacuteticos (Givnish et al 2011) los
geacuteneros de la subfamilia Pitcairnioideae han sido reagrupados en 6 subfamilias con lo que
la situacioacuten taxonoacutemica actual de las Bromeliaceae es la que se muestra en la Tabla 11
Subfamilia Geacutenero
Brocchinioideae Brocchinia
Lindmanioideae Connellia Lindmania
Hechtioideae Hechtia
Navioideae Brewcaria Cottendorfia Navia Sequencia Steyerbromelia
Pitcairnioideae Deuterocohnia Dyckia Encholirium Fosterella Pepinia Pitcairnia
Puyoideae Puya
Tillandsioideae
Alcantarea Catopsis Glomeropitcairnia Guzmania Mezobromelia
RacinaeaTillandsia Vriesea Werauhia
Bromelioideae
Acanthostachys Aechmea Ananas Androlepis Araeococcus Billbergia
Bromelia Canistropsis Canistrum Cryptanthus Deinacanthon Disteganthus
Edmundoa Eduandrea Fascicularia Fernseea Greigia Hohenbergia
Hohenbergiopsis Lymania Neoglaziovia Neoregelia Nidularium Ochagavia
Orthophytum Portea Pseudaechmea Pseudananas Quesnelia Ronnbergia
Ursulaea Wittrockia
Tabla 11 Subfamilias y geacuteneros de Bromeliaceae (Bromeliad Society International) Los geacuteneros incluidos en
esta subfamilia se encontraban originalmente dentro de las Pitcairnioideae
Las Bromeliaceae poseen un rango de haacutebitat muy amplio desde desiertos caacutelidos y
secos hasta bosques lluviosos y friacuteas regiones montantildeosas mostrando un rango de altitud
que va desde el nivel del mar hasta los 4700 metros La mayoriacutea se distribuye en
Sudameacuterica con el nuacutemero maacutes grande de especies halladas en Brasil se extienden desde
Chile y Argentina a traveacutes de Centroameacuterica y el Caribe alcanzando el liacutemite norte en los
alrededores de Virginia en el sudeste de los EEUU (Smith 1934) Una uacutenica especie
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
5
(Pitcairnia feliciana) ha sido encontrada en el oeste de Aacutefrica (Figura 11) A la Argentina
llegan 13 geacuteneros y alrededor de 120 especies (Flora del Conosur Cataacutelogo de las Plantas
Vasculares)
Figura 11 Distribucioacuten mundial de especies de Bromeliaceae lthttpcommonswikimediaorgwikiImage
WorldBromeliadDistributionjpggt
121 Importancia Usos
En la actualidad los usos ornamentales y comestibles son los maacutes difundidos dentro
de las Bromeliaceae siendo el ananaacute o pintildea (Ananas comosus L) el fruto maacutes ampliamente
consumido en el mundo El primer registro que se tiene data de 1493 cuando Cristobal
Coloacuten vio a los indiacutegenas cultivar la especie en las Antillas y a su regreso a Espantildea la
introduce en el ldquoViejo Mundordquo (Bromeliad Society International)
En Latinoameacuterica diversas especies de Bromeliaceae han sido de gran importancia
para el hombre desde tiempos ancestrales En las distintas regiones se les ha dado un uso
particular que puede ser enmarcado en las siguientes categoriacuteas ceremonial comestible
textil medicinal ornamental y combustible entre otros Un estudio reciente (Hornung-Leoni
2011) que incluye 78 especies de Bromeliaceae en 19 paiacuteses latinoamericanos demostroacute
que 33 de ellas son empleadas en Meacutexico Venezuela Peruacute y Bolivia para rituales y
ceremonias de las cuales el 73 corresponde a especies del geacutenero Tillandsia El uso
ornamental involucra 12 especies principalmente de los geacuteneros Tillandsia Aechmea y
Guzmania en Argentina Chile Venezuela y Meacutexico mientras que 2 especies de Puya son
usadas en Peruacute y Ecuador como combustibles Los usos comestibles medicinales y para la
extraccioacuten de fibras han sido registrados para 24 19 y 17 especies respectivamente a lo
largo de numerosos paiacuteses y seraacuten detallados a continuacioacuten
1211 Uso comestible
Ademaacutes de Ananas comosus Bromelia pinguin es una de las especies maacutes usadas
como comestible Se consumen sus frutos raiacuteces semillas y flores tanto directamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
6
como para la preparacioacuten de dulces refrescos postres y guisos Su uso estaacute extendido
desde Meacutexico y las Antillas hasta el norte de Sudameacuterica y Ecuador Hojas de especies de
Tillandsia y Puya son empleadas para envolver bollos tipo ldquotamalesrdquo en Venezuela
Colombia y norte de los Andes Sudamericanos asiacute como tambieacuten se consumen brotes de
otras especies de Tillandsia en Bolivia y Argentina Los frutos de B balansae se comen
asados en algunas zonas de Brasil (Hornung-Leoni 2011)
Distintos grupos eacutetnicos del Chaco paraguayo y argentino consumen frutos maduros
cocidos o crudos de Bromelia serra y B balansae siendo sus semillas tambieacuten empleadas
a partir de las cuales se obtiene un polvo que se consume directamente o bien se utiliza
para hacer sopa Las partes vegetativas de B serra B hieronymi y Dickya ferox tambieacuten
son consumidas Si bien las partes maacutes usadas son las vainas foliares joacutevenes y el eje
vertical de las rosetas basales (Suaacuterez amp Montani 2010) el consumo de los brotes joacutevenes
(ejes laterales) de B hieronymi es una nueva modalidad entre los nintildeos (Arenas 2004)
1212 Obtencioacuten de fibras
El empleo de las Bromeliaceae para la extraccioacuten de fibras es de gran importancia
para el desarrollo de numerosas comunidades a lo largo del continente Las fibras son
destinadas a la fabricacioacuten de varios productos tanto para uso propio de las comunidades
como para su comercializacioacuten2 Hamacas bolsas de mano redes para la pesca puntas de
flecha sillas de montar cesteriacutea sacos cordeleriacutea para adornar vestimentas sombreros
zapatos sandalias y cinturones objetos para uso ceremonial son algunos de los ejemplos
Diversas especies del geacutenero Aechmea son usadas por distintos indiacutegenas en
Meacutexico y Ecuador principalmente A magdalenae a partir de la cual se obtiene una fibra
(conocida como ldquoixtlerdquo o ldquofibra de pitardquo) de gran resistencia usada en la fabricacioacuten de
elementos para la pesca La fibra obtenida de varias especies de Ananas spp
caracterizada por su flexibilidad es empleada para tejidos hamacas y cestas en Venezuela
Tillandsia usneoides es utilizada para rellenar colchones y como material de empaque en
Ecuador En Chile de las hojas de Puya chilensis se obtiene una fibra resistente empleada
para las redes de pesca Fibras duras son extraidas de B pinguin en Meacutexico y Nicaragua
(Hornung-Leoni 2011)
Las fibras de Bromelia hieronymi Mez (conocida como chaacuteguar) son utilizadas por
indiacutegenas del Gran Chaco En cambio el uso textil de B balansae Mez y B serra Griseb no
es certero ya que aunque en la bibliografiacutea consta el empleo de sus fibras por parte de
vilelas y tobas orientales no ha sido registrado en trabajos de campo recientes La fibra maacutes
apreciada por distintas etnias chaquentildeas es la obtenida a partir de Deinacanthon
urbanianum Mez que debido a su durabilidad y resistencia es usada para la elaboracioacuten de
2 Productos elaborados con fibras de ldquobromeliaacuteceas textilesrdquo por la comunidad Wichi (Sastre et al 2013)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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objetos para la pesca Sin embargo su escasez ha llevado a su reemplazo por B hieronymi
Nativos de filiacioacuten guaraniacute en el Paraguay oriental asiacute como los makaacute asentados en las
inmediaciones del riacuteo Paraguay usan como textil las fibras obtenidas de Pseudananas
sagenarius mientras que su uso por parte de nativos del Chaco consta soacutelo en la literatura
(Arenas 1997)
A pesar del uso difundido de las ldquoBromeliaacuteceas textilesrdquo entre numerosas
comunidades son pocas las empleadas como materia prima para la industria En Argentina
a fines del siglo XIX se iniciaron estudios teacutecnicos a fin de evaluar el uso de las
Bromeliaceae con fines textiles Industrias extractoras de fibras fueron instalaacutendose en
Corrientes Chaco Formosa Santiago del Estero y Tucumaacuten pero tuvieron corta duracioacuten
Sin embargo con la Segunda Guerra Mundial y el consecuente desabastecimiento de yute
caacutentildeamo y lino textil se reiniciaron las tareas exploratorias impulsadas por el Estado (Res Nordm
949-46 del Ministerio de Agricultura) llegaacutendose a hacer estudios de cultivos en campos de
experimentacioacuten en distintas provincias del norte Como resultado de tales estudios se
concluyoacute que las Bromeliaceae factibles de uso textil en orden creciente de importancia
industrial son Pseudananas sagenarius Bromelia hieronymi B balansae B serra
Deinacanthon urbanianum Dyckia ferox y Aechmea distichantha adjudicaacutendoles potencial
para la elaboracioacuten de telas tipo batista cuerdas para pescar y telas de arpillera entre otros
Las dificultades con el mercado asiacute como las deficiencias teacutecnicas en la explotacioacuten y la
maquinaria de extraccioacuten no posibilitaron el desarrollo de esta industria en Argentina
(Arenas 1997) En Brasil sin embargo existen pequentildeas industrias textiles extractoras de
fibras de B laciniosa y Neoglaziovia variegata (Hornung-Leoni 2011)
1213 Usos medicinales
Diversas especies del geacutenero Hechtia tienen importancia medicinal en Meacutexico H
glomerata ha sido empleada contra el catarro y la bronquitis las hojas masticadas o
hervidas de H melanocarpa se usan para el tratamiento de la diabetes mientras que el teacute
obtenido de hojas de H podantha es usado como diureacutetico Puya gummifera es empleada
en Ecuador para dolencias de rintildeoacuten mientras que en Chile empleaban como emoliente y
astringente las secreciones de sus inflorescencias producto de las picaduras de las larvas
de mariposas Tambieacuten en Chile es usada P berteroniana como emoliente e infusiones de
tallos y hojas de P chilensis se emplean como antiinflamatorio y para aliviar fiebre y
diarreas Las raiacuteces de Pitcairnia pungens son utilizadas como diureacutetico en Ecuador
(Hornung-Leoni 2011) En Argentina personas pertenecientes a comunidades Wichiacute de
Salta han sentildealado que diversas especies de Tillandsia pueden ser utilizadas para aliviar el
dolor causado por dislocaciones o fracturas (Suaacuterez amp Montani 2010) Tillandsia dasyliriifolia
y T elongata han sido empleadas contra el catarro y la bronquitis en Meacutexico en tanto que T
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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aeranthos (el ldquoclavel del airerdquo) es usada como antiespasmoacutedico y para el tratamiento de
afecciones oculares en Sudameacuterica (Hornung-Leoni 2011)
Dentro de las especies del geacutenero Bromelia B pinguin es conocida por sus
propiedades medicinales en Centroameacuterica Cuba y en algunas regiones de Meacutexico Su fruto
es usado como antihelmiacutentico pero tambieacuten como diureacutetico y antirreumaacutetico Las hojas de
B karatas son utilizadas en algunas regiones de Meacutexico como antiinflamatorio (Hornung-
Leoni 2011) En Brasil los frutos de B balansae son usados por la medicina popular como
jarabe para la tos (Coelho 2010) y el jugo de los frutos de B fastuosa (gravataacute) para el
tratamiento de la bronquitis y el asma (Guimaraes-Ferreira et al 2007)
El uso medicinal de Ananas comosus trasciende a las comunidades latinoamericanas
asentadas en las regiones en las cuales es autoacutectona Desde los tiempos de la colonizacioacuten
la pulpa se empleaba por las comunidades aboriacutegenes para tratar parasitosis intestinales
accioacuten que fue sustentada por los meacutedicos europeos de la eacutepoca (Patintildeo 2002) Tambieacuten
ha sido utilizada como coadyuvante de la digestioacuten (Hornung-Leoni 2011)
El extracto obtenido a partir de A comosus conocido como bromelina o bromelaiacutena
es comercializado desde mediados de la deacutecada del acute50 y desde entonces se han publicado
numerosos trabajos cientiacuteficos en relacioacuten a sus propiedades terapeacuteuticas antiinflamatoria
antitromboacutetica fibrinoliacutetica antitumoral antimetastaacutesica inmunomodulador promotora de la
absorcioacuten de antibioacuteticos debridante de heridas y cicatrizante (Maurer 2001) La bromelina
ha sido usada como agente antiinflamatorio y antiedematoso en casos de artritis lesiones
deportivas traumatismos edema posquiruacutergico quemaduras y como complementario a la
quimioterapia (Bhui 2012) Actualmente la bromelina es un producto medicinal popular para
el tratamiento de la inflamacioacuten y trastornos digestivos (Hornung-Leoni 2011) Es de libre
venta en farmacias y tiendas naturistas principalmente de Estados Unidos de Ameacuterica y
paiacuteses de Europa como un producto meacutedico sin licencia (Brien et al 2004) La
Administracioacuten de Drogas y Alimentos de EEUU (Food and Drug Administration FDA)
considera a la bromelina dentro del subcapiacutetulo correspondiente a los alimentos para
consumo humano y en tal caraacutecter es categorizada como GRAS (Generally Recognized as
Safe) No hace referencia a su utilizacioacuten como medicamento (FDA 2012) Por su parte la
Agencia Europea de Medicinas (European Medicines Agency) ha aprobado muy
recientemente un producto conteniendo bromelina para su uso como debridante de las
escaras producidas como consecuencia de quemaduras (European Medicines Agency
2012)
Si bien los extractos obtenidos tanto a partir de tallos como de frutos de A comosus
son una mezcla compleja de fosfatasas glucosidasas peroxidasas celulasas inhibidores
glicoproteiacutenas y carbohidratos (todos poco caracterizados) los componentes responsables
de sus acciones antihelmiacutentica antiedematosa antiinflamatoria fibrinoliacutetica antitromboacutetica
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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antitumoral debridante de heridas asiacute como aceleradora de la cicatrizacioacuten de heridas
parecieran ser las proteasas cisteiacutenicas presentes en grandes cantidades (Maurer 2001
Salas et al 2008)
13 Tipos de Proteasas Distribucioacuten y Rol en los Vegetales
131 Proteasas Tipos y sistemas de clasificacioacuten
Se conoce como proteasas a las enzimas que catalizan la degradacioacuten de las
proteiacutenas (proteoacutelisis) mediante la adicioacuten de una moleacutecula de agua en los enlaces
peptiacutedicos Aunque el Comiteacute de Nomenclatura de la Unioacuten Internacional de Bioquiacutemica y
Biologiacutea Molecular3 (NC-IUBMB) ha recomendado usar el teacutermino peptidasa para referirse a
estas enzimas en trabajos recientes se siguen utilizando alternativamente las
denominaciones proteasa enzima proteoliacutetica o proteinasa por lo que en la presente tesis
usaremos estos teacuterminos indistintamente
Un sistema de nomenclatura y clasificacioacuten de proteasas es fundamental para el
manejo de la informacioacuten A pesar de que existe una gran variedad de proteasas distribuidas
en los siete reinos (Archaea Bacteria Protozoa Fungi Planta Animalia y Virus) que
cumplen roles fisioloacutegicos muy distintos la existencia de caracteriacutesticas comunes permitioacute
establecer sistemas de clasificacioacuten Estos se basan en los mecanismos cataliacuteticos las
regiones de la cadena polipeptiacutedica sobre las que actuacutean las relaciones evolutivas y la
homologiacutea de sus secuencias
Antes del establecimiento de un organismo reconocido internacionalmente que fijara
pautas de clasificacioacuten y nomenclatura para las enzimas Hartley (1960) propuso clasificar
las proteasas teniendo en cuenta su mecanismo cataliacutetico Este criterio dio lugar a cuatro
clases o tipos cataliacuteticos de peptidasas seriacutenicas cisteiacutenicas aspaacuterticas y
metalopeptidasas La denominacioacuten hace referencia al grupo quiacutemico del sitio cataliacutetico
responsable de la actividad enzimaacutetica serina cisteiacutena aacutecido aspaacutertico e ioacuten metaacutelico
(frecuentemente Zn2+ Mn2+ Co2+) respectivamente Maacutes recientemente fueron incorporados
otros dos tipos las peptidasas glutaacutemicas (Kakudo et al 1992) y treoniacutenicas (Barrett et al
1998)
No obstante estas diferencias los seis tipos cataliacuteticos se pueden agrupar en dos
categoriacuteas las que forman complejos covalentes entre la enzima y el sustrato (peptidasas
seriacutenicas cisteiacutenicas y treoniacutenicas) donde el nucleoacutefilo del sitio cataliacutetico es parte de un
aminoaacutecido (serina cisteiacutena o treonina respectivamente) y las que no forman complejos
enzima-sustrato covalentes (peptidasas aspaacuterticas glutaacutemicas y metalopeptidasas) siendo
responsable del ataque nucleofiacutelico una moleacutecula de agua activada
3 lthttpwwwchemqmulacukiubmbgt
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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1311 Sistema EC de clasificacioacuten de enzimas
En 1961 quedoacute establecido el sistema de clasificacioacuten y nomenclatura de enzimas de
la Comisioacuten Internacional de Enzimas (Enzyme Commission EC) actualmente NC-IUBMB
Basaacutendose en el tipo de reaccioacuten que catalizan la EC agrupoacute las enzimas en seis clases y
les asignoacute un coacutedigo numeacuterico Oxidorreductasas (1) Transferasas (2) Hidrolasas (3)
Liasas (4) Isomerasas (5) y Ligasas (6)
Dentro de la clase 3 (hidrolasas) se agrupan las enzimas que catalizan la reaccioacuten de
escisioacuten de un enlace mediante la adicioacuten de una moleacutecula de agua Los productos de esta
reaccioacuten son dos moleacuteculas a una de las cuales se ha unido el hidroacutegeno y a la otra el
hidroxilo provenientes ambos de la hidroacutelisis del agua
R1-R2 + H2O R1-OH + R2-H
Hidrolasa
Las enzimas de la clase 3 se subagrupan en funcioacuten del enlace quiacutemico sobre el que
actuacutean Asiacute si el enlace entre R1 y R2 es el grupo amida de la unioacuten peptiacutedica las hidrolasas
que catalizan tal reaccioacuten son peptidasas y pertenecen a la subclase 34 (EC 34) la que a
su vez se divide en catorce sub-subclases como se muestra en la Tabla 12
Sub-subclases Descripcioacuten Cantidad
Exopeptidasas
EC 3411 Aminopeptidasas 26 76
EC 3413 Dipeptidasas 11 32
EC 3414 Dindash y trindashpeptidil-peptidasas 8 23
EC 3415 Peptidil-dipeptidasas 4 12
EC 3416 Carboxipeptidasas Tipo Serina 4 12
EC 3417 Metalocarboxipeptidasas 20 58
EC 3418 Carboxipeptidasas Tipo Cisteiacutena 1 03
EC 3419 Omega peptidasas 11 32
Endopeptidasas
EC 3421 Endopeptidasas Seriacutenicas 98 285
EC 3422 Endopeptidasas Cisteiacutenicas 98 285
EC 3423 Endopeptidasas Aspaacuterticas 41 119
EC 3424 Metaloendopeptidasas 20 58
EC 3425 Endopeptidasas Treoniacutenicas 2 06
EC 3499 Endopeptidasas de mecanismo desconocido 0 0
Total 344 100
Tabla 12 Sub-subclases de peptidasas (34) seguacuten el sistema EC (Consultado 12112012)
Las peptidasas EC 3411 a EC 3419 son exopeptidasas mientras que las EC 3421
a EC 3425 y EC3499 son endopeptidasas Las exopeptidasas hidrolizan
secuencialmente uno o maacutes aminoaacutecidos desde los extremos carboxilo (carboxipeptidasas)
amino (aminopeptidasas) o extremos sustituidos ciclados o unidos por uniones
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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isopeptiacutedicas (omegapeptidasas) Las que atacan el N-terminal pueden liberar un uacutenico
residuo aminoaciacutedico (aminopeptidasas EC 3411) o un di- o tripeacuteptido (di- y tripeptidil-
peptidasas EC 3414) A su vez las que actuacutean sobre el C-terminal pueden liberar un uacutenico
amino aacutecido (carboxipeptidasas EC 3416-18) o un dipeacuteptido (peptidil-dipeptidasas EC
3415)
Las endopeptidasas hidrolizan las uniones peptiacutedicas internas de la proteiacutena y si
actuacutean sobre pequentildeos peacuteptidos se denominan geneacutericamente oligopeptidasas (Barrett
2001)
Como puede observarse la clasificacioacuten propuesta por Hartley quedoacute incorporada en
el sistema EC Las carboxipeptidasas se agrupan seguacuten el mecanismo cataliacutetico en
metalocarboxipeptidasas (EC 3417) seriacutencarboxipeptidasas (EC 3416) y
cisteiacutencarboxipeptidasas (EC 3418) mientras que las endopeptidasas se agrupan en
seriacutenicas (EC 3421) cisteiacutenicas (EC 3422) aspaacuterticas (EC 3423) treoniacutenicas (EC
3425) y metaloendopeptidasas (EC 3424)
1312 El sistema MEROPS de clasificacioacuten de peptidasas
Desde mediados del siglo XX a la actualidad la Biologiacutea Molecular (BM) ha aportado
conocimientos no soacutelo referentes a los mecanismos de accioacuten de las enzimas sino tambieacuten
a sus estructuras La posibilidad de conocer las secuencias de aminoaacutecidos de las
proteiacutenas asiacute como su conformacioacuten espacial permitioacute establecer nuevos criterios de
clasificacioacuten de las enzimas que a su vez a la luz del Dogma Central de la BM refleja las
relaciones evolutivas entre ellas
Asiacute Rawlings y Barrett (1993) haciendo uso del gran nuacutemero de secuencias
aminoaciacutedicas de las que disponiacutean dieron a conocer un nuevo sistema de clasificacioacuten de
peptidasas basado en las similitudes estructurales de las proteiacutenas Seguacuten el grado de
homologiacutea las peptidasas fueron agrupadas en familias y eacutestas a su vez en clanes Para
1996 este sistema habiacutea dado lugar a la base de datos MEROPS4 Los tres niveles de
clasificacioacuten se definen a continuacioacuten
Clan Es un conjunto de familias cuyas peptidasas tienen un origen evolutivo comuacuten
que si bien no llega a evidenciarse por comparacioacuten de sus secuencias de aminoaacutecidos siacute
por las similitudes de sus estructuras terciarias Se construye por comparacioacuten de las
estructuras terciarias y cuando no estaacuten disponibles se comparan los ordenamientos de
aminoaacutecidos cataliacuteticos en la cadena polipeptiacutedica o las secuencias aminoaciacutedicas alrededor
de los aminoaacutecidos cataliacuteticos
Familia Se construye por comparacioacuten de la estructura primaria Estaacute constituida por
peptidasas cuyas secuencia de aminoaacutecidos que debe incluir la secuencia de la ldquounidad
4 lthttpmeropssangeracukgt
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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peptidasardquo (regioacuten de la proteiacutena responsable de la actividad cataliacutetica) presentan similitudes
estadiacutesticamente significativas
Peptidasa Cada proteiacutena con actividad peptidasa recibe un nombre y un
identificador (ID MEROPS) Se diferencian por su estructura funcioacuten bioloacutegica sustrato
mecanismo cataliacutetico y origen geneacutetico
Dentro de algunas familias se han detectado dos o maacutes grupos de peptidasas con
suficientes diferencias como para constituir una subfamilia Del mismo modo algunos clanes
han sido divididos en subclanes que contienen familias que evidencian una muy antigua
divergencia
El sistema MEROPS tambieacuten tuvo en cuenta la clasificacioacuten de Hartley ya que en la
asignacioacuten de los identificadores a las familias clanes y peptidasas se usaron letras que
hacen referencia al tipo cataliacutetico de las peptidasas que las integran S (seriacutenicas) C
(cisteiacutenicas) T (treoniacutenicas) A (aspaacuterticas) G (glutaacutemicas) M (metalopeptidasas) N
(asparagiacutenicas) y U (mecanismo desconocido)
La letra P es utilizada para identificar clanes que contienen familias de peptidasas de
maacutes de un tipo cataliacutetico El identificador de un clan se completa con una segunda letra
mayuacutescula asignada secuencialmente (por ejemplo clan CA) y el identificador para una
familia es completado con un nuacutemero (por ejemplo C1 la familia de la papaiacutena) El
identificador MEROPS para cada peptidasa individual comienza con el identificador de
familia y se completa con un nuacutemero decimal (por ejemplo C01005 para bromelaiacutena de
tallo) La versioacuten 97 de la base de datos actualizada al 1ordm de octubre de 2012 cuenta con
320834 secuencias de las cuales 113968 corresponden a peptidasas seriacutenicas 118637 a
metalopeptidasas 52745 a peptidasas cisteiacutenicas 14225 a peptidasas aspaacuterticas 11439 a
peptidasas treoniacutenicas 338 a peptidasas glutaacutemicas 3222 a peptidasas asparagiacutenicas
6256 a peptidasas de tipo cataliacutetico desconocido y 4 inclasificables La base contiene
ademaacutes 520 estructuras (Rawlings et al 2012)
132 Distribucioacuten de Proteasas en los Seres Vivos
En la Tabla 13 se consigna la distribucioacuten de las familias de proteasas en 8546
organismos de los distintos reinos Dentro del reino vegetal la mayoriacutea de las familias estaacuten
constituidas por peptidasas del tipo metaloproteasas (34101) seriacutenicas (22101) y
cisteiacutenicas (20101) Sin embargo el mayor nuacutemero de peptidasas registradas son las
seriacutenicas (29) seguidas por las aspaacuterticas (25) y las cisteiacutenicas (24) La mayoriacutea de las
proteasas cisteiacutenicas en plantas pertenecen a la familia de la papaiacutena (C1)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
13
Reino
Tipo de peptidasas Bacteria Archaea Protozoa Fungi Planta Animalia Virus
Aspaacuterticas 9 5 6 6 9 7 4
Cisteiacutenicas 27 11 20 16 20 22 30
Glutaacutemicas 2 1 - 1 - - 1
Metalopeptidasas 62 34 32 34 34 33 14
Seriacutenicas 25 18 20 16 22 25 18
Treoniacutenicas 1 1 1 1 1 1 -
Asparagiacutenicas 3 - - - - - 6
Distintos Tipos 20 13 15 13 14 18 25
Mecanismo Desconocido 7 4 2 1 1 3 2
Totales 156 87 96 88 101 109 100
Tabla 13 Distribucioacuten de familias de peptidasas de organismos de diferentes reinos en el sistema propuesto por MEROPS (httpmeropssangeracuk consultado 12112012)
133 Rol de las peptidasas en los vegetales
La proteoacutelisis es vital para las ceacutelulas Por un lado es necesaria para el recambio
proteico permitiendo que proteiacutenas dantildeadas mal plegadas o innecesarias sean eliminadas
a la vez que los aminoaacutecidos liberados sean utilizados para la siacutentesis de nuevas proteiacutenas
Por otro lado la degradacioacuten proteica en sitios especiacuteficos es una de las modificaciones
postraduccionales necesaria para que las proteiacutenas sean funcionalmente activas por
ejemplo para la activacioacuten de proenzimas o bien permitiendo el ensamblado de proteiacutenas y
su direccionamiento hacia distintos compartimientos celulares La degradacioacuten proteica
tambieacuten sirve como mecanismo de control celular si el sustrato son proteiacutenas regulatorias
La principal viacutea proteoliacutetica en las ceacutelulas eucariotas estaacute mediada por el sistema
ubiquitinaproteasoma la proteiacutena que debe ser degradada es marcada por unioacuten a la
ubiquitina facilitando la direccioacuten al complejo proteasomal efector de la hidroacutelisis
En las plantas el recambio proteico es considerado fundamental para el crecimiento
Ejemplos de ello son la degradacioacuten de proteiacutenas de reserva durante la germinacioacuten de las
semillas o la removilizacioacuten de proteiacutenas luego de la senescencia foliar con la relocalizacioacuten
de fuentes de N en los oacuterganos reproductivos Maacutes recientemente con la asociacioacuten
encontrada entre el sistema ubiquitinaproteasoma y la embriogeacutenesis la fotomorfogeacutenesis
los ritmos circadianos el desarrollo de flores y tricomas asiacute como la sentildealizacioacuten hormonal
la degradacioacuten selectiva de proteiacutenas ha tomado relevancia como mecanismo de regulacioacuten
de numerosos procesos de crecimiento y desarrollo en las plantas (Schaller 2004)
En Arabidopsis thaliana la primer planta en tener su genoma completamente
secuenciado se han encontrado maacutes de 600 genes de proteasas de todos los tipos
cataliacuteticos a excepcioacuten de las glutaacutemicas ademaacutes de 1300 genes asociados con el sistema
ubiquitina-proteasoma (Schaller 2004) Puesto que Arabidopsis es tomada como modelo
para el estudio fitobioloacutegico la falta de exclusividad del sistema proteasomal en la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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degradacioacuten proteica podriacutea ser extensible a otras especies vegetales El anaacutelisis en
alrededor de cien genomas ha demostrado que aproximadamente un 2 de todos los
productos geacutenicos son peptidasas evidenciaacutendose asiacute que se trata de uno de los grupos
funcionales de proteiacutenas maacutes grandes e importantes (Barrett et al 2004)
En el trabajo de revisioacuten y actualizacioacuten sobre el rol regulatorio de proteasas vegetales
Schaller (2004) cita referencias sobre proteasas (de todos los tipos cataliacuteticos a excepcioacuten
de las treoniacutenicas y las glutaacutemicas) claves para varios procesos bioloacutegicos de las plantas
destacaacutendose las funciones en la degradacioacuten proteica y movilizacioacuten de nitroacutegeno durante
la germinacioacuten de las semillas y la senescencia foliar el procesamiento de proteiacutenas de
reserva durante su acumulacioacuten en semillas diferentes eventos de la muerte celular
programada (iniciacioacuten regulacioacuten y autolisis) la resistencia a insectos y patoacutegenos la
digestioacuten de insectos en plantas carniacutevoras la sentildealizacioacuten por brasinoesteroides y en la
regulacioacuten de procesos de desarrollo y crecimiento tales como la diferenciacioacuten xilemaacutetica
la densidad de estomas y la formacioacuten lateral de raiacuteces del patroacuten embrionario y del
meristema apical entre otros
1331 Peptidasas cisteiacutenicas
Seguacuten el sistema MEROPS las peptidasas cisteiacutenicas estaacuten distribuidas en 76 familias
agrupadas en 13 clanes Dentro del reino Planta las proteasas cisteiacutenicas son una de las
maacutes conocidas por ser el tipo cataltico en que se centraron los primeros estudios sobre
proteasas vegetales En las plantas la mayoriacutea de las proteasas cisteiacutenicas pertenecen a
las familias de la papaiacutena (C1) y la legumaiacutena (C13) (Schaller 2004)
A nivel subcelular las proteasas cisteiacutenicas se localizan en vacuolas y en la pared
celular (Grudkowska amp Zagdańska 2004) sin embargo actividad tipo caspasa en plantas ha
sido detectada en el citosol pero no en vacuolas (Korthout et al 2000) En cuanto a su
distribucioacuten en la planta se han encontrado proteasas en praacutecticamente todos los oacuterganos
vegetales (Salas et al 2008)
Durante la maduracioacuten de las semillas las proteiacutenas de reserva son sintetizadas como
precursores que deben ser procesados para su ensamblado y acumulacioacuten (Jung et al
1998) Ese procesamiento ha sido atribuido a proteasas tipo legumaiacutenas conocidas como
enzimas de procesamiento vacuolar (VPE) (Hara-Nishimura et al 1998 Kinoshita et
al1999) Por otro lado dentro de las proteasas responsables de la degradacioacuten y
movilizacioacuten de proteiacutenas de reserva las cisteiacutenicas son las maacutes abundantes e incluye
ademaacutes de las legumaiacutenas a las del tipo papaiacutena (Grudkowska amp Zagdańska 2004)
Una caracteriacutestica de las proteasas cisteiacutenicas es que responden a estiacutemulos internos y
externos Ante el estreacutes abioacutetico la sequiacutea y el shock teacutermico algunas proteiacutenas son
dantildeadas o innecesarias hacieacutendose imprescindible la siacutentesis de nuevas proteiacutenas Este
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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recambio proteico conlleva un considerable aumento en la siacutentesis de proteasas cisteiacutenicas
hecho demostrado en las hojas de trigo ante el deacuteficit de agua Por otra parte los
aminoaacutecidos liberados actuacutean regulando la presioacuten osmoacutetica celular La induccioacuten de
proteasas cisteiacutenicas principalmente tipo papaiacutena y tipo caspasas acompantildea la muerte
celular programada la cual estaacute asociada con procesos de desarrollo y diferenciacioacuten
vegetal tales como la xilogeacutenesis y la senescencia asiacute como tambieacuten con las respuestas de
defensa (Grudkowska amp Zagdańska 2004)
Algunas proteiacutenas vegetales han sido clasificadas como proteiacutenas ldquoprescindiblesrdquo
puesto que algunas especies pueden sobrevivir sin ellas mientras que otras especies o
variedades dentro de la misma especie las producen en elevadas cantidades siendo poco
claro su rol fisioloacutegico en la planta Dentro de esta categoriacutea entran las proteasas presentes
en cantidades extremadamente altas principalmente en laacutetex y frutos caracteriacutesticas de
ciertas familias (Caricaceae Bromeliaceae y Moraceae) dado que si bien podriacutean
desempentildearse en la defensa contra la invasioacuten de patoacutegenos no se explica la variedad de
contenido proteoliacutetico entre especies altamente relacionadas (Adams amp Rinne 1981) En
estos casos las actividades proteoliacuteticas detectadas son al menos dos oacuterdenes de magnitud
mayores que las actividades encontradas en tejidos comparables de la mayoriacutea de otras
plantas (Glazer amp Smith 1971) Puesto que la siacutentesis acumulacioacuten y utilizacioacuten de las
proteiacutenas ldquoprescindiblesrdquo ocurre en determinados periacuteodos que podriacutean estar relacionados
con estadios del desarrollo de la planta se les ha asignado un posible rol como metabolitos
secundarios (Adams amp Rinne 1981) La sorprendente similitud bioquiacutemica (elevada
estabilidad amplia especificidad y baja tendencia autoliacutetica) de las proteasas cisteiacutenicas
muy abundantes no indicariacutea un ancestro comuacuten sino maacutes bien una convergencia evolutiva
como resultado de una funcioacuten defensiva comuacuten (Boller 1986)
La actividad de proteasas cisteiacutenicas frente a diferentes estiacutemulos puede ser elevada
al 90 de la actividad proteoliacutetica total (Grudkowska amp Zagdańska 2004) En el caso de
Carica papaya L se ha demostrado que la produccioacuten de heridas repetidas en los frutos
aumentan la cantidad de proteiacutenas y la actividad proteoliacutetica en el laacutetex de la papaya lo cual
estaacute acorde con el posible rol de estas proteasas en la defensa de la planta (Azarkan et al
2006)
El papel desempentildeado por las proteasas en las respuestas de defensa en plantas
desencadenadas por patoacutegenos y pestes estaacute comenzando a aclararse No soacutelo
intervendriacutean en la ejecucioacuten directa del patoacutegeno como es el caso de la papaiacutena y otras
proteasas tipo papaiacutena sino tambieacuten en la percepcioacuten por parte del organismo defensor y en
las cascadas de sentildealizacioacuten involucradas con las respuestas de defensa (van der Hoorn amp
Jones 2004)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
16
14 Enzimas Proteoliacuteticas de Bromeliaceae
Varias especies de la familia Bromeliaceae se caracterizan por poseer endopeptidasas
en cantidades superiores a las fisioloacutegicamente necesarias (Barrett 2001) A pesar del
elevado nuacutemero de integrantes de la familia Bromeliaceae es muy reducido el nuacutemero de
geacuteneros todos pertenecientes a la subfamilia Bromelioideae que han sido estudiados hasta
la fecha en busca de enzimas proteoliacuteticas (Ananas Bromelia Hohenbergia y
Pseudananas) siendo Ananas comosus L (el ldquoananaacuterdquo o ldquopintildeardquo) la especie maacutes estudiada a
partir de cuyos tallos se obtiene la bromelina (Heinicke amp Gortner 1957) Otras proteasas de
Bromeliaceae que han sido aisladas y caracterizadas incluyen a la hemisfericina a partir de
frutos de Bromelia hemispherica (Agundis et al 1977 Ochoa et al 1987) pinguinina
obtenida de frutos de Bromelia pinguin (Toro-Goyco et al 1980 Abreu Payrol et al 2008)
karatasina aislada de frutos de Bromelia plumieri (Montes et al 1990) macrodontaiacutena I y II
de frutos inmaduros de Pseudananas macrodontes (Morr) Harms (Brullo et al 1994
Natalucci et al 1996 Loacutepez et al 2000 y 2001 Brullo 2003) balansaiacutena I de frutos
inmaduros de Bromelia balansae Mez (Pardo et al 2000) hieronymaina I II y III aisladas de
frutos inmaduros de Bromelia hieronymi Mez (Bruno et al 2003 2006 2008) fastuosaiacutena
extraiacuteda de frutos inmaduros de Bromelia fastuosa (Cabral et al 2006) y penduliflorain I
obtenida a partir de frutos de Hohenbergia penduliflora (Peacuterez et al 2010) Tambieacuten se han
aislado proteasas de frutos de otras especies de Bromelia B serra (Caffini et al 1988) B
laciniosa (Buttazzoni et al 1984 Priolo et al 1986) B palmeris y B sylvestris (Cruz et al
1974 Hernaacutendez Arana et al 1983)
Dado que el presente trabajo de tesis doctoral estaacute centrado en el estudio de posibles
aplicaciones farmacoloacutegicas de las proteasas presentes en frutos de Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes en comparacioacuten con la bromelina a continuacioacuten se
brinda un resumen de las principales caracteriacutesticas bioquiacutemicas de las proteasas aisladas a
partir de esos materiales
141 Endopeptidasas del ananaacute
Las endopeptidasas del ananaacute son de tipo cisteiacutenicas y pertenecen a la superfamilia de
la papaiacutena (C01) Conocidas en su conjunto como ldquobromelinardquo teacutermino que se ha
reemplazado en los uacuteltimos antildeos por ldquobromelaiacutenardquo En el presente trabajo se utilizaraacute
indistintamente cualquiera de los dos teacuterminos Rowan et al (1990) denominan ldquobromelaiacutena
de tallordquo a la principal endopeptidasa del tallo de ananaacute y ldquobromelaiacutena de frutordquo a la principal
endopeptidasa de fruto Adicionalmente dos endopeptidasas menores (ananaiacutena y
comosaiacutena) fueron separadas del tallo de ananaacute (Rowan et al 1988 1990) Actualmente y
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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en base a estudios geneacuteticos se considera que existen dos tipos de bromelinas de fruto
denominas ldquom-tipo 1rdquo y ldquom-tipo 2rdquo (Rawlings et al 2008)
1411 Bromelina de tallo
La bromelina de tallo (EC 342232) es la proteasa predominante (casi el 90) en los
extractos de tallos de Ananas comosus y se trata de una uacutenica cadena polipeptiacutedica
glicosilada de 245 kDa (Harrach et al 1995) con un punto isoeleacutectrico (pI) de 955
(Murachi 1970) conteniendo siete residuos Cys (Napper et al 1994 Harrach et al 1995) y
tres puentes disulfuro La secuencia aminoaciacutedica completa ha sido deducida por Ritonja et
al (1989) siendo su masa molecular de 22831 Da Para expresar su maacutexima actividad la
enzima requiere la presencia de agentes reductores tales como cisteiacutena El pH oacuteptimo tanto
con sustratos sinteacuteticos como proteicos es amplio (Rowan amp Buttle 1994) A pesar de su
elevada actividad sobre distintos sustratos proteicos actuacutea eficientemente sobre sustratos
sinteacuteticos que contengan uniones Arg-Arg (Rowan et al 1988 Napper et al 1994)
Tambieacuten se ha comunicado una cierta preferencia de la enzima por aminoaacutecidos polares en
las posiciones P1 y P1acute5 (Napper et al 1994) Una caracteriacutestica distintiva de esta proteasa
es su relativamente deacutebil inhibicioacuten por E-64 y la carencia de inhibicioacuten por cistatina de pollo
lo que la diferencia de la mayoriacutea de las peptidasas de la familia C1 (Rowan et al 1990)
1412 Ananaiacutena
Rowan et al (1988) lograron purificar una enzima distinta a la bromelina de tallo a la
que denominaron ananaiacutena (EC 342231) y que representa el 5 de las proteiacutenas totales
del extracto de tallo de ananaacute A diferencia de la bromelina de tallo la ananaiacutena muestra
baja preferencia por sustratos sinteacuteticos que contengan Arg-Arg y alta actividad frente a Z-
Phe-Arg-NHMec y a Bz-Phe-Val-Arg-NHMec Ananaiacutena muestra mayor preferencia por
aminoaacutecidos polares en la posicioacuten P1acute mientras que el requerimiento para el sitio P1 es
mucho menos especiacutefico (Napper et al 1994) en tanto que en el sitio P2 manifiesta
preferencia por una cadena lateral hidrofoacutebica (Rowan et al 1990) El pH oacuteptimo tanto con
sustratos sinteacuteticos como proteicos es cercano a la neutralidad (Rowan amp Buttle 1994)
Ananaiacutena no es glicosilada estaacute formada por una cadena proteica simple de 235 kDa
(Rowan et al 1988 Napper et al 1994 Harrach et al 1995) y su pI es gt 10 (Rowan et al
1988 Harrach et al 1995) Tambieacuten contiene siete residuos Cys (Napper et al 1994) La
secuencia primaria de ananaiacutena ha sido determinada comprobaacutendose que incluye un
inserto entre los residuos 170 y 174 que no estaacute presente en bromelina de tallo ni en
5 En el modelo ideado por Schechter y Berger (1967) para describir la especificidad de corte de las peptidasas
los residuos de aminoaacutecido del sustrato (P) se unen a subsitios del sitio activo de la enzima (S) Estos residuos se numeran a partir del enlace a ser clivado hacia el extremo N-terminal como P1 P2 P3 etc en tanto que los que se encuentran hacia el C-terminal se denominan P1 P2 P3 etc Los subsitios de la proteasa actuacutean acomodando los residuos del sustrato y se numeran como S1 S2 S3 y S1 S2 S3 respectivamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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papaiacutena y una serie de aminoaacutecidos hidrofoacutebicos adyacentes a la His-157 (Lee et al 1997)
El comportamiento de la enzima frente a los inhibidores es similar al de la papaiacutena ya que
es eficientemente inhibida tanto por cistatina de pollo como por E-64 (Rowan et al 1988)
1413 Comosaiacutena
Comosaiacutena es la endopeptidasa menos abundante del extracto de tallo de ananaacute y
representa menos del 1 de las proteiacutenas totales Se trata de una glicoproteiacutena de 245 kDa
y pI gt 10 conteniendo siete residuos Cys y tiene una composicioacuten similar en carbohidratos a
la bromelina de tallo pero es marcadamente diferente en su composicioacuten aminoaciacutedica
(Napper et al 1994) Tiene actividad sobre Z-Arg-Arg-NHMec (Rowan et al 1990) muestra
preferencia por residuos polares tanto en el sitio P1 como P1acute y es inhibida por E-64
(Napper et al 1994)
1414 Bromelina de fruto
La preparacioacuten denominada ldquobromelina de frutordquo (EC 342233) constituye el 30-40
de las proteiacutenas totales del fruto representa casi el 90 del material proteoliacuteticamente
activo (Murachi 1970) y al igual que la bromelina de tallo tiene un amplio pH oacuteptimo frente a
sustratos proteicos y sinteacuteticos (Rowan amp Buttle 1994) Se trata de una cadena polipeptiacutedica
simple de aproximadamente 25 kDa (Rowan et al 1990) cuyo pI es 46 y parece no
tratarse de una glicoproteiacutena (Ota et al 1985) La secuencia N-terminal es ideacutentica a la de
bromelina de tallo (Yamada et al 1976) pero es inmunoloacutegicamente distinta de eacutesta y de
ananaiacutena (Rowan et al 1990)Tiene preferencia por el sustrato sinteacutetico Bz-Phe-Val-Arg-
NHMec y no por Z-Arg-Arg-NHMec lo que la diferencia de la bromelina de tallo (Rowan et
al 1990)
142 Balansaiacutena
Utilizando frutos semimaduros de Bromelia balansae Mez Natalucci et al (1988)
obtienen una preparacioacuten proteoliacutetica activa en un rango de pH amplio (60ndash95) que se
resuelve en tres fracciones proteoliacuteticamente activas por cromatografiacutea de intercambio
ioacutenico Posteriormente Pardo et al (2000) estudiaron las proteasas presentes en frutos en
distintos estadios de maduracioacuten determinaacutendose un aumento en el nuacutemero de proteiacutenas
con diferente pI y un incremento en el contenido de proteiacutenas totales y de azuacutecares a
medida que avanza el grado de madurez La actividad caseinoliacutetica y la actividad especiacutefica
fueron mayores en los estadios de menor madurez Mediante purificacioacuten parcial por
precipitacioacuten etanoacutelica lograron retener el 92 de la actividad enzimaacutetica y el 83 de las
proteiacutenas iniciales eliminaacutendose el 45 de los azuacutecares contenidos en el extracto crudo
Dicha preparacioacuten mostroacute alta estabilidad teacutermica conservaacutendose un 80 de actividad
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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proteoliacutetica luego de ser incubada durante 2 h a 45 ordmC Una banda activa de pI 55
(balansaiacutena I) se encontroacute en cantidades apreciables durante todo el proceso de
maduracioacuten mientras que otra banda activa de pI 87 (balansaiacutena II) soacutelo pudo encontrarse
en cantidades apreciables en frutos maduros trataacutendose en ambos casos de
cisteiacutenendopeptidasas
El peso molecular de Balansaiacutena I determinado por espectrometriacutea de masas (MALDI-
TOF) fue de 23192 Da y por electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-
PAGE) fue 244 kDa su pH oacuteptimo frente a caseiacutena fue 87 y conservoacute maacutes del 80 de
actividad en el rango de pH 58 a 100 Balansaiacutena I mostroacute preferencia por los derivados
Ala y Gln de N-α-CBZ-p-Nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos seguido por los de Gly Tyr y Leu
La secuencia N-terminal muestra gran similitud con las proteasas del ananaacute (Pardo et al
2000)
143 Hieronymaiacutenas
A partir de frutos inmaduros de Bromelia hieronymi Mez Bruno et al (2002) obtienen
extractos parcialmente purificados por precipitacioacuten acetoacutenica (PAR) y etanoacutelica (PER)
conteniendo alta cantidad de proteiacutenas (91 en el PAR y 79 en el PER) y de actividad
caseinoliacutetica (90 en el PAR y 83 en el PER) respecto al extracto crudo de partida
mientras se eliminan la mayor parte de azuacutecares y fenoles Las enzimas presentes
resultaron ser cisteiacutenendopeptidasas Los preparados conservaron maacutes del 90 de la
actividad original cuando fueron preincubados a 37 ordmC y 55 ordmC durante 2 h y mostraron
actividad en un amplio rango de pH alcanzando el 80 de la actividad maacutexima entre los pH
7 y 10 Mediante isoelectroenfoque (IEF) se logran separar 6 bandas de pI 59 64 76 83
y gt 93
1431 Hieronymaiacutena I
Desde frutos inmaduros de B hieronymi Bruno et al (2003) logran aislar una fraccioacuten
a la que denominan ldquohieronymaiacutena Irdquo (pI gt93) cuya homogeneidad fue confirmada por
MALDI-TOF donde mostroacute una masa molecular de 24066 Da por SDS-PAGE mostrando
una banda de 25 kDa y por IEF La enzima de tipo cisteiacutenica presentoacute una actividad
caseinoliacutetica maacutexima en el rango de pH 85-95 y fue completamente inhibida por E-64 y
aacutecido iodoaceacutetico mientras que se incrementoacute por la adicioacuten de cisteiacutena 20 mM
1432 Hieronymaiacutena II
A partir del mismo material Bruno et al (2006) purifican una segunda proteasa
cisteiacutenica (hieronymaiacutena II) cuya homogeneidad fue confirmada por MALDI-TOF-TOF
mostrando un peso molecular de 23411 Da y por SDS-PAGE con un peso molecular de 25
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
20
kDa aunque por IEF se observaron dos isoformas de pI 76 y 83 La actividad caseinoliacutetica
maacutexima fue detectada en el rango de pH entre pH 75-90
1433 Hieronymaiacutena III
Una tercera endopeptidasa cisteiacutenica (hieronymaiacutena III) fue purificada desde frutos
inmaduros de B hieronymi (Bruno et al 2008) cuyo pH oacuteptimo sobre caseiacutena se encuentra
en el rango de pH 86-93 La masa molecular determinada por SDS-PAGE fue de 25 kDa y
por espectrometriacutea de masas de 23713 Da Mediante IEF se observaron dos bandas de pI
59 y 64
La actividad de las tres endopeptidasas frente a sustratos sinteacuteticos mostroacute
diferencias significativas Soacutelo hieronymaiacutena I pudo degradar PFLNA (un sustrato comuacuten
para proteasas de ananaacute) Z-Phe-Arg-p-nitroanilida fue hidrolizado por hieronymaiacutena I y II
mientras que Z-Arg-Arg-p-nitroanilida el sustrato sobre el que tiene alta afinidad bromelina
de tallo y comosaiacutena fue degradado soacutelo por hieronymaiacutena III Ademaacutes las tres
endopeptidasas mostraron diferentes especificidades sobre 5 de los 13 sustratos N-α-CBZ-
p-nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos ensayados el derivado de Ala fue preferido por
hieronymaiacutena I y II seguido por Gly y Asp respectivamente mientras que hieronymaiacutena III
clivoacute preferentemente el derivado de Lys seguido por Asp (Bruno et al 2008)
La comparacioacuten de la secuencia de los N-terminales de hieronymaiacutena II y III mostroacute
gran similitud entre siacute (93) y con las de la bromelina de tallo bromelina de fruto
comosaiacutena ananaiacutena y balansaiacutena I (70-90) (Bruno et al 2006 2008) Mientras que la
secuencia del N-terminal de hieronymaiacutena I mostroacute una similitud del oacuterden del 70 con la de
hieronymaiacutena II y balansaiacutena I y del 60 con las de hieronymaiacutena III bromelina de tallo
ananaiacutena y comosaiacutena (Bruno et al 2003 2008)
144 Macrodontaiacutenas
A partir de frutos de Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [= Pseudananas
sagenarius (Arruda) Camargo] se obtuvo un extracto parcialmente purificado por
precipitacioacuten acetoacutenica denominado macrodontaiacutena el cual fue activo en un amplio rango
de pH obtenieacutendose valores superiores al 75 de la actividad maacutexima entre pH 70 y 105
(caseiacutena) Macrodontaiacutena fue estable en el rango de pH de maacutexima actividad asiacute como en
condiciones de elevada fuerza ioacutenica Por el contrario a diferencia de otras fitoproteasas
macrodontaiacutena no fue demasiado termoestable ya que la actividad residual se redujo al
50 luego de ser incubada durante 2 h a 45 ordmC (Brullo 2003)
Desde macrodontaiacutena se lograron purificar dos endopeptidasas macrodontaiacutena I con
una masa molecular de 25 kDa (SDS-PAGE) y pI de 61 y macrodontaiacutena II con masa
molecular de 27 kDa (SDS-PAGE) y pI de 59 Macrodontaiacutena I exhibioacute un rango de pH
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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oacuteptimo entre pH 61 y 85 en tanto que en macrodontaiacutena II fue maacutes estrecho (pH 75-85)
La actividad de ambas proteasas sobre N-α-CBZ-p-nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos mostroacute
mayor afinidad hacia el derivado de Ala seguido por el de Gln y Tyr El E-64 inhibidor
especiacutefico del sitio activo de cisteiacutenproteinasas exhibioacute un comportamiento diferencial frente
a una y otra proteasa ya que produjo inhibicioacuten praacutecticamente total de macrodontaiacutena I
pero macrodontaiacutena II conservoacute un 15 de actividad residual hecho que podriacutea
relacionarse con una diferente geometriacutea del sitio activo como sugieren Ritonja et al (1989)
para bromelaiacutena de tallo (Brullo 2003) Macrodontaiacutena I y II fueron activas frente a Bz-Phe-
Val-Arg-NHMec pero no frente a Z-Arg-Arg-NHMec Las secuencias N-terminales de
macrodontaiacutena I y II revelan un 926 de identidad entre siacute un 80-90 con comosaiacutena
ananaiacutena bromelina de tallo y balansaiacutena I (Loacutepez et al 2001) un 70-80 con
hieronymaiacutena II y III y un 60 con hieronymaiacutena I (Bruno et al 2008)
Brullo (2003) determinoacute la estructura primaria de macrodontaiacutena I que demostroacute estar
compuesta por 213 aminoaacutecidos con un peso molecular calculado de 23486 Da valor
consistente con el dato aportado por la espectrometriacutea de masas (23459 Da) La
comparacioacuten con las secuencias completas de algunas fitoproteasas cisteiacutenicas reveloacute un
alto grado de identidad (alrededor del 70) con las de Ananas comosus con bromeliacutena de
fruto exhibioacute la mayor similitud (770 de identidad) seguida por ananaiacutena (con 719 de
identidad) y bromeliacutena de tallo (con 671 de identidad) Ademaacutes fue determinado el
caraacutecter no glicoproteacuteico de la enzima Al igual que en papaiacutena en macrodontaiacutena I existen
7 residuos Cys seis de los cuales participan de los tres puentes disulfuro presentes en la
estructura de esta clase de enzimas Dada la semejanza estructural entre varias proteasas
comparadas se concluye que macrodontaiacutena I integra el Clan CA de las proteasas
cisteiacutenicas que lidera papaiacutena (Brullo 2003)
15 Objetivos
Como se ha dicho el extracto acuoso obtenido del ananaacute [Ananas comosus (L)
Merr] conocido como bromelina ha mostrado tener tanto in vivo como in vitro efectos
antiedematoso antiinflamatorio antitumoral antitromboacutetico entre otras acciones
farmacoloacutegicas Pertenece al grupo de proteasas que son administradas oralmente en el
tratamiento sisteacutemico contra la inflamacioacuten las enfermedades relacionadas con la
coagulacioacuten sanguiacutenea y el caacutencer Su baja toxicidad permite que sea bien tolerada en
tratamientos largos Si bien su mecanismo de accioacuten auacuten no ha sido definitivamente
dilucidado sus efectos farmacoloacutegicos son adjudicados principalmente a sus
endopeptidasas cisteiacutenicas Actividades farmacoloacutegicas diversas han sido tambieacuten atribuidas
a fitoproteasas de tipo cisteiacutenicas pertenecientes a otras bromeliaacuteceas (Bromelia fastuosa)
asiacute como a especies pertenecientes a otras familias (Caricaceae Moraceae)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Algunas especies de la familia Bromeliaceae entre ellas Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes se caracterizan por producir grandes cantidades de
endopeptidasas cisteiacutenicas Crecen en amplias regiones de nuestro paiacutes (NEA y NOA) asiacute
como en Brasil Bolivia Paraguay y Colombia Excepto el uso de frutos de B balansae para
tratar la tos en una regioacuten de Brasil no se conocen usos medicinales para estas tres
especies A partir de sus frutos se han aislado y caracterizado en el LIProVe varias
proteasas de tipo cisteiacutenicas que sin embargo no han sido objeto de estudios
farmacoloacutegicos hasta este momento
Es propoacutesito del presente trabajo aportar al conocimiento en relacioacuten a los posibles
usos medicinales de especies de bromeliaacuteceas autoacutectonas de nuestro paiacutes no estudiadas
auacuten para dichos fines Bajo la suposicioacuten que las proteasas de Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes por pertenecer al mismo tipo cataliacutetico y a la misma
subfamilia vegetal podriacutean mostrar actividades bioloacutegicas similares a las proteasas de
Ananas comosus nos planteamos como objetivo general de la presente tesis
La buacutesqueda de posibles efectos farmacoloacutegicos de extractos ricos en
cisteiacutenendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi B balansae
y Pseudananas macrodontes y su comparacioacuten con bromelina
Y como objetivos especiacuteficos
Evaluar el efecto antiinflamatorio de los extractos de B hieronymi B balansae
y P macrodontes
Evaluar los efectos de los extractos de B hieronymi B balansae y P
macrodontes sobre algunos de los componentes de la hemostasia
Evaluar los extractos de B hieronymi B balansae y P macrodontes como
posibles agentes antitumorales
Tratar de establecer la posible relacioacuten entre los efectos medidos y la actividad
proteoliacutetica de las cisteiacutenendopeptidasas estudiadas
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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2 MATERIAL VEGETAL
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
28
21 Material Vegetal Utilizado
211 Bromelia hieronymi Mez
Crece en bosques xeroacutefitos de la provincia fitogeograacutefica chaquentildea Habita desde el
SE de Bolivia a traveacutes del Chaco paraguayo y argentino hasta las provincias de Tucumaacuten
Santiago del Estero y Chaco (Arenas 1997)
Frutos inmaduros fueron recogidos en los alrededores de la ciudad de Santiago del
Estero por el Ing Lucas Roic de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad
Nacional de Santiago del Estero Un ejemplar de referencia ha sido depositado en el
herbario de la Divisioacuten Plantas Vasculares de la Facultad de Ciencias Naturales y Museo de
la Universidad Nacional de La Plata Los frutos fueron lavados secados al aire y
almacenados en freezer a -20 ordmC hasta su uso
2111 Extracto parcialmente purificado de frutos de B hieronymi (Bh)
Aproximadamente 50 g de frutos congelados fueron cortados y triturados en una
procesadora durante 1 min en intervalos de 10 s con igual tiempo de espera con 250 mL de
buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 conteniendo EDTA y cisteiacutena 5 mM Luego de filtrar con
gasa se centrifugoacute durante 30 min a 4 ordmC y 12000 g El sobrenadante que constituye el
extracto crudo se fraccionoacute y almacenoacute a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue
realizada sobre bantildeo de hielo
A fin de eliminar compuestos fenoacutelicos y la mayoriacutea de los carbohidratos presentes
al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y en agitacioacuten suave se le adicionaron 4
voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC Luego de permitir la precipitacioacuten durante 30 min
a 4 ordmC se centrifugoacute a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC Se descartoacute el sobrenadante y el
precipitado fue secado al vaciacuteo durante 30 min el que finalmente fue resuspendido en buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Bruno 2007)
212 Bromelia balansae Mez
Frecuente en el sotobosque umbriacuteo es una planta asociada con el aacutembito fluvial Se
distribuye desde Colombia Amazonia Centro y Este de Brasil Regioacuten Oriental del
Paraguay hasta Corrientes y Misiones y las zonas riberentildeas de Formosa y Chaco en
Argentina (Arenas 1997)
El material estudiado proviene de la Provincia de Misiones (en la proximidad de
Posadas ruta 105 Km 28 a 33 entre los departamentos de San Joseacute y Fachinal) La
recoleccioacuten fue llevada a cabo por el Dr Aniacutebal Amat de la Facultad de Ciencias Exactas
Quiacutemicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones donde se encuentra
depositado un ejemplar de herbario Los frutos fueron lavados secados y almacenados a -
20 ordmC hasta su uso
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
29
2121 Extracto parcialmente purificado de frutos de B balansae (Bb)
Aproximadamente 40 g de frutos semimaduros congelados fueron cortados y
triturados en una procesadora 10 veces durante 10 s (con intervalos de 20 s) con 200 mL de
buffer fosfato soacutedico 01M de pH 7 conteniendo EDTA 5 mM y cisteiacutena 125 mM Luego de
filtrar la preparacioacuten resultante con gasa se la centrifugoacute a 12000 g durante 25 min a 4 ordmC y
el sobrenadante resultante que corresponde al extracto crudo fue fraccionado y
almacenado a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue realizada sobre bantildeo de
hielo
Al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y con agitacioacuten suave se le agregoacute un
volumen de etanol preenfriado a -20 ordmC y se lo dejoacute durante 30 min a 4 ordmC Luego se
centrifugoacute a 3000 g durante 30 min a 4 ordmC El sobrenadante en bantildeo de hielo fue tratado
con 3 voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC y luego de dejarlo durante 30 min a 4 ordmC fue
centrifugado a 3000 g durante 30 min a 4 ordmC Una vez eliminado el sobrenadante el
precipitado fue secado al vaciacuteo durante 45 min Finalmente fue resuspendido con buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Pardo 2004)
213 Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [= P sagenarius (Arruda) Camargo]
Vegeta en el interior de bosques huacutemedos y sombriacuteos es caracteriacutestico en bosques
de galeriacutea Se extiende desde el nordeste centro y este de Brasil a traveacutes del Paraguay
Oriental hasta la Mesopotamia argentina Se halla en toda la cuenca de los riacuteos Paraguay y
Paranaacute desde Bolivia hasta la altura del litoral santafecino (Arenas 1997)
Los frutos en estado semimaduro fueron recogidos en Santa Ana departamento de
Candelaria Provincia de Misiones por el Prof Aniacutebal Amat Un ejemplar de referencia ha
sido depositado en el herbario de la Facultad de Ciencias Exactas Quiacutemicas y Naturales de
la Universidad Nacional de Misiones Los frutos fueron lavados secados al aire y
almacenados a -20 ordmC hasta su uso
2131 Extracto parcialmente purificado de frutos de P macrodontes (Pm)
Aproximadamente 120 g de frutos semimaduros congelados y desprovistos de
semillas y bracteacuteolas fueron cortados y triturados en una procesadora durante 1 min (en
intervalos de 10 s con igual tiempo de espera) con 200 mL de buffer fosfato soacutedico 01M de
pH 6 conteniendo EDTA y cisteiacutena 5 mM Luego de filtrar la preparacioacuten resultante con gasa
se la centrifugoacute a 5000 g durante 30 min a 4 ordmC y el sobrenadante resultante (extracto crudo)
fue fraccionado y almacenado a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue realizada
sobre bantildeo de hielo
Al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y con agitacioacuten suave se le agregoacute un
volumen de etanol preenfriado a -20 ordmC y se lo dejoacute durante 30 min a 4 ordmC Luego se
centrifugoacute a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC El sobrenadante en bantildeo de hielo fue luego
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
30
tratado con 3 voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC y luego de dejarlo durante 120 min a
4 ordmC fue centrifugado a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC Una vez eliminado el sobrenadante
el precipitado fue secado al vaciacuteo durante 30 min Finalmente fue resuspendido con buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Brullo 2003)
214 Ananas comosus (L) Merr
Es una planta perenne nativa de Ameacuterica del Sur de escaso porte y con hojas duras
y lanceoladas de hasta 1 metro de largo fructifica una vez cada tres antildeos produciendo un
uacutenico fruto fragante y dulce muy apreciado en gastronomiacutea (Garciacutea Suaacuterez amp Serrano
2005)
Los efectos evaluados de los preparados proteoliacuteticos fueron comparados con los de
bromelina de tallo comercial (B4882 Sigma Aldrich)
215 Reactivos quiacutemicos
En todos los casos se usoacute etanol 96ordm calidad medicinal (Soria) EDTA (Invitrogen)
cisteiacutena (Sigma Aldrich) y fosfato soacutedico pureza 98 (Carlo Erba)
22 Caracterizacioacuten proteoliacutetica de los extractos parcialmente purificados (Bh Bb y Pm) y de bromelina
221 Teacutecnicas y metodologiacutea
2211 Dosaje de la actividad caseinoliacutetica
La preparacioacuten del sustrato se realizoacute suspendiendo 1 g de caseiacutena de leche bovina
(Sigma Aldrich) en 100 mL de solucioacuten buffer (Tris-HCl 01M pH 80) la suspensioacuten se
colocoacute en un bantildeo de agua que se llevoacute a ebullicioacuten y se mantuvo durante 20 min en esas
condiciones La solucioacuten resultante se filtroacute en caliente y una vez enfriada se agregoacute cisteiacutena
25 mM como activador de proteasas cisteiacutenicas
La mezcla de reaccioacuten se preparoacute con 11 mL de solucioacuten de caseiacutena al 1 y 01 mL
de solucioacuten del extracto en estudio La reaccioacuten fue llevada a cabo a 37 ordmC y detenida a los 2
min por la adicioacuten de 18 mL de aacutecido tricloroaceacutetico al 5 luego de lo cual los tubos fueron
centrifugados a 4000 g durante 30 min determinaacutendose la absorbancia de los
sobrenadantes a 280 nm medida a traveacutes de una celda de 1 cm de paso En todos los
casos fueron realizados ensayos en blanco agregando al preparado proteoliacutetico primero el
aacutecido tricloroaceacutetico y por uacuteltimo la solucioacuten de caseiacutena
Siguiendo el criterio de Sarath et al (1989) para expresar la actividad enzimaacutetica
cuando se utilizan sustratos proteicos se definioacute para este caso una unidad arbitraria
(Unidad caseinoliacutetica UCas) que corresponde a la cantidad de enzima requerida para
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
31
producir un incremento de una unidad de absorbancia a 280 nm al cabo de 1 min en las
condiciones de ensayo
2212 Cuantificacioacuten del contenido proteico
Se utilizoacute el meacutetodo de Bradford (1976) basado en que la unioacuten del Coomassie Blue G-
250 a la proteiacutena produce un corrimiento del maacuteximo de absorbancia de 465 nm (forma roja
del colorante libre) a 595 nm (forma azul del complejo colorante-proteiacutena) Las curvas de
calibracioacuten se confeccionaron utilizando seroalbuacutemina bovina (Sigma-Aldrich) en el rango de
02-12 mgmL para el ensayo estaacutendar y en el rango de 10-100 μgmL para el microensayo
2213 Isoelectroenfoque
Las bandas proteicas se determinaron por isoelectroenfoque (IEF) utilizando un equipo
Mini IEF Cell (Modelo 111 Bio Rad) Las muestras se precipitaron con 4 voluacutemenes de
acetona durante 30 min y luego de centrifugar a 16000 g durante 15 min el precipitado
resultante fue redisuelto con agua bidestilada
Los geles fueron preparados mezclando 20 mL de acrilamida-bisacrilamida (25T6
3C7) 20 mL de glicerol (25 pv) 05 mL de anfolitos Biolyte 3-10 (para Bh Bb y
bromelina) o Pharmalyte 4-65 (para Pm) y 55 mL de agua luego que dicha mezcla fue
degasificada se adicionaron 3 μL de TEMED y 60 μL de persulfato de amonio al 10
Las muestras (1-5 microL) se sembraron y se permitioacute que difundieran dentro del gel
durante 5 min Los electrodos fueron humedecidos con agua bidestilada y los geles se
apoyaron inmediatamente sobre los mismos El IEF fue llevado a cabo en tres etapas
sucesivas 15 min a 100 V 30 min a 200 V y finalmente 1 h a 450 V
Una vez concluida la corrida los geles fueron sumergidos durante 30 min en solucioacuten
fijadora (4 g de aacutecido sulfosaliciacutelico 30 mL de metanol 125 g de aacutecido tricloroaceacutetico y agua
csp 100 mL) Una vez fijados los geles fueron tratados durante 2 h con la solucioacuten
colorante (10 mL de aacutecido aceacutetico glacial 27 mL de etanol 40 mg de Coomassie Brilliant
Blue R-250 500 mg de CuSO4 y agua csp 100 mL) decolorados por tres lavados
sucesivos con solucioacuten decolorante I (7 mL de aacutecido aceacutetico glacial 12 mL de etanol 500
mg de CuSO4 y agua csp 100 mL) y finalmente sumergidos en solucioacuten decolorante II (7
mL de aacutecido aceacutetico glacial 12 mL de Etanol y agua csp 100 mL) hasta obtener un fondo
claro
6 T= (g acrilamida+g bisacrilamida) x 100 volumen total
7 C= g bisacrilamida x 100 (g acrilamida+g bisacrilamida)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
32
2214 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Para el moldeado de los geles y la realizacioacuten de la corrida electroforeacutetica se empleoacute
el equipo Mini Protean III (Bio-Rad) y se procedioacute de acuerdo a la teacutecnica de Laemmli (1970)
con modificaciones Los geles se prepararon con poliacrilamida al 16 (Tabla 21)
Reactivos Gel de apilamiento
(5) Gel de resolucioacuten
(16)
Acrilamida-Bisacrilamida (3008) 115 mL 4 mL
Buffer de resolucioacuten - 094 mL
Buffer de apilamiento 09 mL
H2O 453 mL 2425 mL
SDS al 10 70 μL 75 μL
PSA 10 52 μL 50 μL
TEMED 4 μL 4 μL
Tabla 21 Sistema de geles empleado Buffer de resolucioacuten Tris-HCl 3M pH 88 Buffer de apilamiento Tris-HCl
05M pH 68 PSA persulfato de amonio TEMED NNNacuteNacute-tetrametiletilendiamina
Las muestras fueron tratadas con el agregado de un volumen de buffer de muestra
(Tabla 22) previa adicioacuten de aacutecido iodoaceacutetico 1 mM (concentracioacuten final) llevadas a
ebullicioacuten durante 10 min y centrifugadas durante 10 min a 16000 g
Buffer de muestra
Tris 157 g
SDS 4 g
Glicerol 16 mL
Azul de bromofenol 4 mg
β-mercaptoetanol 25 μL
Llevar a pH 68 con HCl 1M
AD csp 100mL
Tabla 22 Composicioacuten del buffer de muestra El β-mercaptoetanol fue agregado durante el tratamiento de las
muestras
El buffer de reservorio (03 pv de Tris 01 pv de SDS y 144 pv de glicina) se
colocoacute en el reservorio catoacutedico hasta cubrir la parte superior del gel y en el anoacutedico hasta
una altura suficiente como para permitir que todo el electrodo haga contacto con eacutel
En las distintas calles se sembraron 10-15 μL de las muestras y 3 μL de los patrones
de peso molecular (LMW GE Healthcare) fosforilasa b (97 kDa) albuacutemina (66 kDa)
ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (30 kDa) inhibidor de tripsina (201 kDa) y α-
lactoalbuacutemina (144 kDa)
La intensidad de corriente fue de 30 mA durante el apilado y de 60 mA durante la
resolucioacuten hasta la finalizacioacuten de la corrida Inmediatamente despueacutes los geles fueron
removidos de las placas y dejados durante 30 min en solucioacuten fijadora (10 vv de aacutecido
aceacutetico 50 vv de metanol) Luego fueron coloreados con solucioacuten colorante (10 vv de
aacutecido aceacutetico 40 vv de metanol y 100 mg de Coomassie Brillant Blue R-250) y
decolorados con una solucioacuten de aacutecido aceacutetico al 10 vv
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
33
2215 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina
Con el fin de determinar si los efectos medidos para los distintos preparados
proteoliacuteticos eran debidos a la accioacuten de sus proteasas cisteiacutenicas fue necesario evaluar el
efecto de los mismos preparados desprovistos de actividad proteoliacutetica
El meacutetodo de inhibicioacuten que se eligioacute fue tratar los preparados con E-64 (trans-
epoxisuccinil-L-leucilamido(4-guanidino)butano) un potente irreversible y selectivo inhibidor
de proteasas cisteiacutenicas El grupo trans-epoxisuccinil (resto activo) del E-64 se une
irreversiblemente al grupo tiol del sitio activo de muchas proteasas cisteiacutenicas tales como
papaiacutena y bromelina y no reacciona con los grupos tiol de otras enzimas no proteasas como
L-lactato deshidrogenasa (Barrett et al 1982) Dada esta gran especificidad y la baja
toxicidad que ha mostrado es considerado muy uacutetil para ensayos in vivo (Katunuma et al
1995)
22151 Tratamiento con E-64
Bh Bb y Pm fueron obtenidos seguacuten lo indicado previamente (2111 2121 y
2131 respectivamente) y antes de liofilizarlos diferentes aliacutecuotas de cada uno fueron
incubadas con soluciones de 5 10 30 60 80 y 100 μM (concentracioacuten en volumen de
mezcla) de E-64 (E3132 Sigma Aldrich) durante 30 min a 37 ordmC La solucioacuten de bromelina
fue preparada resuspendiendo el polvo comercial en buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 (30
mgml) y diferentes aliacutecuotas fueron incubadas con 60 100 130 150 y 250 μM de E-64 Los
blancos se incubaron de igual manera pero reemplazando el E-64 por igual volumen de
agua destilada Luego se determinoacute la actividad proteoliacutetica de cada aliacutecuota y se la
referencioacute a la actividad proteoliacutetica del preparado blanco a la que se consideroacute el 100
(actividad residual porcentual)
222 Resultados
2221 Perfiles de pI y de peso molecular de Bh Bb y Pm
El contenido proteico la actividad proteoliacutetica y la actividad especiacutefica de cada
preparado de Bh Bb y Pm evaluado se indican en cada capiacutetulo En la Figura 21 se
muestran los perfiles de pI obtenidos para cada preparado los cuales se correspondieron
con los reportados para los extractos parcialmente purificados de Bromelia hieronymi (Bruno
et al 2003) B balansae (Pardo et al 2000) y Pseudananas macrodontes (Loacutepez et al
2000)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
34
Figura 21 IEF A Bh bandas de pI 59 y 64 (Hironymaiacutena III) pI 76 y 83 (Hieronymaiacutena II) pH ge93
(Hieronymaiacutena I) B Bb banda de pI asymp 5 (Balansaiacutena I) bandas de pI 85 y 87 (balansaiacutena II) C Pm bandas de pI 57 59 (Macrodontaiacutena I) y 61 (Macrodontaiacutena II) D Bro (Bromelina de tallo) banda de pI gt93
La banda de pI asymp 46 para bromelina (Fig21 D) se corresponde a la bromelina de
fruto que estaacute presente en pequentildeas cantidades en los tallos de Ananas comosus (Hale et
al 2005)
En la Figura 22 se observan las bandas caracteriacutesticas todas ellas de alrededor de
25 kDa de las proteasas de Bh (asymp25 kDa) Bb (asymp24 kDa) y Pm (asymp26 kDa) La banda de asymp 29
kDa presente en Bh y la banda de asymp30 kDa contenida en Pm tambieacuten estaacuten presentes en los
extractos crudos respectivos y desaparecen cuando las corridas electroforeacuteticas se hacen
sin previa inhibicioacuten con aacutecido iodoaceacutetico comportamiento frecuente en el caso de
proteasas vegetales que actuacutean de inmediato sobre sus sustratos
Figura 22 SDS-PAGE de Bh Bb y Pm A la izquierda patrones de PM (kDa)
A B C D
Bh Bb Pm
144
201
300
450
660
970
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
35
2222 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina
En la Figura 23 se muestra la actividad porcentual residual de Bh Bb Pm y
bromelina luego de incubarlos con distintas concentraciones de E-64 durante 30 min a 37
ordmC
Figura 23 Actividad residual () de la actividad especiacutefica de Bh Bb Pm y bromelina (Bro) Media plusmn
DE (n=3)
De las curvas de inhibicioacuten de la Figura 23 se obtuvo la concentracioacuten miacutenima de E-
64 que inhibe a cada preparado 30 μM para Bh 10 μM para Bb y Pm 150 μM para 30
mgmL de bromelina las cuales fueron aumentadas un 10 maacutes al momento de obtener los
preparados inhibidos para los distintos ensayos
Cuando los preparados fueron liofilizados (excepto bromelina) previo a la evaluacioacuten
de los distintos efectos se les midioacute la actividad proteoliacutetica y la concentracioacuten de proteiacutenas
Sin embargo se observoacute una aparente inconsistencia en la concentracioacuten de proteiacutenas
medidas la concentracioacuten de proteiacutenas del liofilizado inhibido fue un 15 30 y 70 respecto
de la concentracioacuten del liofilizado sin inhibir para Bh Bb y Pm respectivamente
Habitualmente el proceso de liofilizacioacuten no genera peacuterdida de proteiacutenas en este tipo de
preparaciones Para comprobar si ello se debiacutea a una destruccioacuten parcial de las proteasas
se analizoacute cada material liofilizado por SDS-PAGE lo que permitioacute mostrar la presencia de
las bandas esperadas con intensidad similar en los liofilizados activos e inhibidos
Debido a que Bh era el preparado que aparentemente ldquoperdiacuteardquo maacutes proteiacutenas se lo
eligioacute para hacer ensayos de inhibicioacuten y evitando la liofilizacioacuten determinar el contenido
proteico Para esto se repitioacute el procedimiento de inhibicioacuten descripto en 22151 con 10
30 y 60 μM de E-64 y a cada una de las aliacutecuotas de Bh se le determinoacute la concentracioacuten de
proteiacutenas la actividad proteoliacutetica y el perfil por SDS-PAGE
-5
15
35
55
75
95
0 50 100 150 200 250
Act
ivid
ad r
esi
du
al (
)
E-64 (μM)
Pm
Bb
Bh
Bro
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36
En la Figura 24 se muestran la actividad porcentual residual (A) y el contenido de
proteiacutenas (B) de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 durante 30
min a 37 ordmC
Figura 24 A Actividad porcentual residual () de la actividad proteoliacutetica y de la actividad especiacutefica de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 B Contenido proteico de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 Media plusmn DE (n=3)
Se observa una disminucioacuten en la concentracioacuten de proteiacutenas de Bh al aumentar la
concentracioacuten de E-64 Sin embargo en el SDS-PAGE de las distintas aliacutecuotas de Bh
(Figura 25) no se observa peacuterdida ni disminucioacuten de intensidad de las bandas principales de
Bh aun despueacutes de incubar Bh con 60 μM de E-64
Figura 25 SDS-PAGE Ec extracto crudo de B hieronymi 0 Bco 10 30 y 60 Bh luego de incubarlo con E-64 10 30 y 60 μM respectivamente P patrones de peso molecular (LMW Bio-Rad fosforilasa b 974 kDa seroalbuacutemina 662 kDa ovoalbuacutemina 45 kDa anhidrasa carboacutenica 31 kDa inhibidor de tripsina 215 kDa y lisozima 144 kDa
Por otro lado en la Figura 24 B se observa que luego de inhibir Bh con 30 μM de E-
64 (30) la concentracioacuten de proteiacutenas fue asymp14 de la concentracioacuten de proteiacutenas de Bh sin
inhibir (0) lo cual concuerda con la relacioacuten de proteiacutenas de los liofilizados activo e inhibido
observada para Bh
La aparente inconsistencia entre lo observado en la Figura 24 B y la Figura 25
podriacutea explicarse por la dependencia de la sensibilidad del meacutetodo de Bradford con la
composicioacuten de aminoaacutecidos en la superficie proteica (Lucarini amp Kilikian 1999) Si bien el
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 10 30 60
Pro
teiacuten
as (
mg
ml)
E-64 (μM)
A B
-2
18
38
58
78
98
0 5 10 30 60 80 100
Act
ivid
ad r
esi
du
al (
)
E-64 (μM)
Actividad caseinoliacutetica (Ucasml)
Actividad especiacutefica (Ucasmg)
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37
E-64 interacciona esencialmente con la cisteiacutena del sitio activo de las cisteiacutenendopeptidasas
el inhibidor parece inducir alguacuten cambio conformacional en las proteasas tratadas que afecta
fuertemente la reaccioacuten con el colorante No hemos encontrado referencia alguna a este
comportamiento en la bibliografiacutea consultada
A pesar de esta dificultad en la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas para
los distintos ensayos los preparados inhibidos se obtuvieron inhibieacutendolos seguacuten las
concentraciones de E-64 definidas en 2222 y luego se les midioacute la actividad caseinoliacutetica y
se realizoacute un IEF y un SDS-PAGE La inhibicioacuten fue llevada a cabo al momento previo de la
liofilizacioacuten para los preparados destinados a la evaluacioacuten del efecto antiinflamatorio
(Capiacutetulo 3) ya que los mismos fueron realizados en San Luis y se consideroacute maacutes adecuado
transportarlos ya inhibidos con la caracterizacioacuten ya hecha en el LIProVe En tanto que los
preparados destinados al resto de los ensayos (Capiacutetulos 4 y 5) fueron inhibidos luego de
ser liofilizados previamente a los ensayos
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
38
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3 EFECTO
ANTIINFLAMATORIO
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39
31 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al dantildeo
causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por cualquier agresor de naturaleza
bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica (Garciacutea Barreno 2008) Una respuesta inflamatoria
tiacutepica consta de cuatro componentes los inductores inflamatorios los sensores que los
detectan los mediadores inflamatorios inducidos por los sensores y los tejidos diana o
efectores que se ven afectados por los mediadores Dependiendo de la naturaleza de la
causa desencadenante diferentes combinaciones de los distintos componentes existentes
daraacuten lugar a diferentes respuestas inflamatorias Asiacute las respuestas inflamatorias a la
infeccioacuten y a la lesioacuten tisular esteacuteril tienen diferentes propoacutesitos la primera tiene por objeto
proteger al hueacutesped de la infeccioacuten y se puede acoplar con la induccioacuten de la inmunidad
adaptativa mientras que la segunda sirve principalmente para promover la reparacioacuten de los
tejidos (Medzhitov 2010)
311 Inflamacioacuten aguda
La inflamacioacuten aguda es la respuesta temprana de un tejido ante la lesioacuten es
inespeciacutefica de corta duracioacuten y se caracteriza por cambios en la microcirculacioacuten
exudacioacuten de liacutequido y migracioacuten de leucocitos desde los vasos sanguiacuteneos al aacuterea
afectada Desde el punto de vista cliacutenico se caracteriza por los cinco signos cardinales que
se manifiestan en el aacuterea dantildeada rubor (eritema) calor tumoracioacuten (edema) dolor y
functio laesa (peacuterdida de la funcioacuten por una combinacioacuten de los 4 puntos anteriores) Las
alteraciones morfoloacutegicas y funcionales son una manifestacioacuten de una serie compleja de
eventos interrelacionados respuesta vascular respuesta celular y cooperacioacuten tisular viacutea
mediadores quiacutemicos de la inflamacioacuten (Garciacutea Barreno 2008)
3111 Respuesta vascular
Luego de una vasoconstriccioacuten pasajera de las arteriolas en el sitio de agresioacuten le
sigue una vasodilatacioacuten de las arteriolas precapilares producida por la relajacioacuten del
muacutesculo liso vascular Estos cambios llevan a un aumento del flujo sanguiacuteneo en el aacuterea
lesionada causando rubor y calor
Ciertos mediadores son capaces de producir la contraccioacuten de las ceacutelulas
endoteliales de veacutenulas y capilares lo cual produce separacioacuten de las uniones intercelulares
de dichas ceacutelulas conduciendo a un aumento de la permeabilidad vascular y permitiendo
el pasaje de proteiacutenas y liacutequido al espacio extracelular Este escape neto de fluido se
denomina exudacioacuten Entre las proteiacutenas plasmaacuteticas que exudan estaacute el fibrinoacutegeno el
cual se deposita como fibrina sobre los tejidos extravasculares lo cual disminuye la
permeabilidad tisular evitando la reentrada del exudado al vaso que finalmente conduce a la
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formacioacuten del edema A raiacutez del aumento de la permeabilidad vascular se produce un
aumento de viscosidad sanguiacutenea y el flujo sanguiacuteneo comienza a disminuir permitiendo el
acercamiento de los leucocitos a la pared de los vasos (Roitt 2003)
3112 Respuesta celular
Si bien los tipos celulares presentes en los exudados dependeraacuten del agente
agresor la ceacutelula predominante es el polimorfonuclear (PMN) neutroacutefilo en especial en la
fase temprana de la inflamacioacuten Los leucocitos llegan al sitio lesionado mediante una serie
de pasos marginacioacuten adhesioacuten emigracioacuten y quimiotaxis a traveacutes de la pared vascular
A raiacutez del enlentecimiento del flujo sanguiacuteneo los leucocitos son desplazados hacia
la periferia del vaso lo cual junto al aumento de la viscosidad sanguiacutenea favorece la
marginacioacuten leucocitaria hacia la superficie endotelial Esto les permite adherirse a la
superficie endotelial de los vasos proceso incrementado durante la inflamacioacuten aguda por el
aumento en la expresioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten (CAM) en ceacutelulas endoteliales de las
veacutenulas (P y E-selectinas ICAM PAF etc) y en los leucocitos (MAC-1 LFA-1 PAF-R L-
selectinas etc) Los neutroacutefilos adheridos pueden atravesar el vaso sanguiacuteneo por las
uniones intercelulares y la membrana basal (diapeacutedesis) alcanzando el espacio intersticial
(emigracioacuten) desde donde se dirigen al sitio de inflamacioacuten inducidos por un gradiente de
concentracioacuten de factores quimiotaacutecticos (quimiotaxis) (Roitt 2003)
La fagocitosis llevada a cabo fundamentalmente por macroacutefagos y neutroacutefilos es la
internalizacioacuten y digestioacuten celular de partiacuteculas extrantildeas y requiere el reconocimiento el
englobamiento y la degradacioacuten de la partiacutecula Cuando se trata de un agente inerte y
grande el reconocimiento es directo Las opsoninas son sustancias que recubren la
partiacutecula y favorecen su fagocitosis La destruccioacuten del material se lleva a cabo por las
especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) las especies reactivas de nitroacutegeno y el sistema
halogenador ademaacutes de mecanismos independientes del oxiacutegeno tales como la proteinasa
3 la catepsina G la lisozima y la lactoferrina entre otros Estos efectores junto a los
productos de degradacioacuten son liberados al medio extracelular por lo que los dantildeos
colaterales a los tejidos del hueacutesped resultan inevitables (Nathan 2006)
3113 Mediadores quiacutemicos8
La respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso dispositivo de mediadores
que se organizan en complejas redes reguladoras (Garciacutea Barreno 2008) Se trata de
moleacuteculas solubles que difunden faacutecilmente y actuacutean sobre los receptores de los efectores
Los mediadores pueden provenir de los sistemas plasmaacuteticos (coagulacioacuten complemento
cininas) ser liberados desde graacutenulos almacenados en ceacutelulas (serotonina histamina) o ser
8 En este apartado aquellos paacuterrafos que no contienen citas fueron adaptados convenientemente de Rotelli
(2004)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
41
sintetizados inmediatamente cuando se requieren (eicosanoides) Teniendo en cuenta su
accioacuten y su origen se pueden clasificar como se indica en la Tabla 31
Tabla 31 Clasificacioacuten de mediadores de la inflamacioacuten seguacuten accioacuten y origen
La histamina es un mediador temprano de la inflamacioacuten aguda y es liberado desde
los graacutenulos almacenados en los mastocitos perivasculares luego de ser estimulados por
neuropeacuteptidos liberados desde las terminaciones nerviosas (Benoist amp Mathis 2002)
antiacutegenos IL-1 C3a y C5a (Roitt 2003) entre otros Su accioacuten es mediada por receptores
(H) ubicados a lo largo de todo el lecho vascular principalmente en ceacutelulas del muacutesculo liso
y ceacutelulas endoteliales Sobre el muacutesculo liso produce dilatacioacuten mientras que sobre las
ceacutelulas endoteliales produce contraccioacuten y por tanto aumenta la permeabilidad vascular
estimula la expresioacuten de P-selectinas aumentando la adhesioacuten leucocitaria y estimula la
siacutentesis de NO y prostaciclina (PGI2) ambas con efectos vasodilatadores (Brunton et al
2006)
La serotonina (5-hidroxitriptamina 5-HT) puede tener un efecto vasoconstrictor o
vasodilatador seguacuten el receptor sobre el cual actuacutee sin embargo durante la inflamacioacuten
aguda actuacutea tempranamente provocando vasodilatacioacuten con aumento de permeabilidad
aunque con menor potencia que la histamina
Los eicosanoides son las familias de prostaglandinas (PGs) leucotrienos (LTs) y
compuestos similares que derivan de aacutecidos grasos poliinsaturados esenciales de 20
aacutetomos de carbono Son sintetizados en la membrana celular por activacioacuten de la
fosfolipasa A2 o de la fosfolipasa C las cuales catalizan la liberacioacuten del precursor
eicosanoide (aacutecido araquidoacutenico) desde la membrana celular (Brunton et al 2006)
A partir del aacutecido araquidoacutenico se inician dos viacuteas principales de siacutentesis la viacutea de
la ciclooxigenasa (COX) la cual conduce a la formacioacuten de PGs prostaciclinas (PGIs) y
tromboxanos (TXAs) y la viacutea de la lipooxigenasa la cual conduce a la siacutentesis de LTs
Mediadores que incrementan la permeabilidad vascular en el edema inflamatorio
Vasoactivos derivados de ceacutelulas Vasoactivos derivados del plasma
-Aminas bioacutegenas serotonina histamina
-Eicosanoides
-Factor activador de plaquetas (PAF)
-Oxido niacutetrico (NO)
-Cininas
-Cascada de coagulacioacuten
-Sistema de complemento
Mediadores involucrados en el reclutamiento celular (Factores quimiotaacutecticos)
-C5a C3a
-Eicosanoides (LTB4)
-Quimiocinas
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Existen dos isoformas de la COX COX-1 expresada de manera constitutiva en la mayoriacutea
de las ceacutelulas y COX-2 inducida por citocinas y factores de crecimiento entre otros
estiacutemulos
Los leucotrienos LTC4 y LTD4 aumentan la permeabilidad vascular aumentando el
exudado de plasma El LTB4 ademaacutes de aumentar la permeabilidad es un potente agente
quimiotaacutectico aumenta la adherencia y emigracioacuten de los neutroacutefilos a traveacutes del endotelio y
estimula la degranulacioacuten y la siacutentesis de superoacutexido en los PMNs
Mientras que la PGF2 es vasoconstrictora PGE2 y PGI2 son vasodilatadoras y
aumentan el edema y la infiltracioacuten de leucocitos en el aacuterea inflamada Sin embargo PGE2
puede actuar como inmunosupresor inhibe la liberacioacuten de los productos lisosomales de los
neutroacutefilos y macroacutefagos asiacute como la participacioacuten de leucocitos en reacciones de
hipersensibilidad tardiacutea (Brunton et al 2006)
El factor activador de plaquetas (PAF) ademaacutes de ser un potente estimulador de la
agregacioacuten y activacioacuten plaquetaria aumenta la permeabilidad vascular la quimiotaxis y la
adhesioacuten de neutroacutefilos al endotelio asiacute como la generacioacuten de superoacutexido y enzimas
lisosomales desde los PMNs Al actuar sobre receptores acoplados a proteiacutenas G activa las
fosfolipasas A2 y C estimulando la siacutentesis de TXA2 PGs y LTs La trombina e histamina
estimulan su expresioacuten en las ceacutelulas endoteliales Se sintetiza en mastocitos plaquetas
neutroacutefilos eosinoacutefilos monocitos y NK (ldquonatural killersrdquo)
El oacutexido niacutetrico (NO) es un potente vasodilatador potencia la citotoxicidad de los
fagocitos y activa las COX-1 y COX-2 (Salvemini et al 1993) Es sintetizado por dos
isoformas de la oacutexido niacutetrico sintasa (NOS) La NOS constitutiva (c-NOS) estaacute presente en
plaquetas y ceacutelulas endoteliales y produce pequentildeas cantidades de NO La NOS inducible
(i-NOS) se expresa en muacuteltiples ceacutelulas tales como neutroacutefilos macroacutefagos ceacutelulas
endoteliales y muacutesculo liso vascular Diversos agentes vasoactivos (serotonina histamina
bradicinina trombina y estiacutemulos fiacutesicos) estimulan la siacutentesis de NO en las ceacutelulas
endoteliales
Las cininas (bradicinina plasmaacutetica y calidina tisular) son peacuteptidos derivados por
accioacuten de calicreiacutenas del cininoacutegeno plasmaacutetico (cininoacutegeno de alto peso molecular) y del
cininoacutegeno tisular (cininoacutegeno de bajo peso molecular) La calicreiacutena plasmaacutetica es activada
a partir de la precalicreiacutena por accioacuten del factor XII el cual a su vez es activado por contacto
con superficies cargadas negativamente (colaacutegeno heparina productos plaquetarios etc)
Las cininas tienen propiedad vasodilatadora (sobre arteriolas) y vasoconstrictor (sobre
arterias y venas de gran calibre) asiacute como tambieacuten aumentan la permeabilidad en la
microcirculacioacuten y estimulan la siacutentesis de PGs por activacioacuten de fosfolipasas A2 y C En
macroacutefagos estimulan la liberacioacuten de la interleucina IL-1 y del factor de necrosis tumoral
(TNF-α) Uno de sus receptores (B1) es inducible por dantildeo tisular e inflamacioacuten
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El paso final de la coagulacioacuten es la formacioacuten de fibrina la cual no soacutelo frena el
sangrado permitiendo la reparacioacuten del aacuterea lesionada sino que tambieacuten forma una malla en
la que quedan atrapados los agentes agresores impidiendo su diseminacioacuten Por otro lado
durante la formacioacuten de la fibrina se liberan fibrinopeacuteptidos A y B desde el fibrinoacutegeno los
cuales actuacutean como quimiotaacutecticos de los PMNs y potencian los efectos de la bradicinina
El sistema del complemento estaacute formado por proteiacutenas plasmaacuteticas (C) que actuacutean
en forma de cascada en la que cada enzima activa la siguiente La activacioacuten es
desencadenada por complejos antiacutegeno-anticuerpo y productos bacterianos Como
consecuencia de su activacioacuten se forman productos con propiedad opsonizante
quimiotaacutectica y capacidad liacutetica sobre ceacutelulas diana Los productos C5a y C3a estimulan el
estallido respiratorio en los fagocitos desencadenan la liberacioacuten de mediadores (histamina
PAF IL-3 4 5 y 6 entre otros) asiacute como la siacutentesis de LTs PGs y TXs desde mastocitos y
basoacutefilos C5a y en menor medida C3a es un potente agente quimiotaacutectico de neutroacutefilos
ademaacutes de estimular la siacutentesis de eicosanoides C5a tambieacuten genera vasodilatacioacuten y
aumento de la permeabilidad capilar C5a y C3a tambieacuten se pueden formar por accioacuten de la
plasmina la calicreiacutena y enzimas leucocitarias
Bajo el estiacutemulo local el macroacutefago hiacutestico libera las citocinas IL-1 y TNF-α entre
otros mediadores las cuales actuacutean estimulando las ceacutelulas endoteliales (luego de la
trombina o la histamina) ceacutelulas epiteliales y fibroblastos a liberar quimiocinas (MCP-1) Las
quimiocinas actuacutean sobre diversos tipos leucocitarios conducieacutendolos al sitio inflamado IL-8
es un potente quimiotaacutectico para neutroacutefilos pero tambieacuten para linfocitos (Roitt 2003)
312 Regulacioacuten y resolucioacuten de la inflamacioacuten
La finalizacioacuten de la respuesta inflamatoria y la transicioacuten al estado homeostaacutetico es
un proceso activo y altamente regulado conocido como la resolucioacuten de la inflamacioacuten
(Medzhitov 2010) Entre los mecanismos reguladores identificados se pueden mencionar
proteiacutenas reguladoras del complemento el factor transformante β (TGF-β) las IL-4 y IL-10
la PGE2 y los glucocorticoides endoacutegenos que actuacutean regulando la proliferacioacuten y
activacioacuten de las ceacutelulas inflamatorias (Roitt 2003) las lipoxinas (producidas por la 15-
lipooxigenasa en los tejidos) inhiben el reclutamiento de neutroacutefilos y promueven el
reclutamiento de los monocitos que eliminan las ceacutelulas muertas e inician la reparacioacuten del
tejido las resolvinas y protectinas (derivadas del aacutecido eicosapentanoico y del
docosahexanoico) tienen un papel crucial en la resolucioacuten de la inflamacioacuten junto a las
lipoxinas (Medzhitov 2008) los fosfoliacutepidos de las membranas de las ceacutelulas endoteliales
vasculares oxidados por las ROS disminuyen la expresioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten
(Brash 1999)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Dependiendo de la cantidad de tejido destruido y la naturaleza del agente agresor la
inflamacioacuten puede generar secuelas tales como la cicatrizacioacuten y la formacioacuten de abscesos
La cicatrizacioacuten ocurre cuando hay dantildeo sustancial al tejido conectivo yo el tejido
carece de la capacidad para regenerar ceacutelulas especializadas Los tejidos muertos y el
exudado inflamatorio agudo se reemplazan por un tejido conectivo vascular especializado
llamado tejido de granulacioacuten el cual produce gradualmente colaacutegeno para formar una
cicatriz fibrosa A pesar de la peacuterdida de algunas ceacutelulas especializadas y algo de distorsioacuten
arquitectoacutenica de la cicatriz fibrosa se restablece la integridad estructural
La formacioacuten de abscesos es un proceso que tiene lugar cuando la reaccioacuten
inflamatoria aguda no puede destruireliminar el agente agresor y continuacutea con un
componente de la inflamacioacuten croacutenica Esto es maacutes comuacuten en el caso de la infeccioacuten por
bacterias pioacutegenas (Woolf et al 2002)
313 Inflamacioacuten croacutenica
Cuando la inflamacioacuten se mantiene durante un tiempo prolongado (semanas o
meses) se habla de inflamacioacuten croacutenica en la que coexisten el dantildeo tisular y los intentos
de reparacioacuten Puede producirse por mantenimiento de la inflamacioacuten aguda (si no se
resuelve la causa) o bien empezar de manera progresiva y poco evidente sin las
manifestaciones de la inflamacioacuten aguda Este segundo caso es el responsable del dantildeo
tisular de algunas enfermedades como la artritis reumatoide la aterosclerosis la
tuberculosis y la fibrosis pulmonar Ademaacutes es importante en el desarrollo del caacutencer y en
enfermedades que anteriormente se consideraban exclusivamente degenerativas como el
Alzheimer Entre las causas de la inflamacioacuten croacutenica se pueden distinguir las infecciones
persistentes (micobacterias ciertos hongos virus y paraacutesitos) las enfermedades mediadas
por el sistema inmune (artritis reumatoide reacciones aleacutergicas enfermedad de Crohn y
esclerosis muacuteltiple) y la exposicioacuten prolongada a agentes toacutexicos (polvo de siacutelice fibras
suturas y cuerpos extrantildeos que no pueden ser removidos por fagocitosis) (Kumar 2009)
Ante la persistencia durante diacuteas del agente agresor los PMNs son reemplazados
por ceacutelulas mononucleares (macroacutefagos linfocitos y ceacutelulas plasmaacuteticas) si bien pueden
persistir algunos neutroacutefilos Los macroacutefagos presentan una morfologiacutea variable secretan
mediadores de inflamacioacuten regulan la actividad de linfocitos y favorecen la proliferacioacuten y el
desarrollo de fibroblastos y ceacutelulas endoteliales Durante la fase proliferativa de la
inflamacioacuten croacutenica los fibroblastos restauran la matriz del tejido conectivo dantildeado
conduciendo a la fibrosis en tanto que la proliferacioacuten de ceacutelulas endoteliales favorece la
formacioacuten de pequentildeos capilares (angiogeacutenesis)
Un tipo morfoloacutegico de la inflamacioacuten croacutenica es la inflamacioacuten granulomatosa
caracterizada por una coleccioacuten organizada de macroacutefagos los cuales forman ceacutelulas
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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epiteliodes o se fusionan formando ceacutelulas gigantes ante la imposibilidad de digerir el agente
fagocitado Independientemente de su causa los granulomas pueden contener otras ceacutelulas
(linfocitos neutroacutefilos eosinoacutefilos fibroblastos) ademaacutes de fibrosis (Mukhopadhyay et al
2012) El proceso de formacioacuten de granulomas se puede dividir en 4 fases (iniciacioacuten
acumulacioacuten efectora y de resolucioacuten) en las cuales las ceacutelulas T tienen un rol
importante Durante la iniciacioacuten los macroacutefagos son atraiacutedos por el estiacutemulo inflamatorio y
comienza a nuclear la lesioacuten granulomatosa Durante la acumulacioacuten ceacutelulas T CD4+ se
acumulan en el sitio y reclutan otras ceacutelulas efectoras incluyendo ceacutelulas T maacutes
macroacutefagos y en algunos casos eosinoacutefilos Durante la fase efectora las ceacutelulas intentan
reducir la carga de patoacutegenos Por uacuteltimo una vez que la amenaza del patoacutegeno ha sido
reducida o eliminada la infiltracioacuten celular se reduce y se induce la formacioacuten del tejido
cicatricial (Co et al 2004) Las infecciones micoacuteticas la tuberculosis la lepra y la presencia
de cuerpos extrantildeos (talco suturas etc) son algunas de las causas de la inflamacioacuten
granulomatosa
En la inflamacioacuten no granulomatosa las ceacutelulas se encuentran diseminadas Se
caracterizan por la acumulacioacuten de linfocitos sensibilizados por antiacutegenos ceacutelulas
plasmaacuteticas y macroacutefagos Puede observarse necrosis tisular y fibrosis Las causas maacutes
comunes son las infecciones virales croacutenicas y las enfermedades autoinmunes entre otras
(Rotelli 2004)
314 Proteasas como antiinflamatorios
El rol de las proteasas como agentes antiinflamatorios especialmente el de la
tripsina es considerado desde la deacutecada del 50 en varios estudios (Martin et al 1954
Cohen et al 1955) En 1957 Innerfield reporta el efecto antiinflamatorio de la tripsina
administrada intramuscularmente en pacientes con tromboflebitis con gran componente
edematoso Atribuye a la proteasa un aumento en la permeabilidad tisular una disminucioacuten
en la viscosidad de los exudados y la reversioacuten del edema asiacute como la superacioacuten de la
isquemia en los tejidos con inflamacioacuten aguda al eliminar las barreras exudativas
extravasculares al flujo sanguiacuteneo en los pequentildeos vasos comprimidos
Un antecedente importante en el estudio de la accioacuten antiedematosa de las
proteasas cisteiacutenicas es el trabajo de Netti et al (1972) quienes compararon los efectos de
proteasas y agentes antiinflamatorios conocidos sobre edemas inducidos por distintos
agentes flogiacutesticos en pata de rata Los porcentajes de inhibicioacuten de edema para ficina
bromelina al igual que para un concentrado de enzimas proteoliacuteticas pancreaacuteticas fueron
iguales o superiores a los de indometacina acido acetilsaliciacutelico y fenilbutazona mientras
que la papaiacutena a la concentracioacuten ensayada no fue efectiva frente a ninguacuten edema En los
modelos animales la viacutea de administracioacuten de las preparaciones proteoliacuteticas es en su
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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mayoriacutea oral aunque la eficacia antiedematosa de la bromelina administrada
intraperitonealmente tambieacuten ha sido comprobada (Smyth et al 1962 Uhlig amp Seifert
1981)
3141 Bromelina
Desde su introduccioacuten comercial en 1957 se han publicado resultados cientiacuteficos
que revelan los efectos antitromboacutetico fibrinoliacutetico y antiinflamatorio de la bromelina
evaluados mediante ensayos in vivo e in vitro (Maurer 2001) Ademaacutes de los modelos de
edema ya mencionados otros modelos experimentales de inflamacioacuten en los que la
bromelina ha sido efectiva son los siguientes encefalomielitis aleacutergica experimental (un
modelo experimental de la esclerosis muacuteltiple humana) asma aleacutergico pleuritis inducida por
carragenina enfermedades reumatoloacutegicas en ratoacuten arterioesclerosis inmunoloacutegicamente
mediada en aloinjertos aoacuterticos de rata y enfermedad inflamatoria intestinal en ratones IL-10-
- (Fitzhugh et al 2008 Secor et al 2012)
Una serie de estudios cliacutenicos controlados reportaron la eficacia de la bromelina
frente a edema inflamacioacuten dolor hematomas entre otros signos en sinusitis aguda
traumatismos en cara cabeza y extremidades inferiores tumefaccioacuten post-operatoria
inflamacioacuten e hinchazoacuten post-traumaacutetica y cirugiacutea oral (Maurer 2001)
El uso de la bromelina como antiinflamatorio o analgeacutesico en la artritis reumatoide fue
sugerido por Cohen amp Goldman (1964) Maacutes recientemente la bromelina ha sido evaluada
para la artrosis en varios estudios cliacutenicos abiertos o de equivalencia disentildeados para
determinar la efectividad comparativa y la seguridad respecto al tratamiento estaacutendar con
antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) Dichos estudios sugieren que la bromelina sola o
en complejos enzimaacuteticos (PHL9 WOB10 y WOB-N11) puede ser beneficiosa o tan eficaz
como el tratamiento con AINEs mostrando buena tolerabilidad y leves reacciones adversas
(principalmente siacutentomas gastrointestinales) Sin embargo la mayoriacutea de los estudios tienen
determinados problemas metodoloacutegicos que hacen difiacutecil extraer conclusiones definitivas
(Brien et al 2004 2006)
En un estudio de nivel II de medicina basada en la evidencia (EBM) se ha
demostrado que el tratamiento con bromelina en nintildeos con sinusitis aguda puede ser
considerada como segura y beneficiosa (Braun et al 2005)
El efecto antiinflamatorio de la bromelina puede ser explicado por su accioacuten sobre
distintos niveles del complejo proceso inflamatorio como se sentildeala a continuacioacuten
9 PHL Phlogenzyme contiene bromelina tripsina y rutina
10 WOB Wobenzyme contiene bromelina papaiacutena tripsina quimotripsina pancreatina lipase y amilasa
11 WOB-N contiene bromelina tripsina papaiacutena quimotripsina pancreatina y rutina
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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31411 Efecto sobre los componentes de la coagulacioacuten
En el modelo edema de pata inducido por carragenina la accioacuten antiinflamatoria de
bromelina fue correlacionado con el aumento de la actividad fibrinoliacutetica seacuterica (Pirotta amp
Giuli-Morghen 1978) Ademaacutes la bromelina ha mostrado aumentar la concentracioacuten de
plasmina seacuterica (Smyth et al 1962) la activacioacuten de plasminoacutegeno a plasmina (Maurer et
al 2000) y disminuir el nivel seacuterico de fibrinoacutegeno (Livio et al 1978) Todos estos efectos
disminuiriacutean la deposicioacuten de fibrina en el aacuterea inflamada produciendo un aumento en la
permeabilidad tisular y vascular lo que promoveriacutea la reabsorcioacuten del fluido del edema
(Maurer 2001)
31412 Efecto sobre el sistema de calicreiacutenas
En el modelo de inflamacioacuten en ratas ldquobolsa de airerdquo inducido por caoliacuten la bromelina
redujo de manera dosis-dependiente el nivel de bradicinina en el sitio de inflamacioacuten y el
nivel de precalicreiacutena seacuterica los que fueron correlacionados con la reduccioacuten del exudado
plasmaacutetico (Kumakura et al 1988) explicando la accioacuten antiedematosa asiacute como
analgeacutesica de la bromelina
31413 Efecto sobre las viacuteas de la COX y la NOS
Los niveles de PGE2 asiacute como de sustancia P (un neuropeacuteptido asociado a la
percepcioacuten del dolor) se encontraron disminuidos en el exudado inflamatorio generado en
ratas por la implantacioacuten de esponjas embebidas en carragenina (Gaspani et al 2002) En
otro modelo inflamatorio la bromelina redujo de manera dosis-dependiente los niveles de
PGE2 y TXs junto con el volumen de exudado (Vellini et al 1986) Maacutes recientemente la
bromelina ha mostrado reducir la expresioacuten de la COX-2 y PGE2 por inhibicioacuten en la
translocacioacuten del factor nuclear kappa-B (NF-ĸB) en ceacutelulas tumorales asiacute como en modelos
experimentales de caacutencer (Chobotova et al 2010 Bhui et al 2012)
La administracioacuten oral de bromelina mejoroacute la disminucioacuten de la defecacioacuten en ratas
postoperatorias laparotomizadas al menos en parte mediante la inhibicioacuten de la
sobreexpresioacuten de la i-NOS del colon a traveacutes de la ruta del NF-kB (Wen et al 2006)
31414 Modulacioacuten de moleacuteculas de superficie celular
La bromelina ha mostrado remover moleacuteculas de superficie celular en leucocitos
(granulocitos monocitos y linfocitos) asociadas con la adhesioacuten y la activacioacuten leucocitaria
(Hale et al 2002) La reduccioacuten de la migracioacuten de neutroacutefilos en tres modelos murinos de
migracioacuten leucocitaria en cavidad intraperitoneal inflamada fue asociada a la remocioacuten de L-
selectina y principalmente de CD128 (receptor del quimioatractante IL-8) desde la superficie
leucocitaria lo que llevoacute a la eliminacioacuten de la adhesioacuten de alta afinidad mediada por
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
48
integrinas de los vasos sanguiacuteneos del sitio inflamado (Fitzhugh et al 2008) La bromelina
activa proteoliacuteticamente redujo la expresioacuten de CD25 (presente en la superficie de ceacutelulas T
activas que actuacutea como receptor del factor de proliferacioacuten IL-2) de manera dosis y tiempo
dependiente en ensayos in vitro y se propuso como mecanismo el clivaje proteoliacutetico de
CD25 desde la superficie celular (Secor et al 2009) Tambieacuten se ha sugerido que bromelina
podriacutea mediar su efecto antiinflamatorio actuando como moleacutecula de sentildealizacioacuten sobre los
receptores activados por proteasas (PAR) (Engwerda et al 2001 Muumlller et al 2012)
31415 Activacioacuten celular y produccioacuten de citoquinas
La bromelina mostroacute inhibir la transduccioacuten de sentildeales (viacutea MAPKERK-2) y la
produccioacuten de citoquinas (IL-4 IL-2 e IFN-γ) desde ceacutelulas T accioacuten que fue revertida al
inhibir la actividad proteoliacutetica de bromelina (Mynott et al 1999) En un modelo murino de la
enfermedad aleacutergica respiratoria ya establecida la bromelina redujo significativamente el
contenido de ceacutelulas T (CD4 y CD8) en el lavado bronqueoalveolar (BAL) sin afectar el
nuacutemero de ceacutelulas en el bazo o los ganglios linfaacuteticos hiliares ademaacutes de una disminucioacuten
de IL-4 IL-12 IL-17 asiacute como de IFN-α en el suero (Secor et al 2012)
La bromelina regula la produccioacuten de IFN-γTNF-α IL-1β e IL-6 de forma dependiente
de las condiciones inflamatorias La secrecioacuten de TNF-α IL-1β e IL-6 desde ceacutelulas
mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) obtenida de voluntarios sanos asiacute como de
macroacutefagos de ratoacuten seriacutea estimulada in vitro por la bromelina mediante un mecanismo
dependiente de IFN-γ Sin embargo en situaciones en las que las ceacutelulas inmunes ya han
sido estimuladas la bromeliacutena reduce la produccioacuten elevada de TNF-α IL-1β e IL-6 Por
ejemplo en presencia de lipopolisacaacuterido (LPS) un inductor de la reaccioacuten de inflamacioacuten
aguda bromelina reduce la expresioacuten de dichas citocinas desde PBMC (Chobotova et al
2010) Esta probable dualidad tambieacuten ha sido observada en modelos in vivo donde la
bromelina ha mostrado ser capaz tanto de mejorar como de inhibir las respuestas inmunes
dependientes de ceacutelulas T lo cual podriacutea depender del entorno inmunoloacutegico particular en el
que se la administra (Engwerda et al 2001)
Maacutes recientemente en un ensayo cliacutenico aleatorio controlado con placebo la
bromelina ha mostrado modular las respuestas celulares de linfocitos (cambio significativo
en el perfil circadiano de IFN-γ) despueacutes de su administracioacuten oral en voluntarios sanos
(Muumlller et al 2012)
Las evidencias experimentales dan cuenta de que la bromelina tendriacutea accioacuten sobre
muacuteltiples dianas y si bien su mecanismo antiinflamatorio no ha sido completamente
dilucidado numerosos efectos estaacuten mediados por su actividad proteoliacutetica (Pirotta amp Giuli-
Morghen 1978 Hale amp Haynes 1992 Mynott et al 1999 Hale et al 2002 Wen et al
2006 Hale et al 2005 Fitzhugh et al 2008 Secor et al 2009)
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32 Objetivos
Dentro del objetivo general de estudiar el posible efecto antiinflamatorio de los
extractos ricos en cisteiacutenendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) B
balansae (Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) se plantearon los siguientes objetivos
especiacuteficos
Evaluar el efecto de Bh Bb y Pm sobre la inflamacioacuten aguda y croacutenica empleando
modelos de inflamacioacuten en animales
Determinar si los efectos medidos tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los
extractos
Comparar los efectos de Bh Bb y Pm con los medidos para bromelina
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33 Materiales y meacutetodos
331 Modelos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria provocada por distintos estiacutemulos (isquemia agentes
infecciosos injuria quiacutemica teacutermica o mecaacutenica interaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo) puede ser
medida por los signos cliacutenicos que la acompantildean eritema edema dolor e hiperalgesia Una
serie de mecanismos dan lugar a distintas fases en que puede caracterizarse al proceso
inflamatorio
-Fase aguda transitoria caracterizada por vasodilatacioacuten local e incremento de la
permeabilidad capilar
-Fase subaguda caracterizada por infiltracioacuten de leucocitos y ceacutelulas fagociacuteticas
-Fase croacutenica proliferativa en la cual aparece una degeneracioacuten del tejido y fibrosis
Diferentes modelos desarrollados en animales de experimentacioacuten permiten
reproducir dichas fases (Vogel 2002) proporcionando un meacutetodo necesario para el
descubrimiento del uso apropiado de nuevos agentes terapeacuteuticos (Willoughby 2003)
El efecto antiinflamatorio de los preparados proteoliacuteticos fue evaluado usando
modelos de inflamacioacuten aguda o subaguda (edema de pata de rata) y un modelo de
inflamacioacuten croacutenica proliferativa (test del granuloma)
3311 Modelos de inflamacioacuten aguda Edema de pata de rata
Este modelo se basa en medir la capacidad de los agentes antiinflamatorios de
inhibir el edema producido en la pata trasera de ratas o ratones luego de la inyeccioacuten de un
agente flogiacutestico El efecto antiinflamatorio medido asiacute como su duracioacuten dependen de la
sustancia empleada como agente flogiacutestico (Vogel 2002)
33111 Edema de pata inducido por carragenina
Los carragenanos son un grupo complejo de polisacaacuteridos formados por la repeticioacuten
de monoacutemeros de galactosa modificada y son de tres tipos principales lambda kappa y
iota En el modelo de edema de pata la carragenina tipo lambda es inyectada
subcutaacuteneamente en la pata trasera La respuesta inflamatoria generada se caracteriza por
edema hiperalgesia y eritema y se cuantifica por el aumento de tamantildeo de la pata a raiacutez del
edema formado el cual es maacuteximo alrededor de las 5 h posteriores a la inyeccioacuten de
carragenina (Morris 2003)
El incremento en el volumen del edema es dependiente del tiempo y su desarrollo ha
sido descripto como un proceso bifaacutesico (Vinegar et al 1969 Salvemini et al 1996) La
fase temprana (0-1 h) se caracteriza por la liberacioacuten de histamina e 5-hidroxitriptamina (5-
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
51
HT) y le sigue un corto periacuteodo (asymp15-25 h) en que se libera bradicinina (Di Rosa et al
1971) mientras que la fase tardiacutea (asymp25-10 h) ha sido correlacionada con la produccioacuten de
prostaglandinas (PGs) atribuida a la induccioacuten de la ciclooxigenasa inducible (COX-2)
(Seibert et al 1994) La infiltracioacuten y activacioacuten de neutroacutefilos contribuye a la respuesta
inflamatoria principalmente de la fase tardiacutea por liberacioacuten de radicales libres derivados del
oxiacutegeno (O2- radicales hidroxilo) El oacutexido niacutetrico (NO) producido por la oacutexido niacutetrico sintasa
constitutiva (c-NOS) en la primera fase y por la oacutexido niacutetrico sintasa inducible (i-NOS) en la
fase tardiacutea actuacutea como un potente vasodilatador y tendriacutea un rol clave en el mantenimiento
de la respuesta inflamatoria tardiacutea al aumentar la produccioacuten de PGs por activacioacuten de la
COX-2 (Salvemini et al 1996)
La inhibicioacuten del edema de pata inducido por carragenina ha demostrado ser
altamente predictivo de la accioacuten antiinflamatoria del faacutermaco en la enfermedad inflamatoria
humana y las dosis de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en este modelo se
correlacionan bien con la dosis eficaz en los pacientes (Morris 2003)
331111 Procedimiento experimental
En la pata trasera izquierda de cada animal se realizoacute una inyeccioacuten subplantar de
01 mL de carragenina lambda tipo IV (Sigma Aldrich) al 2 en solucioacuten fisioloacutegica Una
hora antes cada lote de animales recibioacute intraperitonealmente (05 mL) los preparados a
ensayar El lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 y como control positivo se
usoacute 10 mgml de indometacina (Sigma Aldrich) o 50 mgml de diclofenac soacutedico (Sigma
Aldrich) Los voluacutemenes de las patas traseras fueron medidos con un pletismoacutemetro a
distintos tiempos post-inyeccioacuten de carragenina (1 3 5 y 7 h)
Aquellos preparados que mostraron tener un efecto antiinflamatorio durante la
primera hora en el modelo de edema inducido por carragenina fueron probados en modelos
de edema inducido por mediadores de la fase temprana histamina y serotonina
33112 Edema de pata inducido por histamina
La histamina a traveacutes de sus receptores (H) distribuidos en el lecho vascular
produce vasodilatacioacuten e hiperpermeabilidad capilar Luego de ser administrada produce un
efecto vasodilatador de muy corta duracioacuten dando lugar a hiperemia enrojecimiento y
edema
331121 Procedimiento experimental
Los animales recibieron en la pata trasera izquierda una inyeccioacuten subplantar de 01
mL de histamina clorhidrato (Sigma Aldrich) al 01 en solucioacuten fisioloacutegica Una hora antes
a cada lote se le administroacute intraperitonealmente 05 mL de los preparados a ensayar y el
lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Mediante la utilizacioacuten de un
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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pletismoacutemetro se midioacute el volumen de edema a los 15 30 y 60 min despueacutes de la
administracioacuten de histamina (Rotelli 2004)
33113 Edema de pata inducido por serotonina
En la inflamacioacuten aguda la serotonina (o 5-HT) produce vasodilatacioacuten e
hiperpermeabilidad vascular aunque con menor potencia que la histamina
331131 Procedimiento experimental
Cada animal recibioacute en su pata trasera izquierda una inyeccioacuten subplantar de 01 mL
de serotonina clorhidrato (Sigma Aldrich) al 001 en solucioacuten fisioloacutegica Una hora antes
cada lote recibioacute intraperitonealmente 05 mL de los preparados a ensayar y el lote control
recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Mediante la utilizacioacuten de un pletismoacutemetro se
midioacute el volumen de edema a los 30 60 y 120 minutos posteriores a la administracioacuten de la
serotonina (Rotelli 2004)
33114 Equipamiento medidas y caacutelculo del volumen de edema
Las medidas del volumen de las patas traseras fueron realizadas mediante el uso de
un pletismoacutemetro (Ugo Basile 7140) que consiste en una celda conteniendo liacutequido en la
cual se sumerge la pata y un transductor que transforma el volumen de liacutequido desplazado
en una sentildeal eleacutectrica la cual se lee como volumen de la pata con una precisioacuten de 001
mL
La celda estaacute constituida por dos tubos interconectados en uno de los cuales se
sumerge la pata y el desplazamiento de agua producido genera un cambio en el nivel del
liacutequido en el segundo tubo donde se encuentra el transductor Este uacuteltimo consiste en dos
pares de electrodos de Pt-Ir Un par de electrodos (electrodo de nivel) mide la conductancia
y la conductividad del liacutequido Por estar los electrodos parcialmente sumergidos la
conductancia es proporcional al nivel del liacutequido y por lo tanto al volumen de la pata Un
segundo par de electrodos (electrodos de compensacioacuten) por estar totalmente sumergidos
soacutelo son sensibles a la conductividad y a traveacutes de un circuito electroacutenico corrigen la lectura
del electrodo de nivel de manera que la sentildeal resultante es proporcional a la conductancia y
por tanto al volumen sumergido El liacutequido contenido en la celda es una solucioacuten de NaCl al
5 conteniendo un agente tensioactivo (proporcionado por el fabricante) que minimiza el
menisco de lectura12
Ambas patas traseras fueron marcadas con una fibra indeleble por encima del
maleacuteolo lateral y cada una fue sumergida hasta hacer coincidir la marca con el menisco del
liacutequido momento en el cual se registroacute la medida del volumen Cada volumen fue medido
12
httpwwwugobasilecomcataloguecategorypain_and_inflammationproduct37140_plethysmometerhtml
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
53
por triplicado en todos los tiempos de medida El volumen de edema fue calculado por la
resta de los voluacutemenes promedio de ambas patas
3312 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma
Meier et al (1950) demostraron que el implante de algodones esteacuteriles en ratas
produciacutean granulomas de cuerpo extrantildeo caracterizados por tejido conectivo no
diferenciado ceacutelulas gigantes e infiltracioacuten de fluido Despueacutes de varios diacuteas el incremento
del peso del pellet implantado puede ser medido constituyendo una medida del tejido
granulomatoso y por lo tanto de la respuesta inflamatoria (Vogel 2002) Este meacutetodo ha
demostrado ser uacutetil para la demostracioacuten de la actividad farmacoloacutegica de los esteroides
como antiinflamatorios (Bailey et al 1982)
El desarrollo del edema implica distintos eventos Tempranamente en la vecindad
del algodoacuten se producen sustancias quimiotaacutecticas para neutroacutefilos y monocitos Durante los
primeros 5 diacuteas despueacutes de la implantacioacuten se demostroacute la continua acumulacioacuten de ceacutelulas
polimorfonucleares (PMNs) principalmente neutroacutefilos que penetraban al algodoacuten desde la
periferia Entre los diacuteas 5 y 7 los estudios histoloacutegicos mostraron que la amplia
vascularizacioacuten se llevaba a cabo con la formacioacuten de una caacutepsula fibrosa junto con una
infiltracioacuten masiva de la caacutepsula por las ceacutelulas mononucleares El aumento en el peso del
granuloma resulta significativo recieacuten a partir del diacutea 5 (Bailey et al 1982)
33121 Procedimiento experimental
Ratas hembra fueron anestesiadas por inyeccioacuten intraperitoneal de una mezcla
conteniendo 75 mgkg de ketamina clorhidrato (Holliday Scott SA) y 12 mgkg de xilacina
clorhidrato (Richmond Laboratories Vet Pharma) El granuloma fue inducido por el implante
subcutaacuteneo de un pellet de algodoacuten esteacuteril (50 mg) en el aacuterea dorsal Un diacutea despueacutes del
implante los animales fueron divididos en lotes de 6 animales e inyectados
intraperitonealmente (05 mL) con los preparados a ensayar Como control positivo se usoacute
un lote administrado con dexametasona fosfato soacutedico (adquirida a Norgreen y a Klonal) en
tanto que el lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 La administracioacuten fue
repetida diariamente durante los 5 diacuteas siguientes El 7mo diacutea las ratas fueron pesadas y
luego de sacrificarlas por dislocacioacuten cervical se les extrajo el granuloma el timo y el bazo
los cuales tambieacuten fueron pesados El aumento en el peso del algodoacuten introducido permitioacute
cuantificar el tejido inflamatorio (granulomatoso) depositado en el algodoacuten (Meier et al
1950)
3313 Caacutelculo del efecto antiinflamatorio y anaacutelisis estadiacutestico
Los datos obtenidos se analizaron estadiacutesticamente mediante ANOVA con posterior
comparacioacuten por las pruebas de Tukey o Dunnett El grado de significancia de las
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
54
diferencias entre los lotes fue evaluado con el paraacutemetro p consideraacutendose
estadiacutesticamente significativo un p lt 005 () Para el procesamiento de los datos se empleoacute
el programa GraphPad Prism Version 500 En los graacuteficos y en las tablas los resultados se
expresan como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de la media (SEM) En todos los casos
salvo excepciones que son especificadas el nuacutemero de reacuteplicas por experimento (n) fue = 6
Los porcentajes de inhibicioacuten de la inflamacioacuten como una medida de la accioacuten
antiinflamatoria fueron calculados con la siguiente foacutermula
inhibicioacuten = (1 - VT VC) x 100
siendo VC la medida promedio para el lote control (volumen para los modelos de edema de
pata de rata masa para el test del granuloma) y VT la medida promedio para el lote que fue
tratado con la droga en estudio La misma foacutermula fue usada para calcular los porcentajes
de reduccioacuten de las masas del timo y del bazo
332 Animales
En todos los ensayos de inflamacioacuten fueron empleadas ratas Wistar de ambos sexos
proporcionadas por el bioterio de la Universidad Nacional de San Luis En el laboratorio
fueron pesadas y distribuidas en lotes de 6 dejadas en jaulas y abastecidas con alimento y
agua ad libitum durante el periacuteodo de los ensayos Para los modelos de inflamacioacuten aguda
se emplearon animales de entre 170 y 220 g y luego de los ensayos fueron sacrificados
mediante una corriente de CO2 Los animales usados para los ensayos de inflamacioacuten
croacutenica pesaron entre 90 y 140 g y fueron sacrificados mediante dislocacioacuten cervical
333 Dosis
Las dosis de Bh Bb y Pm fueron preparadas resuspendiendo los liofilizados en agua
esteacuteril mientras que para preparar las dosis de bromelina se resuspendioacute el polvo comercial
en buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Todas las soluciones fueron preparadas en el
momento de administrarlas
334 Material vegetal ensayado
En la Tabla 32 se presentan los valores de actividad caseinoliacutetica y contenido
proteico por mg de liofilizado (UCasmg y μg proteiacutenamg respectivamente) asiacute como la
actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos parcialmente purificados obtenidos
por precipitacioacuten etanoacutelica a partir de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) Pseudananas
macrodontes (Pm) y Bromelia balansae (Bb) Debido a que se obtuvieron varios extractos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
55
para cada material vegetal (Bh1-5 Bb1-4 y Pm1-4) esto se indica en cada una de las tablas
en que se exponen los resultados obtenidos para cada experimento
Liofilizados UCasmg liofilizado μg proteiacutenamg liofilizado UCasmg proteiacutena
Bh1 0177 plusmn 0004dagger 18 plusmn 2
dagger 98
Bh2 0173 plusmn 0042dagger 21 plusmn 3
dagger 82
Bh3 019 plusmn 003dagger 18 plusmn 2
dagger 106
Bh4 020 plusmn 002dagger 21 plusmn 2
dagger 97
Bh5 020 plusmn 002 19 plusmn 2 9
Bh (Promedio total plusmn DE) 019 plusmn 002 20 plusmn 2 10 plusmn 1
Bb1 0161 plusmn 0006dagger 9 plusmn 1
dagger 17
Bb2 0164 plusmn 003dagger 9 plusmn 1
dagger 17
Bb3 0135 plusmn 0009dagger 13 plusmn 1
dagger 104
Bb4 017 plusmn 001 14 plusmn 1 12
Bb (Promedio total plusmn DE) 016 plusmn 002 11 plusmn 3 14plusmn 4
Pm1 017 plusmn 002 29 plusmn 4 59
Pm2 0187 plusmn 0009 30 plusmn 3 6
Pm3 025plusmn 003dagger 32 plusmn 4
dagger 9
Pm4 0125 plusmn 0013 25 plusmn 2 5
Pm (Promedio total plusmn DE) 018 plusmn 005 29 plusmn 3 6 plusmn 2
Bromelina (Sigma Aldrich) 063 plusmn 006 200 plusmn 20 32 plusmn 05
Tabla 32 Actividad caseinoliacutetica contenido proteico y actividad especiacutefica de los extractos parcialmente
purificados Media plusmn DE daggerError calculado como [Xmaacuteximo-Xmiacutenimo]2 siendo Xmaacuteximo y Xmiacutenimo valores promedios (n =
3) maacuteximo y miacutenimo respectivamente obtenidos de dos mediciones independientes UCas unidades
caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
56
34 Resultados y Discusioacuten
341 Modelos de inflamacioacuten aguda
3411 Edema de pata de rata inducido por carragenina
34111 Bromelia hieronymi
En un trabajo previo (Boeris et al 2004) se encontroacute que en el modelo de edema de
pata de ratoacuten inducido por carragenina una dosis de 50 mgkg de un extracto parcialmente
purificado obtenido de frutos de Bromelia hieronymi presentaba efecto antiinflamatorio Esa
dosis fue evaluada en ratas como una primera aproximacioacuten a la determinacioacuten de una dosis
efectiva En la Tabla 33 se muestran los voluacutemenes de edema promedio y los porcentajes
de inhibicioacuten respecto al lote control medidos a 1 3 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina
de lotes tratados con 50 mgkg de Bh1 y con 50 mgkg de bromelina
Tabla 33 Efecto de Bh1 y bromelina en edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Tanto Bh como bromelina inhibieron significativamente la formacioacuten de edema en
alguno de los tiempos de medida Mientras Bh mostroacute actividad antiinflamatoria a las 3 h tal
como fue reportado (Boeris et al 2004) bromelina lo hizo a las 5 y 7 h post inyeccioacuten de
carragenina
A fin de corroborar si al aumentar la dosis de Bh se lograba efecto antiinflamatorio en
los otros tiempos de medida se ensayaron dosis de 100 y 200 mgkg Ademaacutes puesto que
la hipoacutetesis de partida fue que la actividad proteoliacutetica podriacutea ser la responsable de la accioacuten
antiinflamatoria de los extractos se tuvieron en cuenta las UCaskg administradas De la
Tabla 32 puede deducirse que una dosis de 200 mgkg de Bh1 equivale a un promedio de
35 UCaskg Con fines comparativos la dosis de bromelina se llevoacute a 55 mgkg (equivalente
a 35 UCaskg)
Tiempo
(h)
Control Bh1
50 mgkg Bromelina 50 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 025plusmn002 020plusmn002 20c 029plusmn007 -14c
3 052plusmn002 023plusmn003 56a 03plusmn01 33ca
5 11plusmn01 058plusmn009 45ca 04plusmn02 60a
7 127plusmn005 114plusmn006 10c 05plusmn02 60a
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
57
En los resultados expuestos en la Tabla 34 puede observarse que Bh mostroacute un
efecto antiinflamatorio significativo desde la primera hora en la cual inhibioacute la formacioacuten de
edema con una eficacia de alrededor del 35 alcanzando el maacuteximo valor a las 5 h con un
porcentaje de inhibicioacuten significativamente similar al de bromelina e indometacina (asymp 75)
Mientras que los porcentajes de inhibicioacuten de 100 y 200 mgkg de Bh fueron
significativamente equivalentes a los de la bromelina desde la primera hora hasta las 5 h a
las 7 h soacutelo la dosis de 200 mgkg mantuvo un efecto significativamente similar al de
bromelina (asymp 70) Dado que 55 mgkg de bromelina y 200 mgkg de Bh son equivalentes
en actividad proteoliacutetica (35-36 UCaskg) los resultados de la Tabla 34 estaacuten acordes con
la hipoacutetesis de que la actividad proteoliacutetica seriacutea responsable de la actividad antiinflamatoria
de los preparados enzimaacuteticos Para fortalecer esta hipoacutetesis se proboacute el efecto que tiene la
inhibicioacuten con E-64 de las proteasas cisteiacutenicas sobre la accioacuten antiinflamatoria exhibida por
Bh y bromelina
Tabla 34 Efecto de diferentes dosis de Bh1 bromelina e indometacina en edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
341111 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina
En la Tabla 35 se muestran los voluacutemenes de edema y los porcentajes de inhibicioacuten
respecto al lote control de lotes tratados con 150 mgkg de Bh4 y 150 mgkg de Bh4
incubado con E-64 (Bh4E-64) 50 mgkg de bromelina y 50 mgkg de bromelina incubada
con E-64 (BromelinaE-64) y 025 μmolkg de E-64 (equivalente a los μmoles contenidos en
las dosis de Bh4E-64 y bromelinaE-64)
Tiempo
(h)
Control
Bh1
50 mgkg
90plusmn02UCaskg
Bh1
100 mgkg
180plusmn04UCaskg
Bh1
200 mgkg
354plusmn08UCaskg
Bromelina
55 mgkg
35plusmn3UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 034plusmn001 024plusmn002 29bc 021plusmn003 38b 022plusmn002 35b 031plusmn005 9bc 030plusmn001 12bc
3 059plusmn006 052plusmn009 12c 027plusmn003 54ba 025plusmn002 58b
027plusmn005 54ba 050plusmn005 15ac
5 12plusmn01 07plusmn01 44a 029plusmn009 75b 026plusmn001 78b 028plusmn003 76b 040plusmn004 66ba
7 124plusmn009 09plusmn01 27ac 08plusmn01 40ad 038plusmn006 69b 032plusmn006 74b 053plusmn004 57bd
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
58
Tiempo
(h)
Control
Bh4
150 mgkg
30plusmn3 UCaskg
Bh4E-64
150 mgkg
09plusmn01 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
BromelinaE-64
50 mgkg
4plusmn2 UCaskg
E-64
025 μmolKg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 042plusmn003 022plusmn002 48b 026plusmn004 38b 022plusmn003 48b 028plusmn002 33ba 040plusmn003 5ac
3 067plusmn007 020plusmn003 70b 04plusmn01 33cb 018plusmn002 73b
05plusmn01 25c 062plusmn006 75c
5 115plusmn008 033plusmn005 71b 10plusmn02 13c 020plusmn001 83b 09plusmn02 20c 103plusmn007 10c
7 144plusmn009 09plusmn02 34a 125plusmn006 13ac 028plusmn007 80b 13plusmn02 9c 120plusmn007 17c
Tabla 35 Efecto del tratamiento con E-64 de Bh y bromelina sobre la accioacuten inhibitoria de edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Puede observarse que Bh y bromelina tuvieron efecto antiinflamatorio a lo largo de
todo el ensayo mientras que BhE-64 y bromelinaE-64 soacutelo mostraron efecto significativo
en la primera h post inyeccioacuten de carragenina Auacuten cuando durante todo el ensayo los
porcentajes de inhibicioacuten de Bh fueron maacutes altos que los de BhE-64 soacutelo a las 5 h lo fue
estadiacutesticamente significativo (71 gt 13 plt005) Por su parte los porcentajes de
inhibicioacuten de bromelina fueron significativamente superiores a los de bromelinaE-64 a las 3
5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina E-64 no mostroacute efecto antiinflamatorio en ninguacuten
tiempo de medida
Dado que al eliminar la actividad proteoliacutetica de Bh y bromelina se observoacute una
peacuterdida de actividad antiinflamatoria desde las 3 h siendo maacutes evidente en los tiempos en
que Bh y bromelina muestran los maacuteximos porcentajes de inhibicioacuten (a las 5 h para Bh y a
las 5 y 7 h para bromelina) se podriacutea suponer que las cisteiacutenendopeptidasas seriacutean las
responsables de la actividad antiinflamatoria medida para Bh y bromelina a partir de las 3 h
post inyeccioacuten de carragenina Por otro lado teniendo en cuenta el rol secuencial de los
distintos mediadores de la inflamacioacuten descriptos para este modelo tambieacuten se podriacutea
suponer que las cisteiacutenendopeptidasas de Bh y bromelina inhibiriacutean la infiltracioacutenactividad
de neutroacutefilos o la siacutentesisaccioacuten de NO y PGs los cuales alcanzan picos de produccioacuten
entre las 3 y las 6 h post inyeccioacuten de carragenina (Salvemini et al 1996) Tanto la
inhibicioacuten de la migracioacuten de neutroacutefilos como de la produccioacuten de PGs y NO ya han sido
demostradas para la bromelina en otros modelos (Gaspani et al 2002 Wen et al 2006
Fitzhugh et al 2008 Kalra et al 2008 Bhui et al 2012)
Los bajos porcentajes de inhibicioacuten medidos en la primera hora post inyeccioacuten de
carragenina respecto a los de las siguientes horas para Bh (Tablas 33 34 y 35) y para
bromelina (Tabla 35) estariacutean indicando que Bh y bromelina tienen un bajo efecto inhibitorio
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
59
sobre los mediadores de la primera fase del modelo Aunque otra explicacioacuten posible es que
durante la primera hora auacuten no se haya alcanzado la concentracioacuten efectiva de los
compuestos activos en el sitio de accioacuten Sea cual fuere la causa de la informacioacuten
aportada en la Tabla 35 se puede concluir que los efectos antiinflamatorios de Bh y
bromelina en la primera hora no dependeriacutean de la actividad proteoliacutetica de las
cisteinendopeptidasas
34112 Pseudananas macrodontes
Los resultados obtenidos para Bh y bromelina fueron tenidos en cuenta para
establecer las dosis a ensayar de los extractos obtenidos a partir de frutos de Pseudananas
macrodontes (Pm) En la Tabla 36 se presentan los voluacutemenes y porcentajes de inhibicioacuten
de edema inducida por carragenina en el modelo de pata de rata a distintas horas para 90 y
180 mgkg de Pm1 (equivalentes a 15 y asymp 30 UCaskg respectivamente) 50 mgkg de
bromelina y 10 mgkg de indometacina
Tiempo
(h)
Control
Pm1
90 mgkg
15plusmn2 UCaskg
Pm1
180 mgkg
31plusmn4 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 027plusmn003 019plusmn002 28bc 012plusmn002 55b 018plusmn002 33bc 024plusmn002 11c
3 064plusmn007 035plusmn004 45ba 019plusmn002 70b 029plusmn003 55b
055plusmn006 14ca
5 114plusmn008 06plusmn02 46b 023plusmn002 80b 028plusmn002 75b 038plusmn003 67b
7 13plusmn01 08plusmn02 37a 020plusmn002 85b 045plusmn004 65d 055plusmn004 58ad
Tabla 36 Efecto de diferentes dosis de Pm1 bromelina e indometacina en edema de pata de rata inducido por
carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey p lt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Puede observarse que ambas dosis de Pm tuvieron efecto antiinflamatorio
significativo alcanzando los maacuteximos porcentajes de inhibicioacuten de edema entre las 3 y las 5
h para la menor dosis y entre las 5 y las 7 h para la mayor dosis Por lo tanto Pm es maacutes
efectivo en la fase tardiacutea propuesta para el modelo de edema inducido por carragenina
Si bien en este ensayo bromelina no alcanzoacute los porcentajes de inhibicioacuten medidos
en los anteriores experimentos (Tablas 34 y 35) puede verse que hasta las 5 h fueron
significativamente similares a los de Pm (180 mgkg) Teniendo en cuenta los valores de la
Tabla 32 se observa que la mayor dosis de Pm (180 mgkg) es equivalente en UCas (asymp 30
UCaskg) a las dosis probadas para bromelina y Bh4 (Tabla 35) mostrando los tres
preparados efectos similares Por otro lado los porcentajes de inhibicioacuten de la dosis de 90
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
60
mgkg de Pm (equivalente a 15 UCaskg) y de 100 mgkg de Bh1 (equivalente a 18
UCaskg) mostrados en la Tabla 34 son similares a excepcioacuten de los medidos a las 5 h
341121 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm
A fin de poner a prueba la hipoacutetesis de que la actividad proteoliacutetica es necesaria para
el efecto antiinflamatorio de Pm del mismo modo que para Bh y bromelina se midioacute el efecto
antiinflamatorio luego de inhibir las cisteiacutenendopeptidasas con E-64 (Tabla 37)
Tiempo
(h)
Control
Pm1
180 mgkg
31plusmn4 UCaskg
Pm1E-64
180 mgkg
04plusmn02 UCaskg
E-64
02 μmolkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 038plusmn003 017plusmn003 55b 028plusmn006 26ba 036plusmn003 5ca
3 060plusmn007 017plusmn002 72b 032plusmn006 47b 056plusmn006 7c
5 104plusmn008 021plusmn003 80b 066plusmn03 36cb 093plusmn007 11c
7 126plusmn01 021plusmn004 83a 09plusmn02 29b 108plusmn007 14cb
Tabla 37 Efecto del tratamiento con E-64 sobre el efecto antiinflamatorio de Pm en modelo de edema de pata
generado por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En la Tabla 37 se puede observar que los porcentajes de inhibicioacuten de Pm fueron
superiores a los de la misma dosis de Pm tratada con E-64 (PmE-64) llegando a ser poco
maacutes del doble a las 1 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina lo cual estariacutea indicando que
las cisteiacutenendopeptidasas contribuyen al efecto antiinflamatorio de Pm No obstante esta
contribucioacuten no parece ser la uacutenica puesto que tanto a las 3 como a las 7 h PmE-64 mostroacute
efecto antiinflamatorio significativo sugiriendo que otros componentes presentes en Pm
estariacutean actuando principalmente sobre la fase tardiacutea
Ante este resultado se hicieron ensayos posteriores a fin de dilucidar el posible
componente con actividad antiinflamatoria de Pm Si bien las UCasmg de PmE-64 fueron
0002 plusmn 0001 y por tanto la dosis de 180 mgkg equivalioacute a 04 UCaskg la primera
posibilidad que se evaluoacute es que en el caso de PmE-64 las proteasas no hubieran sido
completamente inhibidas En ensayos posteriores se evaluoacute la actividad fibrinoliacutetica (mm2)
de Pm1 mediante el ensayo de la placa de fibrina13 por tratarse de un meacutetodo muy sensible
(Jespersen amp Astrup 1983) y pudo determinarse que la dosis de Pm1 conteniacutea 658 (plusmn08)
x103 mm2kg mientras que la dosis de Pm1E-64 conteniacutea 206 (plusmn04) x103 mm2kg un 31
de la actividad fibrinoliacutetica de Pm1 Por lo tanto no puede descartase la posibilidad de que
13
Ver 443 (Capiacutetulo Efecto anticoagulante fibrinogenoliacutetico y fibrinoliacutetico)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
61
las proteasas sean las responsables de la actividad antiinflamatoria de PmE-64 De todos
modos dado que al inhibir las proteasas cisteiacutenicas de Pm (llevando la dosis a 04 UCaskg)
los porcentajes de inhibicioacuten de edema disminuyen aproximadamente un 50 respecto a los
de la dosis de 31 UCaskg de Pm podriacutea atribuirse actividad antiinflamatoria a las proteasas
cisteiacutenicas de Pm Dilucidar el grado de participacioacuten de las mismas en el proceso requeriraacute
ensayos ulteriores
34113 Bromelia balansae
Siguiendo el mismo razonamiento que para Pm las dosis a ensayar de los extractos
parcialmente purificados obtenidos a partir de frutos de B balansae (Bb) fueron definidas de
manera que contuvieran la misma actividad proteoliacutetica que las dosis efectivas de bromelina
y Bh (entre 10 y 35 UCaskg) En un primer ensayo se proboacute una dosis intermedia 120
mgkg de Bb1 equivalente a aproximadamente 20 UCaskg (Tabla 38)
Tiempo
(h)
Control
Bb1
120 mgkg
19plusmn1 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 027plusmn003 022plusmn004 19c 018plusmn002 33c 024plusmn002 11c
3 064plusmn007 03plusmn01 53b 029plusmn003 55b 055plusmn006 14cb
5 114plusmn008 05plusmn02 56b 028plusmn002 75b 038plusmn003 67b
7 13plusmn01 06plusmn02 51b 045plusmn004 65b 055plusmn004 58b
Tabla 38 Efecto de Bb bromelina e indometacina sobre el edema de pata generado por carragenina Los
voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6 excepto n=5 para el lote Bb1 a las 5 y 7 h) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En este caso entre las 3 y las 5 h una rata del lote tratado con Bb murioacute por lo que a
las 5 y 7 h el valor de n fue igual a 5 Como puede verse en la Tabla 38 Bb mostroacute
porcentajes de inhibicioacuten significativos a las 3 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina los
cuales no se diferenciaron estadiacutesticamente de los de bromelina asiacute como tampoco de los
de indometacina a las 5 y 7 h A la h post inyeccioacuten de carragenina ninguno de los
compuestos ensayados mostroacute porcentajes de inhibicioacuten significativos
341131 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb
En otro experimento (Tabla 39) se probaron dos dosis de Bb2 100 y 200 mgkg
equivalentes aproximadamente a 15 y 30 UCaskg respectivamente asiacute como 200 mgkg
de Bb2 tratado con E-64 (Bb2E-64)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
62
La dosis de 200 mgkg de Bb2 fue antiinflamatoria soacutelo a las 7 h post inyeccioacuten de
carragenina mostrando un porcentaje de inhibicioacuten significativamente similar al de
diclofenac soacutedico (50 mgkg) La misma dosis de Bb tratada con E-64 (Bb2E-64) no mostroacute
efecto antiinflamatorio aunque no se detectaron diferencias significativas entre los
porcentajes de inhibicioacuten de Bb2 y Bb2E-64 Las dosis de 100 mgkg de Bb2 y E-64 (025
μmolkg) no mostraron efecto significativo en ninguacuten tiempo de medida
Tabla 39 Efecto de diferentes dosis de Bb y BbE-64 sobre el edema de pata generado por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n = 6 excepto n=5 para el lote Bb2E-64 a partir de las 5 h) Test de Tukey plt 005 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Al comparar los resultados de la Tabla 39 con los de la Tabla 38 puede observarse
que si bien el efecto antiinflamatorio se sigue manifestando en la fase tardiacutea propuesta para
este modelo la dosis de 200 mgkg (33 plusmn 6 UCaskg) de Bb2 fue menos efectiva que la de
120 mgkg (19 plusmn 1 UCaskg) de Bb1 lo cual no seriacutea lo esperado si tenemos en cuenta la
actividad proteoliacutetica de ambas Sin embargo el tratamiento con el inhibidor E-64 produjo
una peacuterdida del efecto antiinflamatorio de Bb2 concordante con la hipoacutetesis de que la
actividad de las proteasas presentes en Bb es la causante de tal efecto Una caracteriacutestica
comuacuten de los valores de las Tablas 38 y 39 es la alta dispersioacuten de los voluacutemenes medidos
para los lotes tratados con Bb hecho que no se observa en los valores de los lotes
controles asiacute como tampoco en lotes tratados con diclofenac soacutedico e indometacina
Por otro lado es necesario mencionar que otros ensayos con Bb presentaron cierta
dificultad en relacioacuten a una posible toxicidad En un ensayo el 50 de los animales que
recibieron una dosis de Bb (Bb3 Tabla 32) equivalente a 35 UCaskg murieron entre las 3 y
las 6 h post inyeccioacuten de carragenina En otro ensayo en que se probaron dosis
equivalentes a 10 20 y 30 UCaskg varios animales de los tres lotes tratados mostraron
signos tiacutepicos de toxicidad (pasividad motora alteracioacuten respiratoria ereccioacuten pilomotora y
extremidades cianoacuteticas) a partir de la primera hora post inyeccioacuten de carragenina y entre
las 4 y 5 h murieron Por lo expuesto no deberiacutea descartarse la posibilidad de que Bb
Tiempo
(h)
Control
Bb2
100 mgkg
16plusmn3 UCaskg
Bb2
200 mgkg
33plusmn6 UCaskg
Bb2E-64
200 mgkg
05plusmn01 UCaskg
E-64
025 μmolkg
Diclofenac soacutedico
50 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 033plusmn003 028plusmn004 15c 033plusmn008 0c 043plusmn005 -30c 031plusmn007 6c 024plusmn003 27c
3 07plusmn01 09plusmn02 -19c 05plusmn01 32c 09plusmn01 -32c 06plusmn02 14c 035plusmn005 52c
5 14plusmn01 11plusmn03 24bc 08plusmn03 48bc 11plusmn02 23bc 09plusmn02 34bc 044plusmn007 69b
7 15plusmn01 11plusmn02 30bc 08plusmn02 48b 099plusmn007 35bc 10plusmn02 33bc 073plusmn008 52b
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
63
presente cierta toxicidad a las dosis ensayadas hecho que deberaacute comprobarse mediante
futuros ensayos de toxicidad
Sin dejar de lado las dificultades sentildealadas de los resultados obtenidos se puede
concluir que Bb muestra efecto antiinflamatorio significativo soacutelo sobre la fase tardiacutea del
modelo de edema de pata (Di Rosa et al 1971 Salvemini et al 1996) mostrando menores
porcentajes de inhibicioacuten que dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica de Bh Pm y
bromelina Ademaacutes el efecto antiinflamatorio de Bb podriacutea estar relacionado con la actividad
proteoliacutetica de sus cisteiacutenendopeptidasas
3412 Otros modelos de inflamacioacuten aguda
Como ya se ha mencionado la primera fase (0-1 h) del desarrollo de edema de pata
inducido por carragenina es mediada principalmente por histamina y serotonina (Di Rosa et
al 1971 Salvemini et al 1996) Para corroborar si el efecto inhibitorio de edema observado
en la primera h para Bh Pm y bromelina se debiacutea a un efecto inhibitorio sobre alguno de
estos mediadores se evaluaron las dosis efectivas de dichos preparados a esa h en los
modelos de edema de pata inducidos por histamina y por serotonina
34121 Edema de pata inducido por histamina en ratas
En la Tabla 310 se consignan los voluacutemenes de edema y los respectivos porcentajes
de inhibicioacuten de edema a los 15 30 y 60 min post inyeccioacuten de histamina Se evaluaron
dosis de Bh Pm y bromelina cuyos contenidos en UCas fueran equivalentes a las de las
dosis que en el modelo de edema inducido por carragenina fueron efectivas en la primera
hora esto es 200 mgkg de Bh2 (equivalente a 35 plusmn 8 UCaskg) 170 mgkg de Pm2
(equivalente a 32 plusmn 2 UCaskg) y 55 mgkg de bromelina (equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg)
Tiempo
(min)
Control
Bh2
200 mgkg
35plusmn8 UCaskg
Pm2
170 mgkg
32plusmn2 UCaskg
Bromelina
55 mgkg
35plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
15 039plusmn003 046plusmn003 -18c 038plusmn003 25c 045plusmn002 -15c
30 034plusmn003 041plusmn003 -21c 034plusmn003 0c 044plusmn003 -30c
60 032plusmn003 033plusmn004 -3c 031plusmn003 3c 042plusmn004 -31c
Tabla 310 Efecto de Bh Pm y bromelina sobre el edema inducido histamina Los voluacutemenes de edema son
expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
64
Puede observarse que ninguno de los compuestos probados fue efectivo a las dosis
probadas Por tanto es liacutecito suponer que los efectos antiinflamatorios medidos para Bh Pm
y bromelina en la primera hora post inyeccioacuten de carragenina no se deben a la inhibicioacuten de
la accioacuten de la histamina
La bibliografiacutea en relacioacuten al efecto de la bromelina sobre la inflamacioacuten mediada por
histamina es escasa Seguacuten Kumakura et al (1988) dosis crecientes de bromelina
administradas intravenosamente aumentaban el exudado plasmaacutetico inducido por histamina
a los 30 min en el modelo de ldquobolsa de airerdquo en ratas
34122 Edema de pata inducido por serotonina en ratas
341221 Bromelia hieronymi
En la Tabla 311 se exponen los voluacutemenes de edema y los porcentajes de inhibicioacuten
de edema a los 30 60 y 120 min post inyeccioacuten de serotonina para 100 y 200 mgkg de Bh2
(equivalentes a 17 plusmn 4 y 35 plusmn 8 UCaskg respectivamente) y para 55 mgkg de bromelina
(equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg)
Tiempo
(min)
Control
Bh2
100 mgkg
17plusmn4 UCaskg
Bh2
200 mgkg
35plusmn8 UCaskg
Bromelina
55 mgKg
35plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
30 122plusmn005 118plusmn005 33c 08plusmn01 37a 060plusmn009 51a
60 109plusmn004 116plusmn005 -6c 08plusmn01 28a
063plusmn008 42a
120 083plusmn004 070plusmn003 16ac 066plusmn007 20ac 057plusmn007 31a
Tabla 311 Efecto de Bh2 y bromelina sobre el edema inducido por serotonina Los voluacutemenes de edema son
expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
El efecto medido para bromelina es concordante con el reportado por Netti et al
(1972) quienes midieron un porcentaje de inhibicioacuten de asymp 40 a los 60 min post inyeccioacuten
de serotonina en ratas que recibieron por viacutea oral bromelina (100 mganimal) 4 h previas a la
inyeccioacuten de serotonina
Bh exhibioacute porcentajes de inhibicioacuten significativos a los 30 y 60 min soacutelo con la dosis
de 200 mgkg Si bien dichos valores fueron inferiores a los de la bromelina no fueron
significativamente diferentes Estos resultados estariacutean indicando que la inhibicioacuten que
ejercen Bh y bromelina sobre el edema inducido por carragenina estariacutea al menos en parte
mediada por un efecto inhibidor de la accioacuten de la serotonina
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
65
341222 Pseudananas macrodontes
En la Tabla 312 se muestra el efecto de una dosis de Pm2 (170 mgkg) equivalente
a 32 plusmn 2 UCaskg sobre el edema de pata inducido por serotonina Pm mostroacute un porcentaje
de inhibicioacuten significativo soacutelo a los 30 min Por lo tanto asiacute como en el caso de Bh y
bromelina parte del efecto antiinflamatorio evaluado a la hora post inyeccioacuten de carragenina
se podriacutea deber a un efecto inhibitorio sobre la accioacuten de la serotonina
Tiempo
(min)
Control
Pm2
170 mgkg
32plusmn2 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
30 105plusmn007 08plusmn01 29a 052plusmn003 50a
60 087plusmn007 07plusmn01 22ca 050plusmn004 42a
120 067plusmn006 06plusmn01 20c 046plusmn004 31c
Tabla 312 Efecto de Pm2 sobre el edema inducido por serotonina Los voluacutemenes de edema son expresados
como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
342 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma
Como primera aproximacioacuten en el modelo de inflamacioacuten croacutenica se probaron las
dosis de los preparados que mostraron efecto antiinflamatorio sobre el edema de pata
inducido por carragenina
Como control positivo se utilizoacute dexametasona la cual posee entre otros efectos
adversos tiacutepicos de los glucocorticoides efectos inmunosupresor y cataboacutelico Con el
objetivo de comparar dichos efectos con los de los preparados proteoliacuteticos se calcularon
como una medida del efecto inmunosupresor los porcentajes de reduccioacuten de las masas del
timo y del bazo (Ben Rhouma amp Sakly 1994 Hori et al 1996) mientras que el efecto
cataboacutelico fue medido calculando la peacuterdida de masa corporal (se pesaron los animales
antes y despueacutes del tratamiento y la diferencia de peso corporal fue comparada con los
controles)
3421 Bromelia hieronymi
En la Tabla 313 se exponen los resultados obtenidos para 90 y 180 mgkg de Bh3
(equivalentes a 17 plusmn 3 y 34 plusmn 5 UCaskg respectivamente) 55 mgkg de bromelina
(equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg) y dexametasona (3 mgkg) en el test del granuloma inducido
por pellet de algodoacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
66
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 054plusmn006 043plusmn002 078plusmn009
Bh3
(90 mgkg- 17plusmn3 UCaskg)
047plusmn002 13c 035plusmn002 18bc 09plusmn01 -9c
Bh3
(180 mgkg- 34plusmn5 UCaskg)
032plusmn001 41b 031plusmn002 28b 07plusmn01 7c
Bromelina
(55 mgkg- 35plusmn3 UCaskg )
036plusmn005 34b 031plusmn002 28b 077plusmn008 1c
Dexametasona (3 mgkg) 024plusmn001 55a 011plusmn002 74a 040plusmn004 49b
Tabla 313 Efecto de Bh3 bromelina y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de
algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
La dosis de 180 mgkg de Bh bromelina (55 mgkg) y dexametasona (3 mgkg)
resultaron antiinflamatorias Bh (180 mgkg) y bromelina mostraron porcentajes de inhibicioacuten
de granuloma significativamente similares pero ambos fueron significativamente inferiores al
de dexametasona En relacioacuten al efecto inmunosupresor mientras dexametasona causoacute
significativa reduccioacuten del peso de bazos y timos Bh (180 mgkg) y bromelina soacutelo redujeron
el peso de los timos mostrando porcentajes iguales (28) aunque significativamente
inferiores al de dexametasona (74) Por otra parte la dosis de 90 mgkg de Bh no fue
antiinflamatoria pero tampoco redujo los pesos de los bazos y los timos
En la Figura 31 se muestran los cambios de peso corporal
Figura 31 Efecto de Bh3 bromelina (Bro) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas
tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
-20
-10
0
10
20
30
b
b
a
cControl
Bh3 (173 UCaskg)
Bh3 (345 UCaskg)
Bro (353 UCaskg)
Dex (3 mgkg)
c
Ca
mb
io d
e p
es
o c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
67
Bh (180 mgkg) y bromelina no provocaron peacuterdida de masa corporal aun cuando la
ganancia en masa corporal (14 y 13 g respectivamente) fuera significativamente maacutes baja
que la del lote control (22 g) En cambio dexametasona provocoacute una significativa peacuterdida de
masa corporal (-14 g) respecto al control El lote tratado con la dosis de 90 mgkg de Bh no
mostroacute cambios respecto al lote control
Por lo tanto si bien Bh (180 mgkg) y bromelina (55 mgkg) fueron menos efectivas
que dexametasona (3 mgkg) para inhibir la formacioacuten del granuloma tambieacuten mostraron
menos efectos sobre bazos timos y masa corporal
Debido a la similitud en el contenido de UCas (asymp35 UCaskg) de las dosis de Bh (180
mgkg) y de bromelina (55 mgkg) que mostraron similares efectos en el test del granuloma
se proboacute si dichos efectos dependiacutean de la accioacuten de proteasas cisteiacutenicas
34211 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina en el test del
granuloma
A fin de determinar si la actividad proteoliacutetica de Bh y bromelina es causa de la
accioacuten antiinflamatoria evaluada en el test del granuloma se ensayaron Bh y bromelina con
y sin actividad proteoliacutetica (luego de inhibir con E-64) Los resultados se muestran en la
Tabla 314
Tabla 314 Efecto de Bh5 y bromelina con actividad proteoliacutetica y sin actividad proteoliacutetica (Bh5E-64 y bromelinaE-64) E-64 y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En el caso de bromelina puede observarse que al inhibir sus cisteiacutenendopeptidasas
con E-64 pierde su efecto antiinflamatorio el porcentaje de inhibicioacuten cambia de 24 a -8
dejando de ser significativo Lo mismo sucede con el efecto reductor sobre el peso de los
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Control 036 plusmn 002 043 plusmn 003 053 plusmn 008
Bromelina
(55 mgkg- 35plusmn3 UCaskg )
0272 plusmn 0006 24a 033 plusmn 002 23a 08 plusmn 02 -42c
BromelinaE-64
(55 mgkg- 2plusmn3 UCaskg)
039 plusmn 004 -8c 046 plusmn 003 -7c
065 plusmn 009 -23c
Bh5
(180 mgkg- 36plusmn4 UCaskg)
039 plusmn 001 -8c 042 plusmn 001 2c
082 plusmn 02 -55c
Bh5E-64
(180 mgkg- 1plusmn2 UCaskg)
040 plusmn 003 -11c 040 plusmn 002 7ca
06 plusmn 01 -19c
E-64
(03 μmolkg)
039 plusmn 004 -8c 0421 plusmn 0009 2c
06 plusmn 01 -15c
Dexametasona (3 mgkg) 0230 plusmn 0006 36a 0042 plusmn 0003 90b 033 plusmn 008 38c
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
68
timos el porcentaje de reduccioacuten para bromelina es de 23 mientras que para
bromelinaE-64 es de -7 Por tanto las cisteiacutenendopeptidasas no soacutelo estariacutean actuando
como antiinflamatorias sino tambieacuten ejerciendo un leve efecto reductor sobre el peso de los
timos En este ensayo el porcentaje de reduccioacuten del peso de los timos provocado por
bromelina fue aproximadamente 14 del de dexametasona mientras que los porcentajes de
inhibicioacuten del granuloma de ambas fueron significativamente similares E-64 (03 μmolkg) no
tuvo efecto sobre los granulomas asiacute como tampoco sobre los pesos de los timos y los
bazos
Los resultados obtenidos para Bh no permiten sacar ninguna conclusioacuten respecto al
rol que tendriacutean sus cisteiacutenendopeptidasas como antiinflamatorias puesto que a diferencia
de los datos consignados en la Tabla 313 Bh no tuvo efecto inhibidor significativo de los
granulomas asiacute como tampoco efecto reductor de los timos ademaacutes de no encontrarse
diferencia significativa entre Bh y BhE-64 Los efectos de Bh y BhE-64 fueron ensayados
una vez maacutes pero no pudieron extraerse resultados concluyentes Una posible explicacioacuten a
la dificultad en la reproducibilidad de los resultados para Bh probablemente obedezca a la
poca sensibilidad que el test de granuloma inducido por algodoacuten tiene especialmente para
antiinflamatorios no esteroideos (Bailey et al 1982)
En relacioacuten al efecto sobre el peso corporal no se observaron diferencias
significativas respecto al control para bromelina y para bromelina inhibida con E-64 El E-64
produjo una ganancia de masa corporal significativamente mayor que la de los controles
Pero ninguno de los compuestos probados a excepcioacuten de dexametasona produjeron
peacuterdida de masa corporal (Figura 32)
Figura 32 Efecto de Bh5 bromelina (Bro) y Bh5 y bromelina inhibidas con E-64 (Bh5E-64 y BroE-64
respectivamente) E-64 y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas tratadas durante el ensayo del test del granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
-20
-10
0
10
20
30
Control
Dex (3 mgkg)
Bh5 (364 UCaskg)Bh5E-64(12 UCaskg)
Bro (353 UCaskg)
BroE-64(23 UCaskg)
E-64 (03 molkg)c
cd
a
b b
d
c
Cam
bio
de p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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3422 Pseudananas macrodontes y Bromelia balansae
En un mismo ensayo se probaron dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica (asymp30
UCaskg) de Pm y Bb cuyos efectos fueron comparados con los de bromelina (50 mgkg
equivalente a asymp30 UCaskg) y dexametasona (3 mgkg) Como en todos los ensayos los
lotes estuvieron conformados por 6 animales excepto en el caso de Pm donde los datos
provienen de 4 animales ya que dos de ellos murieron luego de la tercera y cuarta dosis
Puede observarse en la Tabla 315 que Pm y Bb mostraron porcentajes de inhibicioacuten del
granuloma similares a los de bromelina Los porcentajes de reduccioacuten del timo para Pm y Bb
fueron significativamente similares entre siacute y si bien mayores no se diferenciaron
significativamente de los de bromelina
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 054plusmn003 038plusmn003 071plusmn007
Pm3
(130 mgkg- 33plusmn4 UCaskg)
036plusmn002 33ab 020plusmn001 47b 08plusmn01 -8c
Bb 4
(180 mgkg- 31plusmn2 UCaskg)
041plusmn004 24a 021plusmn001 45b 052plusmn007 27cb
Bromelina
(50 mgkg- 32plusmn3 UCaskg)
036plusmn002 33ab 028plusmn002 26b 070plusmn007 1c
Dexametasona (3 mgkg) 024plusmn001 56b 010plusmn002 74a 036plusmn004 49b
Tabla 315 Efecto de Pm3 Bb4 bromelina y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y
sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n = 6 excepto para Pm n=4) Test de Tukey p lt 005 p lt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Los porcentajes de reduccioacuten de los timos de los preparados proteoliacuteticos fueron
significativamente menores al de dexametasona y a diferencia de eacutesta no mostraron efecto
reductor significativo sobre el peso de los bazos
En la Figura 33 pueden observarse los cambios en los pesos corporales de los
animales tratados Si bien los animales de los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos
no aumentaron de peso en la misma cantidad que los del lote control no padecieron peacuterdida
de masa corporal como siacute ocurrioacute con los del lote tratado con dexametasona
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
70
Figura 33 Efecto de Pm Bb bromelina (Bro) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas
tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6 excepto para Pm n=4) Test de Tukey p lt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Los efectos de Pm y Bb sobre los distintos paraacutemetros evaluados en este modelo
fueron similares a los de Bh3 (Tabla 313) Sin embargo la muerte de dos animales del lote
tratado con Pm podriacutea estar indicando un efecto toacutexico del preparado
34221 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb en el test del granuloma
En la Tabla 316 se exponen los resultados obtenidos para 180 mgkg de Bb2
equivalente a 30 UCaskg y para 180 mgkg de Bb2 tratada con E-64 (Bb2E-64) Puede
observarse que Bb no mostroacute efecto inhibidor significativo sobre los granulomas y su
porcentaje de inhibicioacuten no se diferencioacute significativamente del de BbE-64 Tampoco se
observaron efectos significativos de Bb y BbE-64 sobre el peso de los timos
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 050plusmn003 036plusmn002 068plusmn003
Bb 2 (180 mgkg
30plusmn5 UCaskg)
052plusmn008 -4c 036plusmn003 0c 098plusmn005 -44a
Bb2E-64 (180 mgkg
006plusmn001 UCaskg)
039plusmn005 22c 028plusmn003 22c 095plusmn008 -40a
Dexametasona (3 mgkg) 0230plusmn0005 54a 0050plusmn0004 86a 034plusmn001 50b
Tabla 316 Efecto de Bb2 con actividad proteoliacutetica y sin actividad proteoliacutetica (Bb2E-64) y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey p lt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
-20
-10
0
10
20
30
ab
b
a
d
Control
Pm3 (334 UCaskg)
Bb4 (312 UCaskg)
Bro (323 UCaskg)Dex (3 mgkg)
c
Ca
mb
io d
e p
eso c
orp
ora
l (g
)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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A diferencia de lo observado para los preparados en los anteriores ensayos del test
del granuloma los bazos aumentaron significativamente de peso Este efecto fue
independiente de la actividad proteoliacutetica de Bb
En la Figura 34 se muestran los efectos de Bb y BbE-64 sobre los pesos corporales
de los animales Si bien los animales del lote tratado con Bb proteoliacuteticamente activo no
aumentaron de peso en la misma cantidad que los del lote control no mostraron peacuterdida de
masa corporal como siacute ocurrioacute con los del lote tratado con dexametasona
Siendo que la dosis de Bb2 tiene el mismo contenido de UCas (30) que la dosis de
Bb4 que siacute mostroacute efecto antiinflamatorio (Tabla 315) pudo existir alguacuten otro factor que no
se ha controlado y afectoacute a las medidas conduciendo a los resultados contradictorios de las
Tablas 315 y 316 Como se mencionoacute anteriormente la falta de reproducibilidad podriacutea
deberse a la baja sensibilidad del test del granuloma para compuestos no esteroideos
(Bailey et al 1982) Por otro lado Bb2 es el mismo preparado que mostroacute bajo porcentaje
de inhibicioacuten en el modelo de edema de pata inducido por carragenina (Tabla 39) El
aumento en el tamantildeo de los bazos podriacutea estar relacionado con el posible efecto toacutexico que
ha sido detectado en algunos de los ensayos en que se proboacute Bb y que podriacutea enmascarar
su accioacuten antiinflamatoria
Figura 34 Efecto de Bb y Bb inhibida con E-64 (BbE-64) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de
las ratas tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
34222 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm en el test del granuloma
Debido a que la dosis de 30 UCaskg de Pm pareciacutea mostrar cierta toxicidad
(ademaacutes del ensayo cuyos resultados se exponen en Tabla 315 en otro ensayo tambieacuten
murioacute 13 de los animales) se decidioacute bajar la dosis a 13 (equivalente a 10 UCaskg) Al
igual que para Bh y bromelina se ensayoacute el efecto que tiene la inhibicioacuten de las
cisteiacutenendopeptidasas presentes en Pm sobre su efecto antiinflamatorio en el test del
granuloma En la Tabla 317 se muestran los resultados obtenidos para 90 mgkg de Pm4
90 mgkg de Pm4 inhibido con E-64 (Pm4E-64) y dexametasona (3 mgkg)
-20
-10
0
10
20Control
Dex (3 mgKg)
Bb2 (305 UCaskg)
Bb2E-64 (006001 UCaskg)
a
bcb
c
Ca
mb
io d
e p
eso
co
rpo
ral (g
)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Tabla 317 Efecto de Pm4 con y sin actividad proteoliacutetica (Pm4E-64) y dexametasona sobre el granuloma
inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Las dosis ensayadas de Pm en esta oportunidad no provocaron la muerte de los
animales tratados Si bien los porcentajes de inhibicioacuten de granuloma de Pm y de PmE-64
no se diferenciaron significativamente entre siacute el porcentaje de Pm fue estadiacutesticamente
significativo pero no asiacute el de PmE-64 lo cual estariacutea indicando que las
cisteiacutenendopeptidasas de Pm tendriacutean un rol antiinflamatorio en este modelo PmE-64 no
mostroacute actividad fibrinoliacutetica en el ensayo de la placa de fibrina6
De igual modo que para bromelina al inhibir las proteasas de Pm con E-64 no soacutelo
se pierde el efecto antiinflamatorio sino tambieacuten el efecto reductor sobre el peso de los
timos Si bien los porcentajes de reduccioacuten del peso de los timos de Pm y de PmE-64 no se
diferencian significativamente el porcentaje de reduccioacuten respecto al control de Pm es
significativo mientras que el de PmE-64 no
Por otro lado Pm y PmE-64 no redujeron significativamente los pesos de los bazos
al igual que todos los preparados proteoliacuteticos ensayados previamente
En la Figura 35 se observa que Pm y PmE-64 no afectaron significativamente la
ganancia de masa corporal de los animales tratados respecto a los del lote control
Figura 35 Efecto de Pm4 Pm4 inhibida con E-64 (PmE-64) y dexametasona (Dex) sobre los pesos
corporales de las ratas tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Control 050plusmn003 0 36plusmn002 068plusmn003
Pm4 (90 mgkg
11plusmn1 UCaskg)
037plusmn002 26a 026plusmn002 28b 08plusmn01 -23c
Pm4E-64 (90 mgkg
02plusmn01 UCaskg)
0417plusmn0009 17ac 031plusmn003 14cb 062plusmn007 9c
Dexametasona (3 mgkg) 0230plusmn0005 54b 005plusmn0004 86a 034plusmn001 50b
-20
-10
0
10
20
30Control
Dex (3 mgKg)
Pm4 (111 UCaskg)
Pm4E-64 (0201 UCaskg)
a
cc
c
Cam
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de p
eso c
orp
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l (g
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Pm4 mostroacute efectos similares a los de bromelina con una dosis que contuvo 3 veces
menos UCas que la dosis de bromelina usada como referencia (50-55 mgkg equivalente a
30-35 UCaskg) Para verificar si bromelina alcanza su efecto maacuteximo con una dosis de 10
UCaskg se evaluoacute la accioacuten antiinflamatoria de dosis equivalentes a 11 plusmn 1 31 plusmn 3 y 94 plusmn 9
UCaskg Simultaacuteneamente se midieron los porcentajes de reduccioacuten de los pesos de los
timos y los bazos y se registroacute la ganancia de peso corporal Los resultados se muestran en
la Figura 36 excepto los porcentajes de reduccioacuten de los pesos de los bazos y los cambios
de peso corporal ya que no fueron estadiacutesticamente significativos para ninguna de las
dosis
Figura 36 Porcentajes de inhibicioacuten de granuloma y porcentajes de reduccioacuten de timos para 17 50 y 150 mgkg
de bromelina equivalentes a 11 31 y 94 UCaskg mp masa del granuloma o timo del animal tratado con el preparado mc masa del granuloma o timo del animal del lote control Test de Dunnettt p lt 005 p lt 001 p lt 0001 Media plusmn SEM
Como puede observarse en la figura 36 la dosis de bromelina equivalente a 11 plusmn 1
UCaskg mostroacute un porcentaje de inhibicioacuten de 15 que no resultoacute ser estadiacutesticamente
significativo mientras que la dosis equivalente a 31 plusmn 3 UCaskg mostroacute un porcentaje de
inhibicioacuten similar a los de ensayos anteriores (25-30) Queda de este modo comprobado
que las dosis equivalentes en UCas de Pm4 y bromelina no muestran efectos
antiinflamatorios equivalentes
La UCas es una medida de la actividad hidroliacutetica de la proteasa frente a la caseiacutena
un sustrato con muacuteltiples puntos de corte Igual cantidad de UCas significa igual intensidad
de eficacia proteoliacutetica pero nada indica acerca de la especificidad de la enzima activa
Probablemente la dosis de Pm con igual UCas que la de bromelina tiene maacutes especificidad
hacia los blancos involucrados en el mecanismo de inflamacioacuten que subyacen en el modelo
del granuloma
10 30 900
20
40
60
Granuloma Timo
)x100mm(1 cp
UCaskg
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3423 Posible relacioacuten entre la actividad proteoliacutetica-accioacuten antiinflamatoria-
modulacioacuten sobre poblacioacuten linfocitaria T
En la Figura 36 tambieacuten se puede observar que el aumento en el porcentaje de
inhibicioacuten del granuloma se acompantildea de un aumento en el porcentaje de reduccioacuten del
peso de los timos
Para todos los preparados en que se detectoacute efecto antiinflamatorio significativo
tambieacuten se acompantildeoacute de un efecto significativo sobre el peso de los timos y para Pm y
bromelina ambos dependieron de la actividad proteoliacutetica A modo de resumen en la Figura
37 se muestran graficados los pesos de granulomas en funcioacuten de los pesos de los timos
de los animales tratados con los preparados asiacute como con dexametasona (3 mgkg) a lo
largo del presente trabajo
Figura 37 Relacioacuten peso del granuloma - peso del timo para todos los preparados ensayados Los valores fueron calculados dividiendo el peso promedio del granuloma o timo del lote tratado por el peso promedio del granuloma o timo respectivamente del lote control y expresados como la media plusmn SEM Unidades arbitrarias (ua) Las liacuteneas de puntos representan el liacutemite por debajo del cual los valores se diferencian estadiacutesticamente de los controles (ANOVA Tukey plt005)
Puede observarse maacutes claramente que soacutelo los preparados que redujeron
significativamente el peso de los granulomas (valores por debajo de la liacutenea de puntos
horizontal) disminuyeron significativamente el peso de los timos (valores a la izquierda de la
liacutenea de puntos vertical)
Bromelia balansae (Bb)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bb2E-64(006001 UCaskg)
Bb2(305 UCaskg)
Bb4(312 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Pseudananas macrodontes (Pm)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Pm4(111 UCaskg)
Pm4E-64(0201 UCaskg)
Pm3(334 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Bromelina (Bro)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bro(333 UCaskg)
BroE-64(23 UCaskg)
Bro(101 UCaskg)
Bro(949 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Bromelia hieronymi (Bh)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bh5(364 UCaskg)
Bh5E-64(105 UCaskg)
Bh3(173 UCaskg)
Bh3(345 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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A partir de dichas observaciones se podriacutea considerar que parte del mecanismo de
accioacuten antiinflamatorio involucrariacutea la accioacuten moduladora sobre la poblacioacuten de linfocitos T
siendo dependiente de la actividad proteoliacutetica para Pm y bromelina
Ademaacutes de los efectos directos de bromelina sobre los linfocitos T ya mencionados
tales como la inhibicioacuten en la transduccioacuten de sentildeales (Mynott et al 1999) y la regulacioacuten en
la activacioacuten mediado por la remocioacuten de moleacuteculas de la superficie celular (Hale et al
2002) en varios modelos animales la accioacuten reguladora sobre la poblacioacuten linfocitaria T ha
sido asociado al efecto antiinflamatorio de la bromelina En un modelo murino de asma
aleacutergica inducida por ovoalbuacutemina la bromelina administrada intraperitonealmente pudo
atenuar el desarrollo de la enfermedad disminuyendo significativamente las ceacutelulas T CD4+
activadas en particular CD4+CD25+ las ceacutelulas T CD8+ y la relacioacuten CD4+CD8+ en el BAL
(Secor et al 2005) Luego se demostroacute in vitro que bromelina cliva proteoliacuteticamente CD25
desde la superficie de los linfocitos T activos (Secor et al 2009) Por su parte Targoni et al
(1999) reportan que una mezcla de enzimas que contiene bromelina inhibe la
encefalomielitis aleacutergica experimental murina un modelo de enfermedad autoinmune
mediada por ceacutelulas T Este efecto se atribuyoacute a la escisioacuten proteoliacutetica de las moleacuteculas
accesorias CD4 CD44 y CD80 que median las interacciones de ceacutelulas T y ceacutelulas
presentadoras de antiacutegenos En una serie de ensayos in vitro e in vivo Engwerda et al
(2001) concluyen que la bromelina puede simultaacuteneamente mejorar e inhibir las respuestas
mediadas por linfocitos T a traveacutes de una accioacuten estimulante sobre las ceacutelulas accesorias y
una accioacuten inhibidora directa sobre las ceacutelulas T
Es sabido que en el timo los progenitores linfoides tiacutemicos maduran y se diferencian
en linfocitos T inmunocompetentes a traveacutes de un proceso complejo mediado por
quimocinas interleucinas moleacuteculas de adhesioacuten factores de crecimiento y
fundamentalmente por la interaccioacuten entre las ceacutelulas del estroma intratiacutemico (ceacutelulas
epiteliales ceacutelulas dendriacuteticas interdigitadas y macroacutefagos) y los linfocitos (Fainboim amp
Geffner 2008) Durante su paso por el timo el precursor pasa por distintos estadiacuteos de
diferenciacioacuten que se reflejan por la expresioacuten de distintas moleacuteculas de superficie entre
ellas CD25 y CD44 las cuales han mostrado ser sensibles a la accioacuten de la bromelina como
ya se ha mencionado Por otro lado los timocitos proliferan activamente durante la
diferenciacioacuten sin embargo mediante el proceso de seleccioacuten tiacutemica soacutelo aproximadamente
un 2 de los timocitos originados en el timo murino son rescatados de la apoptosis y
pueden emigrar a la periferia como linfocitos T maduros (Kanwar et al 2008)
Teniendo en cuenta 1) que la bromelina es capaz de afectar la poblacioacuten linfocitaria
T y que esto seriacutea mediado por su accioacuten proteoliacutetica sobre las moleacuteculas de superficie
celular 2) que se ha postulado para la bromelina la capacidad de modular la relacioacuten entre
ceacutelulas accesorias y linfocitos T 3) que el proceso de maduracioacuten de los timocitos es
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
76
mediado por diferentes moleacuteculas de superficie celular en su interaccioacuten con el estroma
tiacutemico 4) que una intensa proliferacioacuten linfocitaria acompantildea el proceso de diferenciacioacuten y
5) la asociacioacuten entre el efecto antiinflamatorio y efecto reductor del peso del timo medidos
para los preparados en especial la posible dependencia entre dichos efectos y la actividad
proteoliacutetica de Pm y bromelina se podriacutea interpretar que los preparados alterariacutean los
complejos mecanismos de interaccioacuten celular entre las ceacutelulas del estroma tiacutemico y los
timocitos afectando la proliferacioacuten de los linfocitos T y dando lugar a una poblacioacuten
linfocitaria T perifeacuterica deficiente cuali yo cuantitativamente para intervenir en la respuesta
inflamatoria
Sin embargo esta hipoacutetesis es deacutebil dada las escasas evidencias sobre las que se
sustenta Por empezar un cambio en el peso del timo no indica cuaacuteles son los tejidos
afectados por lo que una evaluacioacuten histoloacutegica permitiriacutea determinar si la disminucioacuten del
peso se debe a la reduccioacuten en la poblacioacuten de ceacutelulas linfoideas ademaacutes de identificar
alteraciones en la arquitectura del oacutergano Por otro lado no es claro el rol que tendriacutean los
linfocitos T en la inflamacioacuten que se desarrolla en el modelo del granuloma inducido por el
pellet de algodoacuten Si bien el desarrollo de la inflamacioacuten granulomatosa es en general un
proceso en el que los linfocitos T tendriacutean un rol predominante los granulomas generados
por cuerpo extrantildeo como es el caso del pellet de algodoacuten estaacuten compuestos casi
exclusivamente por macroacutefagos al menos durante las fases de iniciacioacuten y acumulacioacuten (Co
et al 2004) siendo muy escasas las ceacutelulas linfociacuteticas (Ohtani 2013)
Dado el perfil de actividad de muacuteltiples blancos que caracteriza a la bromelina (Muumlller
et al 2012 Chobotova et al 2010) y probablemente a los preparados proteoliacuteticos
ensayados en el presente trabajo es muy posible que los efectos antiinflamatorio y sobre el
peso de los timos sean independientes entre siacute aunque ambos dependientes de la actividad
proteoliacutetica tanto en el caso de Pm como de bromelina
Dado que los mecanismos de accioacuten que subyacen a los efectos medidos no han
sido objeto de estudio del presente trabajo doctoral futuras investigaciones permitiriacutean
profundizar el conocimiento del rol que cumplen las proteasas de bromelina y especialmente
de Pm que hasta entonces no habiacutean sido estudiadas farmacoloacutegicamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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35 Conclusiones
Bh Bb Pm y bromelina mostraron efecto antiinflamatorio frente a la inflamacioacuten
aguda (edema de pata de rata inducido por carragenina)
Dosis de Bh Pm y bromelina equivalentes en actividad proteoliacutetica mostraron
porcentajes de inhibicioacuten de edema similares entre siacute y con el de indometacina (10
mgkg) actuando predominantemente sobre la fase tardiacutea (3-7h) propuesta para el
modelo edema de pata inducido por carragenina
Bb actuoacute soacutelo sobre la fase tardiacutea propuesta para el modelo edema de pata de rata
inducido por carragenina mostrando porcentajes de inhibicioacuten de edema inferiores a
los de dosis de Bh Pm y bromelina con equivalente actividad proteoliacutetica
Proteasas cisteiacutenicas de Bb Pm y principalmente de Bh y bromelina seriacutean las
causales del efecto antiinflamatorio sobre la inflamacioacuten aguda (edema de pata de
rata inducido por carragenina) y actuariacutean sobre la fase tardiacutea del modelo (3-7h)
En algunos de los ensayos de edema de pata de rata Bb mostroacute signos de toxicidad
Bh Pm y bromelina mostraron efecto antiinflamatorio frente al modelo de inflamacioacuten
aguda edema de pata de rata inducido por serotonina
A las dosis ensayadas Bh Pm y bromelina no inhibieron el edema de pata de rata
inducido por histamina
Una dosis de Pm con 3 veces menos de actividad proteoliacutetica que una dosis de
bromelina mostraron efectos antiinflamatorios significativamente similares sobre el
modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma inducido por algodoacuten
Los efectos antiinflamatorios de Pm y bromelina en el test del granuloma inducido por
algodoacuten dependeriacutean de la actividad proteoliacutetica de sus proteasas cisteiacutenicas
Los efectos antiinflamatorios de dosis equivalentes a 30 UCaskg de Bh y Bb no
fueron reproducibles en el modelo de inflamacioacuten croacutenica
Los efectos antiinflamatorios medidos para los preparados proteoliacuteticos en el modelo
del test del granuloma inducido por algodoacuten fueron acompantildeados de un significativo
y leve efecto reductor del peso del timo de los animales tratados
Los efectos reductores del peso del timo fueron dependientes de la actividad
proteoliacutetica de las proteasas cisteiacutenicas de Pm y de bromelina
Los efectos antiinflamatorios de los preparados proteoliacuteticos fueron significativamente
menores al de dexametasona (3 mgkg)
A diferencia de la dexametasona ninguno de los preparados redujo
significativamente el peso del bazo como tampoco produjeron peacuterdida de masa
corporal mientras que los porcentajes de reduccioacuten del peso del timo fueron
significativamente menores al de dexametasona
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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36 Referencias
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82
41 Hemostasia
En los vertebrados la sangre fluye con una presioacuten relativamente elevada por
conductos que conforman un compartimento cerrado Sin embargo frente a una injuria vascular
la peacuterdida de sangre desde dicho compartimento es limitada El conjunto de mecanismos
fisioloacutegicos que mantienen la sangre fluida e impiden su fuga se denomina hemostasia En ella
intervienen la pared de los vasos sanguiacuteneos componentes celulares (plaquetas) y solubles
(factores plasmaacuteticos de la coagulacioacuten) de la sangre el flujo sanguiacuteneo y de manera
indirecta el almohadillado celuloadiposo y conjuntivo que rodeando el aparato vascular lo
protege por fuera (Castillo et al 1994)
Se denomina hemostasia correctora a la que actuacutea evitando la peacuterdida de sangre
cuando una lesioacuten afecta la integridad de la pared vascular y puede dividirse en cuatro fases
1 Vasoconstriccioacuten localizada
2 Formacioacuten de un agregado plaquetario sobre el aacuterea lesionada
3 Coagulacioacuten (formacioacuten de fibrina)
4 Fibrinoacutelisis (degradacioacuten y remodelacioacuten del coaacutegulo de fibrina)
Puesto que parte de los objetivos de esta tesis se refieren al efecto de los preparados
proteoliacuteticos sobre las fases 3 y 4 las fases 1 y 2 soacutelo seraacuten someramente expuestas
411 Vasoconstriccioacuten
Luego de la lesioacuten vascular se produce una vasoconstriccioacuten en el aacuterea afectada que
conduce al enlentecimiento del flujo sanguiacuteneo Esto favorece la interaccioacuten entre las plaquetas
y los factores de la coagulacioacuten con el endotelio iniciando las fases 2 y 3 Inicialmente y durante
los primeros segundos la vasoconstriccioacuten es debida a una estimulacioacuten simpaacutetica en la
musculatura lisa del vaso y es sostenida probablemente por la serotonina la adrenalina y el
tromboxano A2 (TXA2) liberados desde las plaquetas activadas (Castillo et al 1994)
412 Formacioacuten del trombo plaquetario
En condiciones fisioloacutegicas el trombo plaquetario se forma en el aacuterea lesionada y consta
de varias etapas que involucran la adhesioacuten la activacioacuten y la agregacioacuten plaquetaria
Las plaquetas se adhieren a la pared vascular a traveacutes del subendotelio que queda
expuesto por la lesioacuten Las proteiacutenas que median la unioacuten son fundamentalmente el colaacutegeno
subendotelial el factor de von Willebrand (FvW) y la fibronectina mientras que los receptores
plaquetarios involucrados son glicoproteiacutenas de membrana la GPVI las integrinas GPIaIIa
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
83
(α2β1) y GPIIbIIIa (αIIbβ3) y el complejo Ib-V-IX La consecuencia inmediata de la adhesioacuten es la
activacioacuten plaquetaria que se caracteriza por a) cambio de forma discoide a esfeacuterica con
emisioacuten de pseudoacutepodos y b) contraccioacuten dependiente de Ca+2 intracitoplasmaacutetico la cual
determina el proceso de agregacioacuten plaquetaria Durante el proceso de activacioacuten se
desencadenan reacciones metaboacutelicas asiacute como se generan yo liberan agonistas que
amplifican el proceso tales como ADP y TXA2 Algunos agonistas de la activacioacuten plaquetaria
son el colaacutegeno la adrenalina la noradrenalina la serotonina y el PAF (Castillo et al 1994)
El ADP es liberado desde los graacutenulos densos junto a la serotonina al medio
extracelular e induce la activacioacuten de plaquetas por unioacuten a receptores de membrana El TXA2
sintetizado a partir del aacutecido araquidoacutenico (AA) por las viacuteas de la ciclooxigenasa (COX) y la
tromboxano sintetasa es un potente agregante plaquetario y vasoconstrictor El AA es liberado
desde la membrana plaquetaria por la fosfolipasa A2 activada por la unioacuten de agonistas a sus
receptores Otros agonistas desencadenan el metabolismo del fosfatidilinositol conduciendo a
la activacioacuten de proteincinasa C (PKC) que junto a otras cinasas intervienen en varios procesos
de la activacioacuten plaquetaria (Martinuzzo et al 2003)
La agregacioacuten plaquetaria consiste en la unioacuten de plaquetas entre siacute iniciada por la
unioacuten de plaquetas circulantes a las plaquetas ya adheridas al subendotelio Esta unioacuten es
mediada por el FvW y el fibrinoacutegeno el receptor plaquetario es la integrina GPIIbIIIa que es
expresada en la membrana luego de cambios conformacionales dependientes de Ca+2 y
fosforilaciones mediadas por cinasas (Martinuzzo et al 2003) La trombina induce la activacioacuten
y la agregacioacuten plaquetaria provocando la liberacioacuten de ADP y la siacutentesis de TXA2 (Castillo et
al 1994) Una consecuencia de la activacioacuten plaquetaria es la exposicioacuten de fosfoliacutepidos
anioacutenicos en la membrana cruciales para el proceso de coagulacioacuten (Martinuzzo et al 2003)
413 Coagulacioacuten
La coagulacioacuten plasmaacutetica consiste en la transformacioacuten catalizada por la trombina del
fibrinoacutegeno soluble en una red de fibras (fibrina) proceso que intensifica y asegura la
hemostasia temporal iniciada con la vasoconstriccioacuten y desarrollada por las plaquetas Se
produce como resultado de una serie de reacciones en cascada en la que sucesivamente una
proenzima inactiva (zimoacutegeno) es convertida en enzima activa la cual a su vez activa otra
proenzima Los componentes de esta cascada son denominados factores de coagulacioacuten
(Tabla 41) y se clasifican en tres grupos dependientes de la vitamina K sensibles a trombina y
de contacto Los factores dependientes de la vitamina K se caracterizan por poseer un
aminoaacutecido particular el aacutecido γ-carboxiglutaacutemico obtenido por la carboxilacioacuten del aacutecido
glutaacutemico mediada por la vitamina K (Castillo et al 1994)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
84
Factor Nombre sinoacutenimos Peso molecular
(kDa)
Vida media
(h) Grupo
FI Fibrinoacutegeno 340 100-150 T
FII Protrombina 72 50-80 K
FIII Factor tisular (FT)
tromboplastina tisular 44
FIV Calcio
FV Proacelerina 290-400 24 T
FVII Proconvertina 63 6 K
FVIII Factor antihemoliacutetico A 240 12 T
FIX Factor antihemoliacutetico B 554 24 K
FX Factor Stuart 55 25-60 K
FXI Antecedente tromboplastiacutenico
del plasma (PTA) 160 40-80 C
FXII Factor Hageman 90 50-70 C
FXIII Factor estabilizante
de la fibrina 320 150 T
Precalicreiacutena 88 35 C
cininoacutegeno de alto peso
molecular (HMWK)
120 150 C
FvW Factor de von Willebrand 500-20000 24
Tabla 41 Factores de coagulacioacuten Pesos moleculares vida media en plasma y grupo al que pertenecen K
vitamina K-dependientes T trombina sensibles C de contacto
La cascada de coagulacioacuten fue claacutesicamente descripta como dos viacuteas de activacioacuten de
zimoacutegenos que confluiacutean activando el FX y una viacutea comuacuten en la que el FX convertiacutea la
protrombina en trombina y eacutesta el fibrinoacutegeno en fibrina (Figura 41) En este modelo la viacutea
intriacutenseca es desencadenada por contacto del FXII con una superficie cargada negativamente
(por exposicioacuten de un epitelio distinto al vascular) e involucra ademaacutes a los factores FXI FIX
FVIII precalicreiacutena y HMWK La viacutea extriacutenseca desencadenada por la exposicioacuten del FT (por
una lesioacuten tisular) a la circulacioacuten involucra a FVII (Castillo et al 1994) Las plaquetas
activadas intervienen aportando su superficie fosfolipiacutedica (factor plaquetario III) que actuacutea
como catalizador en la etapa final de la viacutea intriacutenseca y en la viacutea comuacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
85
Figura 41 Modelo claacutesico de la cascada de coagulacioacuten La coagulacioacuten se puede iniciar con la liberacioacuten del FT (Viacutea extriacutenseca) yo con el contacto del FXII con una superficie cargada negativamente (Viacutea intriacutenseca) Ambas viacuteas confluyen activando el FX a FXa el que desencadena la viacutea comuacuten que finaliza con la formacioacuten de fibrina Los factores representados como ciacuterculos actuacutean como cofactores para los factores que actuacutean como enzimas (estrellas)
en las reacciones sentildealadas La superficie fosfolipiacutedica es representada como un oacutevalo celeste
Maacutes recientemente se ha propuesto otro modelo de coagulacioacuten en el cual a) el FT es
el principal desencadenante de la coagulacioacuten b) la amplificacioacuten generada por la trombina es
considerada esencial para el desarrollo del coaacutegulo estable y c) existe interdependencia entre
los factores plasmaacuteticos y los elementos celulares (Figura 42) En este modelo la cascada de
coagulacioacuten es vista como un proceso gradual y superpuesto de activaciones proteoliacuteticas en
tres fases inicial de amplificacioacuten y de propagacioacuten en cuyas dos uacuteltimas fases la superficie
celular es fundamental para localizar la formacioacuten del coaacutegulo sobre la superficie dantildeada Las
dos viacuteas claacutesicas se unen a traveacutes del complejo FTFVIIa (viacutea extriacutenseca) el cual es capaz de
activar el factor de la viacutea intriacutenseca FIX (Adams amp Bird 2009)
4131 Fase inicial
La exposicioacuten del FT a la sangre por dantildeo o activacioacuten del endotelio actuacutea como
desencadenante de la coagulacioacuten activando el FVII circulante a FVIIa junto con el cual forma
el complejo tenasa del factor extriacutenseco (FTFVIIa) sobre la superficie fosfolipiacutedica de la
membrana celular Este complejo activa el FX a FXa y el FIX a FIXa (Adams amp Bird 2009) Si el
FXa permanece en la superficie puede unirse al FVa y activar el FII generando cantidades
picomolares de trombina (FIIa) (Martinuzzo et al 2003)
La duracioacuten de esta fase depende de la concentracioacuten del complejo FTFVIIa y del
inhibidor de la viacutea del factor tisular (TFPI) el cual forma un complejo FTFVIIaFXaTFPI capaz
VIacuteA INTRIacuteNSECA
Superficie dantildeada(carga negativa)
FXII
FXIIa
HMWK FXI
FXIa
FIX
FIXa
FX
FXa
FVIIIa
Ca+2
Trauma
Fosfo
liacutepid
os FT
FVIIa
FVII
VIacuteA EXTRIacuteNSECA
Protrombina
Trombina
Fibrinoacutegeno
Fibrina
VIacuteA COMUacuteN
Fosfo
liacutepid
osCa+2
FVa
Calicreiacutena
Precalicreiacutena
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
86
de limitar la formacioacuten de FXa La expresioacuten del FT tambieacuten puede ser inducido en plaquetas y
monocitos asiacute como en micropartiacuteculas circulantes (MP) derivadas de las ceacutelulas en las que se
expresa (Adams amp Bird 2009)
Resulta importante sentildealar que la fase de contacto de la viacutea intriacutenseca en la que
intervienen el FXII la precalicreiacutena y el HMWK no es requerida para iniciar la cascada si bien
es fundamental para los estudios in vitro de la coagulacioacuten (Furie amp Furie 2008)
4132 Fase de amplificacioacuten
Las pequentildeas cantidades generadas de trombina pueden activar al FV y al FVIII los
cuales actuacutean como cofactores de los complejos protrombinasa (FVaFXa) y tenasa intriacutenseca
(FVIIIaFIXa) formados junto a Ca+2 sobre superficies fosfolipiacutedicas pertenecientes
principalmente a las plaquetas La amplificacioacuten de la coagulacioacuten estaacute dada por el incremento
en la produccioacuten del FXa por parte del complejo tenasa intriacutenseca (entre 50 y 100 veces maacutes
que la generada por el complejo FTFVIIa) y de trombina (Adams amp Bird 2009) El FVIII se
asocia al FvW el que mediante su interaccioacuten con la glicoproteiacutena Ib-V-IX se une a la plaqueta
haciendo maacutes eficiente la activacioacuten del FVIII por la trombina (Martinuzzo et al 2003)
Otro efecto amplificador es la activacioacuten del FXI a FXIa por parte de la trombina en
presencia de Ca+2 y protrombina lo que permite al FXIa localizarse en la superficie plaquetaria y
activar maacutes FIX La trombina activa las plaquetas mediante la unioacuten al PAR-1 (receptor activado
por proteasas) lo que a su vez induce la degranulacioacuten de graacutenulos α la expresioacuten de FVa
sobre la membrana y la activacioacuten de GPIIbIIIa estimulando la agregacioacuten plaquetaria y
activando la superficie plaquetaria al inducir la exposicioacuten de fosfoliacutepidos anioacutenicos
(fosfatidilserina) sobre la misma Las plaquetas activadas por trombina muy probablemente
sean las activadas por colaacutegeno durante la adhesioacuten plaquetaria y tienen una gran afinidad para
unir en su superficie los complejos protrombinasa y tenasa intriacutenseca (Adams amp Bird 2009)
4133 Fase de propagacioacuten
Durante la fase de amplificacioacuten se generan plaquetas activadas capaces de unir los
complejos cataliacuteticos maacutes eficientes para la produccioacuten de trombina la cual a su vez activa a las
plaquetas y a los factores y cofactores que componen esos complejos La fase de propagacioacuten
se basa en el reclutamiento de esas plaquetas activadas en el sitio de injuria El resultado de
estas reacciones es la produccioacuten ldquoexplosivardquo de trombina suficiente como para transformar el
fibrinoacutegeno en fibrina y generar un coaacutegulo estable (Adams amp Bird 2009)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Figura 42 Modelo de la coagulacioacuten con base celular 1 La coagulacioacuten se inicia sobre la ceacutelula portadora del FT originando pequentildeas cantidades de trombina MP micropartiacuteculas circulantes MB membrana basal del endotelio Plt plaquetas 2 La pequentildea cantidad de trombina generada permite activar cofactores plaquetas y FXI formaacutendose sobre las plaquetas los efectivos complejos tenasa intriacutenseco (FVIIIaFIXa) y protrombinasa (FVaFX) que amplifican las reacciones productoras de trombina PS fosfatidilserina 3 Durante la fase de propagacioacuten la cantidad de trombina requerida para la formacioacuten del coaacutegulo se forma desde la superficie de las plaquetas localizadas en el sitio de injuria (Modificado de Adams amp Bird 2009)
4134 Formacioacuten de la fibrina
Puesto que la fibrina se construye a partir de los cambios estructurales que produce la
trombina sobre el fibrinoacutegeno es conveniente describir brevemente la estructura de este uacuteltimo
El fibrinoacutegeno es una glicoproteiacutena fibrosa de gran tamantildeo (340 kDa) compuesta por un diacutemero
de tres cadenas polipeptiacutedicas Aα Bβ y γ unidas por 29 puentes disulfuro (Figura 43) En
cuanto a su estructura terciaria se pueden identificar una regioacuten nodular central (E) y dos
regiones nodulares finales (D)
Figura 43 Estructura molecular del fibrinoacutegeno humano basado en la estructura cristalograacutefica obtenida por rayos X (Kollman et al 2009) las regiones α-C y sus cadenas conectoras no pueden ser resueltas por cristalografiacutea de rayos
X por lo que se muestran esquemaacuteticamente Los fibrinopeacuteptidos son esquematizados para destacar su interaccioacuten con α-C (Tomado de Guthold amp Cho 2011 y parcialmente modificado)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
88
La regioacuten E estaacute formada por los extremos amino terminal unidos por puentes disulfuro
de las seis cadenas Las regiones D estaacuten formadas por los extremos globulares carboxilo
terminales de las cadenas Bβ (β-C) y γ (γ-C) los que a su vez estaacuten formados por tres
dominios Los extremos carboxilo terminales de las cadenas Aα (α-C) se extienden desde el
extremo de la moleacutecula e interactuacutean entre siacute y con el centro (Weisel 2005) Los segmentos
centrales de las tres cadenas se enroscan formando una triple α-heacutelice (regioacuten coiled-coil) que
proporciona flexibilidad y estabilidad mecaacutenica a la moleacutecula uniendo las regiones D a la regioacuten
E (Lauricella 2007)
Se han identificado funciones para varias de las regiones del fibrinoacutegeno la regioacuten E
posee sitios de unioacuten de diferentes afinidades para la trombina el extremo carboxilo terminal de
una variante de la cadena γ (γ`) une trombina y FXIII la regioacuten D aporta sitios DD que
contribuyen a la alineacioacuten de los monoacutemeros de fibrina y sitios DA (en γ-C) o DB (en β-C) donde
se insertaraacuten los sitios A y B (regioacuten E) respectivamente de monoacutemeros vecinos (Figura 44)
finalmente el sitio γXL de la cadena γ interviene en el ensamblado de la fibrina y facilita la accioacuten
del FXIII (Lauricella 2007)
Figura 44 Formacioacuten de fibrina Esquemas de la moleacutecula de fibrinoacutegeno y de la formacioacuten de los distintos niveles estructurales de la fibrina (Tabla de la derecha) luego de la accioacuten de la trombina y del FXIIIa (Estructuras de fibrinoacutegeno y fibras parcialmente modificadas de Undas amp Arieumlns 2011)
TROMBINA
TROMBINA
Fibrinopeacuteptidos A
Fibrinopeacuteptidos B
MICROFIBRA
FIBRA
FIBRINA INSOLUBLE
FIBRINOacuteGENO
Monoacutemero de fibrina
NIVEL
POLIMERO
NIVEL
GEL
(Agregados de microfibras)
(Red tridimensional con distintos grados de ramificaciones)
(Presencia de entrecruzamientos)FXIIIa
FIBRINA SOLUBLE
FXIII
TROMBINACa
++
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
89
La trombina cliva cuatro enlaces especiacuteficos Arg-Gly de los extremos amino terminales
de Aα y Bβ en la regioacuten E desde los cuales se liberan los fibrinopeacuteptidos A y B
respectivamente y se exponen nuevos sitios (A y B respectivamente) en las cadenas clivadas
del ahora monoacutemero de fibrina
La polimerizacioacuten ocurre en varias etapas conduciendo a distintos niveles estructurales
La unioacuten entre monoacutemeros por interacciones de sus sitios A y B (regioacuten E) con sitios DA y DB
(regiones D) de otros monoacutemeros asiacute como las interacciones entre regiones D (a traveacutes de los
sitios DD) de monoacutemeros contiguos que contribuyen a la elongacioacuten del poliacutemero da lugar a la
formacioacuten de microfibras (o protofibras) estabilizadas por interacciones E-D (Lauricella 2007)
La liberacioacuten del fibrinopeacuteptido B produce tal cambio conformacional que los dominios α-C se
disocian de la regioacuten E y quedan disponibles para las interacciones intermoleculares que
favorecen la agregacioacuten bilateral de las microfibras dando lugar a fibras maacutes gruesas ademaacutes
de contribuir a la estabilidad y a las propiedades mecaacutenicas del coaacutegulo (Weisel 2007 Zhmurov
et al 2011) A su vez las fibras se asocian generando ramificaciones que conforman una red
tridimensional (fibrina soluble) La red es finalmente estabilizada (fibrina insoluble) por el FXIIIa
una transglutaminasa activada por trombina en presencia de Ca+2 El FXIIIa forma puentes
amida entre un grupo amino de residuos de lisina y un grupo carbonilo de residuos de glutamina
dando lugar a entrecruzamientos en la red que pueden ser entre dos cadenas γ dos Aα o una
γ con una Aα La fibrina estabilizada es maacutes resistente a la fibrinoacutelisis (Lauricella 2007)
4135 Regulacioacuten de la coagulacioacuten
Numerosas proteiacutenas cumplen con la funcioacuten regulatoria de la coagulacioacuten actuando en
los distintos niveles El FT es regulado por el inhibidor de la viacutea del factor tisular (TFPI) el que
es expresado por el endotelio y las plaquetas asiacute como por otras ceacutelulas y circula unido a LDL
TFPI tambieacuten neutraliza la actividad del FXa e inhibe el complejo FTFVIIa
La antitrombina el principal inhibidor de la coagulacioacuten es un inhibidor de
serinoproteasas tales como FXa FXIa FIXa y calicreiacutena y se sintetiza en el endotelio Por
actuar preferencialmente sobre las enzimas libres contribuye a limitar la coagulacioacuten en la
regioacuten de lesioacuten (Adams amp Bird 2009)
El cofactor II de heparina es un inhibidor de trombina que requiere la presencia de
dermataacuten sulfato o heparina para acelerar su reaccioacuten Los FVa y FVIIIa son inactivados por la
proteiacutena C activa (APC) actuando como cofactor la proteiacutena S La activacioacuten de la proteiacutena C es
llevada a cabo por la trombina unida a la trombomodulina del endotelio mientras que la APC es
inhibida por α1-antitripsina (α1-AT) y por α2-macroglobulina (α2-MG) asiacute como por el inhibidor de
proteiacutena C (PCI) La α1-AT inhibe tambieacuten FXIa calicreiacutena y trombina La α2-MG es un inhibidor
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
90
de amplio espectro ya que inhibe la plasmina la tripsina la calicreiacutena y la elastasa entre otras
ademaacutes de trombina El FXa y el FXIa son inhibidos por el inhibidor de proteasas dependiente
de proteiacutena Z (ZPI) una proteiacutena K-dependiente usando como cofactor la proteiacutena Z
(Martinuzzo et al 2003)
El endotelio actuacutea regulando la hemostasia manteniendo las caracteriacutesticas no
trombogeacutenicas de la cara luminal en contacto con la sangre a traveacutes de la siacutentesis de heparaacuten y
dermataacuten sulfato componentes del sistema de la proteiacutena C antiagregantes plaquetarios como
prostaciclina G2 (PGI2) y oacutexido niacutetrico (NO) entre otros Mientras que ante estiacutemulos
trombogeacutenicos se sintetizan factores prohemostaacuteticos (FvW FT FV)
414 Fibrinoacutelisis
La deposicioacuten de fibrina induce el sistema fibrinoliacutetico que de manera controlada
remueve o remodela el coaacutegulo a traveacutes de la fibrinoacutelisis evitando el depoacutesito indeseado de
fibrina El sistema fibrinoliacutetico estaacute compuesto por zimoacutegenos activadores e inhibidores y a
traveacutes de diferentes mecanismos activa el plasminoacutegeno (Plg) a plasmina que actuacutea
proteoliacuteticamente sobre la fibrina La fibrinoacutelisis estaacute regulada por la concentracioacuten de los
activadores de Plg los cuales tienen una lenta difusioacuten a coaacutegulos ya formados por lo que es
importante su presencia durante la formacioacuten de la red de fibrina de manera que queden
incorporados al coaacutegulo Los principales activadores del Plg son el activador tisular del
plasminoacutegeno (t-PA) y el activador de tipo uroquinasa (u-PA) ademaacutes de algunos activadores
exoacutegenos como la estreptoquinasa generada por estreptococos β-hemoliacuteticos (Martinuzzo et
al 2003)
El t-PA es sintetizado en el endotelio y liberado en respuesta a trombina histamina
bradicinina interleucinas estreacutes y eacutestasis venoso (Martinuzzo et al 2003) entre otros La baja
afinidad del t-PA circulante por el Plg aumenta en presencia de fibrina que es capaz de fijarlo
al igual que al Plg sobre su estructura Asiacute la fibrina promueve la formacioacuten de plasmina sobre
su superficie favoreciendo una lisis local y no una generalizada
El u-PA es secretado por ceacutelulas endoteliales renales y tumorales Se sintetiza en forma
de simple cadena (scu-PA) conocida como prouroquinasa (activa el Plg sobre la fibrina) que
puede ser activada a su forma de doble cadena (tcu-PA) por accioacuten de la plasmina o por los
factores de la fase de contacto (precalicreiacutena HMWK FXII) siendo capaz de actuar sobre el Plg
en fase fluida (Martinuzzo et al 2003)
La plasmina degrada la fibrina (estabilizada por el FXIIIa) liberando fragmentos de
distintos pesos moleculares que en su mayoriacutea incluyen al diacutemero DD (contiene las regiones D
de monoacutemeros contiguos unidos covalentemente) La accioacuten de la plasmina sobre el fibrinoacutegeno
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91
produce fragmentos X Y D y E similares a los que genera al actuar sobre la fibrina no
estabilizada salvo por la ausencia de los fibrinopeacuteptidos A y B (Figura 45)
Figura 45 Productos de degradacioacuten del fibrinoacutegeno y de la fibrina Las flechas rojas indican puntos de corte de la
plasmina las barras negras representan los entrecruzamientos en la fibrina formados por el FXIIIa (Estructuras de
fibrinoacutegeno y fibrina parcialmente modificadas de Undas amp Arieumlns 2011)
La plasmina tambieacuten es capaz de degradar otras proteiacutenas plasmaacuteticas como el FII el
FV el FVIII cininas componentes del complemento asiacute como tambieacuten activar metaloproteasas
que intervienen en la degradacioacuten de la matriz extracelular Por esto es importante la regulacioacuten
de la fibrinoacutelisis que se da tanto a nivel de la plasmina como de los activadores del Plg
(Martinuzzo et al 2003)
La plasmina circulante es inhibida por unioacuten de la α2-antiplasmina (α2-AP) que no soacutelo
afecta el sitio activo sino tambieacuten los sitios de unioacuten a la fibrina Los inhibidores de los
activadores de Plg (PAI) se encuentran en altas concentraciones en sangre y actuacutean formando
complejos covalentes ya sea con el t-PA como con el u-PA
Por su parte la trombina inhibe la fibrinoacutelisis mediante la activacioacuten del inhibidor de la
fibrinoacutelisis activable por trombina (TAFI) El TAFIa remueve residuos Lys de la fibrina
eliminando los sitios de unioacuten al Plg requeridos para la activacioacuten por el t-PA (Adams amp Bird
2009)
42 Trombosis (Korin 2003)
La trombosis es la presencia intravascular de material fibrino-plaquetario con variable
contenido de hematiacutees y leucocitos y puede ser una respuesta fisioloacutegica (trombo hemostaacutetico)
Fibrinoacutegeno
Fragmento X
Fragmento DFragmento Y
Fragmento D Fragmento E
Fragmento (DD)EFragmento (DD)
Fragmento DYYD
Fibrina estabilizada
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92
tal como ya ha sido descripto o ser la consecuencia de una activacioacuten patoloacutegica e inapropiada
del sistema de coagulacioacuten
El trombo patoloacutegico puede ser parcial o totalmente oclusivo hecho que puede llevar a
una isquemia de grado variable y consecuente peacuterdida de la funcioacuten vital del oacutergano ademaacutes
de la posibilidad de embolizacioacuten distal y la consecuente embolia pulmonar Seguacuten donde se
asienten los trombos se dividen en venosos arteriales cardiacuteacos y de microcirculacioacuten
La trombosis venosa se caracteriza por la presencia de trombos compuestos
principalmente por hematiacutees y fibrina (trombos rojos) Los factores desencadenantes maacutes
importantes son la disminucioacuten de la velocidad del flujo sanguiacuteneo (anestesias incapacidad
motora aumento de viscosidad sanguiacutenea etc) y cambios en los sistemas de coagulacioacuten y
fibrinoacutelisis (descenso de inhibidores aumento en la concentracioacuten de factores hipofuncioacuten
fibrinoliacutetica etc) Asiacute actuacutean como factores de riesgo los estados post-operatorios las
neoplasias las plejiacuteas los estados trombofiacutelicos y la edad creciente Cuando la trombosis se
localiza en el sistema venoso profundo suele estar asociada con el riesgo de embolia pulmonar
y constituyen los polos cliacutenicos del tromboembolismo venoso (TEV)
El TEV es tratado y prevenido con anticoagulacioacuten (heparinas no fraccionadas
heparinas de bajo peso molecular o dicumariacutenicos) Casos de TEV severos requieren de un
tratamiento tromboliacutetico
La trombosis arterial se produce en zonas de alta velocidad de flujo sanguiacuteneo y los
trombos se componen fundamentalmente de agregado plaquetario y fibrina y en menor
medida de hematiacutees y leucocitos (trombos blancos) Es consecuencia de alteraciones en la
pared vascular (placas ateromatosas) y puede conducir a accidentes cerebrovasculares y
sindromes coronarios agudos entre otras complicaciones
Los factores que pueden desencadenar la trombosis arterial son un endotelio
disfuncional alteraciones en el flujo sanguiacuteneo y la activacioacuten del sistema de coagulacioacuten
mediado por la exposicioacuten del FT Paralelamente se produce reclutamiento activacioacuten y
agregacioacuten plaquetaria asiacute como la activacioacuten del sistema fibrinoliacutetico el que es regulado por el
PAI-1 depositado en la placa ademaacutes del TAFI y la α2-AP La trombogenicidad de una placa es
una funcioacuten del contenido de FT el cual determina la velocidad de produccioacuten de trombina El
FT presente en las placas proviene de las micropartiacuteculas (MP) derivadas de macroacutefagos
linfocitos y ceacutelulas musculares lisas activadas por citoquinas asiacute como de las membranas de
neutroacutefilos y monocitos que invaden la placa por quimiotaxis y adhesioacuten todo ello favorecido por
el endotelio disfuncional Asiacute el nivel de inflamacioacuten tambieacuten contribuye al desarrollo de la
trombosis arterial Por otro lado el colaacutegeno presente en la placa es un desencadenante de la
activacioacuten plaquetaria El tratamiento depende de la localizacioacuten y compromiso del oacutergano
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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93
afectado para lo cual se usan heparinas aspirina inhibidores de la GPIIbIIIa y tromboliacuteticos
entre otros Dado que la aterotrombosis es una enfermedad multifactorial y multigeacutenica se
asocian muacuteltiples factores de riesgo que deben ser tenidos en cuenta para un tratamiento maacutes
adecuado A los factores de riesgo claacutesicos (diabetes obesidad tabaquismo hiperlipidemia
etc) se han empezado a evaluar otros tales como niveles altos de fibrinoacutegeno indicadores de
inflamacioacuten variantes de glicoproteiacutenas plaquetarias niveles de PAI-1 y polimorfismos de APO
entre otros
421 Agentes para el tratamiento de la trombosis
El tratamiento de los desoacuterdenes tromboacuteticos requieren de tres grupos de faacutermacos
anticoagulantes antiagregantes plaquetarios y fibrinoliacuteticos (Tabla 42) Dado que los blancos
de accioacuten son componentes del sistema hemostaacutetico la desventaja que comparten es el riesgo
a la hemorragia El antitromboacutetico ideal seriacutea aquel que inhibe la trombosis y evita el riesgo de
hemorragia (Furie amp Furie 2008)
Anticoagulantes Antiagregantes plaquetarios Fibrinoliacuteticos
Heparina no fraccionada (HNF)
Heparina de bajo peso molecular
(HBPM)
Inhibidores de trombina (ej
argatroban bivalirudina hirudina)
Anticoagulantes orales
Aspirina
Inhibidores de GPIIbIIIa (ej
abciximab eptifibatide tirofiban)
Bloqueador del receptor de ADP (ej
Ticlopidina clopidogrel)
Inhibidores de TXA2 sintasa
Antagonistas de TXA2
Estreptoquinasa
Activadores del plasminoacutegeno tisular
recombinantes (r-TPAs)
Tabla 42 Agentes para el tratamiento de la trombosis
Los desoacuterdenes cardiovasculares representan la principal causa de muerte en el mundo
asiacute como en la Argentina (WHO) Aunque la trombosis sigue siendo la viacutea final de enfermedad y
muerte en algunas de las enfermedades maacutes comunes tales como infarto de miocardio
accidente cerebrovascular y caacutencer todos los agentes farmacoloacutegicos disponibles para su
prevencioacuten o tratamiento han estado en uso durante deacutecadas o han sido reemplazados con
nuevas variantes que ofrecen una modesta mejora incremental (Furie amp Furie 2008)
En los uacuteltimos antildeos una serie de combinaciones de anticoagulantes antiagregantes
plaquetarios y agentes fibrinoliacuteticos se han probado en ensayos cliacutenicos en pacientes con
siacutendromes coronarios agudos dando lugar a cambios en la praacutectica cliacutenica y mejoras en la
morbilidad y mortalidad de los pacientes (Merli 2007)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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94
En cuanto a los agentes fibrinoliacuteticos la estreptoquinasa sigue siendo un medicamento
efectivo para disolver coaacutegulos estando indicada en el tratamiento de algunos casos de infarto
de miocardio (Sikri amp Bardia 2007) Sin embargo la estreptoquinasa y la u-PA activan no soacutelo
el Plg unido a fibrina sino tambieacuten el Plg circulante generando plasmina libre la cual es capaz
de degradar otras proteiacutenas plasmaacuteticas ademaacutes de contribuir a eventos proinflamatorios
(Syrovets et al 2012) Durante la uacuteltima deacutecada la atencioacuten se ha centrado en la mejora de la
potencia eficacia y facilidad de administracioacuten de los agentes fibrinoliacuteticos En este sentido se
han desarrollado variantes recombinates de los PAs que preferencialmente activan el Plg unido
a fibrina (Collen 1996)
La buacutesqueda de enzimas fibrinoliacuteticas alternativas llevoacute hace 70 antildeos al descubrimiento
de los venenos de serpiente como agentes de disolucioacuten intravascular para coaacutegulos La
alfimeprasa una variante recombinante del veneno se caracteriza por tener un efecto directo
sobre la fibrina y es raacutepidamente inhibida al ser unida por α2-MG (Anoacutenimo 2008)
4211 Proteasas vegetales como antitromboacuteticos
La bromelina ha mostrado ser un agente fibrinoliacutetico in vivo e in vitro no soacutelo actuacutea
directamente sobre la fibrina tambieacuten activa el Plg y aumenta la concentracioacuten de plasmina Por
otro lado y en relacioacuten a su efecto antimetastaacutesico es capaz de disminuir la expresioacuten de uPAR
(receptor de u-PA) en ceacutelulas tumorales (Maurer 2001) En un modelo inflamatorio animal
bromelina incrementoacute la actividad fibrinoliacutetica seacuterica de manera dosis dependiente (Pirotta amp de
Giuli-Morghen 1978)
En un modelo de trombosis in vivo la administracioacuten oral de esta proteasa disminuyoacute la
formacioacuten de trombos (13 en arteriolas y 5 en veacutenulas) mientras que in vitro redujo la
adhesioacuten al endotelio de plaquetas humanas activadas por trombina Por otro lado el
tratamiento de plaquetas humanas con bromelina redujo la agregacioacuten inducida por trombina
(Metzig et al 1999) y por ADP (Glaumlser amp Hilberg 2006)
El tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
fueron prolongados significativamente luego de la administracioacuten oral de bromelina en ratas
(Livio et al 1978) En el mismo estudio se observoacute inhibicioacuten en la agregacioacuten plaquetaria La
administracioacuten oral de bromelina durante 10 diacuteas en personas sanas no afectoacute el TP aunque siacute
levemente el TTPa pero dentro de rangos normales (Eckert et al 1999)
Maacutes recientemente Bilheiro et al (2013) reportaron que una fraccioacuten rica en
cisteiacutenendopeptidasas aislada del laacutetex de Carica candarmarcensis manifestoacute efecto
fibrinoliacutetico fibrinogenoliacutetico y tromboliacutetico actividad inhibitoria de la agregacioacuten plaquetaria
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
95
inducida por ADP asiacute como la prolongacioacuten del TP TT y TTPa Todos estos efectos fueron
dosis dependiente y cesaron al agregar inhibidores de cisteiacutenproteasas
43 Objetivos
Dentro del objetivo general de investigar la posible aplicacioacuten como agentes para el
tratamiento de la trombosis de los extractos parcialmente purificados obtenidos de frutos de
Bromelia hieronymi (Bh) B balanasae (Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) se plantearon
como objetivos especiacuteficos
Evaluar y comparar los posibles efectos de Bh Bb y Pm sobre la coagulacioacuten
sanguiacutenea el fibrinoacutegeno y la fibrina
Determinar si los efectos medidos tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los
extractos
Comparar los efectos de Bh Bb y Pm con los medidos para bromelina
44 Materiales y meacutetodos
441 Efecto anticoagulante
Para medir el efecto de los preparados sobre la coagulacioacuten sanguiacutenea se realizaron dos
pruebas globales de la coagulacioacuten el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de
tromboplastina parcial activado (TTPa) Las pruebas globales se caracterizan por ser raacutepidas y
sencillas y aunque sus resultados pueden indicar una alteracioacuten no identifican el componente
afectado (Duboscq 2003)
Los valores del TP y del TTPa se obtuvieron a partir de ensayos in vitro e in vivo Los
ensayos in vitro se realizaron midiendo el TP y el TTPa de un pool de plasma humano pobre en
plaquetas antes y despueacutes de ser incubado con distintas concentraciones de los preparados
proteoliacuteticos mientras que los ensayos in vivo consistieron en medir el TP y el TTPa de plasmas
obtenidos de ratas Wistar tratadas con los preparados proteoliacuteticos
4411 Ensayos in vitro
44111 Pool de plasma pobre en plaquetas
El pool fue elaborado con 15 muestras de plasma pobre en plaquetas (ppp) obtenidas de
dadores voluntarios adultos de entre 30 y 65 antildeos que no hubieran consumido aspirina u otros
faacutermacos con accioacuten anticoagulante en los 10 diacuteas previos El ppp fue obtenido del
sobrenadante luego de centrifugar sangre anticoagulada con citrato de sodio al 38 (relacioacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
96
sangrecitrato de sodio = 91) durante 10 min a 3000 g El pool fue conservado en freezer a -20
ordmC durante su elaboracioacuten (1 semana) y una vez terminado fue fraccionado en tubos de plaacutestico
y conservado a -80 ordmC hasta su uso (2 meses)
44112 Tiempo de protrombina (TP)
El TP o tiempo de Quick se basa en la medida del tiempo de coagulacioacuten de un plasma
decalcificado en presencia de tromboplastina tisular y Ca+2 El teacutermino tromboplastina tisular
hace referencia a una mezcla de tromboplastina o factor tisular (FT) y fosfoliacutepidos (Duboscq
2003)
Esta prueba permite evaluar la viacutea extriacutenseca del modelo claacutesico de la coagulacioacuten ya
que es sensible a cambios en los niveles del FVII ademaacutes de los otros factores vitamina K-
dependientes (FII y FX) y del FV El nivel de fibrinoacutegeno debe estar muy disminuido (menos del
50 de la concentracioacuten normal en plasma) para alterar el TP Es un ensayo esencial para el
monitoreo de pacientes bajo tratamiento con anticoagulantes orales (Duboscq 2003)
Para la medida del TP se usoacute el kit comercial Soluplastin (Wiener lab Group) que
contiene tromboplastina tisular de cerebro de conejo En la Tabla 43 se esquematiza el
protocolo seguido el cual fue adaptado del procedimiento establecido por el kit
Mezcla de reaccioacuten (MR)
100 μL de ppp + 10 μL de muestra1
en tubo de plaacutestico
Reactivo
(Tromboplastina CaCl2 NaCl)
200 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubacioacuten a 37 ordmC (diferentes tiempos) Incubacioacuten a 37 ordmC durante 2 min
2 Agregar 100 μL de MR al tubo con reactivo y en simultaacuteneo iniciar el cronometraje
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 43 Protocolo experimental para la medida del TP 1 Preparado proteoliacutetico o solucioacuten control (buffer fosfato
soacutedico 01M pH 6)
El coaacutegulo fue detectado ldquopescaacutendolordquo mediante un ansa de acero inoxidable los
valores de TP medidos para el pool de ppp tratado con los distintos preparados proteoliacuteticos
(TPp) fueron expresados en s y se compararon con los medidos para los controles (TPc)
obtenidos al mezclar el pool de ppp con buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 (buffer de
resuspensioacuten de la bromelina y de los precipitados etanoacutelicos de cada uno de los extractos
ensayados)
En cuanto a los valores de referencia seguacuten informacioacuten del proveedor del reactivo el
intervalo de los valores de TP de individuos normales adultos oscila entre 10 y 14 s aunque
dichos valores dependen de los reactivos y del procedimiento Tiempos prolongados indican un
estado de hipocoagulabilidad por deficiencia tanto de factores de la viacutea extriacutenseca como de
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
97
vitamina K y por presencia de inhibidores mientras que tiempos acortados se asocian a estados
de hipercoagulabilidad Altas concentraciones (gt 50 μgmL) de productos de degradacioacuten de
fibrina asiacute como enfermedad hepaacutetica son algunas causas de prolongados valores de TP
(Duboscq 2003)
44113 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
El ensayo consiste en medir el tiempo de coagulacioacuten del plasma decalcificado en
presencia de un exceso de tromboplastina parcial un activador y Ca+2 El teacutermino
tromboplastina parcial se refiere a la porcioacuten fosfolipiacutedica en la que se encuentra anclada la
tromboplastina (o FT) El activador proporciona la superficie cargada negativamente
desencadenante de la fase de contacto generalmente tierra de diatomeas celite o caoliacuten
(Duboscq 2003)
Esta prueba sirve para detectar anormalidades en la viacutea intriacutenseca del modelo claacutesico
ya sea por deficiencia de factores procoagulantes como por la presencia de inhibidores por ser
sensible frente a deficiencias de los factores FXII FXI FIX y FVIII como tambieacuten frente a
deficiencias severas de fibrinoacutegeno FII FV y FX Es usada para monitorear el tratamiento
terapeacuteutico con heparina no fraccionada y con acenocumarol (Duboscq 2003)
Se utilizoacute el kit comercial APTTest (Wiener lab Group) que utiliza cefalina como
tromboplastina parcial y tierra de diatomeas como activador En la Tabla 44 se esquematiza el
protocolo seguido en los ensayos el cual fue adaptado del procedimiento establecido por el kit
Mezcla de reaccioacuten (MR)
100 μL de pool de ppp + 10 μL de muestra1 en tubo
de plaacutestico
Reactivo
(Cefalina + tierra de diatomeas)
100 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubar de MR a 37 ordmC (diferentes tiempos)
2 Agregar 100 μL de MR al tubo con reactivo e incubar a 37 ordmC durante 3 min
3 Agregar 100 μL de CaCl2 0025 molL (precalentado a 37 ordmC) iniciar simultaacuteneamente el cronometraje y homogeneizar
4 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 44 Protocolo experimental para la medida del TTPa1 Preparado proteoliacutetico o control (buffer fosfato soacutedico
01 M pH 6)
El coaacutegulo fue detectado ldquopescaacutendolordquo mediante un ansa de acero inoxidable Los
tiempos de tromboplastina parcial activada medidos para el pool de ppp tratado con las distintas
preparaciones proteoliacuteticas (TTPap) fueron expresados en s y se compararon con los medidos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
98
para los controles (TTPac) los que se obtuvieron al mezclar el pool de ppp con buffer fosfato
soacutedico 01M de pH 6
Los valores de TTPa dependen fuertemente de los reactivos y del sistema de deteccioacuten
utilizado por lo cual es importante comparar los resultados obtenidos de la muestra ensayada
con la de un control usando un mismo lote de reactivo Seguacuten informacioacuten del proveedor del
reactivo el intervalo de los valores de TTPa de individuos normales adultos oscila entre 33 y 48
s y los tiempos que se diferencian en maacutes de 6 s de un plasma control deberaacuten ser
considerados anormales Tiempos prolongados indican un estado de hipocoagulabilidad
(deficiencia de factores o presencia de inhibidores) en tanto que los tiempos acortados
corresponderiacutean a un estado de hipercoagulabilidad aunque en este caso es aconsejable tomar
una nueva muestra pues la muestra podriacutea haber sido activada in vitro (Duboscq 2003)
44114 Efecto de la inhibicioacuten de la actividad proteoliacutetica sobre la accioacuten anticoagulante
Las soluciones de Bh Bb Pm y bromelina que extendieron el TP y el TTPa del pool de
ppp por encima de 180 s fueron incubadas durante 30 min a 37 ordmC con 035 mM de E-64 Luego
de verificar la peacuterdida de la actividad proteoliacutetica de dichas soluciones se volvioacute a determinar los
valores de TP y de TTPa siguiendo los protocolos de las tablas 33 y 34 respectivamente La
solucioacuten control para ambos ensayos fue buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 conteniendo 035
mM de E-64
44115 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados
Los datos fueron analizados estadiacutesticamente mediante ANOVA y posterior test de
Dunnett Cuando se compararon soacutelo dos grupos se utilizoacute la prueba t (no pareada) Un p lt
005 () fue considerado significativo Los caacutelculos fueron realizados con el programa
GraphPadPrism version 50
Para todos los preparados proteoliacuteticos las soluciones y diluciones ensayadas fueron
elaboradas n veces (indicado en cada caso) y a cada una de ellas se les midioacute el TP y el TTPa
por duplicado (intraensayo) Los resultados son expresados como el promedio de los valores
promedio intraensayo plusmn desviacioacuten estaacutendar (DE)
4412 Ensayos in vivo
Los resultados obtenidos en los ensayos in vitro se usaron para estimar las dosis que
pudieran resultar efectivas como anticoagulantes en los ensayos in vivo Para estos ensayos
ratas Wistar de ambos sexos y pesos entre 150 y 240 g fueron divididas en lotes de 6 animales
(3 hembras y 3 machos) Cada lote recibioacute intraperitonealmente los preparados proteoliacuteticos el
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
99
lote control no recibioacute tratamiento Previo a la extraccioacuten sanguiacutenea los animales fueron
anestesiados con una mezcla de 75 mgkg de ketamina clorhidrato (Holliday Scott SA) y 12
mgkg de xilacina clorhidrato (Richmond Laboratories Vet Pharma) administrada
intraperitonealmente La extraccioacuten fue realizada por puncioacuten cardiacuteaca y la sangre obtenida fue
mezclada con citrato soacutedico al 38 en una relacioacuten sangreanticoagulante = 91 se centrifugoacute
durante 10 min a 3000 g y el sobrenadante (ppp) fue separado en tubos de plaacutestico que se
almacenaron en freezer a -20 ordmC hasta el momento de medida del TP y del TTPa En la tabla
45 se esquematiza el protocolo seguido para las determinaciones del TP y del TTPa del ppp de
cada animal seguacuten indicaciones de los respectivos kits comerciales (Wiener lab Group)
TP
Plasma pobre en plaquetas (ppp)
100 μL en tubo de plaacutestico
Reactivo (Tromboplastina CaCl2 NaCl)
200 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubacioacuten a 37 ordmC durante 2 min
2 Agregar 100 μL de ppp al tubo con reactivo y en simultaacuteneo iniciar el cronometraje
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
TTPa
Plasma pobre en plaquetas (ppp)
100 μL
Reactivo
(Cefalina + tierra de diatomeas)
100 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Agregar 100 μL de ppp al tubo con reactivo e incubar a 37 ordmC durante 3 min
2 Agregar 100 μL de CaCl2 0025 moll (precalentado a 37 ordmC) en simultaacuteneo iniciar el cronometraje y homogeneizar
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 45 Protocolos experimentales para las medidas del TP y del TTPa
Tanto el TP como el TTPa de cada animal corresponden al promedio de los valores
obtenidos en dos determinaciones
44121 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados
Los datos obtenidos se analizaron estadiacutesticamente mediante ANOVA seguido por el
test de Tukey y las diferencias entre los grupos fueron consideradas significativas para un
plt005 () Los caacutelculos fueron efectuados con el programa GraphPadPrism version 50 Los
resultados se expresan como el promedio plusmn SEM
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
100
442 Efecto fibrinogenoliacutetico
El efecto de los preparados proteoliacuteticos sobre el fibrinoacutegeno fue evaluado mediante el
registro electroforeacutetico por la teacutecnica de tricina-SDS-PAGE de los hidrolizados obtenidos al
incubar las mezclas de dichos compuestos
4421 Hidrolizados
Se utilizoacute como sustrato proteico el fibrinoacutegeno bovino (F8630 Sigma Aldrich)
solubilizado en buffer Tris-HCl 0025M pH 8 Las mezclas de reaccioacuten se hicieron de manera
que la concentracioacuten final de fibrinoacutegeno fuera mayor o igual a 1 mgmL a fin de poder detectar
la proteiacutena remanente tras el desarrollo de la electroforesis mientras que las concentraciones
de los preparados proteoliacuteticos se fueron variando en funcioacuten de los perfiles obtenidos Las
mezclas se incubaron a 37 ordmC durante diferentes tiempos y las reacciones fueron finalizadas por
el agregado de aacutecido iodoaceacutetico (inhibidor de cisteiacutenendopeptidasas) y de buffer de muestra
(BM) Finalmente fueron llevadas a ebullicioacuten durante 5 min El procedimiento se resume en la
Tabla 46 y la composicioacuten del buffer de muestra en la Tabla 47
Tabla 46 Finalizacioacuten de la reaccioacuten y preparacioacuten de los hidrolizados resultantes para la corrida electroforeacutetica
Buffer de muestra
Tris 157 g
SDS 4 g
Glicerol 16 mL
Azul de bromofenol 4 mg
β-mercaptoetanol 25 μL
Llevar a pH 68 con HCl 1M
AD csp 100mL
Tabla 47 Composicioacuten del buffer de muestra (BM) AD agua destilada β-mercaptoetanol fue agregado en el
momento de tratar los hidrolizados
Para los blancos de reaccioacuten se respetaron las mismas cantidades de la Tabla 46 pero
se cambioacute el orden en que se agregaron los reactivos (Tabla 48)
Tratamiento de los hidrolizados
1) Hidrolizados 25 μL
2) Acido iodoaceacutetico (11 mM) 5 μL
3) BM 25 μL
4) Llevar a ebullicioacuten 5 min
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
101
Tabla 48 Procedimiento para la preparacioacuten de blancos de reaccioacuten Los voluacutemenes de la solucioacuten del
preparado proteoliacutetico (E) y del fibrinoacutegeno (S) fueron tales que S+E = 25 μL
Las muestras resultantes se conservaron en freezer a -20ordmC hasta el momento de la
siembra
4422 Tricina-SDS-PAGE
Esta teacutecnica electroforeacutetica es muy adecuada para la separacioacuten de polipeacuteptidos y
proteiacutenas en el rango de 1 a 100 kDa y es la preferida para la resolucioacuten de proteiacutenas con pesos
moleculares maacutes pequentildeos que 30 kDa (Schaumlgger 2006) La tricina es utilizada como ion de
arrastre en el buffer catoacutedico permitiendo una mayor resolucioacuten de proteiacutenas pequentildeas a
concentraciones menores de acrilamida que en el caso del buffer Tris-glicina utilizado en la
teacutecnica ideada por Laemmli (1970) La electroforesis con tricina permite una mejor resolucioacuten de
polipeacuteptidos sobre todo en el rango de 5 y 20 kDa sin la necesidad del uso de urea (Schaumlgger
amp von Jagow 1987)
Para el moldeado de geles y la corrida electroforeacutetica se empleoacute el equipo Mini-Protean
III (Bio-Rad) Debido a que el PM de la cadena maacutes grande del fibrinoacutegeno (Aα) es de alrededor
de 65 kDa se eligioacute el sistema de geles que permite resolver mezclas proteicas en el rango 5-
100 kDa que consiste en un gel de resolucioacuten con 10 de T14 y 3 de C15 y en un gel de
apilamiento con 4 de T y 3 de C (Tabla 49)
Las muestras obtenidas seguacuten lo indicado en 4421 fueron centrifugadas durante 10
min a 16000 g y el sobrenadante fue sembrado (5 μL) sobre el buffer catoacutedico (Tris 01M
Tricina 01M SDS 01) contenido en las calles
14
T= (g acrilamida+g bisacrilamida) x 100 volumen total 15
C= g bisacrilamida x 100 (g acrilamida+g bisacrilamida)
Blancos de reaccioacuten
1) Volumen de solucioacuten del preparado proteoliacutetico
E μL
2) Acido iodoaceacutetico (11 mM) 5 μL
3) BM 25 μL
4) Volumen de solucioacuten de fibrinoacutegeno S μL
5) Llevar a ebullicioacuten 5 minutos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
102
Reactivos Gel de apilamiento 4T y 3C
Gel de resolucioacuten 10T y 3C
AcrilBis (4815) 06 mL 2 mL
Buffer del gel 100 mL 33 mL
H2O 34 mL 47 mL
PSA 10 40 μL 50 μL
TEMED 4 μL 5 μL
Tabla 49 Sistema de geles empleado (rango 5-100kDa) Buffer del gel Tris-HCl 3M pH 845 conteniendo SDS 03
PSA persulfato de amonio TEMED NNNacuteNacute-tetrametiletilendiamina
En los reservorios anoacutedicos y catoacutedicos de la celda electroforeacutetica se colocaron buffer
anoacutedico (Tris-HCl 02M pH 89) y buffer catoacutedico respectivamente
La electroforesis fue desarrollada sin refrigeracioacuten El voltaje inicial fue de 30 V y se
mantuvo constante durante el paso de las muestras por el gel de apilamiento cuando las
muestras entraron al gel de resolucioacuten se lo aumentoacute a 100 V valor que se mantuvo constante
hasta que el frente de colorante alcanzoacute el fondo del gel Inmediatamente despueacutes los geles
fueron removidos de las placas y las bandas proteicas visualizadas mediante tincioacuten con
Coomassie para lo cual los geles se dejaron durante 30 min en solucioacuten fijadora (10 vv de
aacutecido aceacutetico 50 vv de metanol) Luego fueron coloreados con solucioacuten colorante (10 vv
de aacutecido aceacutetico 40 vv de metanol y 100 mg de Coomassie Brillant Blue R-250) y
decolorados con una solucioacuten de aacutecido aceacutetico al 10 vv Una vez secos fueron escaneados y
las imaacutegenes reducidas a un tamantildeo y resolucioacuten adecuados en un programa de procesamiento
de imaacutegenes (Adobe Photoshop y Aldus Photostyler) Luego se utilizoacute un software especial
(Scion Image 1998 URL httpwwwscioncorpcom) que convierte la intensidad de color de las
bandas presentes en los geles en datos numeacutericos permitiendo realizar densitogramas de las
calles sembradas
443 Efecto fibrinoliacutetico
4431 Placa de fibrina
A fin de evaluar la actividad fibrinoliacutetica de los preparados proteoliacuteticos se desarrolloacute el
ensayo de la placa de fibrina Este ensayo altamente reproducible y sensible consiste en
depositar gotas de la solucioacuten en ensayo sobre un coaacutegulo de fibrina formado en una placa de
Petri y determinar la cantidad de fibrina degradada midiendo las aacutereas de las zonas lisadas
despueacutes de incubar la placa a 37 ordmC sobre una superficie nivelada en una caacutemara huacutemeda
(Jespersen amp Astrup 1983)
Se siguioacute la teacutecnica desarrollada por Dametto et al (2000) con algunas modificaciones
seguacuten la cual 4 mL de fibrinoacutegeno al 05 en el buffer de reaccioacuten (barbital 0045 M pH 775
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
103
conteniendo CaCl2 166 mM MgCl2 07 mM y NaCl 92 mM) fueron mezclados con 4 mL de una
solucioacuten de agarosa al 2 preparada en el mismo buffer y 02 mL de 20 unidades NIHmL de
trombina todos a 42 ordmC La mezcla fue depositada en una placa de Petri (15 x 9 cm)
homogeneizada mediante movimientos circulares y dejada 1 h a temperatura ambiente para
permitir la correcta formacioacuten y estabilizacioacuten de la fibrina Sobre la superficie del coaacutegulo se
sembraron 10 μL por muestra y luego de incubar en atmoacutesfera huacutemeda a 37ordmC durante 14 h se
midieron 2 diaacutemetros perpendiculares para cada aacuterea de lisis
Se utilizoacute fibrinoacutegeno bovino (F8630 Sigma Aldrich) y trombina bovina (T7513 Sigma
Aldrich) mientras que como control se empleoacute plasmina humana (P1867 Sigma Aldrich) La
concentracioacuten de trombina usada en el ensayo fue obtenida por dilucioacuten de una solucioacuten stock
de trombina (100 unidades NIHmL en solucioacuten de 09 de NaCl y 01 de seroalbuacutemina
bovina) con el buffer de reaccioacuten
4432 Caacutelculos y anaacutelisis de resultados
El aacuterea de la zona circular lisada durante el periacuteodo de incubacioacuten es proporcional a la
cantidad de producto (fibrina lisada) formado enzimaacuteticamente y por tanto una medida de la
actividad fibrinoliacutetica de la solucioacuten sembrada la cual fue estimada como el producto de 2
diaacutemetros perpendiculares (mm2) de la zona lisada (Jespersen amp Astrup 1983) La relacioacuten
entre la concentracioacuten de la enzima (C) y la actividad fibrinoliacutetica (A) tal como fue definida es
A = kCa siendo k y a constantes
Puesto que a es diferente de 1 esta relacioacuten no es una funcioacuten lineal Sin embargo
aplicando logaritmos a ambos miembros de la relacioacuten se obtiene
log A = b + alog C siendo b = log k
Lo cual permite estimar los paraacutemetros k y a de forma maacutes precisa mejorando la
precisioacuten del ensayo El paraacutemetro b expresa la actividad fibrinoliacutetica (como log k) cuando la
concentracioacuten es 1 mientras que el paraacutemetro a expresa impliacutecitamente el mecanismo del
ensayo (Jespersen amp Astrup 1983)
La actividad fibrinoliacutetica fue medida por triplicado para una serie de diluciones de cada
preparado proteoliacutetico y se graficaron las relaciones doble logariacutetmicas entre A y C Los
paraacutemetros de correlacioacuten calculados mediante el programa GraphPadPrism version 50
sirvieron para comparar las actividades fibrinoliacuteticas de los distintos preparados ademaacutes de
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
104
encontrar una correlacioacuten entre la actividad caseinoliacutetica y la actividad fibrinoliacutetica para cada una
de ellas
444 Material vegetal
El contenido proteoliacutetico (UCasmg) y proteico (μg proteiacutenamg) asiacute como la actividad
especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos utilizados se presenta en la Tabla 410
Liofilizados UCasmg μg proteiacutenamg UCasmg proteiacutena
Bh 0275 plusmn 0005 27 plusmn 2 10
Pm 0166 plusmn 0009 34 plusmn 3 5
Bb 0155 plusmn 0008 11 plusmn 1 14
Bromelina (Sigma Aldrich) 068 plusmn 004 205 plusmn 2 33
Tabla 410 Contenido proteoliacutetico (UCasmg) proteico (μg proteiacutenamg) y actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos ensayados UCas unidades caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC) Media plusmn DE
Para todos los ensayos las soluciones de los extractos fueron preparadas por
resuspensioacuten de los liofilizados en agua destilada mientras que la bromelina fue redisuelta en
buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
105
45 Resultados y discusioacuten
451 Efecto anticoagulante 4511 Ensayos in vitro
Con el objetivo de determinar las concentraciones tiempos y voluacutemenes a incubar se
realizaron ensayos preliminares con un uacutenico ppp a partir de cuyos resultados (no mostrados)
se decidioacute que el tiempo de incubacioacuten fuera de 2 min Durante los ensayos con el pool de ppp
las concentraciones que no mostraron resultados concluyentes a los 2 min tambieacuten fueron
ensayadas incubando durante 10 min
Debido a que no todas las concentraciones fueron replicadas en igual nuacutemero eacuteste (n)
se indica en la tabla junto con el valor de la desviacioacuten estaacutendar (DE) Como se mencionoacute cada
replicado corresponde a un ensayo independiente y es el promedio de dos medidas realizadas
dentro de cada ensayo Cuando el coaacutegulo no fue detectado dentro de los 180 s desde el inicio
del cronometraje dichas medidas (indicadas como nc) no fueron tenidas en cuenta para el
anaacutelisis estadiacutestico y por tanto no se contabilizaron dentro del valor de n se decidioacute considerar
este tiempo como un efecto maacuteximo
En las tablas aparecen las concentraciones finales es decir referidas al volumen de
mezcla (pool de ppp + preparado proteoliacutetico)
En la mayoriacutea de los casos ademaacutes de diferencias significativas de los valores de TP y
de TTPa respecto a los del control se detectaron coaacutegulos con una consistencia diferente a la
del coaacutegulo obtenido a partir del pool de ppp sin tratamiento proteoliacutetico Por este motivo se
elaboroacute una escala que contempla las diferentes caracteriacutesticas de los coaacutegulos formados
(Tabla 411) En algunos casos se observoacute que el tiempo en que se detecta el hilo de fibrina
(primer indicio de la formacioacuten de fibrina) difiere maacutes del 5 del tiempo en que se detecta el
coaacutegulo de fibrina En este caso se tomoacute como tiempo de coagulacioacuten el promedio de ambos
tiempos y el hecho fue indicado con la letra D
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
106
Caracteriacutestica del coaacutegulo Nuacutemero de referencia
asignado
Filamentoso (carece del volumen y del aspecto
ldquogelatinosordquo del coaacutegulo normal)
I
Muy fraccionado (maacutes de 6 ldquosubcoaacutegulosrdquo) II
Fraccionado (menos de 6 ldquosubcoaacutegulosrdquo) III
Coaacutegulo uacutenico pero de menor solidez que el del pool
de ppp no tratado (imposibilidad de levantarlo con el ansa)
IV
Tabla 411 Escala en que fueron agrupados los coaacutegulos con caracteriacutesticas diferentes de los normales
45111 Tiempo de Protrombina (TP)
En la Tabla 412 se exponen los valores de TP de un pool de ppp luego de incubarlo con
distintas concentraciones de bromelina a 37 ordmC durante 2 min
Bromelina
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
14 gt180 2
13 82 2 37 I (23) nc (13)
11 615 4 8 D (24)
09 38 4 8 D (24)
065 20 3 1
0 165 4 05
Tabla 412 TP para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones bromelina Resultados del test de
Dunnett plt001 plt0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo
nuacutemero de referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada)
nc TPgt180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
La prolongacioacuten significativa del TP fue acompantildeada con alteracioacuten ya sea en el
intervalo de deteccioacuten del coaacutegulo (D) como en la caracteriacutestica del coaacutegulo (I)
En la tabla 413 se muestran los valores de TP del pool de ppp despueacutes de incubarlo con
distintas concentraciones de Bh a 37 ordmC Luego de incubar el pool de ppp con 35 mgmL
durante 2 min se obtuvieron valores y caracteriacutesticas de coaacutegulo muy dispares entre los
replicados Por esta razoacuten se ensayoacute tambieacuten el tiempo de incubacioacuten de 10 min para 35
mgmL y 25 mgmL suponiendo que quizaacutes Bh requiriera mayor tiempo para llegar a un
equilibrio
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
107
Bh (Incubacioacuten 2 min) Bh (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE Caracteriacutestica del coaacutegulo TP (s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
55 62 2 23 I (23) nc (13)
35 437 4 13 I (24)IV (24)D 345 3 9 I (13)
25 20 3 35 IV 22 3 3 IV
15 175 3 2
0 167 3 06 165 3 06 165
Tabla 413 TP para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bh Resultados test de
Dunnett plt001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo nuacutemero de
referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TPgt180
s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
Sin embargo puede observarse que no ha habido variacioacuten significativa luego de
incubar 10 min respecto de los valores obtenidos al incubar 2 min Al igual que lo observado
para bromelina la prolongacioacuten significativa del TP fue acompantildeado por una alteracioacuten en la
caracteriacutestica del coaacutegulo
En la tabla 414 se muestran los valores de TP del pool de ppp luego de incubarlo con
distintas concentraciones de Bb a 37 ordmC
Bb (Incubacioacuten 2 min) Bb (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TP
(s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
85 58 2 0 I (23) nc (13)
75 58 1 0 I (13) nc (23)
73 437 3 55 46 3 4 I (13)
65 29 3 4
0 15 3 1 16 3 06
Tabla 414 TP para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bb n nuacutemero de replicados
DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo nuacutemero de referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la
frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TPgt180 s Resultados test de Dunnett (Bb incubacioacuten 2
min) plt005 plt0001 Resultado t-test (Bb incubacioacuten 10 min) plt0001
No se observan cambios significativos entre los valores de TP del pool de ppp incubado
a 2 y 10 min para una misma concentracioacuten Sin embargo hay un gran cambio en relacioacuten a la
caracteriacutestica del coaacutegulo cuando se variacutea muy poco la concentracioacuten (de 73 a 75 mgmL) En
este caso siacute hay una concentracioacuten que variacutea significativamente el TP sin alterar (al menos
visiblemente) la caracteriacutestica del coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
108
En la tabla 415 se exponen los valores de TP del pool de ppp luego de incubarlo con
Pm durante 2 min a 37 ordmC No se ha observado alteracioacuten visible en la caracteriacutestica del
coaacutegulo aunque siacute en el intervalo de deteccioacuten del coaacutegulo (D) y al igual que ocurre con Bb
existe una concentracioacuten que provoca una variacioacuten significativa del TP sin alterar la
caracteriacutestica del coaacutegulo
Pm
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
9 gt180 2
8 551 5 10 D (45)
78 563 4 45 D (34)
65 323 3 35
55 215 2 05
0 153 3 07
Tabla 415 TP para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de Pm Resultados test de Dunnett
p lt 005 p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo D diferencia
temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica
mencionada)
45112 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
Los valores de TTPa del pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min a 37 ordmC con
distintas concentraciones de bromelina se muestran en la Tabla 416 La concentracioacuten a partir
de la cual se observa una prolongacioacuten significativa del TTPa es similar a la miacutenima
concentracioacuten que prolonga el TP (asymp 09 mgmL) Si bien se observaron diferencias entre el
tiempo en que se detecta el hilo y el coaacutegulo (D) no se visualizaron cambios en la caracteriacutestica
del coaacutegulo respecto a la de un coaacutegulo normal
Bromelina
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
10 gt180 2
085 523 6 8 D (26)
050 343 3 07
0 364 5 3
Tabla 416 TTPa para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de bromelina Resultados test de
Dunnett p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
109
El TTPa del pool de ppp incubado con distintas concentraciones de Bh durante 2 min a
37 ordmC (Tabla 417) fue prolongado significativamente con concentraciones similares a las que
prolongaron el TP Al igual que lo observado en el ensayo para determinar el TP las
concentraciones que prolongaron el TTPa tambieacuten produjeron cambios visibles en la
caracteriacutestica del coaacutegulo
Bh (Incubacioacuten 2 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
38 gt180 3
35 74 4 8 II (34)I(14)
33 534 5 3 IV D (35)
3 457 3 9 IV
0 397 3 06
Tabla 417 TTPa para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de Bh Resultado test de Dunnett
p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica
la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
En la tabla 418 se presentan los valores de TTPa del pool de ppp luego de incubarlo
con distintas concentraciones de Bb durante 2 y 10 min En comparacioacuten con los resultados del
ensayo de medida de TP puede observarse que las concentraciones que prolongaron
significativamente los TTPas estaacuten dentro del rango de concentraciones que prolongaron los
TPs Sin embargo se observoacute cambio en la caracteriacutestica del coaacutegulo cuando hubo
prolongacioacuten significativa de los tiempos
Bb (Incubacioacuten 2 min) Bb (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DS
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TTPa
(s) n DS
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
85 765 2 5 I nc (13) 70 2 9 I nc (13)
75 58 3 7 IIID (23) 60 3 9 II D (13)
65 45 1 IV
55 407 3 3 IV
0 403 3 2 403 3 2
Tabla 418 TTPa para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bb n nuacutemero de
replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada
de la caracteriacutestica mencionada) nc TTPa gt 180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo Bb
(Incubacioacuten 2 min) plt001 (Dunnett) Bb (Incubacioacuten 10 min) plt005 (t-test)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
110
Los tiempos medidos a los 2 y 10 min no fueron significativamente diferentes mientras
que las caracteriacutesticas de los coaacutegulos formados apenas variaron (de III a II)
Luego de incubar el pool con diferentes concentraciones de Pm durante 2 min no se
encontroacute una concentracioacuten que prolongara significativamente el TTPa antes de que lo hiciera
con un TTPa gt 180 s Siacute se observaron cambios en la caracteriacutestica de los coaacutegulos formados
luego de incubar el pool con cada concentracioacuten ensayada (Tabla 419) Cuando se incuboacute
durante 10 min la concentracioacuten de 45 mgmL prolongoacute significativamente el TTPa que resultoacute
ser mayor al TTPa luego de incubar el pool durante 2 min con la misma concentracioacuten Si se
comparan las tablas 415 y 419 se puede observar que la concentracioacuten que prolongoacute maacutes allaacute
de 180 s el TP fue aproximadamente dos veces mayor que la necesaria para prolongar a maacutes
de 180 s el TTPa lo cual estariacutea indicando una mayor especificidad de Pm hacia alguno de los
componentes de la viacutea intriacutenseca que de la extriacutenseca
Pm (Incubacioacuten 2 min) Pm (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) N DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
5 60 2 0 I nc (13)
45 433 3 4 III D (23) 757 3 13 II D (23)
4 362 3 3 IV D (23)
25 362 2 04 D
0 41 3 06 41 3 07
Tabla 419 TTPa para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Pm Resultados t- test p
lt 005 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la
frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TTPa gt 180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de
hilo y coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
111
Para facilitar la comparacioacuten de los efectos de los preparados proteoliacuteticos sobre el TP y
el TTPa se graficaron las relaciones TPpTPc y TTPapTTPac en funcioacuten de la actividad
proteoliacutetica (UCas) de los preparados (Figura 46)
Figura 46 Tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) del pool de ppp luego de
incubarlo con los preparados (TPp TTPap respectivamente) respecto a los tiempos del control (TPc TTPac
respectivamente) en funcioacuten de las UCasmL de bromelina (Bro) y de los preparados de Bromelia balanse (Bb) B
hieronymi (Bh) y Pseudananaacutes macrodontes (Pm) Media plusmn SEM Las liacuteneas verticales con la flecha correspondiente
indican la miacutenima concentracioacuten del preparado respectivo en que no se detecta el coaacutegulo antes de 180 s
El hecho de que la caracteriacutestica del coaacutegulo (I II III IV) variara en relacioacuten a la
concentracioacuten y al preparado con el cual se incuboacute ademaacutes de la alteracioacuten en el intervalo de
deteccioacuten del coaacutegulo (D) dificultoacute las medidas de los tiempos y aportoacute una variabilidad
cualitativa que afectoacute la variabilidad de los tiempos principalmente cuando fueron cercanos al
nc Esto dificultoacute la comparacioacuten entre los efectos de los preparados asiacute como establecer
00 05 10 15
2
4
6
Bro
Bh
Bb
Pm
088 116 15215
I
D
D
DIV
I
IV
I DD
UCasmL
TP
pT
Pc
00 05 10 1505
10
15
20
25
30
Bro
Bh
Bb
Pm
083 132068 104
I
DIII
IV
D
II
IVIV
DIV
DIII
I
DIVD
UCasmL
TT
Pa
pT
TP
ac
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
112
concentraciones efectivas pero de todos modos no impidioacute obtener algunas conclusiones tal
como se indica a continuacioacuten
En todos los casos de un corto rango de concentraciones que alteraron
progresivamente la caracteriacutestica normal del coaacutegulo se pasoacute bruscamente a TP y TTPa
prolongados a maacutes de 10 y 4 veces respectivamente
Para todos los preparados hubo alguna concentracioacuten que ademaacutes de prolongar el TP y
el TTPa modificoacute la caracteriacutestica del coagulo o afectoacute el intervalo de deteccioacuten del mismo (D)
Esto podriacutea estar indicando un efecto directo sobre la estructura de la fibrina yo puesto que
eacutesta depende fuertemente de la concentracioacuten asiacute como de la estructura del fibrinoacutegeno
(Lauricella 2007) tambieacuten sobre la del fibrinoacutegeno Dado que la creciente evidencia apoya el
concepto de que las caracteriacutesticas estructurales de la fibrina pueden representar un nuevo
factor de riesgo para el tromboembolismo arterial y venoso (Undas amp Arieumlns 2011) el
acompantildeamiento de alteraciones en el coaacutegulo al efecto anticoagulante puede resultar una
desventaja De todos modos esto soacutelo podraacute ser determinado mediante estudios que empleen
modelos de trombosis
Otra informacioacuten que se puede obtener de la Figura 46 es que teniendo en cuenta las
actividades proteoliacuteticas de cada preparado la bromelina ha sido la maacutes potente Se requirieron
088 (plusmn 005) 116 (plusmn 006) 15 (plusmn 008) y 152 (plusmn 003) UCasmL de bromelina Bb Pm y Bh
respectivamente para prolongar el TP a maacutes de 180 s yo producir un coaacutegulo Tipo I En tanto
que para prolongar el TTPa a maacutes de 180 s (yo coaacutegulo Tipo I) se requirieron 068 (plusmn 004)
083 (plusmn 004) 104 (plusmn 002) y 132 (plusmn 007) UCasmL de bromelina Pm Bh y Bb
respectivamente Pareceriacutea existir cierta especificidad de cada preparado proteoliacutetico hacia una
u otra viacutea del modelo claacutesico de la coagulacioacuten Por ejemplo 083 UCasmL de Pm son
suficientes para prolongar el TTPa a maacutes de 180 s mientras que el mismo efecto sobre el TP
requirioacute 152 UCasmL de Pm Algo similar ocurre para los demaacutes preparados
Probablemente estas diferencias se pudieron deber a componentes diferentes a las
proteasas cisteiacutenicas presentes en los preparados Para poner a prueba dicha suposicioacuten y
determinar si el efecto anticoagulante es debido a la accioacuten de proteasas cisteiacutenicas se
determinoacute el TP y el TTPa del pool de ppp luego de incubarlo con soluciones de los preparados
tratados y no tratados con E-64
45113 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de los preparados proteoliacuteticos
sobre su efecto anticoagulante
En las Figuras 47 y 48 se muestran el TP y el TTPa respectivamente del pool de ppp
luego de incubarlo durante 2 min a 37 ordmC con las soluciones de bromelina Bh Bb y Pm antes y
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
113
despueacutes de inhibir sus cisteiacutenendopeptidasas Las concentraciones ensayadas fueron un 10
mayor que aquellas que prolongaban el TP y el TTPa por encima de 180 s En la Tabla 420 se
muestran los valores de actividad caseinoliacutetica de las soluciones de bromelina Bh Pm y Bb
antes y despueacutes de tratarlas con E-64 (035 mM) El TP y el TTPa del control fue obtenido luego
de incubar durante 2 min a 37 ordmC 100 μL del pool de ppp con 10 μL de 035 mM de E-64 en
buffer fosfato soacutedico 01M pH 6
Figura 47 TP de un pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min con Bro (155 mgmL) Bh (6 mgmL) Bb (95 mgmL) y Pm (95 mgmL) inactivas (Con E-64) y activas (Sin E-64) proteoliacuteticamente Valores expresados como la media plusmn DE (n = 3) excepto para los grupos Sin E-64 cuyos TP fueron mayores a 180 s Resultado test de Dunnett entre el grupo Con E-64 y el grupo Control p lt 005
Figura 48 TTPa de un pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min con Bro (11 mgmL) Bh (45 mgmL) Bb (95 mgmL) y Pm (65 mgmL) inactivas (Con E-64) y activas (Sin E-64) proteoliacuteticamente Valores expresados como la media plusmn DE (n=3) excepto para los grupos Sin E-64 cuyos TTPa fueron mayores a 180 s Resultado test de Dunnett entre el grupo Con E-64 y el grupo Control p lt 001 p lt 0001
0
50
100
150
Sin E-64Con E-64Control
Bro(155 mgmL)
Bh(6 mgmL)
Bb(95 mgmL)
Pm(95 mgmL)
180
TP
(s)
0
50
100
150
Con E-64
Control
Sin E-64
180
Bro(11 mgmL)
Bh(45 mgmL)
Bb(95 mgmL)
Pm(65 mgmL)
TT
Pa (
s)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
114
Puede observarse que la prolongacioacuten del TP y del TTPa del pool de ppp luego de
incubarlo con cada preparado es debida preponderantemente a la actividad proteoliacutetica de
proteasas cisteiacutenicas Sin embargo el efecto anticoagulante de Bb y Pm no revirtioacute
completamente cuando sus proteasas fueron inhibidas lo cual podriacutea indicar la presencia de
otro componente anticoagulante presente en los preparados Esto es maacutes notable para el TTPa
medido luego de incubar el pool con Pm sin actividad proteoliacutetica (TTPapTTPac igual a 215) lo
cual sumado a que el TP no es afectado por Pm inhibido es coherente con el hecho de que se
requiere mayor UCasmL para prolongar el TP que para prolongar el TTPa Bb inhibido tambieacuten
prolongoacute significativamente el TP y el TTPa aunque las relaciones TPpTPc y TTPapTTPac
fueron maacutes bajas (13 y 14 respectivamente) Un dato importante es que la caracteriacutestica de
los coaacutegulos formados a partir del pool tratado con los preparados inhibidos no mostroacute
diferencias respecto a la caracteriacutestica de un coaacutegulo normal Esto estariacutea indicando que las
alteraciones observadas (I II III IV D) en los coaacutegulos formados desde el pool tratado con los
preparados se debieron a la accioacuten de las proteasas
Liofilizados Solucioacuten (mgmL) Sin E-64 (UCasmL) Con E-64 (UCasmL)
Bro 204 14 plusmn 02 -045 plusmn 027
Bh 100 273 plusmn 04 -03 plusmn 02
Bb 160 244 plusmn 06 -06 plusmn 03
Pm 100 165 plusmn 01 -02 plusmn 01
Tabla 420 Actividad proteoliacutetica frente al sustrato caseiacutena de las soluciones de Bro Bh Bb y Pm antes (Sin E-64) y
despueacutes (Con E-64) de ser tratadas con 035 mM de E-64 durante 30 min a 37ordmC Los valores son expresadas como la media plusmn DE (n = 3) UCas unidades caseinoliacuteticas a 37 ordmC en buffer Tris-ClH 01M pH 75
Otra causa posible que pudiera explicar el efecto anticoagulante de los preparados
tratados con E-64 es que haya quedado una actividad proteoliacutetica remanente que no haya sido
detectada por el ensayo de actividad caseinoliacutetca Puesto que la teacutecnica de la placa de fibrina
es muy sensible tambieacuten se evaluoacute la actividad fibrinoliacutetica de las soluciones de bromelina Bh
Bb y Pm inhibidas con E-64 Sin embargo tampoco pudo detectarse actividad frente a fibrina
4512 Ensayos in vivo
Las dosis de bromelina Bh Bb y Pm administradas a los animales fueron estimadas
teniendo en cuenta los resultados de los ensayos in vitro y la relacioacuten plasmapeso corporal
establecida para ratas Wistar por Bijsterbosch et al (1981) seguacuten la cual
volumen de plasma (mL) = 00291PC(g) + 254 donde PC es el peso corporal
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
115
Como primera aproximacioacuten se definioacute una misma dosis en UCaskg de bromelina Bh
Bb y Pm a fin de poder compararlas La dosis que se eligioacute fue aquella que en los ensayos in
vitro para todos los preparados evaluados prolongara el TP y el TTPa maacutes de 180 s De la
informacioacuten provista por la figura 46 se puede concluir que a partir de la concentracioacuten de 155
UCasmL de plasma se cumple con dicho requisito Por tanto se optoacute por una dosis de 2
UCasmL de plasma equivalente a 633 UCaskg de animal (aplicando la ecuacioacuten antes
mencionada) que fue redondeada a 65 UCaskg
En la Figura 49 se exponen los valores de TP y de TTPa de ppp extraiacutedos luego de 4 h
de la administracioacuten intraperitoneal de los preparados proteoliacuteticos El tiempo de 4 h fue
establecido de experimentos previos con bromelina
Figura 49 TP y TTPa de ppp obtenido de ratas Wistar luego de 4h de la administracioacuten intraperitoneal de 65 UCaskg de bromelina (Bro) Bh Bb y Pm Valores expresados como la media plusmn SEM Nuacutemero de replicados (n) 6 (Control Bh Pm) 5 (Bro y Bb) Tukeyacutes test p lt 005 p lt 001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt005
Aunque todos los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos mostraron valores
prolongados de TP y de TTPa respecto a los de los lotes controles soacutelo fueron significativos
(plt005) los tiempos de los lotes tratados con bromelina y el TP del lote tratado con Bb los
cuales significaron alrededor de un 20 de los tiempos del lote control Por otra parte los
tiempos de los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos no se diferenciaron
significativamente entre siacute Tampoco se detectaron alteraciones en los coaacutegulos durante las
medidas de TP y de TTPa
Los resultados obtenidos en los experimentos in vivo e in vitro (Figura 46) coinciden en
que la bromelina ha sido la maacutes efectiva frente a TTPa y a TP y en que Bb es maacutes efectivo para
prolongar el TP que el TTPa De todos modos debe tenerse en cuenta que estos resultados
soacutelo sirven como una primera aproximacioacuten en la determinacioacuten de dosis efectivas
Control Bro Bh Bb Pm 0
10
20
30aa
cca ca
TP
(s)
Control Bro Bh Bb Pm 0
10
20
30
ca
a
cca
ca
TT
Pa (
s)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
116
452 Efecto fibrinogenoliacutetico
En la Figura 410 se muestran las electroforesis junto al densitograma respectivo de los
hidrolizados obtenidos luego de incubar 200 μL de fibrinoacutegeno bovino 12 mgmL con 075 μL de
cada preparado proteoliacutetico equivalente a 1 UCasmL durante 2 30 60 90 120 y 180 min a 37
ordmC El tiempo 0 min corresponde al blanco de reaccioacuten resultante de inactivar el preparado
proteoliacutetico con iodoaceacutetico y buffer de muestra antes de mezclarlo con la solucioacuten de
fibrinoacutegeno
La similitud entre los perfiles electroforeacuteticos obtenidos con todos los preparados estariacutea
indicando una similar actividad proteoliacutetica frente al fibrinoacutegeno ya sea por la preferencia de
sustrato como por la velocidad de reaccioacuten La primera subunidad en ser degradada
completamente fue Aα hecho observado para todos los preparados a los 2 min de incubacioacuten
Le siguioacute Bβ a los 30 min mientras que la subunidad γ fue la maacutes resistente permaneciendo
intacta durante 180 min de incubacioacuten con cada preparado Otra caracteriacutestica comuacuten
observada en todas las electroforesis fue la presencia de un polipeacuteptido de alrededor de 30
kDa aunque en menor cantidad luego de incubar con Bh que probablemente sea producto de
degradacioacuten de la subunidad Bβ puesto que aparece luego de su desaparicioacuten
Para determinar si la resistencia de la subunidad γ a ser degradada por los preparados
es absoluta se incuboacute el fibrinoacutegeno con una concentracioacuten mayor de cada preparado de
manera de aumentar en 100 veces la relacioacuten enzimasustrato Los perfiles electroforeacuteticos
obtenidos luego de incubar 68 μL de fibrinoacutegeno 34 mgmL con 7 μL de 10 UCasmL de cada
preparado durante 10 y 120 min a 37 ordmC se muestran en la Figura 411
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
117
Figura 410 Tricina-SDS-PAGE de fibrinoacutegeno bovino antes (calle 2) y luego de incubarlo a 37ordmC durante 2 30 60 90 120 y 180 min (calles 4 5 6 7 8 y 9 respectivamente) con bromelina (Bro) Bh Bb y Pm Calle 3 blanco de reaccioacuten (0 min) Calle 1 patrones de peso molecular (Bio-Rad) A la derecha de cada electroforesis se encuentra el densitograma respectivo Son indicadas con flechas las subunidades Aα (α) Bβ (β) y γ del fibrinoacutegeno
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Bro
a b g
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Bh
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)Bb
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Pm
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
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118
Figura 411 Tricina-SDS-PAGE de fibrinoacutegeno bovino antes (calle 2) y luego de incubarlo a 37ordmC durante 10 y 120
min con bromelina (Bro) Bh Bb y Pm (calles 3 4 5 y 6 respectivamente) Calle 1 patrones de peso molecular (Bio-Rad) A la derecha de cada electroforesis se encuentra el densitograma respectivo Son indicadas con flechas las subunidades Aα Bβ y γ del fibrinoacutegeno
Puede observarse que hubo una disminucioacuten en la banda correspondiente a la
subunidad γ a partir de los 10 min de incubacioacuten con cada preparado y que siguioacute disminuyendo
hasta casi desaparecer a los 120 min lo cual confirma que si bien la subunidad γ es altamente
resistente a la accioacuten de las proteasas finalmente es susceptible de ser degradada
A diferencia de lo observado en los ensayos de medidas del efecto anticoagulante la
misma cantidad de UCasmL de cada preparado tuvo un efecto similar sobre el fibrinoacutegeno
Esto puede deberse a que en el plasma cada preparado puede actuar tambieacuten sobre otros
componentes del sistema hemostaacutetico como asiacute tambieacuten pueden ser inhibidos de manera
diferente por α2-MG
Si bien el efecto fibrinogenoliacutetico fue evaluado usando fibrinoacutegeno bovino dada la
escasa diferencia estructural y funcional entre los fibrinoacutegenos de diferentes especies (Weisel
2005) el efecto sobre la subunidad Aα puede servir para explicar la alteracioacuten del coaacutegulo
formado luego de incubar el pool de ppp con los preparados La regioacuten C-α de Aα una vez
producida la liberacioacuten de los fibrinopeacuteptidos A y B produce la agregacioacuten lateral de microfibras
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
10 min
120 min
a b g
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) Bro(4) Bh
(5) Bb(6) Pm
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(4) Bh
(5) Bb(6) Pm
(3) Bro
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119
de fibrina contribuyendo al espesor de la fibra la resistencia a la traccioacuten de la fibrina (Undas amp
Arieumlns 2011) y la rigidez macroscopia observada (Purohit et al 2011)
Por otro lado dado que el fibrinoacutegeno une las plaquetas favoreciendo la agregacioacuten
plaquetaria se podriacutea suponer que Bh Bb y Pm a traveacutes de su accioacuten fibrinogenoliacutetica
afectaraacuten dicho proceso
453 Efecto fibrinoliacutetico
El efecto de los preparados sobre la fibrina fue evaluado mediante el ensayo de la placa
de fibrina En la Figura 412 se muestran los graacuteficos en escala doble logariacutetmica de
(a) la actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la actividad caseinoliacutetica (UCasmL) y
(b) la actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas (μgmL)
Figura 412 Ensayo de la placa de fibrina a Actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la actividad
caseinoliacutetica (UCasmL) y b actividad fibrinoliacutetica en funcioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas (μgmL) de bromelina (Bro) Bh Bb Pm y plasmina en escala doble logariacutetmica (Log-Log) Valores expresados como la media plusmn DE
En las tablas 421 y 422 se muestran los paraacutemetros de correlacioacuten lineal
(GraphPadPrism) determinados para cada preparado seguacuten la relacioacuten log A = b + alog C
siendo A la actividad fibrinoliacutetica y C la concentracioacuten del preparado (Jespersen amp Astrup
1983)
Actividad fibrinoliacutetica-Actividad caseinoliacutetica
Paraacutemetros Bro Bh
Bb
Pm
a 022c plusmn 002 063
a plusmn 003 063
a plusmn 004 052
b plusmn 002
b 417 plusmn 001 369 plusmn 002 368 plusmn 003 378plusmn 002
r2
09017 09775 09639 09767
N 12 14 11 13
Tabla 421 Paraacutemetros de correlacioacuten lineal de la relacioacuten Log-Log entre actividad fibrinoliacutetica y actividad
caseinoliacutetica a pendiente b Log A (cuando C=1 UCasmL) N nuacutemero de puntos Letras superiacutendices distintas indican diferencias significativas (p lt 005)
a b
-05 00 05 10 1530
35
40
45
50
Actividad caseinoliacutetica (UCasmL)
Ac
tiv
ida
d f
ibri
no
liacuteti
ca
(m
m2m
L)
1 2 3 430
35
40
45
50
Pm
Bh
Bro
Plasmina
Bb
Concentracioacuten de proteiacutenas (gmL)
Ac
tiv
ida
d f
ibri
no
liacuteti
ca
(m
m2m
L)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
120
Actividad fibrinoliacutetica-Proteiacutenas
Paraacutemetros Bro Bh Bb
Pm Plasmina
a 022c plusmn 002 062
b plusmn 004 062
b plusmn 004 052
b plusmn 002 023
c plusmn 002
b 363 plusmn 007 24 plusmn 01 26 plusmn 01 261plusmn 006 388plusmn 003
r2
08884 09586 09624 09812 09575
N 12 14 11 13 8
Tabla 422 Paraacutemetros de correlacioacuten lineal de la relacioacuten Log-Log entre actividad fibrinoliacutetica y proteiacutenas a
pendiente b Log A (cuando C=1 μgmL) N nuacutemero de puntos Letras superiacutendices distintas indican diferencias significativas (p lt 005)
Tanto para la relacioacuten entre actividad fibrinoliacutetica y actividad caseinoliacutetica como para la
relacioacuten entre actividad fibrinoliacutetica y proteiacutenas puede observarse que la pendiente a y la
ordenada al origen b de Bh Bb y Pm fueron similares entre siacute y diferentes significativamente de
las de bromelina En la tabla 422 se puede observar que bromelina y plasmina tuvieron
similares pendientes a lo cual permite expresar la actividad fibrinoliacutetica de la bromelina en
unidades de plasmina (Jespersen amp Astrup 1983) En este caso 1 μg de bromelina equivale a
007 μg de plasmina humana (P1867 Sigma Adrich)
La existencia de diferentes pendientes estariacutea indicando diferentes mecanismos
intriacutensecos (Jespersen amp Astrup 1983) En este sentido un factor que puede estar influyendo en
el valor del aacuterea de lisis ademaacutes de la actividad proteoliacutetica es la difusioacuten de las proteasas en
la red de fibrina Puesto que todas las proteasas tienen pesos moleculares similares (entre 22 y
25 kDa) y que las soluciones ensayadas de Bh Bb y Pm se prepararon al disolver el liofilizado
(a partir de una solucioacuten de buffer fosfato soacutedico 01M pH 6) en agua mientras que la bromelina
se disolvioacute en buffer de placa (barbital 0045 M pH 775 NaCl 92 mM) se supuso que el medio
de resuspensioacuten podriacutea estar influyendo Sin embargo no se encontraron diferencias
significativas entre las aacutereas de lisis medidas para bromelina disuelta en diferentes molaridades
del buffer fosfato soacutedico de pH 6 (BF) respecto al aacuterea medida para la bromelina disuelta en el
buffer de placa (BP) como asiacute tampoco se hallaron diferencias significativas entre las
pendientes y las ordenadas al origen de las curvas de actividad fibrinolitica en relacioacuten a la
concentracioacuten de bromelina disuelta en BF o BP (Figura 413)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
121
Figura 413 Efecto del buffer de resuspensioacuten sobre la actividad fibrinoliacutetica de bromelina A Actividad fibrinoliacutetica (mm
2mL) en funcioacuten de la concentracioacuten (mgmL) en escala doble logariacutetmica BF buffer fosfato soacutedico 01 M pH 6
B Actividad fibrinoliacutetica (mm2gota sembrada) para 35 mgmL de bromelina disuelta en diferentes molaridades de BF
de pH 6 Valores expresados como la media plusmn DE
Por lo tanto puede concluirse que bromelina demuestra poseer una mayor actividad
fibrinoliacutetica que Bh Bb y Pm para concentraciones menores a 10 UCasmL mientras que para
concentraciones mayores a 10 UCasmL Bh Bb y Pm tendriacutean mayor actividad fibrinoliacutetica que
bromelina
Una comparacioacuten de la actividad fibrinoliacutetica (412 a) y del efecto anticoagulante (Figura
46) de los preparados permite observar que para prolongar el TP y el TTPa a maacutes de 180 s
bromelina requirioacute aproximadamente 3 veces maacutes de actividad fibrinoliacutetica (entre 136 x103 y
144 x103 mm2mL) que Bh Bb y Pm (entre 52 x103 y 64 x103 mm2mL) Expresado en otros
teacuterminos bromelina muestra mayor efecto fibrinoliacutetico que Bh Bb y Pm sin afectar el TP y el
TTPa lo cual podriacutea llevar a suponer que resultariacutea maacutes ventajosa como agente fibrinoliacutetico
para el tratamiento de algunos de los desoacuterdenes tromboacuteticos (Merli 2007) Sin embargo se
trata de una comparacioacuten entre dos sistemas distintos que tampoco presentan la complejidad
de una trombosis Futuros ensayos fundamentalmente en modelos in vivo son necesarios para
afianzar o descartar estos resultados preliminares
Actividad fibrinoliacutetica de Bromelina (35mgmL)Efecto del buffer de resuspensioacuten
005M 02M 04M Buffer de placa0
50
100
150
200
250
Buffer fosfato soacutedico pH 6
Buffer de resuspensioacuten
mm
2
BromelinaEfecto del buffer de resuspensioacuten
00 05 10 1540
41
42
43
44
45
BF (01M)
BP (005 M)
Concentracioacuten (mgmL)
Acti
vid
ad
fib
rin
oliacuteti
ca (
mm
2m
L)
A B
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
122
46 Conclusiones
Todos los preparados mostraron actividad anticoagulante en los ensayos in vitro efectos
completamente atribuibles a la accioacuten proteoliacutetica de las cisteiacutenendopeptidasas
presentes en Bh y Bro pero parcialmente a las cisteiacutenendopeptidasas de Pm y Bb
Bromelina Bh y Pm fueron maacutes efectivas para prolongar el TTPa de un pool de ppp que
el TP mientras que Bb fue maacutes efectiva para prolongar el TP que el TTPa
Para todos los preparados el efecto sobre el TP y sobre el TTPa fue acompantildeado de un
efecto sobre la caracteriacutestica del coaacutegulo formado (filamentoso fraccionado fraacutegil) el
cual revirtioacute cuando las proteasas fueron inhibidas con E-64
En los ensayos in vivo soacutelo bromelina y Bb con dosis equivalentes en unidades
caseinoliacuteticas tuvieron un leve efecto anticoagulante
Todos los preparados con unidades caseinoliacuteticas equivalentes degradaron el
fibrinoacutegeno con una cineacutetica similar siendo la subunidad Aα la primera en ser degradada
y γ la maacutes resistente
Todos los preparados mostraron accioacuten fibrinoliacutetica siendo maacutes efectiva la bromelina
para concentraciones menores a 10 UCasmL
La bromelina mostroacute un comportamiento similar frente a la fibrina que la plasmina
Los resultados obtenidos en los ensayos permiten concluir que Bh Pm y en especial Bb
podriacutean tener un potencial efecto antitromboacutetico y tromboliacutetico hecho que deberaacute
evaluarse en otros modelos experimentales
Los resultados obtenidos para Bh Pm y Bb pueden ser de utilidad para el disentildeo de
futuros ensayos a los fines de establecer su efectividad como agentes para el
tratamiento de trombosis
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
125
51 Las causas de la aparicioacuten del caacutencer
El caacutencer sigue siendo una de las enfermedades que maacutes preocupan a la
humanidad auacuten cuando no ocupe el primer lugar entre las principales causas de muerte en
el mundo Si bien la ciencia ha ido aportando sucesivos conocimientos en diferentes
aspectos hecho que ha permitido incrementar los mecanismos de prevencioacuten y de
tratamiento se encuentra auacuten sin respuesta la pregunta relacionada con las verdaderas
causas de la enfermedad (Gibbs 2003) Una explicacioacuten posible es que una ceacutelula debe
adquirir habilidades extraordinarias para convertirse en ceacutelula maligna hace poco maacutes de
una deacutecada Hahn amp Weinberg (2002) describieron las condiciones que debe reunir una
ceacutelula normal para convertirse en canceriacutegena a las que denominaron ldquolos seis
superpoderes diaboacutelicos del caacutencerrdquo ilustrados en la Figura 51 y que se describen a
continuacioacuten
1 Crecimiento en ausencia de sentildeales La mayoriacutea de las ceacutelulas normales esperan un
mensaje externo antes de comenzar a dividirse Las ceacutelulas cancerosas a menudo
falsifican sus propios mensajes pro-crecimiento
2 Crecimiento a pesar de oacuterdenes de detencioacuten A medida que el tumor se expande
comprime al tejido adyacente el cual enviacutea mensajes quiacutemicos que normalmente
detienen la divisioacuten celular Las ceacutelulas malignas ignoran tales oacuterdenes asiacute como los de
sus propios mecanismos internos de envejecimiento
3 Evasioacuten de los mecanismos de autodestruccioacuten En las ceacutelulas sanas el dantildeo geneacutetico
por encima de un nivel criacutetico usualmente activa un programa suicida Las ceacutelulas
cancerosas eluden este mecanismo aunque a veces algunos agentes del sistema
inmune pueden obligar a las ceacutelulas cancerosas a autodestruirse
4 Construccioacuten de nuevos vasos sanguiacuteneos Los tumores necesitan oxiacutegeno y nutrientes
para sobrevivir que obtienen obligando a que los vasos sanguiacuteneos vecinos formen
nuevas ramas que se desarrollen a lo largo de la masa tumoral en crecimiento
5 Inmortalidad efectiva Las ceacutelulas sanas usualmente no se dividen maacutes de 70 veces pero
las ceacutelulas malignas necesitan un nuacutemero mayor de divisiones para formar tumores El
envejecimiento celular parece estar relacionado con los teloacutemeros ubicados a ambos
extremos de cada cromosoma La telomerasa permite mantener la longitud normal de los
teloacutemeros solamente en ceacutelulas sexuales no en el resto de las ceacutelulas del organismo Sin
embargo las ceacutelulas canceriacutegenas son capaces de desarrollar actividad telomeraacutesica lo
que praacutecticamente las torna inmortales
6 Poder para invadir otros tejidos y extenderse a otros oacuterganos Cuando las ceacutelulas
cancerosas logran deshabilitar el circuito celular que las confina a una parte especiacutefica
del oacutergano en el cual se generaron se manifiesta la capacidad de invadir los tejidos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
126
cercanos y provocar metaacutestasis en partes lejanas de su ubicacioacuten original lo que le da al
caacutencer su caraacutecter letal
Figura 51 Ilustracioacuten de las seis principales capacidades desarrolladas por las ceacutelulas caacutenceriacutegenas (tomado de
Hanahan amp Weinberg 2011)
A favor de la manifestacioacuten de estas caracteriacutesticas de las ceacutelulas tumorales juega un
rol fundamental la inestabilidad del genoma que genera la diversidad geneacutetica que facilita
su aparicioacuten asiacute como la inflamacioacuten que tambieacuten fomenta muacuteltiples funciones distintivas
Como resultado del avance conceptual en la uacuteltima deacutecada se han antildeadido dos nuevas
caracteriacutesticas a las seis capacidades de las ceacutelulas tumorales antes sentildealadas
involucradas en la patogeacutenesis de algunos y quizaacutes de todos los tipos de caacutencer la
reprogramacioacuten del metabolismo energeacutetico y la capacidad de evadir la destruccioacuten inmune
La primera de ellas consiste en la capacidad de modificar o reprogramar el metabolismo
celular con el fin de apoyar maacutes eficazmente la proliferacioacuten neoplaacutesica La segunda permite
que las ceacutelulas cancerosas puedan evadir la destruccioacuten inmunoloacutegica en particular por
linfocitos T y B macroacutefagos y ceacutelulas asesinas naturales (ldquonatural killersrdquo) Por otra parte la
inflamacioacuten generada por las ceacutelulas inmunes disentildeadas para combatir las infecciones
quizaacutes pueda dar apoyo accidental a las muacuteltiples capacidades de las ceacutelulas tumorales
Pero ademaacutes de las ceacutelulas cancerosas los tumores muestran otra dimensioacuten de
complejidad ya que poseen un repertorio de ldquoceacutelulas reclutadasrdquo ostensiblemente normales
pero que contribuyen a la adquisicioacuten de los rasgos caracteriacutesticos mediante la creacioacuten del
microambiente del tumor (Hanahan amp Weinberg 2011)
52 Epidemiologiacutea del caacutencer
Como se ha mencionado el caacutencer es una de las principales causas de muerte en el
mundo Seguacuten un informe del antildeo 2008 de la Agencia Internacional de Investigacioacuten sobre
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
127
el Caacutencer (IARCWHO 2008) esta enfermedad produjo 76 millones de muertes (alrededor
del 13 del total) de las cuales aproximadamente el 70 ocurrieron en paiacuteses de bajo y
medianos recursos Sin embargo si se evaluacutean las tasas estandarizadas por edad (ASR) de
muerte por caacutencer (excluyendo el caacutencer de piel con histologiacutea distinta al melanoma) cada
100000 habitantes eacutestas no pueden ser correlacionadas con el nivel de ingreso de los
paiacuteses (Figura 52)
Figura 52 Tasa estandarizada por edad (ASR) de mortalidad por caacutencer para ambos sexos cada 100000 habitantes distribuidas por paiacuteses estimadas en el 2008 Fuente IARCWHO 2008
Puede verse que Argentina en relacioacuten al resto del mundo se encuentra en un nivel
medio-alto de mortalidad por caacutencer De acuerdo a un estudio de la Organizacioacuten Mundial
de la Salud (WHO 2011) en nuestro paiacutes el caacutencer representa la segunda causa de muerte
(20) despueacutes de las producidas por las enfermedades cardiovasculares (33) Respecto
a la incidencia de caacutencer (IARCWHO 2008) Argentina ocupa el mismo nivel (medio-alto)
seguacuten las ASR de incidencia de caacutencer cada 100000 habitantes (Figura 53)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
128
Figura 53 Tasa estandarizada por edad (ASR) de incidencia de caacutencer para ambos sexos cada 100000
habitantes distribuidas por paiacuteses estimadas en el 2008 Fuente Fuente IARCWHO 2008
53 Carcinoma Hepatocelular
Dentro de los distintos tipos de caacutencer el carcinoma hepatocelular (CHC) tiene la
seacuteptima ASR de incidencia y la cuarta ASR de mortalidad maacutes alta en el mundo ambas
calculadas al 2008 cada 100000 habitantes y para ambos sexos constituyendo la tercer
causa de muerte por caacutencer Por su parte en Argentina la ASR de incidencia y de mortalidad
ocupan los lugares 16deg y 12deg respectivamente lo cual la ubica en el grupo de paiacuteses con
nivel medio-bajo de incidencia de CHC Tomando el nivel de ingresos de los paiacuteses seguacuten el
Banco Mundial los paiacuteses con niveles de ingresos bajo o medio-bajo son los que
presentaron una mayor ARS de incidencia de CHC (GHOWHO 2008)
531 Factores de riesgo
La heterogeneidad en la incidencia mundial refleja las variaciones en los principales
factores de riesgo de CHC En Asia oriental y en Aacutefrica subsahariana el factor de riesgo
dominante es la infeccioacuten croacutenica con el virus de la hepatitis B (HBV) junto con la exposicioacuten
a la aflotoxina B1 responsables del 80 de los casos de CHC En cambio en Ameacuterica del
Norte Europa y Japoacuten el principal factor de riesgo es la infeccioacuten con el virus de la hepatitis
C junto con la ingesta de alcohol (Forner et al 2012)
En el 70-90 de los pacientes el CHC se desarrolla dentro de una enfermedad
hepaacutetica croacutenica subyacente La infeccioacuten croacutenica con HBV constituye el factor de riesgo
maacutes frecuente el cual se da en maacutes del 50 de los casos con CHC En pacientes con
cirrosis el CHC constituye la principal causa de muerte (Forner et al 2012) Otros factores
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
129
de riesgo son la enfermedad del hiacutegado graso no alcohoacutelico y la diabetes (Stickel amp
Hellerbrand 2010)
532 Patogeacutenesis molecular
El CHC es un tumor epitelial desarrollado a partir de los hepatocitos La
hepatocarcinogeacutenesis es un proceso complejo de muacuteltiples pasos durante el cual se alteran
varias cascadas de sentildealizacioacuten relacionadas con la supervivencia y la proliferacioacuten celular
generando un perfil molecular heterogeacuteneo En maacutes del 50 de los casos de CHC las viacuteas
de sentildealizacioacuten Ras y del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) son activadas
mientras que en el 40-50 la viacutea del MTOR (mammalian Target of Rapamycin complejo
sensible a rapamicina) es interrumpida La viacutea de sentildealizacioacuten del receptor del factor de
crecimiento tipo insulina (IGF1R) se activoacute en 20 de los CHC tempranos mientras que la
desregulacioacuten de la viacutea de c-MET y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es un
evento comuacuten La viacutea de sentildealizacioacuten Wnt es activada en un tercio de los CHC La alta
vascularizacioacuten y actividad angiogeacutenica presente en el CHC estaacute asociada a las viacuteas de
sentildealizacioacuten del factor de crecimiento endotelio vascular (VEGFA) la angiopoyetina 2
(ANGPT2) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (Forner et al 2012)
Las dos mutaciones maacutes frecuentes ocurren en el gen supresor de tumor TP53 (en
alrededor del 25-40 de los casos) y en el gen para β catenina CTNNB1 que se da en
aproximadamente el 25 de los casos y predomina en los CHC relacionados con la
infeccioacuten de HCV (Forner et al 2012)
533 Tratamiento
A pesar de ser un problema de salud mundial importante en los uacuteltimos decenios no
se han producidos avances significativos en el pronoacutestico de la mayoriacutea de los pacientes
(Asghar amp Meyer 2012) La deteccioacuten temprana y el posterior tratamiento es la uacutenica opcioacuten
para alcanzar una supervivencia sin enfermedad a largo plazo Un tratamiento precoz
efectivo estaacute asociado con una supervivencia media superior a los 5 antildeos (Forner et al
2012) Existen varios tratamientos que deberaacuten ser elegidos en relacioacuten al pronoacutestico del
paciente (Llovet et al 1999) Sin embargo no existen suficientes estudios cliacutenicos que
comparen los distintos tratamientos principalmente en el caso de pacientes con un estadio
temprano de la enfermedad (Forner et al 2012)
La reseccioacuten quiruacutergica la ablacioacuten y el trasplante tienen potencial curativo y son las
opciones terapeacuteuticas en la fase temprana de la enfermedad Sin embargo en Occidente y
Japoacuten pudieron ser aplicados solamente en un 30 de los pacientes (Llovet et al 2008)
Ademaacutes la recurrencia representa un serio inconveniente para la reseccioacuten y la ablacioacuten
Los uacutenicos tratamientos no curativos que proporcionan supervivencia son la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
130
quimioembolizacioacuten transarterial (TACE) aplicada en pacientes con grandes caacutenceres o
enfermedad multifocal y el Sorafenib una droga administrada oralmente en pacientes con
CHC avanzado (Forner et al 2012)
54 Terapia enzimaacutetica sisteacutemica en pacientes con caacutencer
Con el propoacutesito de evaluar el beneficio de la administracioacuten de mezclas de enzimas
proteoliacuteticas tales como tripsina quimotripsina papaiacutena o bromelina (terapia enzimaacutetica
sisteacutemica) como complementaria en pacientes que sufren de caacutencer de mama colorrectal y
plasmocitoma se llevaron a cabo estudios de cohorte que representan el nivel IIB de la
medicina basada en evidencia (EBM) aceptados por la Unioacuten Europea para mostrar la
seguridad y la eficacia de los tratamientos meacutedicos Estos estudios demostraron que la
terapia enzimaacutetica sisteacutemica disminuyoacute significativamente los efectos secundarios inducidos
por el tumor y la terapia estabilizoacute la calidad de vida y prolongaron la sobrevida (Beuth
2008)
En cuanto a la bromelina existe abundante evidencia de su efecto anti caacutencer
especialmente en modelos celulares y animales asiacute como en ensayos cliacutenicos Sin
embargo como agente terapeacuteutico para el tratamiento del caacutencer no ha sido objeto de
estudios cliacutenicos controlados aleatorios (Chobotova et al 2010) La actividad anti caacutencer es
atribuida a la actividad proteoliacutetica de sus proteasas las cuales permanecen funcionalmente
intactas luego de ser absorbidas por el tracto gastrointestinal (Maurer 2001) La baja
toxicidad de la bromelina (Moss et al 1963) ha permitido la administracioacuten oral de dosis
altas durante largos periacuteodos y ser bien tolerada (Maurer 2001 Brien et al 2004)
55 Objetivos
Dentro del objetivo general de evaluar el posible efecto antitumoral de los preparados
proteoliacuteticos obtenidos a partir de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) B balansae (Bb) y
Pseudananas macrodontes (Pm) asiacute como de bromelina (Bro) se plantearon los siguientes
objetivos especiacuteficos
Evaluar el efecto de Bh Bb Pm y Bro sobre la viabilidad de ceacutelulas de
hepatocarcinoma humano
Evaluar el efecto de Bh Bb Pm y Bro sobre la adhesioacuten de ceacutelulas de
hepatocarcinoma humano
Comparar los efectos medidos de los preparados y de la bromelina en relacioacuten a la
actividad proteoliacutetica
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
131
56 Materiales y meacutetodos
561 Cultivo celular
Se empleoacute una liacutenea celular de hepatocarcinoma primario humano HepG2 C3A
(ATCC) la cual fue mantenida en medio esencial Dulbecco con alta glucosa (Gibco)
suplementado con suero fetal bovino (SFB) inactivado con calor (Natocor Argentina) al 10
conteniendo 50 UmL de penicilina y 50 μgmL de estreptomocina a 37 ordmC en una atmoacutesfera
humidificada con 5 de CO2 Las ceacutelulas fueron incubadas junto al medio de cultivo en
policubetas de 96 pocillos durante 24 h a fin de permitir su adhesioacuten
562 Tratamientos
Las ceacutelulas crecidas en monocapa a una densidad de 15000 ceacutelulaspocillo fueron
incubadas en 90 μL del medio de cultivo libre de SFB y 10 μL de la solucioacuten del preparado
proteoliacutetico Se ensayaron diferentes concentraciones de cada uno y distintos tiempos de
incubacioacuten luego de los cuales se midioacute la viabilidad y la adhesioacuten celular Como control se
usoacute buffer fosfato soacutedico 002M pH 6 el cual a su vez se ensayoacute frente a agua como
control
Con el objetivo de determinar si los efectos medidos fueron debido a la actividad
proteoliacutetica se hicieron ensayos de adhesioacuten y viabilidad incubando las ceacutelulas con los
preparados proteoliacuteticos tratados y no tratados con solucioacuten 40 μM de E-64 En estos
ensayos el control fue una solucioacuten 40 μM de E-64 en buffer fosfato soacutedico 002 M pH 6
5621 Evaluacioacuten de la viabilidad celular (Ensayo con MTS)
La viabilidad celular fue evaluada mediante un ensayo colorimeacutetrico utilizando el kit
Cell Titer 96 AQueous Non-Radiactive Cell Proliferation Assay (Promega Corp USA) Este
ensayo se basa en que el metabolismo de las ceacutelulas viables produce compuestos
reductores que pueden reducir un derivado de tetrazolio 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-
carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS) en presencia de metosulfonato de
fenazina (PMS) a formazaacuten un producto soluble y coloreado (Buttke et al 1993) Por lo
tanto la cantidad de formazaacuten formado seraacute proporcional al nuacutemero de ceacutelulas viables El
PMS actuacutea como acoplador de electrones entre el producto metaboacutelico y el MTS
Luego de los distintos tratamientos 100 μL de MTS y PMS fueron incorporados al
cultivo celular y despueacutes de incubarlos durante 30 min a 37 ordmC se midioacute la absorbancia a 490
nm en un lector de ELISA (Metertech 960) que es considerada como proporcional al
nuacutemero de ceacutelulas viables Los resultados fueron expuestos como porcentajes de ceacutelulas
viables respecto a los controles
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
132
5622 Ensayo de adhesioacuten celular (Tincioacuten con cristal violeta)
Luego de la incubacioacuten con los distintos preparados proteoliacuteticos el medio de cada
pocillo se descartoacute a fin de eliminar las ceacutelulas no adheridas se lavoacute con solucioacuten salina de
buffer fosfato (PBS) y se agregoacute formaldehido al 37 durante 15 min a temperatura
ambiente para fijar las ceacutelulas adheridas Posteriormente se incuboacute con colorante cristal
violeta al 05 en aacutecido aceacutetico al 3 durante 20 min Luego se lavoacute exhaustivamente y se
agregoacute SDS al 1 para disolver el colorante Finalmente se midioacute la absorbancia a 600 nm
utilizando un lector de ELISA (Metertech 960) que es considerada proporcional al nuacutemero
de ceacutelulas adheridas (Martiacutenez et al 2004) Los resultados fueron expresados como
porcentajes de ceacutelulas adheridas respecto al control
563 Anaacutelisis estadiacutestico
Todos los ensayos fueron realizados por triplicado en tres ensayos independientes
Los promedios de cada ensayo fueron considerados medidas independientes y las
diferencias de las medias de los grupos de tratamiento y del grupo control fueron evaluadas
mediante ANOVA seguido del test de Dunnett Un p lt 005 () fue considerado significativo
Los valores son expresados como la media plusmn SEM
564 Material vegetal ensayado
El contenido proteoliacutetico (UCasmg) y proteico (μg proteiacutenamg) asiacute como la actividad
especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos utilizados se presenta en la Tabla 51
Liofilizados UCasmg μg proteiacutenamg UCasmg proteiacutena
Bh 027 plusmn 005 27 plusmn 2 10
Pm 014 plusmn 001 33 plusmn 3 42
Bb 015 plusmn 001 11 plusmn 1 14
Bromelina (Sigma Aldrich) 065 plusmn 002 209 plusmn 2 31
Tabla 51 Contenido proteoliacutetico (UCasmg) proteico (μg proteiacutenamg) y actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena)
de los extractos ensayados UCas unidades caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC) Media plusmn DE
Para todos los ensayos las soluciones de los extractos fueron preparadas por
resuspensioacuten de los liofilizados en agua destilada mientras que la bromelina fue redisuelta
en buffer fosfato soacutedico 002 M de pH 6
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
133
57 Resultados y discusioacuten
571 Ensayo de viabilidad
En la Figura 54 se exponen los resultados obtenidos del ensayo de viabilidad donde
pueden verse los porcentajes de ceacutelulas HepG2 viables luego de incubarlas durante 24 y 48
h con concentraciones crecientes de bromelina Bh Bb y Pm
Figura 54 Viabilidad de ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett plt005 plt001
plt0001 Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato
soacutedico 0002 M pH 6
Puede observarse que todos los preparados fueron capaces de disminuir la viabilidad
de las ceacutelulas HepG2 a las 48 h de incubacioacuten La bromelina fue la maacutes efectiva ya que por
un lado produjo disminucioacuten significativa con 10 μgmL en tanto que Bh Bb y Pm
requirieron una concentracioacuten de un orden de magnitud superior para mostrar un efecto
similar por otro lado fue la que mostroacute menos de ceacutelulas viables (asymp 40 frente al 65 de
los preparados) para las mayores concentraciones ensayadas A las 24 h de incubacioacuten si
bien las concentraciones maacutes altas de Bb y Pm disminuyeron el porcentaje de ceacutelulas
viables (75 y 71 respectivamente) no fueron significativos mientras que siacute lo fueron los
porcentajes de 100 μgmL de bromelina y 1000 μgmL de Bh (52 y 61 respectivamente)
572 Ensayos de adhesioacuten
En la Figura 55 se exponen los resultados del ensayo de adhesioacuten celular de las
ceacutelulas HepG2 luego de incubarlas durante 1 24 y 48 h con concentraciones crecientes de
bromelina Bh Bb y Pm En la Figura 56 se muestran microfotografiacuteas de las ceacutelulas HepG2
Bromelina
1 10 1000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Bb
18 180 18000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Bh
10 100 10000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Pm
10 100 10000
50
100
150
Control 24 h 48 h
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
134
luego de incubarlas durante 24 h con las concentraciones intermedias de bromelina Bh Bb
y Pm
Figura 55 Adhesioacuten celular de ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett plt001 plt0001
Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato soacutedico 0002 M
pH 6
Todos los preparados tuvieron efecto sobre la adhesioacuten celular Se observoacute una
eliminacioacuten de la adhesioacuten de las monocapas celulares a la superficie plaacutestica de los
pocillos Las ceacutelulas en suspensioacuten adoptaron una forma redondeada Desde la primera h de
incubacioacuten y para las mayores concentraciones ensayadas (100 μgmL de bromelina 1000
μgmL de Bh y de Pm y 1800 μgmL de Bb) se observaron los porcentajes de adhesioacuten maacutes
bajos (entre un 15 y un 30) los cuales no mostraron diferencias significativas (pgt005
Tukey) respecto de los de las 24 y 48 h siguientes de incubacioacuten Tal como sucedioacute en los
ensayos de viabilidad bromelina requirioacute una concentracioacuten de un orden de magnitud
inferior a la de las demaacutes preparaciones para lograr el mismo efecto sobre la adhesioacuten
Bromelina
1 10 1000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Bb
18 180 18000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Bh
10 100 10000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Pm
10 100 10000
50
100
150
Control 1 h 24 h 48 h
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
135
Figura 56 Microfotografiacuteas de campo claro representativas de ceacutelulas HepG2 luego de incubarlas durante 24 h
con los preparados proteoliacuteticos Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato soacutedico 0002 M pH 6
Si se comparan los porcentajes de ceacutelulas adheridas con los porcentajes de ceacutelulas
viables puede observarse que las disminuciones significativas en la viabilidad ocurren 24 h
despueacutes de una disminucioacuten significativa en la adhesioacuten excepto para 100 μgmL de Bh
indicando que la peacuterdida de adhesioacuten conlleva una peacuterdida de la viabilidad La concentracioacuten
de 100 μgmL de Bh mostroacute un menor porcentaje de ceacutelulas adheridas (36) respecto al
control a 1 h de incubacioacuten que no fue seguida de una disminucioacuten significativa de ceacutelulas
viables (85) a las 24 h de incubacioacuten Por otro lado 10 μgmL de Bh a las 48 h de
incubacioacuten mostroacute un porcentaje de ceacutelulas viables (85) que resultoacute ser una disminucioacuten
significativa mientras que el porcentaje de ceacutelulas adheridas 24 h antes (85) no lo fue sin
embargo no parece ser concluyente que la disminucioacuten de la viabilidad no sea precedida por
una disminucioacuten de la adhesioacuten en dicho caso si se toman en cuenta los valores
porcentuales absolutos de adhesioacuten y viabilidad
573 Efecto de la actividad proteoliacutetica sobre los porcentajes de viabilidad y
de adhesioacuten celular
Como se mencionoacute en la introduccioacuten el efecto antitumoral de bromelina es atribuido
preponderantemente a la actividad de sus proteasas (Salas et al 2008 Chobotova et al
2010) Con el fin de determinar si los efectos sobre la viabilidad y adhesioacuten celular medidos
tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los preparados se determinaron los
porcentajes de viabilidad y de adhesioacuten de los mismos tratados y no tratados con E-64 Se
usaron las concentraciones de Bromelina Bh Bb y Pm que mostraron mayores efectos
(100 1000 1800 y 1000 μgmL respectivamente) a las 24 y 48 h de incubacioacuten (Figura 57)
Control Bro (10 gml) Bb (180 gml) Bh (100 gml) Pm (100 gml)
10X
20X
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
136
Figura 57 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas sobre su accioacuten reductora de la viabilidad y la adhesioacuten de
ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett p lt 005 p lt 001 p lt 0001 ns no significativo Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control 4 μM de E-64 en buffer fosfato soacutedico 0002 M pH 6
Puede observarse que los preparados tratados con E-64 no tuvieron efecto
significativo sobre la viabilidad como tampoco sobre la adhesioacuten celular a las 24 y 48 h de
incubacioacuten salvo la concentracioacuten de 1000 μgmL de Pm para la cual se observoacute una
disminucioacuten significativa en el porcentaje de ceacutelulas adheridas (76) a las 24 h que sin
embargo es significativamente superior (p lt 0001 test de Tukey) al porcentaje de adhesioacuten
de Pm activo proteoliacuteticamente (16)
Puede concluirse que el efecto sobre la viabilidad y la adhesioacuten celular de bromelina
Bh y Bb a las 24 y 48 h de incubacioacuten y de Pm a las 48 h seriacutea debido a la actividad
proteoliacutetica de sus cisteiacutenendopeptidasas
A fin de realizar una comparacioacuten entre los distintos preparados en relacioacuten a su
actividad proteoliacutetica en la Tabla 52 se exponen los porcentajes de ceacutelulas viables (V) y
de ceacutelulas adheridas (A) luego de 48 h de incubacioacuten en funcioacuten del contenido de
unidades caseinoliacuteticas (UCasmL) de las concentraciones ensayadas para bromelina Bh
Bb y Pm
0
50
100
150
Sin E-64Con E-64
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Bromelina
(100 gml)
Bb
(1800 gml)
Bh
(1000 gml)
Pm
(1000 gml)
Control
nsns ns
nsns
ns
ns
ns
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
0
50
100
150
Control Sin E-64Con E-64
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Bromelina
(100 gml)
Bb
(1800 gml)
Bh
(1000 gml)
Pm
(1000 gml)
ns ns ns ns nsns
ns
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
137
Preparado proteoliacutetico
UCasmL (x10-3
) V A
Bromelina
065 plusmn 002 91 plusmn 2 91 plusmn 1
65 plusmn 02 69 plusmn 4 23 plusmn 4
65 plusmn 2 44 plusmn 3 20 plusmn 4
Bh
27 plusmn 05 86 plusmn 4 99 plusmn 1
27 plusmn 5 66 plusmn 1 30 plusmn 6
270 plusmn 25 63 plusmn 5 19 plusmn 2
Bb
27 plusmn 02 103 plusmn 4 99 plusmn 3
27 plusmn 2 78 plusmn 7 30 plusmn 7
270 plusmn 20 68 plusmn 3 21 plusmn 2
Pm
14 plusmn 01 95 plusmn 5 96 plusmn 2
14 plusmn 1 70 plusmn 1 31 plusmn 8
140 plusmn 10 65 plusmn 8 20 plusmn 2
Tabla 52 Porcentajes de ceacutelulas viables (V) y de ceacutelulas adheridas (A) en relacioacuten con la actividad proteoliacutetica (UCasmL) de bromelina Bh Bb y Pm luego de incubar ceacutelulas HepG2 durante 48 h Media plusmnSEM Resultados test de Dunnett p lt 005 p lt 001 p lt 0001
Se puede observar que bromelina requiere menos actividad proteoliacutetica que los
demaacutes preparados para mostrar efectos similares hecho que podriacutea deberse a que las
proteasas de bromelina actuacutean conjuntamente mostrando una mayor especificidad hacia
sustratos relacionados con la viabilidad y la adhesioacuten celular presentes en las ceacutelulas de
HepG2 que las proteasas presentes en Bh Bb y Pm A su vez Bh y Bb fueron menos
activas que Pm
La carcinogeacutenesis hepaacutetica estaacute asociada en parte a un cambio en el perfil de las
integrinas expresadas en la superficie del hepatocito las cuales juegan un papel
fundamental en la adhesioacuten y la migracioacuten celular contribuyendo al crecimiento y la invasioacuten
del tumor (Nejjari et al 1999 Massini 2007) Asiacute los bajos porcentajes de adhesioacuten de
ceacutelulas de HepG2 luego de tratarlas con bromelina Bh Bb y Pm permite suponer que
resultaraacuten efectivas para inhibir el crecimiento tumoral en CHC Ademaacutes abre un abanico de
posibles ensayos a realizar a fin de determinar cuaacuteles seriacutean las proteiacutenas superficiales
blanco para cada una de los preparados proteoliacuteticos
En este sentido es importante mencionar que uno de los mecanismos por el cual la
bromelina ejerceriacutea efecto antitumoral es su capacidad para clivar proteiacutenas de la superficie
celular CD44 un marcador de superficie presente en ceacutelulas inmunes y tumorales y que
estaacute asociado con el crecimiento tumoral y la metaacutestasis mostroacute ser sensible a la bromelina
en liacuteneas tumorales murinas y humanas resultando en una reduccioacuten de la invasioacuten y
adhesioacuten al sustrato (Chobotova et al 2010) Fastuosaiacutena otra proteasa cisteiacutenica aislada
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
138
de frutos de Bromelia fastuosa resultoacute activa frente a CD44 en ceacutelulas de melanoma murino
(Guimaratildees-Ferreira et al 2007) En un modelo de melanoma murino la mezcla de
papaiacutena tripsina y quimotripsina redujo la expresioacuten de CD44 y CD45 en el tumor lo cual
fue correlacionado con la supresioacuten del melanoma y la metaacutestasis (Wald et al 2001) Por
tanto dado que las ceacutelulas HepG2 expresan CD44 en su superficie se podriacutea sugerir que
bromelina asiacute como tambieacuten Bh Bb y Pm podriacutean ejercer sus efectos a traveacutes de esta
proteiacutena ademaacutes de las integrinas
La disminucioacuten de la viabilidad celular de HepG2 observada para los preparados
proteoliacuteticos constituye un paso inicial hacia la buacutesqueda de los posibles mecanismos que la
estariacutean mediando Determinar si ha habido arresto celular induccioacuten de apoptosis asiacute
como cuaacuteles son las viacuteas de sentildealizacioacuten involucradas si bien no han sido objetivos de esta
tesis se muestran como prometedores temas para futuros estudios En este sentido existe
evidencia de la capacidad de bromelina para inducir activadores de la apoptosis (p53 y Bax)
en papiloma cutaacuteneo en ratoacuten asiacute como reducir la actividad de reguladores de la
supervivencia celular como Akt y Erk esta uacuteltima de forma contexto celular dependiente
(Chobotova et al 2010) en ceacutelulas de melanoma y carcinoma epideacutermico humano ha
promovido el arresto del ciclo celular en la fase G2M conducieacutendolas a apoptosis (Bhui et
al 2011)
En la Tabla 52 puede observarse que un aumento en 10 veces de la concentracioacuten
de bromelina produjo un cambio importante en el porcentaje de ceacutelulas viables (de 69 a
44) mientras el porcentaje de adhesioacuten permanece aproximadamente constante (20) lo
cual estariacutea indicando que la bromelina podriacutea afectar la viabilidad celular
independientemente de la alteracioacuten de la adhesioacuten celular Esto es diferente a lo observado
en ceacutelulas de glioblastoma humano donde una reduccioacuten en la adhesioacuten la migracioacuten y la
invasioacuten asociada con la reduccioacuten de la integrina α3β1 y el CD44 en la superficie celular no
fue acompantildeada por una disminucioacuten de la viabilidad (Tysnes et al 2001) La aparente
diferencia en el efecto de la bromelina sobre ceacutelulas tumorales humanas podriacutea reflejar una
especificidad de accioacuten lo cual podriacutea hacerla maacutes eficiente como tratamiento frente a
algunos tipos de caacutencer que de otros hecho que hace necesario el estudio sobre mayor
nuacutemero de liacuteneas celulares tumorales humanas (Chobotova et al 2010)
La bromelina no ha sido probada frente a ceacutelulas de HepG2 asiacute como tampoco Bh
Bb y Pm para los cuales estos resultados son los primeros en relacioacuten a la buacutesqueda de
posibles efectos antitumorales Si bien queda una serie de aspectos por investigar
(mecanismos de accioacuten efectos sobre el crecimiento tumoral y metaacutestasis capacidad
migratoria citotoxicidad etc) el presente trabajo constituye un indicio de los potenciales
efectos terapeacuteuticos de proteasas cisteiacutenicas frente al carcinoma hepatocelular
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
139
58 Conclusiones
Extractos ricos en cisteinendopeptidasas de Bromelia hieronymi (Bh) B balansae
(Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) mostraron efecto reductor de la viabilidad y
la adhesioacuten de ceacutelulas de carcinoma hepatocelular (HepG2)
Bh Bb y Pm tuvieron efectos similares en relacioacuten al contenido de unidades
caseinoliacuteticas siendo menores a los mostrados por bromelina
Bh Bb y Pm al igual que bromelina perdieron la accioacuten reductora de viabilidad y
adhesioacuten celular al inhibir la actividad de las cisteinendopeptidasas
Nuevos estudios son necesarios para profundizar el conocimiento de los
mecanismos involucrados en los efectos medidos asiacute como para encontrar otras
acciones que resulten beneficiosas para la terapia de CHC
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
140
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6 CONCLUSIONES FINALES Y PERSPECTIVAS
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
142
El objetivo general del presente trabajo de tesis doctoral fue estudiar la posible
aplicacioacuten farmacoloacutegica de extractos de tres especies vegetales pertenecientes a la familia
Bromeliaceae Bromelia hieronymi Mez Bromelia balansae Mez y Pseudananas
macrodontes (Morr) Harms autoacutectonas del aacuterea que abarca el NEA y NOA Paraguay
Brasil Bolivia y Colombia Las tres especies habiacutean sido previamente estudiadas en el
LIProVe desde el punto de vista bioquiacutemico habieacutendose aislado y caracterizado diversas
endopeptidasas cisteiacutenicas a partir de sus frutos
A excepcioacuten del uso en medicina popular de B balansae para calmar la tos no
existen referencias sobre aplicaciones medicinales de las especies mencionadas Sin
embargo es abundante la informacioacuten sobre las propiedades antiinflamatorias
antitromboacuteticas inmunomoduladoras y antitumorales de la bromelina un extracto acuoso
obtenido a partir del ananaacute [Ananas comosus (L) Merr] especie tambieacuten perteneciente a la
familia Bromeliaceae y rica en endopeptidasas cisteiacutenicas a las que se atribuyen las
actividades farmacoloacutegicas citadas Por este motivo se decidioacute estudiar los efectos
antiinflamatorios antitumorales anticoagulantes fibrinoliacuteticos y fibrinogenoliacuteticos de
extractos acuosos parcialmente purificados por precipitacioacuten etanoacutelica obtenidos a partir de
frutos de B hieronymi (Bh) B balansae (Bb) y P macrodontes (Pm) en relacioacuten a la
actividad proteoliacutetica de los mismos
En base a los estudios realizados se ha arribado a las siguientes conclusiones
Bh Bb y Pm mostraron efecto antiinflamatorio en modelos animales de
inflamacioacuten aguda al ser administradas intraperitonealmente
En el modelo de inflamacioacuten aguda ensayado (edema de pata de rata inducida por
carragenina) dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica (asymp30 UCaskg) de Bh Pm y
bromelina mostraron efectos antiinflamatorios significativamente similares a 10 mgkg de
indometacina El efecto antiinflamatorio medido para Bb fue menor y en algunos ensayos fue
acompantildeado de signos de toxicidad
El efecto antiinflamatorio medido en este modelo fue dependiente de la actividad
caseinoliacutetica (UCas) de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb y bromelina mientras que soacutelo
parcialmente de las de Pm quedando por determinar si la actividad fibrinoliacutetica de Pm es
causal del efecto antiinflamatorio medido para 0 UCaskg de Pm
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
143
Los efectos antiinflamatorios de Bh Bb Pm y bromelina alcanzaron los maacuteximos
valores entre las 5 y las 7 h de inducido el estiacutemulo inflamatorio tiempos en que se alcanza
el maacuteximo valor de inflamacioacuten Teniendo en cuenta los mediadores involucrados en dicha
fase del modelo seriacutea posible que las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb y Pm ejercieran su
accioacuten sobre la COXPGs la NOSNO y la infiltracioacutenactividad de los neutroacutefilos para cuya
confirmacioacuten deberiacutean orientarse futuras investigaciones sobre el mecanismo de accioacuten de
las mismas en los efectos antiinflamatorios observados
Si bien en una magnitud menor dosis de asymp30 UCaskg de Bh Pm y bromelina
tambieacuten fueron efectivas como antiinflamatorios en el modelo de edema de pata de rata
inducido por serotonina no mostrando efecto significativo sobre el edema inducido por
histamina
Mediante el modelo de inflamacioacuten croacutenica en ratas test del granuloma inducido
por pellet de algodoacuten se observoacute un significativo efecto antiinflamatorio de Pm y
bromelina al ser administradas intraperitonealmente mientras que para Bh y Bb
no se obtuvieron resultados concluyentes
Dado que una dosis de asymp10 UCaskg de Pm mostroacute un efecto antiinflamatorio
equivalente al de una dosis de asymp30 UCaskg de bromelina y que ambos efectos fueron
dependientes de la actividad proteoliacutetica (UCas) las proteasas cisteiacutenicas de Pm mostrariacutean
una mayor especificidad que las de bromelina frente a los efectores proinflamatorios
Si bien los efectos antiinflamatorios de Pm y bromelina fueron significativamente
menores o similares al de dexametasona (3 mgkg) a las dosis ensayadas no mostraron
efectos adversos tiacutepicos de glucocorticoides tales como la peacuterdida de masa corporal y
reduccioacuten del peso del bazo causando significativa reduccioacuten del peso del timo pero entre 3
y 4 veces menos que la dexametasona (3 mgkg)
Los efectos antiinflamatorios medidos para dosis de asymp30 UCaskg de Bh y de Bb no
fueron reproducibles en posteriores ensayos
La accioacuten antiinflamatoria medida en el modelo del granuloma para todos los
preparados proteoliacuteticos fue acompantildeada de un significativo y leve efecto reductor del peso
del timo el cual a su vez fue dependiente de la actividad proteoliacutetica de las proteasas
cisteiacutenicas de Pm y bromelina Dilucidar si este hecho es indicativo de un mecanismo
subyacente de la accioacuten antiinflamatoria o es un efecto independiente de los preparados
proteoliacuteticos podriacutea ser objeto de futuras investigaciones
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
144
Bh Bb y Pm actuaron como anticoagulantes fibrinogenoliacuteticas y fibrinoliacuteticas
Bh Bb y Pm prolongaron los tiempos de protrombina (TP) y de tromboplastina parcial
activada (TTPa) de plasma humano en ensayos in vitro ademaacutes de alterar la consistencia
de los coaacutegulos formados respecto de un plasma no tratado con los preparados Ambos
efectos fueron totalmente dependientes de la actividad proteoliacutetica de las proteasas
cisteiacutenicas excepto los efectos de Bb sobre el TP y el TTPa y de Pm sobre el TTPa los
cuales dependieron parcialmente de las cisteiacutenendopeptidasas sugiriendo la presencia de
otros componentes anticoagulantes
El hecho de que una actividad proteoliacutetica (UCas) equivalente de bromelina Bh Bb y
Pm no produjera efectos anticoagulantes equivalentes da cuenta de las diferentes
especificidades con las que actuariacutea cada preparado sobre los distintos elementos del
sistema de coagulacioacuten
En los ensayos In vivo si bien dosis con equivalente actividad proteoliacutetica (65
UCaskg) de todos los preparados administrados intraperitonealmente prolongaron el TP y el
TTPa soacutelo Bb prolongoacute levemente el TP en forma estadiacutesticamente significativa mostrando
un valor de TP significativamente similar al de la bromelina
El efecto sobre el fibrinoacutegeno fue equivalente cuali y cuantitativamente para
equivalentes actividades caseinoliacuteticas (UCas) de Bh Bb Pm y bromelina siendo la
subunidad Aα del fibrinoacutegeno la maacutes susceptible de ser clivada lo cual podriacutea explicar la
alteracioacuten de la consistencia del coaacutegulo observada en los ensayos de medida de TP y
TTPa
Como agentes fibrinoliacuteticos Bh Bb y Pm tuvieron un comportamiento similar y
significativamente diferente al de bromelina la cual a su vez mostroacute un comportamiento
significativamente similar a la plasmina A equivalentes valores de actividad caseinoliacutetica
(UCas) la bromelina mostroacute mayor especificidad que Bh Bb y Pm frente a la fibrina
respecto a los componentes de la cascada de la coagulacioacuten
Los efectos fibrinogenoliacutetico anticoagulante y fibrinoliacutetico medidos para Bh Bb y Pm
los ubica como potenciales agentes antitromboacuteticos o tromboliacuteticos lo cual deberaacute ser
evaluado en modelos de trombosis Las relaciones establecidas entre dichos efectos y el
contenido proteoliacutetico de los preparados podraacuten ser de utilidad al momento de establecer
dosis asiacute como interpretar resultados en futuros ensayos de trombosis
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
145
En relacioacuten a la accioacuten antiinflamatoria la actividad fibrinoliacutetica de Bh Bb y Pm
puede contribuir al mecanismo de accioacuten anti-edema evaluado in vivo hecho que ya ha sido
corroborado para bromelina en tanto que para Bh Bb y Pm ello queda supeditado a futuras
investigaciones dirigidas a dilucidar los mecanismos subyacentes a los efectos
antiinflamatorios medidos
Bh Bb Pm y bromelina disminuyeron significativamente la viabilidad y la
adhesioacuten de ceacutelulas de carcinoma hepatocelular (HepG2)
Los efectos sobre la viabilidad y la adhesioacuten dependieron de la actividad proteoliacutetica
de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina siendo las proteasas de bromelina
las maacutes especiacuteficas en relacioacuten a las de Bh Bb y Pm
Estos resultados abren camino a futuros ensayos dirigidos no soacutelo a estudiar los
mecanismos de accioacuten a traveacutes de los cuales Bh Bb Pm y bromelina afectariacutean las ceacutelulas
de HepG2 sino tambieacuten para evaluar los efectos sobre otros modelos maacutes complejos
Los efectos antiinflamatorios asiacute como anticoagulantes y fibrinoliacuteticos de Bh Bb y Pm
constituyen cualidades con potenciales efectos terapeacuteuticos en el tratamiento sisteacutemico del
caacutencer delineando otra posible liacutenea de investigacioacuten futura
En siacutentesis el presente trabajo ha pretendido aportar informacioacuten novedosa acerca
de la posible importancia farmacoloacutegica de principios activos en este caso proteasas de tipo
cisteiacutenico presentes en plantas que crecen en nuestro paiacutes y que podriacutean enriquecer el no
demasiado extenso acervo de fitofaacutermacos en uso en este momento Por tratarse de
resultados preliminares seraacute necesario en caso de resultar de intereacutes la realizacioacuten de
estudios posteriores y de mayor complejidad que confirmen el potencial farmacoloacutegico de los
preparados estudiados en el marco de la seguridad en cuanto a los riesgos toxicoloacutegicos
que pueda presentar el uso de los mismos
Agradecimientos
A la Facultad de Ciencias Exactas de La Universidad Nacional de La Plata por haberme permitido
realizar mis estudios de grado y posgrado
Al Consejo Nacional de Investigaciones Cientiacuteficas y Teacutecnicas por brindarme las becas para la
realizacioacuten del presente Trabajo de Tesis
Al LIProVe y en especial al Dr Neacutestor O Caffini por ofrecerme el Lugar de Trabajo por su
predisposicioacuten para ayudarme y enorme paciencia para ensentildear
A la Secretariacutea de Poliacuteticas Universitarias del Ministerio de Educacioacuten de La Nacioacuten que a traveacutes del
Programa Inter-U me brindoacute los medios econoacutemicos para los viajes a San Luis donde realiceacute parte
del trabajo experimental aquiacute presentado
A Veroacutenica Laacutezaro quien actuoacute eficientemente en la gestioacuten del Programa Inter-U dentro de La
Facultad de Ciencias Exactas de La Universidad Nacional de La Plata
A la Dra Alejandra E Rotelli mi codirectora de beca por la ensentildeanza y direccioacuten de los ensayos con
modelos animales asiacute como por la colaboracioacuten en la realizacioacuten de los mismos en la Facultad de
Quiacutemica Bioquiacutemica y Farmacia de la Universidad Nacional de San Luis
A la Dra Mariacutea Fernanda Troncoso por la ensentildeanza y colaboracioacuten en la realizacioacuten de los ensayos
con ceacutelulas tumorales en el IQUIFIB Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica de la Universidad de Buenos
Aires y por la correccioacuten del capiacutetulo ldquoEfecto antitumoralrdquo
A la Bioq Mariana Marta Gonzalez de la Caacutetedra de Hematologiacutea de la Facultad de Ciencias Exactas
de la Universidad Nacional de La Plata por la ensentildeanza y colaboracioacuten en los ensayos de
coagulacioacuten y en la obtencioacuten de los pooles de plasma
A la Bioq Anabela Prospitti por la colaboracioacuten en la obtencioacuten de los pooles de plasma
A los Dres Mariana Gomez y Pastor Arenas quienes muy amablemente nos proporcionaron material
bibliograacutefico en relacioacuten a los usos de las bromeliaacuteceas en nuestro paiacutes
A los Dres Mariela Bruno y Marcelo Pardo quienes me ensentildearon los primeros pasos en las teacutecnicas y
metodologiacuteas para el estudio de las proteasas vegetales
En el plano afectivo
A M Fernanda Troncoso por toda su predisposicioacuten y calidez humana
A Mariana y Susana por la buena onda y el compantildeerismo durante las mantildeanas en el laboratorio de
Hematologiacutea
A los integrantes de la Caacutetedra de Farmacologiacutea de la Facultad de Quiacutemica Bioquiacutemica y Farmacia de
la Universidad Nacional de San Luis en especial a Graciela Ameacuterico Alejandra Lily Susana
Mariano y muy especialmente a Ale por la calidez humana el buen humor los brindis y las cenas los
paseos por el surrealismo puntano y los mates frente al arroyo
A los integrantes (algunos ex) del LIProVe en especial a Cacho (Caffini) Ana (Prospitti) Jose (Torres)
Ine (Martin) Martiacuten (Lazza) Euge (Tavarone) Suacute (Morcelle del Valle) Celes (Branda) Franco
(Bernabei) Claudia (Natalucci) y Laura (Lopez) por los tiempos compartidos el ldquosoporterdquo en
momentos difiacuteciles el buen humor y el compantildeerismo Gracias por la paciencia Cacho
A Meli Ana y Guille por simplemente COMPARTIR
A mis viejos mis hermanos a Alfon y Ernes por lo que aprendiacute y volviacute a aprender por las risas y los
abrazos
A Leo por el aguante (PArsquo CIENCIA) los horizontes (se hicieron anchos) y la certeza de que las
palabras no me alcanzaraacuten
Algunos de los resultados presentados en esta Tesis Doctoral han sido objeto de las
siguientes publicaciones yo comunicaciones en reuniones cientiacuteficas
Publicaciones
Errasti M E Caffini N O Pelzer L E amp Rotelli A E (2013) ldquoAnti-inflammatory
Activity of Bromelia hieronymi Comparison with Bromelainrdquo Planta Medica 79 207-
213
Mariacutea E Errasti Neacutestor O Caffini Lilian E Pelzer and Alejandra E Rotelli (2013)
ldquoEvaluation of anti-inflammatory activity of Pseudananas macrodontes (Morr) Harms
fruit extract (Bromeliaceae) in ratsrdquo Zeitschrift fuumlr Naturforschung C (aceptado y en
proceso de revisioacuten)
Comunicaciones en reuniones cientiacuteficas
Errasti ME Bruno MA Rotelli AE Caffini NO Pelzer LE ldquoAntiinflammatory
activity of a partially purified extract from Bromelia hieronymi fruitsrdquo XLI Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Rosario
Santa Fe Argentina 24 al 26 de Noviembre de 2009
Errasti ME Caffini NO Rotelli AE Pelzer L ldquoAccioacuten antiinflamatoria de un
extracto de frutos de Bromelia hieronymi en un modelo de inflamacioacuten croacutenica en
ratasrdquo XLII Reunioacuten Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental
(SAFE) Mar del Plata Buenos Aires Argentina 17 al 20 de Noviembre de 2010
Errasti ME Rotelli AE Gonzaacutelez MM ldquoEvaluacioacuten in vitro de la accioacuten fibrinoliacutetica
y sobre la coagulacioacuten sanguiacutenea de extractos de Bromeliaceasrdquo XLIII Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Tucumaacuten
Argentina 2 al 4 de Noviembre de 2011
Errasti ME Caffini NO Rotelli AE Pelzer L ldquoExtractos de Pseudananas
macrodontes y Bromelia balansae con accioacuten antiinflamatoria en un modelo de
inflamacioacuten croacutenica en ratasrdquo XLIII Reunioacuten Anual de la Sociedad Argentina de
Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Tucumaacuten Argentina 2 al 4 de Noviembre de
2011
Errasti ME Caffini NO Pelzer LE Rotelli AE ldquoRelacioacuten entre efecto
antiinflamatorio y accioacuten proteoliacutetica de extractos de Bromeliaceasrdquo XLIV Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Mendoza
Argentina 31 de Octubre al 2 de Noviembre de 2012
Errasti ME Caffini NO Troncoso MF ldquoAccioacuten de extractos de Bromeliaceas sobre
la adhesioacuten y viabilidad de ceacutelulas de carcinoma hepatocelularrdquo XLIV Reunioacuten Anual
de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Mendoza
Argentina 31 de Octubre al 2 de Noviembre de 2012
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
iii
32 Objetivos 49
33 Materiales y meacutetodos 50
331 Modelos de inflamacioacuten 50
3311 Modelos de inflamacioacuten aguda Edema de pata de rata 50
33111 Edema de pata inducido por carragenina 50
331111 Procedimiento experimental 51
33112 Edema de pata inducido por histamina 51
331121 Procedimiento experimental 51
33113 Edema de pata inducido por serotonina 52
331131 Procedimiento experimental 52
33114 Equipamiento medidas y caacutelculo del volumen de edema 52
3312 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma 53
331 21 Procedimiento experimental 53
3313 Caacutelculo del efecto antiinflamatorio y anaacutelisis estadiacutestico 53
332 Animales 54
333 Dosis 54
334 Material vegetal ensayado 54
34 Resultados y Discusioacuten 56
341 Modelos de inflamacioacuten aguda 56
3411 Edema de pata de rata inducido por carragenina 56
34111 Bromelia hieronymi 56
341111 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina 57
34112 Pseudananas macrodontes 59
341121 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm 60
34113 Bromelia balansae 61
341131 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb 61
3412 Otros modelos de inflamacioacuten aguda 63
34121 Edema de pata inducido por histamina en ratas 63
34122 Edema de pata inducido por serotonina en ratas 64
341221 Bromelia hieronymi 64
341222 Pseudananas macrodontes 65
342 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma 65
3421 Bromelia hieronymi 65
34211 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina
en el test del granuloma 67
3422 Pseudananas macrodontes y Bromelia balansae 69
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
iv
34221 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb en el
test del granuloma 70
34222 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm en el
test del granuloma 71
3423 Posible relacioacuten entre la actividad proteoliacutetica-accioacuten antiinflamatoria-
modulacioacuten sobre poblacioacuten linfocitaria T 74
35 Conclusiones 77
36 Referencias 78
4 Efecto anticoagulante fibrinogenoliacutetico y fibrinoliacutetico
41 Hemostasia 82
411 Vasoconstriccioacuten 82
412 Formacioacuten del trombo plaquetario 82
413 Coagulacioacuten 83
4131 Fase inicial 85
4132 Fase de amplificacioacuten 86
4133 Fase de propagacioacuten 86
4134 Formacioacuten de fibrina 87
4135 Regulacioacuten de la coagulacioacuten 89
414 Fibrinoacutelisis 90
42 Trombosis 91
421 Agentes para el tratamiento de la trombosis 93
4211 Proteasas vegetales como antitromboacuteticos 94
43 Objetivos 95
44 Materiales y meacutetodos 95
441 Efecto anticoagulante 95
4411 Ensayos in vitro 95
44111 Pool de plasma pobre en plaquetas 95
44112 Tiempo de protrombina (TP) 96
44113 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 97
44114 Efecto de la inhibicioacuten de la actividad proteoliacutetica sobre la
accioacuten anticoagulante 98
44115 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados 98
4412 Ensayos in vivo 98
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
v
44121 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados 99
442 Efecto fibrinogenoliacutetico 100
4421 Hidrolizados 100
4422 Tricina-SDS-PAGE 101
443 Efecto fibrinoliacutetico 102
4431 Placa de fibrina 102
4432 Caacutelculos y anaacutelisis de resultados 103
444 Material vegetal 104
45 Resultados y discusioacuten 105
451 Efecto anticoagulante 105
4511 Ensayos in vitro 105
45111 Tiempo de Protrombina (TP) 106
45112 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 108
45113 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de los preparados
proteoliacuteticos sobre su efecto anticoagulante 112
4512 Ensayos in vivo 114
452 Efecto fibrinogenoliacutetico 116
453 Efecto fibrinoliacutetico 119
46 Conclusiones 122
47 Referencias 123
5 Efecto antitumoral
51 Las causas de la aparicioacuten del caacutencer 125
52 Epidemiologiacutea del caacutencer 126
53 Carcinoma Hepatocelular 128
531 Factores de riesgo 128
532 Patogeacutenesis molecular 129
533 Tratamiento 129
54 Terapia enzimaacutetica sisteacutemica en pacientes con caacutencer 130
55 Objetivos 130
56Materiales y meacutetodos 131
561 Cultivo celular 131
562 Tratamientos 131
5621Evaluacioacuten de la viabilidad celular (Ensayo con MTS) 131
5622 Ensayo de adhesioacuten celular (Tincioacuten con cristal violeta) 132
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
vi
563 Anaacutelisis estadiacutestico 132
564 Material vegetal ensayado 132
57 Resultados y discusioacuten 133
571 Ensayo de viabilidad 133
572 Ensayos de adhesioacuten 133
573 Efecto de la actividad proteoliacutetica sobre los porcentajes de viabilidad
y de adhesioacuten celular 135
58 Conclusiones 139
59 Referencias 140
6 Conclusiones finales y perspectivas 142
Agradecimientos 146
1 INTRODUCCIOacuteN GENERAL Y OBJETIVOS
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
1
11 Productos Naturales Medicina Tradicional y Fitomedicinas
Los productos naturales en especial los de origen vegetal han sido una importante
fuente de agentes terapeacuteuticos Los medicamentos derivados de productos naturales
representan alrededor de un 25-30 de los agentes terapeacuteuticos actuales Si bien en las
uacuteltimas deacutecadas debido al avance de la quiacutemica combinatoria la investigacioacuten sobre
productos naturales en la industria farmaceacuteutica ha mostrado una desaceleracioacuten para
algunas enfermedades complejas los productos naturales todaviacutea constituyen una fuente
muy valiosa para la produccioacuten de nuevas entidades quiacutemicas ya que representan
estructuras seleccionados por mecanismos evolutivos durante millones de antildeos (Calixto
2005)
Los ldquoFitomedicamentosrdquo o ldquoFitomedicinasrdquo constituyen una categoriacutea especial de
drogas vegetales Una de las criacuteticas tradicionalmente formuladas a la Medicina Natural o
Medicina Tradicional es la falta de normalizacioacuten o estandarizacioacuten de los materiales
bioloacutegicos pero las fitomedicinas difieren de las asiacute llamadas ldquoplantas medicinalesrdquo en que
estaacuten normalizadas o estandarizadas lo que significa que ciertos compuestos que estaacuten
presentes en el material vegetal se han cuantificado y dilucidado con lo que en principio se
cuenta con un producto final de composicioacuten maacutes o menos constante (Israelsen 1993) en la
medida en que se respeten la eacutepoca y el lugar de recoleccioacuten (Bennett et al 1990)
En contraste con los millones de doacutelares y antildeos de investigacioacuten necesarios para
desarrollar un nuevo medicamento por siacutentesis o incluso desde el prototipo de una fuente
natural el desarrollo de fitofaacutermacos estandarizados exige menos presupuesto y parece ser
perfectamente factible en los paiacuteses en desarrollo Esta aacuterea estaacute recibiendo mucha
atencioacuten en Brasil y en la mayoriacutea de los paiacuteses de Ameacuterica Latina Por otra parte la
comercializacioacuten de las fitomedicinas se ha expandido en todo el mundo durante los uacuteltimos
antildeos especialmente en paiacuteses de Europa como Alemania Francia Italia Reino Unido
Espantildea y maacutes recientemente tambieacuten en los Estados Unidos de Ameacuterica (Calixto 2005)
El intereacutes por las plantas medicinales y las fitomedicinas adopta diferentes
caracteriacutesticas en las diferentes partes del mundo De acuerdo a la Organizacioacuten Mundial de
la Salud aproximadamente el 65-80 de la poblacioacuten de los paiacuteses en desarrollo como
consecuencia de la pobreza y de la imposibilidad de acceso a la medicina moderna
dependen esencialmente de las plantas para la Atencioacuten Primaria de la Salud (Calixto
2005) En todo el continente africano alrededor del 80 de sus habitantes utilizan
fitomedicinas especialmente en el tratamiento de enfermedades que resultan prevalentes
en la zona tales como el VIHSIDA el paludismo la anemia falciforme o drepanociacutetica la
diabetes y la hipertensioacuten Los defensores de las fitomedicinas argumentan que son maacutes
beneficiosas que sus equivalentes sinteacuteticos por ser seguras econoacutemicas aceptables
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
2
culturalmente y adecuadas para tratamientos croacutenicos sugiriendo que su uso deberiacutea
integrarse a la agenda de Salud de dichos paiacuteses (Okigbo amp Mmeka 2006)
La produccioacuten de plantas medicinales y aromaacuteticas tiene una larga tradicioacuten en varios
paiacuteses de Europa tales como el Reino Unido Italia Grecia Alemania Austria y Francia
mientras que en Finlandia Irlanda y Holanda se ha establecido a lo largo de las uacuteltimas
deacutecadas (Verlet amp Leclercq 1998) Desde la deacutecada del 90 se ha producido un
resurgimiento en el intereacutes y el uso de productos de plantas medicinales en Ameacuterica del
Norte y Europa Estudios sobre el uso de plantas medicinales por el puacuteblico norteamericano
han mostrado un aumento en el consumo de casi el 3 de la poblacioacuten en 1991 a maacutes del
37 en 1998 Un factor importante que sin duda contribuyoacute a dicho incremento fue la
promulgacioacuten en ese paiacutes de la legislacioacuten federal de 1994 (Dietary Supplement Health and
Education Act) que facilitoacute la produccioacuten y comercializacioacuten de productos fitomedicinales y
el consiguiente ingreso de varias compantildeiacuteas farmaceacuteuticas importantes en la produccioacuten de
fitomedicinas (Brevoort 1998) En los paiacuteses desarrollados se ha venido dando un aumento
en el uso de la medicina complementaria y alternativa dentro de la cual se incluyen las
fitomedicinas Esto podriacutea deberse ademaacutes de a la tradicioacuten al bajo costo y a una
preocupacioacuten creciente por los efectos adversos de los faacutermacos sinteacuteticos Por otro lado la
esperanza de vida maacutes larga en dichos paiacuteses ha dado como resultado un aumento de los
riesgos de desarrollar enfermedades croacutenicas y debilitantes (las enfermedades coronarias
el caacutencer y la diabetes) y para muchos pacientes la medicina alternativa parece ofrecer
medios menos agresivos para el tramiento de dichas enfermedades que la medicina
alopaacutetica (OMS 2002)
Las Farmacopeas de diversos paiacuteses han recogido en sus monografiacuteas algunas de
las plantas medicinales de mayor difusioacuten La legislacioacuten europea sobre medicamentos
tambieacuten aborda el uso medicinal de los productos procedentes de las plantas El Comiteacute de
Medicamentos a Base de Plantas (HPMC) se constituyoacute en la Agencia Europea de
Medicamentos (EMA) para proporcionar monografiacuteas y entradas de la lista de sustancias y
sus preparados a base de hierbas Mientras tanto se han publicado aproximadamente 100
monografiacuteas donde se define el estaacutendar cientiacutefico y regulatorio vigente para asegurar la
eficacia y la seguridad de las sustancias vegetales y preparados vegetales utilizados en los
medicamentos (Knoumlss amp Chinou 2012)
La Farmacopea de los Estados Unidos de Ameacuterica (USP 32 ndash NF 27) contiene 76
monografiacuteas relacionadas con productos de origen vegetal Si bien existe una farmacopea
herbolaria bastante completa editada con el tiacutetulo de American Herbal Pharmacopoeia eacutesta
no tiene caraacutecter oficial La Farmacopea Mexicana (FEUM) por su parte registra 56
productos vegetales de aplicacioacuten en medicina En la actualidad ambas Farmacopeas
contienen un nuacutemero reducido de monografiacuteas de productos vegetales en comparacioacuten al
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
3
que registran sus homoacutelogas europeas En el caso del coacutedigo mexicano esta ausencia es
auacuten maacutes pronunciada y fue en el antildeo 2000 cuando se inicia un cambio con la publicacioacuten de
la Farmacopea Herbolaria la cual forma parte de la FEUM Esta publicacioacuten marca el inicio
del rescate del arsenal terapeacuteutico conocido y usado en Meacutexico desde siglos atraacutes (Schifter
Aceves et al 2009)
En cuanto a la Farmacopea Argentina en 2008 se renovoacute su Comisioacuten Permanente
quien ya ha producido la uacuteltima versioacuten de la misma (Farmacopea Argentina VIIIa Edicioacuten)
disponible en la paacutegina de la Administracioacuten Nacional de Alimentos Medicamentos y
Tecnologiacutea Meacutedica (ANMAT) en cuatro voluacutemenes1 el tercero de los cuales contiene un
ldquoApartado de Fitoteraacutepicosrdquo que incluye 29 monografiacuteas (ANMAT 2011)
La flora argentina se encuentra representada por maacutes de 8000 especies de plantas
superiores De ellas alrededor de 1600 son utilizadas por la poblacioacuten como ldquoremedio
caserordquo (Rondina et al 2010) en especial por parte de los sectores sociales de menor
acceso a los sistemas de salud
Un estudio sobre el nuacutemero de trabajos publicados entre 1984 y 2004 en revistas
cientiacuteficas indexadas con referato da cuenta del avance que ha tenido en los uacuteltimos antildeos la
investigacioacuten sobre productos naturales (especiacuteficamente plantas) en Ameacuterica Latina siendo
Brasil y luego Meacutexico Argentina y Chile los paiacuteses con mayor nuacutemero de publicaciones Los
estudios de domesticacioacuten produccioacuten biotecnologiacutea y de mejora geneacutetica de las plantas
medicinales son otros campos de la ciencia que se desprenden de tales avances en el uso
de plantas medicinales en Ameacuterica Latina (Calixto 2005)
Latinoameacuterica contiene gran parte de la biodiversidad de todo el mundo pero a pesar
de ello nuestros paiacuteses nunca han podido utilizarla en beneficio de su propio desarrollo
Peor auacuten como consecuencia de la explotacioacuten sin control la mayor parte de las aacutereas
relevantes en cuanto a biodiversidad se ha reducido sensiblemente antildeo tras antildeo mas allaacute
de los esfuerzos esporaacutedicos de algunos gobiernos por preservarla Inclusive el
conocimiento de la medicina tradicional tambieacuten estaacute desapareciendo especialmente el
derivado de las comunidades indiacutegenas originarias (Calixto 2005)
12 Generalidades de la Familia Bromeliaceae
La familia Bromeliaceae estaacute constituida por casi 3700 especies incluidas en 57
geacuteneros Tradicionalmente la familia ha sido subdividida en tres subfamilias Pitcairnioideae
Tillandsioideae y Bromelioideae La subfamilia Pitcairnioideae incluye a las bromeliaacuteceas
maacutes ancestrales y muchas de sus especies recuerdan a la familia de las gramiacuteneas
(Poaceae) de la cual evolucionaron La mayoriacutea son terrestres contando con un sistema
1 httpwwwanmatgovarwebanmatfnaoctava_edicionasp
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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extenso de raiacutez La subfamilia Tillandsioideae formada mayoritariamente por especies
epiacutefitas se ha adaptado para sobrevivir en condiciones muy secas las semillas tienen alas
lo que las hace susceptibles de ser dispersadas por el viento y apeacutendices plumosos que les
permite adherirse sobre superficies rugosas Bromelioideae es la subfamilia maacutes diversa
La mayoriacutea de sus especies tambieacuten son epiacutefitas aunque algunas se han adaptado a las
condiciones terrestres Estaacuten compuestas de un arreglo foliar espiralado denominado
ldquorosetardquo donde las bases foliares se superponen parcialmente y pueden funcionar como un
reservorio hiacutedrico Generalmente tienen hojas espinosas y sus semillas son a menudo
distribuidas por los paacutejaros y animales que consumen sus frutos carnosos (Bromeliad
Society International) Pero en base a recientes estudios geneacuteticos (Givnish et al 2011) los
geacuteneros de la subfamilia Pitcairnioideae han sido reagrupados en 6 subfamilias con lo que
la situacioacuten taxonoacutemica actual de las Bromeliaceae es la que se muestra en la Tabla 11
Subfamilia Geacutenero
Brocchinioideae Brocchinia
Lindmanioideae Connellia Lindmania
Hechtioideae Hechtia
Navioideae Brewcaria Cottendorfia Navia Sequencia Steyerbromelia
Pitcairnioideae Deuterocohnia Dyckia Encholirium Fosterella Pepinia Pitcairnia
Puyoideae Puya
Tillandsioideae
Alcantarea Catopsis Glomeropitcairnia Guzmania Mezobromelia
RacinaeaTillandsia Vriesea Werauhia
Bromelioideae
Acanthostachys Aechmea Ananas Androlepis Araeococcus Billbergia
Bromelia Canistropsis Canistrum Cryptanthus Deinacanthon Disteganthus
Edmundoa Eduandrea Fascicularia Fernseea Greigia Hohenbergia
Hohenbergiopsis Lymania Neoglaziovia Neoregelia Nidularium Ochagavia
Orthophytum Portea Pseudaechmea Pseudananas Quesnelia Ronnbergia
Ursulaea Wittrockia
Tabla 11 Subfamilias y geacuteneros de Bromeliaceae (Bromeliad Society International) Los geacuteneros incluidos en
esta subfamilia se encontraban originalmente dentro de las Pitcairnioideae
Las Bromeliaceae poseen un rango de haacutebitat muy amplio desde desiertos caacutelidos y
secos hasta bosques lluviosos y friacuteas regiones montantildeosas mostrando un rango de altitud
que va desde el nivel del mar hasta los 4700 metros La mayoriacutea se distribuye en
Sudameacuterica con el nuacutemero maacutes grande de especies halladas en Brasil se extienden desde
Chile y Argentina a traveacutes de Centroameacuterica y el Caribe alcanzando el liacutemite norte en los
alrededores de Virginia en el sudeste de los EEUU (Smith 1934) Una uacutenica especie
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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(Pitcairnia feliciana) ha sido encontrada en el oeste de Aacutefrica (Figura 11) A la Argentina
llegan 13 geacuteneros y alrededor de 120 especies (Flora del Conosur Cataacutelogo de las Plantas
Vasculares)
Figura 11 Distribucioacuten mundial de especies de Bromeliaceae lthttpcommonswikimediaorgwikiImage
WorldBromeliadDistributionjpggt
121 Importancia Usos
En la actualidad los usos ornamentales y comestibles son los maacutes difundidos dentro
de las Bromeliaceae siendo el ananaacute o pintildea (Ananas comosus L) el fruto maacutes ampliamente
consumido en el mundo El primer registro que se tiene data de 1493 cuando Cristobal
Coloacuten vio a los indiacutegenas cultivar la especie en las Antillas y a su regreso a Espantildea la
introduce en el ldquoViejo Mundordquo (Bromeliad Society International)
En Latinoameacuterica diversas especies de Bromeliaceae han sido de gran importancia
para el hombre desde tiempos ancestrales En las distintas regiones se les ha dado un uso
particular que puede ser enmarcado en las siguientes categoriacuteas ceremonial comestible
textil medicinal ornamental y combustible entre otros Un estudio reciente (Hornung-Leoni
2011) que incluye 78 especies de Bromeliaceae en 19 paiacuteses latinoamericanos demostroacute
que 33 de ellas son empleadas en Meacutexico Venezuela Peruacute y Bolivia para rituales y
ceremonias de las cuales el 73 corresponde a especies del geacutenero Tillandsia El uso
ornamental involucra 12 especies principalmente de los geacuteneros Tillandsia Aechmea y
Guzmania en Argentina Chile Venezuela y Meacutexico mientras que 2 especies de Puya son
usadas en Peruacute y Ecuador como combustibles Los usos comestibles medicinales y para la
extraccioacuten de fibras han sido registrados para 24 19 y 17 especies respectivamente a lo
largo de numerosos paiacuteses y seraacuten detallados a continuacioacuten
1211 Uso comestible
Ademaacutes de Ananas comosus Bromelia pinguin es una de las especies maacutes usadas
como comestible Se consumen sus frutos raiacuteces semillas y flores tanto directamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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como para la preparacioacuten de dulces refrescos postres y guisos Su uso estaacute extendido
desde Meacutexico y las Antillas hasta el norte de Sudameacuterica y Ecuador Hojas de especies de
Tillandsia y Puya son empleadas para envolver bollos tipo ldquotamalesrdquo en Venezuela
Colombia y norte de los Andes Sudamericanos asiacute como tambieacuten se consumen brotes de
otras especies de Tillandsia en Bolivia y Argentina Los frutos de B balansae se comen
asados en algunas zonas de Brasil (Hornung-Leoni 2011)
Distintos grupos eacutetnicos del Chaco paraguayo y argentino consumen frutos maduros
cocidos o crudos de Bromelia serra y B balansae siendo sus semillas tambieacuten empleadas
a partir de las cuales se obtiene un polvo que se consume directamente o bien se utiliza
para hacer sopa Las partes vegetativas de B serra B hieronymi y Dickya ferox tambieacuten
son consumidas Si bien las partes maacutes usadas son las vainas foliares joacutevenes y el eje
vertical de las rosetas basales (Suaacuterez amp Montani 2010) el consumo de los brotes joacutevenes
(ejes laterales) de B hieronymi es una nueva modalidad entre los nintildeos (Arenas 2004)
1212 Obtencioacuten de fibras
El empleo de las Bromeliaceae para la extraccioacuten de fibras es de gran importancia
para el desarrollo de numerosas comunidades a lo largo del continente Las fibras son
destinadas a la fabricacioacuten de varios productos tanto para uso propio de las comunidades
como para su comercializacioacuten2 Hamacas bolsas de mano redes para la pesca puntas de
flecha sillas de montar cesteriacutea sacos cordeleriacutea para adornar vestimentas sombreros
zapatos sandalias y cinturones objetos para uso ceremonial son algunos de los ejemplos
Diversas especies del geacutenero Aechmea son usadas por distintos indiacutegenas en
Meacutexico y Ecuador principalmente A magdalenae a partir de la cual se obtiene una fibra
(conocida como ldquoixtlerdquo o ldquofibra de pitardquo) de gran resistencia usada en la fabricacioacuten de
elementos para la pesca La fibra obtenida de varias especies de Ananas spp
caracterizada por su flexibilidad es empleada para tejidos hamacas y cestas en Venezuela
Tillandsia usneoides es utilizada para rellenar colchones y como material de empaque en
Ecuador En Chile de las hojas de Puya chilensis se obtiene una fibra resistente empleada
para las redes de pesca Fibras duras son extraidas de B pinguin en Meacutexico y Nicaragua
(Hornung-Leoni 2011)
Las fibras de Bromelia hieronymi Mez (conocida como chaacuteguar) son utilizadas por
indiacutegenas del Gran Chaco En cambio el uso textil de B balansae Mez y B serra Griseb no
es certero ya que aunque en la bibliografiacutea consta el empleo de sus fibras por parte de
vilelas y tobas orientales no ha sido registrado en trabajos de campo recientes La fibra maacutes
apreciada por distintas etnias chaquentildeas es la obtenida a partir de Deinacanthon
urbanianum Mez que debido a su durabilidad y resistencia es usada para la elaboracioacuten de
2 Productos elaborados con fibras de ldquobromeliaacuteceas textilesrdquo por la comunidad Wichi (Sastre et al 2013)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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objetos para la pesca Sin embargo su escasez ha llevado a su reemplazo por B hieronymi
Nativos de filiacioacuten guaraniacute en el Paraguay oriental asiacute como los makaacute asentados en las
inmediaciones del riacuteo Paraguay usan como textil las fibras obtenidas de Pseudananas
sagenarius mientras que su uso por parte de nativos del Chaco consta soacutelo en la literatura
(Arenas 1997)
A pesar del uso difundido de las ldquoBromeliaacuteceas textilesrdquo entre numerosas
comunidades son pocas las empleadas como materia prima para la industria En Argentina
a fines del siglo XIX se iniciaron estudios teacutecnicos a fin de evaluar el uso de las
Bromeliaceae con fines textiles Industrias extractoras de fibras fueron instalaacutendose en
Corrientes Chaco Formosa Santiago del Estero y Tucumaacuten pero tuvieron corta duracioacuten
Sin embargo con la Segunda Guerra Mundial y el consecuente desabastecimiento de yute
caacutentildeamo y lino textil se reiniciaron las tareas exploratorias impulsadas por el Estado (Res Nordm
949-46 del Ministerio de Agricultura) llegaacutendose a hacer estudios de cultivos en campos de
experimentacioacuten en distintas provincias del norte Como resultado de tales estudios se
concluyoacute que las Bromeliaceae factibles de uso textil en orden creciente de importancia
industrial son Pseudananas sagenarius Bromelia hieronymi B balansae B serra
Deinacanthon urbanianum Dyckia ferox y Aechmea distichantha adjudicaacutendoles potencial
para la elaboracioacuten de telas tipo batista cuerdas para pescar y telas de arpillera entre otros
Las dificultades con el mercado asiacute como las deficiencias teacutecnicas en la explotacioacuten y la
maquinaria de extraccioacuten no posibilitaron el desarrollo de esta industria en Argentina
(Arenas 1997) En Brasil sin embargo existen pequentildeas industrias textiles extractoras de
fibras de B laciniosa y Neoglaziovia variegata (Hornung-Leoni 2011)
1213 Usos medicinales
Diversas especies del geacutenero Hechtia tienen importancia medicinal en Meacutexico H
glomerata ha sido empleada contra el catarro y la bronquitis las hojas masticadas o
hervidas de H melanocarpa se usan para el tratamiento de la diabetes mientras que el teacute
obtenido de hojas de H podantha es usado como diureacutetico Puya gummifera es empleada
en Ecuador para dolencias de rintildeoacuten mientras que en Chile empleaban como emoliente y
astringente las secreciones de sus inflorescencias producto de las picaduras de las larvas
de mariposas Tambieacuten en Chile es usada P berteroniana como emoliente e infusiones de
tallos y hojas de P chilensis se emplean como antiinflamatorio y para aliviar fiebre y
diarreas Las raiacuteces de Pitcairnia pungens son utilizadas como diureacutetico en Ecuador
(Hornung-Leoni 2011) En Argentina personas pertenecientes a comunidades Wichiacute de
Salta han sentildealado que diversas especies de Tillandsia pueden ser utilizadas para aliviar el
dolor causado por dislocaciones o fracturas (Suaacuterez amp Montani 2010) Tillandsia dasyliriifolia
y T elongata han sido empleadas contra el catarro y la bronquitis en Meacutexico en tanto que T
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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aeranthos (el ldquoclavel del airerdquo) es usada como antiespasmoacutedico y para el tratamiento de
afecciones oculares en Sudameacuterica (Hornung-Leoni 2011)
Dentro de las especies del geacutenero Bromelia B pinguin es conocida por sus
propiedades medicinales en Centroameacuterica Cuba y en algunas regiones de Meacutexico Su fruto
es usado como antihelmiacutentico pero tambieacuten como diureacutetico y antirreumaacutetico Las hojas de
B karatas son utilizadas en algunas regiones de Meacutexico como antiinflamatorio (Hornung-
Leoni 2011) En Brasil los frutos de B balansae son usados por la medicina popular como
jarabe para la tos (Coelho 2010) y el jugo de los frutos de B fastuosa (gravataacute) para el
tratamiento de la bronquitis y el asma (Guimaraes-Ferreira et al 2007)
El uso medicinal de Ananas comosus trasciende a las comunidades latinoamericanas
asentadas en las regiones en las cuales es autoacutectona Desde los tiempos de la colonizacioacuten
la pulpa se empleaba por las comunidades aboriacutegenes para tratar parasitosis intestinales
accioacuten que fue sustentada por los meacutedicos europeos de la eacutepoca (Patintildeo 2002) Tambieacuten
ha sido utilizada como coadyuvante de la digestioacuten (Hornung-Leoni 2011)
El extracto obtenido a partir de A comosus conocido como bromelina o bromelaiacutena
es comercializado desde mediados de la deacutecada del acute50 y desde entonces se han publicado
numerosos trabajos cientiacuteficos en relacioacuten a sus propiedades terapeacuteuticas antiinflamatoria
antitromboacutetica fibrinoliacutetica antitumoral antimetastaacutesica inmunomodulador promotora de la
absorcioacuten de antibioacuteticos debridante de heridas y cicatrizante (Maurer 2001) La bromelina
ha sido usada como agente antiinflamatorio y antiedematoso en casos de artritis lesiones
deportivas traumatismos edema posquiruacutergico quemaduras y como complementario a la
quimioterapia (Bhui 2012) Actualmente la bromelina es un producto medicinal popular para
el tratamiento de la inflamacioacuten y trastornos digestivos (Hornung-Leoni 2011) Es de libre
venta en farmacias y tiendas naturistas principalmente de Estados Unidos de Ameacuterica y
paiacuteses de Europa como un producto meacutedico sin licencia (Brien et al 2004) La
Administracioacuten de Drogas y Alimentos de EEUU (Food and Drug Administration FDA)
considera a la bromelina dentro del subcapiacutetulo correspondiente a los alimentos para
consumo humano y en tal caraacutecter es categorizada como GRAS (Generally Recognized as
Safe) No hace referencia a su utilizacioacuten como medicamento (FDA 2012) Por su parte la
Agencia Europea de Medicinas (European Medicines Agency) ha aprobado muy
recientemente un producto conteniendo bromelina para su uso como debridante de las
escaras producidas como consecuencia de quemaduras (European Medicines Agency
2012)
Si bien los extractos obtenidos tanto a partir de tallos como de frutos de A comosus
son una mezcla compleja de fosfatasas glucosidasas peroxidasas celulasas inhibidores
glicoproteiacutenas y carbohidratos (todos poco caracterizados) los componentes responsables
de sus acciones antihelmiacutentica antiedematosa antiinflamatoria fibrinoliacutetica antitromboacutetica
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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antitumoral debridante de heridas asiacute como aceleradora de la cicatrizacioacuten de heridas
parecieran ser las proteasas cisteiacutenicas presentes en grandes cantidades (Maurer 2001
Salas et al 2008)
13 Tipos de Proteasas Distribucioacuten y Rol en los Vegetales
131 Proteasas Tipos y sistemas de clasificacioacuten
Se conoce como proteasas a las enzimas que catalizan la degradacioacuten de las
proteiacutenas (proteoacutelisis) mediante la adicioacuten de una moleacutecula de agua en los enlaces
peptiacutedicos Aunque el Comiteacute de Nomenclatura de la Unioacuten Internacional de Bioquiacutemica y
Biologiacutea Molecular3 (NC-IUBMB) ha recomendado usar el teacutermino peptidasa para referirse a
estas enzimas en trabajos recientes se siguen utilizando alternativamente las
denominaciones proteasa enzima proteoliacutetica o proteinasa por lo que en la presente tesis
usaremos estos teacuterminos indistintamente
Un sistema de nomenclatura y clasificacioacuten de proteasas es fundamental para el
manejo de la informacioacuten A pesar de que existe una gran variedad de proteasas distribuidas
en los siete reinos (Archaea Bacteria Protozoa Fungi Planta Animalia y Virus) que
cumplen roles fisioloacutegicos muy distintos la existencia de caracteriacutesticas comunes permitioacute
establecer sistemas de clasificacioacuten Estos se basan en los mecanismos cataliacuteticos las
regiones de la cadena polipeptiacutedica sobre las que actuacutean las relaciones evolutivas y la
homologiacutea de sus secuencias
Antes del establecimiento de un organismo reconocido internacionalmente que fijara
pautas de clasificacioacuten y nomenclatura para las enzimas Hartley (1960) propuso clasificar
las proteasas teniendo en cuenta su mecanismo cataliacutetico Este criterio dio lugar a cuatro
clases o tipos cataliacuteticos de peptidasas seriacutenicas cisteiacutenicas aspaacuterticas y
metalopeptidasas La denominacioacuten hace referencia al grupo quiacutemico del sitio cataliacutetico
responsable de la actividad enzimaacutetica serina cisteiacutena aacutecido aspaacutertico e ioacuten metaacutelico
(frecuentemente Zn2+ Mn2+ Co2+) respectivamente Maacutes recientemente fueron incorporados
otros dos tipos las peptidasas glutaacutemicas (Kakudo et al 1992) y treoniacutenicas (Barrett et al
1998)
No obstante estas diferencias los seis tipos cataliacuteticos se pueden agrupar en dos
categoriacuteas las que forman complejos covalentes entre la enzima y el sustrato (peptidasas
seriacutenicas cisteiacutenicas y treoniacutenicas) donde el nucleoacutefilo del sitio cataliacutetico es parte de un
aminoaacutecido (serina cisteiacutena o treonina respectivamente) y las que no forman complejos
enzima-sustrato covalentes (peptidasas aspaacuterticas glutaacutemicas y metalopeptidasas) siendo
responsable del ataque nucleofiacutelico una moleacutecula de agua activada
3 lthttpwwwchemqmulacukiubmbgt
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1311 Sistema EC de clasificacioacuten de enzimas
En 1961 quedoacute establecido el sistema de clasificacioacuten y nomenclatura de enzimas de
la Comisioacuten Internacional de Enzimas (Enzyme Commission EC) actualmente NC-IUBMB
Basaacutendose en el tipo de reaccioacuten que catalizan la EC agrupoacute las enzimas en seis clases y
les asignoacute un coacutedigo numeacuterico Oxidorreductasas (1) Transferasas (2) Hidrolasas (3)
Liasas (4) Isomerasas (5) y Ligasas (6)
Dentro de la clase 3 (hidrolasas) se agrupan las enzimas que catalizan la reaccioacuten de
escisioacuten de un enlace mediante la adicioacuten de una moleacutecula de agua Los productos de esta
reaccioacuten son dos moleacuteculas a una de las cuales se ha unido el hidroacutegeno y a la otra el
hidroxilo provenientes ambos de la hidroacutelisis del agua
R1-R2 + H2O R1-OH + R2-H
Hidrolasa
Las enzimas de la clase 3 se subagrupan en funcioacuten del enlace quiacutemico sobre el que
actuacutean Asiacute si el enlace entre R1 y R2 es el grupo amida de la unioacuten peptiacutedica las hidrolasas
que catalizan tal reaccioacuten son peptidasas y pertenecen a la subclase 34 (EC 34) la que a
su vez se divide en catorce sub-subclases como se muestra en la Tabla 12
Sub-subclases Descripcioacuten Cantidad
Exopeptidasas
EC 3411 Aminopeptidasas 26 76
EC 3413 Dipeptidasas 11 32
EC 3414 Dindash y trindashpeptidil-peptidasas 8 23
EC 3415 Peptidil-dipeptidasas 4 12
EC 3416 Carboxipeptidasas Tipo Serina 4 12
EC 3417 Metalocarboxipeptidasas 20 58
EC 3418 Carboxipeptidasas Tipo Cisteiacutena 1 03
EC 3419 Omega peptidasas 11 32
Endopeptidasas
EC 3421 Endopeptidasas Seriacutenicas 98 285
EC 3422 Endopeptidasas Cisteiacutenicas 98 285
EC 3423 Endopeptidasas Aspaacuterticas 41 119
EC 3424 Metaloendopeptidasas 20 58
EC 3425 Endopeptidasas Treoniacutenicas 2 06
EC 3499 Endopeptidasas de mecanismo desconocido 0 0
Total 344 100
Tabla 12 Sub-subclases de peptidasas (34) seguacuten el sistema EC (Consultado 12112012)
Las peptidasas EC 3411 a EC 3419 son exopeptidasas mientras que las EC 3421
a EC 3425 y EC3499 son endopeptidasas Las exopeptidasas hidrolizan
secuencialmente uno o maacutes aminoaacutecidos desde los extremos carboxilo (carboxipeptidasas)
amino (aminopeptidasas) o extremos sustituidos ciclados o unidos por uniones
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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isopeptiacutedicas (omegapeptidasas) Las que atacan el N-terminal pueden liberar un uacutenico
residuo aminoaciacutedico (aminopeptidasas EC 3411) o un di- o tripeacuteptido (di- y tripeptidil-
peptidasas EC 3414) A su vez las que actuacutean sobre el C-terminal pueden liberar un uacutenico
amino aacutecido (carboxipeptidasas EC 3416-18) o un dipeacuteptido (peptidil-dipeptidasas EC
3415)
Las endopeptidasas hidrolizan las uniones peptiacutedicas internas de la proteiacutena y si
actuacutean sobre pequentildeos peacuteptidos se denominan geneacutericamente oligopeptidasas (Barrett
2001)
Como puede observarse la clasificacioacuten propuesta por Hartley quedoacute incorporada en
el sistema EC Las carboxipeptidasas se agrupan seguacuten el mecanismo cataliacutetico en
metalocarboxipeptidasas (EC 3417) seriacutencarboxipeptidasas (EC 3416) y
cisteiacutencarboxipeptidasas (EC 3418) mientras que las endopeptidasas se agrupan en
seriacutenicas (EC 3421) cisteiacutenicas (EC 3422) aspaacuterticas (EC 3423) treoniacutenicas (EC
3425) y metaloendopeptidasas (EC 3424)
1312 El sistema MEROPS de clasificacioacuten de peptidasas
Desde mediados del siglo XX a la actualidad la Biologiacutea Molecular (BM) ha aportado
conocimientos no soacutelo referentes a los mecanismos de accioacuten de las enzimas sino tambieacuten
a sus estructuras La posibilidad de conocer las secuencias de aminoaacutecidos de las
proteiacutenas asiacute como su conformacioacuten espacial permitioacute establecer nuevos criterios de
clasificacioacuten de las enzimas que a su vez a la luz del Dogma Central de la BM refleja las
relaciones evolutivas entre ellas
Asiacute Rawlings y Barrett (1993) haciendo uso del gran nuacutemero de secuencias
aminoaciacutedicas de las que disponiacutean dieron a conocer un nuevo sistema de clasificacioacuten de
peptidasas basado en las similitudes estructurales de las proteiacutenas Seguacuten el grado de
homologiacutea las peptidasas fueron agrupadas en familias y eacutestas a su vez en clanes Para
1996 este sistema habiacutea dado lugar a la base de datos MEROPS4 Los tres niveles de
clasificacioacuten se definen a continuacioacuten
Clan Es un conjunto de familias cuyas peptidasas tienen un origen evolutivo comuacuten
que si bien no llega a evidenciarse por comparacioacuten de sus secuencias de aminoaacutecidos siacute
por las similitudes de sus estructuras terciarias Se construye por comparacioacuten de las
estructuras terciarias y cuando no estaacuten disponibles se comparan los ordenamientos de
aminoaacutecidos cataliacuteticos en la cadena polipeptiacutedica o las secuencias aminoaciacutedicas alrededor
de los aminoaacutecidos cataliacuteticos
Familia Se construye por comparacioacuten de la estructura primaria Estaacute constituida por
peptidasas cuyas secuencia de aminoaacutecidos que debe incluir la secuencia de la ldquounidad
4 lthttpmeropssangeracukgt
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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peptidasardquo (regioacuten de la proteiacutena responsable de la actividad cataliacutetica) presentan similitudes
estadiacutesticamente significativas
Peptidasa Cada proteiacutena con actividad peptidasa recibe un nombre y un
identificador (ID MEROPS) Se diferencian por su estructura funcioacuten bioloacutegica sustrato
mecanismo cataliacutetico y origen geneacutetico
Dentro de algunas familias se han detectado dos o maacutes grupos de peptidasas con
suficientes diferencias como para constituir una subfamilia Del mismo modo algunos clanes
han sido divididos en subclanes que contienen familias que evidencian una muy antigua
divergencia
El sistema MEROPS tambieacuten tuvo en cuenta la clasificacioacuten de Hartley ya que en la
asignacioacuten de los identificadores a las familias clanes y peptidasas se usaron letras que
hacen referencia al tipo cataliacutetico de las peptidasas que las integran S (seriacutenicas) C
(cisteiacutenicas) T (treoniacutenicas) A (aspaacuterticas) G (glutaacutemicas) M (metalopeptidasas) N
(asparagiacutenicas) y U (mecanismo desconocido)
La letra P es utilizada para identificar clanes que contienen familias de peptidasas de
maacutes de un tipo cataliacutetico El identificador de un clan se completa con una segunda letra
mayuacutescula asignada secuencialmente (por ejemplo clan CA) y el identificador para una
familia es completado con un nuacutemero (por ejemplo C1 la familia de la papaiacutena) El
identificador MEROPS para cada peptidasa individual comienza con el identificador de
familia y se completa con un nuacutemero decimal (por ejemplo C01005 para bromelaiacutena de
tallo) La versioacuten 97 de la base de datos actualizada al 1ordm de octubre de 2012 cuenta con
320834 secuencias de las cuales 113968 corresponden a peptidasas seriacutenicas 118637 a
metalopeptidasas 52745 a peptidasas cisteiacutenicas 14225 a peptidasas aspaacuterticas 11439 a
peptidasas treoniacutenicas 338 a peptidasas glutaacutemicas 3222 a peptidasas asparagiacutenicas
6256 a peptidasas de tipo cataliacutetico desconocido y 4 inclasificables La base contiene
ademaacutes 520 estructuras (Rawlings et al 2012)
132 Distribucioacuten de Proteasas en los Seres Vivos
En la Tabla 13 se consigna la distribucioacuten de las familias de proteasas en 8546
organismos de los distintos reinos Dentro del reino vegetal la mayoriacutea de las familias estaacuten
constituidas por peptidasas del tipo metaloproteasas (34101) seriacutenicas (22101) y
cisteiacutenicas (20101) Sin embargo el mayor nuacutemero de peptidasas registradas son las
seriacutenicas (29) seguidas por las aspaacuterticas (25) y las cisteiacutenicas (24) La mayoriacutea de las
proteasas cisteiacutenicas en plantas pertenecen a la familia de la papaiacutena (C1)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
13
Reino
Tipo de peptidasas Bacteria Archaea Protozoa Fungi Planta Animalia Virus
Aspaacuterticas 9 5 6 6 9 7 4
Cisteiacutenicas 27 11 20 16 20 22 30
Glutaacutemicas 2 1 - 1 - - 1
Metalopeptidasas 62 34 32 34 34 33 14
Seriacutenicas 25 18 20 16 22 25 18
Treoniacutenicas 1 1 1 1 1 1 -
Asparagiacutenicas 3 - - - - - 6
Distintos Tipos 20 13 15 13 14 18 25
Mecanismo Desconocido 7 4 2 1 1 3 2
Totales 156 87 96 88 101 109 100
Tabla 13 Distribucioacuten de familias de peptidasas de organismos de diferentes reinos en el sistema propuesto por MEROPS (httpmeropssangeracuk consultado 12112012)
133 Rol de las peptidasas en los vegetales
La proteoacutelisis es vital para las ceacutelulas Por un lado es necesaria para el recambio
proteico permitiendo que proteiacutenas dantildeadas mal plegadas o innecesarias sean eliminadas
a la vez que los aminoaacutecidos liberados sean utilizados para la siacutentesis de nuevas proteiacutenas
Por otro lado la degradacioacuten proteica en sitios especiacuteficos es una de las modificaciones
postraduccionales necesaria para que las proteiacutenas sean funcionalmente activas por
ejemplo para la activacioacuten de proenzimas o bien permitiendo el ensamblado de proteiacutenas y
su direccionamiento hacia distintos compartimientos celulares La degradacioacuten proteica
tambieacuten sirve como mecanismo de control celular si el sustrato son proteiacutenas regulatorias
La principal viacutea proteoliacutetica en las ceacutelulas eucariotas estaacute mediada por el sistema
ubiquitinaproteasoma la proteiacutena que debe ser degradada es marcada por unioacuten a la
ubiquitina facilitando la direccioacuten al complejo proteasomal efector de la hidroacutelisis
En las plantas el recambio proteico es considerado fundamental para el crecimiento
Ejemplos de ello son la degradacioacuten de proteiacutenas de reserva durante la germinacioacuten de las
semillas o la removilizacioacuten de proteiacutenas luego de la senescencia foliar con la relocalizacioacuten
de fuentes de N en los oacuterganos reproductivos Maacutes recientemente con la asociacioacuten
encontrada entre el sistema ubiquitinaproteasoma y la embriogeacutenesis la fotomorfogeacutenesis
los ritmos circadianos el desarrollo de flores y tricomas asiacute como la sentildealizacioacuten hormonal
la degradacioacuten selectiva de proteiacutenas ha tomado relevancia como mecanismo de regulacioacuten
de numerosos procesos de crecimiento y desarrollo en las plantas (Schaller 2004)
En Arabidopsis thaliana la primer planta en tener su genoma completamente
secuenciado se han encontrado maacutes de 600 genes de proteasas de todos los tipos
cataliacuteticos a excepcioacuten de las glutaacutemicas ademaacutes de 1300 genes asociados con el sistema
ubiquitina-proteasoma (Schaller 2004) Puesto que Arabidopsis es tomada como modelo
para el estudio fitobioloacutegico la falta de exclusividad del sistema proteasomal en la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
14
degradacioacuten proteica podriacutea ser extensible a otras especies vegetales El anaacutelisis en
alrededor de cien genomas ha demostrado que aproximadamente un 2 de todos los
productos geacutenicos son peptidasas evidenciaacutendose asiacute que se trata de uno de los grupos
funcionales de proteiacutenas maacutes grandes e importantes (Barrett et al 2004)
En el trabajo de revisioacuten y actualizacioacuten sobre el rol regulatorio de proteasas vegetales
Schaller (2004) cita referencias sobre proteasas (de todos los tipos cataliacuteticos a excepcioacuten
de las treoniacutenicas y las glutaacutemicas) claves para varios procesos bioloacutegicos de las plantas
destacaacutendose las funciones en la degradacioacuten proteica y movilizacioacuten de nitroacutegeno durante
la germinacioacuten de las semillas y la senescencia foliar el procesamiento de proteiacutenas de
reserva durante su acumulacioacuten en semillas diferentes eventos de la muerte celular
programada (iniciacioacuten regulacioacuten y autolisis) la resistencia a insectos y patoacutegenos la
digestioacuten de insectos en plantas carniacutevoras la sentildealizacioacuten por brasinoesteroides y en la
regulacioacuten de procesos de desarrollo y crecimiento tales como la diferenciacioacuten xilemaacutetica
la densidad de estomas y la formacioacuten lateral de raiacuteces del patroacuten embrionario y del
meristema apical entre otros
1331 Peptidasas cisteiacutenicas
Seguacuten el sistema MEROPS las peptidasas cisteiacutenicas estaacuten distribuidas en 76 familias
agrupadas en 13 clanes Dentro del reino Planta las proteasas cisteiacutenicas son una de las
maacutes conocidas por ser el tipo cataltico en que se centraron los primeros estudios sobre
proteasas vegetales En las plantas la mayoriacutea de las proteasas cisteiacutenicas pertenecen a
las familias de la papaiacutena (C1) y la legumaiacutena (C13) (Schaller 2004)
A nivel subcelular las proteasas cisteiacutenicas se localizan en vacuolas y en la pared
celular (Grudkowska amp Zagdańska 2004) sin embargo actividad tipo caspasa en plantas ha
sido detectada en el citosol pero no en vacuolas (Korthout et al 2000) En cuanto a su
distribucioacuten en la planta se han encontrado proteasas en praacutecticamente todos los oacuterganos
vegetales (Salas et al 2008)
Durante la maduracioacuten de las semillas las proteiacutenas de reserva son sintetizadas como
precursores que deben ser procesados para su ensamblado y acumulacioacuten (Jung et al
1998) Ese procesamiento ha sido atribuido a proteasas tipo legumaiacutenas conocidas como
enzimas de procesamiento vacuolar (VPE) (Hara-Nishimura et al 1998 Kinoshita et
al1999) Por otro lado dentro de las proteasas responsables de la degradacioacuten y
movilizacioacuten de proteiacutenas de reserva las cisteiacutenicas son las maacutes abundantes e incluye
ademaacutes de las legumaiacutenas a las del tipo papaiacutena (Grudkowska amp Zagdańska 2004)
Una caracteriacutestica de las proteasas cisteiacutenicas es que responden a estiacutemulos internos y
externos Ante el estreacutes abioacutetico la sequiacutea y el shock teacutermico algunas proteiacutenas son
dantildeadas o innecesarias hacieacutendose imprescindible la siacutentesis de nuevas proteiacutenas Este
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
15
recambio proteico conlleva un considerable aumento en la siacutentesis de proteasas cisteiacutenicas
hecho demostrado en las hojas de trigo ante el deacuteficit de agua Por otra parte los
aminoaacutecidos liberados actuacutean regulando la presioacuten osmoacutetica celular La induccioacuten de
proteasas cisteiacutenicas principalmente tipo papaiacutena y tipo caspasas acompantildea la muerte
celular programada la cual estaacute asociada con procesos de desarrollo y diferenciacioacuten
vegetal tales como la xilogeacutenesis y la senescencia asiacute como tambieacuten con las respuestas de
defensa (Grudkowska amp Zagdańska 2004)
Algunas proteiacutenas vegetales han sido clasificadas como proteiacutenas ldquoprescindiblesrdquo
puesto que algunas especies pueden sobrevivir sin ellas mientras que otras especies o
variedades dentro de la misma especie las producen en elevadas cantidades siendo poco
claro su rol fisioloacutegico en la planta Dentro de esta categoriacutea entran las proteasas presentes
en cantidades extremadamente altas principalmente en laacutetex y frutos caracteriacutesticas de
ciertas familias (Caricaceae Bromeliaceae y Moraceae) dado que si bien podriacutean
desempentildearse en la defensa contra la invasioacuten de patoacutegenos no se explica la variedad de
contenido proteoliacutetico entre especies altamente relacionadas (Adams amp Rinne 1981) En
estos casos las actividades proteoliacuteticas detectadas son al menos dos oacuterdenes de magnitud
mayores que las actividades encontradas en tejidos comparables de la mayoriacutea de otras
plantas (Glazer amp Smith 1971) Puesto que la siacutentesis acumulacioacuten y utilizacioacuten de las
proteiacutenas ldquoprescindiblesrdquo ocurre en determinados periacuteodos que podriacutean estar relacionados
con estadios del desarrollo de la planta se les ha asignado un posible rol como metabolitos
secundarios (Adams amp Rinne 1981) La sorprendente similitud bioquiacutemica (elevada
estabilidad amplia especificidad y baja tendencia autoliacutetica) de las proteasas cisteiacutenicas
muy abundantes no indicariacutea un ancestro comuacuten sino maacutes bien una convergencia evolutiva
como resultado de una funcioacuten defensiva comuacuten (Boller 1986)
La actividad de proteasas cisteiacutenicas frente a diferentes estiacutemulos puede ser elevada
al 90 de la actividad proteoliacutetica total (Grudkowska amp Zagdańska 2004) En el caso de
Carica papaya L se ha demostrado que la produccioacuten de heridas repetidas en los frutos
aumentan la cantidad de proteiacutenas y la actividad proteoliacutetica en el laacutetex de la papaya lo cual
estaacute acorde con el posible rol de estas proteasas en la defensa de la planta (Azarkan et al
2006)
El papel desempentildeado por las proteasas en las respuestas de defensa en plantas
desencadenadas por patoacutegenos y pestes estaacute comenzando a aclararse No soacutelo
intervendriacutean en la ejecucioacuten directa del patoacutegeno como es el caso de la papaiacutena y otras
proteasas tipo papaiacutena sino tambieacuten en la percepcioacuten por parte del organismo defensor y en
las cascadas de sentildealizacioacuten involucradas con las respuestas de defensa (van der Hoorn amp
Jones 2004)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
16
14 Enzimas Proteoliacuteticas de Bromeliaceae
Varias especies de la familia Bromeliaceae se caracterizan por poseer endopeptidasas
en cantidades superiores a las fisioloacutegicamente necesarias (Barrett 2001) A pesar del
elevado nuacutemero de integrantes de la familia Bromeliaceae es muy reducido el nuacutemero de
geacuteneros todos pertenecientes a la subfamilia Bromelioideae que han sido estudiados hasta
la fecha en busca de enzimas proteoliacuteticas (Ananas Bromelia Hohenbergia y
Pseudananas) siendo Ananas comosus L (el ldquoananaacuterdquo o ldquopintildeardquo) la especie maacutes estudiada a
partir de cuyos tallos se obtiene la bromelina (Heinicke amp Gortner 1957) Otras proteasas de
Bromeliaceae que han sido aisladas y caracterizadas incluyen a la hemisfericina a partir de
frutos de Bromelia hemispherica (Agundis et al 1977 Ochoa et al 1987) pinguinina
obtenida de frutos de Bromelia pinguin (Toro-Goyco et al 1980 Abreu Payrol et al 2008)
karatasina aislada de frutos de Bromelia plumieri (Montes et al 1990) macrodontaiacutena I y II
de frutos inmaduros de Pseudananas macrodontes (Morr) Harms (Brullo et al 1994
Natalucci et al 1996 Loacutepez et al 2000 y 2001 Brullo 2003) balansaiacutena I de frutos
inmaduros de Bromelia balansae Mez (Pardo et al 2000) hieronymaina I II y III aisladas de
frutos inmaduros de Bromelia hieronymi Mez (Bruno et al 2003 2006 2008) fastuosaiacutena
extraiacuteda de frutos inmaduros de Bromelia fastuosa (Cabral et al 2006) y penduliflorain I
obtenida a partir de frutos de Hohenbergia penduliflora (Peacuterez et al 2010) Tambieacuten se han
aislado proteasas de frutos de otras especies de Bromelia B serra (Caffini et al 1988) B
laciniosa (Buttazzoni et al 1984 Priolo et al 1986) B palmeris y B sylvestris (Cruz et al
1974 Hernaacutendez Arana et al 1983)
Dado que el presente trabajo de tesis doctoral estaacute centrado en el estudio de posibles
aplicaciones farmacoloacutegicas de las proteasas presentes en frutos de Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes en comparacioacuten con la bromelina a continuacioacuten se
brinda un resumen de las principales caracteriacutesticas bioquiacutemicas de las proteasas aisladas a
partir de esos materiales
141 Endopeptidasas del ananaacute
Las endopeptidasas del ananaacute son de tipo cisteiacutenicas y pertenecen a la superfamilia de
la papaiacutena (C01) Conocidas en su conjunto como ldquobromelinardquo teacutermino que se ha
reemplazado en los uacuteltimos antildeos por ldquobromelaiacutenardquo En el presente trabajo se utilizaraacute
indistintamente cualquiera de los dos teacuterminos Rowan et al (1990) denominan ldquobromelaiacutena
de tallordquo a la principal endopeptidasa del tallo de ananaacute y ldquobromelaiacutena de frutordquo a la principal
endopeptidasa de fruto Adicionalmente dos endopeptidasas menores (ananaiacutena y
comosaiacutena) fueron separadas del tallo de ananaacute (Rowan et al 1988 1990) Actualmente y
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
17
en base a estudios geneacuteticos se considera que existen dos tipos de bromelinas de fruto
denominas ldquom-tipo 1rdquo y ldquom-tipo 2rdquo (Rawlings et al 2008)
1411 Bromelina de tallo
La bromelina de tallo (EC 342232) es la proteasa predominante (casi el 90) en los
extractos de tallos de Ananas comosus y se trata de una uacutenica cadena polipeptiacutedica
glicosilada de 245 kDa (Harrach et al 1995) con un punto isoeleacutectrico (pI) de 955
(Murachi 1970) conteniendo siete residuos Cys (Napper et al 1994 Harrach et al 1995) y
tres puentes disulfuro La secuencia aminoaciacutedica completa ha sido deducida por Ritonja et
al (1989) siendo su masa molecular de 22831 Da Para expresar su maacutexima actividad la
enzima requiere la presencia de agentes reductores tales como cisteiacutena El pH oacuteptimo tanto
con sustratos sinteacuteticos como proteicos es amplio (Rowan amp Buttle 1994) A pesar de su
elevada actividad sobre distintos sustratos proteicos actuacutea eficientemente sobre sustratos
sinteacuteticos que contengan uniones Arg-Arg (Rowan et al 1988 Napper et al 1994)
Tambieacuten se ha comunicado una cierta preferencia de la enzima por aminoaacutecidos polares en
las posiciones P1 y P1acute5 (Napper et al 1994) Una caracteriacutestica distintiva de esta proteasa
es su relativamente deacutebil inhibicioacuten por E-64 y la carencia de inhibicioacuten por cistatina de pollo
lo que la diferencia de la mayoriacutea de las peptidasas de la familia C1 (Rowan et al 1990)
1412 Ananaiacutena
Rowan et al (1988) lograron purificar una enzima distinta a la bromelina de tallo a la
que denominaron ananaiacutena (EC 342231) y que representa el 5 de las proteiacutenas totales
del extracto de tallo de ananaacute A diferencia de la bromelina de tallo la ananaiacutena muestra
baja preferencia por sustratos sinteacuteticos que contengan Arg-Arg y alta actividad frente a Z-
Phe-Arg-NHMec y a Bz-Phe-Val-Arg-NHMec Ananaiacutena muestra mayor preferencia por
aminoaacutecidos polares en la posicioacuten P1acute mientras que el requerimiento para el sitio P1 es
mucho menos especiacutefico (Napper et al 1994) en tanto que en el sitio P2 manifiesta
preferencia por una cadena lateral hidrofoacutebica (Rowan et al 1990) El pH oacuteptimo tanto con
sustratos sinteacuteticos como proteicos es cercano a la neutralidad (Rowan amp Buttle 1994)
Ananaiacutena no es glicosilada estaacute formada por una cadena proteica simple de 235 kDa
(Rowan et al 1988 Napper et al 1994 Harrach et al 1995) y su pI es gt 10 (Rowan et al
1988 Harrach et al 1995) Tambieacuten contiene siete residuos Cys (Napper et al 1994) La
secuencia primaria de ananaiacutena ha sido determinada comprobaacutendose que incluye un
inserto entre los residuos 170 y 174 que no estaacute presente en bromelina de tallo ni en
5 En el modelo ideado por Schechter y Berger (1967) para describir la especificidad de corte de las peptidasas
los residuos de aminoaacutecido del sustrato (P) se unen a subsitios del sitio activo de la enzima (S) Estos residuos se numeran a partir del enlace a ser clivado hacia el extremo N-terminal como P1 P2 P3 etc en tanto que los que se encuentran hacia el C-terminal se denominan P1 P2 P3 etc Los subsitios de la proteasa actuacutean acomodando los residuos del sustrato y se numeran como S1 S2 S3 y S1 S2 S3 respectivamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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papaiacutena y una serie de aminoaacutecidos hidrofoacutebicos adyacentes a la His-157 (Lee et al 1997)
El comportamiento de la enzima frente a los inhibidores es similar al de la papaiacutena ya que
es eficientemente inhibida tanto por cistatina de pollo como por E-64 (Rowan et al 1988)
1413 Comosaiacutena
Comosaiacutena es la endopeptidasa menos abundante del extracto de tallo de ananaacute y
representa menos del 1 de las proteiacutenas totales Se trata de una glicoproteiacutena de 245 kDa
y pI gt 10 conteniendo siete residuos Cys y tiene una composicioacuten similar en carbohidratos a
la bromelina de tallo pero es marcadamente diferente en su composicioacuten aminoaciacutedica
(Napper et al 1994) Tiene actividad sobre Z-Arg-Arg-NHMec (Rowan et al 1990) muestra
preferencia por residuos polares tanto en el sitio P1 como P1acute y es inhibida por E-64
(Napper et al 1994)
1414 Bromelina de fruto
La preparacioacuten denominada ldquobromelina de frutordquo (EC 342233) constituye el 30-40
de las proteiacutenas totales del fruto representa casi el 90 del material proteoliacuteticamente
activo (Murachi 1970) y al igual que la bromelina de tallo tiene un amplio pH oacuteptimo frente a
sustratos proteicos y sinteacuteticos (Rowan amp Buttle 1994) Se trata de una cadena polipeptiacutedica
simple de aproximadamente 25 kDa (Rowan et al 1990) cuyo pI es 46 y parece no
tratarse de una glicoproteiacutena (Ota et al 1985) La secuencia N-terminal es ideacutentica a la de
bromelina de tallo (Yamada et al 1976) pero es inmunoloacutegicamente distinta de eacutesta y de
ananaiacutena (Rowan et al 1990)Tiene preferencia por el sustrato sinteacutetico Bz-Phe-Val-Arg-
NHMec y no por Z-Arg-Arg-NHMec lo que la diferencia de la bromelina de tallo (Rowan et
al 1990)
142 Balansaiacutena
Utilizando frutos semimaduros de Bromelia balansae Mez Natalucci et al (1988)
obtienen una preparacioacuten proteoliacutetica activa en un rango de pH amplio (60ndash95) que se
resuelve en tres fracciones proteoliacuteticamente activas por cromatografiacutea de intercambio
ioacutenico Posteriormente Pardo et al (2000) estudiaron las proteasas presentes en frutos en
distintos estadios de maduracioacuten determinaacutendose un aumento en el nuacutemero de proteiacutenas
con diferente pI y un incremento en el contenido de proteiacutenas totales y de azuacutecares a
medida que avanza el grado de madurez La actividad caseinoliacutetica y la actividad especiacutefica
fueron mayores en los estadios de menor madurez Mediante purificacioacuten parcial por
precipitacioacuten etanoacutelica lograron retener el 92 de la actividad enzimaacutetica y el 83 de las
proteiacutenas iniciales eliminaacutendose el 45 de los azuacutecares contenidos en el extracto crudo
Dicha preparacioacuten mostroacute alta estabilidad teacutermica conservaacutendose un 80 de actividad
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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proteoliacutetica luego de ser incubada durante 2 h a 45 ordmC Una banda activa de pI 55
(balansaiacutena I) se encontroacute en cantidades apreciables durante todo el proceso de
maduracioacuten mientras que otra banda activa de pI 87 (balansaiacutena II) soacutelo pudo encontrarse
en cantidades apreciables en frutos maduros trataacutendose en ambos casos de
cisteiacutenendopeptidasas
El peso molecular de Balansaiacutena I determinado por espectrometriacutea de masas (MALDI-
TOF) fue de 23192 Da y por electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-
PAGE) fue 244 kDa su pH oacuteptimo frente a caseiacutena fue 87 y conservoacute maacutes del 80 de
actividad en el rango de pH 58 a 100 Balansaiacutena I mostroacute preferencia por los derivados
Ala y Gln de N-α-CBZ-p-Nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos seguido por los de Gly Tyr y Leu
La secuencia N-terminal muestra gran similitud con las proteasas del ananaacute (Pardo et al
2000)
143 Hieronymaiacutenas
A partir de frutos inmaduros de Bromelia hieronymi Mez Bruno et al (2002) obtienen
extractos parcialmente purificados por precipitacioacuten acetoacutenica (PAR) y etanoacutelica (PER)
conteniendo alta cantidad de proteiacutenas (91 en el PAR y 79 en el PER) y de actividad
caseinoliacutetica (90 en el PAR y 83 en el PER) respecto al extracto crudo de partida
mientras se eliminan la mayor parte de azuacutecares y fenoles Las enzimas presentes
resultaron ser cisteiacutenendopeptidasas Los preparados conservaron maacutes del 90 de la
actividad original cuando fueron preincubados a 37 ordmC y 55 ordmC durante 2 h y mostraron
actividad en un amplio rango de pH alcanzando el 80 de la actividad maacutexima entre los pH
7 y 10 Mediante isoelectroenfoque (IEF) se logran separar 6 bandas de pI 59 64 76 83
y gt 93
1431 Hieronymaiacutena I
Desde frutos inmaduros de B hieronymi Bruno et al (2003) logran aislar una fraccioacuten
a la que denominan ldquohieronymaiacutena Irdquo (pI gt93) cuya homogeneidad fue confirmada por
MALDI-TOF donde mostroacute una masa molecular de 24066 Da por SDS-PAGE mostrando
una banda de 25 kDa y por IEF La enzima de tipo cisteiacutenica presentoacute una actividad
caseinoliacutetica maacutexima en el rango de pH 85-95 y fue completamente inhibida por E-64 y
aacutecido iodoaceacutetico mientras que se incrementoacute por la adicioacuten de cisteiacutena 20 mM
1432 Hieronymaiacutena II
A partir del mismo material Bruno et al (2006) purifican una segunda proteasa
cisteiacutenica (hieronymaiacutena II) cuya homogeneidad fue confirmada por MALDI-TOF-TOF
mostrando un peso molecular de 23411 Da y por SDS-PAGE con un peso molecular de 25
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
20
kDa aunque por IEF se observaron dos isoformas de pI 76 y 83 La actividad caseinoliacutetica
maacutexima fue detectada en el rango de pH entre pH 75-90
1433 Hieronymaiacutena III
Una tercera endopeptidasa cisteiacutenica (hieronymaiacutena III) fue purificada desde frutos
inmaduros de B hieronymi (Bruno et al 2008) cuyo pH oacuteptimo sobre caseiacutena se encuentra
en el rango de pH 86-93 La masa molecular determinada por SDS-PAGE fue de 25 kDa y
por espectrometriacutea de masas de 23713 Da Mediante IEF se observaron dos bandas de pI
59 y 64
La actividad de las tres endopeptidasas frente a sustratos sinteacuteticos mostroacute
diferencias significativas Soacutelo hieronymaiacutena I pudo degradar PFLNA (un sustrato comuacuten
para proteasas de ananaacute) Z-Phe-Arg-p-nitroanilida fue hidrolizado por hieronymaiacutena I y II
mientras que Z-Arg-Arg-p-nitroanilida el sustrato sobre el que tiene alta afinidad bromelina
de tallo y comosaiacutena fue degradado soacutelo por hieronymaiacutena III Ademaacutes las tres
endopeptidasas mostraron diferentes especificidades sobre 5 de los 13 sustratos N-α-CBZ-
p-nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos ensayados el derivado de Ala fue preferido por
hieronymaiacutena I y II seguido por Gly y Asp respectivamente mientras que hieronymaiacutena III
clivoacute preferentemente el derivado de Lys seguido por Asp (Bruno et al 2008)
La comparacioacuten de la secuencia de los N-terminales de hieronymaiacutena II y III mostroacute
gran similitud entre siacute (93) y con las de la bromelina de tallo bromelina de fruto
comosaiacutena ananaiacutena y balansaiacutena I (70-90) (Bruno et al 2006 2008) Mientras que la
secuencia del N-terminal de hieronymaiacutena I mostroacute una similitud del oacuterden del 70 con la de
hieronymaiacutena II y balansaiacutena I y del 60 con las de hieronymaiacutena III bromelina de tallo
ananaiacutena y comosaiacutena (Bruno et al 2003 2008)
144 Macrodontaiacutenas
A partir de frutos de Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [= Pseudananas
sagenarius (Arruda) Camargo] se obtuvo un extracto parcialmente purificado por
precipitacioacuten acetoacutenica denominado macrodontaiacutena el cual fue activo en un amplio rango
de pH obtenieacutendose valores superiores al 75 de la actividad maacutexima entre pH 70 y 105
(caseiacutena) Macrodontaiacutena fue estable en el rango de pH de maacutexima actividad asiacute como en
condiciones de elevada fuerza ioacutenica Por el contrario a diferencia de otras fitoproteasas
macrodontaiacutena no fue demasiado termoestable ya que la actividad residual se redujo al
50 luego de ser incubada durante 2 h a 45 ordmC (Brullo 2003)
Desde macrodontaiacutena se lograron purificar dos endopeptidasas macrodontaiacutena I con
una masa molecular de 25 kDa (SDS-PAGE) y pI de 61 y macrodontaiacutena II con masa
molecular de 27 kDa (SDS-PAGE) y pI de 59 Macrodontaiacutena I exhibioacute un rango de pH
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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oacuteptimo entre pH 61 y 85 en tanto que en macrodontaiacutena II fue maacutes estrecho (pH 75-85)
La actividad de ambas proteasas sobre N-α-CBZ-p-nitrofenil eacutesteres de aminoaacutecidos mostroacute
mayor afinidad hacia el derivado de Ala seguido por el de Gln y Tyr El E-64 inhibidor
especiacutefico del sitio activo de cisteiacutenproteinasas exhibioacute un comportamiento diferencial frente
a una y otra proteasa ya que produjo inhibicioacuten praacutecticamente total de macrodontaiacutena I
pero macrodontaiacutena II conservoacute un 15 de actividad residual hecho que podriacutea
relacionarse con una diferente geometriacutea del sitio activo como sugieren Ritonja et al (1989)
para bromelaiacutena de tallo (Brullo 2003) Macrodontaiacutena I y II fueron activas frente a Bz-Phe-
Val-Arg-NHMec pero no frente a Z-Arg-Arg-NHMec Las secuencias N-terminales de
macrodontaiacutena I y II revelan un 926 de identidad entre siacute un 80-90 con comosaiacutena
ananaiacutena bromelina de tallo y balansaiacutena I (Loacutepez et al 2001) un 70-80 con
hieronymaiacutena II y III y un 60 con hieronymaiacutena I (Bruno et al 2008)
Brullo (2003) determinoacute la estructura primaria de macrodontaiacutena I que demostroacute estar
compuesta por 213 aminoaacutecidos con un peso molecular calculado de 23486 Da valor
consistente con el dato aportado por la espectrometriacutea de masas (23459 Da) La
comparacioacuten con las secuencias completas de algunas fitoproteasas cisteiacutenicas reveloacute un
alto grado de identidad (alrededor del 70) con las de Ananas comosus con bromeliacutena de
fruto exhibioacute la mayor similitud (770 de identidad) seguida por ananaiacutena (con 719 de
identidad) y bromeliacutena de tallo (con 671 de identidad) Ademaacutes fue determinado el
caraacutecter no glicoproteacuteico de la enzima Al igual que en papaiacutena en macrodontaiacutena I existen
7 residuos Cys seis de los cuales participan de los tres puentes disulfuro presentes en la
estructura de esta clase de enzimas Dada la semejanza estructural entre varias proteasas
comparadas se concluye que macrodontaiacutena I integra el Clan CA de las proteasas
cisteiacutenicas que lidera papaiacutena (Brullo 2003)
15 Objetivos
Como se ha dicho el extracto acuoso obtenido del ananaacute [Ananas comosus (L)
Merr] conocido como bromelina ha mostrado tener tanto in vivo como in vitro efectos
antiedematoso antiinflamatorio antitumoral antitromboacutetico entre otras acciones
farmacoloacutegicas Pertenece al grupo de proteasas que son administradas oralmente en el
tratamiento sisteacutemico contra la inflamacioacuten las enfermedades relacionadas con la
coagulacioacuten sanguiacutenea y el caacutencer Su baja toxicidad permite que sea bien tolerada en
tratamientos largos Si bien su mecanismo de accioacuten auacuten no ha sido definitivamente
dilucidado sus efectos farmacoloacutegicos son adjudicados principalmente a sus
endopeptidasas cisteiacutenicas Actividades farmacoloacutegicas diversas han sido tambieacuten atribuidas
a fitoproteasas de tipo cisteiacutenicas pertenecientes a otras bromeliaacuteceas (Bromelia fastuosa)
asiacute como a especies pertenecientes a otras familias (Caricaceae Moraceae)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
22
Algunas especies de la familia Bromeliaceae entre ellas Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes se caracterizan por producir grandes cantidades de
endopeptidasas cisteiacutenicas Crecen en amplias regiones de nuestro paiacutes (NEA y NOA) asiacute
como en Brasil Bolivia Paraguay y Colombia Excepto el uso de frutos de B balansae para
tratar la tos en una regioacuten de Brasil no se conocen usos medicinales para estas tres
especies A partir de sus frutos se han aislado y caracterizado en el LIProVe varias
proteasas de tipo cisteiacutenicas que sin embargo no han sido objeto de estudios
farmacoloacutegicos hasta este momento
Es propoacutesito del presente trabajo aportar al conocimiento en relacioacuten a los posibles
usos medicinales de especies de bromeliaacuteceas autoacutectonas de nuestro paiacutes no estudiadas
auacuten para dichos fines Bajo la suposicioacuten que las proteasas de Bromelia hieronymi B
balansae y Pseudananas macrodontes por pertenecer al mismo tipo cataliacutetico y a la misma
subfamilia vegetal podriacutean mostrar actividades bioloacutegicas similares a las proteasas de
Ananas comosus nos planteamos como objetivo general de la presente tesis
La buacutesqueda de posibles efectos farmacoloacutegicos de extractos ricos en
cisteiacutenendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi B balansae
y Pseudananas macrodontes y su comparacioacuten con bromelina
Y como objetivos especiacuteficos
Evaluar el efecto antiinflamatorio de los extractos de B hieronymi B balansae
y P macrodontes
Evaluar los efectos de los extractos de B hieronymi B balansae y P
macrodontes sobre algunos de los componentes de la hemostasia
Evaluar los extractos de B hieronymi B balansae y P macrodontes como
posibles agentes antitumorales
Tratar de establecer la posible relacioacuten entre los efectos medidos y la actividad
proteoliacutetica de las cisteiacutenendopeptidasas estudiadas
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
23
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2 MATERIAL VEGETAL
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
28
21 Material Vegetal Utilizado
211 Bromelia hieronymi Mez
Crece en bosques xeroacutefitos de la provincia fitogeograacutefica chaquentildea Habita desde el
SE de Bolivia a traveacutes del Chaco paraguayo y argentino hasta las provincias de Tucumaacuten
Santiago del Estero y Chaco (Arenas 1997)
Frutos inmaduros fueron recogidos en los alrededores de la ciudad de Santiago del
Estero por el Ing Lucas Roic de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad
Nacional de Santiago del Estero Un ejemplar de referencia ha sido depositado en el
herbario de la Divisioacuten Plantas Vasculares de la Facultad de Ciencias Naturales y Museo de
la Universidad Nacional de La Plata Los frutos fueron lavados secados al aire y
almacenados en freezer a -20 ordmC hasta su uso
2111 Extracto parcialmente purificado de frutos de B hieronymi (Bh)
Aproximadamente 50 g de frutos congelados fueron cortados y triturados en una
procesadora durante 1 min en intervalos de 10 s con igual tiempo de espera con 250 mL de
buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 conteniendo EDTA y cisteiacutena 5 mM Luego de filtrar con
gasa se centrifugoacute durante 30 min a 4 ordmC y 12000 g El sobrenadante que constituye el
extracto crudo se fraccionoacute y almacenoacute a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue
realizada sobre bantildeo de hielo
A fin de eliminar compuestos fenoacutelicos y la mayoriacutea de los carbohidratos presentes
al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y en agitacioacuten suave se le adicionaron 4
voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC Luego de permitir la precipitacioacuten durante 30 min
a 4 ordmC se centrifugoacute a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC Se descartoacute el sobrenadante y el
precipitado fue secado al vaciacuteo durante 30 min el que finalmente fue resuspendido en buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Bruno 2007)
212 Bromelia balansae Mez
Frecuente en el sotobosque umbriacuteo es una planta asociada con el aacutembito fluvial Se
distribuye desde Colombia Amazonia Centro y Este de Brasil Regioacuten Oriental del
Paraguay hasta Corrientes y Misiones y las zonas riberentildeas de Formosa y Chaco en
Argentina (Arenas 1997)
El material estudiado proviene de la Provincia de Misiones (en la proximidad de
Posadas ruta 105 Km 28 a 33 entre los departamentos de San Joseacute y Fachinal) La
recoleccioacuten fue llevada a cabo por el Dr Aniacutebal Amat de la Facultad de Ciencias Exactas
Quiacutemicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones donde se encuentra
depositado un ejemplar de herbario Los frutos fueron lavados secados y almacenados a -
20 ordmC hasta su uso
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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2121 Extracto parcialmente purificado de frutos de B balansae (Bb)
Aproximadamente 40 g de frutos semimaduros congelados fueron cortados y
triturados en una procesadora 10 veces durante 10 s (con intervalos de 20 s) con 200 mL de
buffer fosfato soacutedico 01M de pH 7 conteniendo EDTA 5 mM y cisteiacutena 125 mM Luego de
filtrar la preparacioacuten resultante con gasa se la centrifugoacute a 12000 g durante 25 min a 4 ordmC y
el sobrenadante resultante que corresponde al extracto crudo fue fraccionado y
almacenado a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue realizada sobre bantildeo de
hielo
Al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y con agitacioacuten suave se le agregoacute un
volumen de etanol preenfriado a -20 ordmC y se lo dejoacute durante 30 min a 4 ordmC Luego se
centrifugoacute a 3000 g durante 30 min a 4 ordmC El sobrenadante en bantildeo de hielo fue tratado
con 3 voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC y luego de dejarlo durante 30 min a 4 ordmC fue
centrifugado a 3000 g durante 30 min a 4 ordmC Una vez eliminado el sobrenadante el
precipitado fue secado al vaciacuteo durante 45 min Finalmente fue resuspendido con buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Pardo 2004)
213 Pseudananas macrodontes (Morr) Harms [= P sagenarius (Arruda) Camargo]
Vegeta en el interior de bosques huacutemedos y sombriacuteos es caracteriacutestico en bosques
de galeriacutea Se extiende desde el nordeste centro y este de Brasil a traveacutes del Paraguay
Oriental hasta la Mesopotamia argentina Se halla en toda la cuenca de los riacuteos Paraguay y
Paranaacute desde Bolivia hasta la altura del litoral santafecino (Arenas 1997)
Los frutos en estado semimaduro fueron recogidos en Santa Ana departamento de
Candelaria Provincia de Misiones por el Prof Aniacutebal Amat Un ejemplar de referencia ha
sido depositado en el herbario de la Facultad de Ciencias Exactas Quiacutemicas y Naturales de
la Universidad Nacional de Misiones Los frutos fueron lavados secados al aire y
almacenados a -20 ordmC hasta su uso
2131 Extracto parcialmente purificado de frutos de P macrodontes (Pm)
Aproximadamente 120 g de frutos semimaduros congelados y desprovistos de
semillas y bracteacuteolas fueron cortados y triturados en una procesadora durante 1 min (en
intervalos de 10 s con igual tiempo de espera) con 200 mL de buffer fosfato soacutedico 01M de
pH 6 conteniendo EDTA y cisteiacutena 5 mM Luego de filtrar la preparacioacuten resultante con gasa
se la centrifugoacute a 5000 g durante 30 min a 4 ordmC y el sobrenadante resultante (extracto crudo)
fue fraccionado y almacenado a -20 ordmC Cada una de las etapas mencionadas fue realizada
sobre bantildeo de hielo
Al extracto crudo mantenido en bantildeo de hielo y con agitacioacuten suave se le agregoacute un
volumen de etanol preenfriado a -20 ordmC y se lo dejoacute durante 30 min a 4 ordmC Luego se
centrifugoacute a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC El sobrenadante en bantildeo de hielo fue luego
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
30
tratado con 3 voluacutemenes de etanol preenfriado a -20 ordmC y luego de dejarlo durante 120 min a
4 ordmC fue centrifugado a 12000 g durante 30 min a 4 ordmC Una vez eliminado el sobrenadante
el precipitado fue secado al vaciacuteo durante 30 min Finalmente fue resuspendido con buffer
fosfato soacutedico 01M de pH 6 liofilizado y almacenado a -20 ordmC (Brullo 2003)
214 Ananas comosus (L) Merr
Es una planta perenne nativa de Ameacuterica del Sur de escaso porte y con hojas duras
y lanceoladas de hasta 1 metro de largo fructifica una vez cada tres antildeos produciendo un
uacutenico fruto fragante y dulce muy apreciado en gastronomiacutea (Garciacutea Suaacuterez amp Serrano
2005)
Los efectos evaluados de los preparados proteoliacuteticos fueron comparados con los de
bromelina de tallo comercial (B4882 Sigma Aldrich)
215 Reactivos quiacutemicos
En todos los casos se usoacute etanol 96ordm calidad medicinal (Soria) EDTA (Invitrogen)
cisteiacutena (Sigma Aldrich) y fosfato soacutedico pureza 98 (Carlo Erba)
22 Caracterizacioacuten proteoliacutetica de los extractos parcialmente purificados (Bh Bb y Pm) y de bromelina
221 Teacutecnicas y metodologiacutea
2211 Dosaje de la actividad caseinoliacutetica
La preparacioacuten del sustrato se realizoacute suspendiendo 1 g de caseiacutena de leche bovina
(Sigma Aldrich) en 100 mL de solucioacuten buffer (Tris-HCl 01M pH 80) la suspensioacuten se
colocoacute en un bantildeo de agua que se llevoacute a ebullicioacuten y se mantuvo durante 20 min en esas
condiciones La solucioacuten resultante se filtroacute en caliente y una vez enfriada se agregoacute cisteiacutena
25 mM como activador de proteasas cisteiacutenicas
La mezcla de reaccioacuten se preparoacute con 11 mL de solucioacuten de caseiacutena al 1 y 01 mL
de solucioacuten del extracto en estudio La reaccioacuten fue llevada a cabo a 37 ordmC y detenida a los 2
min por la adicioacuten de 18 mL de aacutecido tricloroaceacutetico al 5 luego de lo cual los tubos fueron
centrifugados a 4000 g durante 30 min determinaacutendose la absorbancia de los
sobrenadantes a 280 nm medida a traveacutes de una celda de 1 cm de paso En todos los
casos fueron realizados ensayos en blanco agregando al preparado proteoliacutetico primero el
aacutecido tricloroaceacutetico y por uacuteltimo la solucioacuten de caseiacutena
Siguiendo el criterio de Sarath et al (1989) para expresar la actividad enzimaacutetica
cuando se utilizan sustratos proteicos se definioacute para este caso una unidad arbitraria
(Unidad caseinoliacutetica UCas) que corresponde a la cantidad de enzima requerida para
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
31
producir un incremento de una unidad de absorbancia a 280 nm al cabo de 1 min en las
condiciones de ensayo
2212 Cuantificacioacuten del contenido proteico
Se utilizoacute el meacutetodo de Bradford (1976) basado en que la unioacuten del Coomassie Blue G-
250 a la proteiacutena produce un corrimiento del maacuteximo de absorbancia de 465 nm (forma roja
del colorante libre) a 595 nm (forma azul del complejo colorante-proteiacutena) Las curvas de
calibracioacuten se confeccionaron utilizando seroalbuacutemina bovina (Sigma-Aldrich) en el rango de
02-12 mgmL para el ensayo estaacutendar y en el rango de 10-100 μgmL para el microensayo
2213 Isoelectroenfoque
Las bandas proteicas se determinaron por isoelectroenfoque (IEF) utilizando un equipo
Mini IEF Cell (Modelo 111 Bio Rad) Las muestras se precipitaron con 4 voluacutemenes de
acetona durante 30 min y luego de centrifugar a 16000 g durante 15 min el precipitado
resultante fue redisuelto con agua bidestilada
Los geles fueron preparados mezclando 20 mL de acrilamida-bisacrilamida (25T6
3C7) 20 mL de glicerol (25 pv) 05 mL de anfolitos Biolyte 3-10 (para Bh Bb y
bromelina) o Pharmalyte 4-65 (para Pm) y 55 mL de agua luego que dicha mezcla fue
degasificada se adicionaron 3 μL de TEMED y 60 μL de persulfato de amonio al 10
Las muestras (1-5 microL) se sembraron y se permitioacute que difundieran dentro del gel
durante 5 min Los electrodos fueron humedecidos con agua bidestilada y los geles se
apoyaron inmediatamente sobre los mismos El IEF fue llevado a cabo en tres etapas
sucesivas 15 min a 100 V 30 min a 200 V y finalmente 1 h a 450 V
Una vez concluida la corrida los geles fueron sumergidos durante 30 min en solucioacuten
fijadora (4 g de aacutecido sulfosaliciacutelico 30 mL de metanol 125 g de aacutecido tricloroaceacutetico y agua
csp 100 mL) Una vez fijados los geles fueron tratados durante 2 h con la solucioacuten
colorante (10 mL de aacutecido aceacutetico glacial 27 mL de etanol 40 mg de Coomassie Brilliant
Blue R-250 500 mg de CuSO4 y agua csp 100 mL) decolorados por tres lavados
sucesivos con solucioacuten decolorante I (7 mL de aacutecido aceacutetico glacial 12 mL de etanol 500
mg de CuSO4 y agua csp 100 mL) y finalmente sumergidos en solucioacuten decolorante II (7
mL de aacutecido aceacutetico glacial 12 mL de Etanol y agua csp 100 mL) hasta obtener un fondo
claro
6 T= (g acrilamida+g bisacrilamida) x 100 volumen total
7 C= g bisacrilamida x 100 (g acrilamida+g bisacrilamida)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
32
2214 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Para el moldeado de los geles y la realizacioacuten de la corrida electroforeacutetica se empleoacute
el equipo Mini Protean III (Bio-Rad) y se procedioacute de acuerdo a la teacutecnica de Laemmli (1970)
con modificaciones Los geles se prepararon con poliacrilamida al 16 (Tabla 21)
Reactivos Gel de apilamiento
(5) Gel de resolucioacuten
(16)
Acrilamida-Bisacrilamida (3008) 115 mL 4 mL
Buffer de resolucioacuten - 094 mL
Buffer de apilamiento 09 mL
H2O 453 mL 2425 mL
SDS al 10 70 μL 75 μL
PSA 10 52 μL 50 μL
TEMED 4 μL 4 μL
Tabla 21 Sistema de geles empleado Buffer de resolucioacuten Tris-HCl 3M pH 88 Buffer de apilamiento Tris-HCl
05M pH 68 PSA persulfato de amonio TEMED NNNacuteNacute-tetrametiletilendiamina
Las muestras fueron tratadas con el agregado de un volumen de buffer de muestra
(Tabla 22) previa adicioacuten de aacutecido iodoaceacutetico 1 mM (concentracioacuten final) llevadas a
ebullicioacuten durante 10 min y centrifugadas durante 10 min a 16000 g
Buffer de muestra
Tris 157 g
SDS 4 g
Glicerol 16 mL
Azul de bromofenol 4 mg
β-mercaptoetanol 25 μL
Llevar a pH 68 con HCl 1M
AD csp 100mL
Tabla 22 Composicioacuten del buffer de muestra El β-mercaptoetanol fue agregado durante el tratamiento de las
muestras
El buffer de reservorio (03 pv de Tris 01 pv de SDS y 144 pv de glicina) se
colocoacute en el reservorio catoacutedico hasta cubrir la parte superior del gel y en el anoacutedico hasta
una altura suficiente como para permitir que todo el electrodo haga contacto con eacutel
En las distintas calles se sembraron 10-15 μL de las muestras y 3 μL de los patrones
de peso molecular (LMW GE Healthcare) fosforilasa b (97 kDa) albuacutemina (66 kDa)
ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (30 kDa) inhibidor de tripsina (201 kDa) y α-
lactoalbuacutemina (144 kDa)
La intensidad de corriente fue de 30 mA durante el apilado y de 60 mA durante la
resolucioacuten hasta la finalizacioacuten de la corrida Inmediatamente despueacutes los geles fueron
removidos de las placas y dejados durante 30 min en solucioacuten fijadora (10 vv de aacutecido
aceacutetico 50 vv de metanol) Luego fueron coloreados con solucioacuten colorante (10 vv de
aacutecido aceacutetico 40 vv de metanol y 100 mg de Coomassie Brillant Blue R-250) y
decolorados con una solucioacuten de aacutecido aceacutetico al 10 vv
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
33
2215 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina
Con el fin de determinar si los efectos medidos para los distintos preparados
proteoliacuteticos eran debidos a la accioacuten de sus proteasas cisteiacutenicas fue necesario evaluar el
efecto de los mismos preparados desprovistos de actividad proteoliacutetica
El meacutetodo de inhibicioacuten que se eligioacute fue tratar los preparados con E-64 (trans-
epoxisuccinil-L-leucilamido(4-guanidino)butano) un potente irreversible y selectivo inhibidor
de proteasas cisteiacutenicas El grupo trans-epoxisuccinil (resto activo) del E-64 se une
irreversiblemente al grupo tiol del sitio activo de muchas proteasas cisteiacutenicas tales como
papaiacutena y bromelina y no reacciona con los grupos tiol de otras enzimas no proteasas como
L-lactato deshidrogenasa (Barrett et al 1982) Dada esta gran especificidad y la baja
toxicidad que ha mostrado es considerado muy uacutetil para ensayos in vivo (Katunuma et al
1995)
22151 Tratamiento con E-64
Bh Bb y Pm fueron obtenidos seguacuten lo indicado previamente (2111 2121 y
2131 respectivamente) y antes de liofilizarlos diferentes aliacutecuotas de cada uno fueron
incubadas con soluciones de 5 10 30 60 80 y 100 μM (concentracioacuten en volumen de
mezcla) de E-64 (E3132 Sigma Aldrich) durante 30 min a 37 ordmC La solucioacuten de bromelina
fue preparada resuspendiendo el polvo comercial en buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 (30
mgml) y diferentes aliacutecuotas fueron incubadas con 60 100 130 150 y 250 μM de E-64 Los
blancos se incubaron de igual manera pero reemplazando el E-64 por igual volumen de
agua destilada Luego se determinoacute la actividad proteoliacutetica de cada aliacutecuota y se la
referencioacute a la actividad proteoliacutetica del preparado blanco a la que se consideroacute el 100
(actividad residual porcentual)
222 Resultados
2221 Perfiles de pI y de peso molecular de Bh Bb y Pm
El contenido proteico la actividad proteoliacutetica y la actividad especiacutefica de cada
preparado de Bh Bb y Pm evaluado se indican en cada capiacutetulo En la Figura 21 se
muestran los perfiles de pI obtenidos para cada preparado los cuales se correspondieron
con los reportados para los extractos parcialmente purificados de Bromelia hieronymi (Bruno
et al 2003) B balansae (Pardo et al 2000) y Pseudananas macrodontes (Loacutepez et al
2000)
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Figura 21 IEF A Bh bandas de pI 59 y 64 (Hironymaiacutena III) pI 76 y 83 (Hieronymaiacutena II) pH ge93
(Hieronymaiacutena I) B Bb banda de pI asymp 5 (Balansaiacutena I) bandas de pI 85 y 87 (balansaiacutena II) C Pm bandas de pI 57 59 (Macrodontaiacutena I) y 61 (Macrodontaiacutena II) D Bro (Bromelina de tallo) banda de pI gt93
La banda de pI asymp 46 para bromelina (Fig21 D) se corresponde a la bromelina de
fruto que estaacute presente en pequentildeas cantidades en los tallos de Ananas comosus (Hale et
al 2005)
En la Figura 22 se observan las bandas caracteriacutesticas todas ellas de alrededor de
25 kDa de las proteasas de Bh (asymp25 kDa) Bb (asymp24 kDa) y Pm (asymp26 kDa) La banda de asymp 29
kDa presente en Bh y la banda de asymp30 kDa contenida en Pm tambieacuten estaacuten presentes en los
extractos crudos respectivos y desaparecen cuando las corridas electroforeacuteticas se hacen
sin previa inhibicioacuten con aacutecido iodoaceacutetico comportamiento frecuente en el caso de
proteasas vegetales que actuacutean de inmediato sobre sus sustratos
Figura 22 SDS-PAGE de Bh Bb y Pm A la izquierda patrones de PM (kDa)
A B C D
Bh Bb Pm
144
201
300
450
660
970
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2222 Inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina
En la Figura 23 se muestra la actividad porcentual residual de Bh Bb Pm y
bromelina luego de incubarlos con distintas concentraciones de E-64 durante 30 min a 37
ordmC
Figura 23 Actividad residual () de la actividad especiacutefica de Bh Bb Pm y bromelina (Bro) Media plusmn
DE (n=3)
De las curvas de inhibicioacuten de la Figura 23 se obtuvo la concentracioacuten miacutenima de E-
64 que inhibe a cada preparado 30 μM para Bh 10 μM para Bb y Pm 150 μM para 30
mgmL de bromelina las cuales fueron aumentadas un 10 maacutes al momento de obtener los
preparados inhibidos para los distintos ensayos
Cuando los preparados fueron liofilizados (excepto bromelina) previo a la evaluacioacuten
de los distintos efectos se les midioacute la actividad proteoliacutetica y la concentracioacuten de proteiacutenas
Sin embargo se observoacute una aparente inconsistencia en la concentracioacuten de proteiacutenas
medidas la concentracioacuten de proteiacutenas del liofilizado inhibido fue un 15 30 y 70 respecto
de la concentracioacuten del liofilizado sin inhibir para Bh Bb y Pm respectivamente
Habitualmente el proceso de liofilizacioacuten no genera peacuterdida de proteiacutenas en este tipo de
preparaciones Para comprobar si ello se debiacutea a una destruccioacuten parcial de las proteasas
se analizoacute cada material liofilizado por SDS-PAGE lo que permitioacute mostrar la presencia de
las bandas esperadas con intensidad similar en los liofilizados activos e inhibidos
Debido a que Bh era el preparado que aparentemente ldquoperdiacuteardquo maacutes proteiacutenas se lo
eligioacute para hacer ensayos de inhibicioacuten y evitando la liofilizacioacuten determinar el contenido
proteico Para esto se repitioacute el procedimiento de inhibicioacuten descripto en 22151 con 10
30 y 60 μM de E-64 y a cada una de las aliacutecuotas de Bh se le determinoacute la concentracioacuten de
proteiacutenas la actividad proteoliacutetica y el perfil por SDS-PAGE
-5
15
35
55
75
95
0 50 100 150 200 250
Act
ivid
ad r
esi
du
al (
)
E-64 (μM)
Pm
Bb
Bh
Bro
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En la Figura 24 se muestran la actividad porcentual residual (A) y el contenido de
proteiacutenas (B) de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 durante 30
min a 37 ordmC
Figura 24 A Actividad porcentual residual () de la actividad proteoliacutetica y de la actividad especiacutefica de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 B Contenido proteico de Bh luego de incubarlo con distintas concentraciones de E-64 Media plusmn DE (n=3)
Se observa una disminucioacuten en la concentracioacuten de proteiacutenas de Bh al aumentar la
concentracioacuten de E-64 Sin embargo en el SDS-PAGE de las distintas aliacutecuotas de Bh
(Figura 25) no se observa peacuterdida ni disminucioacuten de intensidad de las bandas principales de
Bh aun despueacutes de incubar Bh con 60 μM de E-64
Figura 25 SDS-PAGE Ec extracto crudo de B hieronymi 0 Bco 10 30 y 60 Bh luego de incubarlo con E-64 10 30 y 60 μM respectivamente P patrones de peso molecular (LMW Bio-Rad fosforilasa b 974 kDa seroalbuacutemina 662 kDa ovoalbuacutemina 45 kDa anhidrasa carboacutenica 31 kDa inhibidor de tripsina 215 kDa y lisozima 144 kDa
Por otro lado en la Figura 24 B se observa que luego de inhibir Bh con 30 μM de E-
64 (30) la concentracioacuten de proteiacutenas fue asymp14 de la concentracioacuten de proteiacutenas de Bh sin
inhibir (0) lo cual concuerda con la relacioacuten de proteiacutenas de los liofilizados activo e inhibido
observada para Bh
La aparente inconsistencia entre lo observado en la Figura 24 B y la Figura 25
podriacutea explicarse por la dependencia de la sensibilidad del meacutetodo de Bradford con la
composicioacuten de aminoaacutecidos en la superficie proteica (Lucarini amp Kilikian 1999) Si bien el
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
0 10 30 60
Pro
teiacuten
as (
mg
ml)
E-64 (μM)
A B
-2
18
38
58
78
98
0 5 10 30 60 80 100
Act
ivid
ad r
esi
du
al (
)
E-64 (μM)
Actividad caseinoliacutetica (Ucasml)
Actividad especiacutefica (Ucasmg)
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E-64 interacciona esencialmente con la cisteiacutena del sitio activo de las cisteiacutenendopeptidasas
el inhibidor parece inducir alguacuten cambio conformacional en las proteasas tratadas que afecta
fuertemente la reaccioacuten con el colorante No hemos encontrado referencia alguna a este
comportamiento en la bibliografiacutea consultada
A pesar de esta dificultad en la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas para
los distintos ensayos los preparados inhibidos se obtuvieron inhibieacutendolos seguacuten las
concentraciones de E-64 definidas en 2222 y luego se les midioacute la actividad caseinoliacutetica y
se realizoacute un IEF y un SDS-PAGE La inhibicioacuten fue llevada a cabo al momento previo de la
liofilizacioacuten para los preparados destinados a la evaluacioacuten del efecto antiinflamatorio
(Capiacutetulo 3) ya que los mismos fueron realizados en San Luis y se consideroacute maacutes adecuado
transportarlos ya inhibidos con la caracterizacioacuten ya hecha en el LIProVe En tanto que los
preparados destinados al resto de los ensayos (Capiacutetulos 4 y 5) fueron inhibidos luego de
ser liofilizados previamente a los ensayos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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3 EFECTO
ANTIINFLAMATORIO
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31 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al dantildeo
causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por cualquier agresor de naturaleza
bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica (Garciacutea Barreno 2008) Una respuesta inflamatoria
tiacutepica consta de cuatro componentes los inductores inflamatorios los sensores que los
detectan los mediadores inflamatorios inducidos por los sensores y los tejidos diana o
efectores que se ven afectados por los mediadores Dependiendo de la naturaleza de la
causa desencadenante diferentes combinaciones de los distintos componentes existentes
daraacuten lugar a diferentes respuestas inflamatorias Asiacute las respuestas inflamatorias a la
infeccioacuten y a la lesioacuten tisular esteacuteril tienen diferentes propoacutesitos la primera tiene por objeto
proteger al hueacutesped de la infeccioacuten y se puede acoplar con la induccioacuten de la inmunidad
adaptativa mientras que la segunda sirve principalmente para promover la reparacioacuten de los
tejidos (Medzhitov 2010)
311 Inflamacioacuten aguda
La inflamacioacuten aguda es la respuesta temprana de un tejido ante la lesioacuten es
inespeciacutefica de corta duracioacuten y se caracteriza por cambios en la microcirculacioacuten
exudacioacuten de liacutequido y migracioacuten de leucocitos desde los vasos sanguiacuteneos al aacuterea
afectada Desde el punto de vista cliacutenico se caracteriza por los cinco signos cardinales que
se manifiestan en el aacuterea dantildeada rubor (eritema) calor tumoracioacuten (edema) dolor y
functio laesa (peacuterdida de la funcioacuten por una combinacioacuten de los 4 puntos anteriores) Las
alteraciones morfoloacutegicas y funcionales son una manifestacioacuten de una serie compleja de
eventos interrelacionados respuesta vascular respuesta celular y cooperacioacuten tisular viacutea
mediadores quiacutemicos de la inflamacioacuten (Garciacutea Barreno 2008)
3111 Respuesta vascular
Luego de una vasoconstriccioacuten pasajera de las arteriolas en el sitio de agresioacuten le
sigue una vasodilatacioacuten de las arteriolas precapilares producida por la relajacioacuten del
muacutesculo liso vascular Estos cambios llevan a un aumento del flujo sanguiacuteneo en el aacuterea
lesionada causando rubor y calor
Ciertos mediadores son capaces de producir la contraccioacuten de las ceacutelulas
endoteliales de veacutenulas y capilares lo cual produce separacioacuten de las uniones intercelulares
de dichas ceacutelulas conduciendo a un aumento de la permeabilidad vascular y permitiendo
el pasaje de proteiacutenas y liacutequido al espacio extracelular Este escape neto de fluido se
denomina exudacioacuten Entre las proteiacutenas plasmaacuteticas que exudan estaacute el fibrinoacutegeno el
cual se deposita como fibrina sobre los tejidos extravasculares lo cual disminuye la
permeabilidad tisular evitando la reentrada del exudado al vaso que finalmente conduce a la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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formacioacuten del edema A raiacutez del aumento de la permeabilidad vascular se produce un
aumento de viscosidad sanguiacutenea y el flujo sanguiacuteneo comienza a disminuir permitiendo el
acercamiento de los leucocitos a la pared de los vasos (Roitt 2003)
3112 Respuesta celular
Si bien los tipos celulares presentes en los exudados dependeraacuten del agente
agresor la ceacutelula predominante es el polimorfonuclear (PMN) neutroacutefilo en especial en la
fase temprana de la inflamacioacuten Los leucocitos llegan al sitio lesionado mediante una serie
de pasos marginacioacuten adhesioacuten emigracioacuten y quimiotaxis a traveacutes de la pared vascular
A raiacutez del enlentecimiento del flujo sanguiacuteneo los leucocitos son desplazados hacia
la periferia del vaso lo cual junto al aumento de la viscosidad sanguiacutenea favorece la
marginacioacuten leucocitaria hacia la superficie endotelial Esto les permite adherirse a la
superficie endotelial de los vasos proceso incrementado durante la inflamacioacuten aguda por el
aumento en la expresioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten (CAM) en ceacutelulas endoteliales de las
veacutenulas (P y E-selectinas ICAM PAF etc) y en los leucocitos (MAC-1 LFA-1 PAF-R L-
selectinas etc) Los neutroacutefilos adheridos pueden atravesar el vaso sanguiacuteneo por las
uniones intercelulares y la membrana basal (diapeacutedesis) alcanzando el espacio intersticial
(emigracioacuten) desde donde se dirigen al sitio de inflamacioacuten inducidos por un gradiente de
concentracioacuten de factores quimiotaacutecticos (quimiotaxis) (Roitt 2003)
La fagocitosis llevada a cabo fundamentalmente por macroacutefagos y neutroacutefilos es la
internalizacioacuten y digestioacuten celular de partiacuteculas extrantildeas y requiere el reconocimiento el
englobamiento y la degradacioacuten de la partiacutecula Cuando se trata de un agente inerte y
grande el reconocimiento es directo Las opsoninas son sustancias que recubren la
partiacutecula y favorecen su fagocitosis La destruccioacuten del material se lleva a cabo por las
especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) las especies reactivas de nitroacutegeno y el sistema
halogenador ademaacutes de mecanismos independientes del oxiacutegeno tales como la proteinasa
3 la catepsina G la lisozima y la lactoferrina entre otros Estos efectores junto a los
productos de degradacioacuten son liberados al medio extracelular por lo que los dantildeos
colaterales a los tejidos del hueacutesped resultan inevitables (Nathan 2006)
3113 Mediadores quiacutemicos8
La respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso dispositivo de mediadores
que se organizan en complejas redes reguladoras (Garciacutea Barreno 2008) Se trata de
moleacuteculas solubles que difunden faacutecilmente y actuacutean sobre los receptores de los efectores
Los mediadores pueden provenir de los sistemas plasmaacuteticos (coagulacioacuten complemento
cininas) ser liberados desde graacutenulos almacenados en ceacutelulas (serotonina histamina) o ser
8 En este apartado aquellos paacuterrafos que no contienen citas fueron adaptados convenientemente de Rotelli
(2004)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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sintetizados inmediatamente cuando se requieren (eicosanoides) Teniendo en cuenta su
accioacuten y su origen se pueden clasificar como se indica en la Tabla 31
Tabla 31 Clasificacioacuten de mediadores de la inflamacioacuten seguacuten accioacuten y origen
La histamina es un mediador temprano de la inflamacioacuten aguda y es liberado desde
los graacutenulos almacenados en los mastocitos perivasculares luego de ser estimulados por
neuropeacuteptidos liberados desde las terminaciones nerviosas (Benoist amp Mathis 2002)
antiacutegenos IL-1 C3a y C5a (Roitt 2003) entre otros Su accioacuten es mediada por receptores
(H) ubicados a lo largo de todo el lecho vascular principalmente en ceacutelulas del muacutesculo liso
y ceacutelulas endoteliales Sobre el muacutesculo liso produce dilatacioacuten mientras que sobre las
ceacutelulas endoteliales produce contraccioacuten y por tanto aumenta la permeabilidad vascular
estimula la expresioacuten de P-selectinas aumentando la adhesioacuten leucocitaria y estimula la
siacutentesis de NO y prostaciclina (PGI2) ambas con efectos vasodilatadores (Brunton et al
2006)
La serotonina (5-hidroxitriptamina 5-HT) puede tener un efecto vasoconstrictor o
vasodilatador seguacuten el receptor sobre el cual actuacutee sin embargo durante la inflamacioacuten
aguda actuacutea tempranamente provocando vasodilatacioacuten con aumento de permeabilidad
aunque con menor potencia que la histamina
Los eicosanoides son las familias de prostaglandinas (PGs) leucotrienos (LTs) y
compuestos similares que derivan de aacutecidos grasos poliinsaturados esenciales de 20
aacutetomos de carbono Son sintetizados en la membrana celular por activacioacuten de la
fosfolipasa A2 o de la fosfolipasa C las cuales catalizan la liberacioacuten del precursor
eicosanoide (aacutecido araquidoacutenico) desde la membrana celular (Brunton et al 2006)
A partir del aacutecido araquidoacutenico se inician dos viacuteas principales de siacutentesis la viacutea de
la ciclooxigenasa (COX) la cual conduce a la formacioacuten de PGs prostaciclinas (PGIs) y
tromboxanos (TXAs) y la viacutea de la lipooxigenasa la cual conduce a la siacutentesis de LTs
Mediadores que incrementan la permeabilidad vascular en el edema inflamatorio
Vasoactivos derivados de ceacutelulas Vasoactivos derivados del plasma
-Aminas bioacutegenas serotonina histamina
-Eicosanoides
-Factor activador de plaquetas (PAF)
-Oxido niacutetrico (NO)
-Cininas
-Cascada de coagulacioacuten
-Sistema de complemento
Mediadores involucrados en el reclutamiento celular (Factores quimiotaacutecticos)
-C5a C3a
-Eicosanoides (LTB4)
-Quimiocinas
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
42
Existen dos isoformas de la COX COX-1 expresada de manera constitutiva en la mayoriacutea
de las ceacutelulas y COX-2 inducida por citocinas y factores de crecimiento entre otros
estiacutemulos
Los leucotrienos LTC4 y LTD4 aumentan la permeabilidad vascular aumentando el
exudado de plasma El LTB4 ademaacutes de aumentar la permeabilidad es un potente agente
quimiotaacutectico aumenta la adherencia y emigracioacuten de los neutroacutefilos a traveacutes del endotelio y
estimula la degranulacioacuten y la siacutentesis de superoacutexido en los PMNs
Mientras que la PGF2 es vasoconstrictora PGE2 y PGI2 son vasodilatadoras y
aumentan el edema y la infiltracioacuten de leucocitos en el aacuterea inflamada Sin embargo PGE2
puede actuar como inmunosupresor inhibe la liberacioacuten de los productos lisosomales de los
neutroacutefilos y macroacutefagos asiacute como la participacioacuten de leucocitos en reacciones de
hipersensibilidad tardiacutea (Brunton et al 2006)
El factor activador de plaquetas (PAF) ademaacutes de ser un potente estimulador de la
agregacioacuten y activacioacuten plaquetaria aumenta la permeabilidad vascular la quimiotaxis y la
adhesioacuten de neutroacutefilos al endotelio asiacute como la generacioacuten de superoacutexido y enzimas
lisosomales desde los PMNs Al actuar sobre receptores acoplados a proteiacutenas G activa las
fosfolipasas A2 y C estimulando la siacutentesis de TXA2 PGs y LTs La trombina e histamina
estimulan su expresioacuten en las ceacutelulas endoteliales Se sintetiza en mastocitos plaquetas
neutroacutefilos eosinoacutefilos monocitos y NK (ldquonatural killersrdquo)
El oacutexido niacutetrico (NO) es un potente vasodilatador potencia la citotoxicidad de los
fagocitos y activa las COX-1 y COX-2 (Salvemini et al 1993) Es sintetizado por dos
isoformas de la oacutexido niacutetrico sintasa (NOS) La NOS constitutiva (c-NOS) estaacute presente en
plaquetas y ceacutelulas endoteliales y produce pequentildeas cantidades de NO La NOS inducible
(i-NOS) se expresa en muacuteltiples ceacutelulas tales como neutroacutefilos macroacutefagos ceacutelulas
endoteliales y muacutesculo liso vascular Diversos agentes vasoactivos (serotonina histamina
bradicinina trombina y estiacutemulos fiacutesicos) estimulan la siacutentesis de NO en las ceacutelulas
endoteliales
Las cininas (bradicinina plasmaacutetica y calidina tisular) son peacuteptidos derivados por
accioacuten de calicreiacutenas del cininoacutegeno plasmaacutetico (cininoacutegeno de alto peso molecular) y del
cininoacutegeno tisular (cininoacutegeno de bajo peso molecular) La calicreiacutena plasmaacutetica es activada
a partir de la precalicreiacutena por accioacuten del factor XII el cual a su vez es activado por contacto
con superficies cargadas negativamente (colaacutegeno heparina productos plaquetarios etc)
Las cininas tienen propiedad vasodilatadora (sobre arteriolas) y vasoconstrictor (sobre
arterias y venas de gran calibre) asiacute como tambieacuten aumentan la permeabilidad en la
microcirculacioacuten y estimulan la siacutentesis de PGs por activacioacuten de fosfolipasas A2 y C En
macroacutefagos estimulan la liberacioacuten de la interleucina IL-1 y del factor de necrosis tumoral
(TNF-α) Uno de sus receptores (B1) es inducible por dantildeo tisular e inflamacioacuten
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
43
El paso final de la coagulacioacuten es la formacioacuten de fibrina la cual no soacutelo frena el
sangrado permitiendo la reparacioacuten del aacuterea lesionada sino que tambieacuten forma una malla en
la que quedan atrapados los agentes agresores impidiendo su diseminacioacuten Por otro lado
durante la formacioacuten de la fibrina se liberan fibrinopeacuteptidos A y B desde el fibrinoacutegeno los
cuales actuacutean como quimiotaacutecticos de los PMNs y potencian los efectos de la bradicinina
El sistema del complemento estaacute formado por proteiacutenas plasmaacuteticas (C) que actuacutean
en forma de cascada en la que cada enzima activa la siguiente La activacioacuten es
desencadenada por complejos antiacutegeno-anticuerpo y productos bacterianos Como
consecuencia de su activacioacuten se forman productos con propiedad opsonizante
quimiotaacutectica y capacidad liacutetica sobre ceacutelulas diana Los productos C5a y C3a estimulan el
estallido respiratorio en los fagocitos desencadenan la liberacioacuten de mediadores (histamina
PAF IL-3 4 5 y 6 entre otros) asiacute como la siacutentesis de LTs PGs y TXs desde mastocitos y
basoacutefilos C5a y en menor medida C3a es un potente agente quimiotaacutectico de neutroacutefilos
ademaacutes de estimular la siacutentesis de eicosanoides C5a tambieacuten genera vasodilatacioacuten y
aumento de la permeabilidad capilar C5a y C3a tambieacuten se pueden formar por accioacuten de la
plasmina la calicreiacutena y enzimas leucocitarias
Bajo el estiacutemulo local el macroacutefago hiacutestico libera las citocinas IL-1 y TNF-α entre
otros mediadores las cuales actuacutean estimulando las ceacutelulas endoteliales (luego de la
trombina o la histamina) ceacutelulas epiteliales y fibroblastos a liberar quimiocinas (MCP-1) Las
quimiocinas actuacutean sobre diversos tipos leucocitarios conducieacutendolos al sitio inflamado IL-8
es un potente quimiotaacutectico para neutroacutefilos pero tambieacuten para linfocitos (Roitt 2003)
312 Regulacioacuten y resolucioacuten de la inflamacioacuten
La finalizacioacuten de la respuesta inflamatoria y la transicioacuten al estado homeostaacutetico es
un proceso activo y altamente regulado conocido como la resolucioacuten de la inflamacioacuten
(Medzhitov 2010) Entre los mecanismos reguladores identificados se pueden mencionar
proteiacutenas reguladoras del complemento el factor transformante β (TGF-β) las IL-4 y IL-10
la PGE2 y los glucocorticoides endoacutegenos que actuacutean regulando la proliferacioacuten y
activacioacuten de las ceacutelulas inflamatorias (Roitt 2003) las lipoxinas (producidas por la 15-
lipooxigenasa en los tejidos) inhiben el reclutamiento de neutroacutefilos y promueven el
reclutamiento de los monocitos que eliminan las ceacutelulas muertas e inician la reparacioacuten del
tejido las resolvinas y protectinas (derivadas del aacutecido eicosapentanoico y del
docosahexanoico) tienen un papel crucial en la resolucioacuten de la inflamacioacuten junto a las
lipoxinas (Medzhitov 2008) los fosfoliacutepidos de las membranas de las ceacutelulas endoteliales
vasculares oxidados por las ROS disminuyen la expresioacuten de moleacuteculas de adhesioacuten
(Brash 1999)
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44
Dependiendo de la cantidad de tejido destruido y la naturaleza del agente agresor la
inflamacioacuten puede generar secuelas tales como la cicatrizacioacuten y la formacioacuten de abscesos
La cicatrizacioacuten ocurre cuando hay dantildeo sustancial al tejido conectivo yo el tejido
carece de la capacidad para regenerar ceacutelulas especializadas Los tejidos muertos y el
exudado inflamatorio agudo se reemplazan por un tejido conectivo vascular especializado
llamado tejido de granulacioacuten el cual produce gradualmente colaacutegeno para formar una
cicatriz fibrosa A pesar de la peacuterdida de algunas ceacutelulas especializadas y algo de distorsioacuten
arquitectoacutenica de la cicatriz fibrosa se restablece la integridad estructural
La formacioacuten de abscesos es un proceso que tiene lugar cuando la reaccioacuten
inflamatoria aguda no puede destruireliminar el agente agresor y continuacutea con un
componente de la inflamacioacuten croacutenica Esto es maacutes comuacuten en el caso de la infeccioacuten por
bacterias pioacutegenas (Woolf et al 2002)
313 Inflamacioacuten croacutenica
Cuando la inflamacioacuten se mantiene durante un tiempo prolongado (semanas o
meses) se habla de inflamacioacuten croacutenica en la que coexisten el dantildeo tisular y los intentos
de reparacioacuten Puede producirse por mantenimiento de la inflamacioacuten aguda (si no se
resuelve la causa) o bien empezar de manera progresiva y poco evidente sin las
manifestaciones de la inflamacioacuten aguda Este segundo caso es el responsable del dantildeo
tisular de algunas enfermedades como la artritis reumatoide la aterosclerosis la
tuberculosis y la fibrosis pulmonar Ademaacutes es importante en el desarrollo del caacutencer y en
enfermedades que anteriormente se consideraban exclusivamente degenerativas como el
Alzheimer Entre las causas de la inflamacioacuten croacutenica se pueden distinguir las infecciones
persistentes (micobacterias ciertos hongos virus y paraacutesitos) las enfermedades mediadas
por el sistema inmune (artritis reumatoide reacciones aleacutergicas enfermedad de Crohn y
esclerosis muacuteltiple) y la exposicioacuten prolongada a agentes toacutexicos (polvo de siacutelice fibras
suturas y cuerpos extrantildeos que no pueden ser removidos por fagocitosis) (Kumar 2009)
Ante la persistencia durante diacuteas del agente agresor los PMNs son reemplazados
por ceacutelulas mononucleares (macroacutefagos linfocitos y ceacutelulas plasmaacuteticas) si bien pueden
persistir algunos neutroacutefilos Los macroacutefagos presentan una morfologiacutea variable secretan
mediadores de inflamacioacuten regulan la actividad de linfocitos y favorecen la proliferacioacuten y el
desarrollo de fibroblastos y ceacutelulas endoteliales Durante la fase proliferativa de la
inflamacioacuten croacutenica los fibroblastos restauran la matriz del tejido conectivo dantildeado
conduciendo a la fibrosis en tanto que la proliferacioacuten de ceacutelulas endoteliales favorece la
formacioacuten de pequentildeos capilares (angiogeacutenesis)
Un tipo morfoloacutegico de la inflamacioacuten croacutenica es la inflamacioacuten granulomatosa
caracterizada por una coleccioacuten organizada de macroacutefagos los cuales forman ceacutelulas
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epiteliodes o se fusionan formando ceacutelulas gigantes ante la imposibilidad de digerir el agente
fagocitado Independientemente de su causa los granulomas pueden contener otras ceacutelulas
(linfocitos neutroacutefilos eosinoacutefilos fibroblastos) ademaacutes de fibrosis (Mukhopadhyay et al
2012) El proceso de formacioacuten de granulomas se puede dividir en 4 fases (iniciacioacuten
acumulacioacuten efectora y de resolucioacuten) en las cuales las ceacutelulas T tienen un rol
importante Durante la iniciacioacuten los macroacutefagos son atraiacutedos por el estiacutemulo inflamatorio y
comienza a nuclear la lesioacuten granulomatosa Durante la acumulacioacuten ceacutelulas T CD4+ se
acumulan en el sitio y reclutan otras ceacutelulas efectoras incluyendo ceacutelulas T maacutes
macroacutefagos y en algunos casos eosinoacutefilos Durante la fase efectora las ceacutelulas intentan
reducir la carga de patoacutegenos Por uacuteltimo una vez que la amenaza del patoacutegeno ha sido
reducida o eliminada la infiltracioacuten celular se reduce y se induce la formacioacuten del tejido
cicatricial (Co et al 2004) Las infecciones micoacuteticas la tuberculosis la lepra y la presencia
de cuerpos extrantildeos (talco suturas etc) son algunas de las causas de la inflamacioacuten
granulomatosa
En la inflamacioacuten no granulomatosa las ceacutelulas se encuentran diseminadas Se
caracterizan por la acumulacioacuten de linfocitos sensibilizados por antiacutegenos ceacutelulas
plasmaacuteticas y macroacutefagos Puede observarse necrosis tisular y fibrosis Las causas maacutes
comunes son las infecciones virales croacutenicas y las enfermedades autoinmunes entre otras
(Rotelli 2004)
314 Proteasas como antiinflamatorios
El rol de las proteasas como agentes antiinflamatorios especialmente el de la
tripsina es considerado desde la deacutecada del 50 en varios estudios (Martin et al 1954
Cohen et al 1955) En 1957 Innerfield reporta el efecto antiinflamatorio de la tripsina
administrada intramuscularmente en pacientes con tromboflebitis con gran componente
edematoso Atribuye a la proteasa un aumento en la permeabilidad tisular una disminucioacuten
en la viscosidad de los exudados y la reversioacuten del edema asiacute como la superacioacuten de la
isquemia en los tejidos con inflamacioacuten aguda al eliminar las barreras exudativas
extravasculares al flujo sanguiacuteneo en los pequentildeos vasos comprimidos
Un antecedente importante en el estudio de la accioacuten antiedematosa de las
proteasas cisteiacutenicas es el trabajo de Netti et al (1972) quienes compararon los efectos de
proteasas y agentes antiinflamatorios conocidos sobre edemas inducidos por distintos
agentes flogiacutesticos en pata de rata Los porcentajes de inhibicioacuten de edema para ficina
bromelina al igual que para un concentrado de enzimas proteoliacuteticas pancreaacuteticas fueron
iguales o superiores a los de indometacina acido acetilsaliciacutelico y fenilbutazona mientras
que la papaiacutena a la concentracioacuten ensayada no fue efectiva frente a ninguacuten edema En los
modelos animales la viacutea de administracioacuten de las preparaciones proteoliacuteticas es en su
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mayoriacutea oral aunque la eficacia antiedematosa de la bromelina administrada
intraperitonealmente tambieacuten ha sido comprobada (Smyth et al 1962 Uhlig amp Seifert
1981)
3141 Bromelina
Desde su introduccioacuten comercial en 1957 se han publicado resultados cientiacuteficos
que revelan los efectos antitromboacutetico fibrinoliacutetico y antiinflamatorio de la bromelina
evaluados mediante ensayos in vivo e in vitro (Maurer 2001) Ademaacutes de los modelos de
edema ya mencionados otros modelos experimentales de inflamacioacuten en los que la
bromelina ha sido efectiva son los siguientes encefalomielitis aleacutergica experimental (un
modelo experimental de la esclerosis muacuteltiple humana) asma aleacutergico pleuritis inducida por
carragenina enfermedades reumatoloacutegicas en ratoacuten arterioesclerosis inmunoloacutegicamente
mediada en aloinjertos aoacuterticos de rata y enfermedad inflamatoria intestinal en ratones IL-10-
- (Fitzhugh et al 2008 Secor et al 2012)
Una serie de estudios cliacutenicos controlados reportaron la eficacia de la bromelina
frente a edema inflamacioacuten dolor hematomas entre otros signos en sinusitis aguda
traumatismos en cara cabeza y extremidades inferiores tumefaccioacuten post-operatoria
inflamacioacuten e hinchazoacuten post-traumaacutetica y cirugiacutea oral (Maurer 2001)
El uso de la bromelina como antiinflamatorio o analgeacutesico en la artritis reumatoide fue
sugerido por Cohen amp Goldman (1964) Maacutes recientemente la bromelina ha sido evaluada
para la artrosis en varios estudios cliacutenicos abiertos o de equivalencia disentildeados para
determinar la efectividad comparativa y la seguridad respecto al tratamiento estaacutendar con
antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) Dichos estudios sugieren que la bromelina sola o
en complejos enzimaacuteticos (PHL9 WOB10 y WOB-N11) puede ser beneficiosa o tan eficaz
como el tratamiento con AINEs mostrando buena tolerabilidad y leves reacciones adversas
(principalmente siacutentomas gastrointestinales) Sin embargo la mayoriacutea de los estudios tienen
determinados problemas metodoloacutegicos que hacen difiacutecil extraer conclusiones definitivas
(Brien et al 2004 2006)
En un estudio de nivel II de medicina basada en la evidencia (EBM) se ha
demostrado que el tratamiento con bromelina en nintildeos con sinusitis aguda puede ser
considerada como segura y beneficiosa (Braun et al 2005)
El efecto antiinflamatorio de la bromelina puede ser explicado por su accioacuten sobre
distintos niveles del complejo proceso inflamatorio como se sentildeala a continuacioacuten
9 PHL Phlogenzyme contiene bromelina tripsina y rutina
10 WOB Wobenzyme contiene bromelina papaiacutena tripsina quimotripsina pancreatina lipase y amilasa
11 WOB-N contiene bromelina tripsina papaiacutena quimotripsina pancreatina y rutina
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47
31411 Efecto sobre los componentes de la coagulacioacuten
En el modelo edema de pata inducido por carragenina la accioacuten antiinflamatoria de
bromelina fue correlacionado con el aumento de la actividad fibrinoliacutetica seacuterica (Pirotta amp
Giuli-Morghen 1978) Ademaacutes la bromelina ha mostrado aumentar la concentracioacuten de
plasmina seacuterica (Smyth et al 1962) la activacioacuten de plasminoacutegeno a plasmina (Maurer et
al 2000) y disminuir el nivel seacuterico de fibrinoacutegeno (Livio et al 1978) Todos estos efectos
disminuiriacutean la deposicioacuten de fibrina en el aacuterea inflamada produciendo un aumento en la
permeabilidad tisular y vascular lo que promoveriacutea la reabsorcioacuten del fluido del edema
(Maurer 2001)
31412 Efecto sobre el sistema de calicreiacutenas
En el modelo de inflamacioacuten en ratas ldquobolsa de airerdquo inducido por caoliacuten la bromelina
redujo de manera dosis-dependiente el nivel de bradicinina en el sitio de inflamacioacuten y el
nivel de precalicreiacutena seacuterica los que fueron correlacionados con la reduccioacuten del exudado
plasmaacutetico (Kumakura et al 1988) explicando la accioacuten antiedematosa asiacute como
analgeacutesica de la bromelina
31413 Efecto sobre las viacuteas de la COX y la NOS
Los niveles de PGE2 asiacute como de sustancia P (un neuropeacuteptido asociado a la
percepcioacuten del dolor) se encontraron disminuidos en el exudado inflamatorio generado en
ratas por la implantacioacuten de esponjas embebidas en carragenina (Gaspani et al 2002) En
otro modelo inflamatorio la bromelina redujo de manera dosis-dependiente los niveles de
PGE2 y TXs junto con el volumen de exudado (Vellini et al 1986) Maacutes recientemente la
bromelina ha mostrado reducir la expresioacuten de la COX-2 y PGE2 por inhibicioacuten en la
translocacioacuten del factor nuclear kappa-B (NF-ĸB) en ceacutelulas tumorales asiacute como en modelos
experimentales de caacutencer (Chobotova et al 2010 Bhui et al 2012)
La administracioacuten oral de bromelina mejoroacute la disminucioacuten de la defecacioacuten en ratas
postoperatorias laparotomizadas al menos en parte mediante la inhibicioacuten de la
sobreexpresioacuten de la i-NOS del colon a traveacutes de la ruta del NF-kB (Wen et al 2006)
31414 Modulacioacuten de moleacuteculas de superficie celular
La bromelina ha mostrado remover moleacuteculas de superficie celular en leucocitos
(granulocitos monocitos y linfocitos) asociadas con la adhesioacuten y la activacioacuten leucocitaria
(Hale et al 2002) La reduccioacuten de la migracioacuten de neutroacutefilos en tres modelos murinos de
migracioacuten leucocitaria en cavidad intraperitoneal inflamada fue asociada a la remocioacuten de L-
selectina y principalmente de CD128 (receptor del quimioatractante IL-8) desde la superficie
leucocitaria lo que llevoacute a la eliminacioacuten de la adhesioacuten de alta afinidad mediada por
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
48
integrinas de los vasos sanguiacuteneos del sitio inflamado (Fitzhugh et al 2008) La bromelina
activa proteoliacuteticamente redujo la expresioacuten de CD25 (presente en la superficie de ceacutelulas T
activas que actuacutea como receptor del factor de proliferacioacuten IL-2) de manera dosis y tiempo
dependiente en ensayos in vitro y se propuso como mecanismo el clivaje proteoliacutetico de
CD25 desde la superficie celular (Secor et al 2009) Tambieacuten se ha sugerido que bromelina
podriacutea mediar su efecto antiinflamatorio actuando como moleacutecula de sentildealizacioacuten sobre los
receptores activados por proteasas (PAR) (Engwerda et al 2001 Muumlller et al 2012)
31415 Activacioacuten celular y produccioacuten de citoquinas
La bromelina mostroacute inhibir la transduccioacuten de sentildeales (viacutea MAPKERK-2) y la
produccioacuten de citoquinas (IL-4 IL-2 e IFN-γ) desde ceacutelulas T accioacuten que fue revertida al
inhibir la actividad proteoliacutetica de bromelina (Mynott et al 1999) En un modelo murino de la
enfermedad aleacutergica respiratoria ya establecida la bromelina redujo significativamente el
contenido de ceacutelulas T (CD4 y CD8) en el lavado bronqueoalveolar (BAL) sin afectar el
nuacutemero de ceacutelulas en el bazo o los ganglios linfaacuteticos hiliares ademaacutes de una disminucioacuten
de IL-4 IL-12 IL-17 asiacute como de IFN-α en el suero (Secor et al 2012)
La bromelina regula la produccioacuten de IFN-γTNF-α IL-1β e IL-6 de forma dependiente
de las condiciones inflamatorias La secrecioacuten de TNF-α IL-1β e IL-6 desde ceacutelulas
mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) obtenida de voluntarios sanos asiacute como de
macroacutefagos de ratoacuten seriacutea estimulada in vitro por la bromelina mediante un mecanismo
dependiente de IFN-γ Sin embargo en situaciones en las que las ceacutelulas inmunes ya han
sido estimuladas la bromeliacutena reduce la produccioacuten elevada de TNF-α IL-1β e IL-6 Por
ejemplo en presencia de lipopolisacaacuterido (LPS) un inductor de la reaccioacuten de inflamacioacuten
aguda bromelina reduce la expresioacuten de dichas citocinas desde PBMC (Chobotova et al
2010) Esta probable dualidad tambieacuten ha sido observada en modelos in vivo donde la
bromelina ha mostrado ser capaz tanto de mejorar como de inhibir las respuestas inmunes
dependientes de ceacutelulas T lo cual podriacutea depender del entorno inmunoloacutegico particular en el
que se la administra (Engwerda et al 2001)
Maacutes recientemente en un ensayo cliacutenico aleatorio controlado con placebo la
bromelina ha mostrado modular las respuestas celulares de linfocitos (cambio significativo
en el perfil circadiano de IFN-γ) despueacutes de su administracioacuten oral en voluntarios sanos
(Muumlller et al 2012)
Las evidencias experimentales dan cuenta de que la bromelina tendriacutea accioacuten sobre
muacuteltiples dianas y si bien su mecanismo antiinflamatorio no ha sido completamente
dilucidado numerosos efectos estaacuten mediados por su actividad proteoliacutetica (Pirotta amp Giuli-
Morghen 1978 Hale amp Haynes 1992 Mynott et al 1999 Hale et al 2002 Wen et al
2006 Hale et al 2005 Fitzhugh et al 2008 Secor et al 2009)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
49
32 Objetivos
Dentro del objetivo general de estudiar el posible efecto antiinflamatorio de los
extractos ricos en cisteiacutenendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) B
balansae (Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) se plantearon los siguientes objetivos
especiacuteficos
Evaluar el efecto de Bh Bb y Pm sobre la inflamacioacuten aguda y croacutenica empleando
modelos de inflamacioacuten en animales
Determinar si los efectos medidos tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los
extractos
Comparar los efectos de Bh Bb y Pm con los medidos para bromelina
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50
33 Materiales y meacutetodos
331 Modelos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria provocada por distintos estiacutemulos (isquemia agentes
infecciosos injuria quiacutemica teacutermica o mecaacutenica interaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo) puede ser
medida por los signos cliacutenicos que la acompantildean eritema edema dolor e hiperalgesia Una
serie de mecanismos dan lugar a distintas fases en que puede caracterizarse al proceso
inflamatorio
-Fase aguda transitoria caracterizada por vasodilatacioacuten local e incremento de la
permeabilidad capilar
-Fase subaguda caracterizada por infiltracioacuten de leucocitos y ceacutelulas fagociacuteticas
-Fase croacutenica proliferativa en la cual aparece una degeneracioacuten del tejido y fibrosis
Diferentes modelos desarrollados en animales de experimentacioacuten permiten
reproducir dichas fases (Vogel 2002) proporcionando un meacutetodo necesario para el
descubrimiento del uso apropiado de nuevos agentes terapeacuteuticos (Willoughby 2003)
El efecto antiinflamatorio de los preparados proteoliacuteticos fue evaluado usando
modelos de inflamacioacuten aguda o subaguda (edema de pata de rata) y un modelo de
inflamacioacuten croacutenica proliferativa (test del granuloma)
3311 Modelos de inflamacioacuten aguda Edema de pata de rata
Este modelo se basa en medir la capacidad de los agentes antiinflamatorios de
inhibir el edema producido en la pata trasera de ratas o ratones luego de la inyeccioacuten de un
agente flogiacutestico El efecto antiinflamatorio medido asiacute como su duracioacuten dependen de la
sustancia empleada como agente flogiacutestico (Vogel 2002)
33111 Edema de pata inducido por carragenina
Los carragenanos son un grupo complejo de polisacaacuteridos formados por la repeticioacuten
de monoacutemeros de galactosa modificada y son de tres tipos principales lambda kappa y
iota En el modelo de edema de pata la carragenina tipo lambda es inyectada
subcutaacuteneamente en la pata trasera La respuesta inflamatoria generada se caracteriza por
edema hiperalgesia y eritema y se cuantifica por el aumento de tamantildeo de la pata a raiacutez del
edema formado el cual es maacuteximo alrededor de las 5 h posteriores a la inyeccioacuten de
carragenina (Morris 2003)
El incremento en el volumen del edema es dependiente del tiempo y su desarrollo ha
sido descripto como un proceso bifaacutesico (Vinegar et al 1969 Salvemini et al 1996) La
fase temprana (0-1 h) se caracteriza por la liberacioacuten de histamina e 5-hidroxitriptamina (5-
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
51
HT) y le sigue un corto periacuteodo (asymp15-25 h) en que se libera bradicinina (Di Rosa et al
1971) mientras que la fase tardiacutea (asymp25-10 h) ha sido correlacionada con la produccioacuten de
prostaglandinas (PGs) atribuida a la induccioacuten de la ciclooxigenasa inducible (COX-2)
(Seibert et al 1994) La infiltracioacuten y activacioacuten de neutroacutefilos contribuye a la respuesta
inflamatoria principalmente de la fase tardiacutea por liberacioacuten de radicales libres derivados del
oxiacutegeno (O2- radicales hidroxilo) El oacutexido niacutetrico (NO) producido por la oacutexido niacutetrico sintasa
constitutiva (c-NOS) en la primera fase y por la oacutexido niacutetrico sintasa inducible (i-NOS) en la
fase tardiacutea actuacutea como un potente vasodilatador y tendriacutea un rol clave en el mantenimiento
de la respuesta inflamatoria tardiacutea al aumentar la produccioacuten de PGs por activacioacuten de la
COX-2 (Salvemini et al 1996)
La inhibicioacuten del edema de pata inducido por carragenina ha demostrado ser
altamente predictivo de la accioacuten antiinflamatoria del faacutermaco en la enfermedad inflamatoria
humana y las dosis de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en este modelo se
correlacionan bien con la dosis eficaz en los pacientes (Morris 2003)
331111 Procedimiento experimental
En la pata trasera izquierda de cada animal se realizoacute una inyeccioacuten subplantar de
01 mL de carragenina lambda tipo IV (Sigma Aldrich) al 2 en solucioacuten fisioloacutegica Una
hora antes cada lote de animales recibioacute intraperitonealmente (05 mL) los preparados a
ensayar El lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 y como control positivo se
usoacute 10 mgml de indometacina (Sigma Aldrich) o 50 mgml de diclofenac soacutedico (Sigma
Aldrich) Los voluacutemenes de las patas traseras fueron medidos con un pletismoacutemetro a
distintos tiempos post-inyeccioacuten de carragenina (1 3 5 y 7 h)
Aquellos preparados que mostraron tener un efecto antiinflamatorio durante la
primera hora en el modelo de edema inducido por carragenina fueron probados en modelos
de edema inducido por mediadores de la fase temprana histamina y serotonina
33112 Edema de pata inducido por histamina
La histamina a traveacutes de sus receptores (H) distribuidos en el lecho vascular
produce vasodilatacioacuten e hiperpermeabilidad capilar Luego de ser administrada produce un
efecto vasodilatador de muy corta duracioacuten dando lugar a hiperemia enrojecimiento y
edema
331121 Procedimiento experimental
Los animales recibieron en la pata trasera izquierda una inyeccioacuten subplantar de 01
mL de histamina clorhidrato (Sigma Aldrich) al 01 en solucioacuten fisioloacutegica Una hora antes
a cada lote se le administroacute intraperitonealmente 05 mL de los preparados a ensayar y el
lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Mediante la utilizacioacuten de un
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
52
pletismoacutemetro se midioacute el volumen de edema a los 15 30 y 60 min despueacutes de la
administracioacuten de histamina (Rotelli 2004)
33113 Edema de pata inducido por serotonina
En la inflamacioacuten aguda la serotonina (o 5-HT) produce vasodilatacioacuten e
hiperpermeabilidad vascular aunque con menor potencia que la histamina
331131 Procedimiento experimental
Cada animal recibioacute en su pata trasera izquierda una inyeccioacuten subplantar de 01 mL
de serotonina clorhidrato (Sigma Aldrich) al 001 en solucioacuten fisioloacutegica Una hora antes
cada lote recibioacute intraperitonealmente 05 mL de los preparados a ensayar y el lote control
recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Mediante la utilizacioacuten de un pletismoacutemetro se
midioacute el volumen de edema a los 30 60 y 120 minutos posteriores a la administracioacuten de la
serotonina (Rotelli 2004)
33114 Equipamiento medidas y caacutelculo del volumen de edema
Las medidas del volumen de las patas traseras fueron realizadas mediante el uso de
un pletismoacutemetro (Ugo Basile 7140) que consiste en una celda conteniendo liacutequido en la
cual se sumerge la pata y un transductor que transforma el volumen de liacutequido desplazado
en una sentildeal eleacutectrica la cual se lee como volumen de la pata con una precisioacuten de 001
mL
La celda estaacute constituida por dos tubos interconectados en uno de los cuales se
sumerge la pata y el desplazamiento de agua producido genera un cambio en el nivel del
liacutequido en el segundo tubo donde se encuentra el transductor Este uacuteltimo consiste en dos
pares de electrodos de Pt-Ir Un par de electrodos (electrodo de nivel) mide la conductancia
y la conductividad del liacutequido Por estar los electrodos parcialmente sumergidos la
conductancia es proporcional al nivel del liacutequido y por lo tanto al volumen de la pata Un
segundo par de electrodos (electrodos de compensacioacuten) por estar totalmente sumergidos
soacutelo son sensibles a la conductividad y a traveacutes de un circuito electroacutenico corrigen la lectura
del electrodo de nivel de manera que la sentildeal resultante es proporcional a la conductancia y
por tanto al volumen sumergido El liacutequido contenido en la celda es una solucioacuten de NaCl al
5 conteniendo un agente tensioactivo (proporcionado por el fabricante) que minimiza el
menisco de lectura12
Ambas patas traseras fueron marcadas con una fibra indeleble por encima del
maleacuteolo lateral y cada una fue sumergida hasta hacer coincidir la marca con el menisco del
liacutequido momento en el cual se registroacute la medida del volumen Cada volumen fue medido
12
httpwwwugobasilecomcataloguecategorypain_and_inflammationproduct37140_plethysmometerhtml
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
53
por triplicado en todos los tiempos de medida El volumen de edema fue calculado por la
resta de los voluacutemenes promedio de ambas patas
3312 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma
Meier et al (1950) demostraron que el implante de algodones esteacuteriles en ratas
produciacutean granulomas de cuerpo extrantildeo caracterizados por tejido conectivo no
diferenciado ceacutelulas gigantes e infiltracioacuten de fluido Despueacutes de varios diacuteas el incremento
del peso del pellet implantado puede ser medido constituyendo una medida del tejido
granulomatoso y por lo tanto de la respuesta inflamatoria (Vogel 2002) Este meacutetodo ha
demostrado ser uacutetil para la demostracioacuten de la actividad farmacoloacutegica de los esteroides
como antiinflamatorios (Bailey et al 1982)
El desarrollo del edema implica distintos eventos Tempranamente en la vecindad
del algodoacuten se producen sustancias quimiotaacutecticas para neutroacutefilos y monocitos Durante los
primeros 5 diacuteas despueacutes de la implantacioacuten se demostroacute la continua acumulacioacuten de ceacutelulas
polimorfonucleares (PMNs) principalmente neutroacutefilos que penetraban al algodoacuten desde la
periferia Entre los diacuteas 5 y 7 los estudios histoloacutegicos mostraron que la amplia
vascularizacioacuten se llevaba a cabo con la formacioacuten de una caacutepsula fibrosa junto con una
infiltracioacuten masiva de la caacutepsula por las ceacutelulas mononucleares El aumento en el peso del
granuloma resulta significativo recieacuten a partir del diacutea 5 (Bailey et al 1982)
33121 Procedimiento experimental
Ratas hembra fueron anestesiadas por inyeccioacuten intraperitoneal de una mezcla
conteniendo 75 mgkg de ketamina clorhidrato (Holliday Scott SA) y 12 mgkg de xilacina
clorhidrato (Richmond Laboratories Vet Pharma) El granuloma fue inducido por el implante
subcutaacuteneo de un pellet de algodoacuten esteacuteril (50 mg) en el aacuterea dorsal Un diacutea despueacutes del
implante los animales fueron divididos en lotes de 6 animales e inyectados
intraperitonealmente (05 mL) con los preparados a ensayar Como control positivo se usoacute
un lote administrado con dexametasona fosfato soacutedico (adquirida a Norgreen y a Klonal) en
tanto que el lote control recibioacute buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 La administracioacuten fue
repetida diariamente durante los 5 diacuteas siguientes El 7mo diacutea las ratas fueron pesadas y
luego de sacrificarlas por dislocacioacuten cervical se les extrajo el granuloma el timo y el bazo
los cuales tambieacuten fueron pesados El aumento en el peso del algodoacuten introducido permitioacute
cuantificar el tejido inflamatorio (granulomatoso) depositado en el algodoacuten (Meier et al
1950)
3313 Caacutelculo del efecto antiinflamatorio y anaacutelisis estadiacutestico
Los datos obtenidos se analizaron estadiacutesticamente mediante ANOVA con posterior
comparacioacuten por las pruebas de Tukey o Dunnett El grado de significancia de las
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
54
diferencias entre los lotes fue evaluado con el paraacutemetro p consideraacutendose
estadiacutesticamente significativo un p lt 005 () Para el procesamiento de los datos se empleoacute
el programa GraphPad Prism Version 500 En los graacuteficos y en las tablas los resultados se
expresan como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de la media (SEM) En todos los casos
salvo excepciones que son especificadas el nuacutemero de reacuteplicas por experimento (n) fue = 6
Los porcentajes de inhibicioacuten de la inflamacioacuten como una medida de la accioacuten
antiinflamatoria fueron calculados con la siguiente foacutermula
inhibicioacuten = (1 - VT VC) x 100
siendo VC la medida promedio para el lote control (volumen para los modelos de edema de
pata de rata masa para el test del granuloma) y VT la medida promedio para el lote que fue
tratado con la droga en estudio La misma foacutermula fue usada para calcular los porcentajes
de reduccioacuten de las masas del timo y del bazo
332 Animales
En todos los ensayos de inflamacioacuten fueron empleadas ratas Wistar de ambos sexos
proporcionadas por el bioterio de la Universidad Nacional de San Luis En el laboratorio
fueron pesadas y distribuidas en lotes de 6 dejadas en jaulas y abastecidas con alimento y
agua ad libitum durante el periacuteodo de los ensayos Para los modelos de inflamacioacuten aguda
se emplearon animales de entre 170 y 220 g y luego de los ensayos fueron sacrificados
mediante una corriente de CO2 Los animales usados para los ensayos de inflamacioacuten
croacutenica pesaron entre 90 y 140 g y fueron sacrificados mediante dislocacioacuten cervical
333 Dosis
Las dosis de Bh Bb y Pm fueron preparadas resuspendiendo los liofilizados en agua
esteacuteril mientras que para preparar las dosis de bromelina se resuspendioacute el polvo comercial
en buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6 Todas las soluciones fueron preparadas en el
momento de administrarlas
334 Material vegetal ensayado
En la Tabla 32 se presentan los valores de actividad caseinoliacutetica y contenido
proteico por mg de liofilizado (UCasmg y μg proteiacutenamg respectivamente) asiacute como la
actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos parcialmente purificados obtenidos
por precipitacioacuten etanoacutelica a partir de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) Pseudananas
macrodontes (Pm) y Bromelia balansae (Bb) Debido a que se obtuvieron varios extractos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
55
para cada material vegetal (Bh1-5 Bb1-4 y Pm1-4) esto se indica en cada una de las tablas
en que se exponen los resultados obtenidos para cada experimento
Liofilizados UCasmg liofilizado μg proteiacutenamg liofilizado UCasmg proteiacutena
Bh1 0177 plusmn 0004dagger 18 plusmn 2
dagger 98
Bh2 0173 plusmn 0042dagger 21 plusmn 3
dagger 82
Bh3 019 plusmn 003dagger 18 plusmn 2
dagger 106
Bh4 020 plusmn 002dagger 21 plusmn 2
dagger 97
Bh5 020 plusmn 002 19 plusmn 2 9
Bh (Promedio total plusmn DE) 019 plusmn 002 20 plusmn 2 10 plusmn 1
Bb1 0161 plusmn 0006dagger 9 plusmn 1
dagger 17
Bb2 0164 plusmn 003dagger 9 plusmn 1
dagger 17
Bb3 0135 plusmn 0009dagger 13 plusmn 1
dagger 104
Bb4 017 plusmn 001 14 plusmn 1 12
Bb (Promedio total plusmn DE) 016 plusmn 002 11 plusmn 3 14plusmn 4
Pm1 017 plusmn 002 29 plusmn 4 59
Pm2 0187 plusmn 0009 30 plusmn 3 6
Pm3 025plusmn 003dagger 32 plusmn 4
dagger 9
Pm4 0125 plusmn 0013 25 plusmn 2 5
Pm (Promedio total plusmn DE) 018 plusmn 005 29 plusmn 3 6 plusmn 2
Bromelina (Sigma Aldrich) 063 plusmn 006 200 plusmn 20 32 plusmn 05
Tabla 32 Actividad caseinoliacutetica contenido proteico y actividad especiacutefica de los extractos parcialmente
purificados Media plusmn DE daggerError calculado como [Xmaacuteximo-Xmiacutenimo]2 siendo Xmaacuteximo y Xmiacutenimo valores promedios (n =
3) maacuteximo y miacutenimo respectivamente obtenidos de dos mediciones independientes UCas unidades
caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
56
34 Resultados y Discusioacuten
341 Modelos de inflamacioacuten aguda
3411 Edema de pata de rata inducido por carragenina
34111 Bromelia hieronymi
En un trabajo previo (Boeris et al 2004) se encontroacute que en el modelo de edema de
pata de ratoacuten inducido por carragenina una dosis de 50 mgkg de un extracto parcialmente
purificado obtenido de frutos de Bromelia hieronymi presentaba efecto antiinflamatorio Esa
dosis fue evaluada en ratas como una primera aproximacioacuten a la determinacioacuten de una dosis
efectiva En la Tabla 33 se muestran los voluacutemenes de edema promedio y los porcentajes
de inhibicioacuten respecto al lote control medidos a 1 3 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina
de lotes tratados con 50 mgkg de Bh1 y con 50 mgkg de bromelina
Tabla 33 Efecto de Bh1 y bromelina en edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Tanto Bh como bromelina inhibieron significativamente la formacioacuten de edema en
alguno de los tiempos de medida Mientras Bh mostroacute actividad antiinflamatoria a las 3 h tal
como fue reportado (Boeris et al 2004) bromelina lo hizo a las 5 y 7 h post inyeccioacuten de
carragenina
A fin de corroborar si al aumentar la dosis de Bh se lograba efecto antiinflamatorio en
los otros tiempos de medida se ensayaron dosis de 100 y 200 mgkg Ademaacutes puesto que
la hipoacutetesis de partida fue que la actividad proteoliacutetica podriacutea ser la responsable de la accioacuten
antiinflamatoria de los extractos se tuvieron en cuenta las UCaskg administradas De la
Tabla 32 puede deducirse que una dosis de 200 mgkg de Bh1 equivale a un promedio de
35 UCaskg Con fines comparativos la dosis de bromelina se llevoacute a 55 mgkg (equivalente
a 35 UCaskg)
Tiempo
(h)
Control Bh1
50 mgkg Bromelina 50 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 025plusmn002 020plusmn002 20c 029plusmn007 -14c
3 052plusmn002 023plusmn003 56a 03plusmn01 33ca
5 11plusmn01 058plusmn009 45ca 04plusmn02 60a
7 127plusmn005 114plusmn006 10c 05plusmn02 60a
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
57
En los resultados expuestos en la Tabla 34 puede observarse que Bh mostroacute un
efecto antiinflamatorio significativo desde la primera hora en la cual inhibioacute la formacioacuten de
edema con una eficacia de alrededor del 35 alcanzando el maacuteximo valor a las 5 h con un
porcentaje de inhibicioacuten significativamente similar al de bromelina e indometacina (asymp 75)
Mientras que los porcentajes de inhibicioacuten de 100 y 200 mgkg de Bh fueron
significativamente equivalentes a los de la bromelina desde la primera hora hasta las 5 h a
las 7 h soacutelo la dosis de 200 mgkg mantuvo un efecto significativamente similar al de
bromelina (asymp 70) Dado que 55 mgkg de bromelina y 200 mgkg de Bh son equivalentes
en actividad proteoliacutetica (35-36 UCaskg) los resultados de la Tabla 34 estaacuten acordes con
la hipoacutetesis de que la actividad proteoliacutetica seriacutea responsable de la actividad antiinflamatoria
de los preparados enzimaacuteticos Para fortalecer esta hipoacutetesis se proboacute el efecto que tiene la
inhibicioacuten con E-64 de las proteasas cisteiacutenicas sobre la accioacuten antiinflamatoria exhibida por
Bh y bromelina
Tabla 34 Efecto de diferentes dosis de Bh1 bromelina e indometacina en edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
341111 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina
En la Tabla 35 se muestran los voluacutemenes de edema y los porcentajes de inhibicioacuten
respecto al lote control de lotes tratados con 150 mgkg de Bh4 y 150 mgkg de Bh4
incubado con E-64 (Bh4E-64) 50 mgkg de bromelina y 50 mgkg de bromelina incubada
con E-64 (BromelinaE-64) y 025 μmolkg de E-64 (equivalente a los μmoles contenidos en
las dosis de Bh4E-64 y bromelinaE-64)
Tiempo
(h)
Control
Bh1
50 mgkg
90plusmn02UCaskg
Bh1
100 mgkg
180plusmn04UCaskg
Bh1
200 mgkg
354plusmn08UCaskg
Bromelina
55 mgkg
35plusmn3UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 034plusmn001 024plusmn002 29bc 021plusmn003 38b 022plusmn002 35b 031plusmn005 9bc 030plusmn001 12bc
3 059plusmn006 052plusmn009 12c 027plusmn003 54ba 025plusmn002 58b
027plusmn005 54ba 050plusmn005 15ac
5 12plusmn01 07plusmn01 44a 029plusmn009 75b 026plusmn001 78b 028plusmn003 76b 040plusmn004 66ba
7 124plusmn009 09plusmn01 27ac 08plusmn01 40ad 038plusmn006 69b 032plusmn006 74b 053plusmn004 57bd
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
58
Tiempo
(h)
Control
Bh4
150 mgkg
30plusmn3 UCaskg
Bh4E-64
150 mgkg
09plusmn01 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
BromelinaE-64
50 mgkg
4plusmn2 UCaskg
E-64
025 μmolKg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 042plusmn003 022plusmn002 48b 026plusmn004 38b 022plusmn003 48b 028plusmn002 33ba 040plusmn003 5ac
3 067plusmn007 020plusmn003 70b 04plusmn01 33cb 018plusmn002 73b
05plusmn01 25c 062plusmn006 75c
5 115plusmn008 033plusmn005 71b 10plusmn02 13c 020plusmn001 83b 09plusmn02 20c 103plusmn007 10c
7 144plusmn009 09plusmn02 34a 125plusmn006 13ac 028plusmn007 80b 13plusmn02 9c 120plusmn007 17c
Tabla 35 Efecto del tratamiento con E-64 de Bh y bromelina sobre la accioacuten inhibitoria de edema de pata de rata inducido por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Puede observarse que Bh y bromelina tuvieron efecto antiinflamatorio a lo largo de
todo el ensayo mientras que BhE-64 y bromelinaE-64 soacutelo mostraron efecto significativo
en la primera h post inyeccioacuten de carragenina Auacuten cuando durante todo el ensayo los
porcentajes de inhibicioacuten de Bh fueron maacutes altos que los de BhE-64 soacutelo a las 5 h lo fue
estadiacutesticamente significativo (71 gt 13 plt005) Por su parte los porcentajes de
inhibicioacuten de bromelina fueron significativamente superiores a los de bromelinaE-64 a las 3
5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina E-64 no mostroacute efecto antiinflamatorio en ninguacuten
tiempo de medida
Dado que al eliminar la actividad proteoliacutetica de Bh y bromelina se observoacute una
peacuterdida de actividad antiinflamatoria desde las 3 h siendo maacutes evidente en los tiempos en
que Bh y bromelina muestran los maacuteximos porcentajes de inhibicioacuten (a las 5 h para Bh y a
las 5 y 7 h para bromelina) se podriacutea suponer que las cisteiacutenendopeptidasas seriacutean las
responsables de la actividad antiinflamatoria medida para Bh y bromelina a partir de las 3 h
post inyeccioacuten de carragenina Por otro lado teniendo en cuenta el rol secuencial de los
distintos mediadores de la inflamacioacuten descriptos para este modelo tambieacuten se podriacutea
suponer que las cisteiacutenendopeptidasas de Bh y bromelina inhibiriacutean la infiltracioacutenactividad
de neutroacutefilos o la siacutentesisaccioacuten de NO y PGs los cuales alcanzan picos de produccioacuten
entre las 3 y las 6 h post inyeccioacuten de carragenina (Salvemini et al 1996) Tanto la
inhibicioacuten de la migracioacuten de neutroacutefilos como de la produccioacuten de PGs y NO ya han sido
demostradas para la bromelina en otros modelos (Gaspani et al 2002 Wen et al 2006
Fitzhugh et al 2008 Kalra et al 2008 Bhui et al 2012)
Los bajos porcentajes de inhibicioacuten medidos en la primera hora post inyeccioacuten de
carragenina respecto a los de las siguientes horas para Bh (Tablas 33 34 y 35) y para
bromelina (Tabla 35) estariacutean indicando que Bh y bromelina tienen un bajo efecto inhibitorio
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
59
sobre los mediadores de la primera fase del modelo Aunque otra explicacioacuten posible es que
durante la primera hora auacuten no se haya alcanzado la concentracioacuten efectiva de los
compuestos activos en el sitio de accioacuten Sea cual fuere la causa de la informacioacuten
aportada en la Tabla 35 se puede concluir que los efectos antiinflamatorios de Bh y
bromelina en la primera hora no dependeriacutean de la actividad proteoliacutetica de las
cisteinendopeptidasas
34112 Pseudananas macrodontes
Los resultados obtenidos para Bh y bromelina fueron tenidos en cuenta para
establecer las dosis a ensayar de los extractos obtenidos a partir de frutos de Pseudananas
macrodontes (Pm) En la Tabla 36 se presentan los voluacutemenes y porcentajes de inhibicioacuten
de edema inducida por carragenina en el modelo de pata de rata a distintas horas para 90 y
180 mgkg de Pm1 (equivalentes a 15 y asymp 30 UCaskg respectivamente) 50 mgkg de
bromelina y 10 mgkg de indometacina
Tiempo
(h)
Control
Pm1
90 mgkg
15plusmn2 UCaskg
Pm1
180 mgkg
31plusmn4 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 027plusmn003 019plusmn002 28bc 012plusmn002 55b 018plusmn002 33bc 024plusmn002 11c
3 064plusmn007 035plusmn004 45ba 019plusmn002 70b 029plusmn003 55b
055plusmn006 14ca
5 114plusmn008 06plusmn02 46b 023plusmn002 80b 028plusmn002 75b 038plusmn003 67b
7 13plusmn01 08plusmn02 37a 020plusmn002 85b 045plusmn004 65d 055plusmn004 58ad
Tabla 36 Efecto de diferentes dosis de Pm1 bromelina e indometacina en edema de pata de rata inducido por
carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey p lt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Puede observarse que ambas dosis de Pm tuvieron efecto antiinflamatorio
significativo alcanzando los maacuteximos porcentajes de inhibicioacuten de edema entre las 3 y las 5
h para la menor dosis y entre las 5 y las 7 h para la mayor dosis Por lo tanto Pm es maacutes
efectivo en la fase tardiacutea propuesta para el modelo de edema inducido por carragenina
Si bien en este ensayo bromelina no alcanzoacute los porcentajes de inhibicioacuten medidos
en los anteriores experimentos (Tablas 34 y 35) puede verse que hasta las 5 h fueron
significativamente similares a los de Pm (180 mgkg) Teniendo en cuenta los valores de la
Tabla 32 se observa que la mayor dosis de Pm (180 mgkg) es equivalente en UCas (asymp 30
UCaskg) a las dosis probadas para bromelina y Bh4 (Tabla 35) mostrando los tres
preparados efectos similares Por otro lado los porcentajes de inhibicioacuten de la dosis de 90
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
60
mgkg de Pm (equivalente a 15 UCaskg) y de 100 mgkg de Bh1 (equivalente a 18
UCaskg) mostrados en la Tabla 34 son similares a excepcioacuten de los medidos a las 5 h
341121 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm
A fin de poner a prueba la hipoacutetesis de que la actividad proteoliacutetica es necesaria para
el efecto antiinflamatorio de Pm del mismo modo que para Bh y bromelina se midioacute el efecto
antiinflamatorio luego de inhibir las cisteiacutenendopeptidasas con E-64 (Tabla 37)
Tiempo
(h)
Control
Pm1
180 mgkg
31plusmn4 UCaskg
Pm1E-64
180 mgkg
04plusmn02 UCaskg
E-64
02 μmolkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 038plusmn003 017plusmn003 55b 028plusmn006 26ba 036plusmn003 5ca
3 060plusmn007 017plusmn002 72b 032plusmn006 47b 056plusmn006 7c
5 104plusmn008 021plusmn003 80b 066plusmn03 36cb 093plusmn007 11c
7 126plusmn01 021plusmn004 83a 09plusmn02 29b 108plusmn007 14cb
Tabla 37 Efecto del tratamiento con E-64 sobre el efecto antiinflamatorio de Pm en modelo de edema de pata
generado por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En la Tabla 37 se puede observar que los porcentajes de inhibicioacuten de Pm fueron
superiores a los de la misma dosis de Pm tratada con E-64 (PmE-64) llegando a ser poco
maacutes del doble a las 1 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina lo cual estariacutea indicando que
las cisteiacutenendopeptidasas contribuyen al efecto antiinflamatorio de Pm No obstante esta
contribucioacuten no parece ser la uacutenica puesto que tanto a las 3 como a las 7 h PmE-64 mostroacute
efecto antiinflamatorio significativo sugiriendo que otros componentes presentes en Pm
estariacutean actuando principalmente sobre la fase tardiacutea
Ante este resultado se hicieron ensayos posteriores a fin de dilucidar el posible
componente con actividad antiinflamatoria de Pm Si bien las UCasmg de PmE-64 fueron
0002 plusmn 0001 y por tanto la dosis de 180 mgkg equivalioacute a 04 UCaskg la primera
posibilidad que se evaluoacute es que en el caso de PmE-64 las proteasas no hubieran sido
completamente inhibidas En ensayos posteriores se evaluoacute la actividad fibrinoliacutetica (mm2)
de Pm1 mediante el ensayo de la placa de fibrina13 por tratarse de un meacutetodo muy sensible
(Jespersen amp Astrup 1983) y pudo determinarse que la dosis de Pm1 conteniacutea 658 (plusmn08)
x103 mm2kg mientras que la dosis de Pm1E-64 conteniacutea 206 (plusmn04) x103 mm2kg un 31
de la actividad fibrinoliacutetica de Pm1 Por lo tanto no puede descartase la posibilidad de que
13
Ver 443 (Capiacutetulo Efecto anticoagulante fibrinogenoliacutetico y fibrinoliacutetico)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
61
las proteasas sean las responsables de la actividad antiinflamatoria de PmE-64 De todos
modos dado que al inhibir las proteasas cisteiacutenicas de Pm (llevando la dosis a 04 UCaskg)
los porcentajes de inhibicioacuten de edema disminuyen aproximadamente un 50 respecto a los
de la dosis de 31 UCaskg de Pm podriacutea atribuirse actividad antiinflamatoria a las proteasas
cisteiacutenicas de Pm Dilucidar el grado de participacioacuten de las mismas en el proceso requeriraacute
ensayos ulteriores
34113 Bromelia balansae
Siguiendo el mismo razonamiento que para Pm las dosis a ensayar de los extractos
parcialmente purificados obtenidos a partir de frutos de B balansae (Bb) fueron definidas de
manera que contuvieran la misma actividad proteoliacutetica que las dosis efectivas de bromelina
y Bh (entre 10 y 35 UCaskg) En un primer ensayo se proboacute una dosis intermedia 120
mgkg de Bb1 equivalente a aproximadamente 20 UCaskg (Tabla 38)
Tiempo
(h)
Control
Bb1
120 mgkg
19plusmn1 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Indometacina
10 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 027plusmn003 022plusmn004 19c 018plusmn002 33c 024plusmn002 11c
3 064plusmn007 03plusmn01 53b 029plusmn003 55b 055plusmn006 14cb
5 114plusmn008 05plusmn02 56b 028plusmn002 75b 038plusmn003 67b
7 13plusmn01 06plusmn02 51b 045plusmn004 65b 055plusmn004 58b
Tabla 38 Efecto de Bb bromelina e indometacina sobre el edema de pata generado por carragenina Los
voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n=6 excepto n=5 para el lote Bb1 a las 5 y 7 h) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En este caso entre las 3 y las 5 h una rata del lote tratado con Bb murioacute por lo que a
las 5 y 7 h el valor de n fue igual a 5 Como puede verse en la Tabla 38 Bb mostroacute
porcentajes de inhibicioacuten significativos a las 3 5 y 7 h post inyeccioacuten de carragenina los
cuales no se diferenciaron estadiacutesticamente de los de bromelina asiacute como tampoco de los
de indometacina a las 5 y 7 h A la h post inyeccioacuten de carragenina ninguno de los
compuestos ensayados mostroacute porcentajes de inhibicioacuten significativos
341131 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb
En otro experimento (Tabla 39) se probaron dos dosis de Bb2 100 y 200 mgkg
equivalentes aproximadamente a 15 y 30 UCaskg respectivamente asiacute como 200 mgkg
de Bb2 tratado con E-64 (Bb2E-64)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
62
La dosis de 200 mgkg de Bb2 fue antiinflamatoria soacutelo a las 7 h post inyeccioacuten de
carragenina mostrando un porcentaje de inhibicioacuten significativamente similar al de
diclofenac soacutedico (50 mgkg) La misma dosis de Bb tratada con E-64 (Bb2E-64) no mostroacute
efecto antiinflamatorio aunque no se detectaron diferencias significativas entre los
porcentajes de inhibicioacuten de Bb2 y Bb2E-64 Las dosis de 100 mgkg de Bb2 y E-64 (025
μmolkg) no mostraron efecto significativo en ninguacuten tiempo de medida
Tabla 39 Efecto de diferentes dosis de Bb y BbE-64 sobre el edema de pata generado por carragenina Los voluacutemenes de edema son expresados como la media plusmn SEM (n = 6 excepto n=5 para el lote Bb2E-64 a partir de las 5 h) Test de Tukey plt 005 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Al comparar los resultados de la Tabla 39 con los de la Tabla 38 puede observarse
que si bien el efecto antiinflamatorio se sigue manifestando en la fase tardiacutea propuesta para
este modelo la dosis de 200 mgkg (33 plusmn 6 UCaskg) de Bb2 fue menos efectiva que la de
120 mgkg (19 plusmn 1 UCaskg) de Bb1 lo cual no seriacutea lo esperado si tenemos en cuenta la
actividad proteoliacutetica de ambas Sin embargo el tratamiento con el inhibidor E-64 produjo
una peacuterdida del efecto antiinflamatorio de Bb2 concordante con la hipoacutetesis de que la
actividad de las proteasas presentes en Bb es la causante de tal efecto Una caracteriacutestica
comuacuten de los valores de las Tablas 38 y 39 es la alta dispersioacuten de los voluacutemenes medidos
para los lotes tratados con Bb hecho que no se observa en los valores de los lotes
controles asiacute como tampoco en lotes tratados con diclofenac soacutedico e indometacina
Por otro lado es necesario mencionar que otros ensayos con Bb presentaron cierta
dificultad en relacioacuten a una posible toxicidad En un ensayo el 50 de los animales que
recibieron una dosis de Bb (Bb3 Tabla 32) equivalente a 35 UCaskg murieron entre las 3 y
las 6 h post inyeccioacuten de carragenina En otro ensayo en que se probaron dosis
equivalentes a 10 20 y 30 UCaskg varios animales de los tres lotes tratados mostraron
signos tiacutepicos de toxicidad (pasividad motora alteracioacuten respiratoria ereccioacuten pilomotora y
extremidades cianoacuteticas) a partir de la primera hora post inyeccioacuten de carragenina y entre
las 4 y 5 h murieron Por lo expuesto no deberiacutea descartarse la posibilidad de que Bb
Tiempo
(h)
Control
Bb2
100 mgkg
16plusmn3 UCaskg
Bb2
200 mgkg
33plusmn6 UCaskg
Bb2E-64
200 mgkg
05plusmn01 UCaskg
E-64
025 μmolkg
Diclofenac soacutedico
50 mgkg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
1 033plusmn003 028plusmn004 15c 033plusmn008 0c 043plusmn005 -30c 031plusmn007 6c 024plusmn003 27c
3 07plusmn01 09plusmn02 -19c 05plusmn01 32c 09plusmn01 -32c 06plusmn02 14c 035plusmn005 52c
5 14plusmn01 11plusmn03 24bc 08plusmn03 48bc 11plusmn02 23bc 09plusmn02 34bc 044plusmn007 69b
7 15plusmn01 11plusmn02 30bc 08plusmn02 48b 099plusmn007 35bc 10plusmn02 33bc 073plusmn008 52b
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
63
presente cierta toxicidad a las dosis ensayadas hecho que deberaacute comprobarse mediante
futuros ensayos de toxicidad
Sin dejar de lado las dificultades sentildealadas de los resultados obtenidos se puede
concluir que Bb muestra efecto antiinflamatorio significativo soacutelo sobre la fase tardiacutea del
modelo de edema de pata (Di Rosa et al 1971 Salvemini et al 1996) mostrando menores
porcentajes de inhibicioacuten que dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica de Bh Pm y
bromelina Ademaacutes el efecto antiinflamatorio de Bb podriacutea estar relacionado con la actividad
proteoliacutetica de sus cisteiacutenendopeptidasas
3412 Otros modelos de inflamacioacuten aguda
Como ya se ha mencionado la primera fase (0-1 h) del desarrollo de edema de pata
inducido por carragenina es mediada principalmente por histamina y serotonina (Di Rosa et
al 1971 Salvemini et al 1996) Para corroborar si el efecto inhibitorio de edema observado
en la primera h para Bh Pm y bromelina se debiacutea a un efecto inhibitorio sobre alguno de
estos mediadores se evaluaron las dosis efectivas de dichos preparados a esa h en los
modelos de edema de pata inducidos por histamina y por serotonina
34121 Edema de pata inducido por histamina en ratas
En la Tabla 310 se consignan los voluacutemenes de edema y los respectivos porcentajes
de inhibicioacuten de edema a los 15 30 y 60 min post inyeccioacuten de histamina Se evaluaron
dosis de Bh Pm y bromelina cuyos contenidos en UCas fueran equivalentes a las de las
dosis que en el modelo de edema inducido por carragenina fueron efectivas en la primera
hora esto es 200 mgkg de Bh2 (equivalente a 35 plusmn 8 UCaskg) 170 mgkg de Pm2
(equivalente a 32 plusmn 2 UCaskg) y 55 mgkg de bromelina (equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg)
Tiempo
(min)
Control
Bh2
200 mgkg
35plusmn8 UCaskg
Pm2
170 mgkg
32plusmn2 UCaskg
Bromelina
55 mgkg
35plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
15 039plusmn003 046plusmn003 -18c 038plusmn003 25c 045plusmn002 -15c
30 034plusmn003 041plusmn003 -21c 034plusmn003 0c 044plusmn003 -30c
60 032plusmn003 033plusmn004 -3c 031plusmn003 3c 042plusmn004 -31c
Tabla 310 Efecto de Bh Pm y bromelina sobre el edema inducido histamina Los voluacutemenes de edema son
expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
64
Puede observarse que ninguno de los compuestos probados fue efectivo a las dosis
probadas Por tanto es liacutecito suponer que los efectos antiinflamatorios medidos para Bh Pm
y bromelina en la primera hora post inyeccioacuten de carragenina no se deben a la inhibicioacuten de
la accioacuten de la histamina
La bibliografiacutea en relacioacuten al efecto de la bromelina sobre la inflamacioacuten mediada por
histamina es escasa Seguacuten Kumakura et al (1988) dosis crecientes de bromelina
administradas intravenosamente aumentaban el exudado plasmaacutetico inducido por histamina
a los 30 min en el modelo de ldquobolsa de airerdquo en ratas
34122 Edema de pata inducido por serotonina en ratas
341221 Bromelia hieronymi
En la Tabla 311 se exponen los voluacutemenes de edema y los porcentajes de inhibicioacuten
de edema a los 30 60 y 120 min post inyeccioacuten de serotonina para 100 y 200 mgkg de Bh2
(equivalentes a 17 plusmn 4 y 35 plusmn 8 UCaskg respectivamente) y para 55 mgkg de bromelina
(equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg)
Tiempo
(min)
Control
Bh2
100 mgkg
17plusmn4 UCaskg
Bh2
200 mgkg
35plusmn8 UCaskg
Bromelina
55 mgKg
35plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
30 122plusmn005 118plusmn005 33c 08plusmn01 37a 060plusmn009 51a
60 109plusmn004 116plusmn005 -6c 08plusmn01 28a
063plusmn008 42a
120 083plusmn004 070plusmn003 16ac 066plusmn007 20ac 057plusmn007 31a
Tabla 311 Efecto de Bh2 y bromelina sobre el edema inducido por serotonina Los voluacutemenes de edema son
expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
El efecto medido para bromelina es concordante con el reportado por Netti et al
(1972) quienes midieron un porcentaje de inhibicioacuten de asymp 40 a los 60 min post inyeccioacuten
de serotonina en ratas que recibieron por viacutea oral bromelina (100 mganimal) 4 h previas a la
inyeccioacuten de serotonina
Bh exhibioacute porcentajes de inhibicioacuten significativos a los 30 y 60 min soacutelo con la dosis
de 200 mgkg Si bien dichos valores fueron inferiores a los de la bromelina no fueron
significativamente diferentes Estos resultados estariacutean indicando que la inhibicioacuten que
ejercen Bh y bromelina sobre el edema inducido por carragenina estariacutea al menos en parte
mediada por un efecto inhibidor de la accioacuten de la serotonina
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
65
341222 Pseudananas macrodontes
En la Tabla 312 se muestra el efecto de una dosis de Pm2 (170 mgkg) equivalente
a 32 plusmn 2 UCaskg sobre el edema de pata inducido por serotonina Pm mostroacute un porcentaje
de inhibicioacuten significativo soacutelo a los 30 min Por lo tanto asiacute como en el caso de Bh y
bromelina parte del efecto antiinflamatorio evaluado a la hora post inyeccioacuten de carragenina
se podriacutea deber a un efecto inhibitorio sobre la accioacuten de la serotonina
Tiempo
(min)
Control
Pm2
170 mgkg
32plusmn2 UCaskg
Bromelina
50 mgkg
32plusmn3 UCaskg
Edema
(mL)
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
Edema
(mL)
Inhibicioacuten
()
30 105plusmn007 08plusmn01 29a 052plusmn003 50a
60 087plusmn007 07plusmn01 22ca 050plusmn004 42a
120 067plusmn006 06plusmn01 20c 046plusmn004 31c
Tabla 312 Efecto de Pm2 sobre el edema inducido por serotonina Los voluacutemenes de edema son expresados
como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
342 Modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma
Como primera aproximacioacuten en el modelo de inflamacioacuten croacutenica se probaron las
dosis de los preparados que mostraron efecto antiinflamatorio sobre el edema de pata
inducido por carragenina
Como control positivo se utilizoacute dexametasona la cual posee entre otros efectos
adversos tiacutepicos de los glucocorticoides efectos inmunosupresor y cataboacutelico Con el
objetivo de comparar dichos efectos con los de los preparados proteoliacuteticos se calcularon
como una medida del efecto inmunosupresor los porcentajes de reduccioacuten de las masas del
timo y del bazo (Ben Rhouma amp Sakly 1994 Hori et al 1996) mientras que el efecto
cataboacutelico fue medido calculando la peacuterdida de masa corporal (se pesaron los animales
antes y despueacutes del tratamiento y la diferencia de peso corporal fue comparada con los
controles)
3421 Bromelia hieronymi
En la Tabla 313 se exponen los resultados obtenidos para 90 y 180 mgkg de Bh3
(equivalentes a 17 plusmn 3 y 34 plusmn 5 UCaskg respectivamente) 55 mgkg de bromelina
(equivalente a 35 plusmn 3 UCaskg) y dexametasona (3 mgkg) en el test del granuloma inducido
por pellet de algodoacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
66
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 054plusmn006 043plusmn002 078plusmn009
Bh3
(90 mgkg- 17plusmn3 UCaskg)
047plusmn002 13c 035plusmn002 18bc 09plusmn01 -9c
Bh3
(180 mgkg- 34plusmn5 UCaskg)
032plusmn001 41b 031plusmn002 28b 07plusmn01 7c
Bromelina
(55 mgkg- 35plusmn3 UCaskg )
036plusmn005 34b 031plusmn002 28b 077plusmn008 1c
Dexametasona (3 mgkg) 024plusmn001 55a 011plusmn002 74a 040plusmn004 49b
Tabla 313 Efecto de Bh3 bromelina y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de
algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
La dosis de 180 mgkg de Bh bromelina (55 mgkg) y dexametasona (3 mgkg)
resultaron antiinflamatorias Bh (180 mgkg) y bromelina mostraron porcentajes de inhibicioacuten
de granuloma significativamente similares pero ambos fueron significativamente inferiores al
de dexametasona En relacioacuten al efecto inmunosupresor mientras dexametasona causoacute
significativa reduccioacuten del peso de bazos y timos Bh (180 mgkg) y bromelina soacutelo redujeron
el peso de los timos mostrando porcentajes iguales (28) aunque significativamente
inferiores al de dexametasona (74) Por otra parte la dosis de 90 mgkg de Bh no fue
antiinflamatoria pero tampoco redujo los pesos de los bazos y los timos
En la Figura 31 se muestran los cambios de peso corporal
Figura 31 Efecto de Bh3 bromelina (Bro) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas
tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
-20
-10
0
10
20
30
b
b
a
cControl
Bh3 (173 UCaskg)
Bh3 (345 UCaskg)
Bro (353 UCaskg)
Dex (3 mgkg)
c
Ca
mb
io d
e p
es
o c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
67
Bh (180 mgkg) y bromelina no provocaron peacuterdida de masa corporal aun cuando la
ganancia en masa corporal (14 y 13 g respectivamente) fuera significativamente maacutes baja
que la del lote control (22 g) En cambio dexametasona provocoacute una significativa peacuterdida de
masa corporal (-14 g) respecto al control El lote tratado con la dosis de 90 mgkg de Bh no
mostroacute cambios respecto al lote control
Por lo tanto si bien Bh (180 mgkg) y bromelina (55 mgkg) fueron menos efectivas
que dexametasona (3 mgkg) para inhibir la formacioacuten del granuloma tambieacuten mostraron
menos efectos sobre bazos timos y masa corporal
Debido a la similitud en el contenido de UCas (asymp35 UCaskg) de las dosis de Bh (180
mgkg) y de bromelina (55 mgkg) que mostraron similares efectos en el test del granuloma
se proboacute si dichos efectos dependiacutean de la accioacuten de proteasas cisteiacutenicas
34211 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bh y bromelina en el test del
granuloma
A fin de determinar si la actividad proteoliacutetica de Bh y bromelina es causa de la
accioacuten antiinflamatoria evaluada en el test del granuloma se ensayaron Bh y bromelina con
y sin actividad proteoliacutetica (luego de inhibir con E-64) Los resultados se muestran en la
Tabla 314
Tabla 314 Efecto de Bh5 y bromelina con actividad proteoliacutetica y sin actividad proteoliacutetica (Bh5E-64 y bromelinaE-64) E-64 y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
En el caso de bromelina puede observarse que al inhibir sus cisteiacutenendopeptidasas
con E-64 pierde su efecto antiinflamatorio el porcentaje de inhibicioacuten cambia de 24 a -8
dejando de ser significativo Lo mismo sucede con el efecto reductor sobre el peso de los
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Control 036 plusmn 002 043 plusmn 003 053 plusmn 008
Bromelina
(55 mgkg- 35plusmn3 UCaskg )
0272 plusmn 0006 24a 033 plusmn 002 23a 08 plusmn 02 -42c
BromelinaE-64
(55 mgkg- 2plusmn3 UCaskg)
039 plusmn 004 -8c 046 plusmn 003 -7c
065 plusmn 009 -23c
Bh5
(180 mgkg- 36plusmn4 UCaskg)
039 plusmn 001 -8c 042 plusmn 001 2c
082 plusmn 02 -55c
Bh5E-64
(180 mgkg- 1plusmn2 UCaskg)
040 plusmn 003 -11c 040 plusmn 002 7ca
06 plusmn 01 -19c
E-64
(03 μmolkg)
039 plusmn 004 -8c 0421 plusmn 0009 2c
06 plusmn 01 -15c
Dexametasona (3 mgkg) 0230 plusmn 0006 36a 0042 plusmn 0003 90b 033 plusmn 008 38c
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
68
timos el porcentaje de reduccioacuten para bromelina es de 23 mientras que para
bromelinaE-64 es de -7 Por tanto las cisteiacutenendopeptidasas no soacutelo estariacutean actuando
como antiinflamatorias sino tambieacuten ejerciendo un leve efecto reductor sobre el peso de los
timos En este ensayo el porcentaje de reduccioacuten del peso de los timos provocado por
bromelina fue aproximadamente 14 del de dexametasona mientras que los porcentajes de
inhibicioacuten del granuloma de ambas fueron significativamente similares E-64 (03 μmolkg) no
tuvo efecto sobre los granulomas asiacute como tampoco sobre los pesos de los timos y los
bazos
Los resultados obtenidos para Bh no permiten sacar ninguna conclusioacuten respecto al
rol que tendriacutean sus cisteiacutenendopeptidasas como antiinflamatorias puesto que a diferencia
de los datos consignados en la Tabla 313 Bh no tuvo efecto inhibidor significativo de los
granulomas asiacute como tampoco efecto reductor de los timos ademaacutes de no encontrarse
diferencia significativa entre Bh y BhE-64 Los efectos de Bh y BhE-64 fueron ensayados
una vez maacutes pero no pudieron extraerse resultados concluyentes Una posible explicacioacuten a
la dificultad en la reproducibilidad de los resultados para Bh probablemente obedezca a la
poca sensibilidad que el test de granuloma inducido por algodoacuten tiene especialmente para
antiinflamatorios no esteroideos (Bailey et al 1982)
En relacioacuten al efecto sobre el peso corporal no se observaron diferencias
significativas respecto al control para bromelina y para bromelina inhibida con E-64 El E-64
produjo una ganancia de masa corporal significativamente mayor que la de los controles
Pero ninguno de los compuestos probados a excepcioacuten de dexametasona produjeron
peacuterdida de masa corporal (Figura 32)
Figura 32 Efecto de Bh5 bromelina (Bro) y Bh5 y bromelina inhibidas con E-64 (Bh5E-64 y BroE-64
respectivamente) E-64 y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas tratadas durante el ensayo del test del granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
-20
-10
0
10
20
30
Control
Dex (3 mgkg)
Bh5 (364 UCaskg)Bh5E-64(12 UCaskg)
Bro (353 UCaskg)
BroE-64(23 UCaskg)
E-64 (03 molkg)c
cd
a
b b
d
c
Cam
bio
de p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
69
3422 Pseudananas macrodontes y Bromelia balansae
En un mismo ensayo se probaron dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica (asymp30
UCaskg) de Pm y Bb cuyos efectos fueron comparados con los de bromelina (50 mgkg
equivalente a asymp30 UCaskg) y dexametasona (3 mgkg) Como en todos los ensayos los
lotes estuvieron conformados por 6 animales excepto en el caso de Pm donde los datos
provienen de 4 animales ya que dos de ellos murieron luego de la tercera y cuarta dosis
Puede observarse en la Tabla 315 que Pm y Bb mostraron porcentajes de inhibicioacuten del
granuloma similares a los de bromelina Los porcentajes de reduccioacuten del timo para Pm y Bb
fueron significativamente similares entre siacute y si bien mayores no se diferenciaron
significativamente de los de bromelina
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 054plusmn003 038plusmn003 071plusmn007
Pm3
(130 mgkg- 33plusmn4 UCaskg)
036plusmn002 33ab 020plusmn001 47b 08plusmn01 -8c
Bb 4
(180 mgkg- 31plusmn2 UCaskg)
041plusmn004 24a 021plusmn001 45b 052plusmn007 27cb
Bromelina
(50 mgkg- 32plusmn3 UCaskg)
036plusmn002 33ab 028plusmn002 26b 070plusmn007 1c
Dexametasona (3 mgkg) 024plusmn001 56b 010plusmn002 74a 036plusmn004 49b
Tabla 315 Efecto de Pm3 Bb4 bromelina y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y
sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n = 6 excepto para Pm n=4) Test de Tukey p lt 005 p lt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Los porcentajes de reduccioacuten de los timos de los preparados proteoliacuteticos fueron
significativamente menores al de dexametasona y a diferencia de eacutesta no mostraron efecto
reductor significativo sobre el peso de los bazos
En la Figura 33 pueden observarse los cambios en los pesos corporales de los
animales tratados Si bien los animales de los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos
no aumentaron de peso en la misma cantidad que los del lote control no padecieron peacuterdida
de masa corporal como siacute ocurrioacute con los del lote tratado con dexametasona
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
70
Figura 33 Efecto de Pm Bb bromelina (Bro) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de las ratas
tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6 excepto para Pm n=4) Test de Tukey p lt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
Los efectos de Pm y Bb sobre los distintos paraacutemetros evaluados en este modelo
fueron similares a los de Bh3 (Tabla 313) Sin embargo la muerte de dos animales del lote
tratado con Pm podriacutea estar indicando un efecto toacutexico del preparado
34221 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Bb en el test del granuloma
En la Tabla 316 se exponen los resultados obtenidos para 180 mgkg de Bb2
equivalente a 30 UCaskg y para 180 mgkg de Bb2 tratada con E-64 (Bb2E-64) Puede
observarse que Bb no mostroacute efecto inhibidor significativo sobre los granulomas y su
porcentaje de inhibicioacuten no se diferencioacute significativamente del de BbE-64 Tampoco se
observaron efectos significativos de Bb y BbE-64 sobre el peso de los timos
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Peso (g) Reduccioacuten ()
Control 050plusmn003 036plusmn002 068plusmn003
Bb 2 (180 mgkg
30plusmn5 UCaskg)
052plusmn008 -4c 036plusmn003 0c 098plusmn005 -44a
Bb2E-64 (180 mgkg
006plusmn001 UCaskg)
039plusmn005 22c 028plusmn003 22c 095plusmn008 -40a
Dexametasona (3 mgkg) 0230plusmn0005 54a 0050plusmn0004 86a 034plusmn001 50b
Tabla 316 Efecto de Bb2 con actividad proteoliacutetica y sin actividad proteoliacutetica (Bb2E-64) y dexametasona sobre el granuloma inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey p lt 001 p lt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a p lt 005
-20
-10
0
10
20
30
ab
b
a
d
Control
Pm3 (334 UCaskg)
Bb4 (312 UCaskg)
Bro (323 UCaskg)Dex (3 mgkg)
c
Ca
mb
io d
e p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
71
A diferencia de lo observado para los preparados en los anteriores ensayos del test
del granuloma los bazos aumentaron significativamente de peso Este efecto fue
independiente de la actividad proteoliacutetica de Bb
En la Figura 34 se muestran los efectos de Bb y BbE-64 sobre los pesos corporales
de los animales Si bien los animales del lote tratado con Bb proteoliacuteticamente activo no
aumentaron de peso en la misma cantidad que los del lote control no mostraron peacuterdida de
masa corporal como siacute ocurrioacute con los del lote tratado con dexametasona
Siendo que la dosis de Bb2 tiene el mismo contenido de UCas (30) que la dosis de
Bb4 que siacute mostroacute efecto antiinflamatorio (Tabla 315) pudo existir alguacuten otro factor que no
se ha controlado y afectoacute a las medidas conduciendo a los resultados contradictorios de las
Tablas 315 y 316 Como se mencionoacute anteriormente la falta de reproducibilidad podriacutea
deberse a la baja sensibilidad del test del granuloma para compuestos no esteroideos
(Bailey et al 1982) Por otro lado Bb2 es el mismo preparado que mostroacute bajo porcentaje
de inhibicioacuten en el modelo de edema de pata inducido por carragenina (Tabla 39) El
aumento en el tamantildeo de los bazos podriacutea estar relacionado con el posible efecto toacutexico que
ha sido detectado en algunos de los ensayos en que se proboacute Bb y que podriacutea enmascarar
su accioacuten antiinflamatoria
Figura 34 Efecto de Bb y Bb inhibida con E-64 (BbE-64) y dexametasona (Dex) sobre los pesos corporales de
las ratas tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
34222 Efecto de E-64 sobre la actividad antiinflamatoria de Pm en el test del granuloma
Debido a que la dosis de 30 UCaskg de Pm pareciacutea mostrar cierta toxicidad
(ademaacutes del ensayo cuyos resultados se exponen en Tabla 315 en otro ensayo tambieacuten
murioacute 13 de los animales) se decidioacute bajar la dosis a 13 (equivalente a 10 UCaskg) Al
igual que para Bh y bromelina se ensayoacute el efecto que tiene la inhibicioacuten de las
cisteiacutenendopeptidasas presentes en Pm sobre su efecto antiinflamatorio en el test del
granuloma En la Tabla 317 se muestran los resultados obtenidos para 90 mgkg de Pm4
90 mgkg de Pm4 inhibido con E-64 (Pm4E-64) y dexametasona (3 mgkg)
-20
-10
0
10
20Control
Dex (3 mgKg)
Bb2 (305 UCaskg)
Bb2E-64 (006001 UCaskg)
a
bcb
c
Ca
mb
io d
e p
eso
co
rpo
ral (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
72
Tabla 317 Efecto de Pm4 con y sin actividad proteoliacutetica (Pm4E-64) y dexametasona sobre el granuloma
inducido por pellet de algodoacuten y sobre los pesos de timos y bazos Los pesos son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 005 plt 001 plt 0001 las medias con al menos una letra subiacutendice comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 el subiacutendice ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Las dosis ensayadas de Pm en esta oportunidad no provocaron la muerte de los
animales tratados Si bien los porcentajes de inhibicioacuten de granuloma de Pm y de PmE-64
no se diferenciaron significativamente entre siacute el porcentaje de Pm fue estadiacutesticamente
significativo pero no asiacute el de PmE-64 lo cual estariacutea indicando que las
cisteiacutenendopeptidasas de Pm tendriacutean un rol antiinflamatorio en este modelo PmE-64 no
mostroacute actividad fibrinoliacutetica en el ensayo de la placa de fibrina6
De igual modo que para bromelina al inhibir las proteasas de Pm con E-64 no soacutelo
se pierde el efecto antiinflamatorio sino tambieacuten el efecto reductor sobre el peso de los
timos Si bien los porcentajes de reduccioacuten del peso de los timos de Pm y de PmE-64 no se
diferencian significativamente el porcentaje de reduccioacuten respecto al control de Pm es
significativo mientras que el de PmE-64 no
Por otro lado Pm y PmE-64 no redujeron significativamente los pesos de los bazos
al igual que todos los preparados proteoliacuteticos ensayados previamente
En la Figura 35 se observa que Pm y PmE-64 no afectaron significativamente la
ganancia de masa corporal de los animales tratados respecto a los del lote control
Figura 35 Efecto de Pm4 Pm4 inhibida con E-64 (PmE-64) y dexametasona (Dex) sobre los pesos
corporales de las ratas tratadas durante el ensayo del test de granuloma Los valores (diferencia de pesos antes y despueacutes del tratamiento) son expresados como la media plusmn SEM (n=6) Test de Tukey plt 0001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con plt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt 005
Granuloma Timo Bazo
Peso (g) Inhibicioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Peso (g) Reduccioacuten
()
Control 050plusmn003 0 36plusmn002 068plusmn003
Pm4 (90 mgkg
11plusmn1 UCaskg)
037plusmn002 26a 026plusmn002 28b 08plusmn01 -23c
Pm4E-64 (90 mgkg
02plusmn01 UCaskg)
0417plusmn0009 17ac 031plusmn003 14cb 062plusmn007 9c
Dexametasona (3 mgkg) 0230plusmn0005 54b 005plusmn0004 86a 034plusmn001 50b
-20
-10
0
10
20
30Control
Dex (3 mgKg)
Pm4 (111 UCaskg)
Pm4E-64 (0201 UCaskg)
a
cc
c
Cam
bio
de p
eso c
orp
ora
l (g
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
73
Pm4 mostroacute efectos similares a los de bromelina con una dosis que contuvo 3 veces
menos UCas que la dosis de bromelina usada como referencia (50-55 mgkg equivalente a
30-35 UCaskg) Para verificar si bromelina alcanza su efecto maacuteximo con una dosis de 10
UCaskg se evaluoacute la accioacuten antiinflamatoria de dosis equivalentes a 11 plusmn 1 31 plusmn 3 y 94 plusmn 9
UCaskg Simultaacuteneamente se midieron los porcentajes de reduccioacuten de los pesos de los
timos y los bazos y se registroacute la ganancia de peso corporal Los resultados se muestran en
la Figura 36 excepto los porcentajes de reduccioacuten de los pesos de los bazos y los cambios
de peso corporal ya que no fueron estadiacutesticamente significativos para ninguna de las
dosis
Figura 36 Porcentajes de inhibicioacuten de granuloma y porcentajes de reduccioacuten de timos para 17 50 y 150 mgkg
de bromelina equivalentes a 11 31 y 94 UCaskg mp masa del granuloma o timo del animal tratado con el preparado mc masa del granuloma o timo del animal del lote control Test de Dunnettt p lt 005 p lt 001 p lt 0001 Media plusmn SEM
Como puede observarse en la figura 36 la dosis de bromelina equivalente a 11 plusmn 1
UCaskg mostroacute un porcentaje de inhibicioacuten de 15 que no resultoacute ser estadiacutesticamente
significativo mientras que la dosis equivalente a 31 plusmn 3 UCaskg mostroacute un porcentaje de
inhibicioacuten similar a los de ensayos anteriores (25-30) Queda de este modo comprobado
que las dosis equivalentes en UCas de Pm4 y bromelina no muestran efectos
antiinflamatorios equivalentes
La UCas es una medida de la actividad hidroliacutetica de la proteasa frente a la caseiacutena
un sustrato con muacuteltiples puntos de corte Igual cantidad de UCas significa igual intensidad
de eficacia proteoliacutetica pero nada indica acerca de la especificidad de la enzima activa
Probablemente la dosis de Pm con igual UCas que la de bromelina tiene maacutes especificidad
hacia los blancos involucrados en el mecanismo de inflamacioacuten que subyacen en el modelo
del granuloma
10 30 900
20
40
60
Granuloma Timo
)x100mm(1 cp
UCaskg
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
74
3423 Posible relacioacuten entre la actividad proteoliacutetica-accioacuten antiinflamatoria-
modulacioacuten sobre poblacioacuten linfocitaria T
En la Figura 36 tambieacuten se puede observar que el aumento en el porcentaje de
inhibicioacuten del granuloma se acompantildea de un aumento en el porcentaje de reduccioacuten del
peso de los timos
Para todos los preparados en que se detectoacute efecto antiinflamatorio significativo
tambieacuten se acompantildeoacute de un efecto significativo sobre el peso de los timos y para Pm y
bromelina ambos dependieron de la actividad proteoliacutetica A modo de resumen en la Figura
37 se muestran graficados los pesos de granulomas en funcioacuten de los pesos de los timos
de los animales tratados con los preparados asiacute como con dexametasona (3 mgkg) a lo
largo del presente trabajo
Figura 37 Relacioacuten peso del granuloma - peso del timo para todos los preparados ensayados Los valores fueron calculados dividiendo el peso promedio del granuloma o timo del lote tratado por el peso promedio del granuloma o timo respectivamente del lote control y expresados como la media plusmn SEM Unidades arbitrarias (ua) Las liacuteneas de puntos representan el liacutemite por debajo del cual los valores se diferencian estadiacutesticamente de los controles (ANOVA Tukey plt005)
Puede observarse maacutes claramente que soacutelo los preparados que redujeron
significativamente el peso de los granulomas (valores por debajo de la liacutenea de puntos
horizontal) disminuyeron significativamente el peso de los timos (valores a la izquierda de la
liacutenea de puntos vertical)
Bromelia balansae (Bb)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bb2E-64(006001 UCaskg)
Bb2(305 UCaskg)
Bb4(312 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Pseudananas macrodontes (Pm)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Pm4(111 UCaskg)
Pm4E-64(0201 UCaskg)
Pm3(334 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Bromelina (Bro)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bro(333 UCaskg)
BroE-64(23 UCaskg)
Bro(101 UCaskg)
Bro(949 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
Bromelia hieronymi (Bh)
00 05 1000
05
10
Dexametasona
Bh5(364 UCaskg)
Bh5E-64(105 UCaskg)
Bh3(173 UCaskg)
Bh3(345 UCaskg)
Timo(ua)
Gra
nu
lom
a (
ua
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
75
A partir de dichas observaciones se podriacutea considerar que parte del mecanismo de
accioacuten antiinflamatorio involucrariacutea la accioacuten moduladora sobre la poblacioacuten de linfocitos T
siendo dependiente de la actividad proteoliacutetica para Pm y bromelina
Ademaacutes de los efectos directos de bromelina sobre los linfocitos T ya mencionados
tales como la inhibicioacuten en la transduccioacuten de sentildeales (Mynott et al 1999) y la regulacioacuten en
la activacioacuten mediado por la remocioacuten de moleacuteculas de la superficie celular (Hale et al
2002) en varios modelos animales la accioacuten reguladora sobre la poblacioacuten linfocitaria T ha
sido asociado al efecto antiinflamatorio de la bromelina En un modelo murino de asma
aleacutergica inducida por ovoalbuacutemina la bromelina administrada intraperitonealmente pudo
atenuar el desarrollo de la enfermedad disminuyendo significativamente las ceacutelulas T CD4+
activadas en particular CD4+CD25+ las ceacutelulas T CD8+ y la relacioacuten CD4+CD8+ en el BAL
(Secor et al 2005) Luego se demostroacute in vitro que bromelina cliva proteoliacuteticamente CD25
desde la superficie de los linfocitos T activos (Secor et al 2009) Por su parte Targoni et al
(1999) reportan que una mezcla de enzimas que contiene bromelina inhibe la
encefalomielitis aleacutergica experimental murina un modelo de enfermedad autoinmune
mediada por ceacutelulas T Este efecto se atribuyoacute a la escisioacuten proteoliacutetica de las moleacuteculas
accesorias CD4 CD44 y CD80 que median las interacciones de ceacutelulas T y ceacutelulas
presentadoras de antiacutegenos En una serie de ensayos in vitro e in vivo Engwerda et al
(2001) concluyen que la bromelina puede simultaacuteneamente mejorar e inhibir las respuestas
mediadas por linfocitos T a traveacutes de una accioacuten estimulante sobre las ceacutelulas accesorias y
una accioacuten inhibidora directa sobre las ceacutelulas T
Es sabido que en el timo los progenitores linfoides tiacutemicos maduran y se diferencian
en linfocitos T inmunocompetentes a traveacutes de un proceso complejo mediado por
quimocinas interleucinas moleacuteculas de adhesioacuten factores de crecimiento y
fundamentalmente por la interaccioacuten entre las ceacutelulas del estroma intratiacutemico (ceacutelulas
epiteliales ceacutelulas dendriacuteticas interdigitadas y macroacutefagos) y los linfocitos (Fainboim amp
Geffner 2008) Durante su paso por el timo el precursor pasa por distintos estadiacuteos de
diferenciacioacuten que se reflejan por la expresioacuten de distintas moleacuteculas de superficie entre
ellas CD25 y CD44 las cuales han mostrado ser sensibles a la accioacuten de la bromelina como
ya se ha mencionado Por otro lado los timocitos proliferan activamente durante la
diferenciacioacuten sin embargo mediante el proceso de seleccioacuten tiacutemica soacutelo aproximadamente
un 2 de los timocitos originados en el timo murino son rescatados de la apoptosis y
pueden emigrar a la periferia como linfocitos T maduros (Kanwar et al 2008)
Teniendo en cuenta 1) que la bromelina es capaz de afectar la poblacioacuten linfocitaria
T y que esto seriacutea mediado por su accioacuten proteoliacutetica sobre las moleacuteculas de superficie
celular 2) que se ha postulado para la bromelina la capacidad de modular la relacioacuten entre
ceacutelulas accesorias y linfocitos T 3) que el proceso de maduracioacuten de los timocitos es
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
76
mediado por diferentes moleacuteculas de superficie celular en su interaccioacuten con el estroma
tiacutemico 4) que una intensa proliferacioacuten linfocitaria acompantildea el proceso de diferenciacioacuten y
5) la asociacioacuten entre el efecto antiinflamatorio y efecto reductor del peso del timo medidos
para los preparados en especial la posible dependencia entre dichos efectos y la actividad
proteoliacutetica de Pm y bromelina se podriacutea interpretar que los preparados alterariacutean los
complejos mecanismos de interaccioacuten celular entre las ceacutelulas del estroma tiacutemico y los
timocitos afectando la proliferacioacuten de los linfocitos T y dando lugar a una poblacioacuten
linfocitaria T perifeacuterica deficiente cuali yo cuantitativamente para intervenir en la respuesta
inflamatoria
Sin embargo esta hipoacutetesis es deacutebil dada las escasas evidencias sobre las que se
sustenta Por empezar un cambio en el peso del timo no indica cuaacuteles son los tejidos
afectados por lo que una evaluacioacuten histoloacutegica permitiriacutea determinar si la disminucioacuten del
peso se debe a la reduccioacuten en la poblacioacuten de ceacutelulas linfoideas ademaacutes de identificar
alteraciones en la arquitectura del oacutergano Por otro lado no es claro el rol que tendriacutean los
linfocitos T en la inflamacioacuten que se desarrolla en el modelo del granuloma inducido por el
pellet de algodoacuten Si bien el desarrollo de la inflamacioacuten granulomatosa es en general un
proceso en el que los linfocitos T tendriacutean un rol predominante los granulomas generados
por cuerpo extrantildeo como es el caso del pellet de algodoacuten estaacuten compuestos casi
exclusivamente por macroacutefagos al menos durante las fases de iniciacioacuten y acumulacioacuten (Co
et al 2004) siendo muy escasas las ceacutelulas linfociacuteticas (Ohtani 2013)
Dado el perfil de actividad de muacuteltiples blancos que caracteriza a la bromelina (Muumlller
et al 2012 Chobotova et al 2010) y probablemente a los preparados proteoliacuteticos
ensayados en el presente trabajo es muy posible que los efectos antiinflamatorio y sobre el
peso de los timos sean independientes entre siacute aunque ambos dependientes de la actividad
proteoliacutetica tanto en el caso de Pm como de bromelina
Dado que los mecanismos de accioacuten que subyacen a los efectos medidos no han
sido objeto de estudio del presente trabajo doctoral futuras investigaciones permitiriacutean
profundizar el conocimiento del rol que cumplen las proteasas de bromelina y especialmente
de Pm que hasta entonces no habiacutean sido estudiadas farmacoloacutegicamente
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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35 Conclusiones
Bh Bb Pm y bromelina mostraron efecto antiinflamatorio frente a la inflamacioacuten
aguda (edema de pata de rata inducido por carragenina)
Dosis de Bh Pm y bromelina equivalentes en actividad proteoliacutetica mostraron
porcentajes de inhibicioacuten de edema similares entre siacute y con el de indometacina (10
mgkg) actuando predominantemente sobre la fase tardiacutea (3-7h) propuesta para el
modelo edema de pata inducido por carragenina
Bb actuoacute soacutelo sobre la fase tardiacutea propuesta para el modelo edema de pata de rata
inducido por carragenina mostrando porcentajes de inhibicioacuten de edema inferiores a
los de dosis de Bh Pm y bromelina con equivalente actividad proteoliacutetica
Proteasas cisteiacutenicas de Bb Pm y principalmente de Bh y bromelina seriacutean las
causales del efecto antiinflamatorio sobre la inflamacioacuten aguda (edema de pata de
rata inducido por carragenina) y actuariacutean sobre la fase tardiacutea del modelo (3-7h)
En algunos de los ensayos de edema de pata de rata Bb mostroacute signos de toxicidad
Bh Pm y bromelina mostraron efecto antiinflamatorio frente al modelo de inflamacioacuten
aguda edema de pata de rata inducido por serotonina
A las dosis ensayadas Bh Pm y bromelina no inhibieron el edema de pata de rata
inducido por histamina
Una dosis de Pm con 3 veces menos de actividad proteoliacutetica que una dosis de
bromelina mostraron efectos antiinflamatorios significativamente similares sobre el
modelo de inflamacioacuten croacutenica test del granuloma inducido por algodoacuten
Los efectos antiinflamatorios de Pm y bromelina en el test del granuloma inducido por
algodoacuten dependeriacutean de la actividad proteoliacutetica de sus proteasas cisteiacutenicas
Los efectos antiinflamatorios de dosis equivalentes a 30 UCaskg de Bh y Bb no
fueron reproducibles en el modelo de inflamacioacuten croacutenica
Los efectos antiinflamatorios medidos para los preparados proteoliacuteticos en el modelo
del test del granuloma inducido por algodoacuten fueron acompantildeados de un significativo
y leve efecto reductor del peso del timo de los animales tratados
Los efectos reductores del peso del timo fueron dependientes de la actividad
proteoliacutetica de las proteasas cisteiacutenicas de Pm y de bromelina
Los efectos antiinflamatorios de los preparados proteoliacuteticos fueron significativamente
menores al de dexametasona (3 mgkg)
A diferencia de la dexametasona ninguno de los preparados redujo
significativamente el peso del bazo como tampoco produjeron peacuterdida de masa
corporal mientras que los porcentajes de reduccioacuten del peso del timo fueron
significativamente menores al de dexametasona
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
78
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ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
82
41 Hemostasia
En los vertebrados la sangre fluye con una presioacuten relativamente elevada por
conductos que conforman un compartimento cerrado Sin embargo frente a una injuria vascular
la peacuterdida de sangre desde dicho compartimento es limitada El conjunto de mecanismos
fisioloacutegicos que mantienen la sangre fluida e impiden su fuga se denomina hemostasia En ella
intervienen la pared de los vasos sanguiacuteneos componentes celulares (plaquetas) y solubles
(factores plasmaacuteticos de la coagulacioacuten) de la sangre el flujo sanguiacuteneo y de manera
indirecta el almohadillado celuloadiposo y conjuntivo que rodeando el aparato vascular lo
protege por fuera (Castillo et al 1994)
Se denomina hemostasia correctora a la que actuacutea evitando la peacuterdida de sangre
cuando una lesioacuten afecta la integridad de la pared vascular y puede dividirse en cuatro fases
1 Vasoconstriccioacuten localizada
2 Formacioacuten de un agregado plaquetario sobre el aacuterea lesionada
3 Coagulacioacuten (formacioacuten de fibrina)
4 Fibrinoacutelisis (degradacioacuten y remodelacioacuten del coaacutegulo de fibrina)
Puesto que parte de los objetivos de esta tesis se refieren al efecto de los preparados
proteoliacuteticos sobre las fases 3 y 4 las fases 1 y 2 soacutelo seraacuten someramente expuestas
411 Vasoconstriccioacuten
Luego de la lesioacuten vascular se produce una vasoconstriccioacuten en el aacuterea afectada que
conduce al enlentecimiento del flujo sanguiacuteneo Esto favorece la interaccioacuten entre las plaquetas
y los factores de la coagulacioacuten con el endotelio iniciando las fases 2 y 3 Inicialmente y durante
los primeros segundos la vasoconstriccioacuten es debida a una estimulacioacuten simpaacutetica en la
musculatura lisa del vaso y es sostenida probablemente por la serotonina la adrenalina y el
tromboxano A2 (TXA2) liberados desde las plaquetas activadas (Castillo et al 1994)
412 Formacioacuten del trombo plaquetario
En condiciones fisioloacutegicas el trombo plaquetario se forma en el aacuterea lesionada y consta
de varias etapas que involucran la adhesioacuten la activacioacuten y la agregacioacuten plaquetaria
Las plaquetas se adhieren a la pared vascular a traveacutes del subendotelio que queda
expuesto por la lesioacuten Las proteiacutenas que median la unioacuten son fundamentalmente el colaacutegeno
subendotelial el factor de von Willebrand (FvW) y la fibronectina mientras que los receptores
plaquetarios involucrados son glicoproteiacutenas de membrana la GPVI las integrinas GPIaIIa
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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(α2β1) y GPIIbIIIa (αIIbβ3) y el complejo Ib-V-IX La consecuencia inmediata de la adhesioacuten es la
activacioacuten plaquetaria que se caracteriza por a) cambio de forma discoide a esfeacuterica con
emisioacuten de pseudoacutepodos y b) contraccioacuten dependiente de Ca+2 intracitoplasmaacutetico la cual
determina el proceso de agregacioacuten plaquetaria Durante el proceso de activacioacuten se
desencadenan reacciones metaboacutelicas asiacute como se generan yo liberan agonistas que
amplifican el proceso tales como ADP y TXA2 Algunos agonistas de la activacioacuten plaquetaria
son el colaacutegeno la adrenalina la noradrenalina la serotonina y el PAF (Castillo et al 1994)
El ADP es liberado desde los graacutenulos densos junto a la serotonina al medio
extracelular e induce la activacioacuten de plaquetas por unioacuten a receptores de membrana El TXA2
sintetizado a partir del aacutecido araquidoacutenico (AA) por las viacuteas de la ciclooxigenasa (COX) y la
tromboxano sintetasa es un potente agregante plaquetario y vasoconstrictor El AA es liberado
desde la membrana plaquetaria por la fosfolipasa A2 activada por la unioacuten de agonistas a sus
receptores Otros agonistas desencadenan el metabolismo del fosfatidilinositol conduciendo a
la activacioacuten de proteincinasa C (PKC) que junto a otras cinasas intervienen en varios procesos
de la activacioacuten plaquetaria (Martinuzzo et al 2003)
La agregacioacuten plaquetaria consiste en la unioacuten de plaquetas entre siacute iniciada por la
unioacuten de plaquetas circulantes a las plaquetas ya adheridas al subendotelio Esta unioacuten es
mediada por el FvW y el fibrinoacutegeno el receptor plaquetario es la integrina GPIIbIIIa que es
expresada en la membrana luego de cambios conformacionales dependientes de Ca+2 y
fosforilaciones mediadas por cinasas (Martinuzzo et al 2003) La trombina induce la activacioacuten
y la agregacioacuten plaquetaria provocando la liberacioacuten de ADP y la siacutentesis de TXA2 (Castillo et
al 1994) Una consecuencia de la activacioacuten plaquetaria es la exposicioacuten de fosfoliacutepidos
anioacutenicos en la membrana cruciales para el proceso de coagulacioacuten (Martinuzzo et al 2003)
413 Coagulacioacuten
La coagulacioacuten plasmaacutetica consiste en la transformacioacuten catalizada por la trombina del
fibrinoacutegeno soluble en una red de fibras (fibrina) proceso que intensifica y asegura la
hemostasia temporal iniciada con la vasoconstriccioacuten y desarrollada por las plaquetas Se
produce como resultado de una serie de reacciones en cascada en la que sucesivamente una
proenzima inactiva (zimoacutegeno) es convertida en enzima activa la cual a su vez activa otra
proenzima Los componentes de esta cascada son denominados factores de coagulacioacuten
(Tabla 41) y se clasifican en tres grupos dependientes de la vitamina K sensibles a trombina y
de contacto Los factores dependientes de la vitamina K se caracterizan por poseer un
aminoaacutecido particular el aacutecido γ-carboxiglutaacutemico obtenido por la carboxilacioacuten del aacutecido
glutaacutemico mediada por la vitamina K (Castillo et al 1994)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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Factor Nombre sinoacutenimos Peso molecular
(kDa)
Vida media
(h) Grupo
FI Fibrinoacutegeno 340 100-150 T
FII Protrombina 72 50-80 K
FIII Factor tisular (FT)
tromboplastina tisular 44
FIV Calcio
FV Proacelerina 290-400 24 T
FVII Proconvertina 63 6 K
FVIII Factor antihemoliacutetico A 240 12 T
FIX Factor antihemoliacutetico B 554 24 K
FX Factor Stuart 55 25-60 K
FXI Antecedente tromboplastiacutenico
del plasma (PTA) 160 40-80 C
FXII Factor Hageman 90 50-70 C
FXIII Factor estabilizante
de la fibrina 320 150 T
Precalicreiacutena 88 35 C
cininoacutegeno de alto peso
molecular (HMWK)
120 150 C
FvW Factor de von Willebrand 500-20000 24
Tabla 41 Factores de coagulacioacuten Pesos moleculares vida media en plasma y grupo al que pertenecen K
vitamina K-dependientes T trombina sensibles C de contacto
La cascada de coagulacioacuten fue claacutesicamente descripta como dos viacuteas de activacioacuten de
zimoacutegenos que confluiacutean activando el FX y una viacutea comuacuten en la que el FX convertiacutea la
protrombina en trombina y eacutesta el fibrinoacutegeno en fibrina (Figura 41) En este modelo la viacutea
intriacutenseca es desencadenada por contacto del FXII con una superficie cargada negativamente
(por exposicioacuten de un epitelio distinto al vascular) e involucra ademaacutes a los factores FXI FIX
FVIII precalicreiacutena y HMWK La viacutea extriacutenseca desencadenada por la exposicioacuten del FT (por
una lesioacuten tisular) a la circulacioacuten involucra a FVII (Castillo et al 1994) Las plaquetas
activadas intervienen aportando su superficie fosfolipiacutedica (factor plaquetario III) que actuacutea
como catalizador en la etapa final de la viacutea intriacutenseca y en la viacutea comuacuten
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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Figura 41 Modelo claacutesico de la cascada de coagulacioacuten La coagulacioacuten se puede iniciar con la liberacioacuten del FT (Viacutea extriacutenseca) yo con el contacto del FXII con una superficie cargada negativamente (Viacutea intriacutenseca) Ambas viacuteas confluyen activando el FX a FXa el que desencadena la viacutea comuacuten que finaliza con la formacioacuten de fibrina Los factores representados como ciacuterculos actuacutean como cofactores para los factores que actuacutean como enzimas (estrellas)
en las reacciones sentildealadas La superficie fosfolipiacutedica es representada como un oacutevalo celeste
Maacutes recientemente se ha propuesto otro modelo de coagulacioacuten en el cual a) el FT es
el principal desencadenante de la coagulacioacuten b) la amplificacioacuten generada por la trombina es
considerada esencial para el desarrollo del coaacutegulo estable y c) existe interdependencia entre
los factores plasmaacuteticos y los elementos celulares (Figura 42) En este modelo la cascada de
coagulacioacuten es vista como un proceso gradual y superpuesto de activaciones proteoliacuteticas en
tres fases inicial de amplificacioacuten y de propagacioacuten en cuyas dos uacuteltimas fases la superficie
celular es fundamental para localizar la formacioacuten del coaacutegulo sobre la superficie dantildeada Las
dos viacuteas claacutesicas se unen a traveacutes del complejo FTFVIIa (viacutea extriacutenseca) el cual es capaz de
activar el factor de la viacutea intriacutenseca FIX (Adams amp Bird 2009)
4131 Fase inicial
La exposicioacuten del FT a la sangre por dantildeo o activacioacuten del endotelio actuacutea como
desencadenante de la coagulacioacuten activando el FVII circulante a FVIIa junto con el cual forma
el complejo tenasa del factor extriacutenseco (FTFVIIa) sobre la superficie fosfolipiacutedica de la
membrana celular Este complejo activa el FX a FXa y el FIX a FIXa (Adams amp Bird 2009) Si el
FXa permanece en la superficie puede unirse al FVa y activar el FII generando cantidades
picomolares de trombina (FIIa) (Martinuzzo et al 2003)
La duracioacuten de esta fase depende de la concentracioacuten del complejo FTFVIIa y del
inhibidor de la viacutea del factor tisular (TFPI) el cual forma un complejo FTFVIIaFXaTFPI capaz
VIacuteA INTRIacuteNSECA
Superficie dantildeada(carga negativa)
FXII
FXIIa
HMWK FXI
FXIa
FIX
FIXa
FX
FXa
FVIIIa
Ca+2
Trauma
Fosfo
liacutepid
os FT
FVIIa
FVII
VIacuteA EXTRIacuteNSECA
Protrombina
Trombina
Fibrinoacutegeno
Fibrina
VIacuteA COMUacuteN
Fosfo
liacutepid
osCa+2
FVa
Calicreiacutena
Precalicreiacutena
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de limitar la formacioacuten de FXa La expresioacuten del FT tambieacuten puede ser inducido en plaquetas y
monocitos asiacute como en micropartiacuteculas circulantes (MP) derivadas de las ceacutelulas en las que se
expresa (Adams amp Bird 2009)
Resulta importante sentildealar que la fase de contacto de la viacutea intriacutenseca en la que
intervienen el FXII la precalicreiacutena y el HMWK no es requerida para iniciar la cascada si bien
es fundamental para los estudios in vitro de la coagulacioacuten (Furie amp Furie 2008)
4132 Fase de amplificacioacuten
Las pequentildeas cantidades generadas de trombina pueden activar al FV y al FVIII los
cuales actuacutean como cofactores de los complejos protrombinasa (FVaFXa) y tenasa intriacutenseca
(FVIIIaFIXa) formados junto a Ca+2 sobre superficies fosfolipiacutedicas pertenecientes
principalmente a las plaquetas La amplificacioacuten de la coagulacioacuten estaacute dada por el incremento
en la produccioacuten del FXa por parte del complejo tenasa intriacutenseca (entre 50 y 100 veces maacutes
que la generada por el complejo FTFVIIa) y de trombina (Adams amp Bird 2009) El FVIII se
asocia al FvW el que mediante su interaccioacuten con la glicoproteiacutena Ib-V-IX se une a la plaqueta
haciendo maacutes eficiente la activacioacuten del FVIII por la trombina (Martinuzzo et al 2003)
Otro efecto amplificador es la activacioacuten del FXI a FXIa por parte de la trombina en
presencia de Ca+2 y protrombina lo que permite al FXIa localizarse en la superficie plaquetaria y
activar maacutes FIX La trombina activa las plaquetas mediante la unioacuten al PAR-1 (receptor activado
por proteasas) lo que a su vez induce la degranulacioacuten de graacutenulos α la expresioacuten de FVa
sobre la membrana y la activacioacuten de GPIIbIIIa estimulando la agregacioacuten plaquetaria y
activando la superficie plaquetaria al inducir la exposicioacuten de fosfoliacutepidos anioacutenicos
(fosfatidilserina) sobre la misma Las plaquetas activadas por trombina muy probablemente
sean las activadas por colaacutegeno durante la adhesioacuten plaquetaria y tienen una gran afinidad para
unir en su superficie los complejos protrombinasa y tenasa intriacutenseca (Adams amp Bird 2009)
4133 Fase de propagacioacuten
Durante la fase de amplificacioacuten se generan plaquetas activadas capaces de unir los
complejos cataliacuteticos maacutes eficientes para la produccioacuten de trombina la cual a su vez activa a las
plaquetas y a los factores y cofactores que componen esos complejos La fase de propagacioacuten
se basa en el reclutamiento de esas plaquetas activadas en el sitio de injuria El resultado de
estas reacciones es la produccioacuten ldquoexplosivardquo de trombina suficiente como para transformar el
fibrinoacutegeno en fibrina y generar un coaacutegulo estable (Adams amp Bird 2009)
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Figura 42 Modelo de la coagulacioacuten con base celular 1 La coagulacioacuten se inicia sobre la ceacutelula portadora del FT originando pequentildeas cantidades de trombina MP micropartiacuteculas circulantes MB membrana basal del endotelio Plt plaquetas 2 La pequentildea cantidad de trombina generada permite activar cofactores plaquetas y FXI formaacutendose sobre las plaquetas los efectivos complejos tenasa intriacutenseco (FVIIIaFIXa) y protrombinasa (FVaFX) que amplifican las reacciones productoras de trombina PS fosfatidilserina 3 Durante la fase de propagacioacuten la cantidad de trombina requerida para la formacioacuten del coaacutegulo se forma desde la superficie de las plaquetas localizadas en el sitio de injuria (Modificado de Adams amp Bird 2009)
4134 Formacioacuten de la fibrina
Puesto que la fibrina se construye a partir de los cambios estructurales que produce la
trombina sobre el fibrinoacutegeno es conveniente describir brevemente la estructura de este uacuteltimo
El fibrinoacutegeno es una glicoproteiacutena fibrosa de gran tamantildeo (340 kDa) compuesta por un diacutemero
de tres cadenas polipeptiacutedicas Aα Bβ y γ unidas por 29 puentes disulfuro (Figura 43) En
cuanto a su estructura terciaria se pueden identificar una regioacuten nodular central (E) y dos
regiones nodulares finales (D)
Figura 43 Estructura molecular del fibrinoacutegeno humano basado en la estructura cristalograacutefica obtenida por rayos X (Kollman et al 2009) las regiones α-C y sus cadenas conectoras no pueden ser resueltas por cristalografiacutea de rayos
X por lo que se muestran esquemaacuteticamente Los fibrinopeacuteptidos son esquematizados para destacar su interaccioacuten con α-C (Tomado de Guthold amp Cho 2011 y parcialmente modificado)
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La regioacuten E estaacute formada por los extremos amino terminal unidos por puentes disulfuro
de las seis cadenas Las regiones D estaacuten formadas por los extremos globulares carboxilo
terminales de las cadenas Bβ (β-C) y γ (γ-C) los que a su vez estaacuten formados por tres
dominios Los extremos carboxilo terminales de las cadenas Aα (α-C) se extienden desde el
extremo de la moleacutecula e interactuacutean entre siacute y con el centro (Weisel 2005) Los segmentos
centrales de las tres cadenas se enroscan formando una triple α-heacutelice (regioacuten coiled-coil) que
proporciona flexibilidad y estabilidad mecaacutenica a la moleacutecula uniendo las regiones D a la regioacuten
E (Lauricella 2007)
Se han identificado funciones para varias de las regiones del fibrinoacutegeno la regioacuten E
posee sitios de unioacuten de diferentes afinidades para la trombina el extremo carboxilo terminal de
una variante de la cadena γ (γ`) une trombina y FXIII la regioacuten D aporta sitios DD que
contribuyen a la alineacioacuten de los monoacutemeros de fibrina y sitios DA (en γ-C) o DB (en β-C) donde
se insertaraacuten los sitios A y B (regioacuten E) respectivamente de monoacutemeros vecinos (Figura 44)
finalmente el sitio γXL de la cadena γ interviene en el ensamblado de la fibrina y facilita la accioacuten
del FXIII (Lauricella 2007)
Figura 44 Formacioacuten de fibrina Esquemas de la moleacutecula de fibrinoacutegeno y de la formacioacuten de los distintos niveles estructurales de la fibrina (Tabla de la derecha) luego de la accioacuten de la trombina y del FXIIIa (Estructuras de fibrinoacutegeno y fibras parcialmente modificadas de Undas amp Arieumlns 2011)
TROMBINA
TROMBINA
Fibrinopeacuteptidos A
Fibrinopeacuteptidos B
MICROFIBRA
FIBRA
FIBRINA INSOLUBLE
FIBRINOacuteGENO
Monoacutemero de fibrina
NIVEL
POLIMERO
NIVEL
GEL
(Agregados de microfibras)
(Red tridimensional con distintos grados de ramificaciones)
(Presencia de entrecruzamientos)FXIIIa
FIBRINA SOLUBLE
FXIII
TROMBINACa
++
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La trombina cliva cuatro enlaces especiacuteficos Arg-Gly de los extremos amino terminales
de Aα y Bβ en la regioacuten E desde los cuales se liberan los fibrinopeacuteptidos A y B
respectivamente y se exponen nuevos sitios (A y B respectivamente) en las cadenas clivadas
del ahora monoacutemero de fibrina
La polimerizacioacuten ocurre en varias etapas conduciendo a distintos niveles estructurales
La unioacuten entre monoacutemeros por interacciones de sus sitios A y B (regioacuten E) con sitios DA y DB
(regiones D) de otros monoacutemeros asiacute como las interacciones entre regiones D (a traveacutes de los
sitios DD) de monoacutemeros contiguos que contribuyen a la elongacioacuten del poliacutemero da lugar a la
formacioacuten de microfibras (o protofibras) estabilizadas por interacciones E-D (Lauricella 2007)
La liberacioacuten del fibrinopeacuteptido B produce tal cambio conformacional que los dominios α-C se
disocian de la regioacuten E y quedan disponibles para las interacciones intermoleculares que
favorecen la agregacioacuten bilateral de las microfibras dando lugar a fibras maacutes gruesas ademaacutes
de contribuir a la estabilidad y a las propiedades mecaacutenicas del coaacutegulo (Weisel 2007 Zhmurov
et al 2011) A su vez las fibras se asocian generando ramificaciones que conforman una red
tridimensional (fibrina soluble) La red es finalmente estabilizada (fibrina insoluble) por el FXIIIa
una transglutaminasa activada por trombina en presencia de Ca+2 El FXIIIa forma puentes
amida entre un grupo amino de residuos de lisina y un grupo carbonilo de residuos de glutamina
dando lugar a entrecruzamientos en la red que pueden ser entre dos cadenas γ dos Aα o una
γ con una Aα La fibrina estabilizada es maacutes resistente a la fibrinoacutelisis (Lauricella 2007)
4135 Regulacioacuten de la coagulacioacuten
Numerosas proteiacutenas cumplen con la funcioacuten regulatoria de la coagulacioacuten actuando en
los distintos niveles El FT es regulado por el inhibidor de la viacutea del factor tisular (TFPI) el que
es expresado por el endotelio y las plaquetas asiacute como por otras ceacutelulas y circula unido a LDL
TFPI tambieacuten neutraliza la actividad del FXa e inhibe el complejo FTFVIIa
La antitrombina el principal inhibidor de la coagulacioacuten es un inhibidor de
serinoproteasas tales como FXa FXIa FIXa y calicreiacutena y se sintetiza en el endotelio Por
actuar preferencialmente sobre las enzimas libres contribuye a limitar la coagulacioacuten en la
regioacuten de lesioacuten (Adams amp Bird 2009)
El cofactor II de heparina es un inhibidor de trombina que requiere la presencia de
dermataacuten sulfato o heparina para acelerar su reaccioacuten Los FVa y FVIIIa son inactivados por la
proteiacutena C activa (APC) actuando como cofactor la proteiacutena S La activacioacuten de la proteiacutena C es
llevada a cabo por la trombina unida a la trombomodulina del endotelio mientras que la APC es
inhibida por α1-antitripsina (α1-AT) y por α2-macroglobulina (α2-MG) asiacute como por el inhibidor de
proteiacutena C (PCI) La α1-AT inhibe tambieacuten FXIa calicreiacutena y trombina La α2-MG es un inhibidor
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de amplio espectro ya que inhibe la plasmina la tripsina la calicreiacutena y la elastasa entre otras
ademaacutes de trombina El FXa y el FXIa son inhibidos por el inhibidor de proteasas dependiente
de proteiacutena Z (ZPI) una proteiacutena K-dependiente usando como cofactor la proteiacutena Z
(Martinuzzo et al 2003)
El endotelio actuacutea regulando la hemostasia manteniendo las caracteriacutesticas no
trombogeacutenicas de la cara luminal en contacto con la sangre a traveacutes de la siacutentesis de heparaacuten y
dermataacuten sulfato componentes del sistema de la proteiacutena C antiagregantes plaquetarios como
prostaciclina G2 (PGI2) y oacutexido niacutetrico (NO) entre otros Mientras que ante estiacutemulos
trombogeacutenicos se sintetizan factores prohemostaacuteticos (FvW FT FV)
414 Fibrinoacutelisis
La deposicioacuten de fibrina induce el sistema fibrinoliacutetico que de manera controlada
remueve o remodela el coaacutegulo a traveacutes de la fibrinoacutelisis evitando el depoacutesito indeseado de
fibrina El sistema fibrinoliacutetico estaacute compuesto por zimoacutegenos activadores e inhibidores y a
traveacutes de diferentes mecanismos activa el plasminoacutegeno (Plg) a plasmina que actuacutea
proteoliacuteticamente sobre la fibrina La fibrinoacutelisis estaacute regulada por la concentracioacuten de los
activadores de Plg los cuales tienen una lenta difusioacuten a coaacutegulos ya formados por lo que es
importante su presencia durante la formacioacuten de la red de fibrina de manera que queden
incorporados al coaacutegulo Los principales activadores del Plg son el activador tisular del
plasminoacutegeno (t-PA) y el activador de tipo uroquinasa (u-PA) ademaacutes de algunos activadores
exoacutegenos como la estreptoquinasa generada por estreptococos β-hemoliacuteticos (Martinuzzo et
al 2003)
El t-PA es sintetizado en el endotelio y liberado en respuesta a trombina histamina
bradicinina interleucinas estreacutes y eacutestasis venoso (Martinuzzo et al 2003) entre otros La baja
afinidad del t-PA circulante por el Plg aumenta en presencia de fibrina que es capaz de fijarlo
al igual que al Plg sobre su estructura Asiacute la fibrina promueve la formacioacuten de plasmina sobre
su superficie favoreciendo una lisis local y no una generalizada
El u-PA es secretado por ceacutelulas endoteliales renales y tumorales Se sintetiza en forma
de simple cadena (scu-PA) conocida como prouroquinasa (activa el Plg sobre la fibrina) que
puede ser activada a su forma de doble cadena (tcu-PA) por accioacuten de la plasmina o por los
factores de la fase de contacto (precalicreiacutena HMWK FXII) siendo capaz de actuar sobre el Plg
en fase fluida (Martinuzzo et al 2003)
La plasmina degrada la fibrina (estabilizada por el FXIIIa) liberando fragmentos de
distintos pesos moleculares que en su mayoriacutea incluyen al diacutemero DD (contiene las regiones D
de monoacutemeros contiguos unidos covalentemente) La accioacuten de la plasmina sobre el fibrinoacutegeno
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produce fragmentos X Y D y E similares a los que genera al actuar sobre la fibrina no
estabilizada salvo por la ausencia de los fibrinopeacuteptidos A y B (Figura 45)
Figura 45 Productos de degradacioacuten del fibrinoacutegeno y de la fibrina Las flechas rojas indican puntos de corte de la
plasmina las barras negras representan los entrecruzamientos en la fibrina formados por el FXIIIa (Estructuras de
fibrinoacutegeno y fibrina parcialmente modificadas de Undas amp Arieumlns 2011)
La plasmina tambieacuten es capaz de degradar otras proteiacutenas plasmaacuteticas como el FII el
FV el FVIII cininas componentes del complemento asiacute como tambieacuten activar metaloproteasas
que intervienen en la degradacioacuten de la matriz extracelular Por esto es importante la regulacioacuten
de la fibrinoacutelisis que se da tanto a nivel de la plasmina como de los activadores del Plg
(Martinuzzo et al 2003)
La plasmina circulante es inhibida por unioacuten de la α2-antiplasmina (α2-AP) que no soacutelo
afecta el sitio activo sino tambieacuten los sitios de unioacuten a la fibrina Los inhibidores de los
activadores de Plg (PAI) se encuentran en altas concentraciones en sangre y actuacutean formando
complejos covalentes ya sea con el t-PA como con el u-PA
Por su parte la trombina inhibe la fibrinoacutelisis mediante la activacioacuten del inhibidor de la
fibrinoacutelisis activable por trombina (TAFI) El TAFIa remueve residuos Lys de la fibrina
eliminando los sitios de unioacuten al Plg requeridos para la activacioacuten por el t-PA (Adams amp Bird
2009)
42 Trombosis (Korin 2003)
La trombosis es la presencia intravascular de material fibrino-plaquetario con variable
contenido de hematiacutees y leucocitos y puede ser una respuesta fisioloacutegica (trombo hemostaacutetico)
Fibrinoacutegeno
Fragmento X
Fragmento DFragmento Y
Fragmento D Fragmento E
Fragmento (DD)EFragmento (DD)
Fragmento DYYD
Fibrina estabilizada
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tal como ya ha sido descripto o ser la consecuencia de una activacioacuten patoloacutegica e inapropiada
del sistema de coagulacioacuten
El trombo patoloacutegico puede ser parcial o totalmente oclusivo hecho que puede llevar a
una isquemia de grado variable y consecuente peacuterdida de la funcioacuten vital del oacutergano ademaacutes
de la posibilidad de embolizacioacuten distal y la consecuente embolia pulmonar Seguacuten donde se
asienten los trombos se dividen en venosos arteriales cardiacuteacos y de microcirculacioacuten
La trombosis venosa se caracteriza por la presencia de trombos compuestos
principalmente por hematiacutees y fibrina (trombos rojos) Los factores desencadenantes maacutes
importantes son la disminucioacuten de la velocidad del flujo sanguiacuteneo (anestesias incapacidad
motora aumento de viscosidad sanguiacutenea etc) y cambios en los sistemas de coagulacioacuten y
fibrinoacutelisis (descenso de inhibidores aumento en la concentracioacuten de factores hipofuncioacuten
fibrinoliacutetica etc) Asiacute actuacutean como factores de riesgo los estados post-operatorios las
neoplasias las plejiacuteas los estados trombofiacutelicos y la edad creciente Cuando la trombosis se
localiza en el sistema venoso profundo suele estar asociada con el riesgo de embolia pulmonar
y constituyen los polos cliacutenicos del tromboembolismo venoso (TEV)
El TEV es tratado y prevenido con anticoagulacioacuten (heparinas no fraccionadas
heparinas de bajo peso molecular o dicumariacutenicos) Casos de TEV severos requieren de un
tratamiento tromboliacutetico
La trombosis arterial se produce en zonas de alta velocidad de flujo sanguiacuteneo y los
trombos se componen fundamentalmente de agregado plaquetario y fibrina y en menor
medida de hematiacutees y leucocitos (trombos blancos) Es consecuencia de alteraciones en la
pared vascular (placas ateromatosas) y puede conducir a accidentes cerebrovasculares y
sindromes coronarios agudos entre otras complicaciones
Los factores que pueden desencadenar la trombosis arterial son un endotelio
disfuncional alteraciones en el flujo sanguiacuteneo y la activacioacuten del sistema de coagulacioacuten
mediado por la exposicioacuten del FT Paralelamente se produce reclutamiento activacioacuten y
agregacioacuten plaquetaria asiacute como la activacioacuten del sistema fibrinoliacutetico el que es regulado por el
PAI-1 depositado en la placa ademaacutes del TAFI y la α2-AP La trombogenicidad de una placa es
una funcioacuten del contenido de FT el cual determina la velocidad de produccioacuten de trombina El
FT presente en las placas proviene de las micropartiacuteculas (MP) derivadas de macroacutefagos
linfocitos y ceacutelulas musculares lisas activadas por citoquinas asiacute como de las membranas de
neutroacutefilos y monocitos que invaden la placa por quimiotaxis y adhesioacuten todo ello favorecido por
el endotelio disfuncional Asiacute el nivel de inflamacioacuten tambieacuten contribuye al desarrollo de la
trombosis arterial Por otro lado el colaacutegeno presente en la placa es un desencadenante de la
activacioacuten plaquetaria El tratamiento depende de la localizacioacuten y compromiso del oacutergano
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afectado para lo cual se usan heparinas aspirina inhibidores de la GPIIbIIIa y tromboliacuteticos
entre otros Dado que la aterotrombosis es una enfermedad multifactorial y multigeacutenica se
asocian muacuteltiples factores de riesgo que deben ser tenidos en cuenta para un tratamiento maacutes
adecuado A los factores de riesgo claacutesicos (diabetes obesidad tabaquismo hiperlipidemia
etc) se han empezado a evaluar otros tales como niveles altos de fibrinoacutegeno indicadores de
inflamacioacuten variantes de glicoproteiacutenas plaquetarias niveles de PAI-1 y polimorfismos de APO
entre otros
421 Agentes para el tratamiento de la trombosis
El tratamiento de los desoacuterdenes tromboacuteticos requieren de tres grupos de faacutermacos
anticoagulantes antiagregantes plaquetarios y fibrinoliacuteticos (Tabla 42) Dado que los blancos
de accioacuten son componentes del sistema hemostaacutetico la desventaja que comparten es el riesgo
a la hemorragia El antitromboacutetico ideal seriacutea aquel que inhibe la trombosis y evita el riesgo de
hemorragia (Furie amp Furie 2008)
Anticoagulantes Antiagregantes plaquetarios Fibrinoliacuteticos
Heparina no fraccionada (HNF)
Heparina de bajo peso molecular
(HBPM)
Inhibidores de trombina (ej
argatroban bivalirudina hirudina)
Anticoagulantes orales
Aspirina
Inhibidores de GPIIbIIIa (ej
abciximab eptifibatide tirofiban)
Bloqueador del receptor de ADP (ej
Ticlopidina clopidogrel)
Inhibidores de TXA2 sintasa
Antagonistas de TXA2
Estreptoquinasa
Activadores del plasminoacutegeno tisular
recombinantes (r-TPAs)
Tabla 42 Agentes para el tratamiento de la trombosis
Los desoacuterdenes cardiovasculares representan la principal causa de muerte en el mundo
asiacute como en la Argentina (WHO) Aunque la trombosis sigue siendo la viacutea final de enfermedad y
muerte en algunas de las enfermedades maacutes comunes tales como infarto de miocardio
accidente cerebrovascular y caacutencer todos los agentes farmacoloacutegicos disponibles para su
prevencioacuten o tratamiento han estado en uso durante deacutecadas o han sido reemplazados con
nuevas variantes que ofrecen una modesta mejora incremental (Furie amp Furie 2008)
En los uacuteltimos antildeos una serie de combinaciones de anticoagulantes antiagregantes
plaquetarios y agentes fibrinoliacuteticos se han probado en ensayos cliacutenicos en pacientes con
siacutendromes coronarios agudos dando lugar a cambios en la praacutectica cliacutenica y mejoras en la
morbilidad y mortalidad de los pacientes (Merli 2007)
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En cuanto a los agentes fibrinoliacuteticos la estreptoquinasa sigue siendo un medicamento
efectivo para disolver coaacutegulos estando indicada en el tratamiento de algunos casos de infarto
de miocardio (Sikri amp Bardia 2007) Sin embargo la estreptoquinasa y la u-PA activan no soacutelo
el Plg unido a fibrina sino tambieacuten el Plg circulante generando plasmina libre la cual es capaz
de degradar otras proteiacutenas plasmaacuteticas ademaacutes de contribuir a eventos proinflamatorios
(Syrovets et al 2012) Durante la uacuteltima deacutecada la atencioacuten se ha centrado en la mejora de la
potencia eficacia y facilidad de administracioacuten de los agentes fibrinoliacuteticos En este sentido se
han desarrollado variantes recombinates de los PAs que preferencialmente activan el Plg unido
a fibrina (Collen 1996)
La buacutesqueda de enzimas fibrinoliacuteticas alternativas llevoacute hace 70 antildeos al descubrimiento
de los venenos de serpiente como agentes de disolucioacuten intravascular para coaacutegulos La
alfimeprasa una variante recombinante del veneno se caracteriza por tener un efecto directo
sobre la fibrina y es raacutepidamente inhibida al ser unida por α2-MG (Anoacutenimo 2008)
4211 Proteasas vegetales como antitromboacuteticos
La bromelina ha mostrado ser un agente fibrinoliacutetico in vivo e in vitro no soacutelo actuacutea
directamente sobre la fibrina tambieacuten activa el Plg y aumenta la concentracioacuten de plasmina Por
otro lado y en relacioacuten a su efecto antimetastaacutesico es capaz de disminuir la expresioacuten de uPAR
(receptor de u-PA) en ceacutelulas tumorales (Maurer 2001) En un modelo inflamatorio animal
bromelina incrementoacute la actividad fibrinoliacutetica seacuterica de manera dosis dependiente (Pirotta amp de
Giuli-Morghen 1978)
En un modelo de trombosis in vivo la administracioacuten oral de esta proteasa disminuyoacute la
formacioacuten de trombos (13 en arteriolas y 5 en veacutenulas) mientras que in vitro redujo la
adhesioacuten al endotelio de plaquetas humanas activadas por trombina Por otro lado el
tratamiento de plaquetas humanas con bromelina redujo la agregacioacuten inducida por trombina
(Metzig et al 1999) y por ADP (Glaumlser amp Hilberg 2006)
El tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
fueron prolongados significativamente luego de la administracioacuten oral de bromelina en ratas
(Livio et al 1978) En el mismo estudio se observoacute inhibicioacuten en la agregacioacuten plaquetaria La
administracioacuten oral de bromelina durante 10 diacuteas en personas sanas no afectoacute el TP aunque siacute
levemente el TTPa pero dentro de rangos normales (Eckert et al 1999)
Maacutes recientemente Bilheiro et al (2013) reportaron que una fraccioacuten rica en
cisteiacutenendopeptidasas aislada del laacutetex de Carica candarmarcensis manifestoacute efecto
fibrinoliacutetico fibrinogenoliacutetico y tromboliacutetico actividad inhibitoria de la agregacioacuten plaquetaria
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inducida por ADP asiacute como la prolongacioacuten del TP TT y TTPa Todos estos efectos fueron
dosis dependiente y cesaron al agregar inhibidores de cisteiacutenproteasas
43 Objetivos
Dentro del objetivo general de investigar la posible aplicacioacuten como agentes para el
tratamiento de la trombosis de los extractos parcialmente purificados obtenidos de frutos de
Bromelia hieronymi (Bh) B balanasae (Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) se plantearon
como objetivos especiacuteficos
Evaluar y comparar los posibles efectos de Bh Bb y Pm sobre la coagulacioacuten
sanguiacutenea el fibrinoacutegeno y la fibrina
Determinar si los efectos medidos tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los
extractos
Comparar los efectos de Bh Bb y Pm con los medidos para bromelina
44 Materiales y meacutetodos
441 Efecto anticoagulante
Para medir el efecto de los preparados sobre la coagulacioacuten sanguiacutenea se realizaron dos
pruebas globales de la coagulacioacuten el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de
tromboplastina parcial activado (TTPa) Las pruebas globales se caracterizan por ser raacutepidas y
sencillas y aunque sus resultados pueden indicar una alteracioacuten no identifican el componente
afectado (Duboscq 2003)
Los valores del TP y del TTPa se obtuvieron a partir de ensayos in vitro e in vivo Los
ensayos in vitro se realizaron midiendo el TP y el TTPa de un pool de plasma humano pobre en
plaquetas antes y despueacutes de ser incubado con distintas concentraciones de los preparados
proteoliacuteticos mientras que los ensayos in vivo consistieron en medir el TP y el TTPa de plasmas
obtenidos de ratas Wistar tratadas con los preparados proteoliacuteticos
4411 Ensayos in vitro
44111 Pool de plasma pobre en plaquetas
El pool fue elaborado con 15 muestras de plasma pobre en plaquetas (ppp) obtenidas de
dadores voluntarios adultos de entre 30 y 65 antildeos que no hubieran consumido aspirina u otros
faacutermacos con accioacuten anticoagulante en los 10 diacuteas previos El ppp fue obtenido del
sobrenadante luego de centrifugar sangre anticoagulada con citrato de sodio al 38 (relacioacuten
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sangrecitrato de sodio = 91) durante 10 min a 3000 g El pool fue conservado en freezer a -20
ordmC durante su elaboracioacuten (1 semana) y una vez terminado fue fraccionado en tubos de plaacutestico
y conservado a -80 ordmC hasta su uso (2 meses)
44112 Tiempo de protrombina (TP)
El TP o tiempo de Quick se basa en la medida del tiempo de coagulacioacuten de un plasma
decalcificado en presencia de tromboplastina tisular y Ca+2 El teacutermino tromboplastina tisular
hace referencia a una mezcla de tromboplastina o factor tisular (FT) y fosfoliacutepidos (Duboscq
2003)
Esta prueba permite evaluar la viacutea extriacutenseca del modelo claacutesico de la coagulacioacuten ya
que es sensible a cambios en los niveles del FVII ademaacutes de los otros factores vitamina K-
dependientes (FII y FX) y del FV El nivel de fibrinoacutegeno debe estar muy disminuido (menos del
50 de la concentracioacuten normal en plasma) para alterar el TP Es un ensayo esencial para el
monitoreo de pacientes bajo tratamiento con anticoagulantes orales (Duboscq 2003)
Para la medida del TP se usoacute el kit comercial Soluplastin (Wiener lab Group) que
contiene tromboplastina tisular de cerebro de conejo En la Tabla 43 se esquematiza el
protocolo seguido el cual fue adaptado del procedimiento establecido por el kit
Mezcla de reaccioacuten (MR)
100 μL de ppp + 10 μL de muestra1
en tubo de plaacutestico
Reactivo
(Tromboplastina CaCl2 NaCl)
200 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubacioacuten a 37 ordmC (diferentes tiempos) Incubacioacuten a 37 ordmC durante 2 min
2 Agregar 100 μL de MR al tubo con reactivo y en simultaacuteneo iniciar el cronometraje
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 43 Protocolo experimental para la medida del TP 1 Preparado proteoliacutetico o solucioacuten control (buffer fosfato
soacutedico 01M pH 6)
El coaacutegulo fue detectado ldquopescaacutendolordquo mediante un ansa de acero inoxidable los
valores de TP medidos para el pool de ppp tratado con los distintos preparados proteoliacuteticos
(TPp) fueron expresados en s y se compararon con los medidos para los controles (TPc)
obtenidos al mezclar el pool de ppp con buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 (buffer de
resuspensioacuten de la bromelina y de los precipitados etanoacutelicos de cada uno de los extractos
ensayados)
En cuanto a los valores de referencia seguacuten informacioacuten del proveedor del reactivo el
intervalo de los valores de TP de individuos normales adultos oscila entre 10 y 14 s aunque
dichos valores dependen de los reactivos y del procedimiento Tiempos prolongados indican un
estado de hipocoagulabilidad por deficiencia tanto de factores de la viacutea extriacutenseca como de
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
97
vitamina K y por presencia de inhibidores mientras que tiempos acortados se asocian a estados
de hipercoagulabilidad Altas concentraciones (gt 50 μgmL) de productos de degradacioacuten de
fibrina asiacute como enfermedad hepaacutetica son algunas causas de prolongados valores de TP
(Duboscq 2003)
44113 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
El ensayo consiste en medir el tiempo de coagulacioacuten del plasma decalcificado en
presencia de un exceso de tromboplastina parcial un activador y Ca+2 El teacutermino
tromboplastina parcial se refiere a la porcioacuten fosfolipiacutedica en la que se encuentra anclada la
tromboplastina (o FT) El activador proporciona la superficie cargada negativamente
desencadenante de la fase de contacto generalmente tierra de diatomeas celite o caoliacuten
(Duboscq 2003)
Esta prueba sirve para detectar anormalidades en la viacutea intriacutenseca del modelo claacutesico
ya sea por deficiencia de factores procoagulantes como por la presencia de inhibidores por ser
sensible frente a deficiencias de los factores FXII FXI FIX y FVIII como tambieacuten frente a
deficiencias severas de fibrinoacutegeno FII FV y FX Es usada para monitorear el tratamiento
terapeacuteutico con heparina no fraccionada y con acenocumarol (Duboscq 2003)
Se utilizoacute el kit comercial APTTest (Wiener lab Group) que utiliza cefalina como
tromboplastina parcial y tierra de diatomeas como activador En la Tabla 44 se esquematiza el
protocolo seguido en los ensayos el cual fue adaptado del procedimiento establecido por el kit
Mezcla de reaccioacuten (MR)
100 μL de pool de ppp + 10 μL de muestra1 en tubo
de plaacutestico
Reactivo
(Cefalina + tierra de diatomeas)
100 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubar de MR a 37 ordmC (diferentes tiempos)
2 Agregar 100 μL de MR al tubo con reactivo e incubar a 37 ordmC durante 3 min
3 Agregar 100 μL de CaCl2 0025 molL (precalentado a 37 ordmC) iniciar simultaacuteneamente el cronometraje y homogeneizar
4 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 44 Protocolo experimental para la medida del TTPa1 Preparado proteoliacutetico o control (buffer fosfato soacutedico
01 M pH 6)
El coaacutegulo fue detectado ldquopescaacutendolordquo mediante un ansa de acero inoxidable Los
tiempos de tromboplastina parcial activada medidos para el pool de ppp tratado con las distintas
preparaciones proteoliacuteticas (TTPap) fueron expresados en s y se compararon con los medidos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
98
para los controles (TTPac) los que se obtuvieron al mezclar el pool de ppp con buffer fosfato
soacutedico 01M de pH 6
Los valores de TTPa dependen fuertemente de los reactivos y del sistema de deteccioacuten
utilizado por lo cual es importante comparar los resultados obtenidos de la muestra ensayada
con la de un control usando un mismo lote de reactivo Seguacuten informacioacuten del proveedor del
reactivo el intervalo de los valores de TTPa de individuos normales adultos oscila entre 33 y 48
s y los tiempos que se diferencian en maacutes de 6 s de un plasma control deberaacuten ser
considerados anormales Tiempos prolongados indican un estado de hipocoagulabilidad
(deficiencia de factores o presencia de inhibidores) en tanto que los tiempos acortados
corresponderiacutean a un estado de hipercoagulabilidad aunque en este caso es aconsejable tomar
una nueva muestra pues la muestra podriacutea haber sido activada in vitro (Duboscq 2003)
44114 Efecto de la inhibicioacuten de la actividad proteoliacutetica sobre la accioacuten anticoagulante
Las soluciones de Bh Bb Pm y bromelina que extendieron el TP y el TTPa del pool de
ppp por encima de 180 s fueron incubadas durante 30 min a 37 ordmC con 035 mM de E-64 Luego
de verificar la peacuterdida de la actividad proteoliacutetica de dichas soluciones se volvioacute a determinar los
valores de TP y de TTPa siguiendo los protocolos de las tablas 33 y 34 respectivamente La
solucioacuten control para ambos ensayos fue buffer fosfato soacutedico 01M de pH 6 conteniendo 035
mM de E-64
44115 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados
Los datos fueron analizados estadiacutesticamente mediante ANOVA y posterior test de
Dunnett Cuando se compararon soacutelo dos grupos se utilizoacute la prueba t (no pareada) Un p lt
005 () fue considerado significativo Los caacutelculos fueron realizados con el programa
GraphPadPrism version 50
Para todos los preparados proteoliacuteticos las soluciones y diluciones ensayadas fueron
elaboradas n veces (indicado en cada caso) y a cada una de ellas se les midioacute el TP y el TTPa
por duplicado (intraensayo) Los resultados son expresados como el promedio de los valores
promedio intraensayo plusmn desviacioacuten estaacutendar (DE)
4412 Ensayos in vivo
Los resultados obtenidos en los ensayos in vitro se usaron para estimar las dosis que
pudieran resultar efectivas como anticoagulantes en los ensayos in vivo Para estos ensayos
ratas Wistar de ambos sexos y pesos entre 150 y 240 g fueron divididas en lotes de 6 animales
(3 hembras y 3 machos) Cada lote recibioacute intraperitonealmente los preparados proteoliacuteticos el
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
99
lote control no recibioacute tratamiento Previo a la extraccioacuten sanguiacutenea los animales fueron
anestesiados con una mezcla de 75 mgkg de ketamina clorhidrato (Holliday Scott SA) y 12
mgkg de xilacina clorhidrato (Richmond Laboratories Vet Pharma) administrada
intraperitonealmente La extraccioacuten fue realizada por puncioacuten cardiacuteaca y la sangre obtenida fue
mezclada con citrato soacutedico al 38 en una relacioacuten sangreanticoagulante = 91 se centrifugoacute
durante 10 min a 3000 g y el sobrenadante (ppp) fue separado en tubos de plaacutestico que se
almacenaron en freezer a -20 ordmC hasta el momento de medida del TP y del TTPa En la tabla
45 se esquematiza el protocolo seguido para las determinaciones del TP y del TTPa del ppp de
cada animal seguacuten indicaciones de los respectivos kits comerciales (Wiener lab Group)
TP
Plasma pobre en plaquetas (ppp)
100 μL en tubo de plaacutestico
Reactivo (Tromboplastina CaCl2 NaCl)
200 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Incubacioacuten a 37 ordmC durante 2 min
2 Agregar 100 μL de ppp al tubo con reactivo y en simultaacuteneo iniciar el cronometraje
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
TTPa
Plasma pobre en plaquetas (ppp)
100 μL
Reactivo
(Cefalina + tierra de diatomeas)
100 μL en tubo de hemoacutelisis
1 Agregar 100 μL de ppp al tubo con reactivo e incubar a 37 ordmC durante 3 min
2 Agregar 100 μL de CaCl2 0025 moll (precalentado a 37 ordmC) en simultaacuteneo iniciar el cronometraje y homogeneizar
3 Medir el tiempo transcurrido hasta la deteccioacuten del coaacutegulo
Tabla 45 Protocolos experimentales para las medidas del TP y del TTPa
Tanto el TP como el TTPa de cada animal corresponden al promedio de los valores
obtenidos en dos determinaciones
44121 Anaacutelisis de los datos obtenidos y expresioacuten de resultados
Los datos obtenidos se analizaron estadiacutesticamente mediante ANOVA seguido por el
test de Tukey y las diferencias entre los grupos fueron consideradas significativas para un
plt005 () Los caacutelculos fueron efectuados con el programa GraphPadPrism version 50 Los
resultados se expresan como el promedio plusmn SEM
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
100
442 Efecto fibrinogenoliacutetico
El efecto de los preparados proteoliacuteticos sobre el fibrinoacutegeno fue evaluado mediante el
registro electroforeacutetico por la teacutecnica de tricina-SDS-PAGE de los hidrolizados obtenidos al
incubar las mezclas de dichos compuestos
4421 Hidrolizados
Se utilizoacute como sustrato proteico el fibrinoacutegeno bovino (F8630 Sigma Aldrich)
solubilizado en buffer Tris-HCl 0025M pH 8 Las mezclas de reaccioacuten se hicieron de manera
que la concentracioacuten final de fibrinoacutegeno fuera mayor o igual a 1 mgmL a fin de poder detectar
la proteiacutena remanente tras el desarrollo de la electroforesis mientras que las concentraciones
de los preparados proteoliacuteticos se fueron variando en funcioacuten de los perfiles obtenidos Las
mezclas se incubaron a 37 ordmC durante diferentes tiempos y las reacciones fueron finalizadas por
el agregado de aacutecido iodoaceacutetico (inhibidor de cisteiacutenendopeptidasas) y de buffer de muestra
(BM) Finalmente fueron llevadas a ebullicioacuten durante 5 min El procedimiento se resume en la
Tabla 46 y la composicioacuten del buffer de muestra en la Tabla 47
Tabla 46 Finalizacioacuten de la reaccioacuten y preparacioacuten de los hidrolizados resultantes para la corrida electroforeacutetica
Buffer de muestra
Tris 157 g
SDS 4 g
Glicerol 16 mL
Azul de bromofenol 4 mg
β-mercaptoetanol 25 μL
Llevar a pH 68 con HCl 1M
AD csp 100mL
Tabla 47 Composicioacuten del buffer de muestra (BM) AD agua destilada β-mercaptoetanol fue agregado en el
momento de tratar los hidrolizados
Para los blancos de reaccioacuten se respetaron las mismas cantidades de la Tabla 46 pero
se cambioacute el orden en que se agregaron los reactivos (Tabla 48)
Tratamiento de los hidrolizados
1) Hidrolizados 25 μL
2) Acido iodoaceacutetico (11 mM) 5 μL
3) BM 25 μL
4) Llevar a ebullicioacuten 5 min
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
101
Tabla 48 Procedimiento para la preparacioacuten de blancos de reaccioacuten Los voluacutemenes de la solucioacuten del
preparado proteoliacutetico (E) y del fibrinoacutegeno (S) fueron tales que S+E = 25 μL
Las muestras resultantes se conservaron en freezer a -20ordmC hasta el momento de la
siembra
4422 Tricina-SDS-PAGE
Esta teacutecnica electroforeacutetica es muy adecuada para la separacioacuten de polipeacuteptidos y
proteiacutenas en el rango de 1 a 100 kDa y es la preferida para la resolucioacuten de proteiacutenas con pesos
moleculares maacutes pequentildeos que 30 kDa (Schaumlgger 2006) La tricina es utilizada como ion de
arrastre en el buffer catoacutedico permitiendo una mayor resolucioacuten de proteiacutenas pequentildeas a
concentraciones menores de acrilamida que en el caso del buffer Tris-glicina utilizado en la
teacutecnica ideada por Laemmli (1970) La electroforesis con tricina permite una mejor resolucioacuten de
polipeacuteptidos sobre todo en el rango de 5 y 20 kDa sin la necesidad del uso de urea (Schaumlgger
amp von Jagow 1987)
Para el moldeado de geles y la corrida electroforeacutetica se empleoacute el equipo Mini-Protean
III (Bio-Rad) Debido a que el PM de la cadena maacutes grande del fibrinoacutegeno (Aα) es de alrededor
de 65 kDa se eligioacute el sistema de geles que permite resolver mezclas proteicas en el rango 5-
100 kDa que consiste en un gel de resolucioacuten con 10 de T14 y 3 de C15 y en un gel de
apilamiento con 4 de T y 3 de C (Tabla 49)
Las muestras obtenidas seguacuten lo indicado en 4421 fueron centrifugadas durante 10
min a 16000 g y el sobrenadante fue sembrado (5 μL) sobre el buffer catoacutedico (Tris 01M
Tricina 01M SDS 01) contenido en las calles
14
T= (g acrilamida+g bisacrilamida) x 100 volumen total 15
C= g bisacrilamida x 100 (g acrilamida+g bisacrilamida)
Blancos de reaccioacuten
1) Volumen de solucioacuten del preparado proteoliacutetico
E μL
2) Acido iodoaceacutetico (11 mM) 5 μL
3) BM 25 μL
4) Volumen de solucioacuten de fibrinoacutegeno S μL
5) Llevar a ebullicioacuten 5 minutos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
102
Reactivos Gel de apilamiento 4T y 3C
Gel de resolucioacuten 10T y 3C
AcrilBis (4815) 06 mL 2 mL
Buffer del gel 100 mL 33 mL
H2O 34 mL 47 mL
PSA 10 40 μL 50 μL
TEMED 4 μL 5 μL
Tabla 49 Sistema de geles empleado (rango 5-100kDa) Buffer del gel Tris-HCl 3M pH 845 conteniendo SDS 03
PSA persulfato de amonio TEMED NNNacuteNacute-tetrametiletilendiamina
En los reservorios anoacutedicos y catoacutedicos de la celda electroforeacutetica se colocaron buffer
anoacutedico (Tris-HCl 02M pH 89) y buffer catoacutedico respectivamente
La electroforesis fue desarrollada sin refrigeracioacuten El voltaje inicial fue de 30 V y se
mantuvo constante durante el paso de las muestras por el gel de apilamiento cuando las
muestras entraron al gel de resolucioacuten se lo aumentoacute a 100 V valor que se mantuvo constante
hasta que el frente de colorante alcanzoacute el fondo del gel Inmediatamente despueacutes los geles
fueron removidos de las placas y las bandas proteicas visualizadas mediante tincioacuten con
Coomassie para lo cual los geles se dejaron durante 30 min en solucioacuten fijadora (10 vv de
aacutecido aceacutetico 50 vv de metanol) Luego fueron coloreados con solucioacuten colorante (10 vv
de aacutecido aceacutetico 40 vv de metanol y 100 mg de Coomassie Brillant Blue R-250) y
decolorados con una solucioacuten de aacutecido aceacutetico al 10 vv Una vez secos fueron escaneados y
las imaacutegenes reducidas a un tamantildeo y resolucioacuten adecuados en un programa de procesamiento
de imaacutegenes (Adobe Photoshop y Aldus Photostyler) Luego se utilizoacute un software especial
(Scion Image 1998 URL httpwwwscioncorpcom) que convierte la intensidad de color de las
bandas presentes en los geles en datos numeacutericos permitiendo realizar densitogramas de las
calles sembradas
443 Efecto fibrinoliacutetico
4431 Placa de fibrina
A fin de evaluar la actividad fibrinoliacutetica de los preparados proteoliacuteticos se desarrolloacute el
ensayo de la placa de fibrina Este ensayo altamente reproducible y sensible consiste en
depositar gotas de la solucioacuten en ensayo sobre un coaacutegulo de fibrina formado en una placa de
Petri y determinar la cantidad de fibrina degradada midiendo las aacutereas de las zonas lisadas
despueacutes de incubar la placa a 37 ordmC sobre una superficie nivelada en una caacutemara huacutemeda
(Jespersen amp Astrup 1983)
Se siguioacute la teacutecnica desarrollada por Dametto et al (2000) con algunas modificaciones
seguacuten la cual 4 mL de fibrinoacutegeno al 05 en el buffer de reaccioacuten (barbital 0045 M pH 775
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
103
conteniendo CaCl2 166 mM MgCl2 07 mM y NaCl 92 mM) fueron mezclados con 4 mL de una
solucioacuten de agarosa al 2 preparada en el mismo buffer y 02 mL de 20 unidades NIHmL de
trombina todos a 42 ordmC La mezcla fue depositada en una placa de Petri (15 x 9 cm)
homogeneizada mediante movimientos circulares y dejada 1 h a temperatura ambiente para
permitir la correcta formacioacuten y estabilizacioacuten de la fibrina Sobre la superficie del coaacutegulo se
sembraron 10 μL por muestra y luego de incubar en atmoacutesfera huacutemeda a 37ordmC durante 14 h se
midieron 2 diaacutemetros perpendiculares para cada aacuterea de lisis
Se utilizoacute fibrinoacutegeno bovino (F8630 Sigma Aldrich) y trombina bovina (T7513 Sigma
Aldrich) mientras que como control se empleoacute plasmina humana (P1867 Sigma Aldrich) La
concentracioacuten de trombina usada en el ensayo fue obtenida por dilucioacuten de una solucioacuten stock
de trombina (100 unidades NIHmL en solucioacuten de 09 de NaCl y 01 de seroalbuacutemina
bovina) con el buffer de reaccioacuten
4432 Caacutelculos y anaacutelisis de resultados
El aacuterea de la zona circular lisada durante el periacuteodo de incubacioacuten es proporcional a la
cantidad de producto (fibrina lisada) formado enzimaacuteticamente y por tanto una medida de la
actividad fibrinoliacutetica de la solucioacuten sembrada la cual fue estimada como el producto de 2
diaacutemetros perpendiculares (mm2) de la zona lisada (Jespersen amp Astrup 1983) La relacioacuten
entre la concentracioacuten de la enzima (C) y la actividad fibrinoliacutetica (A) tal como fue definida es
A = kCa siendo k y a constantes
Puesto que a es diferente de 1 esta relacioacuten no es una funcioacuten lineal Sin embargo
aplicando logaritmos a ambos miembros de la relacioacuten se obtiene
log A = b + alog C siendo b = log k
Lo cual permite estimar los paraacutemetros k y a de forma maacutes precisa mejorando la
precisioacuten del ensayo El paraacutemetro b expresa la actividad fibrinoliacutetica (como log k) cuando la
concentracioacuten es 1 mientras que el paraacutemetro a expresa impliacutecitamente el mecanismo del
ensayo (Jespersen amp Astrup 1983)
La actividad fibrinoliacutetica fue medida por triplicado para una serie de diluciones de cada
preparado proteoliacutetico y se graficaron las relaciones doble logariacutetmicas entre A y C Los
paraacutemetros de correlacioacuten calculados mediante el programa GraphPadPrism version 50
sirvieron para comparar las actividades fibrinoliacuteticas de los distintos preparados ademaacutes de
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
104
encontrar una correlacioacuten entre la actividad caseinoliacutetica y la actividad fibrinoliacutetica para cada una
de ellas
444 Material vegetal
El contenido proteoliacutetico (UCasmg) y proteico (μg proteiacutenamg) asiacute como la actividad
especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos utilizados se presenta en la Tabla 410
Liofilizados UCasmg μg proteiacutenamg UCasmg proteiacutena
Bh 0275 plusmn 0005 27 plusmn 2 10
Pm 0166 plusmn 0009 34 plusmn 3 5
Bb 0155 plusmn 0008 11 plusmn 1 14
Bromelina (Sigma Aldrich) 068 plusmn 004 205 plusmn 2 33
Tabla 410 Contenido proteoliacutetico (UCasmg) proteico (μg proteiacutenamg) y actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos ensayados UCas unidades caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC) Media plusmn DE
Para todos los ensayos las soluciones de los extractos fueron preparadas por
resuspensioacuten de los liofilizados en agua destilada mientras que la bromelina fue redisuelta en
buffer fosfato soacutedico 01 M de pH 6
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
105
45 Resultados y discusioacuten
451 Efecto anticoagulante 4511 Ensayos in vitro
Con el objetivo de determinar las concentraciones tiempos y voluacutemenes a incubar se
realizaron ensayos preliminares con un uacutenico ppp a partir de cuyos resultados (no mostrados)
se decidioacute que el tiempo de incubacioacuten fuera de 2 min Durante los ensayos con el pool de ppp
las concentraciones que no mostraron resultados concluyentes a los 2 min tambieacuten fueron
ensayadas incubando durante 10 min
Debido a que no todas las concentraciones fueron replicadas en igual nuacutemero eacuteste (n)
se indica en la tabla junto con el valor de la desviacioacuten estaacutendar (DE) Como se mencionoacute cada
replicado corresponde a un ensayo independiente y es el promedio de dos medidas realizadas
dentro de cada ensayo Cuando el coaacutegulo no fue detectado dentro de los 180 s desde el inicio
del cronometraje dichas medidas (indicadas como nc) no fueron tenidas en cuenta para el
anaacutelisis estadiacutestico y por tanto no se contabilizaron dentro del valor de n se decidioacute considerar
este tiempo como un efecto maacuteximo
En las tablas aparecen las concentraciones finales es decir referidas al volumen de
mezcla (pool de ppp + preparado proteoliacutetico)
En la mayoriacutea de los casos ademaacutes de diferencias significativas de los valores de TP y
de TTPa respecto a los del control se detectaron coaacutegulos con una consistencia diferente a la
del coaacutegulo obtenido a partir del pool de ppp sin tratamiento proteoliacutetico Por este motivo se
elaboroacute una escala que contempla las diferentes caracteriacutesticas de los coaacutegulos formados
(Tabla 411) En algunos casos se observoacute que el tiempo en que se detecta el hilo de fibrina
(primer indicio de la formacioacuten de fibrina) difiere maacutes del 5 del tiempo en que se detecta el
coaacutegulo de fibrina En este caso se tomoacute como tiempo de coagulacioacuten el promedio de ambos
tiempos y el hecho fue indicado con la letra D
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
106
Caracteriacutestica del coaacutegulo Nuacutemero de referencia
asignado
Filamentoso (carece del volumen y del aspecto
ldquogelatinosordquo del coaacutegulo normal)
I
Muy fraccionado (maacutes de 6 ldquosubcoaacutegulosrdquo) II
Fraccionado (menos de 6 ldquosubcoaacutegulosrdquo) III
Coaacutegulo uacutenico pero de menor solidez que el del pool
de ppp no tratado (imposibilidad de levantarlo con el ansa)
IV
Tabla 411 Escala en que fueron agrupados los coaacutegulos con caracteriacutesticas diferentes de los normales
45111 Tiempo de Protrombina (TP)
En la Tabla 412 se exponen los valores de TP de un pool de ppp luego de incubarlo con
distintas concentraciones de bromelina a 37 ordmC durante 2 min
Bromelina
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
14 gt180 2
13 82 2 37 I (23) nc (13)
11 615 4 8 D (24)
09 38 4 8 D (24)
065 20 3 1
0 165 4 05
Tabla 412 TP para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones bromelina Resultados del test de
Dunnett plt001 plt0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo
nuacutemero de referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada)
nc TPgt180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
La prolongacioacuten significativa del TP fue acompantildeada con alteracioacuten ya sea en el
intervalo de deteccioacuten del coaacutegulo (D) como en la caracteriacutestica del coaacutegulo (I)
En la tabla 413 se muestran los valores de TP del pool de ppp despueacutes de incubarlo con
distintas concentraciones de Bh a 37 ordmC Luego de incubar el pool de ppp con 35 mgmL
durante 2 min se obtuvieron valores y caracteriacutesticas de coaacutegulo muy dispares entre los
replicados Por esta razoacuten se ensayoacute tambieacuten el tiempo de incubacioacuten de 10 min para 35
mgmL y 25 mgmL suponiendo que quizaacutes Bh requiriera mayor tiempo para llegar a un
equilibrio
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
107
Bh (Incubacioacuten 2 min) Bh (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE Caracteriacutestica del coaacutegulo TP (s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
55 62 2 23 I (23) nc (13)
35 437 4 13 I (24)IV (24)D 345 3 9 I (13)
25 20 3 35 IV 22 3 3 IV
15 175 3 2
0 167 3 06 165 3 06 165
Tabla 413 TP para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bh Resultados test de
Dunnett plt001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo nuacutemero de
referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TPgt180
s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
Sin embargo puede observarse que no ha habido variacioacuten significativa luego de
incubar 10 min respecto de los valores obtenidos al incubar 2 min Al igual que lo observado
para bromelina la prolongacioacuten significativa del TP fue acompantildeado por una alteracioacuten en la
caracteriacutestica del coaacutegulo
En la tabla 414 se muestran los valores de TP del pool de ppp luego de incubarlo con
distintas concentraciones de Bb a 37 ordmC
Bb (Incubacioacuten 2 min) Bb (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TP
(s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
85 58 2 0 I (23) nc (13)
75 58 1 0 I (13) nc (23)
73 437 3 55 46 3 4 I (13)
65 29 3 4
0 15 3 1 16 3 06
Tabla 414 TP para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bb n nuacutemero de replicados
DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo nuacutemero de referencia asignado (entre pareacutentesis se indica la
frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TPgt180 s Resultados test de Dunnett (Bb incubacioacuten 2
min) plt005 plt0001 Resultado t-test (Bb incubacioacuten 10 min) plt0001
No se observan cambios significativos entre los valores de TP del pool de ppp incubado
a 2 y 10 min para una misma concentracioacuten Sin embargo hay un gran cambio en relacioacuten a la
caracteriacutestica del coaacutegulo cuando se variacutea muy poco la concentracioacuten (de 73 a 75 mgmL) En
este caso siacute hay una concentracioacuten que variacutea significativamente el TP sin alterar (al menos
visiblemente) la caracteriacutestica del coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
108
En la tabla 415 se exponen los valores de TP del pool de ppp luego de incubarlo con
Pm durante 2 min a 37 ordmC No se ha observado alteracioacuten visible en la caracteriacutestica del
coaacutegulo aunque siacute en el intervalo de deteccioacuten del coaacutegulo (D) y al igual que ocurre con Bb
existe una concentracioacuten que provoca una variacioacuten significativa del TP sin alterar la
caracteriacutestica del coaacutegulo
Pm
Concentracioacuten
(mgmL) TP (s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
9 gt180 2
8 551 5 10 D (45)
78 563 4 45 D (34)
65 323 3 35
55 215 2 05
0 153 3 07
Tabla 415 TP para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de Pm Resultados test de Dunnett
p lt 005 p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo D diferencia
temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica
mencionada)
45112 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)
Los valores de TTPa del pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min a 37 ordmC con
distintas concentraciones de bromelina se muestran en la Tabla 416 La concentracioacuten a partir
de la cual se observa una prolongacioacuten significativa del TTPa es similar a la miacutenima
concentracioacuten que prolonga el TP (asymp 09 mgmL) Si bien se observaron diferencias entre el
tiempo en que se detecta el hilo y el coaacutegulo (D) no se visualizaron cambios en la caracteriacutestica
del coaacutegulo respecto a la de un coaacutegulo normal
Bromelina
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
10 gt180 2
085 523 6 8 D (26)
050 343 3 07
0 364 5 3
Tabla 416 TTPa para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de bromelina Resultados test de
Dunnett p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
109
El TTPa del pool de ppp incubado con distintas concentraciones de Bh durante 2 min a
37 ordmC (Tabla 417) fue prolongado significativamente con concentraciones similares a las que
prolongaron el TP Al igual que lo observado en el ensayo para determinar el TP las
concentraciones que prolongaron el TTPa tambieacuten produjeron cambios visibles en la
caracteriacutestica del coaacutegulo
Bh (Incubacioacuten 2 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
38 gt180 3
35 74 4 8 II (34)I(14)
33 534 5 3 IV D (35)
3 457 3 9 IV
0 397 3 06
Tabla 417 TTPa para ppp incubado durante 2 min con distintas concentraciones de Bh Resultado test de Dunnett
p lt 0001 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica
la frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo
En la tabla 418 se presentan los valores de TTPa del pool de ppp luego de incubarlo
con distintas concentraciones de Bb durante 2 y 10 min En comparacioacuten con los resultados del
ensayo de medida de TP puede observarse que las concentraciones que prolongaron
significativamente los TTPas estaacuten dentro del rango de concentraciones que prolongaron los
TPs Sin embargo se observoacute cambio en la caracteriacutestica del coaacutegulo cuando hubo
prolongacioacuten significativa de los tiempos
Bb (Incubacioacuten 2 min) Bb (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) n DS
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TTPa
(s) n DS
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
85 765 2 5 I nc (13) 70 2 9 I nc (13)
75 58 3 7 IIID (23) 60 3 9 II D (13)
65 45 1 IV
55 407 3 3 IV
0 403 3 2 403 3 2
Tabla 418 TTPa para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Bb n nuacutemero de
replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la frecuencia observada
de la caracteriacutestica mencionada) nc TTPa gt 180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de hilo y coaacutegulo Bb
(Incubacioacuten 2 min) plt001 (Dunnett) Bb (Incubacioacuten 10 min) plt005 (t-test)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
110
Los tiempos medidos a los 2 y 10 min no fueron significativamente diferentes mientras
que las caracteriacutesticas de los coaacutegulos formados apenas variaron (de III a II)
Luego de incubar el pool con diferentes concentraciones de Pm durante 2 min no se
encontroacute una concentracioacuten que prolongara significativamente el TTPa antes de que lo hiciera
con un TTPa gt 180 s Siacute se observaron cambios en la caracteriacutestica de los coaacutegulos formados
luego de incubar el pool con cada concentracioacuten ensayada (Tabla 419) Cuando se incuboacute
durante 10 min la concentracioacuten de 45 mgmL prolongoacute significativamente el TTPa que resultoacute
ser mayor al TTPa luego de incubar el pool durante 2 min con la misma concentracioacuten Si se
comparan las tablas 415 y 419 se puede observar que la concentracioacuten que prolongoacute maacutes allaacute
de 180 s el TP fue aproximadamente dos veces mayor que la necesaria para prolongar a maacutes
de 180 s el TTPa lo cual estariacutea indicando una mayor especificidad de Pm hacia alguno de los
componentes de la viacutea intriacutenseca que de la extriacutenseca
Pm (Incubacioacuten 2 min) Pm (Incubacioacuten 10 min)
Concentracioacuten
(mgmL)
TTPa
(s) N DE
Caracteriacutestica del
coaacutegulo
TTPa
(s) n DE
Caracteriacutestica
del coaacutegulo
5 60 2 0 I nc (13)
45 433 3 4 III D (23) 757 3 13 II D (23)
4 362 3 3 IV D (23)
25 362 2 04 D
0 41 3 06 41 3 07
Tabla 419 TTPa para ppp incubado durante 2 y 10 min con distintas concentraciones de Pm Resultados t- test p
lt 005 n nuacutemero de replicados DE desviacioacuten estaacutendar Caracteriacutestica del coaacutegulo (entre pareacutentesis se indica la
frecuencia observada de la caracteriacutestica mencionada) nc TTPa gt 180 s D diferencia temporal entre aparicioacuten de
hilo y coaacutegulo
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
111
Para facilitar la comparacioacuten de los efectos de los preparados proteoliacuteticos sobre el TP y
el TTPa se graficaron las relaciones TPpTPc y TTPapTTPac en funcioacuten de la actividad
proteoliacutetica (UCas) de los preparados (Figura 46)
Figura 46 Tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) del pool de ppp luego de
incubarlo con los preparados (TPp TTPap respectivamente) respecto a los tiempos del control (TPc TTPac
respectivamente) en funcioacuten de las UCasmL de bromelina (Bro) y de los preparados de Bromelia balanse (Bb) B
hieronymi (Bh) y Pseudananaacutes macrodontes (Pm) Media plusmn SEM Las liacuteneas verticales con la flecha correspondiente
indican la miacutenima concentracioacuten del preparado respectivo en que no se detecta el coaacutegulo antes de 180 s
El hecho de que la caracteriacutestica del coaacutegulo (I II III IV) variara en relacioacuten a la
concentracioacuten y al preparado con el cual se incuboacute ademaacutes de la alteracioacuten en el intervalo de
deteccioacuten del coaacutegulo (D) dificultoacute las medidas de los tiempos y aportoacute una variabilidad
cualitativa que afectoacute la variabilidad de los tiempos principalmente cuando fueron cercanos al
nc Esto dificultoacute la comparacioacuten entre los efectos de los preparados asiacute como establecer
00 05 10 15
2
4
6
Bro
Bh
Bb
Pm
088 116 15215
I
D
D
DIV
I
IV
I DD
UCasmL
TP
pT
Pc
00 05 10 1505
10
15
20
25
30
Bro
Bh
Bb
Pm
083 132068 104
I
DIII
IV
D
II
IVIV
DIV
DIII
I
DIVD
UCasmL
TT
Pa
pT
TP
ac
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
112
concentraciones efectivas pero de todos modos no impidioacute obtener algunas conclusiones tal
como se indica a continuacioacuten
En todos los casos de un corto rango de concentraciones que alteraron
progresivamente la caracteriacutestica normal del coaacutegulo se pasoacute bruscamente a TP y TTPa
prolongados a maacutes de 10 y 4 veces respectivamente
Para todos los preparados hubo alguna concentracioacuten que ademaacutes de prolongar el TP y
el TTPa modificoacute la caracteriacutestica del coagulo o afectoacute el intervalo de deteccioacuten del mismo (D)
Esto podriacutea estar indicando un efecto directo sobre la estructura de la fibrina yo puesto que
eacutesta depende fuertemente de la concentracioacuten asiacute como de la estructura del fibrinoacutegeno
(Lauricella 2007) tambieacuten sobre la del fibrinoacutegeno Dado que la creciente evidencia apoya el
concepto de que las caracteriacutesticas estructurales de la fibrina pueden representar un nuevo
factor de riesgo para el tromboembolismo arterial y venoso (Undas amp Arieumlns 2011) el
acompantildeamiento de alteraciones en el coaacutegulo al efecto anticoagulante puede resultar una
desventaja De todos modos esto soacutelo podraacute ser determinado mediante estudios que empleen
modelos de trombosis
Otra informacioacuten que se puede obtener de la Figura 46 es que teniendo en cuenta las
actividades proteoliacuteticas de cada preparado la bromelina ha sido la maacutes potente Se requirieron
088 (plusmn 005) 116 (plusmn 006) 15 (plusmn 008) y 152 (plusmn 003) UCasmL de bromelina Bb Pm y Bh
respectivamente para prolongar el TP a maacutes de 180 s yo producir un coaacutegulo Tipo I En tanto
que para prolongar el TTPa a maacutes de 180 s (yo coaacutegulo Tipo I) se requirieron 068 (plusmn 004)
083 (plusmn 004) 104 (plusmn 002) y 132 (plusmn 007) UCasmL de bromelina Pm Bh y Bb
respectivamente Pareceriacutea existir cierta especificidad de cada preparado proteoliacutetico hacia una
u otra viacutea del modelo claacutesico de la coagulacioacuten Por ejemplo 083 UCasmL de Pm son
suficientes para prolongar el TTPa a maacutes de 180 s mientras que el mismo efecto sobre el TP
requirioacute 152 UCasmL de Pm Algo similar ocurre para los demaacutes preparados
Probablemente estas diferencias se pudieron deber a componentes diferentes a las
proteasas cisteiacutenicas presentes en los preparados Para poner a prueba dicha suposicioacuten y
determinar si el efecto anticoagulante es debido a la accioacuten de proteasas cisteiacutenicas se
determinoacute el TP y el TTPa del pool de ppp luego de incubarlo con soluciones de los preparados
tratados y no tratados con E-64
45113 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas cisteiacutenicas de los preparados proteoliacuteticos
sobre su efecto anticoagulante
En las Figuras 47 y 48 se muestran el TP y el TTPa respectivamente del pool de ppp
luego de incubarlo durante 2 min a 37 ordmC con las soluciones de bromelina Bh Bb y Pm antes y
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
113
despueacutes de inhibir sus cisteiacutenendopeptidasas Las concentraciones ensayadas fueron un 10
mayor que aquellas que prolongaban el TP y el TTPa por encima de 180 s En la Tabla 420 se
muestran los valores de actividad caseinoliacutetica de las soluciones de bromelina Bh Pm y Bb
antes y despueacutes de tratarlas con E-64 (035 mM) El TP y el TTPa del control fue obtenido luego
de incubar durante 2 min a 37 ordmC 100 μL del pool de ppp con 10 μL de 035 mM de E-64 en
buffer fosfato soacutedico 01M pH 6
Figura 47 TP de un pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min con Bro (155 mgmL) Bh (6 mgmL) Bb (95 mgmL) y Pm (95 mgmL) inactivas (Con E-64) y activas (Sin E-64) proteoliacuteticamente Valores expresados como la media plusmn DE (n = 3) excepto para los grupos Sin E-64 cuyos TP fueron mayores a 180 s Resultado test de Dunnett entre el grupo Con E-64 y el grupo Control p lt 005
Figura 48 TTPa de un pool de ppp luego de incubarlo durante 2 min con Bro (11 mgmL) Bh (45 mgmL) Bb (95 mgmL) y Pm (65 mgmL) inactivas (Con E-64) y activas (Sin E-64) proteoliacuteticamente Valores expresados como la media plusmn DE (n=3) excepto para los grupos Sin E-64 cuyos TTPa fueron mayores a 180 s Resultado test de Dunnett entre el grupo Con E-64 y el grupo Control p lt 001 p lt 0001
0
50
100
150
Sin E-64Con E-64Control
Bro(155 mgmL)
Bh(6 mgmL)
Bb(95 mgmL)
Pm(95 mgmL)
180
TP
(s)
0
50
100
150
Con E-64
Control
Sin E-64
180
Bro(11 mgmL)
Bh(45 mgmL)
Bb(95 mgmL)
Pm(65 mgmL)
TT
Pa (
s)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
114
Puede observarse que la prolongacioacuten del TP y del TTPa del pool de ppp luego de
incubarlo con cada preparado es debida preponderantemente a la actividad proteoliacutetica de
proteasas cisteiacutenicas Sin embargo el efecto anticoagulante de Bb y Pm no revirtioacute
completamente cuando sus proteasas fueron inhibidas lo cual podriacutea indicar la presencia de
otro componente anticoagulante presente en los preparados Esto es maacutes notable para el TTPa
medido luego de incubar el pool con Pm sin actividad proteoliacutetica (TTPapTTPac igual a 215) lo
cual sumado a que el TP no es afectado por Pm inhibido es coherente con el hecho de que se
requiere mayor UCasmL para prolongar el TP que para prolongar el TTPa Bb inhibido tambieacuten
prolongoacute significativamente el TP y el TTPa aunque las relaciones TPpTPc y TTPapTTPac
fueron maacutes bajas (13 y 14 respectivamente) Un dato importante es que la caracteriacutestica de
los coaacutegulos formados a partir del pool tratado con los preparados inhibidos no mostroacute
diferencias respecto a la caracteriacutestica de un coaacutegulo normal Esto estariacutea indicando que las
alteraciones observadas (I II III IV D) en los coaacutegulos formados desde el pool tratado con los
preparados se debieron a la accioacuten de las proteasas
Liofilizados Solucioacuten (mgmL) Sin E-64 (UCasmL) Con E-64 (UCasmL)
Bro 204 14 plusmn 02 -045 plusmn 027
Bh 100 273 plusmn 04 -03 plusmn 02
Bb 160 244 plusmn 06 -06 plusmn 03
Pm 100 165 plusmn 01 -02 plusmn 01
Tabla 420 Actividad proteoliacutetica frente al sustrato caseiacutena de las soluciones de Bro Bh Bb y Pm antes (Sin E-64) y
despueacutes (Con E-64) de ser tratadas con 035 mM de E-64 durante 30 min a 37ordmC Los valores son expresadas como la media plusmn DE (n = 3) UCas unidades caseinoliacuteticas a 37 ordmC en buffer Tris-ClH 01M pH 75
Otra causa posible que pudiera explicar el efecto anticoagulante de los preparados
tratados con E-64 es que haya quedado una actividad proteoliacutetica remanente que no haya sido
detectada por el ensayo de actividad caseinoliacutetca Puesto que la teacutecnica de la placa de fibrina
es muy sensible tambieacuten se evaluoacute la actividad fibrinoliacutetica de las soluciones de bromelina Bh
Bb y Pm inhibidas con E-64 Sin embargo tampoco pudo detectarse actividad frente a fibrina
4512 Ensayos in vivo
Las dosis de bromelina Bh Bb y Pm administradas a los animales fueron estimadas
teniendo en cuenta los resultados de los ensayos in vitro y la relacioacuten plasmapeso corporal
establecida para ratas Wistar por Bijsterbosch et al (1981) seguacuten la cual
volumen de plasma (mL) = 00291PC(g) + 254 donde PC es el peso corporal
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
115
Como primera aproximacioacuten se definioacute una misma dosis en UCaskg de bromelina Bh
Bb y Pm a fin de poder compararlas La dosis que se eligioacute fue aquella que en los ensayos in
vitro para todos los preparados evaluados prolongara el TP y el TTPa maacutes de 180 s De la
informacioacuten provista por la figura 46 se puede concluir que a partir de la concentracioacuten de 155
UCasmL de plasma se cumple con dicho requisito Por tanto se optoacute por una dosis de 2
UCasmL de plasma equivalente a 633 UCaskg de animal (aplicando la ecuacioacuten antes
mencionada) que fue redondeada a 65 UCaskg
En la Figura 49 se exponen los valores de TP y de TTPa de ppp extraiacutedos luego de 4 h
de la administracioacuten intraperitoneal de los preparados proteoliacuteticos El tiempo de 4 h fue
establecido de experimentos previos con bromelina
Figura 49 TP y TTPa de ppp obtenido de ratas Wistar luego de 4h de la administracioacuten intraperitoneal de 65 UCaskg de bromelina (Bro) Bh Bb y Pm Valores expresados como la media plusmn SEM Nuacutemero de replicados (n) 6 (Control Bh Pm) 5 (Bro y Bb) Tukeyacutes test p lt 005 p lt 001 las medias con al menos una letra comuacuten no son significativamente diferentes con p lt 005 la letra ldquocrdquo indica que la media no es significativamente diferente del grupo control a plt005
Aunque todos los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos mostraron valores
prolongados de TP y de TTPa respecto a los de los lotes controles soacutelo fueron significativos
(plt005) los tiempos de los lotes tratados con bromelina y el TP del lote tratado con Bb los
cuales significaron alrededor de un 20 de los tiempos del lote control Por otra parte los
tiempos de los lotes tratados con los preparados proteoliacuteticos no se diferenciaron
significativamente entre siacute Tampoco se detectaron alteraciones en los coaacutegulos durante las
medidas de TP y de TTPa
Los resultados obtenidos en los experimentos in vivo e in vitro (Figura 46) coinciden en
que la bromelina ha sido la maacutes efectiva frente a TTPa y a TP y en que Bb es maacutes efectivo para
prolongar el TP que el TTPa De todos modos debe tenerse en cuenta que estos resultados
soacutelo sirven como una primera aproximacioacuten en la determinacioacuten de dosis efectivas
Control Bro Bh Bb Pm 0
10
20
30aa
cca ca
TP
(s)
Control Bro Bh Bb Pm 0
10
20
30
ca
a
cca
ca
TT
Pa (
s)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
116
452 Efecto fibrinogenoliacutetico
En la Figura 410 se muestran las electroforesis junto al densitograma respectivo de los
hidrolizados obtenidos luego de incubar 200 μL de fibrinoacutegeno bovino 12 mgmL con 075 μL de
cada preparado proteoliacutetico equivalente a 1 UCasmL durante 2 30 60 90 120 y 180 min a 37
ordmC El tiempo 0 min corresponde al blanco de reaccioacuten resultante de inactivar el preparado
proteoliacutetico con iodoaceacutetico y buffer de muestra antes de mezclarlo con la solucioacuten de
fibrinoacutegeno
La similitud entre los perfiles electroforeacuteticos obtenidos con todos los preparados estariacutea
indicando una similar actividad proteoliacutetica frente al fibrinoacutegeno ya sea por la preferencia de
sustrato como por la velocidad de reaccioacuten La primera subunidad en ser degradada
completamente fue Aα hecho observado para todos los preparados a los 2 min de incubacioacuten
Le siguioacute Bβ a los 30 min mientras que la subunidad γ fue la maacutes resistente permaneciendo
intacta durante 180 min de incubacioacuten con cada preparado Otra caracteriacutestica comuacuten
observada en todas las electroforesis fue la presencia de un polipeacuteptido de alrededor de 30
kDa aunque en menor cantidad luego de incubar con Bh que probablemente sea producto de
degradacioacuten de la subunidad Bβ puesto que aparece luego de su desaparicioacuten
Para determinar si la resistencia de la subunidad γ a ser degradada por los preparados
es absoluta se incuboacute el fibrinoacutegeno con una concentracioacuten mayor de cada preparado de
manera de aumentar en 100 veces la relacioacuten enzimasustrato Los perfiles electroforeacuteticos
obtenidos luego de incubar 68 μL de fibrinoacutegeno 34 mgmL con 7 μL de 10 UCasmL de cada
preparado durante 10 y 120 min a 37 ordmC se muestran en la Figura 411
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
117
Figura 410 Tricina-SDS-PAGE de fibrinoacutegeno bovino antes (calle 2) y luego de incubarlo a 37ordmC durante 2 30 60 90 120 y 180 min (calles 4 5 6 7 8 y 9 respectivamente) con bromelina (Bro) Bh Bb y Pm Calle 3 blanco de reaccioacuten (0 min) Calle 1 patrones de peso molecular (Bio-Rad) A la derecha de cada electroforesis se encuentra el densitograma respectivo Son indicadas con flechas las subunidades Aα (α) Bβ (β) y γ del fibrinoacutegeno
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Bro
a b g
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Bh
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)Bb
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) 0 min
(4) 2 min
(5) 30 min
(6) 60 min
(7) 90 min
(8) 120 min
(9) 180 min
Pm
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
118
Figura 411 Tricina-SDS-PAGE de fibrinoacutegeno bovino antes (calle 2) y luego de incubarlo a 37ordmC durante 10 y 120
min con bromelina (Bro) Bh Bb y Pm (calles 3 4 5 y 6 respectivamente) Calle 1 patrones de peso molecular (Bio-Rad) A la derecha de cada electroforesis se encuentra el densitograma respectivo Son indicadas con flechas las subunidades Aα Bβ y γ del fibrinoacutegeno
Puede observarse que hubo una disminucioacuten en la banda correspondiente a la
subunidad γ a partir de los 10 min de incubacioacuten con cada preparado y que siguioacute disminuyendo
hasta casi desaparecer a los 120 min lo cual confirma que si bien la subunidad γ es altamente
resistente a la accioacuten de las proteasas finalmente es susceptible de ser degradada
A diferencia de lo observado en los ensayos de medidas del efecto anticoagulante la
misma cantidad de UCasmL de cada preparado tuvo un efecto similar sobre el fibrinoacutegeno
Esto puede deberse a que en el plasma cada preparado puede actuar tambieacuten sobre otros
componentes del sistema hemostaacutetico como asiacute tambieacuten pueden ser inhibidos de manera
diferente por α2-MG
Si bien el efecto fibrinogenoliacutetico fue evaluado usando fibrinoacutegeno bovino dada la
escasa diferencia estructural y funcional entre los fibrinoacutegenos de diferentes especies (Weisel
2005) el efecto sobre la subunidad Aα puede servir para explicar la alteracioacuten del coaacutegulo
formado luego de incubar el pool de ppp con los preparados La regioacuten C-α de Aα una vez
producida la liberacioacuten de los fibrinopeacuteptidos A y B produce la agregacioacuten lateral de microfibras
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
974 662 450 310 215 144
PM (kDa)
10 min
120 min
a b g
a b g
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(3) Bro(4) Bh
(5) Bb(6) Pm
(1) Patrones de PM
(2) Fibrinoacutegeno
(4) Bh
(5) Bb(6) Pm
(3) Bro
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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de fibrina contribuyendo al espesor de la fibra la resistencia a la traccioacuten de la fibrina (Undas amp
Arieumlns 2011) y la rigidez macroscopia observada (Purohit et al 2011)
Por otro lado dado que el fibrinoacutegeno une las plaquetas favoreciendo la agregacioacuten
plaquetaria se podriacutea suponer que Bh Bb y Pm a traveacutes de su accioacuten fibrinogenoliacutetica
afectaraacuten dicho proceso
453 Efecto fibrinoliacutetico
El efecto de los preparados sobre la fibrina fue evaluado mediante el ensayo de la placa
de fibrina En la Figura 412 se muestran los graacuteficos en escala doble logariacutetmica de
(a) la actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la actividad caseinoliacutetica (UCasmL) y
(b) la actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas (μgmL)
Figura 412 Ensayo de la placa de fibrina a Actividad fibrinoliacutetica (mm2mL) en funcioacuten de la actividad
caseinoliacutetica (UCasmL) y b actividad fibrinoliacutetica en funcioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas (μgmL) de bromelina (Bro) Bh Bb Pm y plasmina en escala doble logariacutetmica (Log-Log) Valores expresados como la media plusmn DE
En las tablas 421 y 422 se muestran los paraacutemetros de correlacioacuten lineal
(GraphPadPrism) determinados para cada preparado seguacuten la relacioacuten log A = b + alog C
siendo A la actividad fibrinoliacutetica y C la concentracioacuten del preparado (Jespersen amp Astrup
1983)
Actividad fibrinoliacutetica-Actividad caseinoliacutetica
Paraacutemetros Bro Bh
Bb
Pm
a 022c plusmn 002 063
a plusmn 003 063
a plusmn 004 052
b plusmn 002
b 417 plusmn 001 369 plusmn 002 368 plusmn 003 378plusmn 002
r2
09017 09775 09639 09767
N 12 14 11 13
Tabla 421 Paraacutemetros de correlacioacuten lineal de la relacioacuten Log-Log entre actividad fibrinoliacutetica y actividad
caseinoliacutetica a pendiente b Log A (cuando C=1 UCasmL) N nuacutemero de puntos Letras superiacutendices distintas indican diferencias significativas (p lt 005)
a b
-05 00 05 10 1530
35
40
45
50
Actividad caseinoliacutetica (UCasmL)
Ac
tiv
ida
d f
ibri
no
liacuteti
ca
(m
m2m
L)
1 2 3 430
35
40
45
50
Pm
Bh
Bro
Plasmina
Bb
Concentracioacuten de proteiacutenas (gmL)
Ac
tiv
ida
d f
ibri
no
liacuteti
ca
(m
m2m
L)
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Actividad fibrinoliacutetica-Proteiacutenas
Paraacutemetros Bro Bh Bb
Pm Plasmina
a 022c plusmn 002 062
b plusmn 004 062
b plusmn 004 052
b plusmn 002 023
c plusmn 002
b 363 plusmn 007 24 plusmn 01 26 plusmn 01 261plusmn 006 388plusmn 003
r2
08884 09586 09624 09812 09575
N 12 14 11 13 8
Tabla 422 Paraacutemetros de correlacioacuten lineal de la relacioacuten Log-Log entre actividad fibrinoliacutetica y proteiacutenas a
pendiente b Log A (cuando C=1 μgmL) N nuacutemero de puntos Letras superiacutendices distintas indican diferencias significativas (p lt 005)
Tanto para la relacioacuten entre actividad fibrinoliacutetica y actividad caseinoliacutetica como para la
relacioacuten entre actividad fibrinoliacutetica y proteiacutenas puede observarse que la pendiente a y la
ordenada al origen b de Bh Bb y Pm fueron similares entre siacute y diferentes significativamente de
las de bromelina En la tabla 422 se puede observar que bromelina y plasmina tuvieron
similares pendientes a lo cual permite expresar la actividad fibrinoliacutetica de la bromelina en
unidades de plasmina (Jespersen amp Astrup 1983) En este caso 1 μg de bromelina equivale a
007 μg de plasmina humana (P1867 Sigma Adrich)
La existencia de diferentes pendientes estariacutea indicando diferentes mecanismos
intriacutensecos (Jespersen amp Astrup 1983) En este sentido un factor que puede estar influyendo en
el valor del aacuterea de lisis ademaacutes de la actividad proteoliacutetica es la difusioacuten de las proteasas en
la red de fibrina Puesto que todas las proteasas tienen pesos moleculares similares (entre 22 y
25 kDa) y que las soluciones ensayadas de Bh Bb y Pm se prepararon al disolver el liofilizado
(a partir de una solucioacuten de buffer fosfato soacutedico 01M pH 6) en agua mientras que la bromelina
se disolvioacute en buffer de placa (barbital 0045 M pH 775 NaCl 92 mM) se supuso que el medio
de resuspensioacuten podriacutea estar influyendo Sin embargo no se encontraron diferencias
significativas entre las aacutereas de lisis medidas para bromelina disuelta en diferentes molaridades
del buffer fosfato soacutedico de pH 6 (BF) respecto al aacuterea medida para la bromelina disuelta en el
buffer de placa (BP) como asiacute tampoco se hallaron diferencias significativas entre las
pendientes y las ordenadas al origen de las curvas de actividad fibrinolitica en relacioacuten a la
concentracioacuten de bromelina disuelta en BF o BP (Figura 413)
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Figura 413 Efecto del buffer de resuspensioacuten sobre la actividad fibrinoliacutetica de bromelina A Actividad fibrinoliacutetica (mm
2mL) en funcioacuten de la concentracioacuten (mgmL) en escala doble logariacutetmica BF buffer fosfato soacutedico 01 M pH 6
B Actividad fibrinoliacutetica (mm2gota sembrada) para 35 mgmL de bromelina disuelta en diferentes molaridades de BF
de pH 6 Valores expresados como la media plusmn DE
Por lo tanto puede concluirse que bromelina demuestra poseer una mayor actividad
fibrinoliacutetica que Bh Bb y Pm para concentraciones menores a 10 UCasmL mientras que para
concentraciones mayores a 10 UCasmL Bh Bb y Pm tendriacutean mayor actividad fibrinoliacutetica que
bromelina
Una comparacioacuten de la actividad fibrinoliacutetica (412 a) y del efecto anticoagulante (Figura
46) de los preparados permite observar que para prolongar el TP y el TTPa a maacutes de 180 s
bromelina requirioacute aproximadamente 3 veces maacutes de actividad fibrinoliacutetica (entre 136 x103 y
144 x103 mm2mL) que Bh Bb y Pm (entre 52 x103 y 64 x103 mm2mL) Expresado en otros
teacuterminos bromelina muestra mayor efecto fibrinoliacutetico que Bh Bb y Pm sin afectar el TP y el
TTPa lo cual podriacutea llevar a suponer que resultariacutea maacutes ventajosa como agente fibrinoliacutetico
para el tratamiento de algunos de los desoacuterdenes tromboacuteticos (Merli 2007) Sin embargo se
trata de una comparacioacuten entre dos sistemas distintos que tampoco presentan la complejidad
de una trombosis Futuros ensayos fundamentalmente en modelos in vivo son necesarios para
afianzar o descartar estos resultados preliminares
Actividad fibrinoliacutetica de Bromelina (35mgmL)Efecto del buffer de resuspensioacuten
005M 02M 04M Buffer de placa0
50
100
150
200
250
Buffer fosfato soacutedico pH 6
Buffer de resuspensioacuten
mm
2
BromelinaEfecto del buffer de resuspensioacuten
00 05 10 1540
41
42
43
44
45
BF (01M)
BP (005 M)
Concentracioacuten (mgmL)
Acti
vid
ad
fib
rin
oliacuteti
ca (
mm
2m
L)
A B
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46 Conclusiones
Todos los preparados mostraron actividad anticoagulante en los ensayos in vitro efectos
completamente atribuibles a la accioacuten proteoliacutetica de las cisteiacutenendopeptidasas
presentes en Bh y Bro pero parcialmente a las cisteiacutenendopeptidasas de Pm y Bb
Bromelina Bh y Pm fueron maacutes efectivas para prolongar el TTPa de un pool de ppp que
el TP mientras que Bb fue maacutes efectiva para prolongar el TP que el TTPa
Para todos los preparados el efecto sobre el TP y sobre el TTPa fue acompantildeado de un
efecto sobre la caracteriacutestica del coaacutegulo formado (filamentoso fraccionado fraacutegil) el
cual revirtioacute cuando las proteasas fueron inhibidas con E-64
En los ensayos in vivo soacutelo bromelina y Bb con dosis equivalentes en unidades
caseinoliacuteticas tuvieron un leve efecto anticoagulante
Todos los preparados con unidades caseinoliacuteticas equivalentes degradaron el
fibrinoacutegeno con una cineacutetica similar siendo la subunidad Aα la primera en ser degradada
y γ la maacutes resistente
Todos los preparados mostraron accioacuten fibrinoliacutetica siendo maacutes efectiva la bromelina
para concentraciones menores a 10 UCasmL
La bromelina mostroacute un comportamiento similar frente a la fibrina que la plasmina
Los resultados obtenidos en los ensayos permiten concluir que Bh Pm y en especial Bb
podriacutean tener un potencial efecto antitromboacutetico y tromboliacutetico hecho que deberaacute
evaluarse en otros modelos experimentales
Los resultados obtenidos para Bh Pm y Bb pueden ser de utilidad para el disentildeo de
futuros ensayos a los fines de establecer su efectividad como agentes para el
tratamiento de trombosis
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ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
125
51 Las causas de la aparicioacuten del caacutencer
El caacutencer sigue siendo una de las enfermedades que maacutes preocupan a la
humanidad auacuten cuando no ocupe el primer lugar entre las principales causas de muerte en
el mundo Si bien la ciencia ha ido aportando sucesivos conocimientos en diferentes
aspectos hecho que ha permitido incrementar los mecanismos de prevencioacuten y de
tratamiento se encuentra auacuten sin respuesta la pregunta relacionada con las verdaderas
causas de la enfermedad (Gibbs 2003) Una explicacioacuten posible es que una ceacutelula debe
adquirir habilidades extraordinarias para convertirse en ceacutelula maligna hace poco maacutes de
una deacutecada Hahn amp Weinberg (2002) describieron las condiciones que debe reunir una
ceacutelula normal para convertirse en canceriacutegena a las que denominaron ldquolos seis
superpoderes diaboacutelicos del caacutencerrdquo ilustrados en la Figura 51 y que se describen a
continuacioacuten
1 Crecimiento en ausencia de sentildeales La mayoriacutea de las ceacutelulas normales esperan un
mensaje externo antes de comenzar a dividirse Las ceacutelulas cancerosas a menudo
falsifican sus propios mensajes pro-crecimiento
2 Crecimiento a pesar de oacuterdenes de detencioacuten A medida que el tumor se expande
comprime al tejido adyacente el cual enviacutea mensajes quiacutemicos que normalmente
detienen la divisioacuten celular Las ceacutelulas malignas ignoran tales oacuterdenes asiacute como los de
sus propios mecanismos internos de envejecimiento
3 Evasioacuten de los mecanismos de autodestruccioacuten En las ceacutelulas sanas el dantildeo geneacutetico
por encima de un nivel criacutetico usualmente activa un programa suicida Las ceacutelulas
cancerosas eluden este mecanismo aunque a veces algunos agentes del sistema
inmune pueden obligar a las ceacutelulas cancerosas a autodestruirse
4 Construccioacuten de nuevos vasos sanguiacuteneos Los tumores necesitan oxiacutegeno y nutrientes
para sobrevivir que obtienen obligando a que los vasos sanguiacuteneos vecinos formen
nuevas ramas que se desarrollen a lo largo de la masa tumoral en crecimiento
5 Inmortalidad efectiva Las ceacutelulas sanas usualmente no se dividen maacutes de 70 veces pero
las ceacutelulas malignas necesitan un nuacutemero mayor de divisiones para formar tumores El
envejecimiento celular parece estar relacionado con los teloacutemeros ubicados a ambos
extremos de cada cromosoma La telomerasa permite mantener la longitud normal de los
teloacutemeros solamente en ceacutelulas sexuales no en el resto de las ceacutelulas del organismo Sin
embargo las ceacutelulas canceriacutegenas son capaces de desarrollar actividad telomeraacutesica lo
que praacutecticamente las torna inmortales
6 Poder para invadir otros tejidos y extenderse a otros oacuterganos Cuando las ceacutelulas
cancerosas logran deshabilitar el circuito celular que las confina a una parte especiacutefica
del oacutergano en el cual se generaron se manifiesta la capacidad de invadir los tejidos
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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cercanos y provocar metaacutestasis en partes lejanas de su ubicacioacuten original lo que le da al
caacutencer su caraacutecter letal
Figura 51 Ilustracioacuten de las seis principales capacidades desarrolladas por las ceacutelulas caacutenceriacutegenas (tomado de
Hanahan amp Weinberg 2011)
A favor de la manifestacioacuten de estas caracteriacutesticas de las ceacutelulas tumorales juega un
rol fundamental la inestabilidad del genoma que genera la diversidad geneacutetica que facilita
su aparicioacuten asiacute como la inflamacioacuten que tambieacuten fomenta muacuteltiples funciones distintivas
Como resultado del avance conceptual en la uacuteltima deacutecada se han antildeadido dos nuevas
caracteriacutesticas a las seis capacidades de las ceacutelulas tumorales antes sentildealadas
involucradas en la patogeacutenesis de algunos y quizaacutes de todos los tipos de caacutencer la
reprogramacioacuten del metabolismo energeacutetico y la capacidad de evadir la destruccioacuten inmune
La primera de ellas consiste en la capacidad de modificar o reprogramar el metabolismo
celular con el fin de apoyar maacutes eficazmente la proliferacioacuten neoplaacutesica La segunda permite
que las ceacutelulas cancerosas puedan evadir la destruccioacuten inmunoloacutegica en particular por
linfocitos T y B macroacutefagos y ceacutelulas asesinas naturales (ldquonatural killersrdquo) Por otra parte la
inflamacioacuten generada por las ceacutelulas inmunes disentildeadas para combatir las infecciones
quizaacutes pueda dar apoyo accidental a las muacuteltiples capacidades de las ceacutelulas tumorales
Pero ademaacutes de las ceacutelulas cancerosas los tumores muestran otra dimensioacuten de
complejidad ya que poseen un repertorio de ldquoceacutelulas reclutadasrdquo ostensiblemente normales
pero que contribuyen a la adquisicioacuten de los rasgos caracteriacutesticos mediante la creacioacuten del
microambiente del tumor (Hanahan amp Weinberg 2011)
52 Epidemiologiacutea del caacutencer
Como se ha mencionado el caacutencer es una de las principales causas de muerte en el
mundo Seguacuten un informe del antildeo 2008 de la Agencia Internacional de Investigacioacuten sobre
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
127
el Caacutencer (IARCWHO 2008) esta enfermedad produjo 76 millones de muertes (alrededor
del 13 del total) de las cuales aproximadamente el 70 ocurrieron en paiacuteses de bajo y
medianos recursos Sin embargo si se evaluacutean las tasas estandarizadas por edad (ASR) de
muerte por caacutencer (excluyendo el caacutencer de piel con histologiacutea distinta al melanoma) cada
100000 habitantes eacutestas no pueden ser correlacionadas con el nivel de ingreso de los
paiacuteses (Figura 52)
Figura 52 Tasa estandarizada por edad (ASR) de mortalidad por caacutencer para ambos sexos cada 100000 habitantes distribuidas por paiacuteses estimadas en el 2008 Fuente IARCWHO 2008
Puede verse que Argentina en relacioacuten al resto del mundo se encuentra en un nivel
medio-alto de mortalidad por caacutencer De acuerdo a un estudio de la Organizacioacuten Mundial
de la Salud (WHO 2011) en nuestro paiacutes el caacutencer representa la segunda causa de muerte
(20) despueacutes de las producidas por las enfermedades cardiovasculares (33) Respecto
a la incidencia de caacutencer (IARCWHO 2008) Argentina ocupa el mismo nivel (medio-alto)
seguacuten las ASR de incidencia de caacutencer cada 100000 habitantes (Figura 53)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Figura 53 Tasa estandarizada por edad (ASR) de incidencia de caacutencer para ambos sexos cada 100000
habitantes distribuidas por paiacuteses estimadas en el 2008 Fuente Fuente IARCWHO 2008
53 Carcinoma Hepatocelular
Dentro de los distintos tipos de caacutencer el carcinoma hepatocelular (CHC) tiene la
seacuteptima ASR de incidencia y la cuarta ASR de mortalidad maacutes alta en el mundo ambas
calculadas al 2008 cada 100000 habitantes y para ambos sexos constituyendo la tercer
causa de muerte por caacutencer Por su parte en Argentina la ASR de incidencia y de mortalidad
ocupan los lugares 16deg y 12deg respectivamente lo cual la ubica en el grupo de paiacuteses con
nivel medio-bajo de incidencia de CHC Tomando el nivel de ingresos de los paiacuteses seguacuten el
Banco Mundial los paiacuteses con niveles de ingresos bajo o medio-bajo son los que
presentaron una mayor ARS de incidencia de CHC (GHOWHO 2008)
531 Factores de riesgo
La heterogeneidad en la incidencia mundial refleja las variaciones en los principales
factores de riesgo de CHC En Asia oriental y en Aacutefrica subsahariana el factor de riesgo
dominante es la infeccioacuten croacutenica con el virus de la hepatitis B (HBV) junto con la exposicioacuten
a la aflotoxina B1 responsables del 80 de los casos de CHC En cambio en Ameacuterica del
Norte Europa y Japoacuten el principal factor de riesgo es la infeccioacuten con el virus de la hepatitis
C junto con la ingesta de alcohol (Forner et al 2012)
En el 70-90 de los pacientes el CHC se desarrolla dentro de una enfermedad
hepaacutetica croacutenica subyacente La infeccioacuten croacutenica con HBV constituye el factor de riesgo
maacutes frecuente el cual se da en maacutes del 50 de los casos con CHC En pacientes con
cirrosis el CHC constituye la principal causa de muerte (Forner et al 2012) Otros factores
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
129
de riesgo son la enfermedad del hiacutegado graso no alcohoacutelico y la diabetes (Stickel amp
Hellerbrand 2010)
532 Patogeacutenesis molecular
El CHC es un tumor epitelial desarrollado a partir de los hepatocitos La
hepatocarcinogeacutenesis es un proceso complejo de muacuteltiples pasos durante el cual se alteran
varias cascadas de sentildealizacioacuten relacionadas con la supervivencia y la proliferacioacuten celular
generando un perfil molecular heterogeacuteneo En maacutes del 50 de los casos de CHC las viacuteas
de sentildealizacioacuten Ras y del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) son activadas
mientras que en el 40-50 la viacutea del MTOR (mammalian Target of Rapamycin complejo
sensible a rapamicina) es interrumpida La viacutea de sentildealizacioacuten del receptor del factor de
crecimiento tipo insulina (IGF1R) se activoacute en 20 de los CHC tempranos mientras que la
desregulacioacuten de la viacutea de c-MET y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es un
evento comuacuten La viacutea de sentildealizacioacuten Wnt es activada en un tercio de los CHC La alta
vascularizacioacuten y actividad angiogeacutenica presente en el CHC estaacute asociada a las viacuteas de
sentildealizacioacuten del factor de crecimiento endotelio vascular (VEGFA) la angiopoyetina 2
(ANGPT2) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (Forner et al 2012)
Las dos mutaciones maacutes frecuentes ocurren en el gen supresor de tumor TP53 (en
alrededor del 25-40 de los casos) y en el gen para β catenina CTNNB1 que se da en
aproximadamente el 25 de los casos y predomina en los CHC relacionados con la
infeccioacuten de HCV (Forner et al 2012)
533 Tratamiento
A pesar de ser un problema de salud mundial importante en los uacuteltimos decenios no
se han producidos avances significativos en el pronoacutestico de la mayoriacutea de los pacientes
(Asghar amp Meyer 2012) La deteccioacuten temprana y el posterior tratamiento es la uacutenica opcioacuten
para alcanzar una supervivencia sin enfermedad a largo plazo Un tratamiento precoz
efectivo estaacute asociado con una supervivencia media superior a los 5 antildeos (Forner et al
2012) Existen varios tratamientos que deberaacuten ser elegidos en relacioacuten al pronoacutestico del
paciente (Llovet et al 1999) Sin embargo no existen suficientes estudios cliacutenicos que
comparen los distintos tratamientos principalmente en el caso de pacientes con un estadio
temprano de la enfermedad (Forner et al 2012)
La reseccioacuten quiruacutergica la ablacioacuten y el trasplante tienen potencial curativo y son las
opciones terapeacuteuticas en la fase temprana de la enfermedad Sin embargo en Occidente y
Japoacuten pudieron ser aplicados solamente en un 30 de los pacientes (Llovet et al 2008)
Ademaacutes la recurrencia representa un serio inconveniente para la reseccioacuten y la ablacioacuten
Los uacutenicos tratamientos no curativos que proporcionan supervivencia son la
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
130
quimioembolizacioacuten transarterial (TACE) aplicada en pacientes con grandes caacutenceres o
enfermedad multifocal y el Sorafenib una droga administrada oralmente en pacientes con
CHC avanzado (Forner et al 2012)
54 Terapia enzimaacutetica sisteacutemica en pacientes con caacutencer
Con el propoacutesito de evaluar el beneficio de la administracioacuten de mezclas de enzimas
proteoliacuteticas tales como tripsina quimotripsina papaiacutena o bromelina (terapia enzimaacutetica
sisteacutemica) como complementaria en pacientes que sufren de caacutencer de mama colorrectal y
plasmocitoma se llevaron a cabo estudios de cohorte que representan el nivel IIB de la
medicina basada en evidencia (EBM) aceptados por la Unioacuten Europea para mostrar la
seguridad y la eficacia de los tratamientos meacutedicos Estos estudios demostraron que la
terapia enzimaacutetica sisteacutemica disminuyoacute significativamente los efectos secundarios inducidos
por el tumor y la terapia estabilizoacute la calidad de vida y prolongaron la sobrevida (Beuth
2008)
En cuanto a la bromelina existe abundante evidencia de su efecto anti caacutencer
especialmente en modelos celulares y animales asiacute como en ensayos cliacutenicos Sin
embargo como agente terapeacuteutico para el tratamiento del caacutencer no ha sido objeto de
estudios cliacutenicos controlados aleatorios (Chobotova et al 2010) La actividad anti caacutencer es
atribuida a la actividad proteoliacutetica de sus proteasas las cuales permanecen funcionalmente
intactas luego de ser absorbidas por el tracto gastrointestinal (Maurer 2001) La baja
toxicidad de la bromelina (Moss et al 1963) ha permitido la administracioacuten oral de dosis
altas durante largos periacuteodos y ser bien tolerada (Maurer 2001 Brien et al 2004)
55 Objetivos
Dentro del objetivo general de evaluar el posible efecto antitumoral de los preparados
proteoliacuteticos obtenidos a partir de frutos de Bromelia hieronymi (Bh) B balansae (Bb) y
Pseudananas macrodontes (Pm) asiacute como de bromelina (Bro) se plantearon los siguientes
objetivos especiacuteficos
Evaluar el efecto de Bh Bb Pm y Bro sobre la viabilidad de ceacutelulas de
hepatocarcinoma humano
Evaluar el efecto de Bh Bb Pm y Bro sobre la adhesioacuten de ceacutelulas de
hepatocarcinoma humano
Comparar los efectos medidos de los preparados y de la bromelina en relacioacuten a la
actividad proteoliacutetica
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
131
56 Materiales y meacutetodos
561 Cultivo celular
Se empleoacute una liacutenea celular de hepatocarcinoma primario humano HepG2 C3A
(ATCC) la cual fue mantenida en medio esencial Dulbecco con alta glucosa (Gibco)
suplementado con suero fetal bovino (SFB) inactivado con calor (Natocor Argentina) al 10
conteniendo 50 UmL de penicilina y 50 μgmL de estreptomocina a 37 ordmC en una atmoacutesfera
humidificada con 5 de CO2 Las ceacutelulas fueron incubadas junto al medio de cultivo en
policubetas de 96 pocillos durante 24 h a fin de permitir su adhesioacuten
562 Tratamientos
Las ceacutelulas crecidas en monocapa a una densidad de 15000 ceacutelulaspocillo fueron
incubadas en 90 μL del medio de cultivo libre de SFB y 10 μL de la solucioacuten del preparado
proteoliacutetico Se ensayaron diferentes concentraciones de cada uno y distintos tiempos de
incubacioacuten luego de los cuales se midioacute la viabilidad y la adhesioacuten celular Como control se
usoacute buffer fosfato soacutedico 002M pH 6 el cual a su vez se ensayoacute frente a agua como
control
Con el objetivo de determinar si los efectos medidos fueron debido a la actividad
proteoliacutetica se hicieron ensayos de adhesioacuten y viabilidad incubando las ceacutelulas con los
preparados proteoliacuteticos tratados y no tratados con solucioacuten 40 μM de E-64 En estos
ensayos el control fue una solucioacuten 40 μM de E-64 en buffer fosfato soacutedico 002 M pH 6
5621 Evaluacioacuten de la viabilidad celular (Ensayo con MTS)
La viabilidad celular fue evaluada mediante un ensayo colorimeacutetrico utilizando el kit
Cell Titer 96 AQueous Non-Radiactive Cell Proliferation Assay (Promega Corp USA) Este
ensayo se basa en que el metabolismo de las ceacutelulas viables produce compuestos
reductores que pueden reducir un derivado de tetrazolio 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-
carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS) en presencia de metosulfonato de
fenazina (PMS) a formazaacuten un producto soluble y coloreado (Buttke et al 1993) Por lo
tanto la cantidad de formazaacuten formado seraacute proporcional al nuacutemero de ceacutelulas viables El
PMS actuacutea como acoplador de electrones entre el producto metaboacutelico y el MTS
Luego de los distintos tratamientos 100 μL de MTS y PMS fueron incorporados al
cultivo celular y despueacutes de incubarlos durante 30 min a 37 ordmC se midioacute la absorbancia a 490
nm en un lector de ELISA (Metertech 960) que es considerada como proporcional al
nuacutemero de ceacutelulas viables Los resultados fueron expuestos como porcentajes de ceacutelulas
viables respecto a los controles
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
132
5622 Ensayo de adhesioacuten celular (Tincioacuten con cristal violeta)
Luego de la incubacioacuten con los distintos preparados proteoliacuteticos el medio de cada
pocillo se descartoacute a fin de eliminar las ceacutelulas no adheridas se lavoacute con solucioacuten salina de
buffer fosfato (PBS) y se agregoacute formaldehido al 37 durante 15 min a temperatura
ambiente para fijar las ceacutelulas adheridas Posteriormente se incuboacute con colorante cristal
violeta al 05 en aacutecido aceacutetico al 3 durante 20 min Luego se lavoacute exhaustivamente y se
agregoacute SDS al 1 para disolver el colorante Finalmente se midioacute la absorbancia a 600 nm
utilizando un lector de ELISA (Metertech 960) que es considerada proporcional al nuacutemero
de ceacutelulas adheridas (Martiacutenez et al 2004) Los resultados fueron expresados como
porcentajes de ceacutelulas adheridas respecto al control
563 Anaacutelisis estadiacutestico
Todos los ensayos fueron realizados por triplicado en tres ensayos independientes
Los promedios de cada ensayo fueron considerados medidas independientes y las
diferencias de las medias de los grupos de tratamiento y del grupo control fueron evaluadas
mediante ANOVA seguido del test de Dunnett Un p lt 005 () fue considerado significativo
Los valores son expresados como la media plusmn SEM
564 Material vegetal ensayado
El contenido proteoliacutetico (UCasmg) y proteico (μg proteiacutenamg) asiacute como la actividad
especiacutefica (UCasmg proteiacutena) de los extractos utilizados se presenta en la Tabla 51
Liofilizados UCasmg μg proteiacutenamg UCasmg proteiacutena
Bh 027 plusmn 005 27 plusmn 2 10
Pm 014 plusmn 001 33 plusmn 3 42
Bb 015 plusmn 001 11 plusmn 1 14
Bromelina (Sigma Aldrich) 065 plusmn 002 209 plusmn 2 31
Tabla 51 Contenido proteoliacutetico (UCasmg) proteico (μg proteiacutenamg) y actividad especiacutefica (UCasmg proteiacutena)
de los extractos ensayados UCas unidades caseinoliacuteticas (pH 75 y 37ordmC) Media plusmn DE
Para todos los ensayos las soluciones de los extractos fueron preparadas por
resuspensioacuten de los liofilizados en agua destilada mientras que la bromelina fue redisuelta
en buffer fosfato soacutedico 002 M de pH 6
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
133
57 Resultados y discusioacuten
571 Ensayo de viabilidad
En la Figura 54 se exponen los resultados obtenidos del ensayo de viabilidad donde
pueden verse los porcentajes de ceacutelulas HepG2 viables luego de incubarlas durante 24 y 48
h con concentraciones crecientes de bromelina Bh Bb y Pm
Figura 54 Viabilidad de ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett plt005 plt001
plt0001 Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato
soacutedico 0002 M pH 6
Puede observarse que todos los preparados fueron capaces de disminuir la viabilidad
de las ceacutelulas HepG2 a las 48 h de incubacioacuten La bromelina fue la maacutes efectiva ya que por
un lado produjo disminucioacuten significativa con 10 μgmL en tanto que Bh Bb y Pm
requirieron una concentracioacuten de un orden de magnitud superior para mostrar un efecto
similar por otro lado fue la que mostroacute menos de ceacutelulas viables (asymp 40 frente al 65 de
los preparados) para las mayores concentraciones ensayadas A las 24 h de incubacioacuten si
bien las concentraciones maacutes altas de Bb y Pm disminuyeron el porcentaje de ceacutelulas
viables (75 y 71 respectivamente) no fueron significativos mientras que siacute lo fueron los
porcentajes de 100 μgmL de bromelina y 1000 μgmL de Bh (52 y 61 respectivamente)
572 Ensayos de adhesioacuten
En la Figura 55 se exponen los resultados del ensayo de adhesioacuten celular de las
ceacutelulas HepG2 luego de incubarlas durante 1 24 y 48 h con concentraciones crecientes de
bromelina Bh Bb y Pm En la Figura 56 se muestran microfotografiacuteas de las ceacutelulas HepG2
Bromelina
1 10 1000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Bb
18 180 18000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Bh
10 100 10000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
Pm
10 100 10000
50
100
150
Control 24 h 48 h
gml
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
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134
luego de incubarlas durante 24 h con las concentraciones intermedias de bromelina Bh Bb
y Pm
Figura 55 Adhesioacuten celular de ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett plt001 plt0001
Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato soacutedico 0002 M
pH 6
Todos los preparados tuvieron efecto sobre la adhesioacuten celular Se observoacute una
eliminacioacuten de la adhesioacuten de las monocapas celulares a la superficie plaacutestica de los
pocillos Las ceacutelulas en suspensioacuten adoptaron una forma redondeada Desde la primera h de
incubacioacuten y para las mayores concentraciones ensayadas (100 μgmL de bromelina 1000
μgmL de Bh y de Pm y 1800 μgmL de Bb) se observaron los porcentajes de adhesioacuten maacutes
bajos (entre un 15 y un 30) los cuales no mostraron diferencias significativas (pgt005
Tukey) respecto de los de las 24 y 48 h siguientes de incubacioacuten Tal como sucedioacute en los
ensayos de viabilidad bromelina requirioacute una concentracioacuten de un orden de magnitud
inferior a la de las demaacutes preparaciones para lograr el mismo efecto sobre la adhesioacuten
Bromelina
1 10 1000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Bb
18 180 18000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Bh
10 100 10000
50
100
150
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
Pm
10 100 10000
50
100
150
Control 1 h 24 h 48 h
gml
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Figura 56 Microfotografiacuteas de campo claro representativas de ceacutelulas HepG2 luego de incubarlas durante 24 h
con los preparados proteoliacuteticos Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control buffer fosfato soacutedico 0002 M pH 6
Si se comparan los porcentajes de ceacutelulas adheridas con los porcentajes de ceacutelulas
viables puede observarse que las disminuciones significativas en la viabilidad ocurren 24 h
despueacutes de una disminucioacuten significativa en la adhesioacuten excepto para 100 μgmL de Bh
indicando que la peacuterdida de adhesioacuten conlleva una peacuterdida de la viabilidad La concentracioacuten
de 100 μgmL de Bh mostroacute un menor porcentaje de ceacutelulas adheridas (36) respecto al
control a 1 h de incubacioacuten que no fue seguida de una disminucioacuten significativa de ceacutelulas
viables (85) a las 24 h de incubacioacuten Por otro lado 10 μgmL de Bh a las 48 h de
incubacioacuten mostroacute un porcentaje de ceacutelulas viables (85) que resultoacute ser una disminucioacuten
significativa mientras que el porcentaje de ceacutelulas adheridas 24 h antes (85) no lo fue sin
embargo no parece ser concluyente que la disminucioacuten de la viabilidad no sea precedida por
una disminucioacuten de la adhesioacuten en dicho caso si se toman en cuenta los valores
porcentuales absolutos de adhesioacuten y viabilidad
573 Efecto de la actividad proteoliacutetica sobre los porcentajes de viabilidad y
de adhesioacuten celular
Como se mencionoacute en la introduccioacuten el efecto antitumoral de bromelina es atribuido
preponderantemente a la actividad de sus proteasas (Salas et al 2008 Chobotova et al
2010) Con el fin de determinar si los efectos sobre la viabilidad y adhesioacuten celular medidos
tienen relacioacuten con la actividad proteoliacutetica de los preparados se determinaron los
porcentajes de viabilidad y de adhesioacuten de los mismos tratados y no tratados con E-64 Se
usaron las concentraciones de Bromelina Bh Bb y Pm que mostraron mayores efectos
(100 1000 1800 y 1000 μgmL respectivamente) a las 24 y 48 h de incubacioacuten (Figura 57)
Control Bro (10 gml) Bb (180 gml) Bh (100 gml) Pm (100 gml)
10X
20X
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y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
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Figura 57 Efecto de la inhibicioacuten de las proteasas sobre su accioacuten reductora de la viabilidad y la adhesioacuten de
ceacutelulas HepG2 Media plusmn SEM Resultados test de Dunnett p lt 005 p lt 001 p lt 0001 ns no significativo Las concentraciones se refieren al volumen final del medio de incubacioacuten Control 4 μM de E-64 en buffer fosfato soacutedico 0002 M pH 6
Puede observarse que los preparados tratados con E-64 no tuvieron efecto
significativo sobre la viabilidad como tampoco sobre la adhesioacuten celular a las 24 y 48 h de
incubacioacuten salvo la concentracioacuten de 1000 μgmL de Pm para la cual se observoacute una
disminucioacuten significativa en el porcentaje de ceacutelulas adheridas (76) a las 24 h que sin
embargo es significativamente superior (p lt 0001 test de Tukey) al porcentaje de adhesioacuten
de Pm activo proteoliacuteticamente (16)
Puede concluirse que el efecto sobre la viabilidad y la adhesioacuten celular de bromelina
Bh y Bb a las 24 y 48 h de incubacioacuten y de Pm a las 48 h seriacutea debido a la actividad
proteoliacutetica de sus cisteiacutenendopeptidasas
A fin de realizar una comparacioacuten entre los distintos preparados en relacioacuten a su
actividad proteoliacutetica en la Tabla 52 se exponen los porcentajes de ceacutelulas viables (V) y
de ceacutelulas adheridas (A) luego de 48 h de incubacioacuten en funcioacuten del contenido de
unidades caseinoliacuteticas (UCasmL) de las concentraciones ensayadas para bromelina Bh
Bb y Pm
0
50
100
150
Sin E-64Con E-64
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Bromelina
(100 gml)
Bb
(1800 gml)
Bh
(1000 gml)
Pm
(1000 gml)
Control
nsns ns
nsns
ns
ns
ns
Ceacute
lula
s v
iab
les (
)
0
50
100
150
Control Sin E-64Con E-64
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Bromelina
(100 gml)
Bb
(1800 gml)
Bh
(1000 gml)
Pm
(1000 gml)
ns ns ns ns nsns
ns
Ceacute
lula
s a
dh
eri
das (
)
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
137
Preparado proteoliacutetico
UCasmL (x10-3
) V A
Bromelina
065 plusmn 002 91 plusmn 2 91 plusmn 1
65 plusmn 02 69 plusmn 4 23 plusmn 4
65 plusmn 2 44 plusmn 3 20 plusmn 4
Bh
27 plusmn 05 86 plusmn 4 99 plusmn 1
27 plusmn 5 66 plusmn 1 30 plusmn 6
270 plusmn 25 63 plusmn 5 19 plusmn 2
Bb
27 plusmn 02 103 plusmn 4 99 plusmn 3
27 plusmn 2 78 plusmn 7 30 plusmn 7
270 plusmn 20 68 plusmn 3 21 plusmn 2
Pm
14 plusmn 01 95 plusmn 5 96 plusmn 2
14 plusmn 1 70 plusmn 1 31 plusmn 8
140 plusmn 10 65 plusmn 8 20 plusmn 2
Tabla 52 Porcentajes de ceacutelulas viables (V) y de ceacutelulas adheridas (A) en relacioacuten con la actividad proteoliacutetica (UCasmL) de bromelina Bh Bb y Pm luego de incubar ceacutelulas HepG2 durante 48 h Media plusmnSEM Resultados test de Dunnett p lt 005 p lt 001 p lt 0001
Se puede observar que bromelina requiere menos actividad proteoliacutetica que los
demaacutes preparados para mostrar efectos similares hecho que podriacutea deberse a que las
proteasas de bromelina actuacutean conjuntamente mostrando una mayor especificidad hacia
sustratos relacionados con la viabilidad y la adhesioacuten celular presentes en las ceacutelulas de
HepG2 que las proteasas presentes en Bh Bb y Pm A su vez Bh y Bb fueron menos
activas que Pm
La carcinogeacutenesis hepaacutetica estaacute asociada en parte a un cambio en el perfil de las
integrinas expresadas en la superficie del hepatocito las cuales juegan un papel
fundamental en la adhesioacuten y la migracioacuten celular contribuyendo al crecimiento y la invasioacuten
del tumor (Nejjari et al 1999 Massini 2007) Asiacute los bajos porcentajes de adhesioacuten de
ceacutelulas de HepG2 luego de tratarlas con bromelina Bh Bb y Pm permite suponer que
resultaraacuten efectivas para inhibir el crecimiento tumoral en CHC Ademaacutes abre un abanico de
posibles ensayos a realizar a fin de determinar cuaacuteles seriacutean las proteiacutenas superficiales
blanco para cada una de los preparados proteoliacuteticos
En este sentido es importante mencionar que uno de los mecanismos por el cual la
bromelina ejerceriacutea efecto antitumoral es su capacidad para clivar proteiacutenas de la superficie
celular CD44 un marcador de superficie presente en ceacutelulas inmunes y tumorales y que
estaacute asociado con el crecimiento tumoral y la metaacutestasis mostroacute ser sensible a la bromelina
en liacuteneas tumorales murinas y humanas resultando en una reduccioacuten de la invasioacuten y
adhesioacuten al sustrato (Chobotova et al 2010) Fastuosaiacutena otra proteasa cisteiacutenica aislada
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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138
de frutos de Bromelia fastuosa resultoacute activa frente a CD44 en ceacutelulas de melanoma murino
(Guimaratildees-Ferreira et al 2007) En un modelo de melanoma murino la mezcla de
papaiacutena tripsina y quimotripsina redujo la expresioacuten de CD44 y CD45 en el tumor lo cual
fue correlacionado con la supresioacuten del melanoma y la metaacutestasis (Wald et al 2001) Por
tanto dado que las ceacutelulas HepG2 expresan CD44 en su superficie se podriacutea sugerir que
bromelina asiacute como tambieacuten Bh Bb y Pm podriacutean ejercer sus efectos a traveacutes de esta
proteiacutena ademaacutes de las integrinas
La disminucioacuten de la viabilidad celular de HepG2 observada para los preparados
proteoliacuteticos constituye un paso inicial hacia la buacutesqueda de los posibles mecanismos que la
estariacutean mediando Determinar si ha habido arresto celular induccioacuten de apoptosis asiacute
como cuaacuteles son las viacuteas de sentildealizacioacuten involucradas si bien no han sido objetivos de esta
tesis se muestran como prometedores temas para futuros estudios En este sentido existe
evidencia de la capacidad de bromelina para inducir activadores de la apoptosis (p53 y Bax)
en papiloma cutaacuteneo en ratoacuten asiacute como reducir la actividad de reguladores de la
supervivencia celular como Akt y Erk esta uacuteltima de forma contexto celular dependiente
(Chobotova et al 2010) en ceacutelulas de melanoma y carcinoma epideacutermico humano ha
promovido el arresto del ciclo celular en la fase G2M conducieacutendolas a apoptosis (Bhui et
al 2011)
En la Tabla 52 puede observarse que un aumento en 10 veces de la concentracioacuten
de bromelina produjo un cambio importante en el porcentaje de ceacutelulas viables (de 69 a
44) mientras el porcentaje de adhesioacuten permanece aproximadamente constante (20) lo
cual estariacutea indicando que la bromelina podriacutea afectar la viabilidad celular
independientemente de la alteracioacuten de la adhesioacuten celular Esto es diferente a lo observado
en ceacutelulas de glioblastoma humano donde una reduccioacuten en la adhesioacuten la migracioacuten y la
invasioacuten asociada con la reduccioacuten de la integrina α3β1 y el CD44 en la superficie celular no
fue acompantildeada por una disminucioacuten de la viabilidad (Tysnes et al 2001) La aparente
diferencia en el efecto de la bromelina sobre ceacutelulas tumorales humanas podriacutea reflejar una
especificidad de accioacuten lo cual podriacutea hacerla maacutes eficiente como tratamiento frente a
algunos tipos de caacutencer que de otros hecho que hace necesario el estudio sobre mayor
nuacutemero de liacuteneas celulares tumorales humanas (Chobotova et al 2010)
La bromelina no ha sido probada frente a ceacutelulas de HepG2 asiacute como tampoco Bh
Bb y Pm para los cuales estos resultados son los primeros en relacioacuten a la buacutesqueda de
posibles efectos antitumorales Si bien queda una serie de aspectos por investigar
(mecanismos de accioacuten efectos sobre el crecimiento tumoral y metaacutestasis capacidad
migratoria citotoxicidad etc) el presente trabajo constituye un indicio de los potenciales
efectos terapeacuteuticos de proteasas cisteiacutenicas frente al carcinoma hepatocelular
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
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139
58 Conclusiones
Extractos ricos en cisteinendopeptidasas de Bromelia hieronymi (Bh) B balansae
(Bb) y Pseudananas macrodontes (Pm) mostraron efecto reductor de la viabilidad y
la adhesioacuten de ceacutelulas de carcinoma hepatocelular (HepG2)
Bh Bb y Pm tuvieron efectos similares en relacioacuten al contenido de unidades
caseinoliacuteticas siendo menores a los mostrados por bromelina
Bh Bb y Pm al igual que bromelina perdieron la accioacuten reductora de viabilidad y
adhesioacuten celular al inhibir la actividad de las cisteinendopeptidasas
Nuevos estudios son necesarios para profundizar el conocimiento de los
mecanismos involucrados en los efectos medidos asiacute como para encontrar otras
acciones que resulten beneficiosas para la terapia de CHC
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140
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6 CONCLUSIONES FINALES Y PERSPECTIVAS
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
142
El objetivo general del presente trabajo de tesis doctoral fue estudiar la posible
aplicacioacuten farmacoloacutegica de extractos de tres especies vegetales pertenecientes a la familia
Bromeliaceae Bromelia hieronymi Mez Bromelia balansae Mez y Pseudananas
macrodontes (Morr) Harms autoacutectonas del aacuterea que abarca el NEA y NOA Paraguay
Brasil Bolivia y Colombia Las tres especies habiacutean sido previamente estudiadas en el
LIProVe desde el punto de vista bioquiacutemico habieacutendose aislado y caracterizado diversas
endopeptidasas cisteiacutenicas a partir de sus frutos
A excepcioacuten del uso en medicina popular de B balansae para calmar la tos no
existen referencias sobre aplicaciones medicinales de las especies mencionadas Sin
embargo es abundante la informacioacuten sobre las propiedades antiinflamatorias
antitromboacuteticas inmunomoduladoras y antitumorales de la bromelina un extracto acuoso
obtenido a partir del ananaacute [Ananas comosus (L) Merr] especie tambieacuten perteneciente a la
familia Bromeliaceae y rica en endopeptidasas cisteiacutenicas a las que se atribuyen las
actividades farmacoloacutegicas citadas Por este motivo se decidioacute estudiar los efectos
antiinflamatorios antitumorales anticoagulantes fibrinoliacuteticos y fibrinogenoliacuteticos de
extractos acuosos parcialmente purificados por precipitacioacuten etanoacutelica obtenidos a partir de
frutos de B hieronymi (Bh) B balansae (Bb) y P macrodontes (Pm) en relacioacuten a la
actividad proteoliacutetica de los mismos
En base a los estudios realizados se ha arribado a las siguientes conclusiones
Bh Bb y Pm mostraron efecto antiinflamatorio en modelos animales de
inflamacioacuten aguda al ser administradas intraperitonealmente
En el modelo de inflamacioacuten aguda ensayado (edema de pata de rata inducida por
carragenina) dosis equivalentes en actividad proteoliacutetica (asymp30 UCaskg) de Bh Pm y
bromelina mostraron efectos antiinflamatorios significativamente similares a 10 mgkg de
indometacina El efecto antiinflamatorio medido para Bb fue menor y en algunos ensayos fue
acompantildeado de signos de toxicidad
El efecto antiinflamatorio medido en este modelo fue dependiente de la actividad
caseinoliacutetica (UCas) de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb y bromelina mientras que soacutelo
parcialmente de las de Pm quedando por determinar si la actividad fibrinoliacutetica de Pm es
causal del efecto antiinflamatorio medido para 0 UCaskg de Pm
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
143
Los efectos antiinflamatorios de Bh Bb Pm y bromelina alcanzaron los maacuteximos
valores entre las 5 y las 7 h de inducido el estiacutemulo inflamatorio tiempos en que se alcanza
el maacuteximo valor de inflamacioacuten Teniendo en cuenta los mediadores involucrados en dicha
fase del modelo seriacutea posible que las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb y Pm ejercieran su
accioacuten sobre la COXPGs la NOSNO y la infiltracioacutenactividad de los neutroacutefilos para cuya
confirmacioacuten deberiacutean orientarse futuras investigaciones sobre el mecanismo de accioacuten de
las mismas en los efectos antiinflamatorios observados
Si bien en una magnitud menor dosis de asymp30 UCaskg de Bh Pm y bromelina
tambieacuten fueron efectivas como antiinflamatorios en el modelo de edema de pata de rata
inducido por serotonina no mostrando efecto significativo sobre el edema inducido por
histamina
Mediante el modelo de inflamacioacuten croacutenica en ratas test del granuloma inducido
por pellet de algodoacuten se observoacute un significativo efecto antiinflamatorio de Pm y
bromelina al ser administradas intraperitonealmente mientras que para Bh y Bb
no se obtuvieron resultados concluyentes
Dado que una dosis de asymp10 UCaskg de Pm mostroacute un efecto antiinflamatorio
equivalente al de una dosis de asymp30 UCaskg de bromelina y que ambos efectos fueron
dependientes de la actividad proteoliacutetica (UCas) las proteasas cisteiacutenicas de Pm mostrariacutean
una mayor especificidad que las de bromelina frente a los efectores proinflamatorios
Si bien los efectos antiinflamatorios de Pm y bromelina fueron significativamente
menores o similares al de dexametasona (3 mgkg) a las dosis ensayadas no mostraron
efectos adversos tiacutepicos de glucocorticoides tales como la peacuterdida de masa corporal y
reduccioacuten del peso del bazo causando significativa reduccioacuten del peso del timo pero entre 3
y 4 veces menos que la dexametasona (3 mgkg)
Los efectos antiinflamatorios medidos para dosis de asymp30 UCaskg de Bh y de Bb no
fueron reproducibles en posteriores ensayos
La accioacuten antiinflamatoria medida en el modelo del granuloma para todos los
preparados proteoliacuteticos fue acompantildeada de un significativo y leve efecto reductor del peso
del timo el cual a su vez fue dependiente de la actividad proteoliacutetica de las proteasas
cisteiacutenicas de Pm y bromelina Dilucidar si este hecho es indicativo de un mecanismo
subyacente de la accioacuten antiinflamatoria o es un efecto independiente de los preparados
proteoliacuteticos podriacutea ser objeto de futuras investigaciones
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
144
Bh Bb y Pm actuaron como anticoagulantes fibrinogenoliacuteticas y fibrinoliacuteticas
Bh Bb y Pm prolongaron los tiempos de protrombina (TP) y de tromboplastina parcial
activada (TTPa) de plasma humano en ensayos in vitro ademaacutes de alterar la consistencia
de los coaacutegulos formados respecto de un plasma no tratado con los preparados Ambos
efectos fueron totalmente dependientes de la actividad proteoliacutetica de las proteasas
cisteiacutenicas excepto los efectos de Bb sobre el TP y el TTPa y de Pm sobre el TTPa los
cuales dependieron parcialmente de las cisteiacutenendopeptidasas sugiriendo la presencia de
otros componentes anticoagulantes
El hecho de que una actividad proteoliacutetica (UCas) equivalente de bromelina Bh Bb y
Pm no produjera efectos anticoagulantes equivalentes da cuenta de las diferentes
especificidades con las que actuariacutea cada preparado sobre los distintos elementos del
sistema de coagulacioacuten
En los ensayos In vivo si bien dosis con equivalente actividad proteoliacutetica (65
UCaskg) de todos los preparados administrados intraperitonealmente prolongaron el TP y el
TTPa soacutelo Bb prolongoacute levemente el TP en forma estadiacutesticamente significativa mostrando
un valor de TP significativamente similar al de la bromelina
El efecto sobre el fibrinoacutegeno fue equivalente cuali y cuantitativamente para
equivalentes actividades caseinoliacuteticas (UCas) de Bh Bb Pm y bromelina siendo la
subunidad Aα del fibrinoacutegeno la maacutes susceptible de ser clivada lo cual podriacutea explicar la
alteracioacuten de la consistencia del coaacutegulo observada en los ensayos de medida de TP y
TTPa
Como agentes fibrinoliacuteticos Bh Bb y Pm tuvieron un comportamiento similar y
significativamente diferente al de bromelina la cual a su vez mostroacute un comportamiento
significativamente similar a la plasmina A equivalentes valores de actividad caseinoliacutetica
(UCas) la bromelina mostroacute mayor especificidad que Bh Bb y Pm frente a la fibrina
respecto a los componentes de la cascada de la coagulacioacuten
Los efectos fibrinogenoliacutetico anticoagulante y fibrinoliacutetico medidos para Bh Bb y Pm
los ubica como potenciales agentes antitromboacuteticos o tromboliacuteticos lo cual deberaacute ser
evaluado en modelos de trombosis Las relaciones establecidas entre dichos efectos y el
contenido proteoliacutetico de los preparados podraacuten ser de utilidad al momento de establecer
dosis asiacute como interpretar resultados en futuros ensayos de trombosis
ldquoEstudio de posibles aplicaciones farmacoloacutegicas de extractos de especies de bromeliaacuteceas
y su comparacioacuten con bromelinardquo Mariacutea Eugenia Errasti
145
En relacioacuten a la accioacuten antiinflamatoria la actividad fibrinoliacutetica de Bh Bb y Pm
puede contribuir al mecanismo de accioacuten anti-edema evaluado in vivo hecho que ya ha sido
corroborado para bromelina en tanto que para Bh Bb y Pm ello queda supeditado a futuras
investigaciones dirigidas a dilucidar los mecanismos subyacentes a los efectos
antiinflamatorios medidos
Bh Bb Pm y bromelina disminuyeron significativamente la viabilidad y la
adhesioacuten de ceacutelulas de carcinoma hepatocelular (HepG2)
Los efectos sobre la viabilidad y la adhesioacuten dependieron de la actividad proteoliacutetica
de las proteasas cisteiacutenicas de Bh Bb Pm y bromelina siendo las proteasas de bromelina
las maacutes especiacuteficas en relacioacuten a las de Bh Bb y Pm
Estos resultados abren camino a futuros ensayos dirigidos no soacutelo a estudiar los
mecanismos de accioacuten a traveacutes de los cuales Bh Bb Pm y bromelina afectariacutean las ceacutelulas
de HepG2 sino tambieacuten para evaluar los efectos sobre otros modelos maacutes complejos
Los efectos antiinflamatorios asiacute como anticoagulantes y fibrinoliacuteticos de Bh Bb y Pm
constituyen cualidades con potenciales efectos terapeacuteuticos en el tratamiento sisteacutemico del
caacutencer delineando otra posible liacutenea de investigacioacuten futura
En siacutentesis el presente trabajo ha pretendido aportar informacioacuten novedosa acerca
de la posible importancia farmacoloacutegica de principios activos en este caso proteasas de tipo
cisteiacutenico presentes en plantas que crecen en nuestro paiacutes y que podriacutean enriquecer el no
demasiado extenso acervo de fitofaacutermacos en uso en este momento Por tratarse de
resultados preliminares seraacute necesario en caso de resultar de intereacutes la realizacioacuten de
estudios posteriores y de mayor complejidad que confirmen el potencial farmacoloacutegico de los
preparados estudiados en el marco de la seguridad en cuanto a los riesgos toxicoloacutegicos
que pueda presentar el uso de los mismos
Agradecimientos
A la Facultad de Ciencias Exactas de La Universidad Nacional de La Plata por haberme permitido
realizar mis estudios de grado y posgrado
Al Consejo Nacional de Investigaciones Cientiacuteficas y Teacutecnicas por brindarme las becas para la
realizacioacuten del presente Trabajo de Tesis
Al LIProVe y en especial al Dr Neacutestor O Caffini por ofrecerme el Lugar de Trabajo por su
predisposicioacuten para ayudarme y enorme paciencia para ensentildear
A la Secretariacutea de Poliacuteticas Universitarias del Ministerio de Educacioacuten de La Nacioacuten que a traveacutes del
Programa Inter-U me brindoacute los medios econoacutemicos para los viajes a San Luis donde realiceacute parte
del trabajo experimental aquiacute presentado
A Veroacutenica Laacutezaro quien actuoacute eficientemente en la gestioacuten del Programa Inter-U dentro de La
Facultad de Ciencias Exactas de La Universidad Nacional de La Plata
A la Dra Alejandra E Rotelli mi codirectora de beca por la ensentildeanza y direccioacuten de los ensayos con
modelos animales asiacute como por la colaboracioacuten en la realizacioacuten de los mismos en la Facultad de
Quiacutemica Bioquiacutemica y Farmacia de la Universidad Nacional de San Luis
A la Dra Mariacutea Fernanda Troncoso por la ensentildeanza y colaboracioacuten en la realizacioacuten de los ensayos
con ceacutelulas tumorales en el IQUIFIB Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica de la Universidad de Buenos
Aires y por la correccioacuten del capiacutetulo ldquoEfecto antitumoralrdquo
A la Bioq Mariana Marta Gonzalez de la Caacutetedra de Hematologiacutea de la Facultad de Ciencias Exactas
de la Universidad Nacional de La Plata por la ensentildeanza y colaboracioacuten en los ensayos de
coagulacioacuten y en la obtencioacuten de los pooles de plasma
A la Bioq Anabela Prospitti por la colaboracioacuten en la obtencioacuten de los pooles de plasma
A los Dres Mariana Gomez y Pastor Arenas quienes muy amablemente nos proporcionaron material
bibliograacutefico en relacioacuten a los usos de las bromeliaacuteceas en nuestro paiacutes
A los Dres Mariela Bruno y Marcelo Pardo quienes me ensentildearon los primeros pasos en las teacutecnicas y
metodologiacuteas para el estudio de las proteasas vegetales
En el plano afectivo
A M Fernanda Troncoso por toda su predisposicioacuten y calidez humana
A Mariana y Susana por la buena onda y el compantildeerismo durante las mantildeanas en el laboratorio de
Hematologiacutea
A los integrantes de la Caacutetedra de Farmacologiacutea de la Facultad de Quiacutemica Bioquiacutemica y Farmacia de
la Universidad Nacional de San Luis en especial a Graciela Ameacuterico Alejandra Lily Susana
Mariano y muy especialmente a Ale por la calidez humana el buen humor los brindis y las cenas los
paseos por el surrealismo puntano y los mates frente al arroyo
A los integrantes (algunos ex) del LIProVe en especial a Cacho (Caffini) Ana (Prospitti) Jose (Torres)
Ine (Martin) Martiacuten (Lazza) Euge (Tavarone) Suacute (Morcelle del Valle) Celes (Branda) Franco
(Bernabei) Claudia (Natalucci) y Laura (Lopez) por los tiempos compartidos el ldquosoporterdquo en
momentos difiacuteciles el buen humor y el compantildeerismo Gracias por la paciencia Cacho
A Meli Ana y Guille por simplemente COMPARTIR
A mis viejos mis hermanos a Alfon y Ernes por lo que aprendiacute y volviacute a aprender por las risas y los
abrazos
A Leo por el aguante (PArsquo CIENCIA) los horizontes (se hicieron anchos) y la certeza de que las
palabras no me alcanzaraacuten
Algunos de los resultados presentados en esta Tesis Doctoral han sido objeto de las
siguientes publicaciones yo comunicaciones en reuniones cientiacuteficas
Publicaciones
Errasti M E Caffini N O Pelzer L E amp Rotelli A E (2013) ldquoAnti-inflammatory
Activity of Bromelia hieronymi Comparison with Bromelainrdquo Planta Medica 79 207-
213
Mariacutea E Errasti Neacutestor O Caffini Lilian E Pelzer and Alejandra E Rotelli (2013)
ldquoEvaluation of anti-inflammatory activity of Pseudananas macrodontes (Morr) Harms
fruit extract (Bromeliaceae) in ratsrdquo Zeitschrift fuumlr Naturforschung C (aceptado y en
proceso de revisioacuten)
Comunicaciones en reuniones cientiacuteficas
Errasti ME Bruno MA Rotelli AE Caffini NO Pelzer LE ldquoAntiinflammatory
activity of a partially purified extract from Bromelia hieronymi fruitsrdquo XLI Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Rosario
Santa Fe Argentina 24 al 26 de Noviembre de 2009
Errasti ME Caffini NO Rotelli AE Pelzer L ldquoAccioacuten antiinflamatoria de un
extracto de frutos de Bromelia hieronymi en un modelo de inflamacioacuten croacutenica en
ratasrdquo XLII Reunioacuten Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental
(SAFE) Mar del Plata Buenos Aires Argentina 17 al 20 de Noviembre de 2010
Errasti ME Rotelli AE Gonzaacutelez MM ldquoEvaluacioacuten in vitro de la accioacuten fibrinoliacutetica
y sobre la coagulacioacuten sanguiacutenea de extractos de Bromeliaceasrdquo XLIII Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Tucumaacuten
Argentina 2 al 4 de Noviembre de 2011
Errasti ME Caffini NO Rotelli AE Pelzer L ldquoExtractos de Pseudananas
macrodontes y Bromelia balansae con accioacuten antiinflamatoria en un modelo de
inflamacioacuten croacutenica en ratasrdquo XLIII Reunioacuten Anual de la Sociedad Argentina de
Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Tucumaacuten Argentina 2 al 4 de Noviembre de
2011
Errasti ME Caffini NO Pelzer LE Rotelli AE ldquoRelacioacuten entre efecto
antiinflamatorio y accioacuten proteoliacutetica de extractos de Bromeliaceasrdquo XLIV Reunioacuten
Anual de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Mendoza
Argentina 31 de Octubre al 2 de Noviembre de 2012
Errasti ME Caffini NO Troncoso MF ldquoAccioacuten de extractos de Bromeliaceas sobre
la adhesioacuten y viabilidad de ceacutelulas de carcinoma hepatocelularrdquo XLIV Reunioacuten Anual
de la Sociedad Argentina de Farmacologiacutea Experimental (SAFE) Mendoza
Argentina 31 de Octubre al 2 de Noviembre de 2012
