Cintica Enzimtica

Cintica EnzimticaLa cintica enzimtica es el anlisis cuantitativo del efecto de cada uno de los factores que intervienen en la actividad enzimtica, que se evala a travs de la velocidad de la reaccin catalizada.Las variables ms importantes son:Concentracin de enzima, sustratos y productos (incluyendo inhibidores y/o activadores)pHTemperatura

Ella est basada en la medicin de la velocidad de reaccin. As en la reaccin:

Se tendr:

Como se observa en la figura, la velocidad de reaccin (pendiente) disminuye continuamente a partir de un valor mximo inicial. Esto se puede deber a:Desaturacin de la enzima con sustrato, por disminucin de la concentracin del sustratoInactivacin de la enzima por su inherente inestabilidad Inhibicin por el productoDesplazamiento del equilibrio, si la reaccin es reversible

v[s]Efecto de la concentracin de substrato........

dttsp[ ]Concepto de velocidad iniciald[P]v =, t 0

E + SESE + Pk+1k-1k+2Una cintica hiperblica implica un proceso saturante:Hay un nmero limitado de sitios en la enzimapara fijar substrato; una vez que estn ocupadostodos, por mucho que aumente la concentracinde substrato, la velocidad permanecer constantetendiendo a un valor asinttico

El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinmicadel sistemaE + SESE + Pk+1k-1k+2Sistema No admite solucin analtica.

- Simulaciones numricas- Hiptesis que lo simplifiquen

Hiptesis de Michaelis - MentenE + SESE + Pk+1k-1k+2- La primera parte del mecanismo, E + SESk+1k-1Tiene lugar mucho ms rpidamente que la segunda: ESE + Pk+2

A partir de las suposiciones de Michaelis-Menten y Estado estacionario, llegamos a la ecuacinLa nica diferencia radica en el significado de Km:

Km = k-1/k+1 en mecanismo de M.M.

Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.

Significado de la constante Vmax= k+2 e01. Velocidad asinttica para s

2. Directamente proporcional a la concentracin de enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k+2)

3. Mide funcin de transformacin cataltica

4. Se expresa en unidades de velocidad

Relacin entre Km y VmaxMichaelis y MentenLa Km es la concentracin de sustrato donde se obtiene la mitad de la Vmax

A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustratoA menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato

Representacin Lineweaver-Burke

Representacin Hanes

Representacin de Eadie-Hofstee

Mtodos de linealizacin para determinacin parmetros cinticos

MtodoEje YEje XInterceptoEje YInterceptoEje xPendienteLineweaver-Burke1/v1/s1/V-1/KK/VHaness/vsK/V-K1/VEadie-Hofsteevv/sVV/K-K

Definicin Actividad Enzimtica Es el nmero de moles de sustrato que reaccionan para formar producto, por mol de enzima y por unidad de tiempo. Esto supone que la enzima est plenamente saturada con sustrato y por tanto que la reaccin se efecta con su mxima rapidezEl ndice de recambio muestra la eficiencia impresionante de la catlisis enzimtica

A fin de normalizar la medicin de la actividad, se ocupa el valor de la velocidad inicial de reaccin, donde eses factores son despreciables. As,

Esta velocidad inicial no se espera que sea observada en un proceso enzimtico donde, debido a los elevados tiempos de operacin, es razonable suponer que esos factores ejercern su influencia.

Clculo de Actividad EnzimticaLa velocidad de reaccin catalizada por 0,1ml de una dilucin 1:100 de Fosfatasa Alcalina es 0,3umoles / min. de producto. Cul es su actividad enzimtica?0,1ml-------- 0,3umoles producto / min. 1,0ml------------3,0umoles producto / min. dil 1:100-------------300umoles producto / min. Respuesta: 300U/ml

Efecto del pH en la ENZIMACada enzima tiene un pH ptimo para su actividadEl pH afecta las interacciones inicas

Efecto de la temperatura en la ENZIMACada enzima tiene una temperatura ptima.Temperatura154075Aumento de la velocidadDesnaturacin por calor

Inhibicin enzimtica

Inhibidor:

Efector que hace disminuir la actividad enzimtica, a travs deinteracciones con el centro activo u otros centros especficos(alostricos).

Esta definicin excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica

De esta forma, habr dos tipos de inhibidores:

I. Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo

II. Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la molcula, causando un cambio conformacional con repercusin negativa en la actividad enzimtica.

Inhibicin enzimtica isostrica

Los inhibidores isostricos pueden ser de dos tipos:1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:E + IEI2. Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima:E + IEES + IESI

Inhibicin reversible(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijacin del substrato: Inhibicin Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijacin del substrato a la enzima, pero s impide la accin cataltica: Inhibicin No Competitiva

(c) El inhibidor se fija nicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la accin cataltica; este tipo se conoce como Inhibicin Anticompetitiva

Inhibicin Competitiva

Inhibidores CompetitivosCompiten con el sustrato por el sitio activo de la enzimaSe une solo a la enzima libreV mx no se altera y K M cambia

Inhibicin competitivaAl aumentar la cantidad de SUSTRATO el inhibidor competitivo es desplazado y se forma producto

EESEIISE + PCaractersticas:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibicin- Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del substrato.- El inhibidor es tan especfico como el substratoSe define una constante deequilibrio de disociacin delinhibidor:Ki = [E] [I][EI]

-1/Km-1/(Km(1 + i/Ki))1/VmaxInhibicin competitiva - Representacin recproca doble

Ejemplo Inhibidor Competitivocido succnico + FAD == cido fumrico + FADH2 El inhibidor competitivo es el cido malnicoEs un anlogo estructuralmente parecido al cido succnico

Inhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustratoNo se forma producto

cido Flico y SulfanilamidaLa sulfanilamida es un anlogo estructural del cido p - aminobenzoico (PABA)PABA es el punto de partida para la sntesis de cido flico en las bacteriasEl cido flico es una vitamina esencial para la proliferacin (divisin) bacterianaSulfanilamida se usa en el tratamiento algunas infecciones

Metotrexato y DihidrofolatoEl cido flico en sus formas de dihidro y tetrahidrofolato es coenzima de la reaccin catalizada por la dihidrofolato reductasa Esta reaccin es parte del metabolismo de los nucletidos para la sntesis de DNAMetotrexato se usa en la terapia de algunos cnceres, inhibiendo la sntesis de DNA

Inhibicin No Competitiva

Inhibidor No CompetitivoSe une a un lugar diferente del sitio activo la enzima Se une a la enzima libre y tambin al complejo enzima-sustratoPor accin del inhibidor disminuye la Vm pero el valor de Km no se altera

Inhibicin NO competitiva

Inhibidor NO competitivoEl inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un sitio diferente del sitio activo

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos

Inhibicin Anticompetitiva o Incompetitiva

Inhibidor IncompetitivoEn este tipo de inhibicin el inhibidor se enlaza al centro activo pero solo despus de que el sustrato lo haya hecho y, por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera, aunque todo el sustrato est saturando la enzima y toda la enzima est como complejo ES, el inhibidor puede enlazarse produciendo un complejo inactivo ESI.

Como I solo se une a ES estimula la formacin de ES y, por tanto, incrementa la unin del sustrato a la enzima, disminuyendo Km . Sin embargo, el complejo ESI no conduce a productos y Vm disminuye.

Inhibidor IncompetitivoSe une a un lugar diferente del sitio activo de la enzimaSe une slo al complejo enzima-sustratoLos efectos que tiene: disminuye el valor de Km y tambin el de Vmx

El inhibidor slo puede fijarse al complejo ES;el complejo ESI no es productivo

Determinacin de parmetros cinticos de inhibicin

ModeloKapVapInh compKm(1+i/Ki)VmInh no comp totalKmVm/(1+i/Ki)Inh anticompKm/(1+i/Ki)Vm/(1+i/Ki)

Inhibicin Irreversible- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo qumico de la enzima, modificndola covalentemente

- Su accin no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki:E + I E- A diferencia de la inhibicin reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacin del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente txicos.

Inhibidores IrreversiblesProducen inactivacin permanente de la actividad enzimticaSe interfiere con el normal desarrollo de una reaccin o va metablicaEjemplos: p-cloromercuribenzoato, yodoacetato, diisopropilfluorfosfato

Algunos tipos de inhibidores irreversibles1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Inhibicin enzimtica alosterica

Enzimas AlostricasSon enzimas cuya estructura proteica est formada de varias subunidadesNo se rigen por la cintica de M - MAdems del sitio o centro activo tienen sitios alostricos o de regulacinSitio activo/sustratos; Sitio alostrico/moduladores o reguladoresLa relacin entre la velocidad de reaccin y la concentracin de sustrato sigue cintica sigmodea

Enzimas alostricasLas enzimas alostricas presentan estructura cuaternaria.Tienen diferentes sitios activos, unen mas de una molcula de sustratoLa unin del sustrato es cooperativala curva de velocidad presenta una forma sigmoidal

Concepto de CooperatividadLa unin de los sustratos al sitio activo de una subunidad produce un cambio conformacional que por contacto fsico se transmite a las subunidades vecinas, facilitando las interaccionesModelos de unin: secuencial y concertadoEjemplos: unin Hb-O2, enzimas alostricas y sus sustratos

Moduladores AlostricosTambin reciben el nombre de efectores y pueden ser positivos o negativosSe unen al sitio alostrico que puede estar en la misma subunidad que tiene al sitio activo o en las subunidades regulatoriasSu unin produce un cambio conformacional que afecta al sitio activo

Aspartato Transcarbamilasac L-asp + Carbamil-P === Carbamil-asp + Pi . Primera reaccin en la sntesis de pirimidinasEfector positivo: CTP Efector negativo: ATP Tiene dos subunidades catalticas para los sustratos y tres subunidades regulatorias para los efectores

RESUMENLas enzimas son protenas que catalizan las reacciones biolgicasPresentan especificidad por su sustratoCada enzima presenta dos parmetros importantes Vmax (saturacin de la enzima) y la Km (medida de la afinidad por el sustrato)

RESUMENLa actividad enzimtica puede ser inhibida, por inhibidores competitivos (similares al sustrato) o por inhibidores no competitivos.La temperatura y el pH afectan a la enzima en su actividad cataltica.Algunas enzimas requieren de coenzimas y/o cofactores para su actividad.

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