enzimas cap 02

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Enzimologia - Paula Sá Pereira

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  • A APLICAO DA BIOLOGIAMOLECULAR NA PRODUODE ENZIMAS

    Carmen Lucia Anto Paiva e Paula S-Pereira

    SUMRIOEste captulo versa sobre a contribuio da biologiamolecular na busca, identificao emanipulao de enzimas. Contm um breve histrico da evoluo da biologia molecu-lar, com enfoque na clonagem de genes e sua importncia para a engenharia gentica(tecnologia doDNA recombinante).Mostra como a tecnologia doDNA recombinantepodeproduzirmudanas genticas emmicrorganismos comoobjetivo demelhorar ca-ractersticas bioqumicas e fisiolgicas que tenham valor para a indstria e possam serexploradas comercialmente, como o caso da produo de enzimas. Aborda o controleda expresso gnica e sua manipulao emmicrorganismos de interesse tecnolgico eenfoca os fungos filamentosos como fbricas celulares produtoras de enzimas, almda produo de enzimas por organismos extremfilos. Enfatiza que as propriedadesdas enzimas podem ser melhoradas por redesenho racionalizado ou evoluo direcio-nada e que muito provavelmente a associao das duas estratgias ser a rota de maiorsucesso para melhorar as propriedades e funo de uma enzima, ou mesmo criar umanova funo enzimtica. As plataformas tecnolgicas conhecidas como micas, a gen-mica, transcriptmica, protemica e metabolmica so ferramentas moleculares quepermitem descoberta de novas enzimas e aponta ainda que, atravs da combinao dapesquisa computacional e experimental embiocatlise, h de se aumentar grandemen-te o nvel de conhecimento dos sistemas biocatalticos e de se diminuir os esforosexperimentais e conseqentemente seus custos.

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  • INTRODUOFoi Wearren Weaver quem, em 1938, primeiro utilizou o termo Biologia Molecular.Desde ento enormes progressos tm acontecido neste ramo da cincia, que emergiuda associao dos conhecimentos acumulados nas reas de Bioqumica, Biologia Celu-lar eGentica (WITKOWSKI, 1988). Apartir de ento, algumas dcadas foramnecess-rias para o surgimento da engenharia gentica (ramo da biologiamolecularmais apro-priadamente denominado de tecnologia doDNA recombinante), que s pde aconte-cer devido aos avanos da biologia molecular, no que se refere ao conhecimento decomo as clulas armazenam, duplicam, transferem, expressam e regulam a expressoda informao gentica.

    Nasduasltimasdcadas, a engenharia gentica temsidoempregada intensamen-te para transferir um gene de interesse biotecnolgico de um organismo a outro, masfoi nadcadade70queoprimeiroplasmdeo recombinante foi produzido (COHENetalii, 1973) e a transcriptase reversa foi descoberta (BALTIMORE,1970; TEMIN eMIZUTANI, 1970), abrindo o caminho para a clonagem de genes eucariticos atravsdas bibliotecasdeDNAc(DNAcomplementar). Portanto, osplasmdeos e a transcripta-se reversa so duas importantes ferramentas da biologia molecular, que juntamentecomasenzimasde restriopossibilitaramodesenvolvimentoda tecnologiadoDNAre-combinante. A biologia molecular, atravs da engenharia gentica, tem trazido novassolues para antigos problemas biotecnolgicos. Pode-se, hoje, atravs da tecnologiadoDNA recombinante, produzirmudanas genticas nos organismos vivos comoobje-tivo de melhorar caractersticas bioqumicas e fisiolgicas que tenham valor para aindstria e possam ser exploradas comercialmente. Os microrganismos, tantoprocariotos quanto eucariotos, tm sido especialmente teis neste sentido.

    Vale lembrar que os microrganismos foram usados desde a Antigidade em pro-cessos biotecnolgicos, como na produo do po, da cerveja, do vinho, do queijo, doiogurte e na preservao de alimentos. Na atualidade, tm sido tambm utilizados naproduo de enzimas, antibiticos, solventes, aminocidos, suprimentos alimentares emuitas outras substncias, concomitantemente com a seleo de cepas altamenteeficientes na produo desses produtos (MILLER JR e NAGARAJAN, 2000).

    importante ressaltar queos nicos produtos gnicos a seremabordadosneste ca-ptulo sero as enzimas de natureza protica, por serem o principal objeto deste livro.Sero focalizados temas do campo da biologia molecular como a regulao da expres-so gnica, a manipulao de genes em microrganismos, a produo de enzimas pormicrorganismosgeneticamente engenheirados e a evoluodas enzimas in vitro, comoobjetivo de fornecer uma viso geral da contribuio da biologiamolecular ao aprimo-ramento da produo de enzimas. Sero abordados, tambm, a utilizao de organis-mos extremfilos na produo desses biocatalisadores e o uso dos fungos comofbricas celularesdeenzimas, comnfasenos aspectos relativos biologiamolecular.

    As enzimas so catalisadores biolgicos presentes em todos os seres vivos. Elas solargamente utilizadas, comaplicao emdiversos campos, incluindo a biorremediao,a sntese orgnica, as anlises clnicas, a produo de produtos farmacuticos, de deter-

    ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO30

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  • gentes, de alimentos, de produtos de fermentao, dentre outros. Podem ser usadas deformamuito lucrativa emmeio aquoso ou emmeio no convencional e, ainda, emmei-osde reaoextremos como,porexemplo, emrelao temperatura (BRAIUCAet alii,2006). Almdisso, cada vezmais temhavido aumento do interesse na utilizao das en-zimas conhecidas como catalisadores verdes, tanto em processos tecnolgicos comoem biorremediao , como o caso das lacases (ALCALDE et alii, 2006). Estas ltimasso oxidorredutases que utilizam o oxignio do ar e liberam gua como nico produtoalm do produto principal da reao (RIVA, 2006).

    REGULAO DE EXPRESSO GNICAOobjetivodaengenharia gentica aumentar aprodutividadeeo rendimentodospro-dutos gnicos de interesse, o que geralmente requer o aumento da expresso do geneque codifica para o produto gnico em questo, como por exemplo, o aumento da ex-presso daqueles genes que codificam enzimas de interesse industrial.

    Microrganismos, tanto os procariotos (bactrias), quanto os eucariotos (fungos eleveduras), tm sido muito teis para a produo de enzimas. Portanto fundamentalconhecer os mecanismos bsicos que regulam a expresso gnica nesses organismos.Enfatizamos que este assunto no poderia deixar de ser mencionado neste captulo,pois um importante aspecto da biologia molecular, cujo avano propiciou tambm aevoluo da engenharia gentica, com repercusses na produo de enzimas.

    Em procariotosA idia de que os genes podem ser ligados ou desligados produziu um grande impactosobre a biologia molecular h aproximadamente quarenta anos atrs. Hoje sabemosque a expresso gnica regulada, o que representa uma enorme economia para as c-lulas. Uma bactria tpica tem aproximadamente 4.000 genes, sendo que somente umafrao desses genes est sendo expressa em um determinado momento.

    Vale ressaltar que h duas categorias de genes: os genes constitutivos e os induzve-is. Os primeiros so aqueles que so sempre transcritos e cujos produtos gnicos so es-senciais durante toda a vidada clula.Osltimos so aqueles cujos produtos gnicos au-mentam ou diminuem de acordo com um sinal molecular, geralmente em resposta aosuprimentode alimento. Embora os genes constitutivos sejam sempre transcritos a con-centrao de seus produtos gnicos pode variar bastante de gene para gene.

    So vrios os mecanismos que regulam a expresso de um gene, compreendendoas etapas da transcrio, da traduo e do processamento do produto gnico. Portanto,a concentrao celular de umdeterminado produto gnico ativo no depende somen-te da transcrio, da velocidade e freqncia com que um gene transcrito, mas tam-bm demecanismos regulatrios ps-transcricionais. Estes mecanismos envolvem a re-gulao da biossntese protica, como por exemplo, o controle das funes ribossoma-is, asmodificaes namolcula da protena ocorridas aps a traduo e a velocidade desua degradao.

    CAPTULO 2 A APLICAO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUO DE ENZIMAS 31

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  • Nesta seo soabordados apenasosmecanismosque regulamaproduodo trans-crito primrio (RNAmensageiro, RNAm)emprocariotos, com foconaunidadede regu-lao chamada de operon. Embora os demais mecanismos de regulao no sejam me-nos importantes, no que se refere produo de um produto gnico ativo, eles no soabordados aqui, pois so muitos e envolvem mecanismos muito diversos, como, porexemplo, modificaes ps-traduo por fosforilao, metilao, adenilao, glicosila-o, dentre outros.

    O operon lac de Escherichia coli

    Foram Franois Jacob e Jacques Monod que, em 1961, primeiramente descreveram aregulao da expresso gnica em Escherichia coli. Eles observaram que as clulas deE.coli preferencialmente utilizavam a glicose como fonte de carbono, mesmo em pre-senadeoutros carboidratos como,porexemplo, a lactose. Poroutro lado, emausnciade glicose e empresena de lactose havia expresso de trs genes: o geneZ (que codifi-ca para -galactosidase), o gene Y (para a permease) e o gene A (para transacetilase).Estes genes esto um ao lado do outro no cromossomo bacteriano, so transcritos emconjunto e a -galactosidase e a permease participam do catabolismo da lactose(JACOB e MONOD, 1961).

    O termooperon foi cunhadoparadesignar umaunidadede regulaoda transcri-o. Um operon inclui:

    1. Um conjunto de genes contguos chamados de genes estruturais, que codifi-cam polipeptdeos.

    2. O stio promotor.

    3. As seqncias regulatrias, que atuam em conjunto na regulao da expressodos genes estruturais. Os operons mais comuns possuem de dois a seis genesque so expressos em conjunto, mas h outros que apresentam 20 ou mais ge-nes estruturais (NEIDHARDT, 1996).

    Para o entendimento de como, emE.coli, a lactose capaz de induzir, na ausnciade glicose, a sntese de enzimas para seu prprio catabolismo, necessria a compreen-so dos elementos que regulam a transcrio dos genes estruturais Z, Y e A, tais como ostio promotor, o operador e demais seqncias regulatrias.

    Stio promotor: o stio reconhecido pela RNApolimerase como incio do local detranscrio. Demodo geral, em bactrias, apresenta seqncias de consenso nas regies35 e 10, almdo elementoUP (up-stream), que umelemento rico emAT situado en-tre