enzimas cap 02

A APLICAÇÃO DA BIOLOGIAMOLECULAR NA PRODUÇÃODE ENZIMAS

Carmen Lucia Antão Paiva e Paula Sá-Pereira

SUMÁRIOEste capítulo versa sobre a contribuição da biologia molecular na busca, identificação emanipulação de enzimas. Contém um breve histórico da evolução da biologia molecu-lar, com enfoque na clonagem de genes e sua importância para a engenharia genética(tecnologia do DNA recombinante). Mostra como a tecnologia do DNA recombinantepode produzir mudanças genéticas em microrganismos com o objetivo de melhorar ca-racterísticas bioquímicas e fisiológicas que tenham valor para a indústria e possam serexploradas comercialmente, como o caso da produção de enzimas. Aborda o controleda expressão gênica e sua manipulação em microrganismos de interesse tecnológico eenfoca os fungos filamentosos como “fábricas celulares” produtoras de enzimas, alémda produção de enzimas por organismos extremófilos. Enfatiza que as propriedadesdas enzimas podem ser melhoradas por redesenho racionalizado ou evolução direcio-nada e que muito provavelmente a associação das duas estratégias será a rota de maiorsucesso para melhorar as propriedades e função de uma enzima, ou mesmo criar umanova função enzimática. As plataformas tecnológicas conhecidas como ômicas, a genô-mica, transcriptômica, proteômica e metabolômica são ferramentas moleculares quepermitem descoberta de novas enzimas e aponta ainda que, através da combinação dapesquisa computacional e experimental em biocatálise, há de se aumentar grandemen-te o nível de conhecimento dos sistemas biocatalíticos e de se diminuir os esforçosexperimentais e conseqüentemente seus custos.

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INTRODUÇÃOFoi Wearren Weaver quem, em 1938, primeiro utilizou o termo Biologia Molecular.Desde então enormes progressos têm acontecido neste ramo da ciência, que emergiuda associação dos conhecimentos acumulados nas áreas de Bioquímica, Biologia Celu-lar e Genética (WITKOWSKI, 1988). A partir de então, algumas décadas foram necessá-rias para o surgimento da engenharia genética (ramo da biologia molecular mais apro-priadamente denominado de tecnologia do DNA recombinante), que só pôde aconte-cer devido aos avanços da biologia molecular, no que se refere ao conhecimento decomo as células armazenam, duplicam, transferem, expressam e regulam a expressãoda informação genética.

Nas duas últimas décadas, a engenharia genética tem sido empregada intensamen-te para transferir um gene de interesse biotecnológico de um organismo a outro, masfoi na década de 70 que o primeiro plasmídeo recombinante foi produzido (COHEN etalii, 1973) e a transcriptase reversa foi descoberta (BALTIMORE,1970; TEMIN eMIZUTANI, 1970), abrindo o caminho para a clonagem de genes eucarióticos atravésdas bibliotecas de DNAc (DNA complementar). Portanto, os plasmídeos e a transcripta-se reversa são duas importantes ferramentas da biologia molecular, que juntamentecom as enzimas de restrição possibilitaram o desenvolvimento da tecnologia do DNA re-combinante. A biologia molecular, através da engenharia genética, tem trazido novassoluções para antigos problemas biotecnológicos. Pode-se, hoje, através da tecnologiado DNA recombinante, produzir mudanças genéticas nos organismos vivos com o obje-tivo de melhorar características bioquímicas e fisiológicas que tenham valor para aindústria e possam ser exploradas comercialmente. Os microrganismos, tantoprocariotos quanto eucariotos, têm sido especialmente úteis neste sentido.

Vale lembrar que os microrganismos foram usados desde a Antigüidade em pro-cessos biotecnológicos, como na produção do pão, da cerveja, do vinho, do queijo, doiogurte e na preservação de alimentos. Na atualidade, têm sido também utilizados naprodução de enzimas, antibióticos, solventes, aminoácidos, suprimentos alimentares emuitas outras substâncias, concomitantemente com a seleção de cepas altamenteeficientes na produção desses produtos (MILLER JR e NAGARAJAN, 2000).

É importante ressaltar que os únicos produtos gênicos a serem abordados neste ca-pítulo serão as enzimas de natureza protéica, por serem o principal objeto deste livro.Serão focalizados temas do campo da biologia molecular como a regulação da expres-são gênica, a manipulação de genes em microrganismos, a produção de enzimas pormicrorganismos geneticamente engenheirados e a evolução das enzimas in vitro, com oobjetivo de fornecer uma visão geral da contribuição da biologia molecular ao aprimo-ramento da produção de enzimas. Serão abordados, também, a utilização de organis-mos extremófilos na produção desses biocatalisadores e o uso dos fungos como“fábricas celulares” de enzimas, com ênfase nos aspectos relativos à biologia molecular.

As enzimas são catalisadores biológicos presentes em todos os seres vivos. Elas sãolargamente utilizadas, com aplicação em diversos campos, incluindo a biorremediação,a síntese orgânica, as análises clínicas, a produção de produtos farmacêuticos, de deter-

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO30

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gentes, de alimentos, de produtos de fermentação, dentre outros. Podem ser usadas deforma muito lucrativa em meio aquoso ou em meio não convencional e, ainda, em mei-os de reação extremos como, por exemplo, em relação à temperatura (BRAIUCA et alii,2006). Além disso, cada vez mais tem havido aumento do interesse na utilização das en-zimas conhecidas como catalisadores “verdes”, tanto em processos tecnológicos comoem biorremediação , como é o caso das lacases (ALCALDE et alii, 2006). Estas últimassão oxidorredutases que utilizam o oxigênio do ar e liberam água como único produtoalém do produto principal da reação (RIVA, 2006).

REGULAÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICAO objetivo da engenharia genética é aumentar a produtividade e o rendimento dos pro-dutos gênicos de interesse, o que geralmente requer o aumento da expressão do geneque codifica para o produto gênico em questão, como por exemplo, o aumento da ex-pressão daqueles genes que codificam enzimas de interesse industrial.

Microrganismos, tanto os procariotos (bactérias), quanto os eucariotos (fungos eleveduras), têm sido muito úteis para a produção de enzimas. Portanto é fundamentalconhecer os mecanismos básicos que regulam a expressão gênica nesses organismos.Enfatizamos que este assunto não poderia deixar de ser mencionado neste capítulo,pois é um importante aspecto da biologia molecular, cujo avanço propiciou também aevolução da engenharia genética, com repercussões na produção de enzimas.

Em procariotosA idéia de que os genes podem ser ligados ou desligados produziu um grande impactosobre a biologia molecular há aproximadamente quarenta anos atrás. Hoje sabemosque a expressão gênica é regulada, o que representa uma enorme economia para as cé-lulas. Uma bactéria típica tem aproximadamente 4.000 genes, sendo que somente umafração desses genes está sendo expressa em um determinado momento.

Vale ressaltar que há duas categorias de genes: os genes constitutivos e os induzíve-is. Os primeiros são aqueles que são sempre transcritos e cujos produtos gênicos são es-senciais durante toda a vida da célula. Os últimos são aqueles cujos produtos gênicos au-mentam ou diminuem de acordo com um sinal molecular, geralmente em resposta aosuprimento de alimento. Embora os genes constitutivos sejam sempre transcritos a con-centração de seus produtos gênicos pode variar bastante de gene para gene.

São vários os mecanismos que regulam a expressão de um gene, compreendendoas etapas da transcrição, da tradução e do processamento do produto gênico. Portanto,a concentração celular de um determinado produto gênico ativo não depende somen-te da transcrição, da velocidade e freqüência com que um gene é transcrito, mas tam-bém de mecanismos regulatórios pós-transcricionais. Estes mecanismos envolvem a re-gulação da biossíntese protéica, como por exemplo, o controle das funções ribossoma-is, as modificações na molécula da proteína ocorridas após a tradução e a velocidade desua degradação.

CAPÍTULO 2 � A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 31

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Nesta seção são abordados apenas os mecanismos que regulam a produção do trans-crito primário (RNA mensageiro, RNAm) em procariotos, com foco na unidade de regu-lação chamada de operon. Embora os demais mecanismos de regulação não sejam me-nos importantes, no que se refere à produção de um produto gênico ativo, eles não sãoabordados aqui, pois são muitos e envolvem mecanismos muito diversos, como, porexemplo, modificações pós-tradução por fosforilação, metilação, adenilação, glicosila-ção, dentre outros.

O operon lac de Escherichia coli

Foram François Jacob e Jacques Monod que, em 1961, primeiramente descreveram aregulação da expressão gênica em Escherichia coli. Eles observaram que as células deE.coli preferencialmente utilizavam a glicose como fonte de carbono, mesmo em pre-sença de outros carboidratos como, por exemplo, a lactose. Por outro lado, em ausênciade glicose e em presença de lactose havia expressão de três genes: o gene Z (que codifi-ca para �-galactosidase), o gene Y (para a permease) e o gene A (para transacetilase).Estes genes estão um ao lado do outro no cromossomo bacteriano, são transcritos emconjunto e a �-galactosidase e a permease participam do catabolismo da lactose(JACOB e MONOD, 1961).

O termo operon foi cunhado para designar uma unidade de regulação da transcri-ção. Um operon inclui:

1. Um conjunto de genes contíguos chamados de genes estruturais, que codifi-cam polipeptídeos.

2. O sítio promotor.

3. As seqüências regulatórias, que atuam em conjunto na regulação da expressãodos genes estruturais. Os operons mais comuns possuem de dois a seis genesque são expressos em conjunto, mas há outros que apresentam 20 ou mais ge-nes estruturais (NEIDHARDT, 1996).

Para o entendimento de como, em E.coli, a lactose é capaz de induzir, na ausênciade glicose, a síntese de enzimas para seu próprio catabolismo, é necessária a compreen-são dos elementos que regulam a transcrição dos genes estruturais Z, Y e A, tais como osítio promotor, o operador e demais seqüências regulatórias.

Sítio promotor: É o sítio reconhecido pela RNA polimerase como início do local detranscrição. De modo geral, em bactérias, apresenta seqüências de consenso nas regiões–35 e –10, além do elemento UP (up-stream), que é um elemento rico em AT situado en-tre as posições –40 e –60, que aparece em genes com elevado nível de expressão. As se-qüências de consenso são aquelas preservadas ao longo da evolução nos diferentes pro-motores em diferentes genes. A figura 2.1 mostra o promotor do operon lac de E.coli.

As seqüências de nucleotídeos de diferentes promotores podem variar bastante, oque determina as diferenças nas velocidades da transcrição. A eficiência com a qual aRNA polimerase se liga ao promotor e inicia a transcrição é determinada pelas seqüên-cias de consenso, pelo espaçamento entre elas e pela distância do início da transcrição.


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A troca de um único par de nucleotídeos em uma seqüência de consenso pode diminu-ir a velocidade de transcrição por várias ordens de magnitude. Por outro lado, há trocasde nucleotídeos no promotor que aumentam a velocidade de transcrição (JENSEN eHAMMERS, 1998).

�Operador: O operador é definido como a região do DNA, que interage com umaproteína repressora (repressor) que controla a expressão de um gene ou grupode genes. A seqüência de DNA onde se liga o repressor contém aproximadamen-te 20 pares de nucleotídeos e inclui o local do início da transcrição do RNAm. Amolécula repressora é codificada à distância por um gene chamado de gene re-gulador. O repressor Lac pode se inativar quando ligado à lactose, mas os genesestruturais controlados por ele só serão transcritos se um controle adicional foracionado (KOLB et alii, 1993). Este controle, que inclui a diminuição da concen-tração de glicose e o aumento de AMPc na célula, é descrito a seguir.

� Sítio CRP (do inglês camp receptor protein): Este sítio se situa próximo ao pro-motor e é uma seqüência do DNA com simetria binária, em relação ao eixo (figu-ra 2.1). A proteína receptora de AMPc (CRP) é também designada por CAP (doinglês catabolite gene activator protein). É um homodímero com afinidade pelosítio CRP que interage com a RNA polimerase para facilitar a transcrição, quan-do a fonte de carbono glicose se esgota. Esta proteína CRP tem um sítio de liga-


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Figura 2.1 a) Representação do sítio promotor do operon lac de E.coli; b) comparação entre asregiões –35 e –10 do promotor lac e as seqüências de consenso em um promotor genérico.

DNA5’ATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACCTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAC - 3

TATGTT

região - 10

TTTACA

região - 35

GTGAGTTAGCTCAC

sítio CRP

simetriabinária

A G C T C A CT T G A G T G

local de ligação da RNA polimerase

operador

(a)

(b)

Seqüências deconsenso emum promotor

Promotor lac

região - 10região - 35

TTGACA

ATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG

TATAAT

ATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG

TTTACA TATGTT

ção com o AMPc e este último tem sua síntese inibida e seu efluxo da célula é esti-mulado por glicose. Assim, se a concentração de glicose é alta a de AMPc é baixa(conseqüentemente CRP está inativa) e se a concentração de glicose é baixa a deAMPc é alta (CRP está ativa) (KOLB et alii, 1993).

A expressão dos genes estruturais para o catabolismo da lactose depende, portan-to, da ação em concerto do repressor, que pode estar ativo (não ligado à lactose) ou ina-tivo (ligado à lactose) e da CRP, que pode estar ativa (ligada a AMPc) ou inativa (não li-gada a AMPc, quando a glicose está presente).

Diversos operons catabólicos, como, por exemplo, o da arabinose, já foram descri-tos, assim como, os operons anabólicos, como por exemplo, o da síntese do triptofano.O operon lac é um dos mais simples, entretanto outros mecanismos de regulação, comoo do catabolismo da arabinose, incluem vários passos regulatórios adicionais, que nãoserão aqui discutidos por não ser objetivo deste capítulo examinar a fundo cada operonconhecido, mas apenas propiciar uma visão geral do controle da expressão gênica,como subsídio para as seções seguintes.

Em eucariotosA regulação da expressão gênica em eucariotos é bastante mais complicada do que emprocariotos. Nestes últimos, as proteínas que regulam a transcrição se ligam em locais mu-ito próximos ao sítio de início da transcrição, embora existam exceções como a da proteí-na regulatória de bactéria, NtrC, que ativa a transcrição à distância. NtrC se situa sobreuma porção do DNA denominada de enhancer (realçador). O enhancer é uma seqüên-cia regulatória que, em conseqüência de uma dobra no DNA, possibilita o encontro deNtrC com a RNA polimerase, o que ativa a transcrição (NEIDHARDT, 1996).

Nesta seção descrevemos apenas a regulação da transcrição em eucariotos realiza-da pela RNA polimerase II, que transcreve o DNA para os precursores dos RNA mensa-geiros, não abordando aqui a regulação das RNA polimerases I (transcrição para molé-culas de RNA ribossomal 18S, 5,8S e 28S) e III (para moléculas de RNA transportadorese do RNA ribossomal 5S).

Nos eucariotos, as regiões que controlam a transcrição de um gene podem estar es-palhadas em locais distantes, mas atuando concomitantemente. As regiões controlado-ras da expressão gênica incluem o conjunto formado pelo sítio promotor (onde os fato-res gerais de transcrição e a RNA polimerase, RNApol, se associam) e todas as demais se-qüências regulatórias (onde se ligam proteínas que regulam a velocidade de associaçãodos fatores gerais de transcrição com a RNApol). Muitas proteínas regulatórias que se li-gam aos enhancers ativam a transcrição, entretanto outras a regulam negativamente(KORNBERG, 1996).

A figura 2.2 mostra um esquema da região de controle de um gene eucariótico, evi-denciando a localização dos fatores gerais de transcrição e da RNApol II no promotor ea localização das proteínas regulatórias nas seqüências regulatórias. Estas últimas po-dem se encontrar adjacentes ao promotor, longe dele à montante, dentro de introns ouà jusante do gene (MENKA e THANOS, 2001).


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A iniciação da transcrição é o principal ponto de regulação da expressão gênicatanto para procariotos como para eucariotos, embora seus respectivos mecanismos deregulação apresentem diferenças marcantes. Em procariotos a RNApol geralmenteacessa qualquer promotor e tem a capacidade de iniciar a transcrição mesmo na ausên-cia de seqüências controladoras. Já em eucariotos os promotores são inativos in vivo naausência dessas seqüências.

Há três classes de proteínas que estão envolvidas na regulação da transcrição, quesão os fatores gerais de transcrição, os transativadores e os coativadores. Os primeiros sereferem aos fatores que se ligam à região TATA para a formação do complexo depré-iniciação. Os segundos são os que se associam às moléculas ativadoras, ou às repres-soras, e assim se ligam aos enhancers; eles têm a capacidade de se ligarem a moléculas si-nalizadoras, ativando ou reprimindo a transcrição, em resposta a modificações do ambi-ente celular. Os terceiros são aqueles que agem como intermediários entre os transati-vadores e a RNA polimerase. Em leveduras um exemplo de coativador é o mediador,um complexo de aproximadamente 20 polipeptídeos, que se liga à RNA polimerase II ea transativadores situados nos enhancers (figura 2.2) (MALIK e ROEDER, 2000).

Sabemos que uma plêiade de proteínas atua orquestradamente regulando a trans-crição. Elas, entretanto, em conjunto com os sítios no DNA a que se ligam, não são os


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Figura 2.2 Representação esquemática do início da transcrição de um gene eucariótico (gene A)evidenciando a localização dos fatores gerais de transcrição e da RNApol II no promotor e alocalização das proteínas junto às suas seqüências regulatórias e “enhancer”.

seqüênciaregulatória

fatores geraisde transcrição

proteínasregulatórias

“enhancer”

ativador

domínioativador

RNA polimerase II

transcrição

gene A

TATA

promotor

Mediador

proteínasregulatórias

da expressãogenica

seqüênciaregulatória

Regiões Controladoras do Gene A

únicos elementos na regulação da expressão em nível da transcrição. Há ainda umgrande problema a ser resolvido no cromossomo eucariótico, que se refere à estruturada cromatina (formada de DNA e proteínas) que tem de ser modificada para liberaçãoda região de consenso TATA (TATA box) na região a ser transcrita. O cromossomo eu-cariótico é muito mais complexo do que o de procariotos, pois apresenta estruturas de-nominadas de nucleossomos (TRAVERS, 1999), que compreendem um octâmeros deproteínas histonas circundado por DNA. Mais especificamente, a região TATApresente no promotor deve ser liberada das moléculas de histona para se tornaracessível à RNApol.

Modificações epigenéticas estão sendo, cada vez mais, consideradas importantesno entendimento dos processos de regulação gênica. Em geral, a metilação do DNAestá associada com promotores silenciosos que contêm ilhas CpG, sendo, portanto, a re-pressão gênica provavelmente mediada pela ligação de proteínas específicas ao DNAmetilado. Um outro evento epigenético é a acetilação de histonas. Em geral, a acetila-ção das histonas está associada com a ativação dos genes e a falta de acetilação com re-pressão dos mesmos. A fosforilação das histonas na mitose e a metilação das mesmastambém participam do silenciamento dos genes (BECK e OLEK, 2001; KWAKS eOTTE, 2006). Todos esses mecanismos, atuando em conjunto, colaboram para a regu-lação da expressão gênica em resposta ao ambiente celular, o que representa enormeeconomia para as células, e nos eucariotos superiores garante a diferenciação dascélulas para produção dos tecidos que formarão os diferentes órgãos do indivíduo.

Vale ressaltar que a manipulação da expressão gênica, especialmente em micror-ganismos, é objeto de enorme interesse por parte dos envolvidos em biotecnologia comfoco na produção de enzimas.

MANIPULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM MICRORGANISMOSDepois de identificado, o gene responsável pela codificação de uma enzima específicapode ser isolado e transferido por técnicas de DNA recombinante para um microrganis-mo industrial conhecido. Geralmente, através dos vetores recombinantes de clonagem,como os plasmídeos, incorpora-se o gene de interesse ao microrganismo hospedeiroque vai expressá-lo. A produção desses vetores recombinantes se dá pelo emprego deenzimas de restrição, que cortam o DNA do vetor em locais específicos onde o gene aser clonado será inserido. A enzima DNA ligase, após pareamento das extremidades doDNA do plasmídeo com as do inserto, faz a ligação do DNA do vetor com o DNA do seg-mento que contém o gene de interesse. Às vezes, inserem-se diversas cópias do gene nomicrorganismo hospedeiro a fim de se potenciar a produção da enzima. Vale ressaltarque há enzimas codificadas por mais de um gene diferente (as heterodiméricas, porexemplo). Para facilitar o entendimento, relatamos, neste parágrafo o exemplo declonagem de uma enzima codificada por um único gene.

O fato de se conhecerem as condições ideais de trabalho para os microrganismoshospedeiros favorece a produção das enzimas em grande escala. Os principais micror-ganismos hospedeiros usados são Eschericia coli, estirpes de Bacillus sp., de Aspergillus


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sp. e Saccharomyces cerevisiae. O interesse a respeito da manipulação da expressão gê-nica em microrganismos surge da necessidade de se obter um determinado produtogênico com alto rendimento.

Para que seja produzido um produto novo em uma célula hospedeira, há necessi-dade da expressão coordenada dos genes que codificam as enzimas envolvidas em suasíntese. Há necessidade, também, de um forte controle da expressão dos genes emquestão e de consistente expressão de um produto gênico ativo.

A engenharia metabólica tem se utilizado da tecnologia do DNA recombinantepara a modificação de microrganismos visando à superprodução de substâncias comoas enzimas. Para a produção de um organismo recombinante com a finalidade de ex-pressar uma proteína heteróloga são utilizadas diversas ferramentas da biologiamolecular apresentadas a seguir.

Vetores de clonagem

Vetores de clonagem são seqüências de DNA às quais serão ligados os genes que se dese-ja clonare expressar, em uma determinada célula hospedeira. A expressão de um geneoriginará um produto gênico heterólogo (BAILEY, 1991; COHEN et alii, 1973). Os ve-tores de clonagem precisam apresentar replicação autônoma na célula viva, propician-do assim a proliferação dos genes neles inseridos (figura 2.3). Eles devem ter sítios clivá-veis por endonucleases de restrição (importantes ferramentas da biologia molecularusadas para cortar DNA em seqüências palindrômicas específicas) em que podem serinseridos os fragmentos de DNA para a construção do vetor recombinante. Os vetoresdevem ser pequenos por conveniência de manipulação e eles são escolhidos de acordocom o tamanho do fragmento de DNA a ser clonado. A classificação do tipo de vetor éequivalente à classificação de seu tamanho.


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Figura 2.3 Etapas principais da obtenção de plasmídeos recombinantes, que portam o gene daproteína heteróloga (em vermelho): construção do plasmídeo “in vitro”; seleção da cepatransformada; otimização do cultivo das células transformadas; fermentação; extração e purificaçãodos plasmídeos recombinantes para futura utilização.

Produção dePlasmídeo

Recombinante

Obtenção dosPlasmídeos

Recombinantes

Construção dovetor plasmidial

Seleção da cepatransformada

Optimizaçãodo Meio

Purificação Lise

Fermentação

Os plasmídeos e os transposons são os vetores de clonagem mais usados em enge-nharia metabólica de bactérias. Os primeiros se mantêm autonomamente na célulahospedeira. Já os transposons se integram no cromossomo bacteriano. Os plasmídeostêm a capacidade de comportar um inserto de até 20 kb, embora o tamanho médiotípico do inserto seja de aproximadamente 3,5 kb.

A engenharia metabólica pode ter o interesse de expressar um gene em várias célu-las diferentes para que se possa escolher qual delas apresenta maior produção do pro-duto gênico. Nesse caso, a melhor opção de vetor seria a dos plasmídeos de largo espec-tro que têm, por definição, a habilidade de se replicar em muitos tipos diferentes de cé-lulas hospedeiras (KEASLING, 1999). É necessário que o vetor plasmidial que carrega ogene heterólogo apresente alta estabilidade segregacional, o que garante que todas ascélulas presentes na cultura contêm o plasmídeo recombinante. A propriedade de sersegregado nas células filhas é alcançada pelos plasmídeos através de um de doismecanismos:

1. Através de um elemento de partição presente na bactéria.

2. Através da morte das células que não o contêm (KIM et alii, 2000; NORDSTROMe AUSTIN, 1989).

Os plasmídeos podem ser classificados, quanto ao número de cópias por célula,como plasmídeos de grande, médio e pequeno número de cópias. Os de grande núme-ro de cópias têm mais de 100 cópias por célula e são muito instáveis segregacionalmentena ausência de fatores de seleção, além de não comportarem longas seqüências deDNA. São pequenos, 2 a 3 kb, incluindo o gene de resistência a antibiótico e o promotorpara expressão da proteína heteróloga (KEASLING, 1999).

Os plasmídeos de número médio de cópias apresentam de 5 a 20 cópias por célula.Vários desse tipo foram construídos a partir de plasmídeos de largo espectro, como oRK2. Miniplasmídeos que contêm a origem e o mecanismo de partição de RK2 podemser estáveis durante 200 gerações, aproximadamente, em algumas pseudomonas, na au-sência de pressão seletiva. Os plasmídeos derivados de RK2 podem comportar diferen-tes genes para resistência a antibiótico, diferentes sistemas de expressão induzíveis egrupos de incompatibilidade (BLATNEY et alii, 1997). Essas propriedades possibilitama introdução em uma única célula de múltiplos plasmídeos (com informação para dife-rentes passos metabólicos ou partes de um mesmo passo) originários de diferentes gru-pos de incompatibilidade. Estes plasmídeos de largo espectro têm sido muito utilizadosna construção de uma via nova de biodegradação ou de uma via biossintética, em orga-nismos como E.coli, sendo subseqüentemente transferidos para diversos outros orga-nismos onde são expressos (KEASLING, 1999).

Os de número pequeno de cópias, uma a cinco por célula, são estáveis na ausênciade pressão seletiva e são alternativas excelentes em relação aos plasmídeos de grande emédio número de cópias, quando há necessidade de alta estabilidade e baixa sobrecar-ga metabólica imposta à célula hospedeira. Como esses plasmídeos conseguem replicarfielmente longos segmentos de DNA, eles são capazes de replicar a maior parte dosgenes necessários à síntese de produtos complexos em bactérias (KEASLING, 1999).


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O transposon é uma seqüência específica de DNA que catalisa sua própria movi-mentação dentro dos cromossomos (CRAIG, 1996; 1997). Os transposons têm sido ex-tremamente úteis na transferência de genes em bactérias porque os genes transferidospor esta via são mais estáveis do que os transferidos por plasmídeos. O fenômeno datransposição pode ocorrer praticamente em todas as células incluindo as de eucariotos.Entretanto, o fenômeno natural da transposição é muito pouco freqüente, pois a inser-ção de um transposon dentro de um gene essencial para a célula pode matá-la. Embactérias, há dois tipos de transposons:

1. Os transposons simples, que são seqüências de inserção que contêm apenas asseqüências essenciais à transposição e os genes para as transposases quecatalisam o processo.

2. Os transposons complexos, que contêm mais de um gene além dos necessáriosà transposição (ALBERTS et alii, 2002).

Em comparação com os vetores de clonagem disponíveis para E.coli e leveduras,há menos vetores próprios para fungos filamentosos. O alto custo da produção de enzi-mas para processos industriais torna crítica a seleção apropriada de sistemas compostosde vetores de expressão em fungos filamentosos. Um exemplo de sistema vetor-hospe-deiro é o proposto por Bergquist et alii (2002) para a expressão, em Trichoderma ree-sei, de enzimas obtidas de microrganismos termófilos.

O Departament of Microbial Genetics, do National Institute of Genetics, Mishima,Shizuoka, no Japão, oferece de forma gratuita, exclusivamente para pesquisa, 386 veto-res para clonagem, com indicação de suas propriedades (http://gillnet.lab.ring.ac.jp/~cvector/ NIG-cvector/aboute.html). O Instituto Pasteur é, também, depositário de ve-tores de clonagem e de células e pode ser acessado através do endereçohttp://www.pasteur.fr. O sítio http://vectordb.atcg.com oferece também uma lista demais de 2.600 vetores e as informações essenciais sobre eles.

PromotoresNa maior parte dos processos que envolvem engenharia genética é necessária a troca dopromotor nativo original do gene heterólogo por outro promotor específico para a cé-lula hospedeira, ou por um promotor que permita algum tipo de controle sobre a ex-pressão do gene. Tratamos aqui de três tipos de promotores, os induzíveis, os constituti-vos e os múltiplos.

� Induzíveis: A indução da expressão de um determinado passo metabólico emmicrorganismos é geralmente requerida na engenharia metabólica. Muitos siste-mas indutores de expressão estão atualmente disponíveis, como, por exemplo,os de E.coli, que incluem o sistema de expressão da lactose ou da arabinose. Vári-os derivados do promotor lac original (Plac), dentre outros, estão disponíveis emdiferentes plasmideos (KEASLING, 1999).� Constitutivos: Esta classe de promotores é muito útil para a engenharia metabó-

lica quando não são necessários os promotores induzíveis. Jensen e Hammers


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(1998), desenvolveram promotores constitutivos para serem usados em E.coli eLactococcus lactis. Eles alteraram as seqüências de nucleotídeos nas regiões –10ou –35 de um promotor, ou em ambas as regiões, assim como na região espaça-dora de 16 pb entre estas seqüências, o que levou ao aumento, em várias ordensde magnitude, da força do promotor.

�Múltiplos: A melhor maneira de se conseguir a regulação coordenada de múlti-plos genes é usar diferentes promotores índuzíveis, um para cada gene. A des-vantagem desta estratégia é que se deve adicionar múltiplos indutores ao meio.Uma estratégia alternativa foi a proposta por Jensen e Hammers (1998), já citadaacima, que inclui promotores constitutivos de forças diferentes. Estes seriam in-duzidos pela mesma molécula indutora, mas os diferentes genes seriam expres-sos cada um no seu nível respectivo de acordo com o promotor a que estão associ-ados.

PROTEÍNAS HETERÓLOGASA engenharia genética tem propiciado nas últimas décadas o estudo das mais diferentesproteínas, o que antes do desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinanteera mui-to difícil, pois a maior parte das proteínas eucarióticas está presente em baixíssima quanti-dade nas células. Somente as proteínas presentes em grandes quantidades podiam ser pu-rificadas, dando origem a uma massa de aproximadamente 100 mg de proteína pura, su-ficiente para a análise de sua atividade, seu seqüenciamento e para a produção de anticor-pos. Atualmente, grandes quantidades de uma determinada proteína, até mesmo em es-cala industrial, podem ser produzidas pela tecnologia do DNA recombinante em célulasgeneticamente modificadas. Tais células se multiplicam em fermentadores e expressam areferida proteína heteróloga, que pode ser extraída e purificada.

Proteínas codificadas por genes eucarióticos podem ser expressas em células pro-carióticas via DNAc. Esta estratégia lança mão das transcriptases reversas, que são capa-zes de transcrever reversamente, em DNAc, uma seqüência de RNAm (BALTIMORE,1970). Portanto, formado o DNAc este pode ser introduzido em um vetor para expres-são em bactéria. Como as bactérias não são capazes de retirar os introns das moléculasde RNA precursoras das de RNAm, o artifício de usar DNAc, produzido a partir de ummolde do RNA sem os introns (RNAm), possibilita a expressão em procariotos de poli-peptídeos de origem eucariótica, contendo a seqüência de aminoácidos corresponden-te à codificada pelo RNAm da célula eucariótica de origem. Para que uma proteínaheteróloga seja obtida com alto rendimento é necessário:

1. Que o gene que a codifica seja inserido junto a um promotor forte no vetor deexpressão.

2. Que este vetor seja incorporado em células hospedeiras e que essas células semultipliquem eficazmente.

3. Que o vetor seja estável, se reproduza autonomamente e segregue nas célulasfilhas.


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4. Que o gene heterólogo seja transcrito nas células hospedeiras com alta eficiência.

5. Que o RNAm seja traduzido em uma proteína com a seqüência de aminoácidosda forma original.

6. que esta proteína seja devidamente processada e possa ser secretada ou extraí-da da célula e, finalmente, seja purificada.

Durante a produção de proteínas recombinantes em larga escala, a concentração doproduto é talvez o parâmetro mais crucial para o monitoramento de rotina. Saber exata-mente quando extrair a proteína recombinante evita a redução do rendimento do pro-duto, ocasionada pela extração prematura ou pela degradação do produto no biorreator.Uma excelente revisão sobre o monitoramento rápido de produtos protéicos recombi-nantes, com comparação entre as tecnologias atuais, foi publicada por Baker et alii(2002).

Um exemplo de proteína heteróloga de importância industrial e comercial é a en-zima renina, utilizada na produção de queijo, que pode ser atualmente produzida pormicrorganismos geneticamente modificados. A renina era previamente retirada do es-tômago bovino, entretanto, mais recentemente, o gene da enzima foi inserido em célu-las de levedura, que passaram a produzir a enzima. Esta enzima é conhecida como qui-mozima e é comercialmente utilizada na produção do queijo vegetariano. Este produtoteve a liberação autorizada porque é idêntico ao produto animal natural e, portanto,não necessita de rótulo que identifique sua origem como sendo de organismos geneti-camente modificados. Ressaltamos que os alimentos produzidos que envolvem a enge-nharia genética são objeto de forte controle. As enzimas obtidas de organismos geneti-camente modificados que, entretanto, são inativadas por calor ou pasteurização do pro-duto final são bem aceitas e sua identificação não é necessária. As amilases e proteasessão também importantes exemplos de enzimas usadas na indústria de alimentos quetêm sido produzidas por organismos geneticamente modificados.

Atualmente é possível clonar e expressar qualquer enzima em organismos recom-binantes, mas somente a expressão com alto rendimento torna a enzima economica-mente viável.

FUNGOS FILAMENTOSOS COMO “FÁBRICAS CELULARES”PRODUTORES DE ENZIMASOs fungos filamentosos têm sido usados há séculos como fontes de produção de muitosmetabólitos e enzimas. Eles estão envolvidos no processamento de frutas e legumes, naclarificação de sucos de frutas, na extração de cafés e na produção de adoçantes. Muitosfungos secretam naturalmente proteínas e têm sido explorados comercialmente como“fábricas” de enzimas, tanto as originadas de fungos como das heterólogas, original-mente presentes em outros organismos. Os fungos filamentosos de maior interesse in-dustrial incluem espécies de Aspergillus sp., como A. awamori, A. niger, A. orizae, A. ni-dulans, de Mucor (M. Michie) e de Trichoderma (T. reesei) (VAN DEN HOMBERGHet alii, 1997).


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Modificações genéticas têm sido usadas para melhorar a capacidade de produçãoe secreção de enzimas nesses organismos, já que o rendimento da produção em fungosselvagens é geralmente baixo. O desenvolvimento de estratégias de biologia molecular,inicialmente para modificação genética de bactérias (E. coli e Bacillus spp.), e logo de-pois para a modificação de fungos, rapidamente favoreceu o aprimoramento de certascaracterísticas úteis do fungo. Estas manipulações genéticas têm o intuito de que o fun-go produza e secrete grandes quantidades de enzima, maiores do que no microrganis-mo selvagem (PUNT et alii, 2002).

Muitos fungos convencionais são capazes de produzir grandes quantidades de pro-teínas específicas. Entretanto, eles as secretam juntamente com outras proteínas dasquais têm que ser separadas, o que aumenta substancialmente o custo de produção.Através de técnicas de biologia molecular, os genes de certas proteínas supérfluas po-dem ser eliminados, resultando em altos níveis da proteína de interesse, sem necessida-de de purificação adicional. Idealmente, o gene de interesse deve ser clonado e expres-sado em uma cepa com baixo background de proteínas indesejadas, o que eliminaetapas adicionais de purificação (www.foodproductdesign.com).

Os fungos filamentosos têm sido utilizados também como sistemas de expressãode proteínas heterólogas não-fúngicas. Embora no início das pesquisas as mesmas estra-tégias tenham sido usadas para a expressão das proteínas fúngicas e não-fúngicas, o ní-vel obtido dessas últimas é sempre mais baixo do que o das primeiras. Uma explicaçãopara este fato é a presença de proteases produzidas e secretadas pelo fungo hospedeiro(VAN DE HOMBERGH, 1997). Punt el alii (2002) publicaram uma revisão em que rela-tam suas experiências com cepas deficientes em proteases para a produção de interleu-cina-6 de origem humana. Eles obtiveram o melhor rendimento com uma cepa trans-formada de A. niger deficiente em proteases e que era incapaz de acidificar o meio decultura, impedindo assim a atividade proteásica residual sobre a interleucina-6.

Recentes pesquisas com fungos filamentosos exploraram sua rica diversidade ge-nética e os colocaram em evidência como importantes fontes de células hospedeiraspara a engenharia genética e como fontes de novos genes de interesse biotecnológico.Até o momento, entretanto, somente um número limitado de espécies de fungos foi ex-plorado como células hospedeiras para a produção de proteínas recombinantes(PUNT et alii, 2002).

Várias estratégias de biologia molecular têm sido usadas para aumentar a produ-ção de proteínas homólogas e heterólogas (NEVALAINEN e THEO, 2003). A introdu-ção de múltiplas cópias de genes sob o controle de um promotor homólogo forte emuma cepa mutante alta secretora de proteína é uma delas. Vale ressaltar que ainda háuma baixa quantidade de promotores adequados para a expressão de proteínas homó-logas e heterólogas recombinantes. Esforços importantes estão sendo feitos no sentidode aumentar a seleção de promotores e de conhecer as condições específicas dos pro-motores através da transcriptômica (FOREMAN et alii, 2003) e da proteômica (LIM etalii, 2001).


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Outra estratégia é o estudo de genes que são ativados na célula em resposta às pro-teínas não-dobradas (UPR, do inglês unfolded protein response). As bases molecularesda UPR têm sido objeto, nos últimos cinco anos, de importantes estudos realizados, porexemplo, pelo consórcio de 28 laboratórios europeus (Eurofung, Fungal Biotechno-logy Program, www.eurofung.net) (NEVALAINEN et alii, 2006). O gene que regula aUPR (hac) foi clonado em T. reesei, A. nyger e A. nidulans e os mecanismos de ativaçãoestudados em detalhes (SALOHEIMO et alii, 2003). Além disso, um outro tipo de res-posta regulatória tem sido investigado em fungos. Esta resposta se refere à RESS(repression under secretion stress response), que atua ao mesmo tempo em que ocorrea ativação do gene hac 1 que codifica para um fator de transcrição UPR (NEVALAINENet alii, 2006).

A partir dos resultados inconsistentes obtidos através das várias estratégias usadaspara aumentar o rendimento da produção de produtos gênicos heterólogos em fungos,tornou-se necessário mudar a abordagem de estudo gene a gene para uma abordagemmais unificada, ou seja, estudar o organismo como um todo em relação às modificaçõespós-tradução e à secreção. A coleta de informações celulares globais, a partir de dadosem nível da transcriptômica, proteômica, metabolômica e fluxômica, é tarefa da biotec-nologia de sistemas, que ainda está em seus estágios iniciais e apresenta uma série de de-safios (LEE et alii, 2005).

A modelagem in silico e simulações têm sido desenvolvidas para análise quantitati-va do metabolismo celular em nível de sistema. Com base nas informações globais obti-das será possível desenhar células com propriedades metabólicas melhores para aplica-ções industriais. O artigo de Lee et alii (2005) descreve os recentes avanços da biotecno-logia de sistemas e discute as perspectivas futuras dessa nova área para a produção porfungos de proteínas de interesse econômico.

Se a célula de fungo está sendo apontada como uma importante “fábrica celular’de proteínas de interesse industrial, é necessário que ela seja abordada efetivamentecomo uma fábrica. O gerenciamento dos processos celulares deve incluir as mais impor-tantes propriedades da fábrica - suas estratégias. A fábrica celular tem a habilidade dedesempenhar diferentes estratégias, dependendo de diversos sinais, que são:

1. A capacidade de sentir e fazer entrar as matérias primas disponíveis do meioexterno.

2. A capacidade e o potencial de alterar ou adicionar funções por indução ou mo-dulação.

3. A capacidade de mudar a maquinaria celular, para que possa lidar com novas si-tuações desejadas.

4. De “gerenciar” mudanças em nível celular.

5. A capacidade de realizar as ações requeridas para sobreviver, crescer ecompetir.


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6. Produzir produtos secundários indesejáveis, para o estorvo das competidoras, ese tornar inativa sob a forma de esporos se as condições internas e externas nãoforem ótimas (GIUSEPPIN, VERRIPS e Van RIEL, 1999).

PRODUÇÃO DE ENZIMAS POR EXTREMÓFILOSMicrorganismos que vivem em condições extremas são, normalmente, uma fonte paraobtenção de bioprodutos como, por exemplo, amilases, proteases, lipases, xilanases eligninases através do uso da tecnologia do DNA recombinante. Devido a suas proprieda-des únicas, esses organismos produzem bioprodutos que podem ser empregados nascondições ambientais drásticas que freqüentemente ocorrem na prática industrial(SANTOS et alii, 2001; SÁ-PEREIRA et alii, 2003)

Os extremófilos são organismos que vivem e se reproduzem em condições ambi-entais extremas no que diz respeito a pH, temperatura (calor e frio) e salinidade. Nosúltimos 40 anos têm sido encontrados em fontes de águas quentes, em áreas vulcânicas,nos mares profundos, nas regiões ártica e antártica e seus mares, e em outros sítios geo-térmicos especiais (GERDAY et alii, 2000; SCHIRALDI, e DE ROSA, 2002). Antes dessesachados, pensava-se que esses locais eram ambientes incompatíveis com a vida(SCHIRALDI e DE ROSA, 2002).

A maior parte das enzimas hoje utilizadas é extraída de organismos mesófilos, por-tanto, suas aplicações são em geral restritas, devido à limitada estabilidade nas tempera-turas extremas (altas e baixas) e condições adversas de reação, como pH muito alteradoe presença de solventes orgânicos, dentre outras (CARRERA e COLOMBO, 2000). Asenzimas mesófilas e as extremófilas termófilas são estáveis e ativas em diferentes tempe-raturas, não havendo pressão evolutiva para que as mesófilas sejam estáveis e ativas emaltas temperaturas e as termófilas em baixas temperaturas (SÁ-PEREIRA et alii, 2004;GOMES et alii, 2007).

Os ambientes frios são os mais abundantes do globo terrestre e são colonizados pornumerosos organismos psicrófilos como bactérias, leveduras, fungos e algas unicelula-res. Gerday et alii (2000) relatam as atividades especificas de várias enzimas psicrofílicasselvagens e de algumas de suas formas recombinantes, produzidas por microrganismosdas regiões ártica e ántártica. Já foram identificadas estirpes representativas de bactériasGram-negativas (por exemplo, espécies de Pseudoalteromonas, Moraxella, Psychro-bacter, Polaromonas, Psychroflexus, Polaribacter, Moritella, Vibrio e Pseudomonas),bactérias Gram-positivas (Arthrobacter sp., Bacillus sp. e Micrococcus sp), Archaea (es-pécies de Methanogenium, Methanococcoides e Halorubrum), leveduras (Candida spe Cryptococcus sp), fungos (por exemplo, Penicillium e Cladosporium) e microalgas(Chloromonas) encontrados nestes ambientes inóspitos com características intrínsecasde adaptação ao frio extremo (FELLER e GERDAY, 2003). Estas enzimas incluem a ál-cool desidrogenase, a á-amilase, a aspartato transcarbamilase, a subtilisina, a �-lactama-se, a triose fosfato isomerase, a malato desidrogenase e a xilanase. Alguns exemplos deenzimas extraídas de organismos termófilos relatadas são a amilase, as lipases, as xilana-ses (Sá-PEREIRA et alii, 2002a,b), as Taq polimerase e as celulases (SÁ-PEREIRA, 1994).


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Estas duas últimas são marcantes exemplos de enzimas extremófilas que atingiram omercado e têm sido utilisadas em larga escala.

A maneira como as enzimas respondem à temperatura é fundamental para muitasáreas da biotecnologia. Screening e seleção de proteínas, com uma propriedade térmi-ca particular, são geralmente feitos com o objetivo de obter boa atividade ou resistênciaà desnaturação em uma dada temperatura (EISENTHAL et alii, 2006).

Um exemplo de enzima muito utilizada pela biologia molecular, que resiste a tem-peraturas acima de 90°C é a Taq DNA polimerase, também denominada Taq polime-rase ou, simplesmente, Taq (EC 2.7.7.7). Esta é uma DNA polimerase termoestável, uti-lizada na amplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR. Seu nomedeve-se a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus, uma ex-tremófila isolada, em 1965, de uma fonte hidrotérmica do Parque Nacional Yellowsto-ne, nos Estados Unidos da América. A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturasusadas em PCR, tendo uma meia-vida enzimática de 40 minutos (em 95°C). Trata-se deuma enzima importante, que revolucionou a biologia molecular e, conseqüentemente,a engenharia genética, possibilitando a amplificação de moléculas de DNA de forma es-petacular. Ela permite que muitos ciclos de replicação de DNA (que requerem altastemperaturas) possam ser realizados sem a necessidade de adição de novas moléculasda DNA polimerase após cada etapa de alta temperatura. A técnica que utiliza esta enzi-ma termo resistente chama-se reação em cadeia da polimerase (PCR- polymerase chainreaction) e foi desenvolvida por Kary Mullis, em 1983, que recebeu por isso o PrêmioNobel de Química dez anos depois. Com esta técnica pode-se conseguir a multiplicaçãoexponencial de moléculas de DNA, obtendo-se, assim, massa de material suficientepara as mais diversas finalidades, como por exemplo, o diagnóstico de doençasgenéticas e infecciosas, a identificação de material genético necessário à medicinaforense, o seqüenciamento de ácidos nucléicos e a engenharia genética, com evidenterepercussão no aprimoramento da produção de enzimas.

DIVERSIDADE MICROBIANA COMO FONTE DE NOVAS ENZIMAS

A diversidade microbiana é uma fonte importante de recursos genéticos para o avançoda biologia e biotecnologia. Nos nossos dias, conhecem-se cerca de 4.300 enzimas (se-qüenciadas), 300 destas comercializadas (FERRER, 2004). Os microrganismos apresen-tam imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manu-tenção de ecossistemas, como componentes fundamentais de cadeias alimentares eciclos biogeoquímicos (SCHIMEL, 1995; MYERS, 1996).

Estudos recentes em ecologia molecular microbiana demonstram que a extensãoda diversidade microbiana na natureza é muito maior do que previamente pensado.Estratégias tradicionais de isolamento e seleção de microrganismos têm garantido o de-senvolvimento de novos fármacos e aplicações nas áreas de saúde, agricultura, indústriae meio ambiente.


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Os metagenomasOs metagenomas são o DNA da comunidade microbiana total extraída diretamente deambientes como solos ou sedimentos. A análise dos metagenomas por tecnologia deDNA recombinante permite a exploração do potencial biotecnológico de organismosnão-cultiváveis em laboratório (RODRÍGUEZ-VALERA, 2002).

Metodologias moleculares que independem do cultivo, baseadas em extração di-reta de ácidos nucléicos de amostras ambientais, associada às técnicas de hibridizaçãocom sondas grupo-específicas ou PCR, clonagem e seqüenciamento vêm permitindo aavaliação mais precisa da diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novosgrupos de organismos, nunca antes cultivados.

Através de técnicas inovadoras como análises de 16S rDNA (MACRAE, 2000),DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e hibridação in situ por fluorescên-cia (FISH), pode ser efetuada a caracterização filogenética dos microrganismos e poste-riormente avaliado o seu potencial enzimático.

Apesar de estas metodologias não permitirem acesso ao potencial metabólico des-tes novos organismos individualmente, uma vez que as etapas de isolamento e cultivosão suprimidas dos estudos, o potencial enzimático dos consórcios microbianosestudados é quase inesgotável.

Uma estratégia alternativa para o conhecimento do potencial de cada microrganis-mo que constitui o metagenoma é a clonagem de fragmentos grandes de DNA (>100 kb)a partir de amostras ambientais no vetor BAC (bacterial artificial chromosome) (figura2.3). Estes vetores têm a capacidade de albergar fragmentos de DNA exógeno de grandedimensão em hospedeiros como Escherichia coli, e têm sido usados em bibliotecas genô-micas de eucariotos. O método consiste na clonagem de fragmentos grandes de DNA,originados de DNA do metagenoma, e análise das bibliotecas resultantes em busca deuma nova expressão fenotípica na linhagem hospedeira de E. coli. No caso de se usar a es-tratégia BAC para genomas bacterianos, existe a vantagem de que alguma expressão gêni-ca ocorrerá nos clones BAC, pois o DNA inserido é procariótico. Este processo usando osistema BAC abre perspectivas para a descoberta de novos produtos naturais pela expres-são por genes localizados em operons ou vias biossintéticas complexas.

Projetos multidisciplinares que contemplem o desenvolvimento de novas formasde cultura de microrganismos, a descoberta de novas enzimas a partir de todos os geno-mas de organismos (metagenoma) e a melhoria da sua performance através de técnicasde evolução dirigida serão projetos ambiciosos e de grande interesse científico e social.

AS “ÔMICAS”, TRANSCRIPTÔMICA, PROTEÔMICA EMETABOLÔMICA NA IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS ENZIMASEtimologicamente, a terminação “ômica” (do inglês omics) significa “estudo global”.Assim, a genômica- é de todos os genes, a proteômica é de todas as proteinas, a trans-criptômica é de todos os transcriptos e a metabolômica é do perfil metabólico de umadada célula, tecido, fluido, órgão ou organismo em um dado instante.


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Esta nova etapa da revolução biológica, denominada de era pós-genômica, está as-sociada aos avanços tecnológicos dos últimos anos, que foram possibilitados pelo desen-volvimento da genômica, da transcriptômica, da proteômica e da metabolômica. As pla-taformas tecnológicas conhecidas como “ômicas” são ferramentas moleculares que per-mitem examinar cada estágio do fluxo de informação biológica, de DNA a RNA e, deste,a proteínas e até à função biológica. Com tais instrumentos, pode-se avaliar a expressãode milhares de genes/proteínas em uma única hibridação, o que é muito útil no estudodos mecanismos moleculares das diversas doenças. Alguns investigadores utilizaramtambém a tecnologia array (DNA chip) para determinar as alterações na expressão degenes (SCHULZE e DOWNWARD, 2001).

A técnica de DNA microarray reduziu muito o tempo de análise do transcriptomade uma amostra de DNA e é imprescindível na análise metabolômica. Desta formapode-se ter acesso a novos genes codificadores de enzimas que poderão revolucionar asindústrias às quais estão destinadas. Esta técnica é extremamente útil quando o investi-gador quer analisar um grande número de genes rapidamente, ou quando a amostra aser estudada é muito pequena. Podemos analisar a expressão gênica dentro de uma úni-ca amostra ou comparar a expressão gênica de dois tipos de células ou de dois tecidos di-ferentes. Os microarrays de DNA são pequenos suportes sólidos nos quais milhares deseqüências codificadoras de genes estão imobilizadas ou ligadas de forma organizadaem posições conhecidas. O suporte sólido é normalmente uma lâmina de vidro especialde microscopia, mas também pode ser um a pastilha de silício. O DNA é impresso,depositado ou sintetizado diretamente no suporte. As amostras podem ser DNA, cDNAou oligonucleotideos.

Genômica funcional e bioinformáticaPor biologia computacional ou bioinformática entende-se o uso de técnicas e ferramen-tas da ciência da computação aplicadas aos problemas da biologia, com maior expressãopara as áreas de biologia molecular e genética (THEODORIDIS e KOUTROUMBAS,1999). Novas abordagens de trabalho envolvendo metodologias de bioinformática e bio-logia molecular permitem a prospecção, por computador, de informações, a partir de ba-ses de dados genômicos, e a análise de microrganismos sem a necessidade de isolamentoe cultura, a partir da clonagem direta de DNA de amostras ambientais. Com isso, são pos-síveis a caracterização e descoberta de novos genes, enzimas, moléculas bioativas e fárma-cos associados à rica diversidade de organismos ainda não-cultiváveis e o desenvolvimentode novas estratégias de seleção e triagem de novos produtos, alvos e ensaios a partir do co-nhecimento da genômica e da expressão gênica de organismos diversos.

O estudo de genomas estruturais, através de programas de bioinformática que com-param as seqüências determinadas com as depositadas nas bases de dados disponiveis,como EMBL (COCHRANE et alii, 2006), GenBank (BENSON et alii, 2006) e DNA Data-bank of Japan (OKUBO et alii, 2006), e que são depois processadas, como o GenScan,identificam novos genes com base na presença de seqüências como: TATAA box; codonsde início; codons de terminação; seqüências sinalizadoras de separação (splicing) entre


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exons e introns. Entretanto, a presença de uma região codificadora não implica necessa-riamente em que essa seqüência será transcrita e traduzida na forma de uma proteína,com função bioquímica e biológica. A obtenção e anotação do genoma estrutural de umaespécie geram um mapa físico de toda a seqüência de DNA do genoma. Mapas físicos, emconjunto com mapas de ligação (gerados pelo uso de RFLP, microsatélites, AFLP, etc)são ferramentas cada vez mais úteis em programas de melhoramento genético assistidopor marcadores moleculares.

A estruturação de bancos de Expressed Sequence Tags (EST) (ISELI et alii, 1999)é extremamente útil para a identificação da função bioquímica e biológica de muitosgenes. As EST são seqüências curtas de fragmentos de mRNA. A obtenção dos EST é ummétodo relativamente simples e rápido, visto que o seqüenciamento total do mRNA éum trabalho muito complexo, ao passo que a obtenção de fragmentos curtos é bemmais fácil. A informação genética contida nestes fragmentos é suficiente para a deduçãoda proteína que eles codificam. Após a obtenção dos fragmentos, as seqüências são in-troduzidas na base de dados de EST, que os investigadores podem utilizar para obter amensagem completa sobre mRNAs de interesse e, através da genômica funcional, po-dem produzir a enzima codificada. Assim, genes expressos que codificam proteínascom funções enzimáticas podem ser identificados com o uso destas novas ferramentasda bioinformática.

EVOLUÇÃO DAS ENZIMAS IN VITRO

A expansão contínua do uso de enzimas nas indústrias químicas, têxteis, farmacêuticase de alimentos, cria a necessidade da produção de enzimas com alta estabilidade opera-cional, alta especificidade e enantiosseletividade, além de novas atividades sobre subs-tratos naturais e sintéticos (COHEN et alii, 2001). A engenharia enzimática prometeuma expansão extraordinária da produção e utilização de enzimas modificadas. Duasestratégias têm sido utilizadas: a evolução direcionada e o redesenho racional (rationalredesign) (CHEN, 2001).

A evolução direcionada de enzimas surgiu há alguns anos como uma abordagemmuito eficaz para a adaptação de biocatalisadores para aplicações médicas e industriais.A evolução direcionada mimetiza o darwinismo in vitro, combinando mutação e recom-binação com o screening ou seleção de variantes da enzima com as propriedades deseja-das (SCHMIDT-DANNERT e ARNOLD, 1999). Esta estratégia possui vantagens sobre ouso de luz ultravioleta ou de substâncias mutagênicas, porque na evolução direcionadaa seqüência de nucleotídeos sujeita à mutação ao acaso se restringe ao gene que codifi-ca a proteína de interesse ou até mesmo a partes deste gene. Já na mutagênese por ultra-violeta e agentes químicos todo o genoma da célula é alvo de mutação. A fase crítica daevolução direcionada é achar as variantes de efetivo interesse. Um exemplo marcante éa subtilisina, da qual embora formas variantes tinham sido produzidas e secretadas comalto rendimento, nenhuma delas tinha atividade aumentada nos processos utilizadosnas lavanderias (SCHMIDT-DANNERT e ARNOLD, 1999).


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No redesenho racional, empregam-se mutações sítio-dirigidas com o intuito detrocar com precisão certos aminoácidos da enzima. A nova seqüência é concebida combase em conhecimentos detalhados da estrutura protéica, sua função e mecanismo deação (CHEN, 1999). O poder do redesenho racional foi evidenciado pela produção deuma superóxido dismutase redesenhada, muito mais ativa que as já conhecidas(GETZOFF, 1992).

Os estudos de mutações que melhoram as propriedades enzimáticas revelaramque em muitas enzimas, mas não em todas, as mutações próximas do centro ativo po-dem aumentar drasticamente o sucesso de muitos experimentos que envolvem evolu-ção direcionada (MORLEY et alii, 2006). Estes autores afirmam que, para a estabilidadetérmica e atividade catalítica, tanto as mutações próximas do centro catalítico como asdistantes parecem ser efetivas no melhoramento da enzima. Já no caso da enantioseleti-vidade, da seletividade quanto ao substrato e da atividade catalítica alternativa,mutações próximas ao centro ativo parecem mais efetivas do que as distantes.

Não se pode deixar de mencionar que avanços recentes no campo da ciência dacomputação propiciaram a elaboração de novos métodos, sofisticados e refinados, ca-pazes de descrever a maquinaria dos biocatalisadores com detalhes; embora a previsãopor computadores da quantidade de atividade enzimática ainda seja uma formidávelmeta a ser atingida. A identificação de motivos estruturais, no substrato e nas enzimas,específicos para o reconhecimento enzima/substrato não é nada trivial, porém, cadavez mais, técnicas de modelagem molecular são usadas como ferramentas rotineiraspara a descrição da interação enzima/substrato. Uma excelente revisão dos métodoscomputacionais usados para a orientação de estratégias experimentais em biocatálise,foi recentemente publicada por Braiuca et alii (2006).

Escolher a abordagem mais adequada para melhorar uma enzima depende dequanto se sabe de seu mecanismo e dos esquemas de seleção disponíveis. Com o au-mento do número de estruturas tridimensionais depositadas nos banco de dados e como desenvolvimento de ferramentas poderosas para a modelagem de proteínas, o redese-nho racional tornar-se-á mais eficiente e largamente aplicado. Por outro lado, a evolu-ção direcionada poderá ser aplicada cada vez mais a enzimas de interesse industrialquando houver processos de screening ou seleção eficazes das variantes de interesse.Muito provavelmente, a associação das duas estratégias será uma rota de maior sucessopara melhorar as propriedades e função de uma enzima, ou até mesmo criar uma novafunção enzimática. Vale ressaltar que a habilidade de alterar o metabolismo manten-do-se o equilíbrio celular em termos de metabólitos será a chave da aplicação dealterações em vias metabólicas de um grande número de organismos produtores deenzimas de interesse industrial (CHATTERJEE e YUAN, 2006).

PERSPECTIVASEncontrar uma nova enzima significa encontrar uma nova função microbiana, portan-to deve-se examinar o maior número possível de microrganismos, através de um poten-te sistema de screening. Estima-se que 100 milhões de microrganismos estão presentes


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em 1g de solo e que, portanto, há muitas enzimas ainda a serem descobertas. Além dodesafio da descoberta de uma nova enzima, há também o desafio de torná-la economi-camente viável para o consumo e, também, de modificá-la. Os avanços na área da biolo-gia molecular são contribuições importantes para a produção de microrganismos gene-ticamente modificados que superexpressam certas enzimas e para a produção de enzi-mas recombinantes extremófilas, capazes de atuar em processos nos quais as enzimasmesófilas geralmente perdem a atividade. A biologia molecular também tem contribuí-do para a evolução das enzimas in vitro visando o aumento da atividade e da estabilida-de, ou mesmo a aquisição de nova função. A combinação da pesquisa computacional eexperimental em biocatálise oferece a possibilidade de aumentar grandemente o nívelde conhecimento dos sistemas biocatalíticos e de reduzir os esforços experimentais e,conseqüentemente, seus custos. A coleta de informações celulares globais a partir dedados em nível da transcriptômica, proteômica, metabolômica e fluxômica é tarefapara a biotecnologia de sistemas, que ainda está em seus estágios iniciais, mas queaponta para o fato de que, com base em tais informações globais, um dia será possíveldesenhar células com propriedades metabólicas melhores para aplicações industriais.

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enzimas cap 02

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