entwicklungs- und lichtabhängige akkumulation von c-glycosylflavonen im haferkeimling (avena sativa...

Botanisches Institut der Universitat K6ln

Entwicklungs- und lichtabhangige Akkumulation von C-Glycosylflavonen im Haferkeimling (Avena sativa L.)

Influence of Development and Light on the Accumulation of C-Glycosylflavones in Oat Seedlings (Avena sativa L.)

GOTTFRIED WEISSENBOCK und BERNHARD EFFERTZ

Mit 10 Abbildungen

Eingegangen am 11. Juni 1974

Summary

In the growing shoot of oat seedlings (Avena sativa, «Gelbhafer,,) generally four Cglycosylflavones are synthesized. They probably are closely related biochemically and accumulate to 97-99 % in the primary leaf (fig. 4). The chemically simplest flavone isovitexin (F5 = saponaretin) is a minor component, whereas isovitexin-O-arabinoside (F2),

vitexin-O-glucoside (Fa) and 7-0-methoxy(?)-vitexin-O-rhamnoglucoside (F1) accumulate as main substances (fig. 5). This «basic" flavone pattern is found in all developmental stages, independent of light. In light-grown shoots additional minor flavones, the «chloroplast flavones" (Fs-Fg), and water soluble esters of p-coumaric-, ferulic- and p-hydroxybenzoic acid can be detected. Roots contain only traces of flavones, but instead three water soluble main compounds of unknown nature, having blue fluorescence. In addition, insoluble, hydrolyzable esters of p-coumaric- and ferulic acid are found.

During the 3rd and 4th day of shoot growth (stage 0-1, fig. 1) flavone synthesis starts light-independent. In the beginning of the greening of the primary leaf (stage 1-2) there is an eruptive increase in the content of the main flavones (Fl_3)' with isovitexin (F5) showing a lag phase (fig. 3, 5). The total amount of the leaf flavones at this stage, until 6th day (stage 3), is 3-4 times higher than the chlorophyll (a+b) content. Afterwards chlorophyll content increases further, absolutely as well as relatively, whereas glycoflavone accumulation comes to a stationary phase earlier (stage 4-5) than chlorophyll. Nevertheless, 10 day old differentiated primary leaves contain 1,4 times more flavone than chlorophyll.

In the dark the growth of the primary leaf is retarded as is the rate of glycosylflavone synthesis (fig. 2, 3, 5). Single flavone compounds accumulate up to the 9th-10th day at different rates. The relatively more derivatized methoxy-trioside (FI) accumulates to a greater extent than do the biosides (F2, F3)' and reaches 80 % as compared to levels in green leaves. In contrast, the monoside (Fs) accumulates at the lowest rate and shows together with F3 the strongest light dependency.

Illumination for 26-34 hours of 4, 5 and 6 day old dark grown seedlings (stage 2-4) induces different levels of total flavones in the primary leaves (fig. 7, 8, 10). When 4 day old etiolated leaves are exposed to light for one day, they produce within this day flavones and chlorophylls to an extent, which amounts to about 70-80 % and 100 %, respectively, of the levels found in leaves from plants grown for 5 days in the light. In older leaves this recon-

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C-Glycosylflavone im Haferkeimling 299

stitution is not observed any more. The light-induced accumulation of individual glycosylflavones is different, the compounds Fa and Fs are the most inducible, F j the least (see above). In 4 day old etiolated leaves flavone synthesis begins 2 h after illumination and before chlorophyll synthesis (tab. 1). In 5 and 6 day old leaves greening begins first. Later on, in all cases a higher amount of flavones than chlorophylls is produced and this ratio remains constant during the period of illumination and is largely independent of the age of the leaf as well as of the duration of etiolation.

The above described correlation between flavone accumulation and differentiation of primary leaves and plastids, together with the observation that single flavone compounds, such as isovitexin, were found to be enriched in plastids (WEISSENBOCK et al., 1972; WEISSENBOCK, 1973; WEISSENBOCK and SCHNEIDER, 1974), whereas etioplasts and chloroplasts possess their own specific flavone pattern, point to an important role of plastids in the C-glycosylflavone metabolism in the primary leaves of Avena sativa. For illustration and discussion this hypothesis is put into a working scheme.

Einleitung

Die Biogenese sekundarer Phenyl propane, der Zimtsaurederivate und verschiedenen Flavonoidklassen, ist aufgrund von Experimenten mit radioaktiven Vorstufen, enzymatischen Untersuchungen und genetischen Daten bereits gut bekannt (vgl. z. B. GRISEBACH, 1968; GRISEBACH und BARZ, 1969; GEISSMANN, 1967; HAHLBROCK et al., 1971 a, b, c; KREUZALER und HAHLBROCK, 1972; CAMM und TOWERS, 1973 a; GROSS et al., 1973; HESS, 1968). Flir die Bedingungen aber, unter denen die Biosynthese in vivo ablauft, die die Regulation und den Bildungsort innerhalb der Pflanzenzelle betreffen, liegen bis heute nur vereinzelt Hinweise vor (SA TO, 1966; SATO et al., 1968; ZAPROMETOV und BUKHLAEVA, 1967; STAFFORD und Buss, 1973; KINDL, 1971 a, b, c; KINDL und Rms, 1971 a, b; Rms und KINDL, 1970, 1971; AMRHEIN und ZENK, 1971; RUSSELL, 1971; AUBERT et al., 1972 a, b; ZUCKER, 1972; CAMM und TOWERS, 1973 b; BUCHE und SANDERMANN, 1973; u. a.).

Wahrend intensiver Wachstums- und Differenzierungsprozesse pflanzlicher Organe, bei der Samenkeimung, Keimlingsentwicklung und Blattentwicklung, finden erhebliche Veranderungen im Zimtsaure- und Flavonoidgehalt statt, die sich aus Synthesen und zum Teil aus Abbau- und Umbauvorgangen einzelner Komponenten rekrutieren (STAFFORD, 1969; WEISSENBOCK, 1970; WEISSENBOCK und REZNIK, 1970; AMRHEIN und ZENK, 1970 b; BARZ und HOSEL, 1971; HOSEL, 1972; STRACK, 1973; STAUDE und REZNIK, 1973 u. a.). In derartigen Experimenten hat sich meist gezeigt, daB die Flavonoidsynthese und ihre Forderung durch Licht in relativ frlihen Entwicklungsstadien besonders intensiv ist. Flir die Aufklarung des Biosyntheseablaufs in situ und moglicher physiologischer Funktionen von flavonoiden Verbindungen (z. B. GALSTON, 1969; STENLID, 1970; HELLER und KAUSCH, 1971; OETTMEIER und HEUPEL, 1972; TREBST, 1970; SCHNEIDER, 1974; WEISSENBOCK und SCHNEIDER,

1974), erscheint es daher besonders wichtig, den morphologischen Differenzierungen - vor all em im intrazellularen Bereich - Beachtung zu schenken. Denn es ware denkbar, daB Strukturveranderungen und Flavonoidsynthese nicht nur zeitlich kor-

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reliert sind, sondern auch ursachlich zusammenhangen. Erste Anhaltspunkte liegen vor, die derartige Vermutungen stutzen (vgl. KINDL, 1971 a, KANNANGARA et a!., 1971 a; STAFFORD, 1969; CAMM und TOWERS, 1973 b). Es wurden vor all em Hinweise erhalten, die eine Beteiligung der Plastiden an der Flavonoidbiosynthese wahrscheinlich machen (SATO, 1966; SATO et a!., 1968; ZAPROMETOV u. Mitarb., 1967; BARTLETT et a!., 1972; KINDL, 1971 b; KANNANGARA et a!., 1971 a, b; WEISSENBOCK, 1972 a; SAUNDERS und MCCLURE, 1972; LOFFELHART et a!., 1973). Flavonoidvorkommen in isolierten Chloroplasten verschiedener Pflanzenarten sind nachgewiesen (vgl. Diskussion: WEISSENBOCK, 1973; SAUNDERS und MCCLURE, 1972; MONTlEs, 1969,1971; STRACK, 1973).

Aus Primarblattern von Avena sativa isolierte Etioplasten und Chloroplasten enthalten nicht nur die im Blatt vorkommenden Flavonoide, es liegen vielmehr bestimmte Komponenten in den Plastiden angereichert vor (WEISSENBOCK et a!., 1972; WEISSENBOCK, 1973; WEISSENBOCK und SCHNEIDER, 1974). Chloroplasten weisen einen hoheren Flavonoidgehalt und mehr an Einzelkomponenten auf als die Etioplasten. Haferkeimlinge erscheinen somit fur Analysen der entwicklungs- und lichtabhangigen Flavonoidsynthese und einer Beteiligung der Plastiden daran als besonders geeignet.

Mit den vorliegenden Untersuchungen soli eine Reihe physiologischer und biochemischer Experimente zu diesem Thema begonnen werden. Ziel dieser Arbeit ist es, die Dynamik des Flavonoidstoffwechsels (C-Glycosylflavone), vor allem im Primarblatt und in der Coleoptile von Licht- und Dunkelkeimlingen (Avena sativa, «Gelbhafer») zu untersuchen und den Zusammenhang zwischen morphologisch wohldefinierten Entwicklungsstadien, der Chlorophyllsynthese (Plastidendifferenzierung) und der Flavonakkumulation, sowie -musterbildung aufzuzeigen. Hierzu erfolgt die Anzucht im normalen Licht-Dunkel-Rhythmus und zum Vergleich im Dunkeln (Abschnitt 1).

Eine weitere Serie von Untersuchungen soli dem Studium der Lichtinduzierbarkeit cler Keimlingsflavone clienen. Dabei steht die Frage nach zeitlichen Zusammenhangen zwischen der lichtinduzierten Flavon- und Chlorophyllsynthese wahrend der photomorphogenetischen Umwandlung der Etioplasten im Vordergrund (Abschnitt2).

Material und Methoden

1. Anzucht deT Keimlinge

Avena sativa L. (Sorte «Gelbhafer-FHimingskrone», Ernte 1972, bezogen von Fa. Oberthiir, Kaln) wurde in einer Kulturkammer unter standardisierten Bedingungen herangezogen. Die Aussaat der Karyopsen erfolgte auf wassergesattigter Einheitserde (Pikiererde P, Fa. Keller, Kaln) in 60 X 40 em Kulturschalen aus Kunststoff, 150 g Saatgut pro Schale. Die GefaBe wurden 70 h mit Glasplatten abgedeckt und am 2., 4., 6. und 8. Tag bis zur Wassersattigung des Bodens gegossen. Damit wurde ein gleichmaBiges Ankeimen und Keimlingswachstum mit guter Reproduzierbarkeit der Ergebnisse (vgl. Abschn. 1 mit 2, sowie WEISSENBOCK, 1974) erzielt. Die Anzucht erfolgte im Dauerdunkel oder im Licht (13 h-Tag, Ab-

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schn. 1) unter den Bedingungen: Temperatur 21 ± 1 ° C, reI. Luftfeuchte > 90010 bis 70 h, anschlie~end 70 ± 5010; Leuchtstoffrohren OSRAM L, 65 W/15 «Tageslicht», mittl. Beleuchtungsstarke in Hohe der Kulturschalen 7500 Lux. Bei den Lichtinduktionsversuchen (Abschn. 2) wurden etiolierte Keimlinge bestimmter Entwicklungsstadien unter denselben Bedingungen 26-34 h lang belichtet.

Flir die Analysen wurden die oberirdischen Pflanzenteile") definierter Entwicklungsstadien (Stadium 1-8, St. 1 = 73 h, St. 2 = 97 h, usw. nach der Aussaat; s. Abb. 1, 2) knapp liber der Karyopse abgeschnitten und verwendet. Das Folgeblatt wurde verworfen. Einige qualitative Untersuchungen wurden an entsprechenden, gut mit Wasser gewaschenen Wurzeln durchgeflihrt. Die Ernte erfolgte 1 h vor Ende der 13 h-Lichtphase. Die Dunkelproben wurden im Sicherheitslicht (Interferenzfilter 510 nm, Schott & Gen) geerntet.

2. Flavonoid-Extraktion und quantitative Messungen

Das Pflanzenmaterial (St. 1, n = 100 Sprosse"); St. 2, n = 50; St. 3-8, n = 30; sowie 30-50 Einzelorgane je Stadium) liberbrlihte man mit 20 ml H 20 bidest. (100° C), und homogenisierte in der Reibschale mit etwas Quarzsand p. a. Das Homogenat, 30 ~l, wurde kur~ erhitzt (s. WEISSENBOCK et aI., 1972) und bei 4° 12 h lang aufbewahrt. Das weltere Extraknonsverfahren erfolgte wie beschrieben, ohne Reinigung liber Polyamidsaulen (WEISSENBOCK et aI., 1972). Von der methanol. Losung (3 ml je Probe) wurden 0,3-0,5 ml auf vorgereinigte DCPlatten (Cellulose MN «Aviceh>, flir DC, Lauf in CEW) bandfOrmig aufgetragen und die Flavone in 5 010 wa~r. Eisessig (LM I = 5010 E) oder im Gemisch Chloroform/Eisessig/Wasser (CEW 3 : 2, wassergesatt., v/v, = LM II) aufgetrennt. LM I trennt in Zone a) Flavongemisch F1 +F2 +Fa und b) Flavon F5 (vgl. WEISSENBOCK und SCHNEIDER, 1974), LM II trennt Fj) F2 ,

Fa; die Nebenkomponente F5 liegt dabei zwischen FI, F2. Zur qualitativen Flavonoidmusteranalyse (Abschn. 1 c) wurden beide LM 2-dimensional kombiniert.

Die Bestimmung des Gesamtflavongehalts (Abb. 3) erfolgte nach 2 Verfahren, deren Ergebnisse sich nur geringfligig unterscheiden (Abweichung bis 4010): 1. DC-Trennung in LM I, Messung der Mischbande a), s. Abb. 3 a Licht, Symbol = -0-. 2. in LM II, Messung der Einzelkomponenten FI, F2, Fa und nachfolgende rechnerische Summation, s. Abb. 3 a Licht, Symbol = -0-. Auf die Messung der Nebenkomponenten wurde dabei verzichtet, da die F5-Menge im Durchschnitt nur bei 2010 (Licht) und 3010 (Dunkel) des Gesamtflavons liegt (vgl. Abb. 5) und FS_ 9 < 2010 ist (Abschn. 1 c).

Die Flavone wurden mit 90 010 wa~r. Methanol eluiert, und in einem Losungsvolumen von 1,5-5 ml (in 100010 MeOH) gegen Losungsmittel am Spektralphotometer PMQ II, Zeiss, vermessen:

Die verwendete Chelatisierung der Flavone mit AlCla-Reagenz und bathochrome Verschiebung des Absorptionsmaximums erlaubt eine optische Blindwertkorrektur. Die AlChelat-Maxima liegen bei 388 nm (Flavon FI), 380 nm (F2 und Fa), 385 nm (Flavongemisch FI + F2 + Fa), 379 nm (Fs), vgl. WEISSENBOCK et al. (1972).

1. Messung: ohne Reagenz bei Al-}. max. = Blindwert (Extinktion E1), 2. Messung: nach Zugabe von 3 Tropfen 5010 methanol. AlCla-Losung (AlCla, wasserfrei, Merck) pro 1,5 ml in die Me~- und Vergleichsklivette (d = 1 em), Reaktionszeit 3-4 min = Me~wert (Extinktion E2).

E2-EI = EAl (Extinktion des Flavon-Al-Chelats, vgl. WEISSENBOCK et aI., 1972, WEISSENBOCK, 1973, WEISSENBOCK und SCHNEIDER, 1974).

Die nach dieser Methode ermittelten Extinktions-Koeffizienten flir die kauflichen Flavone

") Primarblatt und Coleoptile (zusatzlich Mesocotyl im Dunkeln und bei Lichtinduktion) wurden gemeinsam verwendet, in der Arbeit durchgehend als <Sprofi> bezeichnet, oder nach Primarblatt und Coleoptile (+ Mesocotyl) getrennt aufgearbeitet.

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Apigenin-glucosid und Apigenin-apioglucosid (= Apiin), Fa. Roth, zeigen nur emen Unterschied von etwa 5 %:

CMonosid = 1,45 . 104 M-I cm2

cBiosid = 1,52' 104 M-I cm2 gemessen beim AI-Chelat-Maximum =

380 nm fur beide Glykoside.

Zur quantitativen Bestimmung der chern. ahnlichen Avena-Flavone, Apigenin-C-monosid (F5)' -biosid (F2,3), -triosid (F1) wurde ein C = 1,52· 104 zugrunde gelegt und die gemessenen Extinktionswerte EAl in Mol bzw. Mikrogramm Flavon - als Apiin-Xquivalent - angegeben.

Die in fruheren Arbeiten mit Avena sativa ebenfalls als EAl gemessenen Extinktionen wurden in ,ug Flavon, als Kampferol-Xquivalent angegeben (WEISSENBOCK et aI., 1972; WEISSENBOCK, 1973; WEISSENBOCK und SCHNEIDER, 1974). Zur Umrechnung in fig ApiinXquivalent sind diese Werte mit dem konstanten Faktor 2,94 zu multiplizieren.

Fur die Chlorophyllbestimmungen (a+b), vgI. WEISSENBOCK und SCHNEIDER (1974), wurden 30-50 Sprosse oder Primarblatter und 50-100 Coleoptilen je Entwicklungsstadium verwendet.

3. Zimtsaureanalysen

Die Wasserextrakte von SproB und Wurzel 4-8 Tage alter Lichtkeimlinge (1-3 g Frischgewicht/30 ml H 20) wurden am Rotavapor bei 45 0 C (+ BuOH) bis zur Trockne eingeengt, mit einigen Tropfen gesattigter, waBr. NaBH4-Lasung versetzt (SCHRODER, 1967) und nach Zugabe von 2 ml 1 N NaOH (N2-gesattigt) 3 min bei 1000 C hydrolysiert (MANSELL und KEMERER, 1970). Die bereits wasserextrahierten Wurzelgewebe wurden der gleichen Hydrolyseprozedur unterworfen. (HIGUSHI et aI., 1967). Nach dem Abkuhlen wurde mit konz. HCI auf pH 2 angesauert und die Lasung mit Diathylather ausgeschuttelt. Die konzentrierte Xtherphase chromatographierte man vergleichend mit authentischen Zimtsauren: Misch- und Cochromatographie mit Zimtsaure (Merck), p-Cumarsaure, Kaffeesaure, Ferulasaure, Sinapinsaure (Roth), zusatzlich Benzoesaure, p-Hydroxy-Benzoesaure, Protocatechusaure; FlieBmittel ToluollEisessig/Wasser (TEW 2 : 1, wassergesatt.), CEW, 10 Ufo E ,auf Cellulose DC (s.o.); BenzollEisessig (BzE 8,5 : 1,5) auf Kieselgel G-DC (Merck), 1- und 2-dimensional (TEW/E), (v/v).

Die Analyse der erhaltenen Substanzspots erfolgte im Tageslicht und unter UV (254, 350 nm) mit und ohne Nachweisreagenzien: NH3, AICI3-spray, Benedict's Reagenz (REZNIK und EGGER, 1961), Pb-Acetat (ges. methanol. Lasung, BIRKOFER et aI., 1960) und diazotierte Sulfanilsaure (NIEMANN, 1969). Aus dem SproB-Hydrolysat wurde p-Hydroxybenzoesaure, aus dem Wurzelruckstand-Hydrolysat Ferulasaure praparativ isoliert und chromatographisch rein (3-4 FlieBmittel, s. 0.) erhalten. Die UV-Spektralanalyse (Gerat: Bausch & Lomb, «Spectronic 505», Spektrum in Methanol und nach Zugabe spezif. Reagenzien, s. BOHM, 1968; MABRY et aI., 1970) bestatigte die chromatographischen Analysendaten.

Ergebnisse

1. Keimlingsentwicklung und Flavonoidkinetik im Licht-Dunkelrhythmus und bei Dunkelheit

a) Charakteristik der Keimlingsentwicklung

Am 3. Tag nach der Aussaat tritt lichtunabhangig die Plumula aus der Karyopse hervor (Entwicklungsstadium 0, Abb. 1). Erfolgt die Keimung im Licht, so durchbricht zwischen dem 4. und 5. Tag (Stadium 1-2) das Primarblatt die Coleoptile

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und beginnt sich zu entfalten. Die Coleoptile stellt anschlieBend bei einer Lange von 12-17 mm ihr Wachstum ein, das Frischgewicht bleibt bei 10-12 mg konstant (Stadium 3-8). Innerhalb des 10tagigen Versuchszeitraums verlauft das Langenwachstum des Primarblatts bis zum 8. Tag (Stadium 5) mit nahezu linearem Anstieg und dann bis zum 11. Tag geringfiigig abgeschwacht (Abb. 2 a). Die Zunahme des Frischgewichts nimmt in dieser Zeit einen starker sigmoiden Verlauf. Das 2. Blatt erscheint zwischen dem 6.-7. Tag der Anzucht im Licht (2 mg Frischgewicht), um den 10. Tag im Etiolement, und wachst bis zum 11. Tag auf eine Lange von etwa 70 mm (12 mg FG) heran. Es wurde bei den Analysen nicht weiter beriicksichtigt.

em

11

10

9

8 7

6

5

2

em

15

14 13 12

11

10

9

8

7

6 5

4 3 2

Licht

IF 0 f,), 3

4

Dunkel

Primiirblatt

Coleoptiie

Karyopse

5 Stadium

Primarblatt

Coleoptlle

Mesocoty\

Karyopse

o 2 3 4 5/6 Stadium --2--3--4--5--6--7/8 Tage

49 73 97 121 145 hr

Abb. 1: SproBmorphologie wahrend der Keimlingsentwicklung (Avena sativa) im Licht und im Dunkeln. Standardanzucht, vgl. Methoden, Pkt. 1.

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a LICht Dunkel

20 FG~~ L .. -0--- --+ ..

15

10

2 3 4 5 6

Licht --0-

Dunkel --

8 Stadium

b

5 6 7 8

Abb. 2: a) Langen- und Frischgewichtszunahme wachsender Avena-Sprosse (= KI; Primarblatt, Coleoptile, + Mesocotyl im Dunkeln) bei Licht- und Dunkelanzucht. Mittelwerte aus 4 Einzelexperimenten, N = 4, Keimlingszahl je Stadium, n = 100-30 (s. Methoden). b) Frischgewichtszunahme der Primarblatter.

Aus den Abb. 1 und 2 wird deutlich, dag betrachtliche Unterschiede zwischen Licht- und Dunkelwachstum bestehen. Sowohl das Sprogwachstum, wie auch die Frischgewichtszunahme etiolierter Keimlinge sind im Vergleich zu belichteten, besonders ab Stadium 3, stark gesteigert. Auch wachst die Coleoptile, die erst im Entwicklungsstadium 4-5 yom Primarblatt durchbrochen wird (Abb. 1), im Gegensatz zur Lichtanzucht bis zu einer Lange von etwa 110-120 mm heran. Dagegen ist die Entwicklung des Primarblattes, bezogen auf Lange und Frischgewicht (Abb. 1,2 b), im Etiolement deutlich verzogert. Weitere morphologische Unterschiede sind aufrechter, phototroper Wuchs der Lichtkeimlinge und unregelmagig gekrlimmter, zum Teil kriechender Wuchs der Dunkelkeimlinge. Augerdem wird im Etiolement zwischen Karyopse und Coleoptile/Primarblatt ein etwa 2-3 cm langer Sprogabschnitt, das Mesocotyl, ausgebildet.

b) Chlorophyllgehalt der Lichtkeimlinge

Abb. 3 a zeigt u. a. den Verlauf der Chlorophyllsynthese (a + b) im Lichtsprog (Primarblatt und Coleoptile). Die sigmoide Kurve ergibt sich 1. aus der langsam anlaufenden Chlorophyllproduktion in den wenigen und z. T. noch in Differenzierung begriffenen Chloroplasten (photomorphogenetische Umwandlung der Plastiden zu Chloroplasten) zwischen Stadium 0-1-2, 2. aus der Phase exponentieller Chlorophyllsynthese (bes. Chloroplastenvermehrung) wahrend der Zellteilung und -strekkung von Stadium 2-6/7 und 3. aus der Sattigung des Keimlings mit photosynthetisch aktiven Pigmenten. Diese Daten beziehen sich in erster Linie auf das Primarblatt, da der Chlorophyllgehalt der Coleoptile relativ gering ist und das Folgeblatt nicht berlicksichtigt wurde. Die maximale Chlorophyllmenge der Coleoptile ist bereits im Stadium 2-3 mit etwa 2 flg erreicht und bleibt liber den Versuchszeitraum

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konstant. Der Chlorophyllanteil der Coleoptile betragt im Stadium 2 10-12010, im Stadium 3 nur noch 5-6 010 und ab Stadium 4 3 bis weniger als 2 010.

c) Flavonoidmuster der Licht- und Dunkelkeimlinge

Aus frUheren Untersuchungen war bekannt, daB 8-10 Tage alte Primarblatter etiolierter und grUner Haferkeimlinge die gleichen Flavonoid-Hauptkomponenten enthalten (WEISSENBOCK, 1973). FUr die Analyse der quantitativen Veranderung einzelner Flavonoide wahrend der Keimlingsentwicklung ist es jedoch wichtig zu wissen, ob in jiingeren Entwicklungsstadien diesel ben Komponenten auftreten oder eventuell Unterschiede im Flavonoidmuster vorliegen (vgl. WEISSENBOCK, 1970). Mittels vergleichender 1- und 2-dimensionaler Chromatographie (Methoden), vgl. WEISSENBOCK (1973), wurde gezeigt, daB sowohl im Dunkeln als auch bei Belichtung die gleichen 3 Hauptkomponenten, die Glykoflavone F!, F2 , Fa und die Neben

komponente F5 in jungen und alteren Keimlingen (Primarblatt und Coleoptile, bzw. Mesocotyl) enthalten sind. Eine getrennte Analyse von Primarblatt und Coleoptile erbrachte dassel be Ergebnis, beide Organe weisen allerdings sehr unterschiedliche Flavonoidmengen auf (Abb. 4).

FI = Apigenin-7-methoxy(?)-8-C-rhamnosylglucor.ylgly(u)cosid Fe = Apigenin-6-C-arabinosylglucosid F3 = Apigenin-8-C-glucosylglucosid F5 = Apigenin-6-C-glucosid F6 = Apigenin-C-glycosid (Amax. 340 nm) F7 = Apigenin-C-glycosid (Amax. 352 nm)

(vgl. WEISSENBOCK, 1973)

Triosid Biosid Biosid Monosid Triosid Triosid

Das Lichtmuster unterscheidet sich yom Dunkelmuster durch das Vorkommen der Nebenflavone Fa und F7 (Fs, F9 hochstens in Spuren, vgl. WEISSENBOCK, 1973), die in isolierten Chloroplasten angereichert sind und bereits ab Stadium 2 im ergriinenden SproB nachweisbar werden. Zusatzlich kommen im wesentlichen 2 im UV (350 nm) blau fluoreszierende, mit NHa anregbare Verbindungen vor. Eine alkalische Hydrolyse der Gesamtfraktion (vgl. Methoden) ergab neb en einigen unbekannten, blau fluoreszierenden Hydrolyseprodukten freie Ferulasaure als Hauptkomponente, sowie p-Cumarsaure und p-Hydroxybenzoesaure.

Zum Vergleich mit dem SproB wurden auch die Wurzeln 4, 5 und 8 Tage alter Lichtkeimlinge analysiert. In den waBrigen Wurzelextrakten (HeiBwasserextraktion, vgl. Methoden) konnten nur Spuren von 3 flavonoid-positiv reagierenden Verbindungen (AI CIa-spray am DC), nicht aber die bekannten Flavone F1-F7, sowie 3 blau fluoreszierende Hauptkomponenten unbekannter Struktur (keine Zimtsauren!) nachgewiesen werden. Erst eine alkalische Hydrolyse mit 1 N NaOH der vorher mit H 20 extrahierten Wurzeln, setzte Ferulasaure und p-Cumarsaure frei, die nativ mit dem Lignin (HIGUSHI et al. 1967) oder mit der Zellwand (HARTLEY, 1973) verestert sein diirften. Der verbleibende Karyopsenrest wurde in die Untersuchungen nicht miteinbezogen.

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Flir die Analysen der Flavonoidkinetik wurden aufgrund der qualitativen Untersuchungen nur die flavonhaltigen Sprosse verwendet und die quantitativen Veran

derungen der C-Glycosylflavone F1, F2 , F3 und Fs im Entwicklungsablauf unter

sucht.

d) Flavonakkumulation wahrend der Keimlingsentwicklung

1. Gesamtflavon

In Abb. 3 a ist der zeitabhangige Verlauf der Gesamtflavon-Akkumulation") wahrend der Keimlingsentwicklung im Sprog (Primarblatt und Coleoptile, bzw. Mesocotyl, vgl. Abb. 1) dargesteUt. Die Werte flir Licht- und Dunkelkeimlinge zeigen altersabhangig erhebliche Unterschiede. 1m Lichtsprog beginnt bereits 24-48 Stunden nach dem Erscheinen der Plumula, wahrend des ersten intensiven Blattwachsturns (Stadium 1-2), eine besonders starke Flavonsynthese. Der Flavongehalt steigt dabei innerhalb von 24 h von 0,5-0,6 auf 31,5 f-lg pro Individuum an (50-60-fache Steigerungsrate). Die weitere Akkumulation verlauft wah rend der linearen Phase der Frischgewichtszunahme der Primarblatter (Abb. 2 b) ebenfaUs linear mit hoher Rate (Maximum zwischen Stadium 2-3), vgl. Abb. 3 c, bis zum Stadium 4-5 und geht dann in die Sattigungsphase liber. Del' Flavongehalt bleibt ab Stadium 5 auf einem Hi::ichstwert von 130-150 f-lg (230-260 nmol) pro Individuum konstant.

Einen anderen Verlauf zeigt die Dunkelkurve. Der etiolierte Sprog reichert, bis zum Stadium 6/7 kontinuierlich, aber in geringerem Mage als der grline, Flavone an; die Flavonakkumulation hat eine Iangere Anlaufzeit. Entsprechend andert sich fortlaufend das Verhaltnis des Flavongehalts von Licht- zu Dunkelkeimling (Abb. 6 a). Auf ahnliche Unterschiede im Frischgewicht grliner und etiolierter Primatblatter (Abb. 2 b) wurde bereits hingewiesen. 1m Stadium 2 enthalten die Lichtkeimlinge noch 6- bis 7mal mehr an Flavon als die etiolierten, innerhalb von 4-6 Tagen sinkt der Quotient auf den Wert 2 im Stadium 6-8 abo

Bei der Entwicklung etiolierter Keimlinge faUt auf, dag trotz der verzi::igerten Flavonoidakkumulation die Steigerung des Gehalts in den jlingsten Entwicklungsstadien am gri::igten ist. Zwischen Stadium 1-2 findet ein etwa 10facher Anstieg von 0,5 auf 5 ,ug, im Stadium 2-3 ein 4facher Anstieg statt, der anschliegend geringer wird. Licht- und Dunkelkeimlinge zeigen somit libereinstimmend die starksten Steigerungsraten der Flavonakkumulation wahrend sehr frliher Differenzierungsund Wachstumsprozesse des Blattgewebes.

Ein Vergleich cler Flavonakkumulation mit cler ChlorophyUsynthese (Abb. 3) im jungen Lichtkeimling macht signifikante Unterschiecle im Pigmentierungsverlauf cleutlich. Die Flavonsynthese setzt im Frlihstaclium cler Entwicklung becleutencl star-

") Es wird meist die Bezeichnung «Akkumulation» gewahlt, da die extrahierbare Flavonmenge nicht unbedingt als MaE fiir die Synthese gelten muE und prinzipiell mit einem weiterfiihrenden Stoffwechsel zu rechnen ist (vgl. BARZ und HOSEL, 1971; HOSEL, 1972; STRACK, 1973 u. a.).

Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 74. s. 298-326. 1974.


ker ein als die Chlorophyllsynthese. 1m Stadium 1 liegt noch etwa gleich vie! an Chlorophyll wie Flavon vor (ChI a + b = 1,1/1g, FI = 0,5 f1g), anschlieBend aber, zwischen den Entwicklungsstadien 1-2-3, wahrend der lag-Phase und im Obergang zur log-Phase der Chlorophyllsynthese (Chloroplastendifferenzierung), wird der

300i Q

i FI/KI[,ug]

t150 Chla+b/KI~gl

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3 4 9

Stadium

c

1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8

Stadium

6

Stadium

d

8

Stadium

Abb. 3: Gesamtflavon-Akkumulation (FI) im SproB (KI) wahrend der Keimlingsentwicklung im Licht und Dunkeln, N = 4. a) nmol und flg!1 KI, Summation der mittl. EinzelmeBwerte aus Abb. 5: -0- -e- = MeBmethode 2, im Vergleich zu -0- = MeBmethode 1 (vgl. Methoden, Pkt. 2); zu a) Chlorophyll (a+b) im LichtsproB, flg!1 KI. b) mg!g Frischgewicht. c) Akkumulationsraten III ,ug, aus a) Licht. d) Flavon!Chlorophyll-Relation im LichtsproB, aus a).


308 G. WEISSENBi::icK und B. EFFERTZ

Flavongehalt SO stark erh6ht, dag er den Chlorophyllgehalt 3- bis 4mal iibertrifft (Abb. 3 c, d). In der Folge ist die Chlorophyllsynthese starker, die Relation Flavon/ Chlorophyll (Abb. 3 d) nimmt langsam ab und erreicht einen konstanten Wert urn 1,4. 1m ausdifferenzierten Primarblatt und in der Coleoptile liegt somit immer noch mehr Flavon als Chlorophyll vor. Es ist bemerkenswert, dag die Phase der Flavonsattigung 2 Tage friiher erreicht wird als jene der Chlorophylle a + b.

In Abb. 3 b ist der Flavongehalt auf das Frischgewicht bezogen. Man erhalt dabei einen ahnlichen Kurvenverlauf wie in Abb. 3 a, die Unterschiede zwischen griinem und etioliertem Sprog werden aber gr6ger. Die Lichtkurve verlauft zu Keimungsbeginn sehr steil, da der Flavon-Gewichtsanteil im Sprog erheblich starker ansteigr als das Frischgewicht. Ab Stadium 4-6 bleibt der Flavongehalt annahernd konstant. Die Dunkelkurve verlauft viel £lacher, es wird aber auch im etiolierten Sprog anteilmagig mehr Flavon als Biomasse produziert (bis Stadium 6).

Fraglich ist, in welchem Mag die Gewichtsdifferenz zwischen griinem und etioliertern Sprog auf unterschiedlichem Wassergehalt beruht. Auf die geeignetere Bezugsgr6ge Trockengewicht mugte aus experimentellen Griinden verzichtet werden. In einem friiheren Experiment wurde mit 8-10 Tage alten Haferkeimlingen unter etwas anderen Kulturbedingungen, sowie Saatgut der Ernte 1971, ein 5- bis 10mal gr6gerer Licht-Dunkel-Unterschied im Flavongehalt pro Trockengewicht erhalten (WEISSENBOCK, 1973).

2. Verteilung des Flavongehalts auf Primarblatt und Coleoptile

Blatt- und Coleoptilwachstum junger Haferkeimlinge verlaufen bei Belichtung und Dunkelheit grundlegend verschieden (Abb. 1, 2). Zur Charakterisierung des Flavonoidstoffwechsels im Keimling ist daher eine getrennte Analyse der einzelnen Organe, Primarblatt und Coleoptile (im Dunkeln + Mesocotyl) wichtig. Die Ergebnisse sind in Abb. 4 dargestellt: Bei Belichtung akkumulieren rund 99 Ofo des SproMlavons im Primarblatt wachsender Keimlinge, die Coleoptile enthalt nur 0,2-1,1010. 1m Dunkeln sind die Verhaltnisse ahnlich; im etiolierten Primarblatt betragt der Flavongehalt 97-99010, obwohl der FrischgewichtsanteiI nur 15-45 Ofo (Stadium 2-6, Abb. 2) des SproMrischgewichts ausmacht. Die viel schwerere Coleoptile (+ Mesocotyl) enthalt nur 1,2-2,6 Ofo des Gesamtflavons. Der FrischgewichtsanteiI griiner Primarblatter betragt wesentlich mehr, er liegt bei 57-91 Ofo im gleichen Entwicklungszeitraum.

Aus diesen Werten ergeben sich rclativ hohe Flavonanteile pro Blattfrischgewicht, die beim etiolierten Primarblatt in den Entwicklungsstadien 2-6 bei 0,8-1,6 mg und beim griinen bei 2,5-1,8 mg pro g Frischgewicht liegen (vgl. Flavongehalt Abb. 4, mit FG Abb. 2 b). Die entsprechenden Relationen Licht- zu Dunkelflavon betragen 3 : 1 im Stadium 2, bis 1,4 : 1 im Stadium 6.

Es fallt auf, dag trotz des niedrigen Flavongehalts der etiolierten Coleoptile (+ Mesocotyl) eine geringe, aber kontinuierliche Zunahme - im Gegensatz zur

Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 74. S. 298-326. 1974.


griinen Coleoptile - an Flavon stattfindet. 1m Etiolement bleibt die Coleoptile wahrscheinlich iiber einen langeren Zeitraum hin stoffwechselaktiv, wahrend sie im Licht bereits im Stadium 2-3 ausdifferenziert ist und nicht mehr weiterwachst (vgl. Abschnitt 1 a, b).

Die Flavonoidwerte der Abb. 3 a (Flavon/Sprog) reprasentieren nach Abb. 4

fast ausschliemich den Flavongehalt der Primiirbliitter etiolierter und griiner Keimlinge. Primarblatter enthalten auch den iiberwiegenden Anteil der Chloroplasten (Abschnitt 1 b).

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5 6

Stadium

Abb. 4: Gesamtflavon-Akkumulation im SproB und in den SproBorganen (Primarblatt, Coleoptile, + Mesocotyl im Dunkeln) von Licht- und Dunkelkeimlingen (nmol und ,ug/ Individuum). Block weiB: LichtsproB, punktiert: DunkelsproB (= 100 %); oberer Blockteil: Flavongehalt und %-Anteil der Primarblatter, unterer Teil: Coleoptilen (+ Mesocotyl), schwarz.



3. Akkumulation der Einzelflavone

Die quantitative Analyse der einzelnen Verbindungen F j , F2, F3, F5 (vgl. Abschnitt 1 c und Formelbilder, Diskussion) sollte zeigen, ob der Verlauf der GesamtflavonAkkumulation (Abb. 3) fiir alle Verbindungen typisch ist, oder ob spezifische Abweichungen vorliegen. Abb. 5 zeigt die Akkumulationskurven fiir griine und etiolierte Sprosse. Bei Belichtung akkumulieren die Flavone FI und F3 im Entwicklungsstadium 2 und 3 gleichermagen, wahrend F2 starker hervortritt (mol-Relation FI : F2 : F3 =

1 : 1,4 : 1). Ab Stadium 3-4 iihertrifft das Triosid F j die Bioside F2 und F3 und akkumuliert his Stadium 8 etwa 1,2- bis 1,5mal starker als diese.

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Stadium Stadium

Abb. 5: Akkumulation der Einzelflavone im Sproil (KI) von Licht- und Dunkelkeimlingen (nmol FlI1 KI, N = 4; vgl. Abb. 3 a).

1m Dunkeln verlauft die Anreicherung mit anderen Relationen der Einzelkomponenten. Etiolierte Keimlinge des Stadiums 2 enthalten etwa 6mal soviel Anteile von FI und F2 als von F3 (6 : 6 : 1). 1 Tag spater (Stadium 3) betragt das Verhaltnis nur noch 2,4 : 2,2 : 1, das Flavon F3 wird innerhalb dieser Zeit besonders stark angereichert (10fach). Wahrend der nachfolgenden Entwicklung haben F2 und F3 etwa dieselben Zuwachsraten, ihre Akkumulation verlauft parallel. Stets ist etwa 1,5- his 2mal mehr an F2 als an F3 vorhanden. Das Triosid FI hat eine hohere Akkumula-


C-Glycosylfla vone im Haferkeimling 311

tionsrate, wodurch sein Gehalt schon ab Stadium 3 betrachtlich starker zunimmt als der von F2 und Fa. 1m Stadium 8 betragt die Relation Ft : F2 : Fa rund 4 : 2 : 1. Der Ft-Gehalt erreicht im etiolierten SproB dabei schon 80 Ofo yom LichtsproB, wobei nicht feststeht, ob die Sattigungsphase vollstandig erreicht ist. Aus Abb. 6 b geht hervor, daB vor allem Ft den Lichtwert anstrebt, wahrend Fa im Dunkeln deutlich unterdriickt ist; denn auch im Stadium 8 ist der Fa-Gehalt griiner Organe noch 4mal groBer als der etiolierter.

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Stadium

Abb. 6: Relation des Flavongehalts von Licht- und Dunkelsprossen, Lichtwerte III Ofo der Dunkelwerte. a) Gesamtflavon, b) Einzelflavone.

Das Monosid Fs (Apigenin-6-C-glucosid, Saponaretin) akkumuliert im Etiolement nur sehr schwach, bis etwa 3 nmol (Abb. 5 b), im Licht erfolgt eine erhebliche Zunahme auf etwa 18 nmol pro SproB im Stadium 5. Entsprechend groB wird der Licht/Dunkel-Quotient (in Ofo, Abb. 6 b); die Kurve beginnt an fangs gegeniiber den Hauptflavonen verzogert (Stadium 2-3), steigt bis zum Stadium 5 aber auf 1300 maximal an und liegt in Stadium 7-8 immer noch zwischen 500 und 630.

2. I nduzierbarkeit der Flavonakkumulation (-synthese) durch Belichtung etiolierter Keimlinge

a) Gesamtflavon

1m normalen Licht-Dunkelrhythmus kultivierte Haferkeimlinge reichern im Primarblatt wahrend friiher Entwicklungsstadien (bis Stadium 4, Alter = 6 Tage) besonders stark Flavone an (Abb. 3, 5). In etiolierten Blattern entsprechenden Alters verlauft die Akkumulation dagegen deutlich abgeschwacht. Derartige Unterschiede las-


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E


sen vermuten, da6 wahrend dieser Entwicklungsphase des Keimlings auch die Induzierbarkeit der Flavonsynthese durch Licht maximal ist. Abbildung 7 zeigt Lichtinduktionsexperimente mit etiolierten Keimlingen verschiedenen Alters. Ein Tei! der Pflanzen wurde zu Beginn des 5. Tages (Stadium 2), des 6. Tages (Stadium 3) und

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Stadium 2

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Stadium 4

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26 0 2 4 6 8 10 12 26 28 31

Stunden nach Belichtun9

Abb. 7: Flavonakkumulation im Sprog (Kl) wahrend der Belichtung (Licht) etiolierter Keimlinge verschiedenen Alters, im Vergleich zur Dunkelkontrolle (Dunkel); ,ug bzw. nmol!l Kl. Beginn der Belichtung: 97 h (Stadium 2), 121 h (Stadium 3), 145 h (Stadium 4) nach der Aussaat. a) Gesamtflavon: oben, b) Einzelflavone: unten.

Z. Pfianzenphysiol. Bd. 74. S. 298-326. 1974.


des 7. Tages (Stadium 4) nach der Aussaat mit WeiiUicht bestrahlt (zur Morphologie s. Abb. 1, Dunkel), der andere Teil blieb als Kontrolle weiterhin im Dunkeln.

Der Kurvenverlauf (Abb. 7 a) zeigt deutlich, daB die Lichtinduzierbarkeit der Flavone bei 4 Tage alten Keimlingen am groBten ist und mit zunehmendem Alter und zunehmender Etiolierungsdauer abnimmt. 1m Stadium 2 steigt der Flavongehalt bei Belichtung exponentiell an und setzt sich schon nach 4 Stun den von den Dunkelwerten besonders deutlich abo In den Stadien 3 und 4 ist der Unterschied beider Anreicherungskurven geringer. Nach 12stlindiger Belichtung weisen 4 Tage alte Sprosse den 1,8fachen, 5 und 6 Tage alte nur den 1,2fachen Flavongehalt der Dunkelkontrollen auf (Abb. 8 a). 26 Stunden Belichtung vergroBern die Unterschiede weiter auf 300 % (Stadium 2) und 160 % (Stadium 3, 4) der Dunkelwerte.

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--- Stadium 2 --... -- 3

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b

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26 28 30 Stunden nach Belichtung

34

34

Abb. 8: a) Relation des Flavongehalts von Licht- und Dunkelsprossen bei Belichtung im Stadium 2, 3 und 4 (Lichtwerte in Ofo der Dunkelwerte, vgl. Abb. 7a). b) Chlorophyl1(a+b)Synthese im Spro£ (Kl) bei Belichtung etiolierter Keimlinge, S. Text.



Abb. 8 b zeigt die Chlorophyllsynthese, vor all em im Primarblatt belichteter Dunkelkeimlinge (s. u.). Dabei wird deutlich, dag die weiter fortgeschrittene Etiolierung im Stadium 3 und 4 eine langsamere Umstellung des Stoffwechsels zur Folge hat: Nach 26 h Belichtung betragt der Chlorophyllgehalt nur 28 bzw. 30 % des Wertes normaler Lichtkeimlinge (vgl. Abb. 3 a). 1m Stadium 2 dagegen wird innerhalb der 26 h Belichtungszeit derselbe Chlorophyllgehalt erreicht, den der von Keimungsbeginn an belichtete Keimling gleichen Alters aufweist. Dies gilt in ahnlicher Weise fiir den entsprechenden Flavongehalt, der durch Lichtinduktion erreicht wird. Er liegt fiir eine Belichtungszeit von 26 h im Stadium 4 bei 45 %, im Stadium 3 bei 50 % und im Stadium 2 bei 70 Ofo des normal en Lichtwerts (vgl. Abb. 3 a).

16

14

12

10

8

24681012 26283034

Stunden nneh Beliehlung

Abb. 9: Frischgewichtsanderungen (FG) etiolierter Sprosse bei Belichtung (L) 1m Stadium 2,3, und 4, im Vergleich zur Dunkelkontrolle (D), FG zu Abb. 7.

Beim Vergleich der Flavonwerte belichteter Sprosse mit den Frischgewichten (Abb. 9) sieht man, dag die Flavonakkumulation bei allen 3 Belichtungsexperimenten spezifisch, d. h. weitgehend unabhangig von Frischgewichtsanderungen ablauft. Das Frischgewicht steigt bei 26-30 Stunden Belichtung im Stadium 3 und 4 im Vergleich zur Dunkelkontrolle nicht oder nur geringfiigig an, nimmt aber im Stadium 2 a.hnlich der Dunkelkurve auffa.llig, aber schwa.cher zu als die Flavonproduktion.

Vergleicht man die unter dem Lichteinflug vermehrte Netto-Flavonanreicherung (fig) (FL = Lichtwert minus Dunkelwert aus Abb. 7 a, je Stadium und Belichtungszeit) mit der Chlorophyllsynthese (,ug), dann zeigen sich augenfa.llige Obereinstimmungen. Die Relation Flavon- zu Chlorophyllgehalt (FL : ChI, a + b), in Tab. 1 A dargestellt, liegt ab 4-8 h Belichtung (5. u.) durchschnittlich urn den Wert 1,7-1,3, und ist weitgehend unabha.ngig yom Keimlingsalter, der Etiolierungsdauer und der Belichtungszeit. Die relativ gute Konstanz des Quotienten ist auf die vergleichbaren Steigerungsraten (IF, Tab. 1 B) fiir die Flavon- und Chlorophyllakkumulation unter

z. P/ianzenphysiol. Bd. 74. s. 298-326. 1974.

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Lichteinflug zuriickzufiihren. Der Durchschnittswert fiir IF liegt bei Flavon und Chlorophyll urn den Wert 2, d. h. Flavon und Chlorophyll werden gleichzeitig und gleich stark gebildet bzw. akkumuliert. 1m Stadium 2 findet schon nach etwa 2 Stunden Belichtung eine deutliche Steigerung des Flavongehalts var einer megbaren Chlorophyllsynthese statt. Bei den alteren Keimlingen (Stadium 3, 4) beginnt die Ergriinung zuerst, die Flavonakkumulation setzt erst nach einer Verzogerung von etwa 2-4 h ein; der Flavonwert iibertrifft aber bald die Chlorophylle mengenmagig urn den Faktor 1,7 bzw. 1,3 (Tab. 1 A).

Auch bei diesen Versuchen spiegeln die erhaltenen Daten fast ausschliemich die Stoffwechselsituation im Primiirblatt des Keimlings wider (vgl. Abb. 4). Coleoptilen und Mesocotyle belichteter Dunkelkeimlinge sind am Ende der Belichtungszeit nur schwach (unmegbar) griin, so dag die Chlorophyllwerte der Abb. 8 b fiir die Primarblatter gelten .

..EL[nmoll 150 Kl.

100

50

o 6 9 12 26 30 32 Stunden nach 8elichtung

Abb. 10: Gesamtflavon-Akkumulation im SproE und in den SproEorganen (Primarblatt, Coleoptile + Mesocotyl) wahrend der Belichtung etiolierter Keimlinge im Stadium 3 (121 h nach Aussaat). Block weiE: Belichtung; punktiert: Dunkelkontrolle = SproE (100010), Verteilung nmol und 010, wie in Abb. 4.

Die Flavonverteilung wurde fiir die Lichtinduktion im Stadium 3 (Keimlingsalter 5 Tage) analysiert (Abb. 10): Ergriinende Primarblatter akkumulieren nach 6-12 h Belichtung 98-99 Ofo und nach 26-34 h 94-95 Ofo des Gesamtflavons vom Sprog. Interessanterweise ist auch bei der Coleoptile (+ Mesocotyl) eine megbare Lichtinduktion auf das 7- bis 8fache des Kontrollwerts zu beobachten.

Z-. PjlanzenphysioL. Ed. 74. S. 298-326. 1974.


b) Lichtinduktion der Einzelflavone

Wie in Abschnitt 1 sollte auch im Lichtinduktionsversuch festgestellt werden, in welchem Umfang die Flavone Fl-F5 am Verlauf der Gesamtakkumulation beteiligt sind. Es zeigt sich, daB das Flavon Fa (vgl. Abschn. 1 c), das von den 3 Hauptkomponenten im Etiolement am starksten unterdruckt ist (Abb. 5, 6 b), auch am starksten induziert werden kann (Abb. 7 b). 1m Stadium 2 (Keimlingsalter 4 Tage) wei sen die Flavone Fl und F2, von einem gemeinsamen Dunkelwert aus

gehend, fast identische Induktionskurven auf und erreichen nach 26 h Belichtung mit einer Netto-Zunahme (Lichtwert minus Dunkelwert) von etwa 28 nmol je Ver

bindung die groBten Absolutwerte (Abb. 7 b). Fl erreicht dabei sogar 90 Ofo des normalen Lichtwerts (s. Abb. 5). Das Flavon Fa, zu Belichtungsbeginn in geringerer Menge vorliegend, akkumuliert zwar nur 22 nmol absolut, die prozentuale Lichtin

duktion (L in Ofo D) ist aber deutlich groBer als bei Fl und F2. Nach 26 h Belichtung betragen die Werte fur Fa etwa 500 Ofo, fur Fl und F2 je 300 Ofo der Dunkelkontrolle.

Bei den alteren, 6 Tage alten Dunkelkeimlingen (Stadium 4) ist die Lichtinduzier

barkeit aller Flavone geringer, doch wird auch hier die relativ starkste Steigerung bei Flavon Fa beobachtet. Fl ist mit dem hochsten Absolutgehalt am schwachsten zu induzieren, die Netto-Akkumulation betragt nach 31 h Licht nur 10 nmol, F2 und Fa dagegen je 20 nmol (per Individuum). Die prozentuale Induktion liegt fur Fa bei 250-300 Ofo, fur F2 bei 200 Ofo und fur Fl bei 125 Ofo der Kontrolle.

Die Nebenkomponente, Flavon F5, wurde nur in Stadium 4 gemessen. Auch hier zeigt sich eine relativ hohe, mit Fa vergleichbare Steigerung von 230 Ofo nach 31 h Belichtung (Abb. 7 b).

Diskussion

In bestimmten Entwicklungsstadien des Haferkeimlings treten sehr charakteristische Veranderungen im Flavonoidstoffwechsel auf, die nicht nur den Gesamtflavongehalt, sondern auch das Verhaltnis cler Einzelkomponenten zueinander betreffen (Abb. 3, 5). Dabei zeigen sich erhebliche quantitative Unterschiede im Flavonmuster etiolierter und gruner Primarblatter (5. a. Abb. 4). Die starksten Steigerungs- und Akkumulationsraten sind mit den auffalligsten morphologischen Differenzierungsvorgangen verbunden.

Die Pflanze steht am Beginn der Entwicklung; Reservestoffe des Samens werden mobilisiert, Zellen teilen sich lebhaft, bilden neue Organellen und Kompartimente aus, vorhandene urn, Enzymsynthesen und Aktivierungen finden statt. Eine Vielzahl streng kontrollierter Reaktionen kommt in Gang und bedingt umfangreiche biochemische und morphologische Differenzierungen. Aile diese Vorgange fiihren zu einem starken Langenwachstum und zur Gewichtszunahme der Keimlingsorgane, die wahrend der friihen Spro~entwicklung von der Zuwachsrate im Flavongehalt noch iibertroffen wird (Abb. 3 b). Sowohl im Lichtals auch im Dunkelkeimling setzt die Flavonsynthese gleicherma~en ein; endogene, nur yom Entwicklungszustand abhangige Faktoren bewirken den Anstieg. Khnliche Ergebnisse liegen auch bei anderen Pflanzen vor. z. B. bei Phaseolus vulgaris (WALTON, 1968),



Fagopyrum esculentum (AMRHEIN und ZENK, 1970 b), Impatiens balsamina (WEISSENBOCK, 1971), Cucurbita maxima (STRACK, 1973; SCHMITTER, 1973), die den Einflu6 endogener Prozesse auf den Phenylpropanstoffwechsel des Keimlings deutlich machen.

Zu Keimungsbeginn findet lichtunabhangig eine Induktion (Neusynthese oder Aktivierung) des Schliisselenzyms des Phenylpropanstoffwechsels Phenylalanin- bzw. Tyrosin-Ammonium-Lyase (PAL, TAL, KOUKOL und CONN, 1961; NEISH, 1961) und anderer Enzyme, z. B. der Chalkon-Flavonon-Isomerase (vgl. WEISSENBOCK,

1974) statt. Erst in der weiteren Entwicklungsphase, etwa ab dem 4. Tag (Stadium 1-2) bei Avena und 2.-3. Tag (Stadium IV-VI) bei Impatiens (WEISSENBOCK, 1971,1972 b) nimmt auch der Lichtfaktor einen bedeutenden Einflug auf die Dynamik der Flavonoid-Pigmentierung; Enzymaktivitat und Akkumulationsrate werden gegeniiber der Dunkelkontrolle betrachtlich gesteigert. Die Lichtperzeption augert sich beim Avena-Keimling, vor all em zu Beginn des Primarblattwachstums, wenn die Coleoptile durchbrochen wird und die Ergriinung einsetzt, in einer stark lichtinduzierten Flavonsynthese im Primarblatt (Abb. 1, 3). Gleichzeitig findet die photomorphogenetische Umwandlung der Plastiden zu griinen Chloroplasten unter Thylakoidbildung statt. Die Akkumulationsrate der Flavone ist dabei im Primarblatt

3- bis 4mal groger als die der Chlorophylle (a + b) (Abb. 3 c, d). Erst im Laufe des weiteren Wachstums nimmt die Chlorophyllmenge relativ zu, da die Flavonakkumulation die Sattigungsphase friiher erreicht als die Chlorophyllsynthese.

Verbleiben die Keimlinge im Dunkeln, dann wandeln sich die Plastiden in Etioplasten urn; die Flavonakkumulation verlauft parallel mit dem Primarblattwachstum, gegeniiber dem Lichtkeimling verzogert, aber mit kontinuierlichem Anstieg (Abb. 2 b, 3 a, b). Der Unterschied im Flavongehalt griiner und etiolierter Blatter ist vor all em in jungen Organen stark ausgepragt und wird mit zunehmendem Alter geringer (Abb. 6 a), da die Sattigung im Licht friiher erreicht ist als bei Dunkelheit. Moglicherweise findet auch weiterhin im Licht eine starke Flavonsynthese statt, die aber infolge hoher Umsatzraten zu keiner weiteren Akkumulation fiihrt (s. BARZ und HasEL 1971; BARZ et a!., 1971; HasEL, 1972).

Es erhebt sich die Frage, wie weit derartige Unterschiede auf «endogenen», also rein entwicklungsabhangigen Faktoren beruhen und in welchem Umfang der LichteinfluB dabei eine Rolle spielt. Dies gilt insbesondere fiir die akkumulierende Menge der einzelnen Glykoflavone (Abb. 5, 7 b) und die daraus resultierende Relation der Komponenten zueinander, die sich bei Belichtung der Keimlinge in Abhangigkeit Yom Entwicklungsstadium gegeniiber dem Etiolement charakteristisch unterscheidet. Das in den Zellen (Geweben) vorliegende Reaktionsmuster «<primare Differenzierung», vgl. z. B. MOHR und SITTE, 1971; Bopp und CAPESIUS, 1973), das sich im Laufe der Entwicklung andern kann, bestimmt dabei die Art und das Ausma6, auf Umweltveranderungen wie Licht zu reagieren. Dber die Problematik bei der Interpretation derartiger Ergebnisse, zur morphologischen und biochemischen Differenzierung von Keimlingen, wurde kiirzlich ausfiihrlich berichtet (Bopp und CAPESIUS, 1973).

Eine Unterscheidung zwischen endogenen und lichtabhangigen Differenzierungsvorgangen bei Avena-Keimlingen ist strenggenommen nur in den erst en Keimungsstadien, etwa bis zum 5. Tag der Anzucht moglich. Denn im Dunkeln haben altere Keimlinge einen stark


C-Glycosylflavone im Haferkcimling 319

veranderten Stoffwechsel, so dag sie zum direkten Vergleich mit normalen Lichtkeimlingen nicht mehr herangezogen werden konnen: Die Lichtinduktionsexperimente machen deutlich, in welchem Differenzierungszustand der Dunkelkeimling noch in der Lage ist, sich rasch an die natiirlichen Lichtverhaltnisse anzupassen bzw. in welchem Umfang eine Merkmalspragung in Abhangigkeit von der Etiolierungsdauer im Keimling bereits stattgefunden hat (vgl. Abschnitt 2 a, b, sowie Diskussion). Zur Frage labiler Festlegung «<Modulation») und stabiler Festlegung «<Determination») der Geschwindigkeit eines Entwicklungsablaufs vgl. Diskussion bei SCHOPFER (1973).

In allen untersuchten Entwicklungsstadien ist die Flavonmenge zu 97-99010 im Primarblatt griiner oder etiolierter Haferkeimlinge lokalisiert. Die Coleoptile (+ Mesocotyl, im Dunkeln) enthalt nur 1-3010 Flavon. Die hohe Gewebespezifitat fiir Flavon-Akkumulation auBert sich besonders deutlich in den 4-6 Tage alten Dunkelkeimlingen (Stadium 2-4, Abb. 1), bei denen der Frischgewichtsanteil des Primarblatts nur zwischen 15-20010 (Coleoptile + Mesocotyl = 80-85010, Abb. 2), der Flavongehalt aber 98-99 Ofo des Sprosses betragt (Abb. 4). Auffallig dabei ist, daB auch die Plastiden zu 90-98010 im Primarblatt vorliegen (vgl. Abschn. 1 b). Es besteht somit eine sehr deutliche Koinzidenz sowohl hinsichtlich der Flavon- und Plastiden-Lokalisation als auch der Synthese- bzw. Akkumulationskinetik von Flavon und Chlorophyll im wachsenden Primarblatt.

Keimlinge von Impatiens balsamina verhalten sich gleichartig (WEISSENB(kK, 1972 b). Die lichtabhangige Flavonol-Akkumulation erfolgt fast vollstandig (99 Ofo) in den tiefgriinen Cotyledonen, wahrend die chloroplastenarmen Hypocotyle nur 1 Ofo Flavonol anreichern. Keimpflanzen von Cucurbita maxima akkumulieren die Hauptmenge an Flavonolen ebenfalls in den Keimblattern, wobei die maximale Konzentration wahrend der Blattentfaltung und Ergriinung erreicht wird (STRACK, 1973). Auch Untersuchungen von SHEEN (1973) erbrachten positive Korrelationen zwischen Chlorophyll- und Chlorogensauregehalt in Blattern von 25 verschiedenen Tabaksorten. Ein interessantes Ergebnis wurde bei einer cytoplasmatischen Mutante «<chlorophyll-variegated») erhalten, bei der die griinen Teile der Blattlamina einen hohen Chlorogensauregehalt sowie hohe PAL- und PolyphenoloxydaseAktivitat aufweisen, die gelben Teile dagegen einen geringeren Gehalt und eine schwachere Enzymaktivitat.

Derartige Obereinstimmungen sind auch bei den Lichtinduktionsexperimenten mit etiolierten Haferkeimlingen zu beobachten, wobei die lichtinduzierte Flavon- und Chlorophyllsynthese, z. Teil nach einer kurzen Verzogerungszeit (Tab. 1), gleichzeitig und gleich stark fast ausschlieBlich im Primarblatt ablauft (Abb. 10). Das Keimlingsalter, die Etiolierungsdauer und die Belichtungszeit haben dabei wohl einen EinfluB auf die Umwandlungsgeschwindigkeit [Etioplast -:> Chloroplast], auf die Intensitat der Chlorophyll- und Flavonsyntheserate, nicht aber auf den gemeinsamen zeitlichen Ablauf dieser biochemischen Prozesse (Tab. 1).

Es ist lange bekannt, daB Licht eine verstarkte Flavonoidsynthese auslOsen kann (HARBORNE, 1967; SMITH, 1972), iiber die Wirkungsmechanismen herrscht jedoch noch keine vollige Klarheit. Das Phytochromsystem spielt dabei die groBte Rolle (Obersicht b. SCHOPFER, 1972), eine blaulichtabhangige Hochenergiereaktion ist ebenfalls in Betracht zu ziehen (SCHERF und ZENK, 1967; MCCLURE und WILSON, 1970;


320 G. WEISSENB(JcK und B. EFFERTZ

SMITH, 1972), die liber Aktivitatssteigerungen oder de novo-Synthesen spezifischer

Enzyme wirken konnen (Zusammenfassung bei ZUCKER, 1972; SMITH, 1972). 1m Zuge des allgemeinen Aufbaus des Photosyntheseapparats konnte auch, infolge

vermehrter Anlieferung primarer Photosyntheseprodukte, eine Steigerung der Flavonoidsynthese stattfinden (Abb. 3; vgl. dagegen Tab. 1 Stadium 2; s. ZAPROMETOV und BUKHLAEVA, 1967).

Ais weitere Moglichkeit - im Zusammenhang mit unseren Lichtinduktionsexperimenten (Abb. 7 und Tab. 1) besonders interessant - darf angenommen werden, dag bei bestimmten Pflanzenarten das Protochlorophyll als akzessorisches Pigment fungiert. CARLIN und MCCLURE (1973) wiesen bei etiolierten Gerstenkeimlingen anhand von Aktionsspektren nach, dag die Lichtinduktion chemisch sehr ahnlicher Flavon-C-glykoside unter der Kontrolle verschiedener Photorezeptoren steht: Aktives

Phytochrom (Pm) allein zeigt sich flir die Synthese von Saponarin (Saponaretin-7-O-glucosid) wirksam und offensichtlich ist Protochlorophyll, zusammen mit Pm, flir die Bifdung von Lutonarin und -3-methylather verantwortlich. Eine direkte Beteiligung der Plastiden an der lichtinduzierten Flavonsynthese ist hier sehr wahrscheinlich gemacht.

Das Grundmuster der Primarblatt- und Coleoptilen-Flavonoide von «Gelbhafer», die Flavon-C-glykoside Fl-F5 (vgl. Abschnitt 1 c), ist genetisch festgelegt und tritt in allen Keimungsstadien, sowohl im Licht als auch im Dunkeln, gleichermagen auf. Durch modifizierende endogene und exogene Faktoren ist eine unterschiedliche Beeinflussung der akkumulierenden Menge jeder einzelnen Komponente moglich (Abb. 5, 7). Die quantitativen Relationen der Flavone zueinander werden dabei von den gewahlten Anzuchtbedingungen, yom Keimlingsalter und Differenzierungsgrad der Zellen bestimmt. Diese komplexen Parameter entscheiden einerseits liber das Ausmag der Synthese oder ggf. Aktivierung der verschiedenen FlavonoidEnzyme (vgl. HAHLBROCK et al., 1971 a, b; HAHLBROCK und WELLMANN, 1973; CAMM und TOWERS, 1973 b; WEISSENBOCK, 1974), andererseits aber auch liber die Bildung der Reaktionsraume in der Zelle, in denen die biochemischen Reaktionen ablaufen. Wahrend der frlihen Keimlingsentwicklung werden vor allem im belichteten Primarblatt intrazellular optimale Bedingungen geschaffen, die hochste FlavonSyntheseraten bedingen. Eine nur kurze Etiolierungsdauer der Keimlinge ermoglicht bei Belichtung eine rasche Umstellung auf normale Lichtverhaltnisse (s. Abschnitt 2 a, b). In 4 Tage alten Dunkelkeimlingen (Stadium 2) wird nach 26 h Belichtung derselbe Chlorophyllgehalt und 70 % des Gesamtflavons (Flavon FI sogar 900/0) normaler Lichtkeimlinge gleichen Alters erreicht. Altere, 5-6 Tage alte Dunkelkeimlinge (Stadium 3, 4) zeigen diese Rekonstitution nicht mehr, eine Determination liegt bereits vor. Die flir eine optimale Chlorophyll- und Flavonsynthese notwendigen Enzymaktivitaten und Reaktionsraume sind nicht oder nicht mehr so rasch zuganglich (vgl. Anmerkung S. 318).

Die auffallige Koinzidenz zwischen Reife- und Differenzierungsgrad der Zellen und Plastiden mit der Flavonkinetik (quantitative Musterbildung, Abb. 5, 7 b) macht

z. PJlanzenphysiol. Ed. 74. s. 298-326. 1974.


eine Kompartimentierung verschiedener Flavonoid-Stoffwechselreaktionen wahr

scheinlich. Geht man davon aus, dag Chloroplasten und Etioplasten aus Primarblattern von

Avena einerseits signifikante Flavonmengen, andrerseits sogar unterschiedliche Flavonmuster aufweisen (vgl. WEISSENBOCK, 1973; WEISSENBOCK und SCHNEIDER, 1974),

dann konnen die erhaltenen Obereinstimmungen (Abb. 3, Tab. 1) als ein deutlicher

Hinweis auf Kausalzusammenhange zwischen lichtinduzierter Flavonsynthese und

Plastidendifferenzierung verstanden werden. Den Plastiden diirfte eine maggebliche regulatorische Rolle zukommen, zumal

sie Enzymaktivitaten des Phenylpropanstoffwechsels aufweisen konnen.

Nach Untersuchungen von Rurs und KINDL (1970) scheint PAL-Aktivitat bereits in «Pro»plastiden von Ricinus communis-Endosperm vorzuliegen, in Etioplasten von Hordeum vulgare (SAUNDERS und MCCLURE, 1972) und Chloroplasten verschiedener Spezies (LoFFELHART et aI., 1973) ist PAL ebenfalls nachweisbar. Dieses Enzym durfte bei Chloroplasten vorwiegend in den Lamellarsystemen lokalisiert sein. Die Fahigkeit isolierter Chloroplast en verschiedenerPflanzenarten, die Hydroxylierung der p-Cumarsaure zu Kaffeesaure zu katalysieren, ist bereits langer bekannt (SATO, 1966; SATO et aI., 1968; BARTLETT et aI., 1972). Auch die Kopf-Schwanz-Kondensation von Malonyl-(Acetyl)-CoA-Einheiten, analog der Synthese des Flavonoid-A-Rings (vgl. KANNANGARA et aI., 1971 a, b) und sogar die Kondensation von p-Cumarsaure mit Acetyl-CoA zum Cl5-Stilben wurde mit isolierten Chloroplasten erhalten (KINDL, 1971 b; s. a. BIRCH, 1968). Die Syntheseaktivitat ist dabei abhangig yom Entwicklungszustand der Plastiden und Yom Licht. Nach den Untersuchungen von ZAPROMETOV et al. (1967) durfte die Catechinsynthese in Chloroplast en von Teekeimlingen autonom erfolgen.

Eigene Versuche mit isolierten, intensiv gewaschenen Avena-Cloroplasten und -Subfraktionen zeigten signifikante Enzymaktivitaten, PAL und Chalkon-Flavonon-Isomerase, der Plastiden (TRINKS und WEISSENBOCK, in Vorbereitung).

Die Primarblattflavone von «Gelbhafer» sind formal und wahrscheinlich auch

biochemisch nahe verwandt (vgl. Abschnitt 1 c, sowie Formelbild).

Das Monosid F5, Saponaretin (= Isovitexin), das chern. einfachste Blattflavon, akkumuliert in griinen oder etiolierten Bl:ittern nur als Nebenkomponente (1-6 0/0

des Gesamtflavons), wahrend die Bioside F2, Isovitexin-O-arabinosid; Fa, VitexinO-glucosid und das Triosid Fb (methoxy)-Vitexin-O-rhamnoglucosid als Hauptkomponenten auftreten (Abb. 5). Isolierte Chloroplasten ausdifferenzierter Primar

blatter (8-10 Tage alt) enthalten dagegen bis zu 70 Ofo (Etioplasten bis 60 Ofo) des Blatt-Saponaretins, F5, und nur 2 bis max. 10 % der Flavone FI _ 3 , vor allem im Stroma lokalisiert (WEISSENBOCK, 1973; WEISSENBOCK und SCHNEIDER, 1974). Zusatzlich kommen 4 weitere Flavone, F6--9, als «Chloroplastenflavonoide» vor (Ab

schnitt 1 c).

Es kann davon ausgegangen werden, dai) das Vorstufenangebot fur die Bildung des BRings aller Avena-Flavone - mit identischer 4'-OH-Substitution (s. Flavone FI _ 9, Abschnitt 1 c) - formal gleichermai)en zur Verfugung steht (vgl. z. B. GRISEBACH und BARZ, 1969; HESS, 1968). Dieses Angebot kann lichtinduziert vermehrt werden, durch eine Aktivierung oder Neusynthese der beteiligten Enzyme PAL, TAL, Zimtsaure-Hydroxylase, p-CumaratCoA-Ligase, Chalkon-Synthetase, Chalkon-Flavanon-Isomerase (vgl. CAMM und TOWERS,

Z. Pjlanzenphysiol. Ed. 74. S. 298-326. 1974.


1973 a; RUSSELL, 1971; HAHLBROCK et a!., 1971 a-c; LINDL et a!., 1973; KREUZALER und HAHLBROCK, 1972; WEISSENBOCK, 1974). Die A-Ring-Vorstufen Malonyl(Acetyl)-CoA diirften durch Licht nicht oder nicht generell induzierbar sein (SCHERF und ZENK, 1967; KANNANGARA et a!., 1971 a, b).

Nach unseren Ergebnissen laufen nun bestimmte Teilreaktionen offensichtlich nicht am gleichen Reaktionsort ab und/oder sie werden durch unterschiedliche Enzymaktivitaten, wohl vor aHem C- und O-glykosidierender Enzyme, reguliert. Aus einer Anzahl theoretischer Moglichkeiten diirfte der eine oder andere Regulationsmechanismus fiir die Bildung des charakteristischen quantitativen Flavonmusters im Haferkeimling zutreffen (s. a. ArbeitsSchema):

1. Unterschiedliche Glykosidierung auf der CwStufe

An gemeinsamen oder verschiedenen Reaktionsorten findet eine unterschiedliche C-Glykosidierung, etwa auf der Chalkon/Flavanon-Zwischenstufe (ALSTON, 1968; WALLACE und GRISE BACH, 1973) und O-Glykosidierung auf der Glycosyl-Flavonstufe (WALLACE et a!., 1969) statt, z. B.:

C-C-glykosidierende Enzyme: Cl~-8-C-glucose (= Fe und Fa-Vorstufe), C 1s-6-C-glucose (= F2 - und Fs-Vorstufe); C1s-6-C-8-C-«Isomerase» (WALLACE und MABRY, 1970; MURRAY und WILLIAMS, 1973); O-glycosyl-Trans/erasen (z. B. SUTTER und GRISE EACH, 1973; HARBORNE, 1967) fiir Glucose (F j , Fa), Rhamnose (F j ), Arabinose (F2), vgI. Formelschema; O-Methyltrans/erase fiir F j (WALLACE et a!., 1969). Dabei konnen gleich- oder verschiedengroEe Cg- und C jS - Vorstufenfluxe eine zusatzliche Rolle spielen.

2. I nterconversion (unter Beriicksichtigung von Pkt. 1)

Biochemische Umwandlung einzelner «End»-produkte, z. B. der Flavone Fs, Fa, durch C-6-C-8-1somerisierung und O-Glycosyltransfer. Die enzymatische Umwandlung von 1sovitexin zu Vitexin wurde kiirzlich von MURRAY und WILLIAMS (1973) erstmals beschrieben (s. a. WALLACE und MABRY, 1970).

Moglicherweise tritt bei Avena 1sovitexin (= Saponaretin, Fs) als Vorstufe fiir 1sovitexinO-arabinosid (F2) und fiir Vitexin-O-glucosid (Fa) auf. Fa konnte durch Rhamnose-Transfer und Methylierung in F j iiberfiihrt werden":

WOH

HO r 0 I h-

I I glc :::,..

HOWO I:OH

------_a :::,.. I I OH 0

glc e OH 0

F2

OH

HO

OH 0

Fi ") Die chern. Struktur von F j ist noch nicht ganz geklart, die Zuckerreihenfolge wahr

scheinlich.



Die Reaktionen konnten im Cytoplasma (durch Kompartimentierung?), aber auch in den Plastiden kontrolliert werden (-+ Plastid en flavone, Vakuolenflavone, s. u.). Nach Abb. 5 sind derartige Umwandlungen auch im etiolierten Primarblatt gut denkbar, wo F2 relativ stark (10-30 nmol), F~ aber nur in Spur en (1-3 nmol) akkumuliert. Khnliches gilt fiir F j und Fa. Der verbleibende Rest-pool an Fs und Fa konnte dabei durch einen «Riickstau» zustan de kommen, der bes. im belichteten Blatt zu einer erheblichen Akkumulation fiihren kann (Abb. 5, 7 b).

3. Weiterfiihrender Stoffwechsel (mit unterschiedlichem «turnover» der Einzelkomponenten)

Diese Moglichkeit ist in Betracht zu ziehen, da in Gerstensprossen der Umsatz von 1sovitexin-7-0-glucosid (vgl. Avena, 1sovitexin) nachgewiesen wurde (KRUGER et aI., 1973) und fUr chemisch nah verwandte Flavonoide unterschiedliche Halbwertszeiten der Umsatze bekannt sind (BARZ und HOSEL, 1971; BARZ et aI., 1971; HOSEL, 1972; STEINER, 1972, 1973; STRACK, 1973). Dabei iibt Licht einen zusatzlichen und auf die einzelnen Komponenten unterschiedlichen EinfluB aus (BARZ et aI., 1971). Glykoside desselben Aglykons (Kampferol bzw. Quercetin) unterliegen in Cucurbita maxima einem unterschiedlichen Umsatz, dessen 1ntensitat streng yom physiologischen Zustand (Differenzierungsgrad) der Keimlinge abhangig ist (STRACK, 1973).

In Avena-Primarblattern konnte man sich eine Beteiligung der Plastiden an der Flavonoidsynthese in folgender Weise vorstellen: Die starke Anreicherung des Saponaretins (Isovitexin, Fs) kommt durch eine weitgehend autonome Synthese innerhalb der Plastiden zustande (vgl. das Arbeits-Schema). Durch weitere, lichtabhangige O-Glykosidierungen und durch eine C-6-C-8-Isomerisierung entsteht das plastidenspezifische Flavonmuster (s.o.) und der bei Etioplasten und Chloroplasten unterschiedliche Flavongehalt.

Arbeits-Schema:

! r+----Cg, CIS - vorstu!en

Plastid

[proptastid 1 Etioplast Chloroplast

0'lQRlasma /s~F2 [Kompartimente]

Cg,ClS-Y. F3-FI "turnover"

C-Glycosylflavon-Stoffwechsel im Primarblatt von Avena sativa, «Gelbhafef». Vakuolenflavone: F t , F2, Fa; Plastidenflavone: F~ (Etioplast, Chloroplast), FS_ 9 (Chloroplast) (Erklarung im Text) (vgl. Formelschema).

Z. Pflanzenphysiol. Bd. 74. S. 298-326. 1974.

324 G. WEISSENBC)cK und B. EFFERTZ

Die Plastidenflavone konnten physiologische Funktionen im Bereich der Photo

synthese iibernehmen, als Cofaktoren im Elektronentransport (vgl. OETTMEIER und HEUPEL, 1972) oder durch Beeinflussung photophosphorylierender Enzyme (SCHNEIDER, 1974; WEISSENBOCK und SCHNEIDER, 1974) oder der Carboxydismutase-Aktivi

tat (Zit. MONTlES, 1971; vgl. Obersicht bei TREBST, 1970). Andererseits besteht die Moglichkeit, da~ Saponaretin - gemeinsam mit Ca-,

C o-, C w Vorstufen(?) - aus den Plastiden transportiert wird, dort wieder nachsynthetisiert wird und im Cytoplasma als Vorstufe fiir die Vakuolenflavone FJ, F2, Fa

dient (s. Formelschema). Dabei konnte lichtabhangig reguliert werden, denn es fallt auf, da~ gerade die biogenetisch weniger abgeleiteten Flavone Saponaretin (F5) und Vitexin-O-glucosid (Fa), die formal als Vorstufen fiir F2 und F, in Frage kommen, auch am starksten lichtinduzierbar sind (Abb. 5, 7 b). Das hoher substituierte (methoxy)-Vitexin-O-rhamnoglucosid F, akkumuliert dagegen auch im etiolierten Primarblatt sehr stark und erreicht am 10. Tag der Aussaat 80 % des vergleichbaren Lichtwerts. Die Hauptmenge der Flavone F,- 3 wird wahrscheinlich im Cytoplasma durch das Zusammenwirken verschiedener Reaktionsraume, einschliemich der Chloro

plasten (vgl. Diskussion KINDL, 1971 a), gebildet und vorwiegend in der Zellvakuole und Zellwand akkumuliert.

Herrn Prof. Dr. H. REZNIK danken wir fiir sein reges Interesse an dieser Arbeit und fiir die Durchsicht des Manuskripts. Frl. G. SACHS sei fiir die vorziigliche technische Mitarbeit herzlich gedankt.

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft sehr groBziigig unterstiitzt.

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entwicklungs- und lichtabhängige akkumulation von c-glycosylflavonen im haferkeimling (avena sativa...

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