entwicklung von fermentationsprozessen zur produktion...

Entwicklung vonFermentationsprozessen zur Produktion

rekombinanter Antikörperfragmentein Pichia pastoris

und Nicotiana tabacum.

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der

Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des

akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte

Dissertation

von

Diplom-Biologe

Stephan Hellwigaus Birkesdorf jetzt Düren

Berichter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. F. Kreuzaler

Universitätsprofessor Dr. Ing. W. Hartmeier

Tag der mündlichen Prüfung: 23. August 2000

i

1 Einleitung ............................................................................................................................................1

1.1 Antikörper und Antikörperfragmente...............................................................................................1

1.1.1 Rolle, Aufbau und Struktur von Antikörpern ..........................................................................1

1.1.2 Modifizierte Antikörper und Antikörperfragmente .................................................................2

1.1.3 Bedeutung rekombinanter Antikörper und Antikörperfragmente ...........................................4

1.2 Expressionssysteme für rekombinante Proteine...............................................................................4

1.2.1 Produktion rekombinanter Proteine in Bakterien ....................................................................5

1.2.2 Produktion rekombinanter Proteine in tierischen Zellkulturen................................................6

1.2.3 Produktion rekombinanter Proteine in pflanzlichen Expressionssystemen.............................6

1.2.4 Produktion rekombinanter Proteine in Hefen ........................................................................12

1.3 Problemstellung..............................................................................................................................17

2 Material und Methoden ...................................................................................................................20

2.1 Material ..........................................................................................................................................20

2.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien ..............................................................................20

2.1.2 Verwendete Medien, Puffer und Lösungen ...........................................................................20

2.1.3 Enzyme und Reaktionskits ....................................................................................................20

2.1.4 Antikörper..............................................................................................................................20

2.1.5 Geräte, Apparaturen und Zubehör .........................................................................................21

2.1.6 Fermenter...............................................................................................................................22

2.1.6.1 Fermenter für die Pflanzensuspensionskultur ...................................................................22

2.1.6.2 Fermenter für die Kultivierung von Pichia pastoris .........................................................23

2.1.7 Verwendete Zellinien ............................................................................................................24

2.1.7.1 Zellinien von Nicotiana tabacum cv Bright-Yellow-2 (BY-2) .........................................24

2.1.7.2 Zellinien von Pichia pastoris ............................................................................................24

2.2 Molekularbiologische Methoden....................................................................................................25

2.2.1 PCR zur Bestimmung des Methanolverwertungs-Phänotyps von Pichia pastoris................25

2.2.2 Analytische Agarosegelelektrophorese .................................................................................26

2.3 Proteinchemische, naßchemische und immunologische Methoden ...............................................26

2.3.1 Herstellung von Proteinextrakten aus BY-2 Zellen...............................................................26

2.3.2 Bestimmung des Gesamtproteingehaltes von BY-2 Zellen...................................................27

2.3.3 Bestimmung des Phosphat-Gehalts in Fermentationsüberständen ........................................27

2.3.4 Bestimmung von Glukose, Fruktose und Saccharose in Fermentationsüberständen ............28

2.3.5 SDS-PAA Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Coomassie Brilliant Blue Färbetechnik ...28

2.3.5.1 Gelelektrophorese .............................................................................................................28

2.3.5.2 Coomassie Brilliant Blue Färbung ....................................................................................28

2.3.6 Western Blot ..........................................................................................................................29

2.3.7 ELISA....................................................................................................................................30

2.3.7.1 ELISA zum Nachweis des biscFv2429 in Pflanzensuspensionskultur .............................31

2.3.7.2 ELISA zum Nachweis von CEA-NA3 in Pichia pastoris – Überständen ........................32

2.3.7.3 ELISA zum Nachweis von scFv4813 in Pichia pastoris – Überständen..........................32

2.3.8 Konzentrationsbestimmung des biscFv2429 mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz ...33

2.3.9 Konzentrationsbestimmung des scFv4813 ............................................................................33

ii

2.3.9.1 Konzentrationsbestimmung von scFv4813 mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz 33

2.3.9.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung .................................................................... 34

2.3.9.3 Konzentrationsbestimmung durch Bradford-Färbung...................................................... 34

2.3.10 Reinigung von scFv4813 aus Pichia-Fermentationsüberstand............................................. 35

2.3.10.1Metall-Affinitätschromatographie.................................................................................... 35

2.3.10.2Kationenaustauscherchromatographie.............................................................................. 36

2.3.10.3Aufkonzentrierung des scFv4813..................................................................................... 36

2.3.10.4Gelchromatographie ......................................................................................................... 37

2.4 Kultivierung von Nicotiana tabacum cv BY-2.............................................................................. 37

2.4.1 Stammhaltung....................................................................................................................... 37

2.4.2 Vorkultur .............................................................................................................................. 37

2.4.3 Bestimmung von Frischgewicht, Trockengewicht und Zellanteil in BY-2 Kulturen ........... 38

2.4.4 Fermentation von Nicotiana tabacum cv BY-2 .................................................................... 38

2.4.4.1 Fermentationen im 5-Liter Maßstab................................................................................. 38

2.4.4.2 Fermentationen im 30-Liter Maßstab............................................................................... 38

2.5 Kultivierung von Pichia pastoris .................................................................................................. 39

2.5.1 Kryokulturen......................................................................................................................... 39

2.5.2 Vorkulturen........................................................................................................................... 40

2.5.3 Bestimmung von optischer Dichte, Frisch- und Trockengewicht ........................................ 40

2.5.4 Expression im Schüttelkolben .............................................................................................. 41

2.5.5 Fermentation von Pichia pastoris......................................................................................... 41

2.5.5.1 Vorbereitung und erste Phase der Fermentation .............................................................. 41

2.5.5.2 Glyzerin-Zulaufverfahren................................................................................................. 42

2.5.5.3 Methanol-Zulaufverfahren ............................................................................................... 43

2.5.5.4 Induktion mit Echtzeit-Methanol-Kontrolle..................................................................... 44

3 Ergebnisse und Diskussion.............................................................................................................. 46

3.1 Entwicklung eines Fermentationsprotokolls für Nicotiana tabacum cv BY-2.............................. 46

3.1.1 Wachstumskinetik von Nicotiana tabacum cv BY-2 im Rührreaktor .................................. 46

3.1.2 Nährstoffaufnahmekinetik .................................................................................................... 49

3.1.3 Kinetik der Expression des biscFv2429................................................................................ 50

3.1.4 Versuche zur Stimulation des CaMV 35SS Promotor........................................................... 52

3.2 Produktion von scFv4813 in Nicotiana tabacum cv BY-2............................................................ 54

3.2.1 Produktion von scFv 4813 im 5-Liter Maßstab .................................................................... 54

3.2.2 Maßstabsvergrößerung in den 30-Liter Maßstab.................................................................. 55

3.3 Entwicklung eines Fermentationsprotokolls für Pichia pastoris................................................... 57

3.3.1 Wachstumskinetik und Medienoptimierung im Schüttelkolben........................................... 57

3.3.2 Bestimmung des Methanolverwertungs-Phänotpys des Expressionsklons .......................... 59

3.3.3 Methanol-Toleranz von Pichia pastoris im Schüttelkolben ................................................. 60

3.3.4 Wachstumskinetik im Fermenter und Optimierung der Fermentationsstrategie .................. 61

3.3.5 Maßstabsvergrößerung in den 30-Liter Maßstab.................................................................. 64

3.3.6 Optimierung der Methanol-Zufuhrsteuerung........................................................................ 65

3.3.6.1 Messung der Methanolkonzentration bei manueller Steuerung der Zufuhrrate ............... 66

3.3.6.2 Steuerung der Methanolzufuhr über die Gelöstsauerstoffkonzentration .......................... 68

iii

3.3.6.3 Methanolanalytik und –steuerung in Echtzeit ...................................................................69

3.3.6.4 Glyzerinsupplementierung während der Induktionsphase ................................................70

3.4 Produktion von scFv4813 in Pichia pastoris .................................................................................75

3.4.1 Produktion von scFv4813 im 5-Liter Maßstab......................................................................75

3.4.2 Produktion des scFv4813 im 30-Liter Maßstab.....................................................................76

3.5 Reinigung von scFv4813 im Gramm-Maßstab ..............................................................................77

3.5.1 Zellabtrennung.......................................................................................................................77

3.5.2 Metall-Affinitätschromatographie .........................................................................................77

3.5.3 Ionenaustauscherchromatographie ........................................................................................79

3.5.4 Gelchromatographie ..............................................................................................................80

3.5.5 Konzentrationsbestimmung des scFv4813 ............................................................................81

3.5.6 Stabilität und Lagerung von scFv4813..................................................................................82

4 Abschlußdiskussion und Ausblick ..................................................................................................84

4.1 Produktion des scFv4813 durch Fermentation von Nicotiana tabacum cv BY-2..........................84

4.2 Produktion des scFv4813 durch Fermentation von Pichia pastoris...............................................86

4.2.1 Fermentationsstrategie...........................................................................................................86

4.2.1.1 Medium .............................................................................................................................86

4.2.1.2 Glyzerin-Zufuhrphase .......................................................................................................87

4.2.1.3 Methanol-Zufuhrphase ......................................................................................................88

4.2.1.4 Vergleich mit anderen in Pichia pastoris exprimierten scFvs ..........................................90

4.3 Reinigung und Lagerung des in Pichia produzierten scFv4813 ....................................................91

4.4 Vergleich der Expressionssysteme unter Einbeziehung ökonomischer Gesichtspunkte................92

5 Zusammenfassung ............................................................................................................................95

6 Literatur ............................................................................................................................................97

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Antikörper und Antikörperfragmente

1.1.1 Rolle, Aufbau und Struktur von Antikörpern

Der zentrale Vorgang in der Immunreaktion eines Vertebraten auf eine Infektion ist die

Erkennung des Erregers als Fremdstoff. Diese Erkennung erfolgt auf molekularer Ebene durch

die Bindung von Antikörpern an Antigene. Antikörper gehören zur Familie der Immunglobuline

(Ig) und werden als Hauptbestandteil der humoralen Immunantwort von Vertebraten durch B-

Lymphozyten gebildet, die jeweils nur Antikörper einer einzigen Spezifität auf ihrer Oberfläche

tragen. Der Kontakt eines B-Lymphozyten mit "seinem" Antigen löst die Proliferation und

Differenzierung dieser Zelle aus. Die im Rahmen dieser Reaktion entstehenden Plasmazellen

sezernieren nun eine große Zahl löslicher Antikörper der entsprechenden Spezifität in das Blut

und die lymphatischen Organe. Die Inaktivierung der Erreger erfolgt durch Komplexierung und

Markierung der Antigene, die wiederum weitere Komponenten des zellulären Immunsystems

aktiviert.

Die Vielfalt der Antikörper und die dadurch erreichbare Spezifität der Erkennungsreaktion

wird auf genetischer Ebene erreicht, indem die Gensequenzen, die für die Erkennungsstelle eines

Antikörpers kodieren, bei der Reifung der B-Lymphozyten aus einigen hundert Gensegmenten

zufällig zusammengesetzt werden.

Man unterscheidet 5 verschiedene Klassen oder Isotypen von Immunglobulinen, die sich

durch verschiedene schwere Ketten auszeichnen: IgA, IgG, IgM, IgD und IgE. Die einfachste

und im Plasma am stärksten vertretene Klasse ist das IgG. IgG Antikörper setzen sich aus vier

Polypeptidketten zusammen, zwei identischen leichten Ketten und zwei identischen schweren

Ketten. Die einzelnen Ketten sind modular aus ca. 110 Aminosäuren enthaltenden Domänen

aufgebaut, wobei die leichten Ketten jeweils zwei und die schweren Ketten jeweils vier solcher

Domänen enthalten (Schiffer et al., 1973). Die N-terminalen Domänen der Ketten enthalten

jeweils drei hypervariable Regionen (complementarity determining regions, CDRs) und werden

als variable Domänen (VL bzw. VH, entsprechend ihrer Zugehörigkeit zur leichten bzw.

schweren Kette) bezeichnet (Kabat et al., 1990). Die CDRs jeweils einer leichten und einer

schweren Kette bilden die eigentliche Antigenerkennungsstelle (Paratop) (Jones et al., 1986;

Verhoeyen et al., 1988). Abb. 1-1 zeigt den Aufbau eines IgG-Antikörpers aus den vier Ketten

Einleitung

2

sowie die Disulfidbrücken, die die schwere und leichte Kette und die beiden schweren Ketten

verbinden, und die Glykosylierungsstellen.

1.1.2 Modifizierte Antikörper und Antikörperfragmente

Mit der Einführung der Hybridoma-Technologie (Köhler und Milstein, 1975) die es erlaubt,

B-Lymphozyten zu immortalisieren und zu klonieren, wurde es möglich, gezielt größere Mengen

monoklonaler Antikörper mit definierter Spezifität zu produzieren. Damit gewannen Antikörper

rasch an Bedeutung für Nachweisverfahren in der Molekularbiologie und Biochemie sowie für

diagnostische und therapeutische Anwendung in der Medizin. Antikörper können, ohne ihre

Affinität oder Spezifität für das Antigen zu verlieren, kovalent an andere Moleküle gebunden

werden, wodurch eine ganze Generation von Antikörper-vermittelten Nachweisverfahren

entstanden ist. Beispiele dafür sind die Kopplung von Enzymen wie alkalische Phosphatase

(AP), an Fluoreszenzfarbstoffe oder andere Stoffe, die qualitative oder quantitative

Nachweisverfahren ermöglichen. Im therapeutischen Bereich lassen sich durch Gabe von

spezifischen Antikörpern Giftstoffe in der Blutbahn neutralisieren oder es lassen sich an einen

Antikörper gekoppelte Effektoren in die räumliche Nähe von z. B. Krebszellen dirigieren

(Colcher et al., 1990; Wong et al., 1995). Dabei ist die Größe eines Vollängen-IgG und seine

Eigenschaft, zwei Bindungsstellen für ein Epitop zu besitzen, teilweise überflüssig oder sogar

hinderlich, so daß kleinere, monovalente Fragmente interessante Alternativen darstellen.

IgG-Antikörper lassen sich proteolytisch in mehrere funktionelle Untereinheiten zerlegen

(Eyk et al., 1967), beispielsweise in die Fc und F(ab)'2–Fragmente (Parham, 1986), Fab-

Fragmente (Porter, 1959) oder Fv-Fragmente (Inbar et al., 1972; Hochman et al., 1973). Abb.

1-1 zeigt die von IgG abgeleiteten Antikörperfragmente.

Einleitung

3

S SS S

COOH

Antigen-Bindungsstelle

VariableDomänen

CDRs

KonstanteDomänen

IgG-Antikörper

Glykosylierungs-Stelle

"Linker"-Peptide

"diabody""bi-scFv"

Fv-FragmentFab-Fragment

S SS S

F(ab)'2-Fragment Fc-Fragment

"Linker"-peptid

"scFv"-Fragment

"Linker"-Peptid

"Linker"-Peptid

Abb. 1-1: IgG-Antikörper und abgeleitete Fragmente: Fc: Kristallisierbares Fragment; Fab:Antigen-bindendes Fragment; F(ab)'2: kovalent verbundenes Dimer des Fab, bivalent; Fv:Fragment der variablen Region, scFv: Einzelketten-Fragment der variablen Region; bi-scFv:bivalentes, bispezifisches Einzelkettenkonstrukt; diabody: aus zwei aggregierten Einzelkettenbestehendes, bivalentes, bispezifisches Konstrukt.

Das kleinste proteolytisch herstellbare antigenbindende Fragment, das Fv-Fragment, ist in

niedrigen Konzentrationen relativ instabil. Mit molekularbiologischen Methoden ist es aber

möglich durch Hinzufügen eines, 10-30 Aminosäuren langen Verbindungspeptids ("Linker") auf

genetischer Ebene ein Konstrukt herzustellen, das ein aus nur einer Kette bestehendes

Antikörperfragment kodiert, das bei geringer Größe (ca. 250 Aminosäuren) gute Spezifität und

Affinität für sein Epitop aufweist (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988; Winter und Milstein,

1991). Diese scFv-Fragmente (Abb. 1-1) sind im Vergleich zu den etwa gleich großen Fv-

Fragmenten stabiler und lassen sich molekularbiologisch gut handhaben. Weiterentwicklungen

der scFvs sind die ebenfalls auf genetischer Ebene erzeugten bivalenten und bispezifschen scFvs

(Mallender und Voss, 1994; Schumann, 1996; Fischer et al., 1999e), "minibodies" (Hu et al.,

1996) oder "diabodies" (Perisic et al., 1994; Adams et al., 1998; Atwell et al., 1999) (Abb. 1-1).

Auch Fusionsprodukte von Antikörperfragmenten mit z. B. Enzymen oder Toxinen lassen sich

Einleitung

4

heute auf genetischem Weg herstellen (Tai et al., 1990; Boleti et al., 1995; Harper et al., 1997;

Luo et al., 1998). Eine Verbesserung der Stabilität von scFvs und "diabodies" läßt sich über das

Einfügen von Cysteinresten auf genetischer Ebene erreichen, die Produkte können dann über

Disulfidbrücken quervernetzt werden (FitzGerald et al., 1997; Govardhan, 1999).

1.1.3 Bedeutung rekombinanter Antikörper und Antikörperfragmente

Polyklonale Seren und monoklonale Antikörper sowie die daraus abgeleiteten Fragmente und

Fusionsproteine (1.1.2) sind die Grundlage zahlreicher proteinchemischer und

molekularbiologischer Nachweisverfahren, beispielsweise für den "Enzyme-linked

immunosorbent assay" (ELISA) oder die Immunfärbung zur Detektion geblotteter Proteine bzw.

Nukleinsäuren (z. B. DIG-Markierung).

Daneben werden rekombinante Antikörperfragmente zunehmend für therapeutische

Applikationen genutzt, beispielsweise ein Fab-Fragment (Abb. 1-1), das bei Myasthenia-gravis-

Patienten die Acetylcholinrezeptoren vor dem Angriff körpereigener Antikörper schützt (Graus

et al., 1997), scFv-Toxin Fusionsproteine (Reiter et al., 1996) oder bispezifische Antikörper, die

einerseits bestimmte Tumorantigene binden und mit der zweiten Spezifität Killerzellen des

Immunsystems rekrutieren und aktivieren (Holliger et al., 1996; Helfrich et al., 1998;

Kipriyanov et al., 1998; Arndt et al., 1999). Die Vorteile von Antikörperfragmenten liegen bei

solchen Anwendungen in der besseren Durchdringung solider Tumore im Vergleich zu

Vollängenantikörpern. Dabei haben scFvs im Vergleich zu Fab-Fragmenten den Vorteil, sich bei

guter Tumorerkennung nicht in den Nieren anzureichern (Colcher et al., 1990). Die Stabilität

von scFvs in humanem Plasma ist ausreichend um einen therapeutischen Effekt zu erzielen, sie

läßt sich aber auch durch weitere Modifikationen verbessern (FitzGerald et al., 1997; Kipriyanov

et al., 1999).

1.2 Expressionssysteme für rekombinante Proteine

Zur Expression rekombinanter Proteine stehen verschiedene Expressionssysteme zur

Auswahl. Das Spektrum reicht von Bakterien über einfache Eukaryonten bis hin zu Pflanzen-,

Insekten- oder Säugerzellkulturen. Bei der Entscheidung für ein bestimmtes System spielt im

Labormaßstab häufig die erwartete Expressionsrate eine entscheidende Rolle, daneben Herkunft,

Eigenschaften und Komplexität des zu exprimierenden Proteins sowie die Verfügbarkeit

bestimmter Technologien.

Bei der Prozeßentwicklung für den industriellen Maßstab stehen andere Fragestellungen im

Vordergrund. Neben der Expressionsrate gehen z. B. der Jahresbedarf, Kosten für Medien und

Einleitung

5

Aufarbeitung/Reinigung des Produktes, die Patentsituation, die Durchführbarkeit aller

Arbeitsschritte im großen Maßstab und die Erfüllung entsprechender Zulassungsanforderungen

in die Überlegungen ein, um das günstigste, sicherste, am besten kontrollierbare und am

schnellsten zu einem marktfähigen Produkt führende Expressionssystem ist.

1.2.1 Produktion rekombinanter Proteine in Bakterien

Das gramnegative Bakterium Escherichia coli stellt den wichtigsten bakteriellen

Wirtsorganismus für die Expression von rekombinanten Proteinen dar. Dahinter steht eine große

Zahl von erfolgreichen Expressionen bis in den industriellen Maßstab und entsprechende

Erfahrung in der genetischen Manipulation und Kultivierung dieses Organismus (Baneyx, 1999).

Die genetische Information wird häufig auf autonom replizierten Plasmiden mit relaxierter

Kontrolle der Kopienzahl in die Bakterien eingebracht. Das führt unter Umständen bei

Kultivierung ohne Selektionsdruck zum Verlust der Plasmide. Außerdem ist die Größe der in

Plasmiden einsetzbaren Fremd-DNA nach oben begrenzt. Solche Probleme lassen sich durch

Verwendung von integrativen Vektoren bzw. durch Verwendung von auxotrophen

Wirtsstämmen mit Komplementation des defekten Gens auf dem Plasmid umgehen (Baneyx,

1999).

Ein vor allem bei der Verwendung starker Promotoren auftretendes Problem hängt mit der

engen Kopplung von Transkription und Translation bei Prokaryonten zusammen: Die

Fremdproteine liegen zwar in großer Menge, aber oftmals nicht in löslicher Form, sondern als

sogenannte Einschlußkörper ("inclusion bodies") vor. In diesem Fall wird die häufig mit großen

Ausbeuteverlusten und Zeit- und Kostenaufwand verbundene Rückfaltung zum löslichen Protein

notwendig.

Die Ausbildung von Disulfidbrücken erfolgt in E. coli infolge des reduzierenden Milieus des

Cytoplasmas und des Vorhandenseins von Thioredoxinen nicht oder nicht in der gewünschten

Weise. Ebensowenig kann E. coli posttranslationale Glykosylierungen ausführen.

Trotz dieser Probleme und Hindernisse stellt die Expression einfacher rekombinanter

Proteine in E. coli einen für industrielle Anwendungen und Jahresproduktionsmengen bis

1000 kg gangbaren Weg dar, was aber zu großen Teil darin begründet liegt, daß die Prozesse und

Arbeitsschritte im industriellen Maßstab bekannt und in regulatorischer Hinsicht abschätzbar

sind (Dr. Minuth, Bayer AG, pers. Mitteilung).

Einleitung

6

1.2.2 Produktion rekombinanter Proteine in tierischen Zellkulturen

Insekten- und Säugetierzellkulturen spielen vor allem für die Produktion von glykosylierten

Proteinen eine Rolle, da diese Systeme die größte Wahrscheinlichkeit für die korrekte

Glykosylierung von heterolog exprimierten Säugetierproteinen bieten (Altmann et al., 1999;

Kost und Condreay, 1999). Für die häufig verwendeten Zellinien wie z. B. Sf9 (Spodoptera

frugiperda) oder CHO ("Chinese hamster ovary") existieren Protokolle, die unter Verwendung

viraler Vektoren oder Plasmide die Expression rekombinanter Proteine im Maßstab bis ca. 1000 l

mit Ausbeuten von 1-20 mg·l-1 erlauben (Wurm und Bernard, 1999). Damit eignen sich tierische

Zellkulturen für Produkte, deren Jahresbedarf 200 kg nicht übersteigt (Dr. Minuth, Bayer AG,

pers. Mitteilung). Die Gefahr einer Kontamination des Produktes durch Humanpathogene ist

allerdings bei tierischen Zellkulturen besonders hoch und erfordert daher zusätzlichen Aufwand

bei der Reinigung des Produktes. Dadurch und durch die aufwendigere Technik und die teureren

Medien liegen die Produktionskosten für ein rekombinantes Protein in tierischer Zellkultur um

den Faktor 2-20 höher als bei mikrobiellen Expressionssystemen.

1.2.3 Produktion rekombinanter Proteine in pflanzlichen Expressionssystemen

Die Transformation von Pflanzen erfolgt hauptsächlich mit Hilfe von Agrobacterium

tumefaciens durch rekombinante Ti-Plasmide oder über ballistische Transformation mit Hilfe

von "particle guns". Als Promotoren werden häufig der 35S-Promoter des "Cauliflower Mosaic

Virus" (CaMV), davon abgeleitete Sequenzen oder andere pflanzliche Promotoren verwendet.

Mittlerweile sind organspezifische Promotoren bekannt, die beispielsweise die gezielte

Expression eines heterologen Proteins in Samen (Fiedler und Conrad, 1995; Parmenter et al.,

1995; Cramer et al., 1999) oder in Kartoffelknollen (Mason et al., 1992; Mason und Arntzen,

1995; Richter et al., 1996; Fiedler et al., 1997; Arakawa et al., 1999) erlauben. Dazu kommt die

Möglichkeit, Proteine in bestimmten Zellkompartimenten anzureichern, z. B. im Cytosol

(Schillberg et al., 1999, Spiegel, 1999 #218), in der Vakuole (Dombrowski und Raikhel, 1996;

Hoppmann, 2000), im endoplasmatischen Retikulum (ER) (Denecke et al., 1992; Vitale et al.,

1993, Spiegel, 1999 #218; Artsaenko et al., 1995), in den Chloroplasten (Staub und Maliga,

1992) oder in den Apoplasten zu sekretieren (Schillberg et al., 1999; Ziegler et al., 2000). Häufig

zeigt sich, daß unabhängig vom Promotor die Akkumulation im ER besonders hohe Ausbeuten

ergibt (Fiedler et al., 1997).

Die Hauptvorteile von Pflanzen als Expressionssystem zur Produktion rekombinanter

Proteine liegen in der preisgünstigen Kultivierung von Pflanzen im Gewächshaus- oder

Freilandanbau und den praktisch unbegrenzten Möglichkeiten der Maßstabsvergrößerung der

Einleitung

7

Produktion (Ma und Hein, 1995b; Herbers und Sonnewald, 1999; Hood und Jilka, 1999; Fischer

et al., 1999c; Fischer et al., 1999d). In der Kultivierung, Ernte und Aufarbeitung selbst größter

Mengen Biomasse kann auf die im Nahrungsmittelbereich etablierte Prozessierungstechnologie

zurückgegriffen werden (Kusnadi et al., 1998), so daß in den letzten Jahren der Begriff

"Molecular Farming" geprägt wurde. Die Expression rekombinanter Proteine in Pflanzen hat

mehrere Ziele z. B. die Veränderung der Eigenschaften von Pflanzen oder Pflanzenteilen oder

die Produktion von industriellen Proteinen, Impfstoffen und Antikörpern.

Der Begriff "Industrielle Proteine" beschreibt Proteine, die in großen Mengen, aber nicht für

therapeutische Anwendungen benötigt werden. Dazu zählen beispielsweise Invertasen,

Amylasen, Proteasen, Phytasen und Zellulasen, aber auch nicht-enzymatische Proteine: (Pen et

al., 1992) zeigten die Expression einer bakteriellen Amylase in Tabaksamen und die direkte

Anwendbarkeit der transgenen Samen für die Stärkeverflüssigung. Als weitere Beispiele können

die Expression einer Phytase in Nicotiana tabacum (Tabak) (Verwoerd et al., 1995), in Glycine

max (Soja) (Denbow et al., 1998), und einer β−Glucanase in Hordeum vulgare (Gerste) (Jensen

et al., 1996). Die Expression von Avidin und von β-Glucuronidase (aus E. coli) in Zea mays

(Mais) (Kusnadi et al., 1998) wird bereits kommerziell.

Bei der Produktion therapeutisch eingesetzter Proteine spielen neben den ökonomischen

Vorteilen der Produktion in Pflanzen zwei Punkte eine wesentliche Rolle: Das Vorhandensein

eines komplexen eukaryontischen Proteinsyntheseapparates, der dem von tierischen Zellen in

vieler Hinsicht ähnlich ist, und das Nichtvorhandensein von Animal- oder Humanpathogenen,

das die Aufarbeitung und Qualitätskontrolle der rekombinanten Produkte erheblich einfacher und

günstiger macht (Herbers und Sonnewald, 1999; Fischer et al., 1999d).

Für die Produktion von Impfstoffen, die über den Verdauungstrakt aufgenommen werden,

bietet sich die Produktion in eßbaren Pflanzen an (Mason und Arntzen, 1995). Eßbare Impfstoffe

("edible vaccines") haben den Vorteil, daß ohne großen Aufwand hinsichtlich der Reinigung

oder Formulierung, ein zur Verabreichung geeignetes Produkt entsteht. Dadurch ließen sich

ausgesprochen preisgünstige Impfpräparate realisieren. Verschiedene virale Antigene wurden

bereits in Pflanzen exprimiert und auf ihre Wirksamkeit bei Tieren getestet (Mason et al., 1996;

Yusibov et al., 1997; Modelska et al., 1998), in der Humanmedizin befinden sich in Kartoffeln

und Mais produzierte bakterielle Antigene, z. B. das Choleratoxin (Arakawa et al., 1999) und das

hitzelabile E. coli Enterotoxin (Mason et al., 1998) sowie ein in Lupine und Salat (Lactuca

sativa) exprimiertes Hepatitis B-Oberflächenantigen (Mason et al., 1992; Kapusta et al., 1999) in

präklinischen bzw. klinischen Phase-I Studien (Hood und Jilka, 1999).

Einleitung

8

Die Produktion von Antikörpern in Pflanzen (Hiatt et al., 1989; Düring et al., 1990; Fischer

et al., 1999c) ist neben der Vermittlung von Resistenzen durch die Herstellung von Antikörpern

zur passiven Immunisierung motiviert (Hiatt und Ma, 1992; Ma und Hein, 1995b; Fischer et al.,

1999d). Die besonderen Vorteile der pflanzlichen Expressionsysteme liegen dabei in der

korrekten Expression komplexer Antikörper, wie anhand von auf genetischer Basis erzeugten

Fv-Antikörpern (Benvenuto et al., 1991), scFv-Antikörpern (Fecker et al., 1996; Fiedler et al.,

1997; Schillberg et al., 1999), bispezifischen Antikörpern (Fischer et al., 1999e), Fab-

Antikörpern (De Wilde et al., 1998; De Neve et al., 1999), Vollängen IgG Antikörpern (Hiatt et

al., 1989; Schillberg et al., 1999; Fischer et al., 1999f), sekretorischen IgA-Antikörpern (Ma et

al., 1994; Ma et al., 1995a) und Antikörper-Fusionsproteinen (Spiegel et al., 1999) gezeigt

wurde. Ein Grund dafür ist die offensichtliche strukturelle und funktionelle Homologie

pflanzlicher Chaperone zum BiP ("Binding Protein") aus Säugetieren (Denecke et al., 1991;

Fontes et al., 1991). Die Einsetzbarkeit solcher in Pflanzen erzeugter Antikörper wurde anhand

eines in Tabak produzierten murinen Antikörpers gegen ein Streptococcus mutans

Adhäsionsprotein bereits gezeigt: Der rekombinante Antikörper war im Mund von Probanden

mehrere Tage stabil und verhinderte die Kolonisierung dentaler Oberflächen durch den

Karieserreger (Ma et al., 1998). Ein in Glycine max produzierter Antikörper gegen Herpes

simplex verhinderte im Mausmodell die Bildung von Läsionen und die Ausbreitung des Virus

(Zeitlin et al., 1998), die Einsatzfähigkeit eines in Nicotiana tabacum produzierten Antikörpers

gegen ein Darmkrebs-assoziiertes Oberflächengantigen wird noch untersucht (Verch et al.,

1998). Vaquero et al. beschrieben die Herstellung und Charakterisierung eines therapeutisch

relevanten, chimären Vollängen-Antikörpers und eines davon abgeleiteten scFv in Nicotiana

tabacum durch transiente Expression in Blattmaterial (Vaquero et al., 1999). Die Eignung von

Reis, Reis-Suspensionskulturen und Weizen zur Produktion therapeutisch relevanter

Antikörperfragmente ist ebenfalls beschrieben (Torres et al., 1999; Stoger et al., 2000).

Neben intakten Pflanzen spielen Pflanzensuspensionskulturen für die Expression

rekombinanter Proteine eine Rolle. Pflanzenteile, typischerweise kreisförmige Ausstiche aus

Blättern ("leaf disks"), werden oberflächensterilisiert und auf für pflanzliche Gewebekulturen

geeigneten festen, Nährböden ausgelegt. Nach Einstellung bestimmter Pflanzenhormonkonzen-

trationen entstehen aus den Blattscheiben undifferenziert wachsende Zellklumpen, sog. "Kalli".

Das Wachstum erfolgt dabei heterotroph, als Kohlenstoff- und Energiequelle werden z. B.

Saccharose, Maltose oder Glukose in 1-4prozentiger Ausgangskonzentration verwendet.

Pflanzensuspensionskulturen werden erzeugt, indem solche Kalli in Flüssigmedien überführt und

unter Schütteln inkubiert werden (Scragg, 1997). Die Zellen teilen sich weiter, und aus den 3-10

Einleitung

9

mm großen Kalli entstehen unter Einwirkung von Scherkräften Suspensionen von Aggregaten

von ca. 0.1 bis 3 mm, die aus ca. 2-100 Zellen bestehen (Taticek et al., 1991; Scragg, 1997). Die

Größe dieser Aggregate ist art- und zellinienspezifisch und kann sich mit fortgesetzter

Subkultivierung in Flüssigkultur hin zu kleineren Aggregaten entwickeln. Die einzelnen Zellen

weisen sphärische bis langgestreckte Formen mit Durchmessern von bis zu 50 µm und Längen

bis ca. 300 µm auf.

Das Wachstum von Pflanzenzellkulturen ist im Vergleich zu mikrobiellen Systemen

langsam. Bei Generationszeiten oberhalb von 24 h sind entsprechend lange Kultivierungszeiten

von ca. 7-21 Tagen erforderlich. Durch die starke Wasseraufnahme und Vakuolisierung der

Pflanzenzellen gegen Ende der Wachstumsphase werden hohe Zelldichten bis ca. 300 g·l-1

(Frischgewicht) erreicht, das entpricht einem Feststoffgehalt um 50 %. Aufgrund des langsamen

Wachstums liegt der trockengewichtsspezifische Sauerstoffbedarf von Pflanzensuspensions-

kulturen bei etwa 0,2 bis 0,6 mmol·g-1·h-1, das entspricht bei Trockenmassekonzentrationen von

maximal 10-20 g·l-1 einer Sauerstoffübertragungsrate von maximal 12 mmol·l-1·h-1 (Singh und

Curtis, 1995). Das ist im Vergleich zu den für mikrobielle Fermentationen notwendigen

Sauerstoffübertragungsraten von bis zu 90 mmol·l-1·h-1 (Taticek et al., 1991) wenig, und

ermöglicht die Prozessführung mit Begasungsraten unter 0,3 l·l-1·min-1 und bei niedrigen

Rührerdrehzahlen.

Im Schüttelkolben stellen diese Rahmenbedingungen kein Problem dar, bei der

Maßstabsvergrößerung in den Fermenter ist es aber nötig, diesen gegenüber Mikroorganismen

stark abweichenden Anforderungen Rechnung zu tragen. Der niedrige Sauerstoffbedarf macht

das Zerschlagen eingetragener Luftblasen zur Oberflächenvergrößerung unnötig. Das kommt der

Rücksichtnahme auf die infolge der Größe möglicherweise bestehende Scherempfindlichkeit der

Zellen entgegen und führt dazu, daß nur selten die in der Mikrobiologie üblichen Turbinenrührer

eingesetzt werden. Statt dessen kommen großflächige Blattrührer oder ähnliche Systeme mit

vergleichsweise niedrigen Drehzahlen zum Einsatz, oder die Durchmischung wird durch

alternative Reaktorbauweisen erreicht. Tabelle 1-1 gibt einen Überblick über die verwendeten

für Pflanzensuspensionskulturen verwendeten Bioreaktortypen:

Einleitung

10

Tabelle 1-1: Beispiele für mit Pflanzensuspensionskulturen verwendete Reaktortypen

Organismus Reaktortyp Maßstab [l] LiteraturstelleDigitalis lanata Rührkessel, Gitterrührer 27 (Spieler et al., 1985)

Echinacea purpurea,Rauwolfia serpentina

Rührkesselkaskade,INTERMIG -Rührer

75000 (Rittershaus et al., 1989)

Dioscorea deltoidea,Catharanthus roseus

Rührkessel, Rushton-Scheibenblattrührer

14 (Drapeau et al., 1986)

Catharanthus roseus Rührkessel, Helixrührer 11 (Jolicoeur et al., 1990)

Catharanthus roseus Rührkessel, Rushton-Scheibenblattrührer

7,5 (Leckie et al., 1991)

Lithospermumerythrorhizon

Drehtrommelreaktor 1 (Tanaka et al., 1983)

Digitalis lanata Airlift Schlaufenreaktor 20 (Spieler et al., 1985)

Eschscholtzia californica Airlift Schlaufenreaktor 2,3 (Byun und Pedersen, 1994)

Mittlerweile hat man erkannt, daß die Annahme, Pflanzensuspensionskulturen seien

scherkraftempfindlich, nicht auf alle Kultivare zutrifft. Vielmehr sind die meisten Zellinien trotz

der Größe der Zellen und Aggregate schertolerant (Taticek et al., 1991; Doran, 1993).

Problematischer als die Scherkraftempfindlichkeit ist die Durchmischung der Kulturen, die

gegen Ende einer Fermentation einen hohen Feststoffanteil und entsprechend hohe apparente

Viskositäten aufweisen. Im Falle von Rührreaktoren erfordert dies den Einsatz relativ

großflächiger, langsam drehender Rührer (Hooker et al., 1990; Kim et al., 1991; Scragg, 1991;

Scragg, 1992; Doran, 1993; Singh und Curtis, 1995). Die Steuerung der Belüftungsrate von

pflanzlichen Zellkulturen ist insofern kritisch, als die Löslichkeit des Pflanzenhormons CO2 bei

zu hoher Belüftungsrate verringert wird, was zu schlechterem Wachstum führt (Smart und

Fowler, 1981; Ducos und Pareilleux, 1986).

Das ursprüngliche Interesse an Pflanzensuspensionskulturen lag weniger in der Expression

rekombinanter Proteine als in der Mikropropagation von Nutzpflanzen (aus Suspensionskulturen

können Kalli und daraus wiederum intakte Pflanzen regeneriert werden) und der Gewinnung von

Sekundärmetaboliten und Aromen (Dörnenburg und Knorr, 1995; Scragg, 1997). Einige

Beispiele für die Produktion von Sekundärmetaboliten in Pflanzensuspensionskulturen sind in

Tabelle 1-2 genannt.

Einleitung

11

Tabelle 1-2: Beispiele für die Produktion von Sekundärmetaboliten in Pflanzenzellkulturen

Organismus Produkt Anwendungsbereich Literaturstelle

Catharanthus roseus Ajmalicin Therapeutikum(Steroidvorstufe)

(Drapeau et al., 1986)

Dioscorea deltoidea Diosgenin Therapeutikum(Bluthochdruck)

(Drapeau et al., 1986)

Eschscholtzia californica Benzophenanthridin Therapeutikum(Zahnmedizin)

(Byun und Pedersen, 1994)

Fragaria ananassa Anthocyanin Farbstoff (Sato et al., 1996)

Taxus spec. Taxol (Paclitaxel) Therapeutikum(Cytostatikum)

(Ketchum et al., 1999)

Mittlerweile setzt sich die Erkenntnis durch, daß Pflanzensuspensionskulturen auch ein

attraktives Expressionssystem für komplexe rekombinante Proteine, insbesondere für

pharmazeutische Anwendungen sein können. Die Gründe dafür sind neben den bereits

angeführten allgemeinen Vorteilen pflanzlicher Expressionssysteme die Möglichkeit, große

Mengen an Biomasse in Fermentern schnell, unter exakt reproduzierbaren Bedingungen sowie

unter Einhaltung strenger Qualitätsmaßstäbe (GMP) produzieren zu können. Diese Erkenntnis

und das zunehmende Interesse an der Expression rekombinanter Proteine in

Pflanzensuspensionskulturen spiegelt sich in der neueren Literatur wieder (Tabelle 1-3).

Tabelle 1-3: Beispiele für die Produktion von rekombinanten Proteinen in Pflanzenzellkulturen

Organismus Produkt Anwendungsbereich Literaturstelle

Glycine max Phytase Viehfutterverbesserung(Phosphatverfügbarkeit)

(Li et al., 1997)

Oryza japonica hAAT Therapeutikum (Elastasehemmer) (Terashima et al., 1999)

Nicotiana tabacum mGM-CSF Therapeutikum (Cytokin) (Lee et al., 1997)

Nicotiana tabacum cv BY-2 GUS Reporterenzym (Shinmyo et al., 1998)

Nicotiana tabacum cv BY-2 Invertase Reporterenzym (des Molles et al., 1999)

Nicotiana tabacum scFv Modellantikörper (Firek et al., 1993)

Nicotiana tabacum rAk Modellantikörper (Magnuson et al., 1996)

Nicotiana tabacum cv BY-2 rAb Modellantikörper (Sharp und Doran, 1999)

Nicotiana tabacum cv BY-2 biscFv Virusresistenz in N. tabacum (Fischer et al., 1999e)

Nicotiana tabacum cv SR-1 rAK Virusresistenz in N. tabacum (Fischer et al., 1999f)

Nicotiana tabacum Ricin Therapeutikum (Sehnke und Ferl, 1999)

Nicotiana tabacum Bryodin Therapeutikum

(Immunotoxin, RIP)

(Francisco et al., 1997)

Eine besondere Rolle kommt den Suspensionskulturen von Nicotiana tabacum zu,

insbesondere der seit 1972 als Suspensionskultur geführten Zellinie BY-2. Dieses Nikotin-freie

Kultivar wächst mit einer Generationszeit von unter 24 h relativ schnell und mit hoher

Synchronizität der Zellteilung. Zudem bildet BY-2 nur kleine Aggregate von ca. 1 mm

Einleitung

12

Durchmesser, so daß verfahrenstechnisch einfach zu behandelnde, feine Suspensionen vorliegen

(Nagata et al., 1992). Obwohl BY-2 Zellen sich nicht mehr zu intakten Pflanzen regenerieren

lassen, machen diese Vorteile sowie die leichte Transformierbarkeit durch einfache Co-

Kultivierung mit rekombinanten Agrobakterien (Fischer et al., 1999e) diese Zellinie zu einem

geeigneten Objekt für die weitere Entwicklung von Applikationen der Pflanzensuspensions-

kultur.

Wie in intakten Pflanzen zeigte sich auch in Suspensionskulturen, daß die Retention der

rekombinanten Proteine im ER über die C-terminalen Signalpeptide H/R/KDEL die höchsten

Ausbeuten erbringen (Fischer et al., 1999a; Doran, 2000). Die erreichten Expressionsraten sind

allerdings mit 0,2 bis 2 % des Gesamtproteins noch unbefriedigend. Promotorstudien zeigen, daß

z. B. in Suspensionskulturen von Nicotiana tabacum der 35S Promotor aus CaMV oder der

davon abgeleitete stärkere 35SS (Kay et al., 1987) übertroffen werden kann (Ni et al., 1995;

Fiedler et al., 1997; Shinmyo et al., 1998).

Pflanzen und pflanzliche Suspensionskulturen stellen damit insbesondere für die Produktion

komplexer oder glykosylierter Proteine (Lerouge et al., 1998; Doran, 2000) eine interessante

Alternative dar, die durch die attraktiven Perspektiven hinsichtlich der Maßstabsvergrößerung

zusätzliche Vorteile aufweist. Die mit Pflanzen bisher gezeigten spezifischen Ausbeuten

rekombinanter Proteine bedürfen allerdings für den industriellen Einsatz noch der Verbesserung.

1.2.4 Produktion rekombinanter Proteine in Hefen

Hefen bieten als Wirtsorganismen für die Überexpression rekombinanter Proteine

wesentliche Vorteile: Die Kultivierung von Hefen ist in der Regel einfach. Sie stellen im

Vergleich zu Zellinien höherer Organismen geringe Ansprüche an das Medium und die

Kultivierungsbedingungen. Hefen lassen sich im wesentlichen in Rührkessel-Bioreaktoren mit

Standardausstattung kultivieren. Bei der Maßstabsvergrößerung von Produktionsprozessen kann

auf jahrzehntelange Erfahrungen aus der Nahrungsmittelindustrie zurückgegriffen werden.

Einzellige Organismen lassen sich leicht klonieren und erlauben daher, mit wohldefinierten

Genpools zu arbeiten. Zudem sind Hefen genetisch gut untersucht und Protokolle zu ihrer

Transformation etabliert. Wesentliche Fortschritte in der Aufklärung der genetischen Abläufe in

Eukaryonten wurden an Saccharomyces cerevisiae gemacht (Buckholz und Gleeson, 1991).

Neben S. cerevisiae haben sich aber auch andere Hefen als Expressionssysteme etabliert. Tabelle

1-4 nennt wesentliche Beispiele:

Einleitung

13

Tabelle 1-4: Beispiele für die Verwendung von Hefe als Expressionssysteme

Spezies Promotor Literaturstelle

Saccharomyces cerevisiae GALx (Galaktose-induziert)GAPDH (konstitutiv)

(Clare und Romanos, 1995; Gellissen undHollenberg, 1997; Muller et al., 1998)

Schizosaccharomyces pombe NMT1 (konstitutiv) (Lu et al., 1997)

Pichia pastoris AOX1 (Methanol-induziert)GAP (konstitutiv)

(Sreekrishna et al., 1997; Higgins und Cregg,1998)

Pichia stipitis XYL1 (Xylose-induziert) (Piontek et al., 1998)

Pichia methanolica AUG1 (Methanol-induziert) (Raymond et al., 1998)

Hansenula polymorpha MOX (Methanol-induziert) (Gellissen und Hollenberg, 1997)

Kluyveromyces lactis LAC4 (Lactose-induziert) (Swinkels et al., 1993)

Schwanniomyces occidentalis AMY1 (Stärke-induziert) (Piontek et al., 1998)

Candida boidinii AOD1 (Methanol-induziert) (Sakai et al., 1996)

Yarrowia lipolytica TEF (konstitutiv), XPR2(Pepton-induziert)

(Park et al., 1997; Muller et al., 1998)

verändert, nach (Lin Cereghino und Cregg, 1999)

Mit den Vorteilen der einfachen Handhabbarkeit eines Einzeller-Systems verbindet sich bei

Hefen das Vorhandensein eines eukaryontischen Proteinsyntheseapparates. Hefen können die

notwendigen Schritte zur korrekten posttranslationalen Modifizierung von Proteinen höherer

Organismen durchführen. Dazu gehören proteolytische Prozessierung, Faltung, Bildung von

Disulfidbrücken und Glykosylierung (Luo et al., 1995; Eckart und Bussineau, 1996; Ikegaya et

al., 1997; Miele et al., 1997; Lin Cereghino und Cregg, 1999; Markaryan et al., 1999).

Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris hat in den letzten Jahren besondere Aufmerksamkeit

als Expressionssystem erhalten. Das ursprüngliche Interesse der Forschung an Pichia richtete

sich auf die Produktion von Einzellerprotein auf der Basis von Methanol (Higgins und Cregg,

1998). Die Entdeckung des extrem starken, methanol-abhängigen AOX1-Promotors führte dann

zur Entwicklung des Pichia pastoris Expressionssystems, das von Invitrogen (Carlsbad, CA,

USA) kommerziell erhältlich ist. Dieser Promotor steuert in Pichia die Expression des ersten

Enzyms in der Methanol-Verwertungskette, der Alkoholoxidase1, kurz AOX1 (EC 1.1.3.13).

Dieses Enzym katalysiert in besonderen Organellen, den Peroxisomen die Oxidation von

Methanol zu Formaldehyd. FAD dient dabei als Cofaktor, das anfallende toxische

Wasserstoffperoxid wird durch Katalase entgiftet. Das ebenfalls toxische Produkt Formaldehyd

wird über die Kopplung an Glutathion "entschärft" und weiter verwertet (Ellis et al., 1985).

Die Expressionsrate der Alkoholoxidase1 in Pichia ist extrem hoch: Beim Wachstum auf

Methanol als einziger Kohlenstoffquelle hat AOX1 einen Anteil von 30% am gesamten löslichen

Protein (Couderc und Baratti, 1980). Neben der Alkoholoxidase1 existiert die Alkoholoxidase2,

die zwar weitgehend homolog ist, aber aufgrund eines schwächeren Promotors in geringerer

Einleitung

14

Menge exprimiert wird. Sie ermöglicht beim Ausfall des AOX1-Gens trotzdem eine - wenn auch

verlangsamte – Verwertung von Methanol (Ellis et al., 1985; Cregg et al., 1989).

Das Pichia-Expressionssystem basiert im wesentlichen auf der Verwendung des AOX1-

Promotors, auch wenn mittlerweile einige andere Promotoren untersucht worden sind (Tschopp

et al., 1987; Waterham et al., 1997). Dabei werden im Gegensatz zum häufig verwendeten

autonom replizierten 2µ-Plasmid bei Saccharomyces cerevisiae integrative Vektoren verwendet.

Die Klonierungsschritte und Amplifikation der Plasmide werden in E. coli durchgeführt.

Als Selektionsmarker dient in den meisten Fällen das Gen der Histidinol-Dehydrogenase

(HIS4), das im Wirtsstamm GS115 mutiert ist, so daß eine Histidin-Auxotrophie entsteht, die

durch Integration des Vektors komplementiert wird (Higgins und Cregg, 1998). Das kanr- Gen

aus Tn903, das in P. pastoris Resistenz gegen das Antibiotikum G418 vermittelt, dient in einigen

Vektoren zur Selektion auf die Integration mehrerer Expressionskassetten. Eine direkte Selektion

der Transformanten auf G418-Resistenz ist allerdings nicht möglich. Zusätzlich wurden in den

letzten Jahren Vektoren entwickelt, die auf der Vermittlung einer Resistenz gegen das

Antibiotikum Zeocin basieren sowie Vektoren, die den konstitutiven GAP Promotor verwenden.

Üblicherweise existieren die Vektoren in Ausführungen mit und ohne Sekretionssignal, wobei in

erster Linie das Sekretionssignal des S. cerevisiae alpha-Paarungsfaktors verwendet wird. Einen

Überblick über die kommerziell erhältlichen, gebräuchlichen Vektoren gibt Tabelle 1-5.

Tabelle 1-5: Gebräuchliche Pichia-Expressionsvektoren

Bezeichnung Selektions-marker

Promotor Bemerkungen

pPIC3(K) his4 AOX1 Intrazelluläre Expression. K: Multi-copy-Selektion überG418-Resistenz möglich.

pPIC9(K) his4 AOX1 Enthält α-Faktor Sekretionssignal aus S. cerevisiae. K:Multi-copy-Selektion über G418-Resistenz möglich.

pPICZ(α) bler AOX1 Kleiner als pPIC3/pPIC9-Vektoren. Mit und ohne α-Faktor Sekretionssignal. Direkte Selektion und Multi-copy-Selektion über Zeocin-Resistenz.

pGAPZ(α) bler GAP Konstitutive Expression. Kleiner als pPIC3/pPIC9-Vektoren. Mit und ohne α-Faktor Sekretionssignal.Direkte und Multi-copy-Selektion über Zeocin-Resistenz.

Einleitung

15

Die Charakteristika der kommerziell erhältlichen Wirtsstämme sind in Tabelle 1-6

wiedergegeben:

Tabelle 1-6: Pichia-Wirtsstämme

Bezeichnung Genotyp Bemerkungen

GS115 his4 Standard-Wirtsstamm. Vektoren der pHIL, pPIC3- und pPIC9

Familien

SMD1168 his4, pep4 Protease-defizienter Wirtsstamm. Vektoren wie oben. Durch

Eliminierung von pep4 fallen weitere Proteasen aus, die durch pep4

aktiviert werden.

X33(Y-11430)

Wildtyp Vektoren der pPICz-Familie (Selektion auf Zeocin-Resistenz)

KM71 his4, aox1::arg4 Langsame Verwertung von Methanol

Mit dem Pichia-Expressionssystem sind in den letzten Jahren mehr als 300 Proteine

überexprimiert worden. Die Herkunft der exprimierten Gene umfaßt dabei das gesamte

Spektrum der belebten Welt und die Art der exprimierten Proteine reicht von komplexen

Hepatitis-B Oberflächenantigenen (Cregg et al., 1987) über kleine Peptidhormone (Clare et al.,

1991b) bis hin zu industriellen Enzymen (Juge et al., 1996). Eine Reihe von Proteinen konnte

dabei im Grammbereich (bezogen auf 1 Liter Kulturvolumen) exprimiert werden. Tabelle 1-7

faßt die bisher besten Expressionsergebnisse zusammen.

Die in Tabelle 1-7 genannten Beispiele stellen die Obergrenze der bisher erzielten

Expressionsraten dar. Für das Gros der in Pichia exprimierten Proteine werden dagegen

Expressionsraten im Bereich um 50 mg/L beschrieben. Am unteren Ende der Skala ist die

Expression einer Reihe von Proteinen im Bereich <1 mg·l-1 dokumentiert (Ohsawa et al., 1995;

Weiss et al., 1995; Pflanz et al., 1999), daneben existieren Fälle, in denen gar keine Expression

nachgewiesen werden konnte, obwohl die Transkription im Northern-Blot nachweisbar war, so

z. B. bei einem Konstrukt, das die VH und CH1 Domänen eines humanen Antikörpers umfaßt (M.

Stassen, Universität Maastricht, persönliche Mitteilung).

Hinsichtlich ihrer qualitativen Eigenschaften unterscheiden sich viele in Pichia

überexprimierte Proteine nicht von den entsprechenden nativen Proteinen (Fierobe et al., 1997;

Nilsen et al., 1997; Murphy et al., 1998; Han und Lei, 1999; Sun et al., 1999). Bei einigen

Proteinen verursachen Pichia-eigene Proteasen Probleme durch Degradation des Produkts noch

während der Expression. Zum Teil ließen sich diese Probleme durch Expression bei niedrigem

pH (Scorer et al., 1993; Werten et al., 1999), Zusatz von Kasein-Totalhydrolysat (Clare et al.,

1991b; Clare et al., 1998; Werten et al., 1999) oder Verwendung des proteasedefizienten

Einleitung

16

Wirtsstammes SMD1168 (siehe Tabelle 1-6) (Brankamp et al., 1995; White et al., 1995)

vermeiden, zum Teil waren solche Maßnahmen aber auch erfolglos (Juge et al., 1996; Henry et

al., 1997; Holmquist et al., 1997).

Tabelle 1-7: Mit dem Pichia-Expressionssystem erzielte Ergebnisse

intrazellulär/

sekretiert

Produkt

(Herkunftsorganismus)

Expressionslevel

[g·l-1]

Literaturstelle

I Tetanustoxin Fragment C

(Clostridium tetani)

12 (Clare et al., 1991a)

I Hydroxynitril-Lyase

(Hevea brasiliensis)

22 (Hasslacher et al., 1997)

I Hüllprotein (HIV) 1,25 (Scorer et al., 1993)

I Pertactin (Bordatella pertussis) 3,0 (Romanos et al., 1991)

I Tumor-Nekrosefaktor (human) 10 (Sreekrishna et al., 1989)

S α-Amylase (Bacillus licheniformis) 2,5 (Paifer et al., 1994)

S Koagulationshemmer

(Ornithodoros moubata)

1,7 (Laroche et al., 1994)

S Bm86 Antigen (Boophilus microplus) 1,5 (Rodriguez et al., 1994)

S Invertase (Saccharomyces cerevisiae) 2,3 (Tschopp et al., 1987)

S Kunitz Proteaseinhibitor (human) 1,0 (Van Nostrand et al., 1994)

S Synthetische Gelatine (Mus spec.) 14,8 (Werten et al., 1999)

S scFv (α-CEA) 1,2 (Freyre et al., 2000)

Auch bezüglich der Glykosylierung sind erhebliche Unterschiede zwischen verschiedenen

Proteinen gefunden worden: Pichia erkennt O- und N-Glykosylierungstellen (Heimo et al.,

1997) und ist in der Lage, Glykosylierungen durchzuführen, die denen der nativen Proteine sehr

ähnlich sind (Holmquist et al., 1997; Murphy et al., 1998; Han und Lei, 1999; Sun et al., 1999).

Die in Pichia festgestellten Glykosylierungen waren in einigen Fällen unterschiedlich von den in

Saccharomyces beobachteten (Miele et al., 1997), da Pichia scheint weniger zur

Hyperglykosylierung zu neigen scheint. In einigen Fällen wurde aber auch Hyperglykosylierung

beobachtet (Scorer et al., 1993; Hellwig et al., 1999), die zum Teil dazu führte, daß das

rekombinante Protein von Antikörpern, die gegen das native Gegenstück erzeugt wurden, nicht

erkannt wurde (Clare et al., 1998). Es ist in solchen Fällen möglich, die Glykosylierungstellen

auf genetischer Ebene durch ortsgerichtete Mutagenese auszuschalten (Munshi et al., 1997).

Die Fermentation von P. pastoris ist insofern einfach, als das der Organismus prinzipiell

keine besonderen Ansprüche an die Ausstattung des Reaktors stellt und auf billigen

Einleitung

17

synthetischen Medien wächst (Zhu et al., 1995; Stratton et al., 1998). Mit Glyzerin oder

Methanol als Kohlenstoffquelle lassen sich im Zulaufverfahren extrem hohe Zelldichten von bis

zu 450 g Frischgewicht pro Liter Kulturvolumen erreichen (Siegel und Brierley, 1989; Clare und

Romanos, 1995; Kim et al., 1997).

Die Fermentationsstrategie folgt in der Regel den im Handbuch der Fa. Invitrogen gegebenen

Vorschlägen: Zunächst wird im ansatzweisen Verfahren mit Glyzerin als Kohlenstoffquelle

fermentiert, bis die vorgelegte Menge Glyzerin verbraucht ist, was am rapiden Ansteigen der

Gelöstsauerstoffkonzentration erkennbar wird. Zu diesem Zeitpunkt wird Glyzerin im

Zulaufverfahren in limitierender Rate zugefüttert, entweder für eine bestimmte Zeit oder bis eine

bestimmte Zelldichte erreicht ist. Anschließend wird das Zulaufverfahren zur Induktion auf

Methanol als einzige Kohlenstoffquelle umgestellt. Die Zufuhrrate von Methanol wird dabei

anhand von Erfahrungswerten langsam gesteigert. Um zu verhindern, daß Methanol zu toxischen

Konzentrationen akkumuliert, wird die Methanolzufuhr in regelmäßigen Abständen gestoppt und

die Zeit bestimmt, die bis zum Ansteigen der Gelöstsauerstoffkonzentration verstreicht. Liegt

diese Zeit über einem Wert von 30-60 s, wird die Methanolzufuhrrate anschließend gesenkt. Mit

dieser Strategie lassen sich Zufuhrraten, die in etwa im Bereich der kombinierten Verbrauchs-

und Verdunstungsraten liegen, realisieren. Abweichend von diesen Fermentationsstrategien sind

vereinzelt Pichia-Fermentationen im kontinuierlichen Verfahren (Ellis et al., 1985; Digan et al.,

1989; Sreekrishna et al., 1989) und Fermentationen im Zufuhrverfahren mit Mischungen von

Glyzerin und Methanol in verschiedenen Verhältnissen beschrieben (Sreekrishna et al., 1989;

Loewen et al., 1997; Sreekrishna et al., 1997; Katakura et al., 1998).

Diese Eigenschaften charakterisieren das Pichia Expressionssystem als ein System, mit dem

sich bestimmte Proteine speziell bei Einsatz etwas aufwendigerer Fermentationstechnik durchaus

in großen Mengen produzieren lassen. Das Problem bei der Erzeugung und Selektion von

Expressorklonen für bestimmte Proteine liegt offensichtlich aufgrund proteinspezifischer

Eigenschaften auf posttranskriptionaler Ebene.

1.3 Problemstellung

Antikörper und Antikörperfragmente spielen schon heute in den medizinischen und

biologischen Wissenschaftsbereichen eine wichtige Rolle als molekulare Werkzeuge, deren

Bedeutung der der Restriktionsenzyme gleichkommt. Zudem rücken Fortschritte in der

Humanisierung von Maus-Antikörpern, der Herstellung von Antikörperbibliotheken und der

Kopplung von Antikörpern mit den verschiedensten Effektoren Antikörper-basierende

Einleitung

18

Therapieformen in den Mittelpunkt des Interesses. Es kann mit Sicherheit angenommen werden,

daß die Zahl der Anwendungen ebenso wie der Maßstab und die Qualität, in dem rekombinante

Antikörper benötigt werden, in den nächsten Jahren noch steigen wird. Damit wird auch die

Erforschung preiswerter, sicherer und zuverlässiger Expressionssysteme erforderlich.

Im Rahmen dieser Arbeit galt es, einen single-chain-Fv Antikörper mit diagnostischer

Relevanz, der beispielhaft für die eingangs erläuterte Entwicklung steht, im Maßstab von 500 mg

zu produzieren und zu reinigen. Dazu sollten als Expressionssysteme die Hefe P. pastoris und

die N. tabacum cv BY-2 Zellkulturlinie verwendet und verglichen werden. Für beide Systeme

sollten Fermentationsstrategien entwickelt, die Prozesse auf Ausbeute und Wachstum untersucht

und optimiert und im 30-l Maßstab durchgeführt werden, um Aussagen über die Eignung dieser

Expressionssysteme im größeren Maßstab zu erhalten. Die Rahmenbedingungen sollten die

Produktion unter den Bedingungen der Guten Herstellungspraxis (GMP) zulassen, um die

Ergebnisse auf therapeutisch relevante Antikörperfragmente übertragen zu können. Die beiden

Expressionssysteme sollten hinsichtlich der volumetrischen Produktivität der Prozesse, des

erforderlichen Aufwands und ökonomischer Aspekte in verschiedenen Produktionsmaßstäben

vergleichend beurteilt werden. Abb. 1-2 zeigt den Ablauf der Promotionsarbeit.

Einleitung

19

Konzentration undStabilität

des scFv4813

Fermentation der Nicotiana-Zelllinie R1-25

Fermentationdes Pichia-Klons N55

Etablierung einerMethanol Online-Analytik

Scale-up in den30-L Maßstab

Versuche zur Stimulationder Expression

Expressionskinetik

Substrataufnahmekinetik

Wachstumskinetik

Entwicklung vonFermentationsstrategien fürNicotiana tabacum cv BY-2

Entwicklung vonFermentationsstrategien

für Pichia pastoris

Wachstumskinetik

Methanol-Toleranz

Medienoptimierung

Optimierung derMethanol-Zufuhrsteuerung

Scale-up in den30-L Maßstab

Transformation und Selektionvon Expressor-Klonen

bzw. -Zelllinien

Klonierung desscFv4813-Gens in

entsprechende Vektorenzur Transformation von

Nicotiana tabacum cv BY-2und Pichia pastoris

Entwicklung derZelllinie biscFv2429(Nicotiana tabacum)

��

Entwicklung desKlons PP599

(Pichia pastoris)

Entscheidung:Produktion in

Tabak oder Hefe

Untersuchungen zu “mixed-feed”Fermentationen

Entwicklung einerReinigungsstrategie

für scFv4813aus Pichia

Entwicklung derZelllinie R1-25

(Nicotiana tabacum)

Entwicklung desKlons N55

(Pichia pastoris)

Reinigung des scFv4813

Produktion des scFv4813

Abb. 1-2: Ablaufdiagramm der vorliegenden Promotionsarbeit: Die grau hinterlegten Schrittesind in dieser Dissertation beschrieben, die weiß hinterlegten Feldern stellen vorbereitendeArbeiten oder im Rahmen anderer Diplom- oder Promotionsarbeiten beschriebene Schritte dar,deren Ergebnisse als Ausgangspunkte für diese Arbeit weiter bearbeitet wurden.

Material und Methoden

20

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien

Alle Chemikalien und Fertiglösungen wurden mindestens mit dem Reinheitsgrad p.a.

verwendet und von folgenden Firmen bezogen: Serva (Heidelberg), Sigma (Deisenhofen),

BioRad (München), Boehringer (Mannheim), Pharmacia (Freiburg), GibcoBRL (Eggenstein),

Merck (Darmstadt), Fluka (Neu-Ulm), Roth (Karlsruhe), Novex (San Diego) und New England

Biolabs (Schwalbach).

Verbrauchsmaterialien stammten von Millipore (Eschborn), Eppendorf (Hamburg),

Whatman (Maidstone, England), USB/Amersham (Bad Homburg), Serva (Heidelberg), Schott

Glaswerke (Mainz), Zeiss (Oberkochen), Greiner (Solingen) und Roth (Karlsruhe).

2.1.2 Verwendete Medien, Puffer und Lösungen

Standard-Lösungen, Puffer und Medien wurden nach (Sambrook et al., 1989) oder (Ausubel

et al., 1994) mit entionisiertem Wasser hergestellt. Der pH-Wert der Lösungen wurde, wenn

nicht anders erwähnt, mit HCl bzw. NaOH eingestellt. Medien, Medienkonzentrate und –zusätze

wurden durch Autoklavieren (25 min, 121° C) oder durch Sterilfiltration (0.2 µm) sterilisiert.

2.1.3 Enzyme und Reaktionskits

Falls nicht anders angegeben wurden alle Enzyme und Kits inkl. Reaktionspuffer von der

Firma Boehringer (Mannheim) bezogen und nach Herstellerangaben eingesetzt.

2.1.4 Antikörper

Im Rahmen dieser Arbeit wurden für ELISA (2.3.7) oder Western Blot (2.3.6) die folgenden

monoklonalen Antikörper bzw. polyklonalen Seren verwendet:

• C-α-TMV: Polyklonale Huhn-anti-TMV Ak (Tabak-Mosaikvirus) aus Eigelb (Monecke,

RWTH-Aachen)

• Fab24: Fab-Fragmente des mAk24 (Fischer, 1990)

• R-α−id24: Polyklonales Kaninchen-anti-Idiotyp mAk 24 Serum (Fischer, 1990)


21

• mAk T84.66 Monoklonaler Mausantikörper gegen CEA (City of Hope, Duarte, CA)

• M-α-His: Monoklonaler Mausantikörper gegen das His6-Epitop (Qiagen, Hilden)

• GAMAP: Polyklonales, AP-konjugiertes Ziege-anti-Maus Serum (Dianova, Hamburg)

• GARAP: Polyklonales, AP-konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen Serum, (Dianova,

Hamburg)

• M-α-KDEL: Monoklonaler Mausantikörper mit Spezifität für das Grp78 Epitop (Biomol,

Hamburg)

2.1.5 Geräte, Apparaturen und Zubehör

• Reinraumwerkbank (BABCOCK-BS; Bad Hersfeld)

• Inkubationsschüttler Innova 4830 (New Brunswick Scientific, Nürtingen)

• Dialux 20 Mikroskop, Objektiv NPL Fluotar 40/0,70 NPT, Okular Periplan 12,5(Leitz,

Wetzlar), Photoautomat MP55 (Wild, Köln)

• Photometer: Zweistrahl-Spektrophotometer Uvikon 930 (Kontron, München),

Quarzglasküvetten

• PCR-Thermocycler: Primus 96 (MWG-Biotech, Ebersberg)

• Fotodokumentation mit UV-Transilluminator: Wellenlänge 302nm (Herolab, Wiesloch)

• Gelelektrophorese-Apparaturen: Elektrophoresekammern, Gelträger, Kämme, Netzteile,

MiniProtean II- und Transblot-Zelle, Vakuumgeltrockner (BioRad, München)

• Ultraschallgeber "Labsonic U" (B. Braun Biotech, Melsungen)

• Rührzellen-Druckkonzentratoren (Millipore, Eschborn)

• Fotoscanner Arcus II (Agfa, Köln)

• BIACORE 2000, CM5-Sensorchip, NTA-Sensorchip (Biosensor, Uppsala, Schweden)

• Multikanalphotometer SpectraMAX 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)

• Zentrifugen: RC-5B/RC-5C (Sorvall, Bad Homburg), Biofuge A (Heraeus, Osterode),

Eppendorfzentrifuge (Eppendorf, Hamburg), Avanti 30 und Avanti J25 (Beckman, Fullerton,

CA, USA)

• Durchflußzentrifuge: CARR Powerfuge P6 (Carr, Ranschbach)

• Econo-Proteinreinigungsanlage (BioRad, München)

• Streamline 25-Säule mit "Streamline Chelating Medium" (Pharmacia, Freiburg)

• Äkta Purifier Proteinreinigungsanlage (Pharmacia, Freiburg)


22

2.1.6 Fermenter

2.1.6.1 Fermenter für die Pflanzensuspensionskultur

Für die Kultivierung der Nicotiana tabacum BY-2 Zellinien wurden drei verschiedene

Rührreaktoren aus den Bioclave-, Biobench- und Biopilot-Baureihen der Firma Applikon

(Schiedam, Niederlande) verwendet. Alle Kessel wiesen einen Schlankheitsgrad von 2:1

(Füllhöhe:Duchmesser) bezogen auf das Arbeitsvolumen auf. Die Durchmischung erfolgte in

allen Fällen von oben durch jeweils einen dreiblättrigen Schrägblattrührer. Alle Reaktoren

wurden ohne Schikanen betrieben. Die Kenndaten der Reaktoren sind in Tabelle 2-1

zusammengefaßt.

Tabelle 2-1: Kenndaten der Rührreaktoren für die Pflanzensuspensionskultur

Bezeichnung 5-l Bioclave

5-l Biobench

30-l Biopilot

Arbeitsvolumen 5 l 30 l

Durchmesser 162 mm 265 mm

Füllhöhe 320 cm 530 mm

Rührerart

(Anzahl)

3-blättr.

Schrägblattrührer

(1)

3-blättr.

Schrägblattrührer

(1)

Rührer-Durchmesser 60 mm 140 mm

Rührerdrehzahl 130 U·min-1 100 U·min-1

Abb. 2-1 zeigt maßstabsgerecht die Geometrie der Biobench 7 und des Biopilot 40

Rührkessel. Im folgenden werden die Bioreaktoren einheitlich entsprechend den

Arbeitsvolumina als 5-l Reaktor (Biobench 7) und 30-l Reaktor (Biopilot 40) bezeichnet.


23

Abb. 2-1: Geometrie und Durchmischungsverhältnisse der für Nicotiana tabacum cv BY-2(links) bzw. Pichia pastoris (rechts) verwendeten 5-l bzw. 30-l Rührkessel.

Die Meßwertumwandlung, -anzeige und ggf. Kontrolle von Temperatur, Belüftungsrate,

Rührerdrehzahl, pH-Wert und Antischaumzugabe wurde von den Applikon Steuereinheiten

ADI 1030, ADI 1040 bzw. ADI 1060 in Verbindung mit den Basiseinheiten durchgeführt. Die

Meßwertaufzeichnung erfolgte über die BioXpert Software (Applikon) in den Versionen 1.10 bis

2.21 in Intervallen von 1-5 Minuten.

2.1.6.2 Fermenter für die Kultivierung von Pichia pastoris

Für die Kultivierung von Pichia pastoris wurden 5-l Biobench und 30-l Biopilot Reaktoren

verwendet, die bis auf die eingesetzten Rührer und den Einbau von Schikanen den in der

Pflanzensuspensionskultur verwendeten Reaktoren baugleich waren (siehe Tabelle 2-1, Abb.

2-1). Es kamen jeweils drei 6-blättrige Rushton Scheibenblattrührer von 63 mm (5-l Biobench)

bzw. 83 mm (30-l Biopilot) Durchmesser zum Einsatz. Der verwendete Motor war stärker

dimensioniert und erlaubte Drehzahlen von 1000 U·min-1 (5-l Biobench) bzw. 500 U·min-1 (30-l

Biopilot).


24

2.1.7 Verwendete Zellinien

2.1.7.1 Zellinien von Nicotiana tabacum cv Bright-Yellow-2 (BY-2)

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Suspensionskulturen von Nicotiana

tabacum cv BY-2 verwendet: Die als biscFv2429KDEL bezeichnete Zellinie exprimiert einen

aus den monoklonalen Antikörpern "24" und "29" gegen TMV konstruierten bispezifischen

single-chain Antikörper biscFv2429 unter der Kontrolle eines modifizierten CaMV 35SS

Promotors. Das C-terminale KDEL Signalpeptid führt zur Retardierung des Proteins im

endoplasmatischen Retikulum (ER) der Zellen. Die Herstellung des Expressionskonstrukts und

der Zellinie wurde beschrieben (Schumann, 1996).

Die als R1-25 bezeichnete Zellinie exprimiert das scFv-Fragment des FSH-spezifischen mAk

4813 (FSH, "follicle stimulating hormone" unter Kontrolle eines synthetischen Promotors aus

Regulationssequenzen der Octopin-Synthase und Mannopin-Synthase-Gene (Ni et al., 1995).

Auch in diesem Fall wurde die C-terminale KDEL-Sequenz zur Akkumulation des scFv4813 im

ER verwendet. Das scFv4813-Konstrukt wurde freundlicherweise von Dr. Paul van der Logt

(Unilever, Bedford, GB) zur Verfügung gestellt, von Dr. Olga Artsaenko (Institut für Biologie I,

RWTH-Aachen) in den Pflanzenexpressionsvektor pSSH1 im Rahmen eines Industrieprojekts

umkloniert und anschließend zur Transformation von Agrobacterium tumefaciens verwendet.

Aus der Co-Kultivierung rekombinanter A. tumefaciens mit Nicotiana tabacum cv BY-2 Wildtyp

ging die rekombinante Tabak-Zellinie R1-25 hervor (Raven, 1999).

2.1.7.2 Zellinien von Pichia pastoris

Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei verschiedene Expressorklone von Pichia pastoris

verwendet: Alle drei Klone sind Konstrukte, die auf dem pPIC9K Vektor basieren (Tabelle 1-5;

(White et al., 1995)).

Der Klon PP3299 wurde freundlicherweise von Dr. Paul van der Logt (Unilever Research

Laboratories, Bedford, UK) zur Verfügung gestellt. Dieser Klon exprimiert das scFv-Fragment

des mAk 3299 (Maus-anti-hCG, human chorionic gonadotrophin), das nach Induktion im

Medium in Konzentrationen von ca. 100 mg·l-1 akkumuliert. Dieser Klon wurde phänotypisch als

MutS-Klon charakterisiert (pers. Mitteilung, Dr. P. van der Logt, Unilever). Anhand dieses Klons

wurde im Rahmen der Maßstabsvergrößerung in den 30-l Maßstab das Auftreten proteolytischer

Effekte bei mangelnder Durchmischung gezeigt (3.3.5, Abb. 3-15).

Der Klon PP599 exprimiert das Fusionsprotein CEA N-A3, das aus zwei Domänen des

humanen "Carcinoembryonic antigen" (CEA) in sekretierter, glykosylierter Form ins Medium.


25

Die Klonierung des Gens sowie die Erzeugung und Charakterisierung dieses Mut+-

Expressorklons sind beschrieben (Robin, 1998; You et al., 1998; Hellwig et al., 1999).

Der Klon N55 exprimiert das scFv-Fragment des mAk4813 (2.1.7.1). Das Protein wird mit

Hilfe der im Vektor pPIC9K enthaltenen prepro-"leader"-Sequenz des α-Paarungsfaktors von

S. cerevisiae sekretiert und besitzt eine C-terminale his6-Sequenz zur Detektion und Reinigung

(Aminosäuren 253 bis 258, s. u.). Die Erzeugung und Charakterisierung dieses Klons ist

beschrieben (Raven, 1999). Die Aminosäuresequenz dieses Antikörpers lautet:

1 11 21 31 41 51

| | | | | |

1 MAEVKLQESG GGLVKPGGSL KLSCAASGFT FSSYVMSWVR QTPEKRLEWV ATISSGGSYT 60

61 YYPDSVKGRF TISRDNAKNT LYLQMSSLRS EDTAMYYCAR QRVDGYSSYW YFDVWGQGTT 120

121 VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS VDIELTQSPK FMSTSVGDRV SITCKASQNV GTAVAWYQQK 180

181 PGQSPKLLIY SASNRYSGVP DRFAGSGSGT DFTLTISNMQ SEDLADYFCQ QYSTSPYTFG 240

241 GGTKLELKRA AAHHHHHH

Die theoretische Masse beträgt demnach 27,8 kDa.

2.2 Molekularbiologische Methoden

Alle gentechnologischen Arbeiten wurden nach S1-Richtlinien durchgeführt und waren

durch das Regierungspräsidium des Landes NRW sowie vom BGA genehmigt

[AZ 521-K-1-8/98: AI3-04/1/0866/88 (S1)].

2.2.1 PCR zur Bestimmung des Methanolverwertungs-Phänotyps von Pichia pastoris

Die Bestimmung des "Methanol utilization"-Phänotyps wurde mit Hilfe der PCR (Saiki et

al., 1985) unter Abwandlung des Protokolls von Linder durchgeführt (Linder et al., 1996): 10 µl

einer 1:10 verdünnten, 16 h alten Pichia-Vorkultur wurden mit 5 µl einer frisch angesetzten

Lyticase-Lösung (Sigma, 5 U·µl-1) versetzt. Der Ansatz wurde 20 min bei 28° C inkubiert und

anschließend bei –20° C tiefgefroren und wieder aufgetaut, um die Zellen aufzuschließen.

Zelltrümmer wurden abzentrifugiert und 5 µl des Überstandes wurden in 200-µL silikonisierten

"PCR-strips" direkt zur PCR eingesetzt (s. u.). Zur Vermeidung von Verdunstung wurden die

Ansätze mit 50 µl Mineralöl überschichtet. Die PCR wurde nach dem folgenden Schema im

Thermocycler (MWG Biotech) durchgeführt.

10 µl des PCR-Ansatzes wurden mit Hilfe eines 1,2 %igen Agarosegels analysiert (2.2.2).


26

PCR-Ansatz:1-10 ng Matrizen-DNA (Pichia Zellaufschluß)5-10 pmol 5’-Primer (5'-AOX, s. u.)5-10 pmol 3'-Primer (3'-AOX, s. u.)

1,5 mM MgCl2

0.25 mM dNTP mix5 % (v/v) DMSO

10 % (v/v) 10-fach Taq DNA-Polymerase-Puffer2 U Taq-Polymerase

ad 50 µl H2O

PCR Primer (MWG)5'-AOX: 5'-GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC3'-AOX: 5'-GGC AAA TGG CAT TCT GAC ATC

PCR-Schema:5 min 95° C (Template-Denaturierung)

30 Wiederholungen:1 min 95° C (Strangtrennung)1 min 54° C (Primer-Anlagerung)1 min 72° C (Kettenverlängerung)

3 min 72° C

2.2.2 Analytische Agarosegelelektrophorese

Die Auftrennung der in der PCR amplifizierten DNA-Fragmente erfolgte in 1,2%igen (w/v)

Agarosegelen bei einer Feldstärke von 4-5 V/cm2. Als Größen- und Konzentrationsstandard

wurde PstI geschnittene DNA des λ-Phagen verwendet. Die Herstellung der Gele und die

Durchführung der Elektrophorese erfolgte in 1xTBE-Puffer unter Zusatz von 0,1 µg/ml

Ethidiumbromid (Sambrook et al., 1989). Dokumentiert wurden die Agarosegele mit dem

digitalen Photodokumentationssystem von Herolab bei einer Wellenlänge von 302 nm.

1xTBE-Puffer90 mM TRIS90 mM B(OH)3

2,5 mM EDTA

2.3 Proteinchemische, naßchemische und immunologische Methoden

2.3.1 Herstellung von Proteinextrakten aus BY-2 Zellen

Zur Analyse der intrazellulär lokalisierten Antikörperfragmente biscFv2429 und scFv4813

wurden Gesamtproteinextrakte hergestellt. Dazu wurde die Fermentationsbrühe zentrifugiert

(4300 g, 5 min), der Überstand dekantiert, das Zellvolumen bestimmt und mit dem gleichen

Volumen Proteinextraktionspuffer resuspendiert. Ein Aliquot von 4 ml wurde in ein frisches

Röhrchen überführt und mit Hilfe eines Ultraschallgebers (Braun) 60 halbsekündigen


27

Ultraschallimpulsen, unterbrochen von halbsekündigen Pausen, ausgesetzt. Die Leistungsabgabe

des Geräts betrug 60 W. Anschließend wurden Trümmer von Zellwänden und Organellen

abzentrifugiert (4300 g, 5 min) und der Überstand bis zur Analyse bei –20° C gelagert.

Proteinextraktionspuffer, pH 8,0200 mM TRIS

5 mM EDTA1 mM DTT

150 mM NaCl0,02 % (w/v) NaN3

0,1 % (v/v) Tween 20

2.3.2 Bestimmung des Gesamtproteingehaltes von BY-2 Zellen

Zur Bestimmung des Gesamtproteingehaltes von BY-2 Zellextrakt (2.3.1) wurde der

"BioRad Protein assay" (BioRad, München) verwendet, der auf der Bradford-Färbung beruht

(Bradford, 1976).

50 µl eines 1:100 verdünnten BY-2 Zellextrakts wurden in Mikrotiterplatten pipettiert und

mit 160 µL der 1:4 verdünnten Färbelösung versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 5-10

Minuten wurde die Absorption bei 595 nm bestimmt. Der Mittelwert der Dreifachansätze wurde

mit einer Kalibrationskurve von RSA Fraktion V (Merck) über den Bereich von 5-50 µg/ml

korreliert und darüber die Proteinkonzentration ermittelt.

2.3.3 Bestimmung des Phosphat-Gehalts in Fermentationsüberständen

Zur Bestimmung des Phosphat-Gehalts in Überständen von N. tabacum cv BY-2

Fermentationen wurde eine nach DIN 38405 entwickelte, naßchemische Methode verwendet.

Phosphat bildet in Gegenwart von Ascorbinsäure und Antimon mit Molybdat-Ionen einen blauen

Komplex ("Phosphormolybdän-Blau"), dessen Bildung bei 680 nm verfolgt werden kann. 100 µl

des zu messenden Überstandes wurden mit 200 µl Ascorbinsäure-Lösung und 400 µl Molybdat-

Reagenz versetzt und mit entionisiertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Nach exakt 15 Minuten

wurde die Absorption bei 680 nm bestimmt und mit einer Kalibrationskurve verglichen.


28

Ascorbinsäurelösung0,57 M Ascorbinsäure

Molybdat-Reagenzlösung21 mM (NH4)Mo7O24

2,1 mM K(SbO)C4H4O6

25 % (v/v) H2SO4

2.3.4 Bestimmung von Glukose, Fruktose und Saccharose in Fermentationsüberständen

Die Bestimmung von Glukose, Fruktose und Saccharose in Fermentationsüberständen von N.

tabacum cv BY-2 erfolgte mit Hilfe des Enzymkits "Sucrose, D-Glucose, D-Fructose"

(Boehringer, Mannheim) nach Angaben des Herstellers. Der Test beruht auf der photometrischen

Messung der Abnahme der Extinktion bei 340 nm infolge enzymatischer, NADPH-abhängiger

Umsetzung der Saccharide.

2.3.5 SDS-PAA Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Coomassie Brilliant BlueFärbetechnik

2.3.5.1 Gelelektrophorese

Die denaturierende SDS-PAGE zur Trennung von Proteinen gemäß ihrer molekularen Größe

wurde in einem diskontinuierlichen Puffersystem nach Laemmli durchgeführt (Sammelgel:

T=4%, C=2,7%, pH 6,8; Trenngel: T=12%, C=2,7%, pH 8,8) (Laemmli, 1970). Die Gele wurden

in der „Mini Protean II“-Apparatur (BioRad) nach Herstellerangaben hergestellt. Die in den

Proben enthaltenen Proteine wurden durch Erhitzen mit 10x SDS-PAGE-Probenpuffer

(5min/95°C) solubilisiert und anschließend bei konstanter Spannung von 150 V im Gel getrennt.

10x SDS-PAGE-Probenpuffer62,5 mM TRIS

10 % (v/v) Glyzerin2 % (w/v) SDS5 % (v/v) ß-Mercaptoethanol

0,05 % (w/v) Bromphenolblau

Elektrophorese-Laufpuffer, pH 8.325 mM TRIS

192 mM Glyzin0,1 % (w/v) SDS

2.3.5.2 Coomassie Brilliant Blue Färbung

Die Visualisierung elektrophoretisch aufgetrennter Proteine im Gel erfolgte nach Hersteller-

angaben durch Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbelösung (ca. 1 h bei RT).

Zum Entfärben wurde das Gel in Entfärbelösung zwei mal kurz erhitzt (95° C). Anschließend

wurde das Gel zwischen zwei Cellophanfolien getrocknet und lichtgeschützt gelagert. Als


29

Größenstandard für alle Coomassie-gefärbten Proteingele diente Mark 12 (Novex). Dieser

Größenstandard enthält Proteine der Molekulargewichte 200, 115, 98, 66,3, 55,4, 36,5, 31,0,

21,5 und 15,4 kDa.

Coomassie-Färbelösung0,25 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G250

50 % (v/v) Methanol9 % (v/v) Essigsäure2 % (w/v) tri-Chlor-Essigsäure

Coomassie Entfärbelösung5 % (v/v) Methanol

7,5 % (v/v) Essigsäure

2.3.6 Western Blot

Zum Nachweis von scFvs im Nanogrammbereich über die C-terminalen his6 bzw. KDEL

Peptide wurden die reduzierten und denaturierten Proteine nach gelelektrophoretischer

Auftrennung (2.3.5) auf Nitrozellulose (Amersham) transferiert (Towbin et al., 1979). Die

entsprechende Proteinbande wurde auf der Nitrozellulosemembran nach Zugabe von

spezifischen Antikörpern durch die Bindung eines mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugierten

sekundären anti-Antikörpers mit nachfolgendem Substratumsatz sichtbar gemacht (Burnette,

1981). Dies ermöglicht die eindeutige Identifizierung des scFvs unter den anderen in der Probe

vorhandenen Proteinen und eine Gößenabschätzung. Gleichzeitig lassen sich Degradationen am

Auftreten zusätzlicher, kleinerer Banden erkennen.

Als Größenmaßstab diente in allen Western Blots eine Mischung aus vorgefärbten Proteinen

von mit den Molekulargewichten 150, 62, 47,5, 32,5, 25 und 16,5 kDa (New England Biolabs).

Zum Blockieren freier Bindungsstellen auf der Nitrozellulosemembran vor der Inkubation mit

sekundären Antikörpern diente in allen Fällen "Marvel" Skim Milk Powder (0,01 % Fett), in

2 %iger (w/v) Lösung (1 h bei RT). Als sekundäre Antikörper kamen M-α-his (Qiagen) in der

Konzentration 100 ng·ml-1 bzw. M-α-KDEL (Biomol) in der Konzentration 1,5 ng·ml-1 zum

Einsatz (2.1.4). In beiden Fällen wurde Fc-spezifischer GAMAP (Dianova) in einer Konzentration

von 120 ng·ml-1 als Anti-Antikörper verwendet (2.1.4). Als Substrat zur Anfärbung gebundener

AP-markierter Antikörper diente die NBT/BCIP Fertigsubstratlösung (GibcoBRL), die nach

Herstellerangaben eingesetzt wurde.


30

Transferpuffer25 mM TRIS

192 mM Glyzin20 % (v/v) Methanol

2.3.7 ELISA

Der ELISA (Engvall und Perlmann, 1971) stellt eine äußerst sensitive Methode zum

Nachweis der Funktionalität von Antikörpern und Antikörperfragmenten dar. Darüber hinaus

zeichnet er sich durch hohe Selektivität aus. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte der Nachweis der

Antikörperfragmente mit dem Verfahren des direkten oder indirekten ELISA (Fischer, 1990).

Alle ELISA Puffer wurden nach (Clark und Adams, 1977) hergestellt. In allen ELISAs kamen

M129B "high binding" Polystyrol-Mikrotiterplatten (Greiner) zum Einsatz.

"Coating"- Puffer (CP), pH 9,615 mM Na2CO3

25 mM NaHCO3

0,02 % (w/v) NaN3

Glutardialdehyd-Bindungspuffer (GBP), pH 5,0100 mM K2HPO4

Phosphatpuffer (PBS), pH 7,410 % (v/v) 10xPBS

Physiologische Salzlösung (PS)0,85 % (w/v) NaCl

Probenpuffer (PP), pH 6,010 % (v/v) 10 x PBS

2 % (w/v) PVP (20-30 kDa)0,2 % (w/v) NaN3

0,05 % (w/v) Tween 20

Proteinextraktionspuffer (EP), pH 7,50,2 M 1 M Tris-HCl

0,05 M EDTA0,02 % (w/v) NaN3

0,1 % (v/v) Tween 201 mM PMSF

Enzymmarkierte Antikörper-Puffer (EMAP), pH 7,410 % (v/v) 10 x PBS

2 % (w/v) PVP (20-30 kDa)0,2 % (w/v) BSA

0,02 % (w/v) NaN3

0,05 % (v/v) Tween 20

Substratpuffer (SP), pH 9,810 % (v/v) di-Ethanolamin

1 mM MgCl2


31

Waschpuffer (PBS-T), pH 7,410 % (v/v) 10 x PBS

0,05 % (v/v) Tween 20

Phosphatgepufferte Saline (10x PBS)1,37 M NaCl

27 mM KCl81 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4

2.3.7.1 ELISA zum Nachweis des biscFv2429 in Pflanzensuspensionskultur

Der ELISA zum funktionalen Nachweis des biscFv2429 wurde als indirekter ELISA mit

indirektem "Coating" durchgeführt. Das indirekte Coating über C-α-TMV (2.1.4) ermöglicht es,

die Tabak-Mosaikvirionen, die im alkalischen Milieu in ihre Monomere zerfallen als intakte

Virionen im ELISA zu präsentieren. Der Nachweis TMV-gebundener biscFv2429 erfolgte über

das polyklonale anti-idiotypische R-α-id24 Serum (2.1.4). Als Standard für diesen ELISA wurde

der Fab24 (2.1.4) in Konzentrationen von 1,25 bis 10 ng·ml-1 verwendet.

Schritt Reagenz Volumen[µl]

Inkubation

Immobilisierung C-α-TMV (1:5000 in CP) 100 2 h 37° C

Absättigung freierBindungsstellen

RSA (2 % (w/v) in PS) 150 1 h RT

oder ü. N. 4° C

Bindung von TMV TMV (1 µg·ml-1 in PP) 100 2 h 37° C

Probenauftrag Verdünnungen des Zellextrakts aus Nicotianatabacum biscFv2429KDEL in EP

100 2 h 37° C

sekundärer Ak R-α-id24 (1:5000 in EMAP) 100 2 h 37° C

AP-konjugierter Ak GARAP (100 ng·ml-1 in EMAP) 100 1 h 37° C

Substratreaktion PNPP (1 mg·ml-1 in SP) 100 variabel, 37° C


32

2.3.7.2 ELISA zum Nachweis von CEA-NA3 in Pichia pastoris – Überständen

Die Funktionalität des Fusionsproteins CEA-NA3 wurde im ELISA mit Hilfe des CEA-

spezifischen Antikörpers mAk T84.66 nachgewiesen. CEA-NA3-haltiger Fermentations-

überstand des Pichia-Klons PP599 wurde direkt in CP verdünnt und immobilisiert.

Schritt Reagenz Volumen[µl]

Inkubation

Immobilisierung Verdünnungen des Überstandes ausFermentationen des Klons PP599 in CP

100 2 h 37° C


RSA (2 % (w/v) in PS) 150 1 h RT

oder ü. N. 4° C

sekundärer Ak mAk T84.88 (100 ng·ml-1 in PBS) 100 2 h 37° C

AP-konjugierter Ak GAMAP (100 ng·ml-1 in PBS) 100 1 h 37° C


2.3.7.3 ELISA zum Nachweis von scFv4813 in Pichia pastoris – Überständen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Funktionalität des in Pichia pastoris produzierten

scFv4813 über einen indirekten ELISA gezeigt. Dazu wurde das synthetisch hergestellte 20-mer

Peptid MCO3, das freundlicherweise von Dr. Jerry Slootstra (ID-DLO, Molecular Recognition,

Lelystad, Niederlande) zur Verfügung gestellt wurde, als Antigen genutzt. Dieses Peptid mit der

Aminosäuresequenz M K G P D T I F T C P E A T Q C H C G K stellt ein aus einer Teilsequenz

des FSH abgeleitetes Mimitop dar, an das die gegen FSH gerichteten rekombinanten Antikörper

selektiv binden. Die Verwendbarkeit dieses Peptids als Mimitop anstelle des kostspieligen hFSH

wurde bereits gezeigt (Raven, 1999). Der ELISA wurde nach folgendem Schema durchgeführt:

Schritt Reagenz Volumen [µl] Inkubation

Aktivierung Glutardialdehyd (0,2 % (v/v) in GBP) 100 3 h RT

Bindung des Mimitop-Peptids Mimitop-Peptid (10µM in PBS) 100 4 h RT


RSA (2 % (w/v) in PS) 150 1 h RT

Probenauftrag Verdünnungen des Fermentations-überstands des Klons N55 in PBS

100 2 h 37° C

sekundärer Ak M-α-his (100 ng·ml-1) 100 2 h 37° C

AP-konjugierter Ak GAMAP (100 ng·ml-1) 100 1 h 37° C



33

2.3.8 Konzentrationsbestimmung des biscFv2429 mit Hilfe der Oberflächenplasmon-resonanz

Die Konzentrationsbestimmung des biscFv2429 (Fischer et al., 1999e) wurde mit Hilfe einer

BIACORE® 2000 (BioSensor) durchgeführt. Dabei wird die Bindung eines Analyten an einen

Liganden, der in einer Flußzelle immobilisiert ist, in Echtzeit gemessen. Das Ausgangssignal

wird in der Einheit RU ("Response units") angegeben und ist direkt proportional zur Masse des

gebunden Analyten. Das Meßprinzip und seine Anwendung für quantitative und kinetische

Messungen ist mehrfach beschrieben (Jonsson et al., 1991; Stenberg et al., 1991; Malmqvist und

Karlsson, 1997; Sack, 1998; Malmqvist, 1999).

Die Messung der Konzentration des biscFv2429 im Extrakt aus BY-2 Zellen (2.3.1) erfolgte

aufgrund der Bindung dieses Fragments an intakte Tabak-Mosaikvirionen (TMV), der in der

Meßzelle immobilisiert war. Die Oberfläche der Flußzelle wurde vor jeder Probe regeneriert und

die Probenvorbereitung und –verdünnung erfolgte stets nach dem gleichen Protokoll (s. u.). Als

Standard wurde das in etwa gleich große Fab-Fragment des mAk 24 gewählt, das ebenfalls eine

Bindungsstelle für TMV aufweist und daher ähnliche Meßergebnisse ergeben sollte. Es standen

auf 1 µg·ml-1 und 0.5 µg·ml-1 eingestellte Standardkonzentrationen zur Verfügung.

Die Proben wurden zentrifugiert (10000 g/2 min/4° C), um die Zelltrümmer abzutrennen und

der Überstand mit löslichen Bestandteilen wurde 1:4 in Laufpuffer verdünnt. Ein Probenzyklus

sah wie folgt aus:

Regeneration: 10 µl Regenerationspuffer (30 µL·min-1)

Binden: 20 µl Probe (5µl·min-1)

Laufpuffer, pH 7,410 mM HEPES

0,15 M NaCl0,5 mM EDTA

0,005 % (v/v) Tween 20

Regenerationspuffer30 mM HCl

2.3.9 Konzentrationsbestimmung des scFv4813

2.3.9.1 Konzentrationsbestimmung von scFv4813 mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz

Die Konzentrationsbestimmung his6-markierter Proteine in Pichia-Kulturüberständen wurde

analog zu 2.3.8 mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz durchgeführt. Im Falle des scFv4813


34

erfolgte die Messung aufgrund der Bindung des scFv4813 über den carboxyterminalen his6-Tag

an eine Nickel-NTA ("Nitrilo-triacetic acid") Oberfläche. Die NTA-Oberfläche der Flußzelle

wurde vor jeder Probe regeneriert und die Probenvorbereitung und –verdünnung erfolgte stets

nach dem gleichen Protokoll. Unter diesen Bedingungen entsprechen 1000 RU Konzentration

des his6-markierten Analyten etwa 10 µg·ml-1.

Die Proben wurden zentrifugiert (10000g/2min/4°C) um die Zelltrümmer abzutrennen, der

Überstand mit den löslichen Bestandteilen wurde 1:20 in Laufpuffer verdünnt.

Regeneration: 5 µl Regenerationspuffer (5µl·min-1)

Beladen mit Nickel: 10 µl Ladepuffer (5µl·min-1)

Binden: 20 µl Probe (5µl·min-1)

Laufpuffer, pH 7,410 mM HEPES

0,15 M NaCl0,005 % (v/v) Tween 20

Ladepuffer, pH 7,4:500 µM NiCl2

10 mM HEPES0,15 M NaCl

0,005 % (v/v) Tween 20

Regenerationspuffer pH 8,3:10 mM HEPES

0,15 M NaCl0,35 M EDTA

0,005 % (v/v) Tween 20

2.3.9.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung

Die photometrische Bestimmung der Konzentration von gereinigtem scFv4813 (2.3.10) aus

Pichia pastoris (2.3.10) erfolgte bei 280 nm in PBS. Der theoretische millimolare

Extinktionskoeffizient wurde aus der Aminosäuresequenz mit Hilfe des im Internet vom "Swiss

Institute of Bioinformatics" (SIB) zur Verfügung gestellten Programms "ProtParam" ermittelt

(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html (Stand 4/2000)).

Der theoretische millimolare Extinktionskoeffizient bei 280 nm ist 49170, demnach

entspricht eine E280 von 1 einer scFv-Konzentration von 0,56 mg·ml-1.

2.3.9.3 Konzentrationsbestimmung durch Bradford-Färbung

Die Konzentration von gereinigtem scFv4813 aus Pichia pastoris (2.3.10) wurde zusätzlich

durch Anfärbung mit dem Bradford-Assay (BioRad, München, siehe 2.3.2) ermittelt. 50 µl des


35

gereinigten Proteins wurden in verschiedenen Verdünnungen in Mikrotiterplatten vorgelegt.

Dazu wurden 160 µl einer 1:4 oder 1:10 verdünnten Lösung der Färbereagenz gegeben. Die

Extinktion bei 595 nm wurde nach 15minütiger Inkubation bei Raumtemperatur gemessen. Als

Standard diente RSA Fraktion V (Merck), das zwischen 5 und 50 µg·ml-1 eine lineare

Korrelation mit der Extinktion aufweist.

2.3.10 Reinigung von scFv4813 aus Pichia-Fermentationsüberstand

2.3.10.1 Metall-Affinitätschromatographie

Bei der Metall-Affinitätschromatographie wird ein zweiwertiges Kation, typischerweise Ni2+

oder Cu2+ durch einen kovalent an eine Matrix gebundenen Chelatbildner, z. B. NTA (Nitrilo-tri-

acetic acid) oder IDA (Imino-diacetic acid) gebunden. Mit der mobilen Phase aufgetragene

andere Chelatbildner, z. B. his6-markierte Proteine, können durch weitere Komplexierung des

Kations selektiv gebunden werden. Die Elution erfolgt durch starke, lösliche Chelatbildner wie

EDTA oder Imidazol. Selektive "Fang"-Schritte bzw. Affinitätschromatographie eignen sich

besonders als erster Schritt in einer Aufarbeitungskaskade, da mit der selektiven Bindung eine

effiziente Aufkonzentrierung des Produkts verbunden ist.

Für den scFv4813 aus Pichia wurde Ni-IDA Affinitätschromatographie in Kombination mit

der "expanded bed"-Technologie verwendet. Dabei werden die Partikel der Säulenmatrix

innerhalb der Säule von unten angeströmt und fluidisiert. Das Bett expandiert abhängig von der

Dichte, der Flußrate und dem Partikelgehalt der mobilen Phase um das drei- bis sechsfache, es

bleibt aber durch entsprechenden Schlankheitsgrad des Säulenkörpers und geeignete

Zulaufgeometrie bei einer idealen Verdrängungsströmung mit relativ enger

Verweilzeitverteilung. Dieses Verfahren ermöglicht es, stark partikelhaltige Suspensionen

aufzutragen, ohne daß es zum Verblocken der Säule kommt. Bei der Elution wird die Säule in

umgekehrter Richtung betrieben, so daß das Bett- und damit das Elutionsvolumen möglichst

gering ist.

Zum Einsatz kamen eine "Streamline 50"-Säule (Pharmacia) mit 75 ml "Streamline

Chelating" Matrix (Pharmacia). Die Matrix wurde zum Laden mit Nickel, Auftrag von

Fermentationsüberstand und Waschen (Puffer und Lösungen s. u.) im expandierten Zustand bei

einem Säulenvolumen (SV) von ca. 300 ml betrieben. Zur Elution wurde die Flußrichtung

umgekehrt, und der Stempel der Säule bis an die Obergrenze des nun gepackten Bettes

herabgefahren (SV=75 ml). Die Elution des scFv4813 wurde durch Messung der Absorption bei

280 nm in einer entsprechenden Fließzelle (BioRad) überwacht und der Eluatstrom von Hand


36

fraktioniert. Während der Elution wurde der Eluatstrom durch ein in Serie geschaltetes

Hohlfaserdialysemodul in den Laufpuffer für die anschließende Kationenaustauscher-

chromatographie umgepuffert (2.3.10.2).

Äquilibrierungspuffer, pH 7,41 M NaCl2,7 mM KCl8,1 mM Na2HPO4

1,5 mM KH2PO4

Nickel-Ladepuffer100 mM NiSO4

Elutionspuffer, pH 7,4250 mM Imidazol

1 M NaCl2,7 mM KCl8,1 mM Na2HPO4

1,5 mM KH2PO4

Dialysepuffer, pH 5.050 mM NaCH3COO

2.3.10.2 Kationenaustauscherchromatographie

Zur weiteren Reinigung des scFv4813 wurde wegen des hohen isoelektrischen Punktes des

Proteins ein Kationenaustauscher (Poros 50 HS) verwendet. Die Säule mit einem Bettvolumen

von 8 ml war in ein "Äkta Purifier" Reinigungssystem (Pharmacia) integriert, über dessen

Pumpen und Meßzellen die Beladung und Elution der Säule sowie die Fraktionierung des Eluats

gesteuert wurden. Die Säule wurde mit Laufpuffer äquilibriert und mit dem in Laufpuffer

dialysierten Eluat der Ni-Affinitätschromatographie beladen. Die Elution erfolgte mit einem

stufenlosen 0-100 % Gradienten in Elutionspuffer.

Laufpuffer, pH 5.050 mM NaCH3COO

Elutionspuffer, pH 5.050 mM NaCH3COO

1 M NaCl

2.3.10.3 Aufkonzentrierung des scFv4813

Zur Vorbereitung auf die Gelchromatographie wurde das Eluat der Kationenaustauscher-

chromatographie (2.3.10.2) durch Druckfiltration konzentriert. Dazu diente eine Ultrafiltrations-

Rührzelle (Millipore), die mit einer Celluloseacetatmembran mit 10 kDa Ausschlußgrenze


37

ausgestattet war. Die Zelle wurde mit 6 bar Stickstoff überlagert. Das Fassungsvermögen der

Rührzelle betrug max. 70 ml, die auf ein Minimum von etwa 5 ml konzentriert werden konnten.

2.3.10.4 Gelchromatographie

Die Gelchromatographie wurde als letzter Schritt in der Reinigung des scFv4813 eingesetzt.

Als Säulenfüllung wurden 450 ml Sephacryl S100 HR (Pharmacia) verwendet. Die Säule wurde

bei 4° C betrieben. Probenauftrag (aufkonzentriertes Eluat aus 2.3.10.3) und Elution mit

Gelfiltrations-Laufpuffer wurden mit dem "Äkta Explorer" Reinigungssystem (Pharmacia)

durchgeführt, das auch zur Detektion des Produkts und Fraktionierung des Eluats anhand der

Extinktionsmessung bei 280 nm verwendet wurde.

Laufpuffer pH, 7,55 mM TRIS2 mM DTT

0,5 mM EDTA

2.4 Kultivierung von Nicotiana tabacum cv BY-2

2.4.1 Stammhaltung

Die verwendeten Zellinien von Nicotiana tabacum cv BY-2 wurden als Suspensionskulturen

durch wöchentliches Überimpfen kultiviert. Dazu wurden 50 ml BY-2 Medium in einem

250-ml Erlenmeyerkolben mit 5% (v/v) einer 7 Tage alten Kultur inokuliert und bei 100 U·min-1

und bei 26° C im Dunkeln inkubiert.

BY-2 – Medium, pH 5,80,443 % (v/v) MSMO (Sigma)

1 mg·l-1 Thiamin HCl0,2 mg·l-1 2.4-D

200 mg·l-1 KH2PO4

100 mg·l-1 myo-Inosite3 % (w/v) Sucrose

2.4.2 Vorkultur

Zur Anzucht von Vorkulturen wurden die entsprechenden Zellinien in 250 ml BY-2 Medium

(2.4.1) in 1-l Erlenmeyerkolben 5%ig (v/v) überimpft und für 5 Tage bei 26° C und 100 U·min-1

kultiviert. Die Vorkulturen wurden einzeln mikroskopisch auf Kontaminationen überprüft, bevor

sie vereinigt und zur Inokulation einer Fermentation verwendet wurden.


38

2.4.3 Bestimmung von Frischgewicht, Trockengewicht und Zellanteil in BY-2 Kulturen

Zur Bestimmung des Zellanteils und des Frischgewichts wurden 10 ml einer BY-2 Kultur in

einem graduierten 14-ml Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) bei 4300 g für 5 min in einem

Ausschwingrotor zentrifugiert. Danach wurde der Feststoffanteil ("Packed Cell Volume", PCV)

an der Graduierung des Röhrchens abgelesen. Die Genauigkeit dieser Methode liegt bei +/- 2%.

Der Überstand wurde dekantiert, die Zellen mit entionisiertem Wasser resuspendiert, mit Hilfe

einer Wasserstrahlpumpe auf einen 50-mm Cellulosefilter (Whatman) übertragen, und einmal

gewaschen. Anschließend wurden die Zellen quantitativ auf vorgewogene Aluminium-

Wägeschälchen übertragen und das Frischgewicht ermittelt. Die Genauigkeit dieser Methode

liegt bei Biomassekonzentrationen bis 50 g·l-1 bei +/- 3 % und bei Biomassekonzentrationen

zwischen 50 und 250 g·l-1 bei +/- 2 %.

Anschließend wurde die Biomasse bei 60° C bis zur Gewichtskonstanz (24 h) getrocknet und

das Trockengewicht mit einer Genauigkeit von +/- 5 % bestimmt.

2.4.4 Fermentation von Nicotiana tabacum cv BY-2

2.4.4.1 Fermentationen im 5-Liter Maßstab

Zur Vorbereitung der Fermentation wurde die pH-Elektrode des Fermenters kalibriert. 4 Liter

BY-2 Medium (2.4.1) wurden mit einigen Tropfen Antischaummittel (Roth) versetzt und

zusammen mit dem Reaktor sterilisiert (121° C, 30 min). Nach dem Abkühlen wurde die

Temperatur auf 26° C geregelt und die Sauerstoffelektrode bei einer konstanten Belüftungsrate

von 0,1 l·l-1·min-1 und einer Rührerdrehzahl von 130 U·min-1 auf 100 % Sauerstoffsättigung

kalibriert. Temperatur und Rührerdrehzahl wurden während der Fermentation konstant gehalten.

Der pH-Wert wurde gemessen, aber nicht geregelt. Die Luftzufuhr wurde über die

Gelöstsauerstoffkonzentration (dO2) derart gesteuert, daß die Luftzufuhr bei dO2-Werten über

20 % gestoppt wurde. Die Belüftungsrate bei offenem Ventil lag zu Beginn der Fermentation bei

0,1 l·l-1·min-1 und wurde manuell erhöht, wenn diese Rate bei konstant offener Luftzufuhr nicht

ausreichte, um 20 % dO2 zu halten, bis zu einer maximalen Belüftungsrate von 0,3 l·l-1·min-1. Im

Falle der Verwendung der Bioclave-Glasreaktoren wurde – sofern nicht anders angegeben – der

Reaktor während der Fermentation mit lichtdichter Folie abgedunkelt. Die Inokulation erfolgte

mit 900-1000 ml Vorkultur (2.4.2), die ein PCV von ca. 50 % (v/v) aufwies.

2.4.4.2 Fermentationen im 30-Liter Maßstab

Für Fermentationen im 30-l Maßstab wurden nach der Kalibration der pH-Elektrode 26 Liter

BY-2 Medium (2.4.1) gemeinsam mit einigen Tropfen Antischaummittel im Reaktor sterilisiert


39

(121° C, 30 min). Nach dem Abkühlen auf 26° C wurde die Sauerstoffelektrode bei einer

konstanten Belüftungsrate von 0,2 l·l-1·min-1 und einer Rührerdrehzahl von 80 U·min-1 auf 100 %

Sauerstoffsättigung kalibriert. Temperatur und Rührerdrehzahl blieben während der

Fermentation konstant. Der pH-Wert wurde gemessen, aber nicht geregelt. Die Luftzufuhr wurde

über die Gelöstsauerstoffkonzentration (dO2) derart gesteuert, daß die Luftzufuhr bei dO2-

Werten über 20 % gestoppt wurde. Die Belüftungsrate bei offenem Ventil lag zu Beginn der

Fermentation bei 0,2 l·l-1·min-1 und wurde manuell erhöht, wenn diese Rate bei konstant offener

Luftzufuhr nicht ausreichte, um 20 % dO2 zu halten, bis zu einer maximalen Belüftungsrate von

0,4 l·l-1·min-1. Als Inokulum diente die Fermentationsbrühe einer 5-l Fermentation (2.4.4.1) mit

einem PCV von 40-50 % (v/v). Dazu wurden der 5-l Reaktor und der 30-l Reaktor über einen

Silikonschlauch (ID 8 mm) miteinander verbunden, die Verbindung dampfsterilisiert und das

Inokulum durch Beaufschlagung des Animpffermenters mit 1 bar Überdruck steril in den 30-l

Kessel überführt.

2.5 Kultivierung von Pichia pastoris

2.5.1 Kryokulturen

Von allen Pichia-Klonen wurden Stammkulturen in Form von Kryokulturen angelegt. Ein

durch Quadrantenaustrich eines Stammes auf YPD-Agar vereinzelter rekombinanter Klon wurde

in 10 ml YPD-Flüssigmedium in einem 50-ml "Falcon"-Reaktionsgefäß (Greiner, Solingen)

inokuliert. Das Kulturröhrchen wurde unter aeroben Bedingungen bei 30° C unter starkem

Schütteln (250 U·min-1) inkubiert, bis eine Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm

(OD600) von 1,5-2 erreicht war.

Die Kultur wurde nach mikroskopischer Kontrolle auf Kontaminationen durch Zugabe von

sterilem, 60%igem (v/v) Glyzerin auf eine Endkonzentration von 15 % (v/v) Glyzerin eingestellt

und in sterilen 1,5-ml-Eppendorfröhrchen (Greiner, Solingen) in 100-µl-Aliquots in flüssigem

Stickstoff eingefroren. Die Stammbank wurde anschließend bei –80° C gelagert. Die

Kryokulturen wurden in regelmäßigen Abständen durch Ausstrich auf YPD-Agar auf Sterilität

und Lebendzellzahl überprüft.


40

YPD-Flüssigmedium2 % (w/v) Hefeextrakt1 % (w/v) Pepton2 % (w/v) Glukose

YPD-Nährbodenentspricht YPD-Flüssigmedium mit 2 % (w/v) Agar

2.5.2 Vorkulturen

Der zu fermentierende Klon von Pichia pastoris wurde aus einer Kryokultur auf YPD-

Nährboden (2.5.1) ausgestrichen und 2 Tage bei 30° C inkubiert. Von diesem Ausstrich wurden

Vorkulturen in jeweils 10 ml BMGY oder YPG Vorkulturmedium in 50-ml Falcon-Gefäßen

angelegt und unter aeroben Verhältnissen inkubiert (30° C, 250 U·min-1, 24 h). Diese

Vorkulturen wurden verwendet, um jeweils 200 ml BMGY oder YPG in 1000-ml

Erlenmeyerkolben (mit Schikanen) anzuimpfen, die unter den gleichen Bedingungen für 16-24 h

inkubiert wurden. Die Vorkulturen wurden einzeln mikroskopisch auf Kontaminationen

überprüft, bevor sie vereinigt und zur Inokulation verwendet wurden.

BMGY Vorkulturmedium2 % (w/v) Hefeextrakt1 % (w/v) Pepton

1,37 % (w/v) Yeast Nitrogen Base, ohne Aminosäuren1 % (v/v) Glyzerin

100 mM KH2PO4

YPG Vorkulturmedium2 % (w/v) Hefeextrakt1 % (w/v) Pepton1 % (v/v) Glyzerin

2.5.3 Bestimmung von optischer Dichte, Frisch- und Trockengewicht

Im unteren Zelldichtebereich wurde die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm

(OD600) von Pichia-Kulturen als Maß für die Biomassekonzentration herangezogen. Dazu

wurden die Kulturen im Verhältnis 1:20 in PBS (2.3.7) verdünnt und die OD600 gegen PBS

bestimmt. Die so erhaltenen Werte korrelieren bis zu einer OD600 von ca. 25 linear mit dem

Frischgewicht. In Hochzelldichtekulturen über 50 g·l-1 ergibt diese Methode aufgrund der

nichtlinearen Korrelation bei höheren Verdünnungsstufen ungenaue Werte.

Zur Bestimmung des Frischgewichts von Pichia-Kulturen wurden 2 x 1500 µl der jeweiligen

Kultur in zwei vorgewogene Eppendorf-Röhrchen pipettiert und die Zellen bei 4000 g für 2 min.

zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Anschließend wurden die Röhrchen gewogen und


41

das Frischgewicht ermittelt. Mit dieser Methode läßt sich eine Genauigkeit von +/- 3 g·l-1

erzielen, was für den Hochzelldichtebereich ausreichend ist.

Zur Bestimmung des Trockengewichts wurden 10 ml einer Kultur bei 3400 g für 5 min. in

vorgewogenen 10-ml Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) abzentrifugiert, der Überstand wurde

dekantiert und die Röhrchen wurden bei 60° C für 24 h getrocknet. Anschließend wurde die

Biotrockenmasse gravimetrisch bestimmt. Für Pichia pastoris ergab sich ein konstantes

Verhältnis von 1:4 – 1:3,8, d. h. ein Trockenanteil von 25-26 % am Frischgewicht.

2.5.4 Expression im Schüttelkolben

Zur Bestimmung der Methanol-Toleranz wurden jeweils 40 ml einer YPG-Vorkultur (2.5.2)

von Pichia pastoris Klon N55 (2.1.7.2) bei einer OD600 von 24 unter sterilen Bedingungen in 50-

ml "Falcon"-Gefäßen abzentrifugiert (1500 g, 5 min), der Überstand dekantiert und das Pellet in

10 ml YPM Induktionsmedium aufgenommen. Methanol wurde bis zur jeweiligen

Endkonzentration zugegeben und die Falcon-Röhrchen unter aeroben Bedingungen für 36 h

inkubiert (250 U·min-1, 30° C). Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen zentrifugiert (5000 g,

5 min) und die Konzentration des scFv4813 per Oberflächenplasmonresonanz (2.3.9.1) im

Überstand bestimmt.

YPM Induktionsmedium2 % (w/v) Hefeextrakt1 % (w/v) Pepton

0,5-6,5 % (v/v) Methanol

2.5.5 Fermentation von Pichia pastoris

2.5.5.1 Vorbereitung und erste Phase der Fermentation

Das Pichia-Fermentationsmedium ohne die Spurenelementelösung wurde nach der

Kalibrierung der pH-Elektrode eingefüllt und zusammen mit dem Fermenter sterilisiert. Das

jeweils verwendete Medium und die Glyzerin-Ausgangskonzentration sind im Ergebnisteil

genannt. Anschließend wurden Zugabeflaschen für Antischaummittel und 28%ige

Ammoniaklösung steril angeschlossen und der pH-Wert wurde durch Zugabe von Ammoniak

auf 6,0 eingestellt. Ammoniak dient neben der pH-Kontrolle auch als einzige Stickstoffquelle

des Fermentationsmediums. Die sterilfiltrierten Ptm1-Spurenelemente und einige Tropfen

Antischaummittel wurden zugegeben, bevor die Sauerstoffelektrode bei Belüftungs- und

Rührwerkseinstellungen identisch mit denen während der Fermentation auf 100 %

Sauerstoffsättigung kalibriert wurde. Die Belüftungsrate wurde – falls nicht anders angegeben –


42

auf 2 l·l-1·min-1 (Preßluft) eingestellt. Bei Fermentationen im 5-l Reaktor (2.1.6) wurde der

Rührer auf konstant 1000 U·min-1 eingestellt, im 30-l Reaktor (2.1.6) auf 500 U·min-1. Alle

Fermentationen wurden bei einer Temperatur von 30° C durchgeführt.

Der erste Teil der Fermentation bestand in allen Fällen aus der Biomassebildung im

ansatzweisen Verfahren auf der Basis von Glyzerin als Kohlenstoffquelle ("glycerol batch

phase"). Der pH-Wert wurde durch automatische Zugabe von Ammoniaklösung konstant bei 6.0

gehalten. Während dieser Phase sinkt die Gelöstsauerstoffkonzentration (dO2) mit zunehmender

Biomasse ab, um dann plötzlich anzusteigen. Dieser Anstieg ("dO2 spike") signalisiert den

völligen Verbrauch des vorgelegten Glyzerins und das Ende der ersten Fermentationsphase.

Pichia Fermentationsmedium A (Invitrogen)2,2 mM CaSO4

18,8 mM MgSO4

22,6 mM KOH32,2 mM K2SO4

0,84 % (v/v) Phosphorsäure (85 %)4 % (v/v) Glyzerin

0,4 % (v/v) Ptm1 Spurenelementelösung (Invitrogen)

Pichia Fermentationsmedium B (verändert)1,1 mM CaSO4

9,4 mM MgSO4

11,3 mM KOH16,1 mM K2SO4

0,4 % (v/v) Phosphorsäure (85 %)5 % (v/v) Glyzerin

0,4 % (v/v) Ptm1 Spurenelementelösung (Invitrogen)

Ptm1 Spurenelementelösung (Invitrogen)230 mM FeSO4

24 mM CuSO4

19,9 mM MnSO4

2,10 mM CoCl2

0,53 mM NaI0,83 mM Na2MoO4

0,32 mM B(OH)3

0,15 mM ZnCl2

0,82 mM Biotin

2.5.5.2 Glyzerin-Zulaufverfahren

In einigen Fällen wurde nach Abschluß der Biomassebildung im ansatzweisen Verfahren

(2.5.5.1) eine zusätzliche Phase der Biomassebildung im limitierten Glyzerin-Zulaufverfahren

("limited glycerol fed-batch") durchgeführt, um vor Beginn der Induktion eine höhere

Biomassekonzentration zu erreichen. Einige Autoren halten diese Phase C-limitierten


43

Wachstums für mit einer Derepression des AOX1-Promotors verbunden und damit der

darauffolgenden Induktionsphase förderlich (Stratton et al., 1998).

Die Zufuhr der Ptm1-supplementierten Glyzerinlösung erfolgte intervallartig mit fester

Zufuhrrate, die im Ergebnisteil jeweils angegeben ist. Diese Art der Zugabe führt bei

limitierender Zufuhrrate zu stark schwankenden dO2-Werten.

Glyzerin-Zulaufmedium50 % (v/v) Glyzerin

1,2 % (v/v) Ptm1-Spurenelementelösung (2.5.5.1)

2.5.5.3 Methanol-Zulaufverfahren

Zur Induktion der Expression des scFv4813 wurde im Methanol-Zulaufverfahren fermentiert:

Nach Abschluß der Biomassebildung auf Basis von Glyzerin und vollständiger Erschöpfung des

Glyzerins wurden die Zellen auf die Methanolverwertung adaptiert. Zwischen der Erschöpfung

des Glyzerins und dem Beginn der Adaption lagen zum Teil technisch bedingte, bis zu 6-

stündige Phasen ohne Kohlenstoffquelle. Zur Induktion wurde mit Spurenelementelösung

supplementiertes Methanol automatisch gesteuert intervallartig zugeführt.

Methanol-Zulaufmedium98,8 % (v/v) Methanol

1,2 % (v/v) Ptm1-Spurenelementelösung (2.5.5.1)

Induktion mit manuell gewählter Zufuhrrate

Im einfachsten Fall wurde die Zufuhrrate manuell vorgewählt und es erfolgte keine

Rückkopplung auf den Regler (Abb. 2-2 A). Die Gelöstsauerstoffkonzentration (dO2) gab dabei

indirekte Hinweise auf die Methanolkonzentration: bei zu niedriger Zufuhrrate liegt der dO2-

Wert nahe 100 %, bei zu hoher Zufuhrrate liegt der dO2-Wert nahe 0, dann besteht die Gefahr

der Akkumulation von Methanol.

Induktion mit dO2-kontrollierter Zufuhrrate

Die Induktion mit dO2-gesteuerter Methanolzufuhr basiert auf der schnellen Reaktion des

dO2-Wertes auf die Erschöpfung der Kohlenstoffquelle. Die Steuereinheit ADI 1030 wurde dazu

so programmiert, daß bei Überschreiten eines dO2-Sollwertes die Methanolzufuhrpumpe

aktiviert wurde (Abb. 2-2 B). Bei dieser Art der Zufuhrsteuerung schwankt die

Methanolkonzentration um 0 %, da der dO2-Wert schon bei niedrigen Methanolkonzentrationen


44

unter den Sollwert absinkt. In dieser Konfiguration kann der dO2-Istwert nicht mehr zur

Steuerung der Belüftungsrate verwendet werden.

BA

dO2

const.

dO2

C

MeOH

dO2

Abb. 2-2: Die verschiedenen Regelungsstrategien zur Steuerung der Methanol-Zufuhrrate. A:Manuelle Vorwahl einer konstanten Rate ohne Rückkopplung. B: Automatische Steuerung derMethanolzufuhr abhängig von der Gelöstsauerstoffkonzentration. C: Automatische Steuerungder Methanolzufuhr durch Echtzeit-Methanol-Analytik.

2.5.5.4 Induktion mit Echtzeit-Methanol-Kontrolle

Um Methanolkonzentrationen in einem Bereich oberhalb von 0 % regeln zu können, wurde

eine Echtzeit-Methanol-Analytik aufgebaut (Abb. 2-2 C). Das System basiert auf dem

kommerziell erhältlichen Alkoholsensor (ALKOSENS II) und der dazugehörigen

Regelungseinheit (ACETOMAT) der Fa. Heinrich Frings GmbH & Co KG (Bonn) und wird in

der industriellen Essigsäurefermentation eingesetzt. Der in-situ sterilisierbare Sensor besteht aus

einer Membran, durch die flüchtige Alkohole aus der Fermentationsbrühe pervaporieren. Auf der

Rückseite der Membran transportiert ein konstanter Luftstrom die Moleküle zu einem beheizten,

dotierten SnO2 Halbleitersensor, an dem durch die Oxidation der Alkohole eine Verringerung

des Widerstandes bewirkt wird (Abb. 2-3).

In der Regelungseinheit wird der gemessene Widerstand mit einer nichtlinearen

Kalibrationskurve korreliert und digital sowie analog als Methanolkonzentration ausgegeben und

mit einem Sollwert verglichen. Abhängig vom Sollwert können interne Relais angesteuert

werden. Im vorliegenden Fall wurde der ACETOMAT so konfiguriert, daß eine externe

Zufuhrpumpe bei Unterschreiten des Sollwertes eine bestimmte Menge Methanol, die

0,08 % (v/v) entsprach, förderte.


45

��

��

��

��

TrägergasHalbleiter-Gassensor

Selektive Membran

Abb. 2-3: Funktionsprinzip des Methanolsensors: Flüchtige Alkohole pervaporieren durch dieselektive Membran und werden von einem Trägergasstrom zum Gassensor transportiert.

Der Analogausgang wurde über einen A/D-Wandler in das Prozessleitsystem BioXpert

eingespeist und so die Methanolkonzentration synchron mit den übrigen Prozessdaten erfaßt.

Ergebnisse und Diskussion

46

3 Ergebnisse und Diskussion

Vorangegangene Arbeiten am Institut für Biologie I der RWTH Aachen hatten bereits die

Expression von Antikörperfragmenten in pflanzlichen Suspensionskulturen (Drossard, 1996;

Schumann, 1996; Drossard et al., 1997; Sack, 1998; Raven, 1999) behandelt. Die Eignung dieses

Expressionssystem zur Produktion rekombinanter Antikörper hatte sich dabei erwiesen. Die

Zellinie Nicotiana tabacum cv BY-2 erwies sich als genetisch stabil und erbrachte bei gutem

Wachstumsverhalten reproduzierbare Produktausbeuten. Es hatte sich gezeigt, daß die Sekretion

von Antikörperfragmenten in den Apoplasten mit Hilfe entsprechender „Leader“-Peptide

möglich ist, die Akkumulation im ER mit Hilfe des KDEL Retentionssignals aber höhere

Ausbeuten erbringt.

Das Pichia pastoris Expressionssystems war am Institut für Biologie I als alternatives

Expressionssystem für die Produktion sekretierter, rekombinanter Proteine etabliert worden. Die

erfolgreiche Transformation, Selektion und Expression eines humanen Glykoproteins und eines

murinen scFv-Fragments sind in den jeweiligen Arbeiten von Robin und Raven beschrieben

(Robin, 1998; Raven, 1999).

Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit stand aufbauend auf den vorgenannten

Ergebnissen die Entwicklung und Optimierung von Fermentationsstrategien für die

Suspensionskultur von Nicotiana tabacum cv BY-2 sowie Pichia pastoris im Vordergrund. Der

diagnostisch relevante murine scFv4813 sollte im Maßstab bis 500 mg produziert werden.

3.1 Entwicklung eines Fermentationsprotokolls für Nicotiana tabacum cvBY-2

Die Entwicklung eines Fermentationsprotokolls für Nicotiana tabacum cv BY-2 erfolgte

anhand einer im Institut für Biologie I bereits bestehenden transgenen Zellinie, die einen biscFv

(Abb. 1-1) produzierte (Schumann, 1996), da zu Beginn dieser Promotionsarbeit die

Entwicklung einer Zellinie zur Produktion des scFv4813 noch nicht abgeschlossen war (Raven,

1999).

3.1.1 Wachstumskinetik von Nicotiana tabacum cv BY-2 im Rührreaktor

Initiale Versuche mit 5 % bzw. 10 % (v/v) Inokulumgröße hatten ergeben, daß für das

Anwachsen der BY-2 Zellinie biscFv2429 im Fermenter ein Inokulum in der Größenordnung


47

von 20 % notwendig ist (Daten nicht gezeigt). Abb. 3-1 zeigt den Verlauf einer typischen

Fermentation dieser Zellinie unter diesen Bedingungen. Die Konzentration von Phosphat und die

Gesamtzuckerkonzentration im Überstand (2.3.3 bzw. 2.3.4) erwiesen sich als leicht meßbare

und für den Verlauf einer Fermentation charakteristische Parameter, die geeignet sind, die

Fermentation begleitend zur Frischgewichts- und PCV-Bestimmung zu überwachen und zu

dokumentieren. Dies ist besonders interessant, da die Größe der Zellaggregate und die

Eigenschaft der Pflanzenzellen, oberhalb des Mediums an den Oberflächen des Kulturgefäßes zu

haften, nicht immer eine repräsentative Beprobung der Biomasse erlauben. In diesem Fall

können die Phosphat- und Zuckerkonzentrationen wertvolle Hinweise über den Fortschritt einer

Fermentation geben. Im vorliegenden Fall war Phosphat nach 141 und Zucker nach 180 h nicht

mehr im Überstand meßbar. Die Zunahme von Frischgewicht und PCV verlief parallel und war

nach ca. 200 h abgeschlossen. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Fermentation beendet.

0 50 100 150 2000

50

100

150

200

250

300

350

Fris

chge

wic

ht [g

·L-1]

Zeit [h]

0

50

100

150

200

250

300

Pho

spha

t [m

g·L-1

]

0

10

20

30

40

50

60

70P

CV

[%]

0

5

10

15

20

25

30

35

Ges

amtz

ucke

r [g

·L-1]

Abb. 3-1: Fermentation der Nicotiana tabacum cv BY-2 Zellinie biscFv2429 im 5-l Maßstab(2.4.4). Das Frischgewicht (!) wurde gravimetrisch (2.4.3), der Zellanteil (", PCV) durchZentrifugation ermittelt (2.4.3). Phosphat (#) wurde im Überstand photometrisch über denPhosphormolybdän-Blau-Komplex (2.3.3) und die Gesamtzuckerkonzentration ($) mittels einesEnzymkits (Boehringer) bestimmt (2.3.4).

Abb. 3-2 zeigt die typischen morphologischen Veränderungen von Nicotiana tabacum cv

BY-2 im Verlauf einer Fermentation. Die Zellen weisen 24 h nach der Inokulation einen

Durchmesser von ca. 50 µm und eine Länge von ca. 100 µm auf und sind relativ stark


48

vakuolisiert. Nach ca. 100 h haben die Zellen mehrere Teilungszyklen vollzogen, wobei eine

Teilung jeweils senkrecht auf die letzte Teilungsebene erfolgt. Diese Teilungen erfolgen unter

nur geringer Volumenzunahme, so daß sich in erster Linie die Zellzahl, weniger das PCV erhöht.

In diesem Zustand sind die Zellen kubisch bis kugelig mit einem Durchmesser von ca. 25 µm.

Die Zellen bilden Aggregate von ca. 8-80 Zellen. Gegen Ende der Fermentation weisen die

Zellen nach erfolgtem Streckungswachstum wieder eine starke Vakuolisierung und eine Länge

von 100 bis 150 µm auf. Die Vakuolisierung und Streckung ist an eine starke Zunahme des PCV

sowie an ein Auseinanderbrechen der Aggregate gebunden. Da die Zellen einer BY-2 Kultur ein

synchrones Wachstumsverhalten aufweisen (Nagata et al., 1992), stellt die lichtmikroskopische

Untersuchung ebenso wie die Bestimmung des Phosphat- und Gesamtzuckergehaltes eine

geeignete Methode dar, dem Verlauf der Fermentation neben der Bestimmung von PCV und

Frischgewicht zu folgen.

Abb. 3-2: Morphologie von Nicotiana tabacum cv BY-2 nach 24 h (A), 100 h (B) und 180 h (C)im Verlauf einer Fermentation. Die Proben wurden aus einer Fermentation der ZelliniebiscFv2429 (2.1.7.1) nach Standardbedingungen (2.4.4) gezogen. Die Hellfeld-Aufnahmen(Leitz Dialux 20, Wild Photoautomat MP55) wurden bei 400facher Vergrößerung angefertigt.Die Skalen wurden durch Abfotografieren der Skalierungen auf entsprechenden Objektträgern(Leitz) mit der gleichen Objektiv/Okular Kombination erstellt.

Die Eigenschaft der Zellen, zunächst Nährstoffe aus dem Medium aufzunehmen, sich zu

teilen und erst anschließend durch Wasseraufnahme, Vakuolisierung und Streckungswachstum

die Größe der individuellen Zellen wieder zu erhöhen, führt zu einem nicht-synchronen Verlauf

der Frisch- und Trockengewichtsentwicklung. Während sich Frischgewicht und PCV parallel

entwickeln, steigt das Trockengewicht zunächst stärker an, um nach der vollständigen Aufnahme

der Nährstoffe konstant zu bleiben, während PCV und Frischgewicht noch stark ansteigen

(Daten nicht gezeigt). Der Trockengewichtsanteil von Nicotiana tabacum BY-2 Biomasse

schwankt daher zwischen 4 % und 7,5 % des Frischgewichts.


49

3.1.2 Nährstoffaufnahmekinetik

Die Kinetik der Aufnahme der C-Quelle wurde näher untersucht, um den

Fermentationsverlauf möglichst gut charakterisieren zu können. Der bereits in Abb. 3-1 gezeigte

Verlauf der Gesamtzuckerkonzentration im Überstand läßt sich wie in Abb. 3-3 gezeigt, auflösen

(2.3.4). Die als Kohlenstoffquelle zugesetzte Saccharose wird bei Nicotiana tabacum cv BY-2

extrazellulär hydrolysiert und in Form der Monosaccharide aufgenommen.

Das typische Bild zeigt während der Lag-Phase eine Zunahme der

Monosaccharidkonzentrationen mit zunächst langsamer Abnahme des Gesamtzuckergehalts

Zwischen 75 und 125 h kommt es zu einer schnellen Hydrolyse der restlichen Saccharose und

einer vollständigen Aufnahme der Monosaccharide, dabei wird stets die Glukose bevorzugt

aufgenommen.

0 50 100 150 2000

5

10

15

20

25

30

Zuc

ker

g·L-1

Zeit [h]

0

50

100

150

200

250

Pho

spha

t [m

g·L-1

]

Abb. 3-3: Verlauf der Konzentrationen von Glukose, Fruktose und Saccharose während einerFermentation der Nicotiana tabacum cv BY Zellinie biscFv2429KDEL im 5-l Maßstab (2.4.4).Die Konzentrationen von Saccharose ("), Fruktose (#) und Glukose ($) wurden mit Hilfe einesEnzymkits bestimmt (2.3.4), daraus ergab sich die Gesamtzuckerkonzentration (!). Phosphat (%)wurde photometrisch über den Phosphormolybdän-Blau-Komplex ermittelt (2.3.3).

Insgesamt bietet die Analyse des Überstandes einer Fermentation von Nicotiana tabacum cv

BY-2 vier leicht zu bestimmende charakteristische Anhaltspunkte, die stets in der gleichen

Reihenfolge auftreten: Die vollständige Hydrolyse der Saccharose, die vollständige Aufnahme

von Phosphat, Glukose und Fruktose. Diese typischen Punkte erlauben ein Monitoring der


50

Fermentation auch ohne zuverlässige Bestimmung der Biomassekonzentration und eine – mit

Hilfe entsprechender Analytik in Echtzeit durchführbare – Dokumentation einer solchen

Fermentation.

3.1.3 Kinetik der Expression des biscFv2429

Die Expression des biscFv2429 im Verlauf der oben im Detail analysierten Fermentation ist

in Abb. 3-4 gezeigt. Die Konzentration des Antikörperfragments wurde in diesem Fall per

ELISA (2.3.7.1) gemessen, wobei das Fab24-Fragment des mAk24 (2.1.4) als Standard

verwendet wurde. Sie lag über den Verlauf der Fermentation im Zellextrakt (2.3.1) zwischen

1163 und 2261 ng·ml-1, dabei lagen die Werte zu Beginn und zum Ende der Fermentation

tendenziell niedriger. Die mit Hilfe der Bradford-Färbung (2.3.2) gemessene Konzentration an

Gesamtprotein zeigte die gleiche Tendenz, mit den Extrema 508 und 2357 µg·ml-1 war die

Schwankungsbreite jedoch größer. Bei der Bestimmung des gesamtlöslichen Proteins wurde

RSA Fraktion V als Standard verwendet. Da die Empfindlichkeit der Reaktion von Proteinen mit

Bradford-Färbereagenz von Protein zu Protein unterschiedlich ist und die Anfärbung von RSA

bekanntermaßen relativ empfindlich ist, unterliegt die Bestimmung des gesamtlöslichen Proteins

nach dieser Methode einem nicht näher quantifizierbaren Fehler – die tatsächlichen Werte

dürften höher liegen. Das Verhältnis der Gesamtprotein-Konzentrationen der einzelnen Proben

zueinander bleibt davon unberührt.

Entsprechend dem tendenziell gleichen Verlauf von biscFv2429 und Gesamtprotein ergibt

sich die ebenfalls in Abb. 3-4 gezeigte Expressionsrate, die in etwa konstant um den Mittelwert

von ca. 0,125 % lag. Die Tatsache, daß die Konzentration an biscFv2429 außerhalb der Phasen

intensiver metabolischer Aktivität, wenn die Gesamtproteinkonzentration niedrig ist, kaum

absinkt, entspricht den Erwartungen für die Expression eines rekombinanten Proteins über einen

konstitutiven Promotor und dessen Akkumulation im ER.


51

0 50 100 150 2000

500

1000

1500

2000

2500

Ges

amtlö

slic

hes

Pro

tein

[µg·

mL-1

]

Zeit [h]

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Exp

ress

ions

rate

[%]

0

500

1000

1500

2000

2500

bisc

Fv2

429

[ng·

mL-1

]

Abb. 3-4: Analyse der intrazellulären Akkumulation des biscFv2429 während einerFermentation der Nicotiana tabacum cv BY-2 Zellinie biscFv2429KDEL im 5-l Maßstab (2.4.4).Die Konzentration des biscFv2429 (#) wurde per ELISA (2.3.7.1) bestimmt und zurKonzentration des gesamtlöslichen Proteins (2.3.2) im Zellextrakt (") in Beziehung gesetzt, umdie Expressionsrate in % des Gesamtproteins (&' zu bestimmen.

Das Verhältnis von Expressionsrate und volumetrischer Produktausbeute bei einem

intrazellulären Produkt verdeutlicht Abb. 3-5. Obwohl die Konzentration des biscFv2429 im

Zellextrakt zur Mitte der Fermentation am höchsten liegt (#, A), ist die Gesamtmenge des

Produktes gegen Ende der Fermentation am höchsten und korreliert im Verlauf der Fermentation

im wesentlichen mit dem PCV (B). Aus diesem Grund, sowie aufgrund des schwankenden

Trockengewichtsanteils (3.1.1) wird im folgenden das PCV als Maß für die

Biomassekonzentration verwendet.


52

0 50 100 150 2000

500

1000

1500

2000

2500

BA

bi

scF

v242

9 [n

g·m

L-1]

(Ext

rakt

)

Zeit [h]

0 50 100 150 2000

10

20

30

40

50

60

PC

V [%

]

Zeit [h]

0

10

20

30

40

50

60

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

bisc

Fv2

429

[mg·

L-1]

(Fer

men

tatio

nsvo

lum

en)

Abb. 3-5: Fermentation der Nicotiana tabacum cv BY-2 Zellinie biscFv2429KDEL im 5-lMaßstab (2.4.4). Der Zellanteil (", PCV) wurde durch Zentrifugation bestimmt (2.4.3), dieKonzentration des biscFv2429 im Zellextrakt (#, A) per ELISA (2.3.7.1). Daraus errechnet sichdie Ausbeute des biscFv2429 bezogen auf das Kulturvolumen ($, B).

3.1.4 Versuche zur Stimulation des CaMV 35SS Promotor

Mit der in 3.1.1 bis 3.1.3 beschriebenen Zellinie wurde eine Reihe von Fermentationen

durchgeführt, die darauf abzielten, die 35SS-kontrollierte Expression des biscFv2929 zu

stimulieren, da die Gesamtausbeute an rekombinantem Protein mit ca. 2 mg·ml-1 (bezogen auf

Fermentationsvolumen) vor der Reinigung zu niedrig für die Produktion handhabbarer Mengen

des rekombinanten Proteins zu sein schien.

Zu den Versuchen gehörten die Zugabe von Hefeextrakt als möglichem Elicitor, Zugabe

einer 10-fach erhöhten Dosis 2.4-D, Erhöhung der Temperatur und die Fermentation unter

Tageslichteinfluß. Zellextrakte aus allen Proben dieser Fermentationsreihe sowie aus zwei

Standardfermentationen wurden in einem einzigen Lauf auf einem BIACore-Chip, auf dessen

Oberfläche TMV-Virionen immobilisiert waren, mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz

analysiert. Dadurch war die Vergleichbarkeit der Proben untereinander gewährleistet. Abb. 3-6

zeigt die normalisierten Maxima der Parameter PCV (2.4.3), Produktkonzentration im

Zellextrakt nach ELISA (2.3.7.1) und volumetrische Produktausbeute. Dazu wurden die in den

einzelnen Fermentation gefundenen Maximalwerte ermittelt und auf den höchsten innerhalb der

gesamten Versuchsreihe gefundenen Wert (=100 %) bezogen.


53

ST1 ST2 YE 2.4 T LI0

20

40

60

80100


20

40

60

80

100

Ausbeute

(RUmax

·L-1)

Wachstum(PCV

max)

Expression(RU

max)


20

4060

80

100

Abb. 3-6: Versuche zur Erhöhung der Expression des biscFv2429 mit Hilfe des 35SS Promotor.Gezeigt sind die in verschiedenen Fermentationen erreichten Maxima der Biomassebildung(PCV) (2.4.3), der Akkumulation von biscFv2429 im Zellextrakt sowie die Ausbeute desProdukts bezogen auf das Fermentationsvolumen. ST1, ST2: Standard-Fermentationen (26° C,Dunkel, wie 2.4.4) YE: Zugabe von Hefeextrakt auf 0.5 % (w/v) nach 80 h; 2.4-D: Zugabe von2.4-D auf eine Endkonzentration von 2 mg·l-1 nach 80 h; T: Erhöhung der Temperatur auf 37° Cnach 100 h. LI: Fermentation im Glasreaktor unter Tageslicht.

Mit 40-50 % PCV lagen die in den verschiedenen Fermentationen erreichten Zelldichten

relativ nahe beieinander, der niedrige Wert bei der mit Hefeextrakt supplementierten

Fermentation, bei der ein maximales PCV von 26 % gefunden wurde, ist mit Schwierigkeiten bei

der Entnahme einer repräsentativen Probe zu erklären.

Die maximale Konzentration des biscFv2429 im Zellextrakt schwankte stärker, sie lag bei

der Tageslichtfermentation um etwa 30% höher als die Maximalwerte der anderen

Fermentationen. Dennoch war die Gesamtausbeute an biscFv2429 bei dieser Fermentation nicht

am höchsten, da der Maximalwert der intrazellulären Akkumulation zu einem frühen Zeitpunkt,

das heißt bei niedrigem PCV auftrat, und zum Erntezeitpunkt relativ stark abgesunken war. Die

höchste auf das Fermentationsvolumen bezogene Ausbeute wurde mit der Standardfermentation

ST2 erreicht.

Auffallend ist, daß die maximalen Produktkonzentrationen im Zellextrakt bei allen 4

Fermentationen mit versuchter Stimulation der Expression höher lagen, als in den


54

Standardfermentationen. Daß die Gesamtausbeute dennoch bei einer Standardfermentation am

höchsten war, könnte daran liegen, daß die Expression zwar stimuliert wurde, dieser Effekt

jedoch von kurzer Dauer war. In diesem Fall könnte durch eine Verlagerung der exogenen

Stimulation zum Ende der Fermentation hin eine Verbesserung erzielt werden. Entscheidend für

die hohe volumetrische Produktivität bei der mit ST2 bezeichneten Fermentation war ein hohes

PCV zum Erntezeitpunkt in Verbindung mit einem relativ hohen Produktgehalt. Anhand der

durchgeführten Fermentationen ließ sich eine Stimulation der CaMV-35SS gesteuerten

Expression nicht zeigen.

Insgesamt waren die mit diesem System erreichten Konzentrationen des Produktes im

Zellextrakt immer noch niedrig, die höchste unter Verwendung dieses Promotors gefundene

Konzentration lag bei von 3,1 µg·ml-1, dieser Wert entspräche bei 55 % PCV, dem höchsten in

einer Fermentation gemessenen Wert, einer volumenbezogenen Ausbeute von 2,9 mg·l-1. Die

Reinigung rekombinanter Proteine aus dem komplexen Gesamtproteinextrakt von

Pflanzensuspensionskulturen ist aber mit Ausbeuteverlusten verbunden, so daß für die

Produktion handhabbarer Mengen des scFv4813 nach Alternativen gesucht wurde.

3.2 Produktion von scFv4813 in Nicotiana tabacum cv BY-2

3.2.1 Produktion von scFv 4813 im 5-Liter Maßstab

Aufgrund der mit dem CaMV 35SS erreichten Ergebnisse wurde für die Expressionskassette

des scFv4813 der (ocs)3mas Promotor gewählt, mit dem in Tabaksuspensionskulturen höhere

Expressionsraten erreichbar sind (2.1.7). Die Fermentation der Zellinie R1-25 zur Produktion des

scFv4813 in Pflanzensuspensionskultur verlief hinsichtlich der Wachstumskinetik entsprechend

den mit der Zellinie biscFv2429KDEL gemachten Erwartungen. Abb. 3-7 zeigt Biomassebildung

und Verlauf von pH-Wert und Gelöstsauerstoffkonzentration während einer Fermentation im 5-l

Reaktor.


55

00 48 96 144 1923

4

5

6

7

pH

Zeit [h]

5101520253035404550

PC

V [%

]

0

10

20

30

40

50

dO2

[%]

406080100120140160180200220

Fris

chge

wic

ht [g

·L-1]

Abb. 3-7: Fermentation der Zellinie R1-25 von Nicotiana tabacum cv BY-2 im 5-l Maßstab(2.4.4). Frischgewicht (!) wurde gravimetrisch bestimmt (2.4.3), der Zellanteil (", PCV) durchZentrifugation (2.4.3). Die Gelöstsauerstoffkonzentration dO2 (durchgezogene Linie) wurdedurch getaktete Belüftung auf 20 % konstant gehalten, die maximale Belüftungsrate war auf0.2 vvm begrenzt. Der pH-Wert (gestrichelte Linie) wurde gemessen, aber nicht geregelt.

Der Abfall der Gelöstsauerstoffkonzentration nach ca. 96 h ist auf eine zu niedrig eingestellte

maximale Belüftungsrate zurückzuführen: Bis ca. 88 h wurde die Luftzufuhr automatisch

getaktet um ein dO2 von 20% zu halten, danach stieg die Sauerstoffaufnahmerate der Zellen aber

weiter an, so daß die Belüftungsrate bei konstant offenem Ventil nicht ausreichte, 20 % zu

halten. Das Wachstumsverhalten der Zellen läßt keine Rückschlüsse zu, ob die kritische

Gelöstsauerstoffkonzentration, bei der das Wachstum der Zellen infolge Sauerstoffmangels

verlangsamt wird, unterschritten wurde. Mit einem PCV von 49 % und einem Frischgewicht von

215 g·l-1 wurden zum Erntezeitpunkt bei 190 h normale Werte erreicht.

3.2.2 Maßstabsvergrößerung in den 30-Liter Maßstab

Die im 5-l Reaktor angezogenen Zellen wurden direkt zur Inokulation des 30-l Reaktors

verwendet. Zum Transfer wurden die beiden Reaktoren steril miteinander verbunden und der 5-l

Reaktor mit 0,5 bar Überdruck beaufschlagt. Dadurch konnten eventuelle scherkraftbedingte

Zellschädigungen durch die Verwendung einer Pumpe vermieden werden. Der gesamte Inhalt

des 5-l Reaktors wurde in den 30-l Reaktor überführt, so daß die Größe des Inokulums ca. 16 %

(v/v) betrug. Abb. 3-8 zeigt den Verlauf der Fermentation im 30-l Maßstab.


56

00 24 48 72 96 120 144 1683

4

5

pH

Zeit [h]

0

10

20

30

40

PC

V [%

]

0

20

40

60

80

100

dO2

[%]

0

25

50

75

100

125

150

Fris

chge

wic

ht [g

·l-1]

Abb. 3-8: Fermentation der Zellinie R1-25 von Nicotiana tabacum cv BY-2 im 30-l Maßstab(2.4.4). Die Gelöstsauerstoffkonzentration dO2 (durchgezogene Linie) wurde durch getakteteBelüftung konstant auf 20 % gehalten. Das Frischgewicht (!) wurde gravimetrisch bestimmt(2.4.3), der Zellanteil (", PCV) durch Zentrifugation (2.4.3). Der pH-Wert (gestrichelte Linie)wurde gemessen, aber nicht geregelt.

Aufgrund starken Anhaftens der Zellen oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche ("wall growth"),

möglicherweise auch aufgrund der ungünstigeren Lage des Probennahmeventils im 30-l Reaktor,

lagen die in den Proben erhaltenen PCV-Meßwerte deutlich unterhalb der Erwartungen. Der

Verlauf der Gesamtzuckerkonzentration (Ergebnisse nicht dargestellt) und auch die nach der

Ernte ausgewogene Zellmasse waren mit 8,2 kg Frischgewicht erwartungsgemäß. Für eine nicht

homogene Durchmischung des Reaktorinhalts während der letzten 48 h der Fermentation

sprechen auch die in diesem Zeitraum stark schwankenden Meßwerte der pH- und dO2-Sonden

(Abb. 3-8). Dieses Problem trat bei einigen Fermentation auf.

Die Analyse der Proben auf Expression des scFv4813 erfolgte durch Western-Blot mit Hilfe

eines monoklonalen Antikörpers mit Spezifität für das KDEL-Epitop (2.1.4). Zum Zeitpunkt der

Analyse dieser Proben waren weder ein gereinigter, eingestellter Standard des scFv4813, noch

humanes FSH zum Beschichten von ELISA-Platten oder Immobilisieren an einem BIACore

Chip (analog zu der Bestimmung des biscFv2429, 2.3.8) verfügbar, so daß diese Methode die

einzig mögliche zum Nachweis des scFv4813 war. Anstelle einer Quantifizierung konnte daher

lediglich eine Abschätzung der Konzentration erfolgen. Das Ergebnis ist in Abb. 3-9 dargestellt:


57

Abb. 3-9: Western Blot (2.3.5) von Gesamtproteinextrakten (2.3.1) aus Proben der Fermentation(2.4.4) der Zellinie R1-25 von Nicotiana tabacum cv BY-2. Die Proben wurden zu den überjeder Spur angegebenen Zeiten (in h) gezogen. 30 µl des Gesamtproteinextrakts wurden für jedeSpur aufgetragen. Die Detektion des scFv4813 (Pfeil) erfolgte über den M-α-KDEL Antikörper(100 ng·ml-1, 1 h, RT) und das GAM-AP Serum (120 ng·ml-1, 1h, RT) (2.1.4). Die Färbereaktionmit NBT-BCIP wurde nach 5 min durch Waschen in Wasser gestoppt.

Anhand der Stärke der Banden wurde die Konzentration des scFv4813 im

Gesamtproteinextrakt auf ca. 15 µg·ml-1 geschätzt. Die gesamte Zellmasse der Fermentation

hätte nach 2.3.2 ca. 22 Liter Proteinextrakt ergeben, also ca. 330 mg scFv4813, woraus sich eine

auf das Fermentationsvolumen bezogene Produktivität im Bereich von 1,6 mg·l-1·d-1 ergibt.

Verglichen mit den für den biscFv4813 (siehe 3.1.3-3.1.4) erhaltenen Werten (2-3 mg·l-1)

wurden also mit dem (ocs)3mas-Promotor etwa um den Faktor 4-5 gesteigerte Ausbeuten erzielt.

Dennoch stehen auch für die Zellinie R1-25 der notwendige Zellaufschluß und die erforderliche

Reinigung des Produkts aus dem komplexen Gesamtproteinextrakt, der Gewinnung des

rekombinanten Produktes im Gramm-Maßstab hinderlich gegenüber.

3.3 Entwicklung eines Fermentationsprotokolls für Pichia pastoris

3.3.1 Wachstumskinetik und Medienoptimierung im Schüttelkolben

Die Untersuchung des Wachstums von Pichia pastoris im Schüttelkolben wurde

durchgeführt, um einen Überblick über die auf verschiedenen Kohlenstoffquellen erzielbaren

Wachstumsraten und Biomasseerträge zu gewinnen. Untersucht wurden die im "Pichia

expression manual" (Invitrogen, Carlsbad, CA, Version D) vorgeschlagenen Medien YPD

(2.5.1) und BMGY (2.5.2). Zusätzlich wurde eine vereinfachte Version des Vorkulturmediums

BMGY, nämlich YPG (2.5.2) getestet, um die Frage zu beantworten, ob das teurere und

aufwendiger herzustellende BMGY ersetzt werden kann. Als Maß für das Wachstum wurde die


58

OD600 herangezogen (2.5.3), die im untersuchten Biomassebereich die höchste Genauigkeit

liefert. Die Mittelwerte aus jeweils zwei Messungen der beiden Ansätze eines jeden Mediums

wurden aufgetragen und mit Hilfe der Software Microcal Origin 5.0 ausgewertet (sigmoid fit).

Die Ergebnisse sind in Abb. 3-10 dargestellt.

0 4 8 12 16 20 240

5

10

15

20

25

30

BMGY Sigm. Fit BMGY YPD Sigm. Fit YPD YPG Sigm. Fit YPG

OD

600

Zeit [h]

Abb. 3-10: Wachstum von Pichia pastoris Klon N55 in verschiedenen Medien (2.5.1, 2.5.2) imSchüttelkolben. Die Kolben wurden zum Zeitpunkt t=0 jeweils 1%ig aus der gleichen Vorkultur(in BMGY) angeimpft. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben gezogen und dasWachstum anhand der Bestimmung der Optischen Dichte (2.5.3) verfolgt.

Die Parameter der sigmoidalen Wachstumskurven (Tabelle 3-1) zeigen, daß die drei

verglichenen Medien hinsichtlich des Wachstumsverhaltens von Pichia gleichwertig sind. Die

Ergebnisse geben keine Auskunft darüber, ob die ermittelte maximale Wachstumsrate von 0,3 h-1

durch endogene Parameter (z. B. Replikationsgeschwindigkeit) oder exogene Parameter (z. B.

Sauerstoffeintrag im Schüttelkolben) bestimmt ist.

Tabelle 3-1: Wachstum des Pichia pastoris Klons N55 (2.1.7.2) im Schüttelkolben mitverschiedenen Medien:

Medium µmax

[h-1]OD600max FWmax

[g·l-1]Wendepunkt

[h]BMGY 0,31 27,2 61 13,6

YPD 0,30 28,9 65 13,4

YPG 0,31 28,3 63 13,6


59

3.3.2 Bestimmung des Methanolverwertungs-Phänotpys des Expressionsklons

Die Bestimmung des "Methanol utilization"-Phänotyps ist zur Charakterisierung eines Pichia

Expressionstammes unerläßlich, da dieser Einfluß auf das Wachstumsverhalten während der

Induktion hat. Abgesehen davon gibt es möglicherweise einen Einfluß auf die Expressionsraten

rekombinanter Proteine (Clare et al., 1991a; ; Romanos, 1995; Higgins und Cregg, 1998). Die im

Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Bestimmung beruht auf dem Nachweis des AOX1-Gens mit

Hilfe spezifischer Primer für die 5' und 3' untranslatierten Regionen (2.2.1). Dieses Verfahren ist

schneller und zuverlässiger als die Bestimmung über die Wachstumsgeschwindigkeit von

Kolonien auf Nährböden mit Methanol als Kohlenstoffquelle.

Im Falle der Integration der zirkularisierten Expressionskassette über einen einzelnen

Cross-Over Vorgang in den 5' oder 3' AOX1-Regionen oder im HIS4-Gen (diese Sequenzen sind

in der Expressionskassette enthalten) wird die Methanolverwertungskapazität der Zelle nicht

beeinträchtigt. Die 5' und 3' Primer amplifizieren zwei DNA-Fragmente: Das native AOX1-Gen

und die Expressionskassette, die die gleichen flankierenden Regionen aufweist.

Wird das native AOX1-Gen durch die Expressionskassette infolge eines doppelten

Cross-Over Vorgangs an den flankierenden 5' und 3' Regionen ersetzt, so läßt sich durch die

entsprechenden Primer nur noch eine Bande in der Größe der Expressionskassette amplifizieren.

Die Bestimmung der Methanolverwertungsphänotypen ergab für den Pichia-Klon N55 das in

Abb. 3-11 gezeigte Resultat:

Abb. 3-11: Bestimmung des Methanolverwertungs-Phänotyps des Pichia Expressionsklons N55durch PCR (2.2.1). Die in der PCR mit spezifischen Primern für die Expressionskassette desscFv4813 und das native AOX1-Gen amplifizierten Banden wurden im Agarosegel (2.2.2)analysiert. Die Pfeile zeigen die Banden an, die dem intakten AOX1-Gen (2,3 kB), bzw. derscFv4813 Expressionskassette (1,3 kB) größenmäßig entsprechen.

Die Bande der von den 5'AOX und 3'AOX-Sequenzen flankierten Expressionskassette des

scFv4813 war deutlich erkennbar und wies die berechnete Größe von 1,3 kB auf. Die Bande für

das intakte AOX1-Gen war schwächer, was darauf zurückzuführen sein könnte, daß der

Expressorklon N55 im G418-Resistenztest über die Toleranz gegen erhöhte Konzentrationen des

Antibiotikums G418 (s. Einleitung) als Träger mehrerer Kopien der Expressionskassette


60

identifiziert wurde (Raven, 1999), für das fremde Gen also zu Beginn der PCR mehr Matrizen-

DNA vorlag. Auch die PCR-Untersuchung des für die Vorversuche verwendeten Pichia-Klons

PP599 (2.1.7.2) hatte einen Mut+-Genotyp enthüllt (Robin, 1998), so daß davon ausgegangen

werden konnte, daß die mit dem Klon PP599 erhaltenen Ergebnisse bezüglich der Optimierung

des Fermentationsverfahrens im wesentlichen auf den Klon N55 anwendbar waren.

3.3.3 Methanol-Toleranz von Pichia pastoris im Schüttelkolben

Aus Versuchen mit anderen Pichia-Klonen war bekannt, daß die Expression der CEA N-A3

Domäne im Schüttelkolben stark von der Ausgangskonzentration von Methanol abhängt

(Hellwig et al., 1999). Die Toleranz des Pichia-Klons N55 für Methanol sollte ermittelt werden,

um für den Vergleich der Expression im Fermenter mit der im Schüttelkolben aussagekräftige

Daten zu erzeugen. Abb. 3-12 zeigt die nach 36-stündiger Induktion mit verschiedenen

Methanol-Ausgangskonzentrationen im Überstand nachweisbare Menge an sekretiertem

scFv4813. Als Maß für die Akkumulation des his6-markierten scFv4813 Antikörperfragments

wurden die per Oberflächenplasmonresonanz (2.3.9.1) erhaltenen Werte verwendet.

0

500

1000

1500

2000

6,5

5,5

4,5

3,52,5

1,5

0,5

Methanol [% (v/v)]

scF

v 48

13 [R

U]

Abb. 3-12: Expression von scFv 4813 in Pichia pastoris Klon N55 (2.1.7.2) im Schüttelkolbenmit verschiedenen Methanol-Ausgangskonzentrationen (2.5.4). Die Akkumulation vonsekretiertem scFv4813 im Medium wurde durchOberflächenplasmonresonanz (2.3.9.1) ermittelt.

Die Ergebnisse zeigen eine deutlich höhere Akkumulation des scFv4813 in den Kolben mit

höherer Methanol-Ausgangskonzentration. Das Maximum liegt bei der Ausgangskonzentration

von 4.5 % (v/v) mit 2000 RU fast dreimal so hoch wie bei den vom Hersteller (Invitrogen)


61

verwendeten Ausgangskonzentrationen von 0.5 % (v/v). Dieses Ergebnis wurde durch die

Analyse der Proben durch SDS-PAGE und Coomassie Färbung bestätigt (Daten nicht gezeigt).

Die Tatsache, daß Pichia pastoris im Schüttelkolben Methanolkonzentrationen bis zu

4,5 % (v/v) toleriert, ist überraschend, da in der Literatur die Toxizitätsgrenze von Methanol bei

methylotrophen Hefen bei 0,5 bis 1 % (v/v) angesiedelt wird. Der Grund für diesen Effekt

könnte darin liegen, daß die Sauerstoffversorgung unter den gewählten Bedingungen (2.5.4)

unzureichend ist: Die Zelldichte liegt zu Beginn der Induktion bei ca. 250 g·l-1, so daß die

Gelöstsauerstoffkonzentration nahe 0 liegen dürfte. Möglicherweise erfolgt unter diesen

Bedingungen die Bildung des toxischen Formaldehyds im ersten Schritt der

Methanolverwertungskette so langsam, daß ein Effekt auf den Zellmetabolismus erst bei sehr

hohen Methanolkonzentrationen auftritt.

Dieses Ergebnis ist insofern relevant für die Fermentation von Pichia, als daß zumindest

unter sauerstofflimitierten Bedingungen von einer höheren Toleranz als 0,5 % (v/v) für Methanol

ausgegangen werden kann, was vereinfachte Zufütterungsstrategien und Zulaufgeometrien

erlaubt.

3.3.4 Wachstumskinetik im Fermenter und Optimierung der Fermentationsstrategie

Die "Standard"-Fermentationsstrategie für Pichia pastoris entsprechend dem Handbuch der

Fa. Invitrogen (Pichia Expression Manual, Invitrogen, Carlsbad, CA, Version D) ist in Abb. 3-13

anhand einer Fermentation des Klons PP599 demonstriert. Dieser Klon wurde verwendet, um die

Fermentationsstrategie von Pichia pastoris zu etablieren und zu optimieren, bevor ein

Expressorklon für den scFv4813 identifiziert war.


62

0 12 24 36 48 60 72 84 960

50

100

150

200

250

300

Fris

chge

wic

ht [g

·L-1

]

Zeit [h]

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

321

Gly

zerin

/Met

hano

l Zuf

uhrr

ate

[mL·

h-1]

Abb. 3-13: Fermentation von Pichia pastoris Klon PP599 im 5-l Maßstab nach demStandardprotokoll (2.5.5). Die Zufuhrraten von Glyzerin (gestrichelte Linie) bzw. Methanol(punktierte Linie) wurden manuell gewählt. Das Frischgewicht (!) wurde gravimetrischbestimmt (2.5.3). Die Pfeile geben die Dauer der Anwachsphase auf Glyzerin (1), derZwischenphase im Glyzerin-Zulaufverfahren (2) bzw. der Induktionsphase im Methanol-Zulaufverfahren (3) dar.

Die drei Abschnitte der Fermentation sind deutlich erkennbar. 4 l Fermentationsmedium "A"

(2.5.5.1) wurden mit 4 % (v/v) einer Vorkultur (2.5.2) des Klons PP599 beimpft. Innerhalb von

31 h wurde das gesamte eingesetzte Glyzerin verbraucht und ein Frischgewicht von 127 g·l-1

erreicht. Der zweite Abschnitt der Fermentation war durch eine 5 Stunden andauernde Glyzerin-

Zulaufphase definiert. Die Zufuhrrate der 50%igen Glyzerinlösung betrug 37 ml·h-1 und wurde

manuell gewählt. In dieser Phase erhöhte sich das Frischgewicht auf 214 g·l-1. In der dritten

Phase der Fermentation wurde die Expression des heterologen Proteins durch Zufuhr von

Methanol als einziger Kohlenstoffquelle bei einer manuell vorgegebenen Rate von 18 ml·h-1,

entsprechend ca. 4 ml·l-1·h-1 über einen Zeitraum von 46 h induziert. Das Wachstum war auf

Methanol deutlich langsamer, so daß das Frischgewicht während der Induktion plateauartig bei

ca. 225 g·l-1 verlief.

Das Standardverfahren wurde in mehreren Schritten hinsichtlich der Inokulumgröße, der

Salz- und Glyzerinkonzentrationen im Medium und der Fermentationsstrategie optimiert.


63

Abb. 3-14 zeigt anhand der Produktion des Fusionsproteins CEA N-A3 mit Pichia pastoris

Klon PP599 den typischen Verlauf einer Fermentation mit 4,5 l Arbeitsvolumen nach der

optimierten Strategie.

0 12 24 36 48 60 720

100

200

300

400

500

600

Fris

chge

wic

ht [g

·L-1]

Zeit [h]

0

100

200

300

400

500

600

CE

A N

-A3

[RU

]

0

2

4

6

8

Met

hano

l-Zuf

uhrr

ate

[ml·h

-1]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

CE

A N

-A3,

ELI

SA

, 1:1

2.80

0)

Abb. 3-14: Fermentation von Pichia pastoris Klon PP599 im 5-l Maßstab (2.5.5). Die Methanol-Zufuhrrate (gestrichelte Linie) wurde manuell gewählt. Das Frischgewicht (!) wurdegravimetrisch bestimmt (2.5.3). Die Akkumulation des CEA N-A3 wurde per Oberflächen-plasmonresonanz (", 2.3.9.1) bzw. im ELISA (#()2.3.7.2) bestimmt.

Das optimierte Fermentationsmedium "B" (2.5.5.1) enthielt eine um die Hälfte erniedrigte

Konzentration an Basalsalzen und eine auf 5 % erhöhte Glyzerin-Ausgangskonzentration. Durch

die Erhöhung des Inokulationsvolumens auf 400 ml (9 %) konnte die Biomassebildungsphase

trotz der erhöhten Glyzerin-Ausgangskonzentration auf 22 h verkürzt werden. Die für den

Beginn der Induktionsphase erwünschten Zelldichten von ca. 170 g·l-1 konnten mit 5 % Glyzerin

auch ohne Glyzerin-Zulaufphase erzielt werden. Dabei wurden mit 0.22 h-1 die gleichen

maximalen Wachstumsraten erreicht, wie mit dem Fermentationsmedium "A".

Durch eine sehr niedrig dosierte Methanolzufuhr und deren stufenweise Erhöhung auf einen

Maximalwert von 8 ml·h-1 oder ca. 2 ml·l-1·h-1 wurde ein glatter Übergang in die Induktionsphase

erreicht. Die finale Methanolzufuhrrate lag erheblich niedriger als die im Handbuch

vorgeschlagene. Der Mut+ Klon PP599 erreichte bei langsamer Adaption durch die stufenweise

Erhöhung der Methanol-Zufuhrrate Wachstumsraten um 0,02 h-1 auf Methanol als

Kohlenstoffquelle, so daß sich das Frischgewicht bis zum Ende der Fermentation bei 69 h auf

370 g·l-1 erhöhte. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Halbierung der Salzkonzentration des Mediums


64

sich selbst im extremen Hochzelldichtebereich nicht negativ auf die Wachstumsrate oder die

erreichbare Biomassekonzentration auswirkt.

Bei Verwendung des Fermentationsmediums "A" waren beim Einstellen des pH-Werts auf

neutral-basische Werte zu Beginn der Aufarbeitung stets größere Mengen Salze ausgefallen.

Dieser Effekt unterblieb mit dem salzreduzierten Fermentationsmedium "B".

Die Akkumulation des sekretierten CEA N-A3 im Überstand wurde mit Hilfe von der

Oberflächenplasmonresonanz (2.3.9.1) und des ELISA (2.3.7) bestimmt. Der Vergleich der

Werte zeigt, daß beide Methoden im wesentlichen gleiche, relative Ergebnisse bringen (Abb.

3-14). Dies bedeutet, daß die schnellere und wegen der hohen Kosten der für den ELISA

benötigten Antigene und sekundären Antikörper billigere Methode der Bestimmung über die

Oberflächenplasmonresonanz für die Standardanalytik einer Fermentationen verwendet werden

kann. Die Abschätzung der Konzentrationen war schwierig, da das vom Klon PP599 sekretierte

Fusionsprotein in Pichia stark und heterogen glykosyliert ist, und im PAA-Gel über den Bereich

von 45 bis 200 kDa "schmiert" (Hellwig et al., 1999).

Die mit Hilfe dieses Klons entwickelte Fermentationsstrategie in Bezug auf Inokulumgröße,

Medium und Adaption an Methanol im 5-l Maßstab konnte erfolgreich auf die Fermentation des

Klons N55 übertragen werden (3.4.1).

3.3.5 Maßstabsvergrößerung in den 30-Liter Maßstab

Die Maßstabsvergrößerung in den 30-l Maßstab erfolgte aufbauend auf den anhand des

Pichia-Klons PP599 gewonnenen Ergebnissen mit dem Klon N55. Die ersten Versuche wurden

im Biopilot 40 Reaktor ohne eingebaute Stromstörer gemacht (Abb. 2-1). In den Proben der

ersten Fermentationen ließ sich der scFv4813 weder über Oberflächenplasmonresonanz noch

über den ELISA nachweisen (Daten nicht gezeigt). Auch im Coomassie-gefärbten SDS-PAA-

Gel ließ sich kein scFv Fragment nachweisen, obwohl die Produktion im 5-l Reaktor erfolgreich

verlaufen war (A in Abb. 3-15). Wachstum und Sauerstoff-, Ammonium- sowie

Methanolverbrauch ließen keine direkten Schlüsse auf den Grund dafür zu (Daten nicht gezeigt).

Auch Zellen, die unter sterilen Bedingungen während der Induktionsphase aus dem 30-l

Fermenter geerntet und im Schüttelkolben mit BMMY-Medium induziert wurden, zeigten

normale Expression des scFv (Daten nicht gezeigt). Eine Fermentation des Klons 3299, der ein

anderes scFv Fragment sehr stark exprimiert (bis zu 200 mg·l-1 im Fermentationsüberstand),

zeigte deutliche Degradation dieses Fragments im 30-l Maßstab (B in Abb. 3-15).

Aus diesen beiden Befunden ließ sich folgern, daß es sich bei den enttäuschenden

Expressionsergebnissen im 30-l Reaktor nicht um ein Expressions- sondern um ein


65

Degradationsproblem handelte, daß durch chemisch-physikalische Faktoren der Kultivierung im

30-l Reaktor ausgelöst wurde.

Abb. 3-15: Coomassie-gefärbtes SDS PAA-Gel (2.3.5) von Proben aus verschiedenenFermentationen von Pichia pastoris im 30-l Reaktor vor dem Einbau von Stromstörern in denReaktor. In allen Fällen wurden 30 µl Überstand geladen. A: Klon N55 (2.1.7.2). 1-2:Fermentationen mit 30 l Arbeitsvolumen 3-5: Fermentation mit 18 l Arbeitsvolumen 6:Positivkontrolle aus dem 5-l Reaktor. B: Klon 3299 (2.1.7.2), 30 l Arbeitsvolumen. Die Pfeilezeigen die Banden des scFv4813 an (A, Spur 6), bzw. des scFv3299 (B) und dessenDegradationsprodukte.

In der Tat traten die Probleme nicht mehr auf, nachdem der 30-l Reaktor mit vier

Stromstörern nachgerüstet worden war. Die durch die Schikanen verbesserte Durchmischung hat

Einfluß auf zahlreiche Prozeßfaktoren: In schlecht durchmischten Zonen können Sauerstoff-

oder Nährstoffmangel oder lokale pH-Gradienten auftreten. Möglicherweise kommt es durch

einen solchen Faktor auch zur Expression von Proteasen. Die Fragen welcher dieser Faktoren die

Degradationsprobleme verursacht hatte und ob es sich um einen chemisch-physikalischen Faktor

oder um eine dadurch induzierte Expression extrazellulärer Proteasen handelte, wurden nicht

weiter verfolgt. SDS-PAA Gele, die die erfolgreiche Expression des scFv4813 im 30-l Reaktor

zeigen sind in Abb. 3-17 und Abb. 3-25 gezeigt.

3.3.6 Optimierung der Methanol-Zufuhrsteuerung

Die Standard-Ausstattung von Rührkesselreaktoren umfaßt üblicherweise Echtzeiterfassung

und -regelung von Temperatur, pH-Wert, Gelöstsauerstoff (dO2) und Füllhöhe, nicht aber eine

Methanol-Analytik. Aufgrund der Toxizität von Methanol ist es aber notwendig, bei dessen

Verwendung als Kohlenstoffquelle unterhalb einer bestimmten Grenze zu bleiben, die unter

anderem von der Sauerstoffverfügbarkeit abhängt. Auch wenn gezeigt werden konnte, daß

zumindest im Schüttelkolben die Methanoltoleranz erstaunlich hoch war, war eine Steuerung der


66

Methanolkonzentration in einem engeren Bereich wünschenswert. Entsprechende Versuche zur

Optimierung der Zufuhrsteuerung wurden sowohl im 5-l als auch im 30-l Reaktor durchgeführt.

3.3.6.1 Messung der Methanolkonzentration bei manueller Steuerung der Zufuhrrate

Zur Verdeutlichung der Problematik der Fermentationsführung mit manuell gesteuerter

Methanolzufuhr (entsprechend der in 3.3.4 geschilderten Strategie) wurde die

Methanolkonzentration im Verlauf einer solchen Fermentation gemessen und aufgezeichnet.

Dies geschah, nachdem die Technologie zur Methanolmessung in Echtzeit bereits etabliert war,

um Klarheit zu erhalten, welche Methanolkonzentrationen im Verlauf einer manuell gesteuerten

Fermentation überhaupt auftreten. Das Ergebnis ist in Abb. 3-16 dargestellt.

00 24 48 72 96 1200

100

200

300

400

Fris

chge

wic

ht [g

·L-1]

scF

v481

3 [R

U]

Zeit [h]

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

B

A

21

Met

hano

l-Zuf

uhrr

ate

[ml·l

-1·h

-1]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Met

hano

l [%

(v/

v)]

0

20

40

60

80

100

120

140

dO2

[%]

Abb. 3-16: Fermentation von Pichia pastoris Klon N55 im 30-l Maßstab mit Echtzeit Methanol-Analytik (2.5.5). Die Messung der Methanolkonzentration (A, durchgezogene Linie) erfolgte mitHilfe des Frings ALKOSENS II (2.5.5.4). Die Steuerung der Methanol-Zufuhrrate (A,gestrichelte Linie) erfolgte manuell aufgrund von Erfahrungswerten und anhand des Verlaufs derGelöstsauerstoffkonzentration. Die Gelöstsauerstoffkonzentration (B, durchgezogene Linie)wurde in Echtzeit erfaßt, Frischgewicht (!) gravimetrisch (2.5.3) und Akkumulation vonscFv 4813 (") per Oberflächenplasmonresonanz (2.3.9.1) aus den Proben. Die Pfeile geben dieDauer der Biomassebildungsphase (1) bzw. der Induktionsphase (2) an.

Nach der Anwachsphase von 35 h wurde bei einem Frischgewicht von 185 g·l-1 durch Zufuhr

von Methanol bei einer konstanten Rate von 1 ml·l-1·h-1 die Induktionsphase eingeleitet. Da die

Zellen zu diesem Zeitpunkt noch an Glyzerin adaptiert waren, akkumulierte Methanol. Mit

zunehmender Adaption der Zellen innerhalb der nächsten Stunden stieg der spezifische


67

Methanolverbrauch. Nach 42 h erreichte die Methanol-Verbrauchsrate den Betrag der Methanol-

Zufuhrrate und stieg darüber an, wodurch die Methanolkonzentration im Fermenter wieder

absank. Die Erschöpfung des während der Adaptionsphase akkumulierten Methanols wurde nach

59 h durch ein plötzliches Ansteigen der Gelöstsauerstoffkonzentration ("dO2-spike") angezeigt.

Dies war das Signal, die Methanolzufuhrrate auf 2 ml·l-1·h-1 zu erhöhen. Nach 4,5 h bei

2ml·l-1·h-1 wurde die Methanolzufuhr kurz gestoppt. Die Zeit bis zum Auftreten eines erneuten

dO2-spikes lag über 1 min, was darauf hinwies, daß die Methanol-Verbrauchsrate unter 2

ml·l-1·h-1 lag. Die Zufuhrrate wurde auf 1,2 ml·l-1·h-1 abgesenkt. Im weiteren Verlauf der

Induktionsphase wurde noch mehrfach die Zeit bestimmt, die nach dem Stop der Substratzufuhr

bis zum Auftreten des dO2-spikes vergeht (bei 87/89 h bzw. 107/111 h). Dieses Verfahren stellt

die einzige Möglichkeit dar, ohne Echtzeit-Methanolmessung die Methanolzufuhrrate auf den

Verbrauch abzustimmen.

Der Verlauf der Methanolkonzentration zeigt, daß bei diesem Verfahren die

Methanolkonzentration während der Induktionsphase zwischen 0 und 0,4 % (v/v) schwankte.

Das Frischgewicht nahm während der Induktionsphase nur von 182 auf 243 g·l-1 zu. Die

Konzentration von scFv4813 im Überstand nahm in der zweiten Hälfte der Induktionsphase

kaum noch zu, ein Befund der durch SDS-PAGE und Western Blot (Abb. 3-17) bestätigt wird.

Abb. 3-17: Analyse der Akkumulation von sekretiertem scFv4813 im Überstand der in Abb.3-16 gezeigten Fermentation des Klons N55. 30 µl zellfreier Überstand wurden durch SDS-PAGE (2.3.5) aufgetrennt und durch Coomassie-Färbung (2.3.5.2) nachgewiesen (links). Für denWestern Blot (2.3.6) der gleichen Proben wurden jeweils 10 µl aufgetrennt und nach demBlotten mit Hilfe des monoklonalen M-α-his6 (2.1.4) und des sekundären Antikörpers GAM-AP(2.1.4) detektiert (rechts). Die Pfeile zeigen die Banden an, deren Größe mit der für scFv4813berechneten Bande übereinstimmt. Die Proben wurden zu den über den jeweiligen Spurenstehenden Zeitpunkten gezogen. Pro Spur wurden 30 µl (Coomassie-Färbung) bzw. 10 µl(Western Blot) des zellfreien Überstandes aufgetragen.


68

Die Tatsache, daß im Western Blot außer der Bande des scFv4813 keine weiteren Banden

durch den anti-his6-Antikörper detektiert werden zeigt, daß keine proteolytischen Abbauprodukte

des scFv4813 im Medium vorliegen, ansonsten würden C-terminale kleinere Proteinbanden

detektiert werden. Außerdem weist dieses Ergebnis darauf hin, daß die schnelle Bestimmung der

im Überstand akkumulierten scFvs über den His6-tag mit der Oberflächenplasmonresonanz

(2.3.9.1) wahrscheinlich nicht durch andere Proteine im Überstand gestört wird bzw. es sich bei

der Gesamtheit des auf dem NTA-Chip gebundenen Proteins tatsächlich um scFv4813 handelt.

Insgesamt zeigt diese Fermentation, daß die manuelle Steuerung der Methanol-Zuflußrate

zwar möglich ist, aber zu stark schwankenden Methanolkonzentrationen führt. Eine solche

Fermentation ist nicht reproduzierbar, da eine Vielzahl von Parametern wie z. B. Frischgewicht,

Volumen, Belüftungsrate, Abluftkühlung etc. auf den Methanolverbrauch Auswirkungen haben,

der sich zudem aus der Summe von Methanol-Stoffwechsel und Methanolverlust über die Abluft

zusammensetzt. Die Methanolkonzentration stellt aber wegen der doppelten Funktion des

Methanols als einzige Kohlenstoffquelle und als Induktor einen wesentlichen Prozessparameter

dar. Zudem war dieses Ergebnis nur auf der Basis der aus vorangegangenen Fermentationen

gewonnenen Daten bezüglich des Methanolverbrauchs erzielbar. Beim Start der Methanolzufuhr

mit einer Rate von 4 ml·l-1·h-1, wie z. B. bei der in Abb. 3-13 gezeigten Fermentation wären bei

gleicher Dauer der Adaptionsphase wesentlich höhere Methanolkonzentrationen akkumuliert

worden.

3.3.6.2 Steuerung der Methanolzufuhr über die Gelöstsauerstoffkonzentration

Eine erste Verbesserung der Steuerung der Methanol-Zufuhrrate wurde erreicht, indem die

Methanol-Pumpe in Abhängigkeit von der Gelöstsauerstoffkonzentration durchgeführt wurde (B

in Abb. 2-2). Diese Strategie wurde in der in Abb. 3-18 gezeigten Fermentation im 5-l Maßstab

ab 53 h verfolgt (4), nachdem zuvor die Biomassebildungsphase auf Glyzerin (1), eine langsame

Adaption an Methanol (2) und eine Phase mit manuell gesteuerter Methanolzufuhr (3)

durchgeführt worden waren. Bei Überschreitung einer Gelöstsauerstoffkonzentration von 20 %

wurde die Methanol-Pumpe aktiviert. Die Stellgröße dieses Regelkreises wurde alle 15 s neu

berechnet. Dies entspricht der Zeit, die die Meßgröße dO2 unter den gegebenen Bedingungen bei

Erschöpfung der Kohlenstoffquelle benötigt, um ca. 20 % anzusteigen bzw. um bei erneuter

Dosierung von Methanol um diesen Wert abzufallen. Die Pumpintervalle waren so gewählt, daß

innerhalb von zwei Regelkreiszeiten maximal 0,05 % (v/v) Methanol gefördert werden konnten.

Die anhand der Einschaltzeiten der Methanol-Pumpe berechnete Förderrate lag in den ersten

18 h mit relativ konstanten 4,2 ml·min-1 nahe bei dem Wert, der sich in den manuell gesteuerten


69

Fermentationen als sinnvoll erwiesen hatte. Danach kam der Regelkreis allerdings ins

Schwingen, wie Abb. 3-18 zeigt. Die sich in dieser Phase einstellenden Methanol-

konzentrationen konnte nicht gemessen werden, allerdings weisen die niedrigen Wachstumsraten

und die Stagnation der Konzentration des scFv4813 im Überstand nach 80 h auf nicht optimale

Verhältnisse hin.

Diese Regelung der Methanol-Zufuhrrate stellt insofern eine Verbesserung dar, als die

Methanol-Zufuhr automatisch der Entwicklung des Methanolverbrauchs folgt und die Gefahr der

Akkumulation von Methanol bzw. der Unterversorgung der Zellen entfällt. Allerdings lassen

sich damit nur Methanolkonzentrationen nahe 0 % (v/v) realisieren.

00 12 24 36 48 60 72 84 960

50

100

150

200

250

300

350

400

Fris

chge

wic

ht [g

·L-1]

scF

v481

3 [R

U]

Zeit [h]

020406080

100120140160180

3 41 2

dO2

[%]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

scF

v481

3, E

LIS

A, 1

:400

0

2

4

6

8

10

Met

hano

l-Zuf

uhrr

ate

[mL·

h-1]

Abb. 3-18: Fermentation von Pichia pastoris Klon N55 mit dO2-gesteuerter Methanolzufuhr(2.5.5) ab 53 h. Die Zufuhrrate (gestrichelte Linie), wurde bis zu diesem Zeitpunkt manuellvorgegeben. Die Gelöstsauerstoffkonzentration (durchgezogene Linie) wurde automatischaufgezeichnet. Das Frischgewicht (!) wurde gravimetrisch ermittelt (2.5.3), die Akkumulationvon scFv4813 (") per Oberflächenplasmonresonanz (2.3.9.1) und im ELISA (2.3.7.3).

3.3.6.3 Methanolanalytik und –steuerung in Echtzeit

Als Konsequenz aus diesen Ergebnissen ergab sich die Forderung nach einer

konzentrationsabhängigen Steuerung der Methanolkonzentration. Aufgrund der hohen

Zelldichten und der entsprechend hohen Methanol-Metabolisierungsraten konnte eine solche

Steuerung nur über eine Echtzeit-Methanol-Analytik erfolgen. Dazu kam der in der industriellen

Essigsäurefermentation etablierten "ALKOSENS II" Ethanolsensor (Heinrich Frings GmbH &

Co. KG, Bonn) in Verbindung mit der "ACETOMAT" Steuereinheit des gleichen Herstellers


70

zum Einsatz. Diese Technologie erlaubte die weitere Optimierung der Methanol-

Zufuhrsteuerung (Abb. 3-19). Unmittelbar nach der Biomassebildungsphase (dO2-spike bei 26 h)

wurde die Adaption mit Hilfe einer festen Zufuhrrate von 1 ml·l-1·h-1 durchgeführt. Nach dem

ebenfalls am plötzlichen Anstieg des dO2 erkennbaren Ende der Adaptionsphase wurde die

Steuerung mit einem Sollwert von 0,5 % (v/v) aktiviert. Die Methanolkonzentration wurde bei

diesem Wert über 48 h konstant gehalten. Während dieser Phase nahm das Frischgewicht stetig

bis auf 300 g·l-1 zu. Das gleiche galt für die Akkumulation von scFv4813 im Medium, die einen

Endwert von 430 RU, entsprechend etwa 40-50 mg·l-1 erreichte.

00 12 24 36 48 60 72 840

50

100

150

200

250

300

Fris

chge

wic

ht [g

·L-1]

Zeit [h]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Met

hano

l [%

]

0

20

40

60

80

100

120

dO

2 [%

]

0

100

200

300

400

scF

V 4

813

[RU

]

Abb. 3-19: Fermentation von Pichia pastoris Klon N55 im 30-l Maßstab mit Echtzeit Methanol-Analytik und –Kontrolle (2.5.5). Die Methanolkonzentration (durchgezogene Linie) wurde mitdem Frings ALKOSENS II Alkoholsensor bemessen (2.5.5.4). Die Gelöstsauerstoff-konzentration (gepunktete Linie) wurde in Echtzeit erfaßt, Frischgewicht (!()2.5.3) gravimetrischund Akkumulation von scFv 4813 ("')per Oberflächenplasmonresonanz *2.3.9.1).

Diese Fermentationsstrategie erwies sich im weiteren Verlauf der Arbeit als in Bezug auf die

Reproduzierbarkeit, die während der Induktionsphase beobachteten Wachstumsraten und die

Qualität der Dokumentation der Fermentation gut geeignet.

3.3.6.4 Glyzerinsupplementierung während der Induktionsphase

Verschiedene Literaturstellen (Sreekrishna et al., 1989; Loewen et al., 1997; Sreekrishna et

al., 1997; Katakura et al., 1998) berichten von erfolgreicher Fermentation von Pichia pastoris


71

unter Verwendung von "mixed feeds", d. h. der gleichzeitigen Zufuhr von Methanol und

Glyzerin während der Induktionsphase. Diese Strategie geht davon aus, daß Glyzerin als leichter

verfügbare Energie- und Kohlenstoffquelle die Synthesekapazität der Zellen während der

Induktionsphase verbessert, ohne die AOX1-abhängige Expression des Produkts zu inhibieren.

Um diesen theoretischen Ansatz für den Pichia pastoris Klon N55 zu überprüfen, wurden

Fermentationen durchgeführt, in denen während der wie in 3.3.6.3 durchgeführten

Induktionsphase zusätzlich Glyzerin zugegeben wurde. Dabei ist die spezifische (auf Biomasse

bezogene) Glyzerin-Zufuhrrate wichtiger als die volumetrische (auf Volumen bezogene)

Zufuhrrate. Durch Zufuhr von Glyzerin mit gleichbleibender Zufuhrrate bei steigendem

Frischgewicht wurden stetig sinkende spezifische Zufuhrraten erreicht, so konnte innerhalb einer

einzigen Fermentation eine gewisse Spannbreite an spezifischen Glyzerin-Zufuhrraten

untersucht werden.

Abb. 3-20 zeigt eine solche Fermentation, bei der ab 39 h Glyzerin mit einer Rate von

4,9 g·l-1·h-1 zugeführt wurde und ab 42 h Methanol konstant auf 0,5 % gehalten wurde.

00 12 24 36 48 60 720

100

200

300

400

Fris

chge

wic

ht [g

·L-1]

Time [h]

0

20

40

60

80

100

120

140 21

dO2

[%]

0

50

100

150

200

scF

v481

3 [R

U]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Met

hano

l [%

(v/

v)]

Abb. 3-20: Fermentation von Pichia pastoris Klon N55 im 30-l Maßstab mit Echtzeit Methanol-Analytik zusätzlicher Glyzerinsupplementierung: Methanol wurde in Echtzeit gemessen undautomatisch auf 0.5 % (v/v) geregelt (durchgezogene Linie). Glyzerin wurde während derInduktionsphase mit einer festen Rate von 4,9 g·l-1·h-1 zugeführt. Die Gelöstsauerstoff-konzentration (durchgezogene Linie) wurde in Echtzeit erfaßt, Frischgewicht (!) gravimetrischund Akkumulation von scFv4813 (") per Oberflächenplasmonresonanz.


72

Die initiale spezifische Zufuhrrate von 38 mg·g-1·h-1 (A in Abb. 3-21) war so gewählt, daß sie

limitierend war, d. h. das zugeführte Glyzerin wurde sofort aufgenommen und akkumulierte

nicht im Fermenter. Ab 41 h wurde zur Induktion eine Methanolkonzentration von 0,5 % (v/v)

eingestellt.

Durch die Glyzerinsupplementierung lag die Wachstumsrate mit 0,023 h-1 während der

Fermentation etwa doppelt so hoch wie mit Methanol als alleiniger Kohlenstoffquelle (Abb.

3-19, Tabelle 3-2). Die Fermentation wurde bei einem Frischgewicht von 450 g·l-1 beendet, als

erkennbar wurde, daß eine gleichmäßige Durchmischung aufgrund der hohen Zelldichte nicht

mehr erfolgte. Die Konzentration des scFv4813 im Überstand blieb mit maximal 23 RU am

unteren Bereich der Nachweisgrenze, d. h. mindestens um den Faktor 20 unter der Expression

ohne Glyzerinsupplementierung.

Daraus wurde gefolgert, daß die spezifische Glyzerin-Zufuhrrate über den gesamten Verlauf

der Induktionsphase so hoch gewesen war, daß die AOX1-gesteuerte Expression des scFv4813

inhibiert wurde. Eine weitere Fermentation wurde durchgeführt, bei der die Glyzerin-Zufuhrrate

um die Hälfte reduziert wurde. In dieser in Abb. 3-21 mit "B" bezeichneten Fermentation wurde

mit einer spezifischen Zufuhrrate von 14,5 mg·g-1·h-1 begonnen, durch die Zunahme der

Biomasse lag die spezifische Zufuhrrate zum Erntezeitpunkt bei 6,5 mg·g-1·h-1.

00 12 24 36 48 60 72 84 960

5

10

15

20

25

30

35

40

C

B

A

Spe

zifis

che

Gly

zerin

-Zuf

uhrr

ate

[mg·

g-1·h

-1]

Zeit [h]

Abb. 3-21: Spezifische Glyzerin-Zufuhrraten während der Induktionsphase dreierFermentationen im "mixed-feed" Verfahren ("). Glyzerin wurde mit festen Zufuhrraten vonA: 4,9, B: 2,45 bzw. C: 1,25 g·l-1·h-1 zugeführt. Daraus wurden durch Bezug auf dasFrischgewicht zum jeweiligen Zeitpunkt die spezifischen Zufuhrraten ermittelt. Die Pfeile gebendie Zeitpunkte an, zu denen durch Einstellung von 0,5 % (v/v) Methanol die Induktion begonnenwurde.


73

Auch hier lag die Frischgewichtszunahme (Daten nicht gezeigt) während der Induktion

erwartungsgemäß deutlich über dem in Fermentationen ohne zusätzliche Glyzerinzufuhr

beobachteten Maß. Allerdings blieben auch hier die Expressionswerte bis auf die letzte Probe am

unteren Bereich der Nachweisgrenze (Daten nicht gezeigt). In der letzten Probe zeigte die

Analyse per Oberflächenplasmonresonanz 81 RU, entsprechend einer Konzentration von ca. 8

mg·l-1. Dieses Ergebnis wurde durch eine entsprechend schwache Bande im Coomassie-

gefärbten PAA-Gel bestätigt (Daten nicht gezeigt).

Eine dritte Fermentation wurde durchgeführt (Abb. 3-22, "C" in Abb. 3-21), bei der die

Glyzerin-Zufuhrrate nochmals auf 1,25 g·l-1·h-1 halbiert wurde, so daß sich eine spezifische

Glyzerin-Zufuhrrate von anfänglich 6,4 mg·g-1·h-1 ergab, die im Verlauf der Induktionsphase auf

4 mg·g-1·h-1 absank. Im Gegensatz zu den vorher beschriebenen "mixed-feed"-Fermentationen

mit spezifischen Glyzerin-Zufuhrraten von zwischen 38 und 5,5 mg·g-1·h-1 (A und B in Abb.

3-21) war in diesem Fall eine konstante Zunahme der Konzentration von scFv4813 im Überstand

meßbar. Die zum Erntezeitpunkt gemessenen Akkumulation des scFv4813 lag mit 228 RU –

entsprechend ca. 22 mg·l-1 allerdings etwa 50% unter den Werten ohne zusätzliche

Glyzerinzufuhr.

00 12 24 36 48 60 72 840

100

200

300

Fris

chge

wic

ht [g

·L-1]

scF

v 48

13 [R

U]

Zeit [h]

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Met

hano

l [%

(v/

v)]

0

2

4

6

8

Gly

zerin

Zuf

uhrr

ate

[mg·

g-1·h

-1]

0

30

60

90

120B

A

dO2

[%]

Abb. 3-22: Fermentation von Pichia pastoris Klon N55 im 30-l Maßstab. Methanol wurde inEchtzeit gemessen (2.5.5.4) und automatisch auf 0.5 % (v/v) geregelt (A, durchgezogene Linie).Glyzerin wurde während der Induktionsphase mit einer festen Rate von 1,25 g·l-1·h-1 zugeführt,durch Bezug auf die jeweilige Trockenbiomasse ergab sich die spezifische Zufuhrrate(gestrichelte Linie). Die Gelöstsauerstoffkonzentration (B, durchgezogene Linie) wurde inEchtzeit erfaßt, Frischgewicht (!) gravimetrisch (2.5.3) und Akkumulation von scFv 4813 (")per Oberflächenplasmonresonanz (2.3.9.1).


74

Eine Zusammenfassung der Fermentationen zur Untersuchung der Glyzerinsupplementierung

während der Induktionsphase zeigt Tabelle 3-2.

Tabelle 3-2: Eckdaten zu Fermentationen des Pichia Klon N55 im "mixed feed" Verfahren.

Glyzerin-Zufuhrrate

[g·l-1·h-1]

SpezifischeGlyzerin-

Zufuhrrate[mg·g-1·h-1]

Dauer[h]

End-Frisch-gewicht

[g·l-1]

Wachstums-rate

(Induktion)[h-1]

Endkonzentration scFv4813

[RU]

4,9 38 - 11 77 449 0,023 232,45 14,5 – 5,5 85 450 0,016 811,25 7,0 – 4,0 89 310 0,007 228

0 0 86 324 0,012 436

Der positive Einfluß der Glyzerinsupplementierung auf die Frischgewichtszunahme während

der Induktion wurde in den Endfrischgewichten bzw. Fermentationszeiten sowie anhand der

mittleren Wachstumsrate während der Induktion deutlich. Gleichzeitig wirkte sich Glyzerin

negativ auf die Akkumulation von sekretiertem scFv4813 aus, woraus gefolgert wurde, daß die

Induktion des AOX1-Promotors durch Glyzerin auch bei niedrigen spezifischen Zufuhrraten

inhibiert wurde.

Die Wachstumsrate bei der am niedrigsten dosierten Glyzerinsupplementierung lag sogar

noch unterhalb der ohne Glyzerinzufuhr. Eine erniedrigte Wachstumsrate bei geringer

Glyzerinzufuhr und gleichzeitig nicht limitierter Methanolverfügbarkeit weist darauf hin, daß

nicht nur, wie bereits diskutiert, die Expression des rekombinanten Proteins durch Glyzerin

inhibiert wird, sondern wahrscheinlich auch die Expression der Alkoholoxidase 1 selber, die

vom gleichen Promotor abhängig ist.

Es lagen also zwei Hinweise vor, die zeigen, daß für den Pichia Klon N55 nicht nur die

Expression rekombinanter Proteine sondern auch die der Alkoholoxidase 1, die beide über den

AOX1-Promotor gesteuert werden, durch Glyzerin selbst in extrem niedrigen spezifischen

Zufuhrraten negativ beeinflußt werden. Sowohl die spezifische Expression, als auch die Raum-

Zeit-Ausbeute der gesamten Fermentation profitierten nicht von der Glyzerinsupplementierung.

Aus diesem Grund wurde für die anschließenden Fermentationen zur Produktion des scFv4813

auf die Strategie der Induktion mit Methanol als einziger Kohlenstoffquelle zurückgegriffen. Die

Methanolzufuhrrate wurde dabei im 5-l Reaktor, in dem die Verwendung der ALKOSENS II

Sonde aus technischen Gründen nicht möglich war, über die Gelöstsauerstoffkonzentration

gesteuert (Abb. 2-2 B), im 30-l Reaktor dagegen über die on-line Methanol-Analytik (Abb. 2-2

C), die die Einhaltung einer konstanten Methanolkonzentration von 0.5% (v/v) ermöglichte.


75

3.4 Produktion von scFv4813 in Pichia pastoris

3.4.1 Produktion von scFv4813 im 5-Liter Maßstab

Abb. 3-23 zeigt die Produktion des scFv4813 nach dem optimierten Verfahren (2.5.5.3) für

den 5-l Reaktor. Da eine Echtzeitmessung mit der Frings ALKOSENS II-Sonde wegen der

Abmessungen der Sonde im 5-l Reaktor nicht möglich war, war die Steuerung der

Methanolzufuhr in Abhängigkeit von der Sauerstoffkonzentration (B in Abb. 2-2) in diesem

Reaktor das Verfahren der Wahl.

Nach der Anwachsphase wurde die Kultur für 6 Stunden mit niedrigen, manuell eingestellten

Zufuhrraten von maximal 2 ml·l-1·h-1 an Methanol adaptiert, unmittelbar danach wurde die

Methanolzufuhr durch die dO2-abhängige Steuerung übernommen (vgl. 3.3.6.2). Im Vergleich zu

der in Abb. 3-18 gezeigten Fermentation waren die Regelparameter des Steuerkreises hier soweit

optimiert, daß das Systems nicht mehr ins Schwingen geriet. Dementsprechend zeigte das

Frischgewicht während der Fermentation eine stetige Zunahme. Das gleiche galt für die

Konzentration von scFv4813 im Überstand.

00 12 24 36 48 60 720

50

100

150

200

250

300

350

Fris

chge

wic

ht [g

·L-1]

Zeit [%]

0

20

40

60

80

100

dO2

[%]

0

50

100

150

200

250

300

scF

v481

3 [R

U]

0

1

2

3

4

5

Met

hano

l-Zuf

uhrr

ate

[mL·

L-1·h

-1]

Abb. 3-23: Fermentation von Pichia pastoris Klon N55 im 5-l Maßstab mit dO2-gesteuerterMethanol-Zufuhr (2.5.5.3). dO2 wurde in Echtzeit gemessen (durchgezogene Linie) undwährend der Induktionsphase durch automatische Zugabe von Methanol auf 20 % reguliert. Ausden Einschaltzeiten der Methanol-Pumpe wurde die Zufuhrrate (gestrichelte Linie) berechnet.Das Frischgewicht (!) wurde gravimetrisch (2.5.3) und die Akkumulation von scFv 4813 (") perOberflächenplasmonresonanz (2.3.9) aus den Proben ermittelt.


76

Der aus dieser Fermentation gewonnene Kulturüberstand wurde verwendet, um die

Reinigungsstrategie für scFv4813 in Vorbereitung auf die optimierte Fermentation im 30-l

Maßstab zu entwickeln (Daten nicht gezeigt).

3.4.2 Produktion des scFv4813 im 30-Liter Maßstab

Die Produktion des scFv4813 im 30-l Maßstab wurde den Ergebnissen der Optimierung

folgend mit Echtzeit-Methanol-Analytik und –Kontrolle durchgeführt (Abb. 2-2 C), bei der auf

zusätzliche Glyzerinsupplementierung verzichtet wurde. Die Anwachsphase war bedingt durch

ein kleineres Inokulum länger als bei vergleichbaren Fermentationen mit dem gleichen Klon.

Nach Adaption mit festen Methanol-Zufuhrraten wurde die Methanolkonzentration auf konstant

0,5 % (v/v) gesteuert und für ca. 50 h aufrechterhalten. Abb. 3-24 zeigt das Ergebnis.

00 24 48 72 960

50

100

150

200

250

300

350

Fris

chge

wic

ht [g

·l-1]

Zeit [h]

0

20

40

60

80

100

120

140321

dO2

[%]

0

100

200

300

400sc

Fv4

813

[RU

]

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Met

hano

l [%

(v/

v)]

Abb. 3-24: Fermentation von Pichia pastoris Klon N55 im 30-l Maßstab. Methanol wurde inEchtzeit gemessen (2.5.5.4) und automatisch auf 0,5 % (v/v) geregelt (punktierte Linie). DieGelöstsauerstoffkonzentration (durchgezogene Linie) wurde in Echtzeit erfaßt, Frischgewicht (!)gravimetrisch (2.5.3) und Akkumulation von scFv 4813 (") per Oberflächenplasmonresonanz(2.3.9). Die Pfeile verdeutlichen die Dauer der Anwachsphase (1), der Adaptionsphase (2) undder Induktionsphase (3)

Die Zellmasse nahm während der Induktionsphase stetig bis auf einen Endwert von 338 g·l-1

zu, dies entsprach einem Feststoff- bzw. Zellanteil von 32 % (v/v). Die per

Oberflächenplasmonresonanz abgeschätzte Konzentration an sekretiertem scFv4813 im

Überstand nahm vor allem in den ersten 20 h der Induktionsphase stark zu und blieb dann in


77

etwa konstant bei einem Wert um 40 mg·l-1. Die Fermentation wurde nach 100,5 h gestoppt.

Abb. 3-25 zeigt ein Coomassie-gefärbtes PAA-Gel der Fermentationsüberstände. Die gesamte

Fermentationsbrühe wurde aufgearbeitet.

Abb. 3-25: Coomassie-gefärbtes PAA-Gel (2.3.5) von Fermentationsüberständen der in Abb.3-24 gezeigten Fermentation. Der Pfeil zeigt die Banden an, deren Größe mit der für scFv4813berechneten Größe übereinstimmt. Die Proben wurden zu den über den jeweiligen Spurengenannten Zeitpunkten gezogen. Pro Spur wurden 30 µl Überstand geladen.

3.5 Reinigung von scFv4813 im Gramm-Maßstab

3.5.1 Zellabtrennung

Vor der Zellabtrennung wurde die Fermentationsbrühe durch Zugabe von 10xPBS, festem

NaCl und NaOH auf 1 M NaCl, 1xPBS pH 7.5 eingestellt, um eine gute Bindung des scFv4813

in der nachfolgenden Ni-IDA Affinitätschromatographie zu erreichen. Wegen des erheblichen

Zellanteils von 32 % wurde die Zugabe von 10xPBS und NaCl auf 0,68 Liter Überstand pro

Liter zellhaltiger Fermentationsbrühe berechnet. Zur Abtrennung der Zellen wurde eine CARR

Powerfuge P6 verwendet. Die Zellabtrennung erfolgte mit einer Effizienz von > 99% in 11

Trennzyklen innerhalb von 80 Minuten. Die Zellmasse wurde verworfen und der Überstand

wurde bis zur Ni-IDA-Affinitätschromatographie (2.3.10.1) bei 4° C gelagert.

3.5.2 Metall-Affinitätschromatographie

Da die Kapazität der zur Verfügung stehenden Streamline-Säule zu gering war, wurden

insgesamt 23,4 l Fermentationsüberstand in 6 Chargen von etwa 4 l einer Metall-

Affinitätschromatographie unterzogen: Die Säule wurde im expandierten Modus (2.3.10.1) bei

einer Fließrate von 20 ml·min-1 äquilibriert (3 SV), mit Nickel beladen (2 SV) und gewaschen (3


78

SV). Anschließend wurde der Fermentationsüberstand bei der gleichen Fließrate auf die Säule

gegeben, wobei 4 l etwa 8 SV entsprechen. Anschließend wurde die Säule wiederum mit 2 SV

Äquilibrationspuffer gewaschen. Zur Elution wurde die Flußrichtung umgekehrt und die Säule

im Packbettverfahren eluiert. Zur Elution wurde ca. 2 SV Elutionspuffer (im gepackten Modus

entsprechend ca. 140 ml) bei einer Fließrate von 5 ml·h-1 verwendet. Während der Elution wurde

ein Hohlfaserdialysemodul in Serie geschaltet, um das Eluat sofort in den Auftragepuffer für die

anschließende Kationenaustauscherchromatographie umzupuffern. Danach wurde die Säule mit

20 ml·h-1 in Aufwärtsfließrichtung wieder expandiert und erneut mit Nickel beladen.

Abb. 3-26: Coomassie-gefärbtes SDS PAA-Gel (2.3.5) von aufeinanderfolgendenEluatfraktionen der Ni-IDA Affinitätschromatographie von scFv4813-haltigem Pichia-Fermentationsüberstand. Die Pfeile zeigen die Banden an, deren Größe mit der für scFv4813berechneten Bande übereinstimmt. Pro Spur wurden 10 µl der jeweiligen Fraktion geladen. DieZahlen geben die Nummer der jeweiligen 10-ml Eluatfraktion an.

Abb. 3-26 zeigt die Elution des scFv4813 anhand des Coomassie-gefärbten PAA-Gels der

Eluatfraktionen eines solchen Chromatographiezyklus. Bei allen sechs Zyklen wurden anhand

der Absorption bei 280 nm 14 Fraktionen von je 10 ml gesammelt. In allen Fällen war der

Hauptanteil des scFv4813 in den Fraktionen 3-6 konzentriert. Anhand der Coomassie-gefärbten

Gele ließ sich die Konzentration des scFv4813 auf 150 bis 2000 mg·l-1 in den verschiedenen

Fraktionen abschätzen. Die 8 bis 10 am höchsten konzentrierten Fraktionen wurden aus jedem

Zyklus ausgewählt und vereinigt, so daß für die Ionenaustauscherchromatographie 520 ml

Ausgangsmaterial mit einer Konzentration (über SDS-PAGE abgeschätzt) von etwa 1 mg·ml-1

erhalten wurden. Als Bilanz der Metall-Affinitätschromatographie ergab sich eine

Aufkonzentrierung um den Faktor 48 unter Verlust von ca. 35 % des rekombinanten Proteins.


79

Dieser relativ hohe Verlust an Ausgangsmaterial ist in erster Linie auf eine Überladung der

Säule zurückzuführen. Es hatte sich gezeigt, daß bei Verwendung von 70 ml Matrix nach

Auftrag von 2 Liter Pichia-Überstand zunehmende Mengen des scFv4813 im Durchfluß

nachweisbar waren. Da jedoch keine größere Expanded-bed Säule zur Verfügung stand und die

Prozessierung des in 6 Chargen von je 4 Litern aufgeteilten Überstandes ohnehin schon ca. 32

Stunden in Anspruch nahm, wurde dieser Verlust in Kauf genommen, um die Aufreinigung

möglichst zügig durchzuführen. Eventuelle Degradationsprodukte des Proteins wären unter

Umständen nur schwierig abzutrennen.

Der Haupteffekt der Affinitätschromatographie bestand in der Anreicherung des Produktes.

Die Reinheit des Eluats ist wie in Abb. 3-26 erkennbar, noch nicht allzu hoch. Zwischen 45 und

80 kDa sind noch mindestens 5 weitere Proteinbanden oberhalb der Bande des scFv4813 zu

erkennen, sowie ein kleines Protein bei ca. 15 kDa. Da ein Teil des produzierten Materials für

die Kristallisation und Strukturaufklärung verwendet werden sollte, wurden weitere

Reinigungsschritte durchgeführt.

3.5.3 Ionenaustauscherchromatographie

Aufgrund des anhand der Aminosäuresequenz ermittelten pI von 8,77 wurde als nächster

Reinigungschritt eine Kationenaustauscherchromatographie durchgeführt. Auch die für die

Ionenaustauscherchromatographie verfügbaren Säulen ließen die Prozessierung des vereinigten

Eluats aus 3.5.2 nur in drei Chargen zu. Es wurden jeweils 20-25 SV bei einer Fließrate von

10 ml·min-1 auf die Säule gegeben. Zur Elution wurde der Gradient in 100 % Elutionspuffer über

20 min gefahren. Die Säule wurde mit 100 % Elutionspuffer gewaschen (8-10 SV) und

anschließend mit ca. 10-15 SV Ladepuffer äquilibriert, bevor eine weitere Charge geladen

wurde.

Die Elution des scFv4813 erfolgte bei der gewählten Steilheit des Gradienten bei

Salzkonzentrationen zwischen 0,4 und 0,5 M NaCl. Das Eluat wurde in 10-ml Fraktionen

gesammelt. Abb. 3-27 zeigt je eine Eluatfraktionen der drei Chargen. Insgesamt wurden 450 ml

Eluat erhalten, die wiederum in 5 Chargen aufkonzentriert (2.3.10.3) und für die Gelfiltration

verwendet wurden.


80

Abb. 3-27: Coomassie-gefärbtes SDS PAA-Gel (2.3.5) der Eluatfraktionen der drei Chargen vonvorgereinigtem (3.5.2) scFv4813 in der Kationenaustauscherchromatographie (2.3.10.2). ProSpur (1-3) wurden 10 µl aufgetragen. Der Pfeil zeigt die Banden an, deren Größe mit der fürscFv4813 berechneten Bande übereinstimmt.

3.5.4 Gelchromatographie

Das auf insgesamt 25 ml aufkonzentrierte Eluat der Kationenaustauscherchromatographie

wurde in fünf Chargen von je 5 ml einer Gelchromatographie unterworfen. Nach dem Laden

einer Fraktion wurde die Sephacryl S100 HR-Säule bei einer Flußrate von 1 ml·min-1 eluiert. Das

Eluat wurde nach der Extinktionsmessung bei 280 nm in 10-ml Fraktionen gesammelt. Abb.

3-28 zeigt die vier Eluatfraktionen des Gelchromatographielaufs einer der o. g. Chargen.

Abb. 3-28: Coomassie-gefärbtes SDS PAA-Gel (2.3.5) von Eluatfraktionen einesGelchromatographielaufs (2.3.10.4) von vorgereinigtem (3.5.3) scFv4813. Der Pfeil zeigt dieBanden an, deren Größe mit der für scFv4813 berechneten Bande übereinstimmt. Die Zahlengeben die Reihenfolge an, in der die Fraktionen eluierten.


81

Aus jedem Gelchromatographielauf wurden die beiden Hauptfraktionen gesammelt und

vereinigt, so daß zwei Eluatfraktionen ("A" und "B") erhalten wurden. Diese beiden Fraktionen

wurden einer genaueren Konzentrationsbestimmung unterworfen, um die Gesamtausbeute der

Fermentation nach der Reinigung des Proteins ermitteln zu können.

3.5.5 Konzentrationsbestimmung des scFv4813

Die Konzentrationsbestimmung des gereinigten scFv4813 (3.5.1-3.5.4) wurde mit mehreren

Methoden vorgenommen: Einerseits wurde das Protein mit Bradford-Reagenz gefärbt und die

Konzentration durch Korrelation mit einer aus RSA erstellten Kalibrationskurve bestimmt.

Zusätzlich wurde aus der Aminosäuresequenz der theoretische millimolare

Extinktionskoeffizient bei 280 nm ermittelt und die Konzentration des scFv4813 im Eluat der

Gelfiltration durch Anwendung des Lambert-Beer'schen Gesetzes bestimmt. Die Meßwerte sind

in Abb. 3-29 dargestellt.

0 10 20 30 40 500,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30 A

Eluat A

1:100Eluat B1:100

E5

95

Konzentration RSA [µg·ml-1]

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,300,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8 B

E28

0

1 / Verdünnung

Abb. 3-29: Konzentrationsbestimmung des gereinigten scFv4813. A: Messung der Extinktionbei 595 nm nach Anfärbung mit Bradford-Reagenz (2.3.9.3). Die Kalibrationskurve des RSA-Standards (!) und die mit 1:100 Verdünnungen der Eluatfraktionen A und B erhaltenenExtinktionen sind angegeben. B: Messung der Extinktion bei 280 nm (2.3.9.2). Die Extinktionender Eluate A (!) und B (#) sind über den Kehrwert der Verdünnung aufgetragen, um eine lineareKorrelation zu ermöglichen.

Bei der Konzentrationsbestimmung über den Bradford-Komplex lagen lediglich die 1:100

Verdünnungen im linearen Bereich der Kalibrationskurve mit RSA. Bei der Bestimmung der

Extinktion bei 280 nm zeigten die Verdünnungen über einen weiten Konzentrationsbereich eine

lineare Korrelation, so daß die Steigung der linearen Ausgleichsgeraden zur

Konzentrationsbestimmung verwendet wurde. Aus dem millimolaren Extinktionskoeffizienten


82

von 49170 ergibt sich eine Extinktion von 1,77 bei einer Konzentration von 1 mg·ml-1. Tabelle

3-3 zeigt die Ergebnisse der Konzentrationsbestimmungen.

Tabelle 3-3: Ergebnisse der Konzentrationsbestimmung der beiden Eluatfraktionen.

Bestimmungsmethode Eluat A [mg·ml-1] Eluat B [mg·ml-1]Bradford-Färbung 2,87 2,48E280 8,703 6,527

Die Ergebnisse der Konzentrationsbestimmungen wichen fast um den Faktor drei

voneinander ab, was aber nicht unüblich ist, da die Intensität der Bradford-Färbung vom

jeweiligen Protein abhängt, und als Standard RSA verwendet wurde, das ca. 1,5 mal so

empfindlich mit Bradford-Lösung reagiert, wie z. B. IgG (Angabe lt. Hersteller). Abschätzungen

der Konzentration über die Größe von Coomassie-gefärbten SDS-PAA-Gelen ergeben

Konzentrationen um 5 mg·ml-1 (Daten nicht gezeigt). Die Linearität der Bestimmung über dei

Extinktion be 280nm über einen Verdünnungsbereich von zwei Zehnerpotenzen (s. o.), die dabei

zugrunde liegende Verwendung eines proteinsequenzspezifischen Extinktionskoeffizienten und

die hohe Reinheit des Proteins, die in Abb. 3-28 erkennbar ist, sprechen dafür, daß in diesem Fall

die Methode der photometrischen Konzentrationsbestimmung das korrektere Ergebnis liefert.

Danach enthielt das gesamte Eluat "A" in 35 ml ca. 307 mg scFv4813, das gesamte Eluat "B" in

33 ml ca. 215 mg scFv4813.

Die Gesamtausbeute der 30-l Fermentation betrug demnach über 500 mg hochreinen

Proteins. Bei einer abgeschätzten Konzentration von ca. 40 mg·l-1 im Fermentationsüberstand

entspricht das einer Reinigungseffizienz von ca. 54 %. Für den größten Teil des Verlusts ist die

Überladung der Streamline-Säule bei der Metall-Affinitätschromatographie verantwortlich (s.o.),

weitere Verluste entstanden durch das großzügige "Abschneiden" der Elutionspeaks bei der

Auswahl der Fraktionen, die jeweils weiterverarbeitet wurden.

3.5.6 Stabilität und Lagerung von scFv4813

Die Lagerfähigkeit des gereinigten scFv4813 wurde überprüft, indem Aliquots der

Eluatfraktion A unter verschiedenen Bedingungen 3 Wochen lang gelagert und anschließend auf

ihr Erscheinungsbild im Coomassie-gefärbten PAA-Gel und ihre Reaktivität (BIACore-

Bestimmung über das his6-Motiv, Kap. 2.3.9.1) untersucht wurden.

Die unverdünnten Proben wurden bei RT, 4° C, -20° C und –70° C gelagert, wobei bei den

Aliquoten bei RT und bei 4° C jeweils ein Ansatz mit 0,1 % (w/v) NaN3 und ein Ansatz ohne

NaN3 untersucht wurde. Das Ergebnis ist in Abb. 3-30 gezeigt. Nach Lagerung bei


83

Raumtemperatur und ohne zusätzliche Konservierung mit Hilfe von Natriumazid war nach 3

Wochen eine deutliche Abnahme der mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz gemessenen

Konzentration festzustellen. Zusätzlich waren bei den oberhalb von 0° C gelagerten Proben

leichte Abnahmen der Konzentration gegenüber den bei -20° C und bei -70° C gelagerten Proben

erkennbar. Die Ergebnisse waren in den 1:10 verdünnten Proben tendenziell gleich. Der erste

Befund deutet auf mikrobielle Zersetzung des Proteins hin, der zweite auf nicht-mikrobielle

Degradation. Vor der Lagerung der Proben ergab die Messung nach 2.3.9.1 ca. 11000 RU, ein

direkter Vergleich dieser Messung mit den in Abb. 3-30 gezeigten Werten ist aber nicht

aussagekräftig, da die Messungen mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz vom Zustand des

verwendeten NTA-Chips abhängen, dessen Qualität über einen Zeitraum von drei Wochen nicht

konstant bleibt. Daher ließen sich nur Werte von zeitnah gemessenen Proben vergleichen. Im

Western-Blot der entsprechenden Proben waren keine Degradationsbanden zu erkennen,

obgleich die Bande des bei RT gelagerten Aliquots deutlich schwächer geworden war (Daten

nicht gezeigt).

RT RT (+Azid) 4° C 4° C (+Azid) -20° C -70° C0

2000

4000

6000

8000

10000

scF

v481

3 [R

U]

Abb. 3-30: Lagerstabilität des gereinigten scFv4813 (2.3.10). Aliquote des scFv4813 wurden beiverschiedenen Temperaturen für 3 Wochen z. T. unter Zusatz von Natriumazid gelagert. DieStabilität von 1:1 (helle Säulen) und 1:10 (dunkle Säulen) verdünntem, gereinigtem (3.5.2-3.5.4)scFv4813 (Eluat "A") anschließend durch Konzentrationsbestimmung mit Hilfe der Oberflächen-plasmonresonanz (2.3.9.1) bestimmt.

Die Bestimmung der Konzentration über das His6-Motiv ist nicht mit einer

Aktivitätsbestimmung des Proteins gleichzusetzen, sie läßt zuverlässige Rückschlüsse nur über

eine eventuelle Degradation in Form von proteolytischer Zersetzung zu, nicht aber Aussagen in

Bezug auf die Funktionalität des Proteins. Dennoch zeigen die Ergebnisse, daß der scFv4813 bei

-20° C und -70° C gut lagerfähig ist, mit Einschränkungen sogar bei 4° C.

Abschlußdiskussion und Ausblick

84

4 Abschlußdiskussion und Ausblick

4.1 Produktion des scFv4813 durch Fermentation von Nicotiana tabacum cvBY-2

Erste Versuche zur Entwicklung einer Fermentationsstrategie für die Suspensionskultur

Nicotiana tabacum BY-2 wurden anhand der schon vor Beginn dieser Arbeit am Institut für

Biologie I der RWTH Aachen etablierten Zellinie biscFv2429KDEL (2.1.7) durchgeführt

(Schumann, 1996). Diese Zellinie exprimiert das Gen für ein bispezifisches "single-chain"-

Antikörperfragment unter der Kontrolle des CaMV 35SS Promotors. Obwohl später für die

Produktion des scFv4813 in Nicotiana tabacum cv BY-2 mit der Zellinie R1-25 der (ocs)3mas

Promotor verwendet wurde (Ni et al., 1995), konnten die mit diesem System gewonnenen Daten

weitgehend auf die Produktion des scFv4813 übertragen werden, da es sich bei beiden

rekombinanten Proteinen um von murinen IgG abgeleitete Antikörperfragmente handelte, beide

Promotoren konstitutive Promotoren sind und das rekombinante Protein in beiden Fällen durch

die C-terminale KDEL-Sequenz im ER retardiert wurde. Beide Proteine waren im ER der

Pflanzenzellen stabil und als funktionale scFv im ELISA nachweisbar.

Die Fermentation wurde mit der Zellinie R1-25, die den scFv4813 exprimierte, erfolgreich

bis in den 30-l Maßstab durchgeführt. Der Prozeß war verfahrenstechnisch relativ einfach: Die

Inokulation erfolgte mit 15 bis 20 % (v/v) Vorkultur mit einem PCV von 50 %. Die Temperatur

wurde konstant auf 26° C geregelt und die Gelöstsauerstoffkonzentration wurde durch getaktete

Zugabe von Luft oberhalb von 10-20 % gehalten. Die Durchmischung durch Schrägblattrührer

bei relativ langsamen, konstanten Drehzahlen von 130 (5-l Arbeitsvolumen) bzw. 80 (30-l

Arbeitsvolumen) war effektiv. Zellschädigungen wurden nicht beobachtet. Der pH-Wert wurde

nicht geregelt. Mit dieser Strategie ergab sich eine Fermentationsdauer von 160 bis 200 h. Die

für die BY-2 Zellinie typische Synchronizität der Zellteilungen wurde dabei beobachtet. Aus den

im Überstand leicht analysierbaren Nährstoffkonzentrationen (Phosphat, Saccharose, Glukose,

Fruktose) ergaben sich typische Fermentationskinetiken.

Die intrazellulär im ER akkumulierten Antikörperfragmente wurden nach dem Aufbrechen

der in Extraktionspuffer resuspendierten Zellen durch Ultraschall in ELISA und Western Blot

analysiert sowie per Oberflächenplasmonresonanz analysiert. Dabei ergaben sich für den

biscFv2429 in Verbindung mit dem 35SS Promotor Expressionslevel bis maximal 2,9 mg·l-1

(bezogen auf das Fermentationsvolumen), mit dem (ocs)3mas Promotor lagen die maximal für


85

den scFv4813 per Western Blot abgeschätzten Expressionslevel bei maximal 11 mg·l-1. Diese

Werte entsprechen einer Expressionsrate von etwa 0,2 bis 1 % des gesamtlöslichen Proteins.

Diese Werte liegen im Rahmen der von anderen Forschern für die Nicotiana tabacum cv BY-2

Zellinie erhaltenen Ergebnisse (Hein et al., 1991; Firek et al., 1993; Magnuson et al., 1996;

Francisco et al., 1997; Lee et al., 1997; des Molles et al., 1999; Sehnke und Ferl, 1999; Sharp

und Doran, 1999; Fischer et al., 1999a; Doran, 2000). Am Institut für Biologie I der RWTH

Aachen durchgeführte Versuche zur Expression von Proteinen in Nicotiana tabacum cv BY-2

und deren Sekretion ins Medium waren zwar prinzipiell erfolgreich (Drossard, 1996; Fischer et

al., 1999a; Fischer et al., 1999e; Fischer et al., 1999f), aber die bezogen auf das

Fermentationsvolumen erreichten Ausbeuten waren im Einklang mit den Ergebnissen anderer

Gruppen (Doran, 2000) zu gering, um diesen Weg, der eine deutlich einfachere Reinigung der

Proteine ermöglicht hätte, zu rechtfertigen. Der einzige Bericht, der die Expression eines

rekombinanten Proteins in sekretierter Form in pflanzlichen Zellkulturen in größeren Mengen

(Ausbeute vor Reinigung 85 mg·l-1 bezogen auf das Fermentationsvolumen) beschreibt,

behandelt die Expression von humanem α-1-Antitrypsin (hAAT) in einer Kultur von Orhiza

japonica (Terashima et al., 1999).

Versuche, die Expression in Pflanzensuspensionskulturen durch Zugabe von Elicitoren,

Aminosäuren, Licht oder Pflanzenhormone zu steigern, haben zwar in einzelnen Fällen Erfolg

gezeigt (Sehnke und Ferl, 1999; Fischer et al., 1999a), wie sich im Falle der Zellinie R1-25 im

Rahmen dieser Arbeit zeigte (3.1.4), sind diese Effekte aber nicht ohne weiteres auf bestimmte

Kombinationen von Promotor und zu exprimierendem Protein übertragbar. In diesem Bereich

besteht noch weiterer Handlungsbedarf.

Die Suche nach stärkeren, eventuell auch induzierbaren Promotoren wie dem (ocs)3mas-

Promotor (Ni et al., 1995) oder den von Shinmyo et al. beschriebenen "heat-shock"-Promotoren

(Shinmyo et al., 1998) scheint gerade für die pflanzliche Suspensionskultur von besonderer

Bedeutung, da sich in vielen Fällen gezeigt hat, daß die Expressionsraten (in % des

gesamtlöslichen Proteins) in Suspensionskulturen deutlich unter denen liegen, die sich mit dem

gleichen Promotor in intakten Pflanzen der gleichen Art erreichen lassen (Doran, 2000).

Die Entwicklung und Optimierung der Zellinien biscFv2429KDEL und R1-25 wurde im

Rahmen dieser Arbeit nicht in Betracht gezogen. Zwar zeigten beiden Zellinien auch bei

langfristiger Subkultivierung unter nicht-selektiven Bedingungen keine Variabilität in den

erreichten Expressionsmengen, es ist aber denkbar, daß die Zellinien, die stets in Schüttelkolben

subkultiviert wurden, auf die Bedingungen im Fermenter nicht angepaßt waren. Eine ständige

Kultivierung im Fermenter, etwa durch kontinuierliche bzw. semikontinuierliche Fermentation


86

("draw-fill") oder durch Subkultivierung innerhalb eines Netzwerks von Rührkesseln könnte

langfristige Adaptions- und Selektionseffekte zur Ausprägung bringen. Diese Effekte könnten

sich in besserem Wachstum im Fermenter niederschlagen, es besteht aber auch die Gefahr, daß

Selektionsdruck hin zu z. B. schneller wachsenden Zellen mit einer Verringerung der

Expressionslevel einhergeht. Für derart langfristige und aufwendige Untersuchungen standen im

Rahmen der vorliegenden Arbeit allerdings weder ausreichend Zeit noch Fermentationskapazität

zur Verfügung. Entsprechende Langfristversuche stellen aber eine weitere, interessante

Perspektive zur Etablierung pflanzlicher Suspensionskulturen als Alternative neben mikrobiellen

und tierischen Expressionssystemen dar.

4.2 Produktion des scFv4813 durch Fermentation von Pichia pastoris

4.2.1 Fermentationsstrategie

Die Entwicklung einer Fermentationsstrategie für Pichia pastoris erfolgte teilweise nicht

anhand des späteren Expressorklons für den scFv4813 (Klon N55), sondern mit dem Klon

PP599, der ein Fusionsprodukt zweier Domänen des humanen Glykoproteins CEA exprimierte

(You et al., 1998; Hellwig et al., 1999). In beiden Fällen wurde die Expression des

rekombinanten Proteins über den AOX1 Promotor gesteuert und beide Proteine wurden über das

prepro-Sekretionssignal des α-Paarungsfaktors von S. cerevisiae ins Medium sekretiert. Die mit

dem Klon PP599 entwickelte Fermentationsstrategie ließ sich in wesentlichen Teilen auf die

Fermentation von des Klons N55 anwenden. Die vom Hersteller des Expressionssystems

vorgeschlagene "Standard"-Fermentationsstrategie wurde dabei in folgenden Punkten

abgeändert.

4.2.1.1 Medium

Das verwendete Medium "B" (2.5.5.1) enthielt um 50 % reduzierte Konzentrationen aller

Makro-Nährstoffe, ohne daß eine Einschränkung der Wachstumsgeschwindigkeit, der erreichten

Biomassekonzentrationen oder der Expressionsraten zu beobachten gewesen wäre. Daraus

ergeben sich erhebliche Vorteile: Erstens sind die Komponenten des Fermentationsmediums "A"

(2.5.5.1) bei pH 6 nicht vollständig gelöst und führen dadurch zu Fehlern in der

Frischgewichtsbestimmung zu Beginn der Fermentation und zu möglicher Beschädigung der

Fermenteroberflächen durch abrasive Effekte. Zweitens fielen beim Einstellen des pH-Werts im

Überstand auf leicht basische Werte für die Aufarbeitung stets erhebliche Mengen an nicht

metabolisierten Salzen aus. Diese Effekte wurden mit dem Fermentationsmedium "B" nicht


87

beobachtet. Abgesehen von den positiven Auswirkungen auf die Fermentation und die

Aufbereitung stellt die Reduktion der Salzmenge einen ökonomischen Vorteil dar, der zwar im

Pilotmaßstab kaum ins Gewicht fällt, im industriellen Maßstab aber durchaus Bedeutung hat. Die

Ausgangs-Glyzerinkonzentration wurde auf 5 % (v/v) erhöht, wodurch sich keine negativen

Einflüsse auf die Wachstumsgeschwindigkeit ergaben (siehe auch 4.2.1.2).

4.2.1.2 Glyzerin-Zufuhrphase

Im "Standard"-Fermentationsprotokoll ist nach dem Verbrauch des vorgelegten Glyzerins

eine Glyzerin-Zufuhrphase vorgesehen. Damit wird beabsichtigt, die zur Induktion erwünschten

hohen Zelldichten zügig zu erreichen, ohne die Wachstumsrate durch eventuelle

Substratinhibierung infolge zu hoher initiale Glyzerinkonzentrationen zu beeinträchtigen. Dabei

soll die Glyzerin-Zufuhrrate so niedrig sein, daß Glyzerin limitierend ist, da unter diesen

Umständen möglicherweise der AOX1-Promotor dereprimiert wird und die Adaption an

Methanol schneller erfolgt (Stratton et al., 1998). Weder die Derepression des AOX1-Promotors

(etwa durch im Western-Blot oder ELISA nachweisbare basale Expression von rekombinanten

Proteinen während einer Phase limitierender Glyzerinzufuhr) noch die schnellere Anpassung an

Methanol konnten in entsprechenden Versuchen festgestellt werden. Diese Ergebnisse

entsprechen den Modellen, nach denen die Regulation des AOX1-Promotors sowohl Repression

durch leichter verfügbare Kohlenstoffquellen als auch Induktion durch Methanol involviert (Ellis

et al., 1985; Tschopp et al., 1987; Waterham et al., 1997). In diesem Punkt unterscheidet sich die

Regulation des AOX1 von Pichia pastoris entscheidend von der Regulation des MOX-Promotor

der methylotrophen Hefe Hansenula polymorpha, der tatsächlich die Expression unter

limitierender Glyzerinzufuhr ohne Methanol erlaubt (Gellissen et al., 1995; Hollenberg und

Gellissen, 1997). Die Adaption an Methanol war, gemessen an der Zeit, die im Rührkessel vom

Beginn der Methanol-Zufuhr bis zum Erreichen der maximalen Methanol-Verbrauchsrate

notwendig war, unabhängig davon, ob der Methanol-Zufuhrphase eine Phase mit limitierender

Glyzerinzufuhr vorgeschaltet war. Die zu Beginn der Induktion erwünschten Zelldichten von ca.

180 g·l-1 wurden bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Fermentationen dadurch

erreicht, daß die initiale Glyzerinkonzentration von 4 % (v/v) auf 5 % erhöht wurde. Diese

Ausgangs-Glyzerinkonzentration wurde aus ähnlichen Gründen auch von anderen Gruppen

verwendet (Digan et al., 1989; Clare und Romanos, 1995; Loewen et al., 1997). Dazu kommt,

daß die verwendeten Mut+-Stämme auch auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle während

der Induktion noch Wachstumsraten bis 0,02 h-1 aufwiesen und somit die Biomasse auch

während der Induktion signifikant zunahm.


88

4.2.1.3 Methanol-Zufuhrphase

Die maximale Methanol-Zufuhrrate lag mit 4-5 ml·l-1·h-1 deutlich unter den von anderen

Autoren beschriebenen Werten, die mit bis zu 15 ml·l-1·h-1 angegeben werden (Nilsen et al.,

1997). Die Obergrenze von 4-5 ml·l-1·h-1 hatte sich bereits in den Fermentationen mit manuell

eingestellter, fester Zufuhrrate ergeben, bei denen höhere Zufuhrraten zur Akkumulation von

Methanol und letztlich zum Absterben der Zellen führten (Daten nicht gezeigt), und bestätigte

sich bei den Fermentationen, in denen die Methanolzufuhr über den Gelöstsauerstoff oder on-

line Methanolanalyse gesteuert wurde.

Für die Differenz gibt es mehrere mögliche Gründe: Eine mögliche Erklärung wären

unterschiedliche Sauerstoffübergangsraten in den verschiedenen Rührreaktoren. Aufgrund der

hohen Zelldichten wurden die Fermentationen während der Induktionsphase – trotz des relativ

langsamen Wachstums auf Methanol – unter Sauerstofflimitierung oder nahe daran geführt. Da

die Verwertung von Methanol stöchiometrisch an die Sauerstoffverfügbarkeit gekoppelt ist,

würde eine niedrigere Sauerstoffübergangsrate unmittelbar zu niedrigerer Methanol-

Verwertungsrate und Wachstumsrate führen. Gegen diese Möglichkeit sprechen mehrere Punkte.

Zum einen waren die Eckdaten der Prozessführung (Durchmischung mit 3 Rushton-

Scheibenblattrührern bei hohen Umdrehungszahlen und Belüftungsraten zwischen 1,5 und 2,3

vvm) mit den Daten anderer Autoren vergleichbar. Zum anderen wurden Fermentationen

durchgeführt, in denen die Sauerstoffübergangsrate durch zusätzliche Zufuhr von reinem

Sauerstoff zum Begasungsstrom erhöht wurde (z. B. Abb. 3-19, 46 h - 64 h). Damit konnten

Gelöstsauerstoffkonzentration von ca. 15-20 % erreicht werden, also Werte die oberhalb des

dO2krit liegen (normalerweise schwankte der dO2 während der Fermentation zwischen 1 % und

5 %, die Sauerstoffübergangsrate war also fast maximal). Obwohl diese Versuche mehrfach

wiederholt wurden, waren keine damit verbundenen Steigerungen der Wachstumsrate oder des

Methanolverbrauchs erkennbar, ein Zeichen dafür, daß die Sauerstoffübergangsrate auch ohne

Zusatz von reinem Sauerstoff zum Begasungsstrom knapp oberhalb der maximalen

Sauerstoffaufnahmerate lag. Damit bleiben als Erklärung entweder unterschiedliche Mengen an

mit der Abluft ausgetragenen Methanols infolge anderer Reaktorgeometrien oder

Bestimmungsfehler bezüglich der Methanol-Verbrauchsraten.

Die wesentlichste Verbesserung der Fermentationsstrategie stellte die Implementierung der

on-line Methanolsteuerung dar. Die Vorteile liegen in der gleichmäßigen Methanolkonzentration

von 0,5 % (Abb. 3-19) im Vergleich zu schwankenden Methanolkonzentrationen bei manueller

Steuerung (Abb. 3-16) bzw. nahe bei 0 liegenden Methanolkonzentrationen bei dO2-abhängiger

Steuerung (Abb. 3-23). Eine gleichmäßige Methanolkonzentration schafft optimale


89

Wachstumsbedingungen und führt zu verbesserten Expressionsergebnissen (Stratton et al.,

1998). Daneben ermöglicht die on-line Methanolkontrolle eine vereinfachte und sicherere

Fermentationsführung, da die Gefahr einer Über- oder Unterdosierung mit den entsprechenden

Folgen nicht besteht, weil die Zufuhrrate sich automatisch dem Methanolverbrauch anpaßt. Im

Rahmen dieser Arbeit wurde die von der Fa. Heinrich Frings GmbH & Co KG (Bonn) für die

Ethanolmessung in Essigsäurefermentation entwickelte und in dieser Branche im industriellen

Maßstab etablierte Technologie erstmalig im Zusammenhang mit der Methanol-Zufuhrsteuerung

in Fermentation von Pichia pastoris eingesetzt. Zum Einsatz kamen dabei die Sonde

ALKOSENS II sowie ein Prototyp mit veränderter Geometrie, beide in Verbindung mit der

ACETOMAT Methanolsteuerung. Die direkte Messung im Medium durch eine

Pervaporationsmembran (Abb. 2-3) erlaubt die Veränderung der Belüftungsrate während der

Fermentation, was bei im Abluftstrom messenden Sonden, wie der von Katakura et al.

verwendeten, nicht möglich ist (Katakura et al., 1998). Das gemessene Signal stellt einen

Summenparameter dar, der alle membrangängigen, oxidierbaren Substanzen widerspiegelt, die

von der Spülluft zum Halbleitersensor transportiert werden. In dem verwendeten Mineralmedium

waren keine störenden Substanzen enthalten. Da Pichia pastoris nicht oder nur in minimalem

Maßstab zur Gärung befähigt ist, bestand auch nicht die Gefahr, die Messung durch biogenes

Ethanol zu verfälschen (Higgins und Cregg, 1998). Die verwendete Membran schloß darüber

hinaus die Pervaporation eventueller organischer Säuren aufgrund ihrer Selektivität aus (Dr.

Frank Emde, Frings, pers. Mitteilung). Die in Abb. 3-22 und Abb. 3-24 gezeigte Fermentations-

strategie ist – soweit diese publiziert sind – anderen Pichia-Fermentationsstrategien in puncto

Betriebssicherheit, Dokumentierbarkeit und Reproduzierbarkeit überlegen.

Die durch die Implementierung der Methanol-Analytik verfügbare Technologie wurde

genutzt, um die gemischte Zufuhr von Glyzerin und Methanol während der Induktion zu

untersuchen. Diese Strategie ist in einigen Arbeiten als vorteilhaft im Hinblick auf die

volumetrische Produktivität beschrieben worden (Sreekrishna et al., 1989; Loewen et al., 1997;

Sreekrishna et al., 1997; Katakura et al., 1998). In diesen Untersuchungen wurden Methanol-

und Glyzerinzufuhr nicht voneinander entkoppelt, d. h. die beiden Substrate wurden in

verschiedenen Verhältnissen gemischt und die Mischung wurde mit manuell gesteuerten Raten

zugeführt. Im Gegensatz dazu wurde die Zufuhr der beiden Kohlenstoffquellen in dieser Arbeit

erstmals völlig entkoppelt, indem der über die ALKOSENS II-Sonde gesteuerten konstanten

Methanolkonzentration eine manuell gesteuerte Glyzerinzufuhr überlagert wurde. Dadurch

wurde die Möglichkeit einer präzisen Untersuchung des Einflusses einer zusätzlichen

Glyzerinverfügbarkeit während der Induktionsphase geschaffen.


90

Es konnte gezeigt werden, daß selbst geringste spezifische Glyzerin-Zufuhrraten, die weit

unter der maximalen Glyzerin-Aufnahmerate lagen, sich negativ auf die Induktion des AOX1-

Promotors auswirkten. Dieser Effekt wurde an der drastisch verringerten Konzentration des

scFv4813 im Überstand deutlich, aber auch daran, daß die Wachstumsrate bei sehr niedrigen

Glyzerin-Zufuhrraten noch niedriger war, als die Wachstumsrate mit einer konstanten

Konzentration von 0,5 % Methanol als einziger Kohlenstoffquelle (vgl. Tabelle 3-2). Der

letztgenannte Effekt kann nur auf eine Inhibierung der Expression der Alkoholoxidase 1

zurückzuführen sein.

Diese Folgerung kann verallgemeinert werden. Dennoch muß der beobachtete deutliche

Effekt auf die spezifische (und in diesem Fall auch volumetrische) Produktivität nicht bei allen

Klonen und in allen Bioreaktoren in dieser Ausprägung auftreten. Im Falle von MutS- Stämmen

oder bei aus anderen Gründen, wie z. B. Sauerstofflimitierung, nicht optimal laufenden

Prozessen kann der Effekt der zusätzlichen Glyzerinversorgung sich auf die volumetrische

Produktivität unter Umständen positiv auswirken, nämlich dann, wenn der Einfluß anderer

limitierender Faktoren von der Zugänglichkeit einer leichter verwertbaren Kohlenstoffquelle wie

Glyzerin überlagert wird.

Die Frage, ob die Expression über den AOX1-Promotor durch Glyzerin inhibiert wird oder

nicht, ist in den letzten Jahren in verschiedenen Veröffentlichungen gegensätzlich beantwortet

worden. Während einige Arbeiten ganz klar von einer Repression des AOX1 Promotors durch

Glyzerin sprechen (Buckholz und Gleeson, 1991; Hollenberg und Gellissen, 1997; Lal et al.,

1997; Sreekrishna et al., 1997), gehen andere vom genauen Gegenteil aus (Loewen et al., 1997;

Katakura et al., 1998), darauf beruht schließlich das Konzept des "mixed feed".

Interessanterweise gibt es auch Ergebnisse, die sogar bei gemischter Zufuhr von Glucose und

Methanol unter bestimmten Umständen vorteilhafte Expressionsergebnisse zeigen (pers.

Mitteilung, R. Takors., Forschungszentrum Jülich, IBT-2)

Unabhängig von solchen möglicherweise spezifischen Effekten ist zu erwarten, daß sich die

Fermentation von Pichia mit Hilfe der on-line Methanol-Analytik zumindest im professionellen

Bereich durchsetzen wird.

4.2.1.4 Vergleich mit anderen in Pichia pastoris exprimierten scFvs

Die bei der Produktion des scFv4813 im Fermenter erreichten Expressionslevel von ca.

40 mg·l-1 (3.4.2) liegen im Vergleich mit anderen, in Pichia exprimierten single-chain

Antikörpern etwa im Mittelfeld. Die von Freyre et al. mit einem sekretierten scFv erreichten

1,2 g·l-1 (Freyre et al., 2000) stellen unter den bisher publizierten (Fischer et al., 1999b; Eldin et


91

al., 1997; Gram et al., 1998) Arbeiten zur Produktion solcher Fragmente in Pichia den höchsten

Wert dar (Vgl. Tabelle 1-7). Daneben kann von einer Reihe nicht publizierter Ergebnisse (pers.

Mitteilung, Dr. P. van der Logt, Unilever, Bedford, GB bzw. J. Drossard, RWTH Aachen)

abgeleitet werden, daß bei einer Reihe von Versuchen, sekretierte scFvs in Pichia zu

produzieren, Expressionslevel im Bereich von 1-5 mg·l-1 erreicht wurden. Die Verwendung des

Pichia-Expressionssystems stellt also keine Garantie für die erfolgreiche Überexpression eines

Proteins im größeren Maßstab dar. Selbst innerhalb strukturell relativ ähnlicher Proteine

entscheiden neben der erfolgreichen Selektion eines "guten" Expressorklons bisher nicht näher

bekannte, proteinspezifische Faktoren über den Erfolg oder Mißerfolg der Produktion in Pichia.

4.3 Reinigung und Lagerung des in Pichia produzierten scFv4813

Bei der Reinigung des scFv4813 aus dem Fermentationsüberstand von Pichia pastoris erwies

sich die Ni-IDA Affinitätschromatographie in Verbindung mit der "expanded bed"-Technologie

für den ersten Reinigungsschritt als sehr geeignet. Ausschlaggebend dafür war zum ersten die

Möglichkeit, den nach Entfernung von ca. 99,9 % der Zellen noch relativ trüben Überstand über

die Säule zu geben. Eine Filtration zur vollständigen Entfernung der Zellen, die erheblichen

zeitlichen und materiellen Aufwand bedeutet hätte (s. u.) war nicht notwendig. Zum zweiten

erlaubte der durch den Charakter der Affinitätschromatographie gegebene hohe

Aufkonzentrierungsfaktor die weiteren Schritte mit einem um den Faktor 50 reduzierten

Volumen. Eine dem Reaktorvolumen angepaßte, größere Chromatographiesäule hätte eine

insgesamt höhere Ausbeute ermöglicht (3.5.2) und die Prozessierungszeit verkürzt.

Der ungewöhnlich hohe theoretische isoelektrische Punkt des Proteins von 8,77 erlaubte die

weitere Reinigung über eine Kationenaustauscherchromatographie bei pH 5,0, wobei die in der

Ni-IDA Affinitätschromatographie im Eluat enthaltenen kontaminierenden 80, 60 und 45-50 kDa

Proteine entfernt wurden (vgl. Abb. 3-27 und Abb. 3-28). Der abschließende Gelfiltrationsschritt

diente der Entfernung eventueller Dimere des scFv. Die Reinigungseffizienz läßt sich aufgrund

der nicht exakt bestimmten Konzentration des scFv4813 im Fermentationsüberstand nur relativ

grob abschätzen. Der Wert von 54 % (3.5.5) ist angesichts der zu klein dimensionierten Säule in

der Affinitätschromatographie und der hohen Reinheit des Produkts nach einer 3-Schritt-

Prozedur, die vor der Ausbeutemaximierung Vorrang hatte, akzeptabel. Das Ergebnis ließe sich

aber durch Verwendung größerer Säulen noch deutlich verbessern.

Die Stabilität des gereinigten scFv4813 ist als sehr gut einzustufen, da selbst ohne Zusatz von

Proteaseinhibitoren oder Natriumazid sogar bei 4° C innerhalb von 3 Wochen keine


92

nennenswerten proteolytischen Effekte oder Aktivitätsverluste (bezogen auf die Funktionalität in

der Ni-NTA Oberflächenplasmonresonanzanalyse) festzustellen waren.

Die Reinheit und Qualität des in dieser Weise gewonnen scFv4813 war ausreichend zur

Kristallisierung des Proteins (pers. Mitteilung, Dr. Kurt Hoffmann, RWTH Aachen, Inst. f.

Biologie I). Diese Arbeit stellt daher neben anderen (O'Donohue et al., 1996; Kim et al., 1997;

Linnevers et al., 1997; Zhan et al., 1999) ein weiteres Beispiel für die Eignung des Pichia-

Expressionssystems zur Produktion von rekombinanten Proteinen zur Strukturanalyse dar.

4.4 Vergleich der Expressionssysteme unter Einbeziehung ökonomischerGesichtspunkte

Die Expression des diagnostisch relevanten scFv4813 durch Fermentation ist, wie gezeigt,

sowohl in Nicotiana tabacum BY-2 als auch in Pichia pastoris möglich. Im vorliegenden Fall

wurde das Pichia Expressionssystem gewählt, weil das Protein in diesem System in relativ

hohen Konzentrationen ins Medium sekretiert wurde. Im BY-2 System wäre durch Verwendung

entsprechender Sekretionssignale anstelle des KDEL-Retentionssignals auch eine sekretierte

Expression möglich gewesen, aber aufgrund der Erfahrung, daß die intrazelluläre Expression

höhere Expressionsraten hervorbringt (Firek et al., 1993; Fischer et al., 1999a; Doran, 2000),

war dieser Weg gewählt worden. Natürlich wäre die Reinigung des scFv 4813 auch aus

Pflanzenzellextrakten möglich gewesen, die guten Ergebnisse in Pichia machten diesen deutlich

aufwendigeren Prozeß aber unnötig.

Tabelle 4-1 zeigt eine Gegenüberstellung der beiden Expressionssysteme anhand der

Eckdaten einer 30-l Fermentation. Dabei wird deutlich, daß die bessere Eignung des Pichia-

Systems nicht uneingeschränkt gültig ist

Tabelle 4-1: Gegenüberstellung der beiden Expressionssysteme

Pichia pastoris Nicotiana tabacum cv BY-2

Medium preiswert teuer*

Fermentationsdauer 4 Tage 7-8 Tage

Technischer Aufwand hoch niedrig

Personeller Aufwand hoch niedrig

Expressionslevel** max. 30 mg·l-1 max. 11mg·l-1

Volumetrische Produktivität 7,5 mg·l-1·d-1 1,6 mg·l-1·d-1

Lokalisierung sekretiert intrazellulär

Reinigung einfach schwierig*Verwendung von Fertigmedium **bezogen auf Fermentationsvolumen


93

Das für die Pflanzenzellkultur verwendete Fertigmedium in Pulverform schlägt sich im 30-l

Maßstab deutlich im Preis nieder, bei einer Fermentation im Großmaßstab würde die Herstellung

dieses Mediums aus den Einzelkomponenten aber effektiver und der Preis würde dem des

Pichia-Mediums näher kommen. Trotz der kürzeren Fermentationsdauer erfordert die

Fermentation von Pichia pastoris aufgrund der aufwendigen Prozessführung (pH-Regulation,

Schaumkontrolle, Zufuhrverfahren, Methanolmessung) einen erheblich höheren personellen und

materiellen Aufwand als die verfahrenstechnisch denkbar einfach gestalteten Fermentationen

von Nicotiana tabacum cv BY-2. Aus diesem Grund liegen die für eine Pflanzenzellkultur zu

kalkulierenden Arbeitskosten und Geräteabschreibungen deutlich niedriger als die Kosten einer

Pichia-Fermentation.

Die Produktion des scFv4813 in Pichia zeigte einen um den Faktor 3 höheren

Expressionslevel sowie eine um den Faktor 4,7 höhere volumetrische Produktivität als die

Produktion in Pflanzensuspensionskultur. Diese beiden Werte sind aber stark von

proteinspezifischen Faktoren abhängig, so daß sie nicht generalisiert werden können. Die

Entwicklung stärkerer Promotoren für die Pflanzensuspensionskultur läßt für dieses System noch

Perspektiven nach oben zu, während die Machbarkeit noch stärkerer Promotoren für das

Hefesystem unwahrscheinlich erscheint.

Die erfolgreiche Optimierung der Taxol-Produktion in Suspensionskulturen von Taxus spec.

durch die Fa. Phyton (pers. Mitteilung, Dr. Rainer Fischer) zeigt, daß Pflanzensuspensions-

kulturen durch Medien- und Stammoptimierung durchaus um den Faktor 100 in ihrer

Produktivität gesteigert werden können. Obwohl sich dieses Ergebnis auf die Produktion eines

Sekundärmetaboliten bezieht, zeigt es auch für die Produktion rekombinanter Proteine in

Pflanzensuspensionskulturen Perspektiven auf.

Für Proteine, deren Produktion in mikrobiellen Wirtsorganismen nicht möglich ist, weil diese

z. B. essentielle Faltungsschritte oder posttranslationale Modifikationen nicht korrekt ausführen

können, bietet sich die Pflanzensuspensionskultur als Alternative zu tierischen Zellkulturen an.

Im wirtschaftlichen Vergleich dieser beiden Systeme schneidet die Pflanzensuspensionskultur

deutlich besser ab, weil zum einen die Kultivierungskosten niedriger sind, zum anderen z. B. für

die Produktion von Therapeutika der Nachweis des Nichtvorhandenseins von Humanpathogenen

und Onkogenen einfacher und kostengünstiger ausfällt (Fischer et al., 1999a; Doran, 2000), .

Auch gegenüber der Expression in intakten Pflanzen weist die Pflanzensuspensionskultur

bestimmte Vorteile auf (Fischer et al., 1999a; Fischer et al., 1999d). Intakte Pflanzen sind

insbesondere wegen der Möglichkeit, im Feldanbau sehr große Mengen an Biomasse zu äußerst


94

niedrigen Kosten zu erzeugen, attraktiv. Die Nachteile dieses Systems liegen aber in der

kostenintensiven Reinigung rekombinanter Produkte aus dem Pflanzenmaterial. Für den Fall des

rekombinanten Avidins aus Mais (Hood et al., 1999) machen die Aufarbeitungskosten 94 % der

Gesamtkosten aus (Doran, 2000). Bei Pflanzensuspensionskulturen sind die Aufarbeitungskosten

grundsätzlich niedriger, weil das Ausgangsmaterial homogener ist und viele bei intakten

Pflanzen vorhandene störende Begleitstoffe (Wachse, Öle, Chlorophyll, Alkaloide) nicht oder

nur in geringerem Umfang vorhanden sind. Dazu kommen regulatorische Aspekte, die bei der

Produktion therapeutisch wirksamer Proteine eine Rolle spielen: Lückenlose Dokumentation der

Wachstumsphasen ist im Feldanbau ebensowenig denkbar wie exakt reproduzierbare

Bedingungen während mehrwöchiger Wachstumsphasen. Demgegenüber sind die Bedingungen

bei der Pflanzensuspensionskultur sehr leicht reproduzierbar und dokumentierbar, was der

Produktion nach GMP entgegenkommt. Dazu kommt die Unabhängigkeit der

Suspensionskulturen von klimatischen Einflüssen und Vegetationszeiten sowie die Möglichkeit,

Biomasse vergleichsweise schnell zu produzieren. Pflanzliche Suspensionskulturen bieten also

insbesondere für die Produktion komplexer Proteine, die in kleinen bis mittleren Mengen für

therapeutische Zwecke benötigt werden, besondere Vorteile.

Die relativ niedrigen Expressionslevel in Pflanzensuspensionskulturen machen trotz der

genannten Vorteile die Weiterentwicklung dieses Expressionssystems erforderlich. Auch in

diesem Fall wird allerdings die Frage, welches Expressionssystem für ein bestimmtes Protein das

Mittel der Wahl ist, von proteinspezifischen Eigenschaften abhängen, und möglicherweise nur

empirisch zu klären sein. Diese Entscheidung fiel im vorliegenden Fall auf der Basis der mit dem

Pichia-System erzielten Expressionslevel, der benötigten Menge des rekombinanten Proteins

und der deutlich leichteren Reinigung des rekombinanten Produkts aus dem Pichia-

Fermentationsüberstandes für das mikrobielle System.

Zusammenfassung

95

5 Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war es, im Rahmen des EU Projektes "Processing technology for recovery

of recombinant antibody produced in crop plants" (FAIR-PL-CT96-1039) etwa 500 mg des

rekombinanten scFv4813 zur Verfügung zu stellen. Das Projekt beschäftigte sich mit der

Entwicklung von affinitätschromatographischen Reinigungsstrategien für in pflanzlichen

Systemen produzierte Antikörperfragmente. Als immobilisierte Liganden sollten synthetische

Peptide dienen, die aus der Aminosäuresequenz des Antigens (im Falle des scFv4813

follikelstimulierendes Hormon, FSH) oder aus synthetischen Peptidbibliotheken gewonnen

werden sollten. Der Antikörper sollte entweder direkt in Pflanzensuspensionskulturen oder in

einem mikrobiellen Wirt produziert werden.

Die pflanzliche Zellinie Nicotiana tabacum cv BY-2 war am Institut für Biologie I

einschließlich der notwendigen Techniken zur Transformation und Selektion schon seit

mehreren Jahren etabliert. Als mikrobieller Wirt wurde zu Beginn des Projekts noch relativ neue

Pichia pastoris Expressionssystem gewählt, mit dem bei einem der Kooperationspartner gute

Erfahrungen gemacht worden waren.

Schon während die notwendigen Klonierungsarbeiten im Vorfeld der Expression des

scFv4813 in Tabak und Pflanzenzellen (die nicht zum Umfang dieser Arbeit gehören) anliefen,

wurde anhand einer bereits bestehenden transgenen Zellinie von Nicotiana tabacum cv BY-2

(biscFv2429) sowie eines transgenen Pichia-Stammes (PP599) Fermentationsstrategien für die

beiden unterschiedlichen Expressionssysteme entwickelt. Im Fall der Pflanzensuspensions-

kulturen umfaßte dies die Untersuchung der Fermentationsbedingungen, der Wachstumskinetik,

Substrataufnahmekinetik und Versuche zur Stimulation der Expression. Die Ergebnisse

mündeten in der erfolgreichen Maßstabsvergrößerung in den 30-l Maßstab und die Produktion

des scFv4813 diesem System. Parallel dazu wurden Fermentationsstrategien für Pichia pastoris

entwickelt, wobei sich die Arbeit hier nach der Untersuchung grundlegender Parameter auf die

Entwicklung optimaler Zufuhrstrategien für Methanol während der im "fed-batch" Modus

erfolgenden Induktionsphase konzentrierte. Auch das Pichia-System wurde bis in den 30-l

Maßstab vergrößert.

Initiale 30-l Fermentationen zur Produktion des scFv4813 in beiden Systemen (Zellinie

R1-25 bzw. Pichia-Klon N55) führte zu der Entscheidung, dem mikrobiellen System den

Vorrang zu geben, da hier der scFv4813 in sekretierter Form vorlag und verhältnismäßig leicht

Zusammenfassung

96

zu reinigen war. Zudem waren die Expressionslevel deutlich höher als in der

Pflanzensuspensionskultur.

Nach der Entwicklung einer Reinigungsstrategie (nicht Bestandteil dieser Arbeit) wurden

annähernd 500 mg des scFv4813 aus einer 30-l Fermentation von Pichia pastoris mit Hilfe eines

3-Schritt-Verfahrens gereinigt. Die Konzentration und Stabilität des Produkts wurden bestimmt.

Die Reinheit des Produktes war ausreichend zu dessen Kristallisation.

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Anhang

114

Anhang A. Abkürzungen

2,4 D 2,4-Di-Chlor-phenoxyessigsäure

AOX1 Alkoholoxidase 1

AP Alkalische Phosphatase

APS Ammoniumpersulfat

ATCC "American Type Culture Collection"

BMGY Komplexes, gepuffertes Pichia-Medium mit Glyzerin

BMMY Komplexes, gepuffertes Pichia-Induktionsmedium mit Methanol

CaMV "Cauliflower Mosaic Virus", Blumenkohlmosaikvirus

CEA "Carcinoembryonic antigen", Darmkrebs-assoziiertes Oberflächenantigen

CH Konstante Region der schweren Kette

CL Konstante Region der leichten Kette

DMSO Dimethylsulfoxid

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

ER Endoplasmatisches Retikulum

et al. und andere

Fab "Fragment antigen binding", Antigen-bindendes Fragment

FAD Flavin-Adenin Dinukleotid

Fc "Fragment crystalisable", kristallisierbares Fragment

FSH Follikelstimulierendes Hormon (Peptidhormon)

FW Frischgewicht

GAP Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase

GMP "Good Manufacturing Practice"

GUS β-Glucuronidase

hAAT humanes α-1-Antitypsin

hCG "human chorionic gonadotrophin", Peptidhormon

HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure

ID Innendurchmesser

IDA "Imino-diacetic acid"

mAk monoklonaler Antikörper

Anhang

115

mGM-CSF muriner Granulocyten Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor

MSMO "Murashige & Skoog with minimal organics", Pflanzenzellkulturmedium

Mut+ "Methanol-utilization" Wildtyp

MutS "Methanol utilization slow"

NRRL "Northern Regional Research Laboratories", Peoria, IL

NTA "Nitrilo-triacetic acid"

OD Optische Dichte

PAA Polyacrylamid

PMSF Polymethylsulfon

PNPP p-Nitrophenylphosphat

rAk rekombinanter Antikörper

RIP "ribosome-inactivating protein"

RSA Rinderserumalbumin, hier: Fraktion V

scFv "single chain Fragment variable", Einzelkettenantikörper

SDS "Sodium-dodecyl-sulfate ", Natrium-dodecyl-sulfate

SDS-PAA SDS-Polyacrylamid

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

SV Säulenvolumen

TBE Tris/Borsäure/EDTA Puffer (Elektrophorese von DNA)

TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamin

TMV Tabakmosaikvirus

TRIS Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan

Tween 20 poly-oxyethylen(20) sorbitan-monolaurate

vvm "volume per volume per minute", Belüftungsrate

v/v "volume per volume", Volumenprozent

VH Variable Region der schweren Kette

VL Variable Region der leichten Kette

w/v "weight per volume", Gewicht pro Volumen

YPD Komplexes, ungepuffertes Pichia-Medium mit Glukose

YPG Komplexes, ungepuffertes Pichia-Medium mit Glyzerin

YPM Komplexes, ungepuffertes Pichia-Induktionsmedium mit Methanol

Anhang

116

Anhang B. Veröffentlichungen, die direkt oder indirekt aus der Promotionsarbeitresultieren

• Drossard, J., Nähring, J. M., Hellwig, S., Fischer, R. (1997). Production of engineeredantibodies in tobacco plants and cell suspension cultures. In: Antibody engineering, Newtechnology, Application and Commercialization: IBC library services, 69-93.

• Fischer, R., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U., Hellwig, S. (1999). Towardsmolecular farming in the future: Pichia pastoris-based production of single-chain antibodyfragments. Biotechnol Appl Biochem: 30, 117-120.

• Fischer, R., Drossard, J., Hellwig, S., Emans, N., Schillberg, S. (1998). Transgenic plants asbioreactors for the expression of recombinant antibodies. In: 10th International Congress ofImmunology (New Delhi, India: Monduzzi Editore, S. p. A., Bologna, Italy), 307-313.

• Fischer, R., Emans, N., Schuster, F., Hellwig, S., Drossard, J. (1999). Towards molecularfarming in the future: using plant-cell-suspension cultures as bioreactors. Biotechnol ApplBiochem: 30, 109-112.

• Hellwig, S., Robin, F., Drossard, J., Raven, N. P., Vaquero-Martin, C., Shively, J. E.,Fischer, R. (1999). Production of carcinoembryonic antigen (CEA) N-A3 domain in Pichiapastoris by fermentation. Biotechnol Appl Biochem: 30, 267-275.

• Hellwig, S., Emde, F., Henke, M., Raven, N. P. G., van der Logt, P., Fischer, R.: Analysis ofsingle-chain antibody production in Pichia pastoris using on-line methanol control in fed-batch and mixed-feed fermentations. Eingereicht (Biotechnol Bioeng)

Anhang

117

Anhang C. Poster und Vorträge

• Hellwig, S., Drossard, J., Schillberg, S., Fischer, R.: Production of recombinant antibodies byfermentation of transgenic plant suspension cell lines. 8th IBC Conference on "Recombinantantibody engineering", San Diego, CA, U. S. A. Dezember 1997

• Hellwig, S., Drossard, J., Fischer, S.: Production of antibody fragments in suspensioncultures of Nicotiana tabacum: From shake flask to stirred tank reactor. Vortrag, DECHEMAJahrestagung der Biotechnologen, Wiesbaden, 1998

• Hellwig, S., Drossard, J., Sack, M., Chandler, J., Vaquero, C., Fischer, R.: Production ofrecombinant antibodies by fermentation of plant suspension cell lines. Poster, XthInternational virology conference, Jerusalem, Israel, 1998

• Hellwig, S., Emde, F., Raven, N. P. G., Fischer, R.: Production of scFv antibody fragments inthe methylotrophic yeast Pichia pastoris using online methanol control in fed batchfermentations. Poster, DECHEMA 1999

Anhang

118

Danksagung

Prof. Fritz Kreuzaler danke ich für die Möglichkeit, diese Arbeit am Institut für Biologie Ianfertigen zu können und für seine wunderbaren Vorlesungen.

Prof. Winfried Hartmeier danke ich für die Übernahme des Korreferates.

Ich danke Dr. Rainer Fischer für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, seinen unermüdlichenund selbstlosen Einsatz für den Erfolg der Arbeitsgruppe und das in mich gesetzte Vertrauen.

Ich danke neben allen anderen Mitarbeitern der "Antibody group" vor allem (in alphabeticalorder) Olga Artsaenko (Unilever, intakte Pflanzen), Jürgen Drossard (Tabak,Reinigungsstrategien), Mario Henke (versteht auch was von Fermentern), Torsten Natelberg(Zerstörungsexperte), Nicole Raven (N55, PCR), Frederic Robin (PP599, Kultur, retraite auxflambeaux), und Flora Schuster (Vorkulturen) für die hervorragende Zusammenarbeit.

In meiner Zeit bei Unilever in Bedford und während des gesamten "Unilever" EU-Projekteswaren Prof. Philip Porter, Prof. Paul Davis, Dr. Glen Hughes und Dr. Paul van der Logt vonUnilever sowie Prof. Rob Meloen und Jerry Slootstra vom ID-DLO auf wissenschaftlicher undmenschlicher Basis hervorragende Kollegen.

Mit Dr. Frank Emde (Frings GmbH & Co KG, Bonn) etablierte sich eine ausgesprochenfruchtbare Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Online-Methanol-Analytik

Holger, Jörg, Monne und Achim haben mich in völliger Ignoranz der Unwahrscheinlichkeit, daßich es schaffen könnte, ermutigt, ernsthaft für einen Marathon zu trainieren. Mein Erfolg gehörteuch.

Anke Krüger hat mich trotz häufig unmöglicher Arbeitszeiten ("Wann bist du eigentlich zuletztnach Hause gekommen?") stets unterstützt und schließlich sogar geheiratet. Das ist tollkühn undverdient Dank und Anerkennung.

Anhang

119

Lebenslauf

Name: Stephan Hellwig

Geburtsdatum/-ort: 1. April 1971 in Birkesdorf (jetzt Düren)

Anschrift: Abteistraße 8

52066 Aachen

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: verheiratet

Schulbildung: 8/80 – 8/89 Franziskusgymnasium Vossenack

Abschluß: Abitur (2,3)

Zivildienst: 10/89 –10/90 Altenheim St. Nikolaus, Düren

Studium: 10/90 –7/96 RWTH Aachen

Abschluß: Diplom-Biologe

Prüfungsfächer: Biotechnologie (Prof. Hartmeier)

Mikrobiologie (Prof. Wolf)

Zoologie (Prof. Scriba)

Organische Chemie (Prof. Höcker)

Titel der Diplomarbeit: Versuche zur Optimierung der kontinuierlichen Milchsäurefermentation

mit Lactobacillus casei in der Blenke-Kaskade (RWTH Aachen, Lehrstuhl für Biotechnologie)

Berufstätigkeit: seit 10/96 Wiss. Angestellter,

RWTH Aachen, Institut für Biologie I

Arbeitsgruppe Dr. Fischer

entwicklung von fermentationsprozessen zur produktion...

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