enhanced seizures and hippocampal neurodegeneration following kainic acid-induced seizures in...

12
Enhanced seizures and hippocampal neurodegeneration following kainic acid-induced seizures in metallothionein- I + II-de®cient mice Javier Carrasco, 1 Milena Penkowa, 2 Hanne Hadberg, 2 Amalia Molinero 1 and Juan Hidalgo 1 1 Departamento de Biologõ Âa Celular, de Fisiologõ Âa y de Inmunologõ Âa, Unidad de Fisiologõ Âa Animal, Facultad de Ciencias, Universidad Auto  noma de Barcelona, Bellaterra, Barcelona, Spain 08193 2 Institute of Medical Anatomy, Section C, The Panum Institute, University of Copenhagen, DK-2200, Copenhagen, Denmark Keywords: apoptosis, caspases, metallothionein-III, NF-kB, oxidative stress, zinc Abstract Metallothioneins (MTs) are major zinc binding proteins in the CNS that could be involved in the control of zinc metabolism as well as in protection against oxidative stress. Mice lacking MT-I and MT-II (MT-I + II de®cient) because of targeted gene inactivation were injected with kainic acid (KA), a potent convulsive agent, to examine the neurobiological importance of these MT isoforms. At 35 mg/ kg KA, MT-I + II de®cient male mice showed a higher number of convulsions and a longer convulsion time than control mice. Three days later, KA-injected mice showed gliosis and neuronal injury in the hippocampus. MT-I + II de®ciency decreased both astrogliosis and microgliosis and potentiated neuronal injury and apoptosis as shown by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated in situ end labelling (TUNEL), detection of single stranded DNA (ssDNA) and by increased interleukin-1b-converting enzyme (ICE) and caspase-3 levels. Histochemically reactive zinc in the hippocampus was increased by KA to a greater extent in MT-I + II-de®cient compared with control mice. KA-induced seizures also caused increased oxidative stress, as suggested by the malondialdehyde (MDA) and protein tyrosine nitration (NITT) levels and by the expression of MT-I + II, nuclear factor-kB (NF-kB), and Cu/Zn- superoxide dismutase (Cu/Zn-SOD). MT-I + II de®ciency potentiated the oxidative stress caused by KA. Both KA and MT-I + II de®ciency signi®cantly affected the expression of MT-III, granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and its receptor (GM-CSFr). The present results indicate MT-I + II as important for neuron survival during KA-induced seizures, and suggest that both impaired zinc regulation and compromised antioxidant activity contribute to the observed neuropathology of the MT-I + II- de®cient mice. Introduction Metallothioneins (MTs) are a family of low molecular weight, cysteine-rich, heavy metal-binding proteins (Kagi & Schaffer, 1988). There are several isoforms of MTs in mice. MT-I and MT-II are expressed coordinately in all tissues, whereas MT-III and MT-IV are localized mainly in the brain and strati®ed squamous epithelia, respectively (Palmiter et al., 1992; Quaife et al., 1994). Knowledge of the speci®c roles (if any) of the different MT isoforms in the CNS is still scarce. MT-III was discovered as a factor in brain extract with sequence homology to MT-I and MT-II (Uchida et al., 1991). Previous studies have demonstrated that the localization and regulation of MT-III differs from that of MT-I + II, and that several human neurodegenerative disorders and a number of animal models of brain damage alter signi®cantly the expression of the three CNS MT isoforms (Aschner, 1996; Aschner et al., 1997; Hidalgo et al., 1997). The development of mice carrying null mutations in the MT-I + II (Masters et al., 1994a) and MT-III (Erickson et al., 1997) genes, as well as mice overexpressing them (Erickson et al., 1995, 1997), will undoubtedly help in understanding the function of MTs in the CNS. MT-III-de®cient mice had decreased concentrations of zinc in several brain regions, demonstrating a role of this MT isoform in zinc regulation (Erickson et al., 1997). In addition, when these mice were challenged with kainic acid (KA), a well-known excitotoxin (Coyle & Puttfarcken, 1993; Sperk, 1994), they showed increased susceptibility to seizures and exhibited greater neuron injury in the CA3 ®eld of the hippocampus (Erickson et al., 1997). In contrast, transgenic mice overexpressing MT-III were more resistant to KA-induced neuronal injury. Thus, these studies demonstrated for the ®rst time a physiological role of MT-III in the CNS, namely, neuronal protection in the CA3 area of the hippocampus. The mechanisms underlying the protective in vivo role of MT-III have not been established, but they might be related to the proposed role of this protein on zinc regulation (Uchida et al., 1991; Erickson et al., 1994, 1997; Palmiter, 1995; Sewell et al., 1995; Quaife et al., 1998), as it is released during seizures (Frederickson & Moncrieff, 1994). KA-induced seizures may also increase reactive oxygen species (ROS) levels (Coyle & Puttfarcken, 1993; Bains & Shaw, 1997), and thus an antioxidant role of MT-III could also be considered. MT-III is homologous to MT-I + II, and, thus, it is feasible that all three CNS MT isoforms could function similarly despite their very different pattern of expression. The aim of this Correspondence: Dr J. Hidalgo, as above. E-mail: [email protected] Received 22 October 1999, revised 23 March 2000, accepted 28 March 2000 European Journal of Neuroscience, Vol. 12, pp. 2311±2322, 2000 ã Federation of European Neuroscience Societies

Upload: javier-carrasco

Post on 06-Jul-2016

214 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

�������� ������ ��� � ���� �� ������������������������ ���� ���������� ������ � ��������������� � ���������� ���

����� ���������� ����� �������! "���� "��#����! $���� �������� ��� ���� "���������������� �� � ������� �������� �� � � ������� � �� ������������ �� ��� �� � � ������� �� ��� ������� �� � ��� ����� ���� ��� ������� �� ���������� ���������� ���������� ��� � ��� !"��� �� �# $�� ��� ������ ��� �� �� %&� '��� ��� ��� �� ���� � �# �����&����� �()""��� �����&����� �����*

��������+ ������ �� ��������� �����& ��� �)���� ,�)��� �- �� �� ������ . ��

$#������

�������������� %�&�' ��� ��(�� �� #���� ������ � ��� �)* ���� ����� #� ������� � ��� ������� �� �� ����#���� �� ���� ��� �������� ������ �+����� ������, ��� ������ �&�� ��� �&��� %�&�� � �� �������' #������ �� �������� ���� ��������� �����(����� ��� ���� ��� %-$'� � ����� ��������� ������ �� �+���� ��� �����#������� � ������� �� ����� �& �������, $� ./��0�� -$� �&�� � �� ������� ���� ��� ������ � ����� ���#�� �� ���������� ��� � ������ ��������� ��� ���� ������� ���, &������1� ������ -$��(����� ��� ������ ����� ��� �������� �(��1 � ��� � ���� ��, �&�� � �� �������1 ��������� #��� ������������� ��������� ��� ��������� �������� �(��1 ��� � � ���� �� ����� #1 ������� ���+1��������1� ������������������� �� ������� ��#����� %&2)�3'� �������� �� ����� �������� 4)$ %��4)$' ��� #1 �������� ���������������������� ��1�� %���' ������ ����. ������, "�����������1 ������� �� � ��� � ���� �� ��� �������� #1 -$ �� � ������� �+���� � �&�� � ������������� ���� ��� ������� ���, -$������� ������ ���� ������ �������� �+����� ������� �� ��������� #1 ��� �����������1��%�4$' ��� ����� �1����� ������� %)�&&' ������ ��� #1 ��� �+ ������ �� �&�� � ��� ������� ��������5 %)6��5'� ��� ��07���� ���+�� �������� %��07��*84', �&�� � �� �������1 ��������� ��� �+����� ������ ������ #1 -$, 5��� -$ ��� �&�� � ���������1 ���������1 �������� ��� �+ ������ �� �&����� ��������1�������� ���� �����1 ��������� ������ %9���*6' ��� ������ ��� %9���*6�', &�� ������ ������� ������ �&�� � �� �� � ������ ��� ������ ������� ����� -$������� ������� ��� ����������� #��� � ���� �� ��������� ��� ��� ������ ����+���� �����1 �����#��� �� ��� �#������ ����� �������1 �� ��� �&�� � ���������� ���,

�����������

������������� ��� ��� � ������ �� ��� ��������� �������

������������ ����� ����������� ������ ����� � ��������� � !! "

����� ��� ������ ������ �� �� � ����" ���# �� ���## ���

�$����� ����������� � ��� ����� ������ ���### �� ���#% ���

������&�� ����� � ��� ���� �� �����'�� (����� ����������

����������� �)������� �� ��"� � *+ ,����� �� ��"� � - "

�������� �� ��� ����'� ���� ��� �� �� ��� �������� ��

������ � ��� ./� � ���� �����" ���### �� ��������� � � ������

� ���� �$����� ���� �(���� �������� �� ���# �� ���## �0�����

�� ��"� � � " )������ ����� ���� ���������� ���� ��� ������&����

�� ��������� �� ���### ������ ���� ���� �� ���# 1 ##� �� ����

������ ���� ��������������� ������� �� � ����� �� �����

����� �� ���� ������ ����� ���'����� ��� �$����� �� ��� �����

./� �� ������ �2����� � 3+ 2���� �� ��"� � 4+ 5������

�� ��"� � 4 "

��� ���������� �� ���� ������� ��� ������� � ��� ���# 1 ##

������ �� ��"� � -� �� ���### �6���7� �� ��"� � 4 ���� �

���� � ���� �����$����� ���� �6���7� �� ��"� � 8� � 4 � ����

���������� ���� � ��������� ��� ������ �� �� � ��� ./�"

���###���'���� ���� ��� �������� ���������� �� &�� � ������

���� ������ ���������� � ���� �� ��� �� ������ � &��

��������� �6���7� �� ��"� � 4 " # �������� ��� ���� ���� ����

��������� ���� 7���� ���� ��2 � � �����7�� �$������$� �.���� �

)�������7�� � 9+ ����7� � - � ���� ����� ������� ������������

�� ��&��� �� �$������� ������� ���� �:��� � ��� .29 '��� �� ���

���������� �6���7� �� ��"� � 4 " # ������� ������� ����

�����$����� ���### ���� ���� ������ �� �2������� ������

�:���" ���� ���� ����� ���������� ��� ��� '�� ���� �

������������ ���� �� ���### � ��� ./�� ������ ������ ���������

� ��� .29 ���� �� ��� ����������"

��� ������� �������� ��� ���������� �� ���� ���� �� ���###

���� �� ��� ���������� ��� ���� ����� �� ������� �� ��� �������

���� �� ��� ������ � &�� ��������� �0����� �� ��"� � �+ 6���7�

�� ��"� � -� � 4+ )�������� � 8+ ������ �� ��"� � 8+ ,����� �� ��"�

� ! � � �� � ������� ����� ��&��� �;�������7� � ���������

� - " �2������� ��&��� ��� ��� ������ �������� �$���

����� �<=� ����� �.���� � )�������7�� � 9+ >�� � �����

� 4 � �� ��� � ����$���� ���� �� ���### ����� ��� ��

��������" ���### � ��������� �� ���# 1 ##� ��� ���� �� �

������� ���� ��� ����� ./� �� ������ ����� ������ ��������

������ ����� ���� �������� ������ �� �$�����" ��� ��� �� ���

������ ����? @� A" 5������� � �����"6�����? �������B��"���"�

������� �� ������ ����� ����� �� ���� ����� ������� �� ���� ����

������� ������ �� ������������ ��! ��� ��! ����"����� ���� � #� ������ �� ������� ����������� $��������

������ �� �� �������� ���# 1 ##���'���� ���� ���� �2 ��

�$���� ������� �� �� ���� �� ������ ������ �� ���� ������

���� ���###"

�������� ��� �������

������

5���&���� ���# 1 ## 7��7��� �����= ����� �������� �

��������� �������� ������ �� ��"� � -� � ���� �������� ����

A��7� C�� ������ 0�2 " ��� ����= ���� ���� ����� � ���

�* D�� ������ ���7�����+ ��������� ���� ���� ��� ���� ���� ���

� ������"

��� ���� ���� �������� ���� ������ ���������� �������

��* � ����� ? �* � ���7 ������� ����������� ** �.� ���� �� �����

�������� � ������% ��� �� ���� ����7 ������ ������ �$�������"

��� ������ ��������� ���� �������� �� ��� ������ .�������� ��

2���� <������ �� 6���� �� ���� �� @����7"

�� ��� ��� ���� ��� �

E� ������� ��� '�� ������� �$�������" ���� �� ������ ���� ����

������� ���� 7���� ���� ��2 ������� �=� 0�2 � ������� �

����������������� ���� �)>� �� �:����� ��������������� ��"�" �

�� ��� ������� ��&��� ���� ������� ��� * �" ���&��� ���������

������ ������������� �� � ����� �� ������� ������������

�������� ���� ��������� �� �������� ����� ��� <���� " .�����

���� �������� )>� ���"

�2������� ������ � �� ������ ���������� ��� ����+ ���

���������� � �� �� ��� ��� ������ ���� �����7� � - " ����

��� .29 ����� �� ��� ��������� �� �2 � ���### ��'���� ����

�� �� ��������� ���� �2������� ��&��� � ���### �������

����� �� ������ ��� ����� � ��� ����������� ����" .�������

���� ���� ������� ��� � � �"8���* ���� ��� ��������� ��������� ��

��� �����"

������������� ������ ��� ������� ������

���� ���� ������ ��������&�� ���� >������ ��������$���� �F��D

�C+ 6�� C����� #/� 0�2 �� ������� ������������� ���� �������&��

���� ������ �8�� � �������� �� ����� ������� ����DC � )>�

�8�� �� G�����H '$����� ��8�� " G�����H '$����� ����

�� �������� -I ������������ ����� �8I ������ ���� ������ ��"*I

�������� �(���� ������ ���� " ;����������� �� �������� ������

������ �� �� ��7���� �������� �� ����������������" >��� ����

���'$�� � G�����H '$����� �� - �. ��� - �� �� ������� ���

������������ �� �������� � 9FI ����� �� - �. ��� * ���"

2��������� ���� ���� ���&� � ������� �J8F �. ��� 8�� ��

7��� �� J!F �." �� ���������� ������ ����� ���� ��� � �

�������� �� ��� ����� ���� ����������� ��������� � ��� �����

�� �� ��� ��� ������ ��������� ������������� �������������

����� /�� ����H ����� �� �0/6C �����(��"

;�� ������� ���������� ����� ���� ����������� � @�����2CC�9

�)��� ������+ G���� C��" #�"� .2� 0�2 ��� 8�� �������� ��

�������� � �FI ���� ���� � ������������ ���� ��>�+ F"F8�

�<#�� �5 4"-� F"�8 � /�.� ���� F"F�I /����� )�-F ��>�D/�����

��� 9F�� �� ���� �����������" ���� ����� �������� ���

�������� ���� �������� ������������ ��������� ���� �����

������ �������� ���� >���7�� ������� 21> ���� 5��������

�) ��� �� (���� ������� ���� #�K �G���� C��" #�" "

������ ���� �������� �������� ���� �� �� ��� ��������

������� ��������? )�������� ������ ������ ����� '�������� ������

������ �K;2) � ? *8F �@�7������ @� + �������� ��� ���������

K;2) � ? �FF �G���� C����������� #�" + ��������� ������ ����

���� ���� ����'� ����� �/�6 � ? �FFF �� � ? 8FFF

�@�7������ + �������� ��� �������� #-D!F � ? 8F �������

2�������� 0� + ���� �������� ����'����� �/; � ? *FF

�@�7����� + ��������� ������ ������� ����� ���# 1 ## � ? 8FF �K����

�� ��"� � 9� � - + �������� ���� �������� ���# 1 ## � ? 8F

�@�7����� + ��������� ������ ������� ���### � ? �FFF �.������

�� ��"� � + �������� ���� �������������� �/#�� � ? 8F

�2���� @�������� �L� 0�2 + ��������� ������ ���������������

���� ��@2 � ? �FF �2���� @������� + �������� ��� ��������

K��.�; � ? 8F �K�&��� @�������� 0� + ��������� ������ ����

���� K��.�;��� ������ � ? 8FF �<������ @������� #�"�

;������ /A� 0�2 + ��������� ������ �������� ������� � ? 8FF

�@�7����� + �������� ���� �������� .�DG��=@ � ? 8F

������� �=� 0�2 + �������� ���� �������� ���� ������

@/2 �@/2 � ? �FF �2��$� .���"� 0� + ��������� ������ ����

���� �������7��� �������� �&���� �#.6 � ? �FF ����� .��&�

.2� 0�2 + ��������� ������ �������� ������9D.))9* � ? �FF

����� .��& + �� �������� ���� �������� /;��> � ? �FF

�>�������� ������� K����� "

��� ������� �������� ���� �������� ��� ����������� ����������

#�K � ? -FF ������ � ����������� �������� #�K � ? *FF ����

����� � �� ����������� ������� #�K � ? �FFF �2������� 0� �

�������� �� ����������J�����J����$���� ������$ �������2>�

.�����$D5<)+ @�7����� " ���� ������� �� �������� ��� �

��� ������������ ���� ��������� ��� 9F�� �� ���� �����������"

2��������� ����� ���� �������� ���� ����������� �������� ��

����������J����$���� ������$ ��������� ���� �����'������ ��2

�������+ /6/� C��� ������ )������� �2� 0�2 " ��� ����@/2

�� �� ��� #�� ������ �� �� �������� �� ��� ����������� ����

�������� #�� � ? �F �G���� C��" #�" �������� ��

������2>.�����$D5<)" ��� ������������ �� ������&�� ���

F"F�8I 5*=* � @2>D�>�"

>���������� ������ ����� ���� &'��������� ���������% ������

� ? 8FF� �� ��$� <����������� ����� � ? 8F �������2������ ���� ���

� ���7�� ��� ���� �� ��� �������������� ���� ������� ��� �

���������D����������"

# ����� �� �������� ��� �$��� �� �����'� ����� � ���

����������������� �$������� ��� ������� ������� ��� ��

�������" <���� ���� �������� ��� �� ���� ������ ����

������" ;�� �$������� �� �������� �� ��� ������ � G��

2$�����* ����� ��������� �� ���"

���������� �� �� ��� ����

@���� ��� ����� �� ��� ���� � ����� �� ������ �� ������

�������� ���� ������� ��� ��� �������� �����'����� �� ������

M�������� �����(��" @������ � ��� ������� �������� �� ��

��� �������� ������� �������� ���� ���? ���� ���������� #�K

�51C ��7�� ���� ;#�. �������� >����������� 2"� 2C� 0�2 +

M����������:������ ���� ������� #�K �51C �.����������

=����� <������ )������� .2� 0�2 + �����������:������

��� ���������� #�K � ? *F �@�7����� + ��$� <�� ��:������ ����

�������� #�� �� ���� ����'� � ? *F �A��7� #����<������

C��" #�"� )2� 0�2 + ���� ��������� #�K �51C ��7�� ���� ;#�.

� ? -F �������� >����������� 2"� 2C� 0�2 + ���� �������� #�K

��7�� ���� ����������������� �2�.2 � ? *F �@�7����� + ����

�������� #�K ��7�� ���� ;#�. � ? *FF �G���� C���������� #�" +

���� ���������� #�K ��7�� ���� 2�.2 � ? 8F �@�7������ @� + ����

���������� #�K ��7�� ���� ��$� <�� � ? 4F �A��7�

#����<������ C��" + ���� ������� #�K ��7�� ���� 2�.2 � ? 8F

�A��7� #����<������ C��" + ��� ��7�� �������� #�K ��7��

���� M������� � ? 3F �>���� ����� 0� "

������� ���$����������� �������� ���� ��������� ���$����

���� ����������� ��0�) ������ ��7 �� �������� ��0/6C

*9�* A" .������ �� ��"

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**

����� �� ��������� ��� ��� 2������ )�� �� ���� �������

�������� 7�� �=���� K����������� �@� 0�2 " �� ������ ��� ���� ��

���� �������� �������� ����� ���� ����������� ���� �����

����� ������ ������� /�6 ���� ���� + ��������� ������ ����

��� ����� '�������� ������ ������ �K;2)+ ��� �������� ��

�������� ��� ������� ;-D!F ���� ���������D���������� "

���� ����� ���� ��������� �������� ���� 2������ ��������

7�� ��0/6C ��7�� ���� M������� �=��� �� ���� �������� ����

=��� "

��� ����� ���� �������� � *F�C �� M������� ������

����� �@�7������ @� �� 7��� � ��� ���7 �� - �." ������ ����

������� � �������� ����� ��� ������� ������� �� ������� ��

�������� ��� �$��� �� �����'� �����" <���� ���� ��������

��� �� ���� ������ ���� ������" ;�� ��� ���������

�$������� �� �������� �� ��� ��� ���� � G�� 2$�����* �����

��������� �(������ ���� � ��������� �@2)#D;#�.D��$� <�� '����

�� ���"

�� ��� ������������� �� ���� ��� ������

������ ������ ������� ����� �*F�� ����7 ���� ��� ���� ���

���&� ���� ���� � ������� �<��������A�� *!FF ;������� 6�

K����� �� ������ � ���� ������ ���� ���� C������ �����

���� ��� �������� �� J!F �. ���� ��� ��� �� ��� �����" ���

����� ���� ������� ������ ��� J�"3F�� �� J�"!F�� ������

���� ��� ��� ����� �� ��� �$����� �� ���# �� ���### ������

� ��� ������� ����� �� ������ ����� .29 �� .2� ���������

����� ������� ����������� �� ���� ����� �� ����������"

���# �� ���### ���� ������� ��� ��� �@/2 ��������

�������� �� @� <"@" )������� �0������� �� E������� ��������

E2 ��� ���# �</2� �� @� K"�" 2���� �@�������� ��

>����������� ��� .���� ��� 0�2 � �����������" )��������� ��

�� �� ����� ����� �� ��� �� ���� �������&���� ���������

���� ��������� � ��������� �������� �5���N��& �� ��"� � 4+

.������ �� ��"� � ! " 2�������������� �� ��������� �$���� ���

'�� �5����'����)� 2������� 0� �� ��� ���� ��� 9 ���" 2��

����� ���� �������� ����������� �� �$���� �� ��� ���

���������������� '��" ���# �� ���### </2 ����� ���� ���(�����

�������� ��������� � ����� ����� �� ���� ���� ���� ��� ����� ��

������� ��� ������� ������ �� ��� ����� �� ��$�� � ��'��

���� ���� � C���� , 8FF�. ���� �C����� K����� " ��� ���# ��

���### </2 ����� ��� ��� �$����� � ��������� ��� ������

�� ��$��� ������� ����� "

��������������������� ���� ������� �� �$���� ��� ����� ��

� ���������������� ������ �2������� 0� �� ���������

�������� �� �����������H ��������" .��� ���� �����������

���� ������"

� � ������ �������

������ ���� ��������� ����������������������� ��������� ���

*8�� �� ���� ����������� � � ������ ������� ����� �������

����� � 9 "

!��������� �������

<���� ���� ������ ���� ������� ����� �� ������� �2/=%2

���� ���� �� �2 �������� � ��� ������" E�� ��������� ��

���'��� �( O F"F8 � �� �� ���������� �� �� � ���(���� �� �

����'� ������ �� ��� ���# 1 ## ��'����� ����� ��� ��������" ���

������ ����� �� ��� �� ��� ��� ������ �� ���# 1 ## ��'����� �

�2������� ��&��� �� ��� ������ �� �2 ����������� � ���

# 1 ## �$����� � ��� ����� ����" E�� � ������� ����������

�� ���� ��� ��JE����� )���� �� ���"

:������

! ���� �

���### �= ���� ���� ��� ��� �� ���� ������� ������������ ��

�2������� ��&��� �6���7� �� ��"� � 4 " E� ���� ��� ����

���# 1 ## �= �����= ���� ������ ��������" # ��� '��

�$�������� �� �$����� ��� �������� �� ����= ����� �� ���

��������� �� ��������� ��� ����������� ��� �� ����� ��&��� �

��� ��:����� �� ����+ ��� ��&��� ���� ������� ��� * �" ;��� ���

�$�������� � ��� �� 98��D7� �2 �� ������� ��� ��� ��������

�$������� ����� �� ��� " .����� ����� ���� �:����� ����

)>�" 2���� �:������ ��� ��������� �� ���� ���� �� �������� ���

�FF�� ��� ������� �����" ��� ����� �� ������� �� ���� ����

�� ����J����� ������� ���� (����'�� ��� ��������� �������

��" =���� ��&������������ ��������� ����� �� ������� :�����

�� ����� ���� ��� �������" E� ��� ��� ����� ���� ���� �����

�$������� ���� ���� ��D�� ����J����� ������� � � ���$ ��

��� ����� ��&��� ��������"

2� ��� ��� �� �2 ��� �98��D7� � ��� �� ��� ����� �����

��&��� �� ��� ��&����������� ��������� ��� � ��������

������� ���������� �� :����� �;��" � �� ����� � " ����

;#K" �" 6����� �� ���# 1 ## ��'����� � �2������� ��&���" ���� �������� �:����� ���� 98��D7� 7���� ���� ��2 � �������� � �������� �������� �� ������� ��� �FF��" ��� ����� �� ������� ����� �� �������� ���� �� ������� ������ ��� �������" <���� ��� �����6�+ ��������� ��* D�� � �P *F+ ����= ����� �P *3" Q(O F"F8 �" ����� ����"

�2>C6 �" <���� �� �* D�� �� ���# 1 ##���'���� ���� �� �2 �����������

E����� ��������" 2���� ���� 2���� C����� �������������� �� �I �� ������ ��&��� �I :����� �I ��� �I

�* D�� *F �"8 � �"F F -F *F" � *"8 F����= *3 �"83� F"4 �FF !3"8Q �!"F� �"4 F

���� ���� �:����� ��������������� ���� 7���� ���� �� 98��D7� ���� ������" E����� ��������� ������ ����� ����� �� ������� �� ������� ������� ��� ���� �6�" Q ����'����� ������� ��� �* D�� ����+ (O F"F�" ;��(���� ���� ���� ������ ���� ��� �* ���"

���# 1 ##? ���� � ��&���������� �������������� *9�9

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**

��������� ����� ���������� ����������� ���� ������ �����

��� �� ��� �� �� ������������ �� ��� �� ������ ����� �� ��� "

E���� ��� ������ �� ��&��� ��� �� ����� *F�� � ���� �����

�� ����= ���� ����� ���'��� ��������� ���� �������

������ ���� ����� � ��� ����� �� ������� �(O F"F8 ��

� ��� ���������� ������� ���� �(O F"F� " ;����������� ��� ���

�= ���� ����� � ������� ���(���� �� ��&��� �(O F"F� ��

:����� �( O F"F� � �������� � ������� ������������ �� ���# 1 ##�

��'���� ���� �� �2������� ��&���"

� �������� ���

�� ������� ��� ��������� �� ��� �� ������ � ��� ����$� �� �2�

������ ��&���� �� ��������� ��� ����� � ��� �</2 �� ������

����� � ���� ����� ���� ���# 1 ## �� ���### ������ �� ���

�= ���� ��� ���### ������ ����" ���# �� ���### �</2 �����

���� ������� �� �� ���� �������&���� ����� �2 �������� � ���

������� �$�������" 2 ���# �� ���## ��� ����������� ����������

�� ���� ���� ��� ����� �������� ��� ���# ��� ������������ ��

��� ���# 1 ## ������ ������ �� ��"� � -� " ���# 1 ## �� ���###

������ ���� ��������� �� ����������������� � ��� ���

�$������� ����� ��&��� �������� �� ���������"

# � '�� �$�������� ���� ���� 7����� �� ����������� �������

���� '$���� *- � ����� �2 �� P 4 ��� ���� ������ �� ����= ����

�� )>� ��P 9 �:�����" <����������� ���������������� ����� ���

���# �</2 ��� ��� � ;��" *� �� ��� (����'����� ������� ���

� ��� ����������� '��� �� ��� ��� ����� ��� ����� ��� ��� �

����� *" ��� ����� ��������� � ���� ������� ����������� �� ���

���# ������ � ��� ���������� ����� ��� �2������� ��&���" ���

������ �� ���'��� � ��� ��� ����������� '��� �������

����� ��� ������� ����� �� ������ ����� ��������� ���� ����� ��

;#K" *" 6����� �� �2 ����������� ������������ ���# �</2 ����� �� �� �����������&����" ��� '���� ��� ������������� �������������������� �� ������� ����� �� ��� ���� ���� �� ��������������������� ����� ����'����� ������������� ������� ��� ��� ���# ������ �������� �� �2��:����� ����" ���� ����7����� � ��� ����� ��� )>� �� �2 �:�����",����'����� ���� ������� ��� � ����'������������ ���� �� ������ ���� ������������ ����� ��� ����� * " ����� ����8FF��"

�2>C6 *" 6����� �� �2 ����������� � ����������� ���# �� ���### �</2 ����� ������� �� �� ���� �������&����

�* D�� ����=

.����� �2 .����� �2

���# �</2@����� ���� 43*� -3 ��*�� -8Q J J.2� ��������� ���� ����� ��!� *4 4-� �3FQ J J.29 ��������� ���� ����� 9--� *4 ��8-� -8Q J JC������ ���������� 9�*� 9! �93*� -4Q J J=��� ����� �-4� 8 !3*� 3FQ J J

���### �</2@����� ���� 8!!� �F* 8 3� *F 8*9� - 8-8� 98.2� ��������� ���� ����� 93-� !� 9 3� -- 99 � 39 *!-� - .29 ��������� ���� ����� 89 � � 833� 99 - -� 3 -!-� *FC������ ���������� �99� �F �33� �9 �F9� *9 �-9� *�=��� ����� �9F� 4 �9�� �9 !4� ��

���# �� ���### �</2 ���� ����� �� �� ���� �������&���� ��� ;��" * ��� ������������ ���������������� �� ��� ���# ������ " 2���� ���� 7������ ��� ����� ��� )>� �� �2 �:������ �� ��� ���� ���&� � �������� � �������� �� ������" </2 ����� ���� ���(������������ ��������� � ���������� ��� ����� ���� �� �� ��� ���� ��� �����" <���� ��� �����6�" .������ �:����� ���� )>�+ �2� �:����� ���� 98��D7� 7���� ����" �P 9 �)>� ������� ����� �� �P 4 � �2 ������� ����" Q(O F"FF� �" ������ ����"

*9�- A" .������ �� ��"

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**

.2� �� .29� ������� ���������� �� ���� ����� �( O F"FF� "

��� �������������������� ������� ����� ���� ��� �� ��� ���#

���� �� ������� � ����������� ����� ������� � ����� ����

�;��" * ������ " 2 �$������� ��� ���### ���� �� ������� � ���

.2�J.29 ��������� ���� ����� �� ������ ���� ����� �� ��� "

# ������ �� ���#� ���### �</2 ����� ������� ��������

��������� � ��� ���� ������ ����� �2 �������� ������ * "

<������� �� ��� �2 ��������� � ���� ������ �� �������� ���

### �</2 ����� � ��� ���������� �� ������� � ��� ����=

����� ����� �� ��� ���'��� � ��� ���� ����� �� ����������

�( O F"F� " # � ���� �$�������� ���# �� ���### �</2 ����

��������� � ���� 7����� �� �� *� ��� ����� ��� �2 �:����� ����� ��

��� " ���# �� ���'����� ����������� ��� �� �� ����7 ����� �2

�:������ �������� ��������� �� ������� �� ����� ����� � ���

����������� ���� 9���7 ����� �2 �:�����" ���### �� ��������

��������� � ��� ����� �2 �:����� � ��� ����������� ������ ���

��������� ��� �� ������ �������� �� -J4 ��� ����� �2

����������� ���### �</2 ����� � ��� ������� �����������

������ �������� �� ���� ����� ���� ���� �� ���������� ������ ���

� )>���:����� ����"

2 �$������� � ��� ���� �� )>���:����� ����� ���� ���# 1 ##

��������������� �� ������� � �������� ����� ������ ���

���� ������ �������� �� � ��� ���� ������+ � ��� �����������

��� ���� ������ �������� �$����� ���# 1 ## �� � ������

���� ���� ���������� ��� ���# 1 ## ����� �� ��� " .��� ����

�� ���# 1 ## ������� ���� ���� ������� ��� � ��� .29 ��'��� ���

��������� ������ �� ��� ��� � ;��" 3 �������� ���� �����

������������ ��������" ����� ��� ����� �2 �:������ ����� ����

������� ����� ���# 1 ## �$����� ���'����� �( O F"FF� " >���

�������� �������� �� ��������� ��������� ����� ���# 1 ##

��������������� ����� �� ��� "

# )>���:����� ����� ���### ��������������� �� ������� � �

��� ����������� �������� � ���� � � ������� �� �����

��� ��� " .��� ���� �� ���### ������� ���� ������� ��� � ���

.29 ��'��� �;��" 3 �������� ���� 9 ��� ����� �2 �:������ �����

�� ����= ���� ������� ����� ���### �$����� ���'�����

�( O F"FF� � ��� ������ ���� ������� � ��� ����= ����

�( O F"FF� " ���### �� �$����� � �������� �������� �� ���������

��������� ��� ��� "

# ������� ��� ����������������� ���� ��� ���# 1 ## ��'����

��� �� ���� �������&���� ����� ��� ���# �</2" ��� �� �� ���

��� ��� ��� ���### ������� � �������� ���### �</2 ����� ���

������ ������ ��� ����� ��� �2 �:������ ��� ������ �� ������

� ������ �� ����= ����" �� ���� ��� �������������� �������

���� ���� ��� �� ���� �� ��� ����������������� ��� ���###� ��

���� ������ ��� ���� �� ���### ��� ����� �� � �$������� ���

���### </2 ���� �������� �)�7��� �� ��"� � � � ��� ���

���### ��������������� �.������ �� ��"� � "

���������" ����# ��$��# �% ��� ������ �&

��� ����� �� ���� �������� �������� � ��������� �� � �� ����

�������� �0/6C �����(��� � ���� � �� �����������������

�������� �� @/2� � ��� � ����� 9" @/2 ����� ����

������� ��� ������ ���� ��� ���� ������ �� ����'� ��� �0/6C

�;��7���� �� ��"� � 3 " =�� � ��� �0/6C ������� �� @/2

������� ���� ���� �������� � ��� ���������� �� )>���:�����

����" ;������� �2 �:������ ��� ����� �� ��������� ����

������� ���������� ��� ���������� �� ����� ���� �(O F"FF� �

��� �� � ������� �$���� �� ����= ���� �( O F"F8 " �� �������

����������&� ��� ��������� ������ �� ��� ������ ��� #.6 ��

������9 ����������� ����� ���� � ��������� ���� ���

�0/6C �� @/2 ����� ������ 9 "

�� ������� ��� ������� �� ��� ���� �������� ������� � ���

.29 ����������� ���� �� ������� ��� ������ M�������� �����

���� �0/6C �� ����/�6 ���� ���� � ����K;2) ���� ��������

�� ����;-D!F ���� ���������D���������� �;��" 92J; " .��� ����

������� ��� � '�� ���� ��� ����� �� ��� ����� �� ���� ������� ���

�0/6C �� /�6� K;2) �� ;-D;!F ��� ��� � ����� 9" #� � �����

���� �2������� ��&��� ����� �� ������ ������� � ��� �����

���� �� ���� ��� ��� ���'����� � ��� ����"

' ����( �������� �

2������� ��� ������ ��� ����� ���� ./� ������� �� ��� ��

��������� �������� ���������� �� ��� �� K;2) �����" 2 ������

���� �� ��� ���������� �� �������� ���� ����� � ��� ���

�������� �;��" -2 " # )>���:����� ����� ��� ����� �� K;2)

������� �������� �� �������� � ����= ���� �������� ����

���� �� ����� ���� �;�� - �� 3 " ���������������� ��� �������� ��

����= ���� �������� �������� � � ����� ���� �;��" -> �� . "

;������� �2 �:����� � ����� ����� K;2) �������������

�������� ���� ������� ���������� ��� ����������� ��'��� ��

��� ����� �� K;2) ������� ���� �� ���'����� �( O F"FF�

������� �������� ���� ���� �� � )>���:����� ���� �;��" 3 " ���

�������� �������� ���� ������������� ���� ����� ���� ����� ��

����7 ������ �;��" -@ " # �2��:����� ����= ����� ��������

��������� �� ������� �(O F"FF� �������� ���� ���� �� �����

�2>C6 9" 6����� �� ���# 1 ## ��'����� � �2������� ������� � ��� .29 ��'��� �� ��� ���������� �������� ���� ��� �"8��*

.����� �2

�* D�� ����= �* D�� ����=

����� ������0/6C *"F� F"9 *"*� F"- 3"!� F"4Q "-� F"4Q�R�@/2 �"3� F"- *"F� F"- "F� F"8Q �*"-� F"!Q�R#.6 �"!� F"- *"3� F"8 !"-� F"3Q �9"9� F" Q�R.�����9 �"3� F"- *"*� F"3 !"*� F"!Q �9"!� F"4Q�R

@����� ������0/6C1DK;2)1 �"*� F"94 *"3� F"8��0/6C1D#-D!F1 F"3� F"*- *"*� F"49�0/6C1D/�61 8"!� F"49 !"-� F"8�R

.��� ���� ��� ��� �����6� ��P 8 " ���� ���� 7����� 9 ��� ����� ��� )>� �� �2 �:����� �� ��� ���� '$�� � �������� � �������� ��������" ;�� ��� ���� ������ ����� ���� ��������� �� ������� 2/=%2 ���� ���� �� �������� � ��� ������" ��� ������ �� ��� �2������� ��&����Q �� ��� ���# 1 ## ��'����� �R �� ���'��� �( �� ���� O F"F8 � ��� ���" ;�� ��� ������ �����M�������� ����� ��� ��� ;��" 9 � ��� ��������� ��������� ���� ��� ������ �����" ��� ����� �� ���� ������� ��� ���� �0/6C �� /�6 ���� ���'����� ������ � ��� ����= ���� �R(O F"F8 "

���# 1 ##? ���� � ��&���������� �������������� *9�8

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**

���� �;��" 3 " ���� �������� �������� ����������� ���� �����

���� ����� �� ��������� ����7 ������+ �������� ��� ��������

�������� ��� ���������� �� )>���:����� ���� � ��������� ����

K;2) ��������������� �;��" -6 "

����� ��

���������D���������� ��� ��� ������ ��� ����� ���� ./�

������� �� ��� ����� ������������ �� ������� ��� �� �����

����� ���������� ������ �2������� ������ � ��� ����������" #

��� )>���:����� ����� ���������� ���� ���� ������ � �����������

��������� �� ����'�� ���� ����� ������������ ����� ����'��

(������ ��������� �;��" -; �� K " # ����� ����� ��� �2 �:�����

������ � ���'��� ��������� �� ���������� ���� � ��� ��'��� ��

��� ���������� �� ��� ����� �� ����� ������� ���� �������

���'������ ���� ��� ������ ������ � .2�J.29 �(O F"FF�+

;��" 3 " ��� ��������� ��������� ����� ������� �� �����������

�� ��� ��������" 5������� ���������� ���� ������� ����'�� ��

���� � ����������� ����� � ���� ��������� ���������� ����

����� �� 9 ��� ����:����� �;��" -5 " # ����= ����� ��� �2

�:����� �� ��� �������� �� ����������+ �������� ��� ����� ��

����� ������� ���� �� �������� �������� ���� ���� �� ����� ����

�( O F"F8 �;��" 3 " 2�� ��� ����������� ��������� �� ��������� ��

�������� �� ���# 1 ## ��'������ � ���� ��� ��������� �������� ����

��7� �� �������� ������� ��� ������������� ���� ������&���� �� �

��� ��������� �� ����� ���� �;��" -5 �� # "

)������ ����� � ����( ����

�� ��� ��:�� &�� ����� ������ �� ����� ����� ����� ������

��� ����� ������ �� ��� ������ ����� ����� � ��� �����������

�� �� ���� ������ � &��" ���� �������������� �������� ����� &��

����� ���� ��������� ��� ����H �����" # )>���:����� �����

� ��������� � �������� &�� �� ������� ������ ����� �� ���

�= ���� �;��" 82 �� > " ��� ������ �� ��� ����H ����� �

)>���:����� ���� �� 7��� ��� �� ���������� ��� � ���� ���� �

����� �� ������ �2������� ������" ���� � �2��:����� �����

���� � �������� ������ � �������������� �������� &�� �� �������

�� � ���������� � ������� 9 ��� ����� �2 �:����� �;��" 8. "

# �2��:����� ����= ����� � ������� ������ �� �������

�;��" 8@ "

*������( ��� �� � ����� " �$�# ����# �+��, ��� %�-.��!*$ ��� �����

�� ��� ��:�� ����$���� ������� �� ��������� ��� ����= ����

����� �� ��:����� �� � ������� �$������� ��� ����� �2�

������ ��&���" �� ������� ��� � ���������� �� ������ ���

������ ����� �� ������� �$������� ���+ �@2 ���M����� �����

����$������ �� /#�� ���M����� ������ ������ �������� ������

� ���� ��M��� ����$������� �������� �� ������� ����� �$���

�/= �� �����$��� ����� " �2 �:����� ����� � �������� ������

�� ��� ����� �� ���� ������� ��� �@2 �� /#�� �;��" 3 " /#��

����� ���� ������� � ��� ����= ���� �������� ���� �����

���� �;��" 9K �� 5� �� 3 " E� ��� ��������� ��� ��:�� �$�������

����������� ���������� ������ /;��> �� ��� ����$����

�&��� .�DG��=@ �;��" 3 " >��� ���� ������� �� �2�������

��&��� �(O F"FF� � ��� .2�J.29 '���� �� �� � ������� �$��� �

����= ���� �(O F"F8 " 2���� �2 ������������ /;��> �������

��������� ����� �� ��� ����� ��� ��� ��� � ����'�� ����

������ �����M�������� ������������� ��� ���� �$����� /;�

�> ���� @/2 ������� ����" # ��:����� ����� .�DG��=@

�� ������� � � ��� ����� ���� �� ��� ����������� �� ��������

�2��:������ .�DG��=@ �$����� �� ������� � �������� ����

�� � ������� ������ ���� �� ��� .2�J.29 '��� �� � ������

���� ��� ��� "

/��%!+ ��� /��%!+�

��� ������� ����� �������� � ���������� ����� ����� �� �2�

������ ��&��� � ��� ����= ����� ��� �� ������� ���� ���

��������� �� ������ ������ �������� ��� ����� ��������� �� ���

��������" # ��� ������ �� ���� ��������� ��� ������ �� �2 �� ���

# 1 ## ��'����� � K��.�; ��������������� �� � ���� �� ��

��������� K��.�;�" # ���� ���� ���# 1 ## ��'����� ����� ��

������� ��� ����� � )>���:����� ���� �;��" 3 " �2 ��������

������� ��� ����� �� K��.�; ������� ���� �( O F"F� � ��� ����

���# 1 ## ��'����� ���'����� �( O F"F8 ������ ���� �����

�;��" 3 " ��� ��� ���� ���� �$����� K��.�; �� ��������

��������� ��� ��� ���������� ���� ���� ��� ��������� �����+

K��.�;� �$����� �� �� ��������� � ��������� ���������� ��

�������� � � ��� �������� ��� ��� "

4�������

��� ������ �� �2 � ���# 1 ## ��������� �� ��� ��� ������ � �

��� ������� �� ���� ����� ���� ��� ��������� �������

���������� ���# 1 ## �$����� �@���� �� ��"� � 8+ G��� �� ��"�

� 8+ ������� �� ��"� � ! " E� ��� ���� ���� ���# 1 ## ���

����������� � ��� ./� �� ��� ������ ����������� �� �2� ��

���� ��� ����� ����� � ��� ����������� ���� ��� �������� �

��� �����$ ����� ��� � ��� �������� �����$ �� ��� ���������

�����" ��� ������ �� �$����� � �������� ���� ��� �2��������

��&��� ������ �����7� � -+ >��2��� � !8 � �� ������

����� ���� ���# 1 ## ��� �������� ������ ��� ����� ���� �2�

������ ��&���" ��� ����� ��� ���� ���# 1 ##���'���� ���� ���

��������� �� �2������� ��&���" ���� ��� ��������� �� �����

:������ ��� ����� �� �������� �� ��� ������� ���� � ���

�= ���� �� ����� ����� ���� �� ������" # ������� ��� ������

���� �� �� �������� �� ���# 1 ## ��'�����" =������� ���� �����

��� �����7���� ������ �� ���� ������� � ���### ��'���� ����

�6���7� �� ��"� � 4 " ����������� ���� �� ������ �������

�������� � ����� ����� �� �2 �:�����+ ������ �������� 9J-

���� ���� ������� ������ �� ���� ��� ����� ��� ��� ��

��� ������ ���� ����� ��� �2 ������������ �� ���# 1 ##

��'����� ��� �� ����� ����� ������������ �� �2 ��� �� ����� �2

��� ����� �� ��� " E���� ��� ������� ������������ �� ������ ��

�2 ����� �� �$������ �E������ � /���� � � � ��� �������

�������� ��� ����� ��������� �������� ��� ������ �� ���# 1 ##

��'����� ����� �� �� ���������"

�� ����������&� �������� ������� ������� �� ��� �������

������������ �� ��� ����= ���� ����� �� ���� ������� ��� �

;#K" 9" @����� ����������������� ��� �0/6C �� ����'� ���� ���7�� ��� �@2 �� /#�� ����� �� ����� �� ����= ���� �������� �2��:������" �2 �� > ���� ���� 7����� 9 ��� ����� ��� )>� �� �2 �:����� �� ��� ���� '$�� � �������� � �������� �� ������" ��� '���� ����0/6C ����� ����� �� /�6 ����� ���� �� �2��:����� ����� �2 �� ����= �> ����" #� � ������ ���� ��� ����= ���� ��� � ������������ �� ��������� ���� � ��� ���������� .29 ���� ��� �������� ���� ���� �� ����� ����" �. �� @ K;2) ����� �� �0/6C ���� ����� ���2��:����� ����� �. �� ����= �@ ����" �6 �� ; ;-D!F ����� �� �0/6C ���� ����� �� �2��:����� ����� �6 �� ����= �; ����" �K ��5 /#�� ����� �� �@2 ����� ����� �� �2��:����� ����� �K �� ����= �5 ����" ����� ��� 2J@� �� K �� 5� 9F��+ 6 �� ;� **��"

*9�3 A" .������ �� ��"

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**

���# 1 ##? ���� � ��&���������� �������������� *9�4

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**

*9�! A" .������ �� ��"

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**

�������� ���������������� ����� �� ��� .29 ����������� ��'����

��� ��� ��������� ����� �� �2������� ��&���" #� � �������� ��

�����&� ���� ��� � ��� ���� ����� � ���'��� �������������� ���� ��

���### �� ������� �6���7� �� ��"� � 4 " ����� ��� ����� �2

����������� �� ����� ����� ����� ������ �� ������� � ���

���� �� ��� ����������� �� ������������ ���� �� ��� .29 '����

� ����'�� �� �������� ���� �� �������$���J��� ����� ���

��� " 2� ��� ����� ��� �� ��� ���� ���� ��������

�������� � ��� �� �0/6C� @/2� #.6 �� ������9 �����"

2 ���'��� ����� ����� �� ������ ������ �� ��� ������� �

���� �������� �������� �� ��������� ��������� ���� �����" E��

���� ����� ���� ��������� � ��� ����= ����� ���'���

��������� ���� �������+ ��� ����� �� ���� ��������

������� �� �������� ����� ��� ����� �� ��������� ���������

�� ��������� �� �������� �������� �� ������� ���'�����"

)����������� ������ �� �$�������� ���� ����� ��� � ���

������������� ��������� �� ��������� ���� �� � �������

������ �M�$ �� ����� ������� ������� �������� �� ����

���(���� ������ '���" # ��&�������� ����������� ������

������� ��������� &�� ���� ��������� ������� �����

������ �� �� � ������� ��������� �� �$�������� ����������

�� � �� ������� /�@2 ����������������� �$������� ��

����� 2�)2D�2 ����������������� �$������� ���� � .����

� !!+ C�� �� ��"� � F+ E�� �� ��"� � 9+ S� � E��� � 8 "

6$�� &�� � ������$��� �� �������� ��&���� ����������

���� ��� ��������� ����� ��� &�� �;�������7� �� ��"� � ! + ���

;#K" 8" ����H ����� �� ����� �� ����= ����" ���� ���� 7����� 9 ��� ����� ��� )>� �� �2 �:����� �� ��� ���� '$�� � �������� � �������� ��������" �2 # )>���:����� ����� ����� &�� ����� � �� ��������� � ��� ���������� �� �� � ���� ������ � ��� �����$" �> # )>���:����� ����=����� &�� ����� � �� ��������� � ���������� �� ���7�� � ��� �����$" �. ;������� �2��:������ &�� ����� �� ����� ���� ��� ������� ������� ����������� �� �����$" �@ ;������� �2��:������ &�� ����� �� ����= ���� ��� ������� �������� ��������� � ��� �����$" ����� ��� 2J@� -FF��"

;#K" -" K;2) ����������������� �� ����� ������������ �� ��:����� �� �2 �:����� ����" ���� ���� 7����� 9 ��� ����� ��� )>� �� �2 �:������� ��� ���� '$�� � �������� � �������� �� ������" �2 �������� ���� ����� �� ����� ����� ����������� ���� .2��.29 �� ������ �����@K �� � ����� ����" �> K;2) ������������������ ����� �������� �� ��� ����������� .2* ����� � )>���:����� ����� ����" �. K;2) ������������������� ����� �������� �� ��� ����������� .2* ����� � )>���:����� ����= ����" �@ ��� .2* ����� ������ ������ �������� ��������� ���� ����� ���� ����� ������ �������� �2 �:����� � ����� ����" �6 ��� .2* ����� �� �2 �:����� ����= ���� ������ ����� ���������������� ������ ��� ���� �� ����� ����" �; C���� ������������ ����� ����� ��������� �� ��� ����������� .2* ����� � )>���:����� ���������" �K C���� ������������� ����� ����� ��������� �� ��� ����������� .2* ����� � )>���:����� ����= ����" �5 ;������� �2 �:������ �������� �� ���������� ���� � ���'����� ������� � ����� ����" 2�������� ���������� ���� ���� �������� ����� ����'�� ���������� ��� ������ ������� ������������" �# ;������� �2 �:������ ��� ����� �� ���������� ���� � ��� ���'����� ������� � ����= ���� ����������" 5������� ��� ��������� ���������� ���� ��� ������7� ���� �� ����'����� �������� ���� ���� �� ����� ����" ����� ��� 2� * F��+ >J6� * ��+ ;J#� 84��"

���# 1 ##? ���� � ��&���������� �������������� *9�

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**

� .���� � -+ ��� �� ��"� � 3 " ���# 1 ## ��� ��:�� &�� �����

������� �� ��� ����� ��'����� ����� ���� � ���'��� ������ �

��� ������ �� &�� ��������� � ��� ./�" #����� �� ���� �������

� ����� ������ ��� ��� ����� &�� ����� �� �� �������� � ��� ./� ��

����= ���� �)�7��� �� ��"� � � " @���� �2������� ��&����

�� ����� �� ��������� ���� ��� ����� �� ���# 1 ## ����� ���� ��

������� ���� &�� ����� � ��� ����������� ��������� ��������

������������� ������ '���" #����� ��� ���� �� ���������� &��

�����'�� �� ����H ����� ����� � 9 �� ������� �������"

���������� ������� ���� &�� ����� � ��� ����= ���� �����

��������� �� ��� ������� �������������� ����� �2�������

��&��� �;�������7� �� ��"� � ! + /��� � .���� � 9 "

#���������� &�� � ���������� � ��� �������������� �� ������

����������� ������� �.��:���� � C��� � 4 "

2����� ������ �$������� ��� ��� ������� ������ �������

�� ��� ����= ���� � � ������� �$������� ���" 2�������� ��

��������� �������� ��� ������ ���� ������� ���������� ����� ���

��� ���� �� ������� �������� ���������� � ��������������� ����� ����

��������� ���'����� �� ������ ����� ��������� � >�� �

����� � 4 " #���������� �$������� ��� �� ��� ������� �

������ ���� ��������������� ����� �.���� � )�������7��

� 9+ >�� � ����� � 4+ 5���� �� ��"� � 4+ ������� �� ��"�

� 4 " ���# 1 ## ��� �������� ���'��� ����$���� ������ �����

� >������ � 9+ C�&� �� ��"� � 8 � ��� ����� �� ����� �� ���������

���� ���# 1 ## ��'����� ����� ���� � ���'��� ������ � ���

����$���� �������� �� ��� ./�" ��� ������ � /;��>� � ��:��

�$������� ����������� ���������� ������ � ��7������� ����

�������7 �� ��"� � * � ������� ����� � ������� �$������� ���

� ����= ���� ��������� ���� �2" ��� ����� ��� .�DG��=@

����� ������ ���� �������� � ��� ����������� �� ��� ����$����

�&��� ����� �� ������ � � ���������� �����" ��� /#��

����� ������� ��������� ���� ��� ����� �� ���# 1 ## ���� ��

������� �$������� ���" )����� ������ ������� � � ���$ ��

������� ����$������� �������� �� /= �� �����$���" ���# 1 ##

���� ��� ��� �� ������� ���'����� ���� /= ������ �� ��"�

� 9+ ����7� �� ��"� � -+ ���� �� ��"� � 3 " ;����������� ���

# 1 ## ������ �� ������� ����� ��� ������$�� �� @/2��������

������ �� /= � /#5 9�9 ���� �������& �� ��"� � 8 " 2������� ����

������ ��� ���7��� �������� (������ ������ �� ��� �����$���

�������� ����� ��'����� ����� ������ �����$��� ����� �������

������� ���� .�*1 ����� ����� � >������ � 9 " ���� �����

������� � �������� ��� ��� ������� ������ ������ �������

������� � ��� ����= ����� �������� ����� ������� ���� ��

����� ��� ���� ��� ����� ����"

���������� ���� �������� &�� ��������� �� ������� �$�������

��� ����� ��������� �� ��� ������ ����� ������� � ��� ����=

���� �:����� ���� �2" ��� �� ��� ��� ������� ��� � ��������

����� �� ./� ������� ��� �������� �)�7��� �� ��"� � � " #� �

��������� ���� ��� ���� ���� ��� ��������� �� ��� ������

����� �� ��� ��������" ���� �� ������ ��� �� ������� ��������

� ��� ���� �� �����������������" # �������� ����� ���# 1 ##

��� �$����� �� � ���� ����� �$��� � ���� ��� � ����� ����

���� �2����� � 3+ 2���� �� ��"� � 4+ 5������ �� ��"� � 4 "

=������� ��� �������� ���# 1 ## ������ ����� � ���� �����

��������� ���'����� �� ��� ������� ������ �������� ����

�:��� �������� ���� ����� ���� ����"

��� ��������� �� ���������� ����� �� �2������� ������

�:��� ���� �������� � ��� ����= ������ ������� ������

������� � �������� �� ������� �������" ��� ����� ���

��������� �� ������� ������ ����� ������ ��������� ��

���������� ��� �������� �� �� ������ ��� ������ ���������

����� ./� ������ �K����7��5������ �� ��"� � 3+ <���� �� ��"� � 4 "

��� �$��� ������� �������� ��� ��� ��������� �� �����

������ � ��� ����= ���� ����� �� �� ���������" #� ����� ��

������ ���� ��� ��� ������ ���� ������ ������ ������� ������

������ ������ �$�� &�� ����� �� �$������� ���� ����� ���

������ ����� ����� ������ ����� �2������� ��&���" #� � ���

������ ���� ������ ������� �� ��� �������� ��D�� ���������

�� ��� ����= ��� �������� �"�" K;2) �� K��.�; ����� ���

������� � ����= ���� ����� �� �2 ��������" K��.�;� �����

�$����� � �������� ��������� � � ����� ���������D����������

������ �K����� � #����� � !! " ���� ��� �������� ���������

��������� �� K��.�;� �������� ���� ��� �������� ����������

�$����� �� K��.�;�� ����� �$����� �� ���� � ����� ��� �������

������������� ���������� � ��� ����=" ;������ ����� �� �����

����7��D������ ������ � ��� �� ����� ����� �� �$������$�����

�� ./� ������ � ��������"

���### �� �������� � � ������ T������ ��������� ������H

������ �� �������� ������� �� ��� �������� ���� � ������� � ���

������ �� ���� �$����� �0����� �� ��"� � �+ 6���7� �� ��"� � -+

)�������� � 8+ ������ �� ��"� � 8 " .�������� ���### � �

�������������� ������ �� ���� � ��� ����� �� ���� �$����� ��

�� ���� �6���7� �� ��"� � -� � 4+ ������ �� ��"� � 8 " E� ����

��� ������� � ��������������� ������ �� ���### ��� �������� ���

�������� �.������ �� ��"� � � �� ��� ��� ������������ ���� ��

��� ������ ��� �� �������� ������ ��� �� ����" # ��� �������

�� ��� ���� ���### �</2 �� ������ ����� ��� ������� �� �2�

������ ��&��� � ����� ����� �� ���� ��� ������� ��� �� ���

�</2 ������ � ������� ������� � ����= ����" ��� ���� ���

��� �������� �� ��� �� ���� ������ ��� �������� ��� �$������ ������

;#K" 3" #���������������� ���� ���� � ��� .29 ��'��� �� ������������� �������� ���� ��� �"8��* " ���� ���� �:����� ���� ������)>� ������� �� ���� 7���� ���� ��2 �� 7����� 9 ��� �����" .��� ������� ��� �����6� ��P 8J�F " <���� ���� ��������� �� �������2/=%2 ���� ���� �� �������� � ��� ������" ��� ������ �� ��� �2���������&��� �� ��� ���# 1 ## ��'����� �� ���'��� �( �� ���� O F"F8 � ������"

*9*F A" .������ �� ��"

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**

�� ���### </2 ����� � ��� ����= ��� �7��" .���� �

������ �������� ����� �� � ������ �� ������" 2������� ����

���������� ���������� ��� ��������� ������� ����� ���� ���### �

������ ������������ �� ���� ������ �� �� ����������� ���������� ��

���# 1 ## �)����� �� ��"� � -+ ������ �� ��"� � 8 � ����� �����

���� ��� ����� ������ ����� ���� ��� ������" ���� �� �����

�������� ���� ��� ����� �� ���# 1 ## ���� ��� ����������

����� �� ���###" ������ ������ �� ���� �������� ���� � ���###

�= ���� ���� ���� � ���������� ��� �������"

$���������������

��� ������ ��7������� @� <"@" )������� ��� ���������� ������ ����������� �� ��� ��� ���# �����" ���7 ��� ���� �� )������ �" ������� A���� .��� ��� �$������ �������� ������� �� �� ���� ���� �� >�����<��� ��� ����� ������������ ������" ��� ���� �� ��� C��������� �H2�U���>��(������ ��� @��������� �� >��(������ � >������� ��������� ���7��������" ��� ���� �� �������� �� )�)K. )� !JF�4F� .���������� � 0�������� # <������ � �K< FF99F �� ;������N TC� .��$�H 4D�F*JFF �A5 � �� �� ��� /��� /����7 ;���� @�7 6������ ���7��;��7������ @��" A���� ���� �� 5���� ;��� ;��� �� �4"�*"� !��K���� �� 2��� 5����H ;��� �� �V����� 0�������� CW�������7������� ;�7�������� ��) " A. � � ������ �� .#<#� ;# 3D*3�9"

$##��������

K;2)� ����� '�������� ������ ������+ K��.�;� �������������������������� ��������� ������+ K��.�;�� ��������������������� ����� ���������� ������ ��������+ �������7������������� �&���� #.6+ �2� 7��������+ ������ ��������>� /;��>+ �@2� ��������������+ ��� ��������������+ /=� ����� �$���+ )>�� ����������������� ����+ �=@� �����$����������+ @/2� ���� ���� @/2+ �>�� ������������ ����"

:���������

2����� �" �� 3 ��� �������� ���'���� �� ���� �������������"#*$�+! �!� ��� ��* J��93"

2����� �"� .������ �"K"� ������ ."@"� )�������� <"@"� 6���7�� A"." �>��� 2"#" �� 4 ������������� � ���� � ��� ���� � ��������� �����������" ,�-����! *���! (��%����!� ���� ** J*-*"

>��� A" � ����� ." �� 4 /��������������� ������� � ����? ��� ������ ����������� � �$������� ������������ ������ �����" +��� ���!���!� ��� 998J98!"

>��2��� S" �� !8 C����� ��&��� �� ���� ������ �������� �� 7���� ����?������� �� �������� �� ���� �������� ���� �������" ��������������� 948J-F9"

.������� A"� K������ �"� �������� 2"� )�7���� �"� ���� �" � 5������� A"�� ������������� ��� �###? �������� �� ��������� ����������������� ���� ���#1## � ��� ����&� ������ ��� ���� �� � � ���������� ��������� �� ����� �� 2�&������H ����� ����" �! �������%����� ���8J��* "

.������� A"� 5���N��&� A"� K�&�N��&� >"� .�������� #" � 5������� A" �� ! C�����&���� �� ��������������# �� �### �$����� � ��� ./� ��������� ���� ���� ����������������� �$����� �� �������7� 3" �-�!�����!� ���� �!-J� -"

.����� A" � )�������7�� )" �� 9 =$������� ���� ���������� ����������������� �������" $������� ���� 3! J3 8"

.��:����� �" � C��� K" �� 4 G�� ��������� � ��� ����? �������� ������ ��������������� �������" ��������! .��!� �� �94J�3 "

@����� �"� )�&����7� �"C"� E����� A"� ����� ;" � 2����� K"�" �� 8 �������������� ������ �� �$����� �� ��������������# �� �### ������� ��� ������� ��� � ��� ���� ����� 7���� ����������� ��&���"�������%! /��!� ��� 8 J4�"

6���7�� A"."� 5���������� K"� ������ �"2"� ;������7� K"A" � )�������� <"@"�� 4 @������� �� ��� ��������������### ��� � ����? ����� �� ����&��� ��������� �� ���� ������������ �� ������ ����� �� ��&���" �!�������!� ��� �*4�J�*!�"

6���7�� A"."� ������ >"2"� ������ 6"A"� >������ <"C" � )�������� <"@"�� 8 6$����� �� ���� ��������������### � ������� ����"�������%! /��!� ��� 98J-�"

6���7�� A"."� ������� 2"�"� A��� C"�"� E���� @"<" � )�������� <"@"�� - 6����� ����������� �������� � 2�&������H ����� �����$ � ���������� ���� ������������� �� ��������������### �K#; " +��� ���!���� * 4J9F-"

;��7����� ="�"� <���� A"2"� �������7��� 6"%" � %����� C" �� 3 ��������������� �� ����������� @/2 � � ����'� �� ������ �������� ���7���� �������" �-�! ��� ���!� ���� 9!4J9 4"

;�������7�� ."� 5�����&� �" � ��K���� A" �� ! ���������� �� &����� ��������� �� ��&���������� ����� �� ����" +��� ���!� ��� 9�4J9*�"

;�������7�� ." � ��������� @" �� - G���������� ����" +���!$�0����� �� �*4J�9 "

K����� �"� K������ �"� 5�����&� A"� ������&� )"� >������ #" � 5������� A"�� - <�������� �� ������������� ���������� � ��� ����? ������ ����������������� &��� ������� �� �����$�" *%! �! (�'����!� ���� 643FJ6434"

K����� �"� <������� @"%"� <������ >" � 5������� A" �� 9 @��������� �� ������������ ������ ������� ������������� ��� ��� �������������" �!/%%�������'� ��� *F J**8"

K����7��5������� )"� %� .��7��� @"� /�X������� E" � #���� )" �� 3 ��������� ������� �� ���������� ���������" 2" #��������� ������������� �� ��������������� �����" �������%! /��!� �� �J�*"

K������ @" � #����� A" �� !! .�������������� ������ � �������� ��������� ���������" �! �������!� � -4F4J-4�4"

5����� �"� .����� A"�"� �������� ."2"� ����������� �"� )��� ," � ;�����<"2" �� 4 /���������� ���� ������� ���� � �������������� ���� ��������� �������� �� ����� ����������" /��! ���! ��������!� ��� * J9�4"

5���N��&� A"� .������� A"� 2����N� �"C" � 5������� A" �� 4 #;/��<�D����� ��� � ������ ����� �� ���� ������������� #1## ����� �������$� ��� �� �� ��������&���� ���" �! �� ���-�� ���!� �� 939J94F"

5������� A"� .�������� >" � .�������� #"C" �� 4 <�������� �� �����������������" �! ,����� �������%!� �� �J*3"

����� A"5" � ��������� 2" �� !! >���������� �� �������������"+�����%���'� ��� !8F J!8�8"

������ �"."� K�� �"� 2������� E"6" � )������� @"5" �� 9 ������������� ����� ���� ;�*1 �� /= �� ���� ������� ���� 2�P *"F9 6�< ����" +�����%! +����'�! ���! �%%��!� ��� 39*J398"

���� A" � .���� @" �� - G�� ��$����� � �������� �������� ����?��������� �� /��������@��������� ��������" ������������ ��� �F- J�F84"

���� A"� ���� �"� K���� >"� 5�� S"� 5�� ." � .���� @" �� 3 ��� ���� �� &��� �������� ������ ����� ����� ������ ������ �������� �������" $����������� �F�9J�F�3"

���� A"�S" � .���� @" �� !! G�� ����� �$�������� ���� ���� ������$������ �������� ����" �! �������!� � *�3-J*�4�"

����7�� �"@"� ;����� �"� �������� �"� G�7�� ;"�"� @����� #"� E�����A"<"� >�������� 5"� >������ �"@" � �����>������� %" �� - /������$��� ������ &�������� ������ ������ &�� ������ ����������������� �� �������� �� ��� &�� '�������� ���� ������������������� C2. " +�����%! +����'�! ���! �%%��!� ���� ��F8J���F"

C�&�� A"�"� ����� S"� @�������&&�� @"� ������7�� 2"6"� .���� �"5" � )����>"<" �� 8 6����� �������� �� �$������� ��� � �������� ������������ ���� ������� ���� ��'���� � ������������� # �� ## ���" �!+���! ��%!� ���� 88F3J88�F"

C��� K"� C����� 2"� �������� �" � 5��������� 2" �� F ���������$����� �� &�� � ��� ��� ����������" �������! &���!� ���� �88J�8!"

������ >"2"� ������ 6"A"� ,������ ."A"� >������ <"C" � )�������� <"@"�� -� �������� �������� �� ������������� # �� ## ��� �������������� �� �������" (��! ���� *�� ! $��! )$*� �� 8!-J8!!"

������ >"2"� ,������ ."A"� 6���7�� A"."� ������ 6"A"� ;������7� K"A"�G��������&� >")"� >������ <"C" � )�������� <"@" �� -� �������������### � �$����� � ���� ���� �(����� &�� � ������ ������" �!�������!� ��� 8!--J8!84"

����� <"<"� 5�������� A";"� ������ K"�"� .��7� A"."� E���7�� �")" � E�7�@"2" �� 3 6������ ���� ����� �$��� ����� ������� ��$����� ���������� ��� ����� ���� �������������" ��%! ���! ,�-����!� � 9*3J99*"

�������� )"� �� >��7� ;"� >���� ��������� �" � <������ K" �� ! 2�������� �� ������������� ## �� ������������� A �</2 ����� �7������������� ���" ��������� � 4 J!9"

���� �" �� 9 ���������� ���������� �� ����H ������� ����� �������� �����M�������� ������������" �! ������� ����! �� �- J�83"

/���� A" � .���� A" �� 9 #M���� �� G.�* ����������� � ������������ ����������� ����� �� 7���� ���� � ���" +��� ���!� ���� * !J9F9"

)�������� <"@" �� 8 .��������� �$����� �� ��������������### ����### �

���# 1 ##? ���� � ��&���������� �������������� *9*�

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**

��� �� ���#� ������ ������ ��� ���� ������ &�� ��'����" ,�-����!*���! (��%����!� ���� �9 J�-3"

)�������� <"@"� ;������ �"@"� E�������� �"6" � @����� @"�" �� * ���###� � ���������'� ������ �� ��� ������������� ��� ������" (��! ����*�� ! $��! ) $ *� � 3999J3994"

)�7���� �"� .������� A"� K������ �"� ���� �" � 5������� A" �� � ./����� ������ � ������� ������� � ��������������#1## ��'���� ����"�! �������!� �� *898J*8-8"

)�7���� �"� K������ �"� ���� �"� ������ )"� 5���N��&� A" � 5������� A"�� � #������� �M�������� ����� �� ����� ���� ����� � ������������������������# �� �## ��'���� ����" �-�! �����!� ���� �- J�3-"

)�7���� �"� ���� �"� .������� A"� 5������� 5"� �������� 2"� >��������5" � 5������� A" �� � ������� ���������� �M�������� ����� ������ �:��� � �������7��3 ��'���� ����" 1���� ��� 9-9J984"

)������ @"C"� ;����� �"�"� ;������ )"� >�������� /"6"� 5�&�7��� )" � %��7��" �� - #������� ������� �������� �� ����� ����� ��������� �������� ������ ��������� ������ �K#; ���� ����� �� �(��� ����"#�+$ &���!� ���� � 9J� 4"

,������ ."� ������ 6"� ������ >"� >������ <" � )�������� <" �� ! 6�������$����� �� ��������������### ���� ��������� ����� ���� ����� �������� ����" ,�-����! *���! (��%����!� ��� �-!J�84"

,������ ."A"� ;������ �"@"� 6���7�� A"."� ;������7� K"A"� ������ 6"A"�G��������&� >")" � )�������� <"@" �� - #������ �� � ��������������� ������ ����#% ����� ����� ������������� �������'�� (����� ���������" +�����%���'� ��� 4*8FJ4*8 "

<����� A"C"� ��������� 2" � K���� ;" �� 4 <������� ��������? �������� ����������� ��� �� ���������� ������" ,�� � �������!� ��� 84FJ844"

����� �" � >������ #" �� 9 =$��� ���� ������� �� �������������" #���� ��! +���! �� !� ��� 9*8J994"

������7� <"� 2������� �" � >�������� )" �� * /������ ������ 7>? ��$������� ����������� ���������� ������ �� ��7������� ���� �������� " #�� �� ! ���! �%%��!� ��� **�J*94"

������&� �"2"� C�&�� A"�"� S�������� A"."� 2���� E")"� E�������� �"�>������� 5"2"� �&��� 6"� >������� �"<"� <����� )"@"� C������� A"<" A� �)���� >"<" �� 8 ������������� ������� ����� ��� ������$�� �� @/2�������� ������ �� ����� �$���" (��! ���� *�� ! $��! )$*� �� --8*J--83"

������� 2"�"� A��� C"�"� 6���7�� A"."� )�������� <"@" � E���� @"<"�� 8 >���������� �� ��������������9 ��������� ���� �� ���� ��������� �(���� ������ ��� ����� ����� ���������" +�����%���'� ���-4-FJ-4-4"

�������� 6"� >����S���� 6"� 5������&� �" � ����� <" �� 4 =$���������� � ���������� �:���? ���� ����$���� �������� � � �������� ���������� �������" �! ���! +��� #��2 �����!� ��� �FF4J�F� "

����7� K" �� - ����� ���� ��&��� � ��� ���" (�0! ��������!� ��� �J9*"0������ S"� ��7��� �"� ������ �"� #����� S" � �������� �" �� � ���

������ ��������� ������ ���� � ��'���� � ��� 2�&������H ����� ���� �� 3! ���� ���� ����������������7� ������" ������ �� 994J9-4"

E��� A"5"� 5������� @"�"� ���� A" � .���� @"E" �� 9 2�)2 ����������������� ��������� &�� ������$�����" ������ ��� -9J- "

E������� C" � /���� @" �� � @���������� �� �$�����'� ������ ��7���� ���� �� ������ ���� ���� � ��� ������� ����� ���� �� ��� ������ ������ �� ���� ������ ���������" �-�! �����!� ����**3J*93"

S�� 5" � E��� A" �� 8 G*1 �������� .�*1 ��������� 2�)2D7���������� �� ������� �������� ����� �:���" ��������� �� *889J*883"

G���� 5"� >����� /"6" � ������ ."@" �� 8 .������� ��������� ��������������� # �� ### �</2 � ���� ����" �������%! /��!� ���-9J8!"

*9** A" .������ �� ��"

� *FFF ;�������� �� 6������ /��������� ��������� ������� ������ �� ������������ ��� *9��J*9**