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Enfermedad de Gaucher: Diagnóstico y avances en el tratamiento
Dr. Miguel PocovíCatedrático de Bioquímica y Biología MolecularUniversidad de Zaragoza
Barcelona 22 Septiembre 2013
Phillip-Charles-Ernest Gaucher
Enfermedad de Gaucher– una EDL
• La enfermedad lisosomal mas frecuente.
• Autosómica recesiva.
• 1:15 judíos Ashkenazi son portadores y
1: 850 la padecen.1: 850 la padecen.
• Otras poblaciones 1:40.000 -1:100.000.
• Dispone de varios tipos de tratamiento.
• Deficiencia de Glucocerobrosidasa lisosomal.
Macrófagos tisulares
InfiltracionesFibrosis intersticial
Ocupación de los alveolos
Manifestaciones clínicas
Células Kupffer
Matraz de ErlenmeyerOsteonecrosis
Osteoesclerosis
Osteoclastos
Médula ósea
Anemia, trombocitopenia
Células de Gaucher
Otros órganosCorazón
Nódulos linfáticos
Sistema nervioso central
Riñones
Manifestaciones oculares
Manifestaciones cutáneas
Fenotipo Continuo
Tipo 1
Tipo 2
Tipo 3
Hidropsfetalis
EpilepsiaMioclonia
AfectaciónBulbar
Movimientossacádicos
Asintomaticos Hepatoespleno-megalia
Sidransky et al 2004
DiagnósticoDiagnóstico
¿Qué pretendemos con el diagnóstico?
• Hacer un diagnóstico precoz, antes que aparezca patología irreversible en:
• Recién nacidos• Niños• Niños• Adolescentes• Familiares• Población seleccionada, por ejemplo….
Estrategias de búsqueda de pacientes con EG
• Trombocitopenia de origen no filiado o atribuida a hiperesplenismo, sin marcadores de hepatopatía crónica de origen cirrótico o trombocitopenia de origen inmune
• Esplenomegalia de origen no filiado asociada o no a cirrosis hepática. Pacientes esplenectomizados sin diagnóstico hepática. Pacientes esplenectomizados sin diagnóstico concreto
• Fractura espontánea de cadera no justificada. Osteomielitis “aséptica”
• Fosfatasa ácida + esplenomegalia u otros?
Mistry PK et al. Am J Hematol 2011
Mistry PK et al. Am J Hematol 2011
Aspirado de médula ósea:Células
Células de Gaucher
No aconsejable si es primera opción:Existen metodos menos invasivos para diagnostico.Presencia de celulas pseudo-Gaucher: mieloma múltiple, SMD, LMC….
Glucosilceramida Ceramida + Glucosaglucocerebrosidasa
Como se diagnostica la EG? (I)
Leucocitos/fibroblastos
pH 5
Como se diagnostica la EG? (II)
Taurocholato
37ºC, 2h
4-metilumbeliferil-β-D-glucopiranósido(Sigma) β-D-glucopiranosa 4-metilumbeliferona
4MUλexcitación = 366 nmλemisión = 446 nm
Actividad enzimática (nmol/mgp.h)
16
18
20
22
24
26
28
30
¿Qué nos aporta el análisis enzimático?
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Pacientes Portadores Sanos
En leucocitos o fibroblastos
:CostosoNecesidad de controles. ValoresestándaresSolapamiento
Casos especiales : Gota de sangre sobrepapel de filtro (FTA)
DNAActividadenzimática
β-glucocerebrosidasaAnálisis gen
GBA
Importancia de que las gotas de sangre sean homogéneas
1 gota 2 gotas 3 gotas
GΒΑ actividad X 2X 3X
Debe depositarse idéntica cantidad que en controles
Diagnóstico genético
Herencia: Autosómica recesiva
Defecto genético: Mutaciones en el gen de GBA (>300)(1)
Gen de GBACromosoma 1
Región q21
Enfermedad de GaucherSujeto sano
Sujeto portador
Sujeto enfermo
Región q217 Kb
11 exones
GBA I II III V VI VII VIII IX X XIIV
Ψ-GBA
Del 55 pb
I II III V VI VII VIII IX X XI
Alu(313 pb)
Alu(626pb)
Alu(320 b)
Alu(277pb)
IV
(1) www.tau.ac.il/~racheli/genedis/gaucher /gaucher.htmlAlfonso P. Tesis Doctoral
MissenseV15MG113ER120WM123T
Mutaciones en GBAencontradas en España
N396TV398I
D409HL444PR463C
H311RW312RY313HG325WL336P
SplicingIVS4-2a>gIVS5+1g>t
Deletionslarge deletionc.42-65del24
c.225-227delTACc.708delCc.953delT
M123TR131CT134PP182LN188S
G195WR257QP266LE326KG202R
N = 66
R463CR463HR496H
Stop mut .W(-4)XR47XR163XR257XR359X
L336PR359QS364NS364RN370SG377SD380NP391LV391IR395C
Other mutationsc.(-203)A>G
RecombinationsRec all gene
Great rec ex5-...10RecTL
RecNciI
c.953delTc.1214-1215delGCc.1263-1317del55c.1439-1445del7
c.1451-1452delACc.1510-1512delTCT
Insertionsc. 84insGc.500insT
Giraldo P et al Orphanet J Rare Dis. 2012 Mar 19;7
PacienteDNA
AnálisisGenético
Familiares
FEETEG
Solicitante
Diagrama de flujo para el diagnóstico genético
N370SL444PG377SD409Hdel55bp
AnálisisGenético
FEETEGRegistro
SiPCR larga 7,3 KbPCR anidadaSecuenciación Re-secuenciaciónNo
Biomarcadores para EG
• Fosfatasa ácida• Lisozima� ββββ-hexosaminidasa (A/B)• NeopterinaNeopterina• Adenosin desaminasa (ADA)• Enzima convertidora de angiotensina (ECA)• Quitotriosidasa• CCL18-PARK9
QUITOTRIOSIDASA
- Presente en plasma humano:
Determinación de actividad
Función: DesconocidaAntifúngico: Candida, Aspergillus ?Nematodos filiformes: Filarias
Sustrato artificial: 4-metilumbelliferil −β−β−β−β-D-N, N´, N”-
Determinación de actividad
Hollak C et al. J Clin Invest. 1994; 93: 1288–1292.
Actividad quitotriosidasa(nmol/mL.h)
Pacientes Gaucher Portadores No-portadores Niños
n=109 n=121 n=89 n=37n=109 n=121 n=89 n=3713.991 ± 12.647 71 ±55 45 ±39 37 ±25
300 veces
Giraldo P, et al. Haematologica 2001;86:977
¿Para qué sirve la quitotriosidasa ?
40.000Paciente # 5001
QT.nmol/ml.hr
10.000
Inicial 12 24 36 48
20.000
meses
Inicial 12 24 36 48 60
6.000
2.000Paciente # 716
72
Actividad quitotriosidasa en pacientes con EG vs genotipo
Gen quito. N actividad quito. (nmol/mL.h)
Nor / Nor 74 17.387 ± 12.800Nor / Nor 74 17.387 ± 12.800
Dup / Nor 41 11.870 ± 10.430*
Dup / Dup 3 0
*p < 0.01
INCONVENIENTE
Genotipo del gen QUITOTRIOSIDASA
E2E1 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E11 E12E10
375 pb399 pb
ChsPCR
+/+ +/- -/-
24 pb
Chas
24 pb
Chs
Chas
24 pb
Alelo mayor
Alelo menor ( nulo )
Biomarcador CCL18/PARC
948 ng/mL (rango 237-2285 ng/mL)
33 ng/mL (rango 10-72 ng/mL)
Boot RG et al. Blood 2004; 103:33-39
X 29
paciente 1
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1000,00
0 6 15 24 36
meses de tratamiento
CC
L18
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Act
ivid
ad d
e Q
T
CCL18
QT
paciente 3
800,00
1000,00
10000
12000
Act
ivid
ad d
e Q
T
Relación entre el descenso de los nivelesplasmáticos de CCL18 y actividad de QT
según nuestra experiencia
paciente 2
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1000,00
3 13 29 42 52 65 77
meses de tratamiento
CC
L18
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Act
ivid
ad d
e Q
T
CCL18
QT
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
0 39 51 60 72 83 99 105
meses de tratamiento
CC
L18
0
2000
4000
6000
8000
10000
Act
ivid
ad d
e Q
T
CCL18
QT
Resumen• Análisis enzimático de Glucocerebrosidasa
– Diagnóstico• Análisis genético Glucocerebrosidasa
– Estudio familiares (portadores / no portadores)– Consejo genético– Consejo genético– Pronóstico
• Biomarcadores: quitotriosidasa y/o CCL18/PARC– Valoración– Respuesta a tratamientos– Seguimiento
Posible caso(Sospecha)(Sospecha)(Hospital)
Lab (FEETEG)
Courier
Separaciónespecimenes
leucocitosDNA
FEETEGDiagnostico
**
leucocitosPlasma
ββββ-GlucocerOtras lisoso.
Biomarcadores:Activ Quitotrios,CCL18 y MIP1ββββ
Diagnostico genético:Glucocerebrosidasa mutaciones +Quitotriosidasa genotipoSMPD1, AGAL NPC1, NPC2 mutaciones
+
REGISTRO FEETEG
SOLICITANTE
*
Seguimiento depacientes
Muestra(sangre o plasma
(Hospital)
Courier
Laboratorio *(FEETEG)
Separaciónalicuotado*
Análisis
Plasma
Biomarcadores:quitotriosidasa
actividad yCCL18
REGISTRO FEETEG
SOLICITANTE
*
*
Tratamientos
Palmitoil-CoA + serina
UDP-glucosa
GangliósidosCeramida:glucosil-
transferasa
Formación y degradación de la glucosilceramida
Ceramida Glucosilceramida
(glucocerebrósido) Globósidos
Lactósidos
Ceramida + Glucosa
ββββ-Glucocerebrosidasa
Formación = Degradación
Síntesis + catabolismo Globosidos, Gangliósidos..
Formación
Condiciones normales: Equilibrio
No hay depósito de glucosilceramida
Degradación
GlucocerebrosidasaGLUCOSILCERAMIDA
(SUBSTRATO)
Enfermedad de Gaucher:Desequilibrio entre entrada y salida
Formación > Degradación(normal) (disminuida)
Síntesis + catabolismo Globosidos, Gangliósidos..
Formación
Degradación
GlucocerebrosidasaGLUCOSILCERAMIDA
(SUBSTRATO)
Se deposita glucosilceramida
OPCIONES TERAPÉUTICASTERAPÉUTICAS
Opciones terapéuticas : TES
Síntesis + catabolismo Globos., Gangli..
FormaciónImiglucerasa
Degradación
ImiglucerasaVelaglucerasaTaliglucerasa
TES
GlucocerebrosidasaGlucocerebrosidasa
GLUCOSILCERAMIDA(SUSTRATO)
1978Descubrimiento de los receptores de manosa 6-
fosfatoCélula
Lisosoma
ReceptorManosa-6-P
Enzima P
P
P
P
P
Lisosoma
Lisosoma
LisosomaEnzima
P
P
PP
P
P
1990
Barton, Brady, Grabonski inician los primeros
tratamientos con enzima betaglucosidasa obtenida de placenta
Alglucerasa. Ceredasa. Genzyme Corp
1996Se comercializa la primera
enzima recombinante en CHO
QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit
Strategene
Imiglucerase. Cerezyme. Genzyme-Sanofi
Glicoformas (decoración) típica que se producen en mamíferos
Asn Asn Asn Asn
Mannosidase I
Asn
ER
Asn
Golgi
Glucose
AsnAsn
N-acetylglucosamine Mannose Galactose Sialic acid Fucose
Asn
Enzymatic
degradation
Como se Como se consigueconsigue queque la la ImiglucerasaImiglucerasatengatenga la la glicosilaciónglicosilación adecuadaadecuada
((decoracióndecoración ))• Se permite que la síntesis en células CHO se comple te • Se realiza una digestión con neuraminidasa, beta-ga lactosidasa
y beta-N-acetilglucosaminidasa para eliminar los azu cares terminales.
• De esta forma se dejan expuestos - 3 restos de manosa .manosa .
Asn Asn Asn Asn
Mannosidase I
Asn
ER
Asn
Golgi
Glucose
AsnAsn
N-acetylglucosamine Mannose Galactose Sialic acid Fucose
Asn
Enzymatic
degradation
Exposed Mannose
Velaglucerasa VPRIV (Shire ). Recombinante expresada en células humanas
(comercializada marzo 2011)
Fibroblastos humanos
QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit
Strategene
La La glicosilaciónglicosilación ((decoracióndecoración ) ) adecuadaadecuadade la de la VelaglucerasaVelaglucerasa se se consigueconsigue con con
KifunensineKifunensine
• Se impide que la cadena de oligosacarido se modifiqueen el Golgi
•• ImpideImpide queque quedenqueden enmascaradasenmascaradas laslas manosasmanosas
Asn Asn Asn Asn
Mannosidase I
Asn
ER
Asn
Golgi
Glucose
AsnAsn
N-acetylglucosamine Mannose Galactose Sialic acid Fucose
Asn
Enzymatic
degradation
Exposed Mannose
Taliglucerase . Uplyso (Protalix )/(Pfizer). Producida en células de zanahoria
(Aprobada por FDA pero no por EMA)
Sintesis de laTaliglucerase
Endoquitinasabasicabasica
Arabidopsisthaliana
Quitinasa ATabaco
E F D L L V D T M
RE
Vacuola
Asn
nucleous
Distribución de N-Gliproteinasencélulas vegetales
RE
Golgi
Asn
Asn
Extracellularspace
Señales deReconocimiento
Glicosilación “Decoración” de lasEnzimas recombinantes
P
P
P
P
P
Enzima
N-acetil-glucosamina
Manosa
P
P
P
P
P
Tekoah Y et al Biosci Rep. 2013 Aug 28. [Epub ahead of print]
Captación de las enzimas recombiantes
Taliglucerasa
Imiglucerasa
Velaglucerasa
Tekoah Y et al Biosci Rep. 2013 Aug 28. [Epub ahead of print]
Opciones terapéuticas en la EG: Terapia Reducción Sustrato (TRS)
Síntesis + catabolismo Globos, Gangli..
Formación
NB-DNJ, miglustat(Zavesca ®)TRS
Ceramida:glucosiltransferasa
Degradación
Glucocerebrosidasa
GLUCOSILCERAMIDA(SUSTRATO)
Palmitoil-CoA + serina
UDP-glucosa
GangliósidosCeramida:glucosil-
transferasa
Ceramida Glucosilceramida
(glucocerebrósido) Globósidos
Lactósidos
Ceramida + Glucosa
ββββ-Glucocerebrosidasa
Miglustat(Iminoazucar)
ObtenidoObtenidode la corteza de la raízde la moreraMorus alba
Bacteria streptomyces
TRS
�N-butil-deoxynojirimicin MiglustatZavesca ®Actelion
�Genz-112638. Eliglustat (Pendiente aprobación) Genzyme -Sanofi
Similitud estructural Iminoazucares : Miglustat vs glucosilceramida
OH
OH
OHHO
OH
OHHO
Glucose Ceramida
Glucosylceramide
O
HN
OH
C13H27
O
C17H35
O
OH
Miglustat
NOH
CH3
Similitud estructural:Eliglustat vs Glucosilceramida
OH
OH
OHHO
Glucosa Ceramida
ß-Glu-Cer Glucosilceramida
O
HN
OH
C13H27
O
C17H35
O
OH
Eliglustat(pendiente aprobación)
1-(4´-Hydroxy)phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol
Otras opciones terapéuticas: ChaperonasChaperonas
5´3333´ mRNA
Lumen REProteina
ProteinaNormal
Chaperonasmoleculares
¿Qué misión tienen las chaperonas?
Proteinamutada
Chaperonessintéticas
Golgi Golgi
LisosomasPH = 5
Degradación
Como funcionan las chaperonas en las Enfermedades de Depósito Lisosomal
Chaperona
farmacológica
Proteína mal plegadaProteina-Chaperona Complejo
farmacológica
Reduce el estresCelular e inflamación
Reduce el sustratoacumulado
Sustrato acumulado
Reticuloendoplásmico
Aparato de
Golgi
Lisosoma
Facilita el tráfico
Opciones terapéuticas en EGRecuperar actividad de enzima mutada
del propio paciente
Síntesis + catabolismo Globos., Gangli..
FormaciónChaperonas
Degradación
FarmacológicasChaperonas
GlucocerebrosidasaGlucocerebrosidasa
GLUCOSILCERAMIDA(SUSTRATO)
Tratamientos aprobados o en desarrollo . • TES1,2
– Imiglucerasa (Cerezyme®)– Velaglucerasa (VPRIV™)– Taliglucerasa (FDA si, EMA no)
• TRS2-4
– Miglustat (Zavesca®)– Eliglustat/Genz-112638
(pendiente)
• Trasplante de médula ósea(TMO)7
– Solo Neuronopáticos– TMO en algunos casos ha
solucionado sintomas– No aconsejable en mayoría
casos
• Terapia génica 8(pendiente)
• Chaperonas o enzyme enhancement therapy 5,6
– Afegostat tartrate/AT2101 (Plicera™; desarrollointerrumpido)
1. The Pharma Letter Web site. Available at: http://www.thepharmaletter.com/file/96654/protalix-gets-temporary-approval-for-gaucher-drug-taliglucerase-in-france.html. 2. Sidransky E. Gaucher disease. Medscape Web site. Available at: http://emedicine.medscape.com/article/944157-print. 3. The Medical News Web site. Available at: http://www.news-medical.net/news/20100212/Genzyme-announces-2-year-data-from-eliglustat-tartrate-Phase-2-trial-for-Gaucher-disease.aspx. 4. Actelion Web site. http://www1.actelion.com/en/scientists/development-pipeline/phase-4/miglustat-zavesca.page. 5. Cigna Web site. Available at: http://www.cigna.com/customer_care/healthcare_professional/coverage_positions/pharmacy/ph_1011_coveragepositioncriteria _zavesca.pdf. 6. Reuters Web site. Available at: http://www.reuters.com/article/idUKN0250346520091002. 7. Pastores GM et al. In: Pagon RA et al. GeneReviews [Internet]. 1993-2000. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene&part=gaucher. 8. Grabowski GA. Lancet. 2008;372:1263-1271.
•– Investigación