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  • Enfermedad de Gaucher: Diagnóstico y avances en el tratamiento

    Dr. Miguel Pocoví Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular Universidad de Zaragoza

    Barcelona 22 Septiembre 2013

    Phillip-Charles-Ernest Gaucher

  • Enfermedad de Gaucher– una EDL

    • La enfermedad lisosomal mas frecuente. • Autosómica recesiva. • 1:15 judíos Ashkenazi son portadores y

    1: 850 la padecen.1: 850 la padecen.

    • Otras poblaciones 1:40.000 -1:100.000. • Dispone de varios tipos de tratamiento. • Deficiencia de Glucocerobrosidasa lisosomal.

  • Macrófagos tisulares

    Infiltraciones Fibrosis intersticial

    Ocupación de los alveolos

    Manifestaciones clínicas

    Células Kupffer

    Matraz de Erlenmeyer Osteonecrosis

    Osteoesclerosis

    Osteoclastos

    Médula ósea

    Anemia, trombocitopenia

    Células de Gaucher

    Otros órganos Corazón

    Nódulos linfáticos

    Sistema nervioso central

    Riñones

    Manifestaciones oculares

    Manifestaciones cutáneas

  • Fenotipo Continuo

    Tipo 1

    Tipo 2

    Tipo 3

    Hidrops fetalis

    Epilepsia Mioclonia

    Afectación Bulbar

    Movimientos sacádicos

    Asintomaticos Hepatoespleno- megalia

    Sidransky et al 2004

  • DiagnósticoDiagnóstico

  • ¿Qué pretendemos con el diagnóstico?

    • Hacer un diagnóstico precoz, antes que aparezca patología irreversible en:

    • Recién nacidos • Niños• Niños • Adolescentes • Familiares • Población seleccionada, por ejemplo….

  • Estrategias de búsqueda de pacientes con EG

    • Trombocitopenia de origen no filiado o atribuida a hiperesplenismo, sin marcadores de hepatopatía crónica de origen cirrótico o trombocitopenia de origen inmune

    • Esplenomegalia de origen no filiado asociada o no a cirrosis hepática. Pacientes esplenectomizados sin diagnóstico hepática. Pacientes esplenectomizados sin diagnóstico concreto

    • Fractura espontánea de cadera no justificada. Osteomielitis “aséptica”

    • Fosfatasa ácida + esplenomegalia u otros?

  • Mistry PK et al. Am J Hematol 2011

  • Mistry PK et al. Am J Hematol 2011

  • Aspirado de médula ósea: Células

    Células de Gaucher

    No aconsejable si es primera opción: Existen metodos menos invasivos para diagnostico. Presencia de celulas pseudo-Gaucher: mieloma múltiple, SMD, LMC….

  • Glucosilceramida Ceramida + Glucosa glucocerebrosidasa

    Como se diagnostica la EG? (I)

    Leucocitos/fibroblastos

  • pH 5

    Como se diagnostica la EG? (II)

    Taurocholato

    37ºC, 2h

    4-metilumbeliferil-β-D-glucopiranósido(Sigma) β-D-glucopiranosa 4-metilumbeliferona

    4MUλexcitación = 366 nm λemisión = 446 nm

  • Actividad enzimática (nmol/mgp.h)

    16

    18

    20

    22

    24

    26

    28

    30

    ¿Qué nos aporta el análisis enzimático?

    0

    2

    4

    6

    8

    10

    12

    14

    16

    Pacientes Portadores Sanos

    En leucocitos o fibroblastos

    :Costoso Necesidad de controles. Valores estándares Solapamiento

  • Casos especiales : Gota de sangre sobre papel de filtro (FTA)

    DNAActividad enzimática

    β-glucocerebrosidasa Análisis gen

    GBA

  • Importancia de que las gotas de sangre sean homogéneas

    1 gota 2 gotas 3 gotas

    GΒΑ actividad X 2X 3X

    Debe depositarse idéntica cantidad que en controles

  • Diagnóstico genético

  • Herencia: Autosómica recesiva

    Defecto genético: Mutaciones en el gen de GBA (>300)(1)

    Gen de GBA Cromosoma 1

    Región q21

    Enfermedad de Gaucher Sujeto sano

    Sujeto portador

    Sujeto enfermo

    Región q21 7 Kb

    11 exones

    GBA I II III V VI VII VIII IX X XIIV

    Ψ-GBA

    Del 55 pb

    I II III V VI VII VIII IX X XI

    Alu (313 pb)

    Alu (626pb)

    Alu (320 b)

    Alu (277pb)

    IV

    (1) www.tau.ac.il/~racheli/genedis/gaucher /gaucher.html Alfonso P. Tesis Doctoral

  • Missense V15M G113E R120W M123T

    Mutaciones en GBA encontradas en España

    N396T V398I

    D409H L444P R463C

    H311R W312R Y313H G325W L336P

    Splicing IVS4-2a>g IVS5+1g>t

    Deletions large deletion c.42-65del24

    c.225-227delTAC c.708delC c.953delT

    M123T R131C T134P P182L N188S

    G195W R257Q P266L E326K G202R

    N = 66

    R463C R463H R496H

    Stop mut . W(-4)X R47X R163X R257X R359X

    L336P R359Q S364N S364R N370S G377S D380N P391L V391I R395C

    Other mutations c.(-203)A>G

    Recombinations Rec all gene

    Great rec ex5-...10 RecTL

    RecNciI

    c.953delT c.1214-1215delGC c.1263-1317del55 c.1439-1445del7

    c.1451-1452delAC c.1510-1512delTCT

    Insertions c. 84insG c.500insT

    Giraldo P et al Orphanet J Rare Dis. 2012 Mar 19;7

  • Paciente DNA

    Análisis Genético

    Familiares

    FEETEG

    Solicitante

    Diagrama de flujo para el diagnóstico genético

    N370S L444P G377S D409H del55bp

    Análisis Genético

    FEETEG Registro

    Si PCR larga 7,3 Kb PCR anidada Secuenciación Re-secuenciaciónNo

  • Biomarcadores para EG

    • Fosfatasa ácida • Lisozima � ββββ-hexosaminidasa (A/B) • NeopterinaNeopterina • Adenosin desaminasa (ADA) • Enzima convertidora de angiotensina (ECA) • Quitotriosidasa • CCL18-PARK9

  • QUITOTRIOSIDASA

    - Presente en plasma humano:

    Determinación de actividad

    Función: Desconocida Antifúngico: Candida, Aspergillus ? Nematodos filiformes: Filarias

    Sustrato artificial: 4-metilumbelliferil −β−β−β−β-D-N, N´, N”-

    Determinación de actividad

    Hollak C et al. J Clin Invest. 1994; 93: 1288–1292.

  • Actividad quitotriosidasa (nmol/mL.h)

    Pacientes Gaucher Portadores No-portadores Niños

    n=109 n=121 n=89 n=37n=109 n=121 n=89 n=37 13.991 ± 12.647 71 ±55 45 ±39 37 ±25

    300 veces

    Giraldo P, et al. Haematologica 2001;86:977

  • ¿Para qué sirve la quitotriosidasa ?

    40.000 Paciente # 5001

    QT. nmol/ml.hr

    10.000

    Inicial 12 24 36 48

    20.000

    meses

    Inicial 12 24 36 48 60

    6.000

    2.000 Paciente # 716

    72

  • Actividad quitotriosidasa en pacientes con EG vs genotipo

    Gen quito. N actividad quito. (nmol/mL.h)

    Nor / Nor 74 17.387 ± 12.800Nor / Nor 74 17.387 ± 12.800

    Dup / Nor 41 11.870 ± 10.430*

    Dup / Dup 3 0

    *p < 0.01

    INCONVENIENTE

  • Genotipo del gen QUITOTRIOSIDASA

    E2E1 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E11 E12E10

    375 pb 399 pb

    Chs PCR

    +/+ +/- -/-

    24 pb

    Chas

    24 pb

    Chs

    Chas

    24 pb

    Alelo mayor

    Alelo menor ( nulo )

  • Biomarcador CCL18/PARC

    948 ng/mL (rango 237-2285 ng/mL)

    33 ng/mL (rango 10-72 ng/mL)

    Boot RG et al. Blood 2004; 103:33-39

    X 29

  • paciente 1

    0,00

    200,00

    400,00

    600,00

    800,00

    1000,00

    0 6 15 24 36

    meses de tratamiento

    C C

    L1 8

    0

    2000

    4000

    6000

    8000

    10000

    12000

    A ct

    iv id

    ad d

    e Q

    T

    CCL18

    QT

    paciente 3

    800,00

    1000,00

    10000

    12000

    A ct

    iv id

    ad d

    e Q

    T

    Relación entre el descenso de los niveles plasmáticos de CCL18 y actividad de QT

    según nuestra experiencia

    paciente 2

    0,00

    200,00

    400,00

    600,00

    800,00

    1000,00

    3 13 29 42 52 65 77

    meses de tratamiento

    C C

    L1 8

    0

    2000

    4000

    6000

    8000

    10000

    12000

    A ct

    iv id

    ad d

    e Q

    T

    CCL18

    QT

    0,00

    200,00

    400,00

    600,00

    800,00

    0 39 51 60 72 83 99 105

    meses de tratamiento

    C C

    L1 8

    0

    2000

    4000

    6000

    8000

    10000

    A ct

    iv id

    ad d

    e Q

    T

    CCL18

    QT

  • Resumen • Análisis enzimático de Glucocerebrosidasa

    – Diagnóstico • Análisis genético Glucocerebrosidasa

    – Estudio familiares (portadores / no portadores) – Consejo genético– Consejo genético – Pronóstico

    • Biomarcadores: quitotriosidasa y/o CCL18/PARC – Valoración – Respuesta a tratamientos – Seguimiento

  • Posible caso (Sospecha)(Sospecha) (Hospital)

    Lab (FEETEG)

    Courier

    Separación especimenes

    leucocitos DNA

    FEETEG Diagnostico

    * *

    leucocitos Plasma

    ββββ-Glucocer Otras lisoso.

    Biomarcadores: Activ Quitotrios, CCL18 y MIP1ββββ

    Diagnostico g