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  • Enfermedad de Gaucher: Diagnóstico y

    avances en el tratamiento

    Dr. Miguel Pocoví Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular

    Universidad de Zaragoza

    Barcelona 22 Septiembre 2013

    Phillip-Charles-Ernest Gaucher

  • Enfermedad de Gaucher– una EDL

    • La enfermedad lisosomal mas frecuente.

    • Autosómica recesiva.

    • 1:15 judíos Ashkenazi son portadores y

    1: 850 la padecen.

    • Otras poblaciones 1:40.000 -1:100.000.

    • Dispone de varios tipos de tratamiento.

    • Deficiencia de Glucocerobrosidasa lisosomal.

  • Macrófagos tisulares

    Células Kupffer

    Matraz de Erlenmeyer

    Osteonecrosis

    Osteoesclerosis

    Osteoclastos

    Médula ósea

    Anemia, trombocitopenia

    Células de Gaucher

    Infiltraciones

    Fibrosis intersticial

    Ocupación de los alveolos

    Otros órganos

    Corazón

    Nódulos linfáticos

    Sistema nervioso central

    Riñones

    Manifestaciones oculares

    Manifestaciones cutáneas

    Manifestaciones clínicas

  • Fenotipo Continuo

    Hidrops

    fetalis

    Epilepsia

    Mioclonia

    Afectación

    Bulbar

    Movimientos

    sacádicos

    Asintomaticos Hepatoespleno-

    megalia

    Sidransky et al 2004

    Tipo 1

    Tipo 2

    Tipo 3

  • Diagnóstico

  • ¿Qué pretendemos con el

    diagnóstico?

    • Hacer un diagnóstico precoz, antes que

    aparezca patología irreversible en:

    • Recién nacidos

    • Niños

    • Adolescentes

    • Familiares

    • Población seleccionada, por ejemplo….

  • Estrategias de búsqueda de

    pacientes con EG

    • Trombocitopenia de origen no filiado o atribuida a

    hiperesplenismo, sin marcadores de hepatopatía crónica de

    origen cirrótico o trombocitopenia de origen inmune

    • Esplenomegalia de origen no filiado asociada o no a cirrosis

    hepática. Pacientes esplenectomizados sin diagnóstico

    concreto

    • Fractura espontánea de cadera no justificada. Osteomielitis

    “aséptica”

    • Fosfatasa ácida + esplenomegalia u otros?

  • Mistry PK et al. Am J Hematol 2011

  • Mistry PK et al. Am J Hematol 2011

  • Células de Gaucher

    Aspirado de médula ósea:

    Células

    No aconsejable si es primera opción:

    Existen metodos menos invasivos para diagnostico.

    Presencia de celulas pseudo-Gaucher: mieloma múltiple, SMD, LMC….

  • Glucosilceramida Ceramida + Glucosa

    glucocerebrosidasa

    Leucocitos/fibroblastos

    Como se diagnostica la EG? (I)

  • pH 5

    Taurocholato

    37ºC, 2h

    4-metilumbeliferil-β-D-glucopiranósido(Sigma) β-D-glucopiranosa 4-metilumbeliferona

    Como se diagnostica la EG? (II)

    4MUλexcitación= 366 nm λemisión = 446 nm

  • Actividad enzimática (nmol/mgp.h)

    0

    2

    4

    6

    8

    10

    12

    14

    16

    18

    20

    22

    24

    26

    28

    30

    Pacientes Portadores Sanos

    En leucocitos o

    fibroblastos

    :Costoso Necesidad de controles. Valores

    estándares

    Solapamiento

    ¿Qué nos aporta el análisis enzimático?

  • DNAActividad

    enzimática

    -glucocerebrosidasa

    Casos especiales: Gota de sangre sobre

    papel de filtro (FTA)

    Análisis gen

    GBA

  • Importancia de que las gotas de

    sangre sean homogéneas

    G actividad X 2X 3X

    1 gota 2 gotas 3 gotas

    Debe depositarse idéntica cantidad que en controles

  • Diagnóstico genético

  • Herencia: Autosómica recesiva

    Defecto genético: Mutaciones en el gen de GBA (>300)(1)

    Gen de GBA Cromosoma 1

    Región q21

    7 Kb

    11 exones

    GBA I II III V VI VII VIII IX X XIIV

    Ψ-GBA

    Del 55 pb

    I II III V VI VII VIII IX X XI

    Alu (313 pb)

    Alu (626pb)

    Alu (320 b)

    Alu (277pb)

    IV

    Enfermedad de Gaucher

    (1) www.tau.ac.il/~racheli/genedis/gaucher /gaucher.html

    Sujeto sano

    Sujeto portador

    Sujeto enfermo

    Alfonso P. Tesis Doctoral

  • Missense

    V15M

    G113E

    R120W

    M123T

    R131C

    T134P

    P182L

    N188S

    G195W

    R257Q

    P266L

    E326K

    G202R

    N = 66

    Mutaciones en GBA

    encontradas en España

    N396T

    V398I

    D409H

    L444P

    R463C

    R463H

    R496H

    Stop mut.

    W(-4)X

    R47X

    R163X

    R257X

    R359X

    H311R

    W312R

    Y313H

    G325W

    L336P

    R359Q

    S364N

    S364R

    N370S

    G377S

    D380N

    P391L

    V391I

    R395C

    Splicing

    IVS4-2a>g

    IVS5+1g>t

    Other mutations

    c.(-203)A>G

    Recombinations

    Rec all gene

    Great rec ex5-...10

    RecTL

    RecNciI

    Deletions

    large deletion

    c.42-65del24

    c.225-227delTAC

    c.708delC

    c.953delT

    c.1214-1215delGC

    c.1263-1317del55

    c.1439-1445del7

    c.1451-1452delAC

    c.1510-1512delTCT

    Insertions

    c. 84insG

    c.500insT

    Giraldo P et al Orphanet J Rare Dis. 2012 Mar 19;7

  • Paciente DNA

    N370S L444P G377S D409H del55bp

    Análisis Genético

    Familiares

    FEETEG Registro

    Solicitante

    Si PCR larga 7,3 Kb

    PCR anidada

    Secuenciación

    Re-secuenciaciónNo

    Diagrama de flujo para el

    diagnóstico genético

  • Biomarcadores para EG

    • Fosfatasa ácida

    • Lisozima

     -hexosaminidasa (A/B)

    • Neopterina

    • Adenosin desaminasa (ADA)

    • Enzima convertidora de angiotensina (ECA)

    • Quitotriosidasa

    • CCL18-PARK9

  • QUITOTRIOSIDASA

    Sustrato artificial: 4-metilumbelliferil -D-N, N´, N”-

    - Presente en plasma humano:

    Determinación de actividad

    Función: Desconocida Antifúngico: Candida, Aspergillus ? Nematodos filiformes: Filarias

    Hollak C et al. J Clin Invest. 1994; 93: 1288–1292.

  • Actividad quitotriosidasa

    (nmol/mL.h)

    Pacientes Gaucher Portadores No-portadores Niños

    n=109 n=121 n=89 n=37

    13.991 ± 12.647 71 ±55 45 ±39 37 ±25

    300 veces

    Giraldo P, et al. Haematologica 2001;86:977

  • ¿Para qué sirve la

    quitotriosidasa?

    Inicial 12 24 36 48

    40.000 Paciente # 5001

    20.000

    QT. nmol/ml.hr

    meses

    Inicial 12 24 36 48 60

    10.000

    6.000

    2.000 Paciente # 716

    72

  • Actividad quitotriosidasa en

    pacientes con EG vs genotipo

    Gen quito. N actividad quito. (nmol/mL.h)

    Nor / Nor 74 17.387 ± 12.800

    Dup / Nor 41 11.870 ± 10.430*

    Dup / Dup 3 0

    *p < 0.01

    INCONVENIENTE

  • Genotipo del gen QUITOTRIOSIDASA

    75 pb 99 pb

    Chs PCR

    E2E1 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E11 E12E10

    +/+ +/- -/-

    24 pb

    Chas

    24 pb

    Chs

    Chas

    24 pb

    Alelo mayor

    Alelo menor ( nulo )

  • Biomarcador CCL18/PARC

    33 ng/mL

    (rango 10-72 ng/mL)

    948 ng/mL

    (rango 237-2285 ng/mL)

    Boot RG et al. Blood 2004; 103:33-39

    X 29

  • paciente 1

    0,00

    200,00

    400,00

    600,00

    800,00

    1000,00

    0 6 15 24 36

    meses de tratamiento

    C C

    L 1 8

    0

    2000

    4000

    6000

    8000

    10000

    12000

    A c ti

    v id

    a d

    d e Q

    T

    CCL18

    QT

    paciente 2

    0,00

    200,00

    400,00

    600,00

    800,00

    1000,00

    3 13 29 42 52 65 77

    meses de tratamiento

    C C

    L 1 8

    0

    2000

    4000

    6000

    8000

    10000

    12000

    A c ti

    v id

    a d

    d e Q

    T

    CCL18

    QT

    paciente 3

    0,00

    200,00

    400,00

    600,00

    800,00

    1000,00

    0 39 51 60 72 83 99 105

    meses de tratamiento C

    C L

    1 8

    0

    2000

    4000

    6000

    8000

    10000

    12000

    A c ti

    v id

    a d

    d e Q

    T

    CCL18

    QT

    Relación entre el descenso de los niveles

    plasmáticos de CCL18 y actividad de QT

    según nuestra experiencia

  • Resumen

    • Análisis enzimático de Glucocerebrosidasa

    – Diagnóstico

    • Análisis genético Glucocerebrosidasa

    – Estudio familiares (portadores / no portadores)

    – Consejo genético

    – Pronóstico

    • Biomarcadores: quitot