enfermedad de gaucher: diagnأ³stico y avances en el tratamiento • de esta forma se dejan...

Enfermedad de Gaucher: Diagnóstico y

avances en el tratamiento

Dr. Miguel Pocoví Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular

Universidad de Zaragoza

Barcelona 22 Septiembre 2013

Phillip-Charles-Ernest Gaucher

Enfermedad de Gaucher– una EDL

• La enfermedad lisosomal mas frecuente.

• Autosómica recesiva.

• 1:15 judíos Ashkenazi son portadores y

1: 850 la padecen.

• Otras poblaciones 1:40.000 -1:100.000.

• Dispone de varios tipos de tratamiento.

• Deficiencia de Glucocerobrosidasa lisosomal.

Macrófagos tisulares

Células Kupffer

Matraz de Erlenmeyer

Osteonecrosis

Osteoesclerosis

Osteoclastos

Médula ósea

Anemia, trombocitopenia

Células de Gaucher

Infiltraciones

Fibrosis intersticial

Ocupación de los alveolos

Otros órganos

Corazón

Nódulos linfáticos

Sistema nervioso central

Riñones

Manifestaciones oculares

Manifestaciones cutáneas

Manifestaciones clínicas

Fenotipo Continuo

Hidrops

fetalis

Epilepsia

Mioclonia

Afectación

Bulbar

Movimientos

sacádicos

Asintomaticos Hepatoespleno-

megalia

Sidransky et al 2004

Tipo 1

Tipo 2

Tipo 3

Diagnóstico

¿Qué pretendemos con el

diagnóstico?

• Hacer un diagnóstico precoz, antes que

aparezca patología irreversible en:

• Recién nacidos

• Niños

• Adolescentes

• Familiares

• Población seleccionada, por ejemplo….

Estrategias de búsqueda de

pacientes con EG

• Trombocitopenia de origen no filiado o atribuida a

hiperesplenismo, sin marcadores de hepatopatía crónica de

origen cirrótico o trombocitopenia de origen inmune

• Esplenomegalia de origen no filiado asociada o no a cirrosis

hepática. Pacientes esplenectomizados sin diagnóstico

concreto

• Fractura espontánea de cadera no justificada. Osteomielitis

“aséptica”

• Fosfatasa ácida + esplenomegalia u otros?

Mistry PK et al. Am J Hematol 2011

Mistry PK et al. Am J Hematol 2011

Células de Gaucher

Aspirado de médula ósea:

Células

No aconsejable si es primera opción:

Existen metodos menos invasivos para diagnostico.

Presencia de celulas pseudo-Gaucher: mieloma múltiple, SMD, LMC….

Glucosilceramida Ceramida + Glucosa

glucocerebrosidasa

Leucocitos/fibroblastos

Como se diagnostica la EG? (I)

pH 5

Taurocholato

37ºC, 2h

4-metilumbeliferil-β-D-glucopiranósido(Sigma) β-D-glucopiranosa 4-metilumbeliferona

Como se diagnostica la EG? (II)

4MUλexcitación= 366 nm λemisión = 446 nm

Actividad enzimática (nmol/mgp.h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

Pacientes Portadores Sanos

En leucocitos o

fibroblastos

:Costoso Necesidad de controles. Valores

estándares

Solapamiento

¿Qué nos aporta el análisis enzimático?

DNAActividad

enzimática

-glucocerebrosidasa

Casos especiales: Gota de sangre sobre

papel de filtro (FTA)

Análisis gen

GBA

Importancia de que las gotas de

sangre sean homogéneas

G actividad X 2X 3X

1 gota 2 gotas 3 gotas

Debe depositarse idéntica cantidad que en controles

Diagnóstico genético

Herencia: Autosómica recesiva

Defecto genético: Mutaciones en el gen de GBA (>300)(1)

Gen de GBA Cromosoma 1

Región q21

7 Kb

11 exones

GBA I II III V VI VII VIII IX X XIIV

Ψ-GBA

Del 55 pb

I II III V VI VII VIII IX X XI

Alu (313 pb)

Alu (626pb)

Alu (320 b)

Alu (277pb)

IV

Enfermedad de Gaucher

(1) www.tau.ac.il/~racheli/genedis/gaucher /gaucher.html

Sujeto sano

Sujeto portador

Sujeto enfermo

Alfonso P. Tesis Doctoral

Missense

V15M

G113E

R120W

M123T

R131C

T134P

P182L

N188S

G195W

R257Q

P266L

E326K

G202R

N = 66

Mutaciones en GBA

encontradas en España

N396T

V398I

D409H

L444P

R463C

R463H

R496H

Stop mut.

W(-4)X

R47X

R163X

R257X

R359X

H311R

W312R

Y313H

G325W

L336P

R359Q

S364N

S364R

N370S

G377S

D380N

P391L

V391I

R395C

Splicing

IVS4-2a>g

IVS5+1g>t

Other mutations

c.(-203)A>G

Recombinations

Rec all gene

Great rec ex5-...10

RecTL

RecNciI

Deletions

large deletion

c.42-65del24

c.225-227delTAC

c.708delC

c.953delT

c.1214-1215delGC

c.1263-1317del55

c.1439-1445del7

c.1451-1452delAC

c.1510-1512delTCT

Insertions

c. 84insG

c.500insT

Giraldo P et al Orphanet J Rare Dis. 2012 Mar 19;7

Paciente DNA

N370S L444P G377S D409H del55bp

Análisis Genético

Familiares

FEETEG Registro

Solicitante

Si PCR larga 7,3 Kb

PCR anidada

Secuenciación

Re-secuenciaciónNo

Diagrama de flujo para el

diagnóstico genético

Biomarcadores para EG

• Fosfatasa ácida

• Lisozima

 -hexosaminidasa (A/B)

• Neopterina

• Adenosin desaminasa (ADA)

• Enzima convertidora de angiotensina (ECA)

• Quitotriosidasa

• CCL18-PARK9

QUITOTRIOSIDASA

Sustrato artificial: 4-metilumbelliferil -D-N, N´, N”-

- Presente en plasma humano:

Determinación de actividad

Función: Desconocida Antifúngico: Candida, Aspergillus ? Nematodos filiformes: Filarias

Hollak C et al. J Clin Invest. 1994; 93: 1288–1292.

Actividad quitotriosidasa

(nmol/mL.h)

Pacientes Gaucher Portadores No-portadores Niños

n=109 n=121 n=89 n=37

13.991 ± 12.647 71 ±55 45 ±39 37 ±25

300 veces

Giraldo P, et al. Haematologica 2001;86:977

¿Para qué sirve la

quitotriosidasa?

Inicial 12 24 36 48

40.000 Paciente # 5001

20.000

QT. nmol/ml.hr

meses

Inicial 12 24 36 48 60

10.000

6.000

2.000 Paciente # 716

72

Actividad quitotriosidasa en

pacientes con EG vs genotipo

Gen quito. N actividad quito. (nmol/mL.h)

Nor / Nor 74 17.387 ± 12.800

Dup / Nor 41 11.870 ± 10.430*

Dup / Dup 3 0

*p < 0.01

INCONVENIENTE

Genotipo del gen QUITOTRIOSIDASA

75 pb 99 pb

Chs PCR

E2E1 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E11 E12E10

+/+ +/- -/-

24 pb

Chas

24 pb

Chs

Chas

24 pb

Alelo mayor

Alelo menor ( nulo )

Biomarcador CCL18/PARC

33 ng/mL

(rango 10-72 ng/mL)

948 ng/mL

(rango 237-2285 ng/mL)

Boot RG et al. Blood 2004; 103:33-39

X 29

paciente 1

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

0 6 15 24 36

meses de tratamiento

C C

L 1 8

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

A c ti

v id

a d

d e Q

T

CCL18

QT

paciente 2

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

3 13 29 42 52 65 77

meses de tratamiento

C C

L 1 8

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

A c ti

v id

a d

d e Q

T

CCL18

QT

paciente 3

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

0 39 51 60 72 83 99 105

meses de tratamiento C

C L

1 8

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

A c ti

v id

a d

d e Q

T

CCL18

QT

Relación entre el descenso de los niveles

plasmáticos de CCL18 y actividad de QT

según nuestra experiencia

Resumen

• Análisis enzimático de Glucocerebrosidasa

– Diagnóstico

• Análisis genético Glucocerebrosidasa

– Estudio familiares (portadores / no portadores)

– Consejo genético

– Pronóstico

• Biomarcadores: quitot