endotheliale mechanismen der gefäßdilatation bei der … · regel aus der summe der...

Aus dem Institut für Physiologie der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. Wolfgang Jelkmann

Endotheliale Mechanismen

der Gefäßdilatation

bei der funktionellen Hyperämie

im Skelettmuskel der Maus

Inauguraldissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Universität zu Lübeck

- Aus der Medizinischen Fakultät -

Vorgelegt von

Malte Milkau

aus

Bad Oldesloe

Lübeck 2010

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Cornelis de Wit

2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Uwe Wiegand

3. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Axel Pries

Tag der mündlichen Prüfung: 17.02.2010

Zum Druck genehmigt: Lübeck, den 17.02.1010

INHALTSVERZEICHNIS

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Prinzipien der Durchblutungsregulation 1

1.2 Aufbau und Kontraktionsmechanismen der Blutgefä ße 3

1.3 Endothelabhängige Mechanismen der Vasodilatatio n 6

1.4 EDHF 8

1.5 Koordination des Gefäßverhaltens durch Gap junc tions 11

1.6 Funktionelle Hyperämie in der Skelettmuskulatur 14

1.7 Ziel der vorliegenden Arbeit 16

2. Material und Methoden 18

2.1 Versuchstiere 18

2.1.1 Allgemeines 18

2.1.2 Genotypisierung 19

2.2 Intravitalmikroskopie 22

2.2.1 Anästhesie und Präparation 22

2.2.2 Mikroskopie 26

2.2.3 Nervenstimulation 27

2.2.4 Prinzipieller Versuchsablauf 28

2.2.5 Stimulation mit vasoaktiven Substanzen 29

2.2.6 Untersuchungen zur funktionellen Hyperämie 30

2.2.7 Auswertung und Statistik 30

2.3 Textverarbeitung 32

3. Ergebnisse 33

3.1 Gefäßdilatationen durch vasoaktive Substanzen 33

3.1.1 Dilatationen nach Applikation von ACh und SNP in Wildtyptieren 33

3.1.2 Dilatationen nach Applikation von ACh und SNP in Cx40-defizienten

Tieren

34

3.2 Charakteristika der funktionellen Hyperämie 35

3.2.1 Abhängigkeit von Stimulationsdauer und -frequenz 35

3.2.2 Einfluss von Indomethacin und Nitro-L-Arginin 37

3.3 Rolle von K Ca bei der funktionellen Hyperämie 39

INHALTSVERZEICHNIS

II

3.3.1 Rolle von endothelialen KCa-Kanälen 39

3.3.2 Rolle des IKCa 43

3.3.3 Rolle des SKCa 44

3.4 Rolle von Connexinen bei der funktionellen Hype rämie 47

3.4.1 Rolle von Connexin 40 47

3.4.2 Austausch von Cx40 durch Cx45 50

4. Diskussion 53

4.1 Charakteristika der funktionellen Hyperämie 53

4.2 Bedeutung von K Ca für die funktionelle Hyperämie 55

4.3 Koordination der Gefäßdilatation durch Connexin e 57

4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick 59

5. Zusammenfassung 63

6. Literatur 64

7. Anhang 78

7.1 Verwendete Substanzen 78

7.2 Lösungen und Puffer 80

7.3 Weitere Materialien 81

7.4 PCR 81

7.4.1 Verwendete Primer 81

7.4.2 Reaktionsansätze 82

7.4.3 Temperaturverläufe 82

8. Danksagung 83

9. Lebenslauf 85

10. Publikationen 87

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

III

Abkürzungsverzeichnis

ACh Acetylcholin

Ado Adenosin

ATP Adenosintriphosphat

BKCa KCa mit großer (big) Leitfähigkeit

Bl6 siehe C57Bl/6

bp Basenpaare

C57Bl/6 Mausstamm mit definiertem genetischem Hintergrund

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat

cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat

CNP C-Typ natriuretisches Peptid

CO2 Kohlendioxid

COX Cyclooxygenase

Cx Connexin

Cx40ko genetisch veränderter Mausstamm (siehe auch 2.1.1)

Cx40KI45 genetisch veränderter Mausstamm (siehe auch 2.1.1)

Cyp450 Cytochrom-P450-Epoxygenasen

DA Außendurchmesser

DI Innendurchmesser

dKCa-ko genetisch veränderter Mausstamm (siehe auch 2.1.1)

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Nukleotidlösung

EC Endothelzellen (endothelial cells)

EETs Epoxyeicosatriensäuren

EDHF Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

eNOS endotheliale NO-Synthase

ER endoplasmatisches Retikulum

Fa. Firma

GJ Gap junctions

HZV Herzzeitvolumen

H2O2 Wasserstoffperoxid


IV

I Stromstärke

IKCa KCa mit mittlerer (intermediate) Leitfähigkeit, auch KCa3.1

IKCa-ko genetisch veränderter Mausstamm (siehe auch 2.1.1)

Indo Indomethacin

i.p. intraperitoneal

IP3 Inositoltrisphosphat

i.v. intravenös

KCa Calcium-abhängiger Kaliumkanal

KCa2.3 siehe SKCa

KCa3.1 siehe IKCa

KG Körpergewicht

Kir Einwärts-Gleichrichter-Kaliumkanal (inward rectifier)

l Länge

L-NA Nitro-L-Arginin

LOX Lipoxygenase

M. Musculus

MEGJ myoendotheliale Gap junctions

MLCK Myosin Leichte Ketten (Chain) Kinase

MLCP Myosin Leichte Ketten (Chain) Phosphatase

MW Mittelwert

n Anzahl der Beobachtungen

NO Stickstoffmonoxid

η Viskosität

O2 Sauerstoff

∆P Druckdifferenz

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PLA2 Phospholipase A2

PLC Phospholipase C

PGI2 Prostaglandin I2, Prostazyklin

PGs Prostaglandine

r Radius

R Strömungswiderstand

rcf Relative Zentrifugalkraft

SDS Sodiumdodecylsulfat


V

SEM Standardfehler des Mittelwerts (standard error mean)

sGC lösliche (soluble) Guanylatzyklase

SKCa KCa mit kleiner (small) Leitfähigkeit, auch KCa2.3

SKCa-ko genetisch veränderter Mausstamm (siehe auch 2.1.1)

SMC Glatte Gefäßmuskelzellen (smooth muscle cells)

SNP Natriumnitroprussid (Sodiumnitroprusside)

tTA Tetracyclin Transaktivator

UCL1684 spezifischer Blocker des SKCa

V. Vena

VDCC Spannungsabhängiger Ca2+-Kanal (Voltage-Dependent

Ca2+-Channel), auch L-Typ-Calciumkanal

EINLEITUNG

1

1. Einleitung

1.1 Prinzipien der Durchblutungsregulation

Das Herz-Kreislaufsystem ist ein Organsystem, dessen Funktion lebensnotwendig

für jeden höheren Organismus ist. Mit dem Blut werden Sauerstoff (O2),

Energieträger, sonstige Nährstoffe und Signalstoffe zu den peripheren Geweben

befördert und Stoffwechselendprodukte und insbesondere Kohlendioxid (CO2)

abtransportiert. Außerdem ist das Kreislaufsystem unverzichtbar für die

Wärmeregulation und die Funktion des Immunsystems. Entscheidend für die

Erfüllung dieser Aufgaben ist, dass zu jeder Zeit ein bedarfsweise adaptierter

Blutfluss in den einzelnen Geweben und Organstromgebieten gewährleistet ist.

Betrachtet man das Gefäßsystem annähernd als ein Gebilde aus miteinander

kommunizierenden starren Rohren, in denen eine laminare Strömung einer

homogenen Flüssigkeit herrscht, so lassen sich einige physikalische Regeln

anwenden. Nach dem Ohmschen Gesetz wird die Gesamtstromstärke I

(Herzzeitvolumen, HZV) einerseits von der Perfusionsdruckdifferenz ∆P (arterieller

Blutdruck) und andererseits vom peripheren Gefäßwiderstand R bestimmt. Der

Gesamtwiderstand des Gefäßbettes berechnet sich nach der Kirchhoffschen

Regel aus der Summe der Einzelwiderstände der hintereinander liegenden

Gefäßabschnitte. Der Widerstand der einzelnen Abschnitte wiederum berechnet

sich nach dem Gesetz von Hagen-Poiseuille aus dem Kehrwert der vierten Potenz

des Radius (1/r4), der Länge (l) des betrachteten Gefäßabschnittes und der

Viskosität des Blutes (η).

I = R

∆P

Rges. = R1 + R2 + …

R = 8 • η • l

π • r4

Ohmsches Gesetz

Kirchhoffsche Regel (für Widerstände in Reihe)

Gesetz von Hagen-Poiseuille

EINLEITUNG

2

Die einzige in vivo nennenswert beeinflussbare Größe der drei letztgenannten ist

der Gefäßradius und auf Grund der oben bezeichneten Abhängigkeit hat bereits

eine geringe Gefäßerweiterung eine große Abnahme des Strömungswiderstandes

zur Folge.

Im Gefäßsystem des Menschen nimmt der Gesamtquerschnitt der Blutgefäße mit

abnehmender Gefäßgröße kontinuierlich zu. Auf der Ebene der Kapillaren ist ein

Gesamtquerschnitt erreicht, der 500- bis 800-mal dem Durchmesser der Aorta

ascendens entspricht. Kapillaren sind auf Grund ihres histologischen Aufbaus

(s.u.) nicht in der Lage, ihren Durchmesser aktiv zu verändern, daher sind die

ihnen vorgeschalteten Arteriolen mit einem regulierbaren Durchmesser von etwa

10 bis 100 µm die eigentlichen Widerstandsgefäße. Ihr Tonus und damit die

Gefäßweite hat den größten Anteil an der Regulation des Strömungswiderstandes.

Diese Arteriolen waren Objekt der Untersuchungen, die dieser Arbeit zu Grunde

liegen.

Da die Auswurfleistung des Herzens und damit das HZV begrenzt ist, ist es nicht

möglich, dass alle Organe gleichzeitig maximal perfundiert werden. Es muss

demzufolge eine differenzierte Durchblutungsregulation auf Ebene der einzelnen

Organe erfolgen. Dies wird dadurch erreicht, dass die Arteriolen (Widerstands-

gefäße) einzelner Organstromgebiete bedarfsadaptiert eine Widerstandsänderung

bewirken, so dass es bei gesteigertem Bedarf zu einer Mehrdurchblutung kommt

(funktionelle oder aktive Hyperämie). Diese Regulation basiert vor allem auf

lokalen Mechanismen. So können sowohl physikalische als auch biochemische

Faktoren den lokalen Gefäßtonus beeinflussen und so zu einer Konstriktion

(Verengung) oder einer Dilatation (Erweiterung) des Gefäßes führen. Ein Beispiel

für einen physikalischen Faktor ist die Wandschubspannung, die den

Kontraktionszustand eines Gefäßes beeinflussen kann. Außerdem ist das Gefäß

in der Lage, auf Änderungen des transmuralen Drucks zu reagieren (Bayliss-

Effekt). Ebenso kann ein verändertes extrazelluläres Milieu (zum Beispiel Anstieg

oder Abfall des Sauerstoffpartialdrucks oder des pH, Freisetzung von Metaboliten)

oder die Sekretion von vasoaktiven Substanzen den Kontraktionszustand eines

Gefäßes verändern.

EINLEITUNG

3

Im Gegensatz zu diesen lokalen Mechanismen dienen zentrale Mechanismen

weniger einer bedarfsorientierten Durchblutung einzelner Organe, sondern viel

mehr einer Regulation des systemischen Blutdrucks. Neurohumorale und

endokrine Einflüsse spielen hier eine Rolle. Das vegetative Nervensystem kann

durch sympathische konstriktorische Fasern den Gefäßtonus über adrenerge α1-

Rezeptoren beeinflussen. Der Parasympathikus beeinflusst den Gefäßtonus nur in

geringem Maße und in bestimmten Organsystemen (Geschlechtsorgane) und ist

an der Regulation des systemischen Blutdrucks nicht beteiligt. Weitere Effektoren

der zentralen Regulation sind Adrenalin, welches im Nebennierenmark produziert

wird, und Angiotensin II, welches im Gefäßlumen selbst aus Vorläufermolekülen

entsteht. Im Allgemeinen reagieren diese zentralen Regulationsmechanismen

entweder auf Zeichen einer Minderperfusion (z.B. in der Niere oder mediiert durch

bestimmte Barorezeptoren) oder auf eine erwartete Mehrleistung des Organismus

(z. B. Schreckreaktion mit Sympathikusaktivierung) und führen dann zu einer

Änderung des Gefäßtonus, um den systemischen Blutdruck im physiologischen

Bereich zu halten.

Der Anteil dieser verschiedenen lokalen und systemischen Mechanismen an der

Regulation des jeweiligen Gefäßtonus variiert in verschiedenen Geweben stark.

Die Versuche in dieser Arbeit beziehen sich auf die Durchblutung speziell des

Skelettmuskels und daher sollen die dort relevanten Mechanismen im Folgenden

noch näher betrachtet werden.

1.2 Aufbau und Kontraktionsmechanismen der

Blutgefäße

Das Herz-Kreislaufsystem besteht aus dem Herzen, das die treibende Kraft für

den Blutfluss generiert, sowie dem arteriellen und dem venösen Gefäßsystem.

Das arterielle System des Körperkreislaufs beginnt mit der Aorta und geht mit

abnehmender Größe der einzelnen Gefäße in die Arterien und die Arteriolen über

und führt dann zum kapillären System. Hier findet der Stoffaustausch mit den

Geweben statt. Den Kapillaren angeschlossen ist wiederum das venöse System

aus Venolen und größeren Venen, das das Blut zum Herzen zurückführt.

EINLEITUNG

4

Allen Gefäßen ist der grundlegende histologische Aufbau gemein [1]. Ihr Lumen ist

stets von einer einschichtigen Lage aus Endothelzellen ausgekleidet (Intima), die

die Grenzfläche zum fließenden Blut darstellen und vielfältige Aufgaben besitzen.

Außer ihrem Einfluss auf den lokalen Gefäßtonus (s.u.) nehmen sie auch wichtige

Funktionen im Zusammenhang mit der Immunabwehr und der Blutgerinnung wahr

und synthetisieren Bestandteile der extrazellulären Matrix der subendothelialen

Schicht. Die einzelnen Endothelzellen sind platte, polygonale Zellen, die mit ihrer

Längsachse parallel zum Blutstrom ausgerichtet sind. Sie sind sowohl durch Gap

junctions (s.u.), als auch durch Tight junctions miteinander verbunden und stellen

eine Diffusionsbarriere dar.

An das Endothel schließt sich die Media an, die vom Endothel durch eine dünne

Bindegewebsschicht und eine elastische Membran (Membrana elastica interna)

abgetrennt ist. Letztere ist von Öffnungen durchsetzt, um die Diffusion von Stoffen

zu erleichtern. Die Media besteht aus glatten Muskelzellen sowie Extra-

zellulärmatrix. Im Gegensatz zu den Endothelzellen sind die Gefäßmuskelzellen

mit ihrer Längsachse zirkulär um das Gefäß angeordnet. Die Dicke der Media ist

bei den großen Arterien am größten und nimmt mit abnehmender Gefäßgröße ab.

Auf der Ebene der Arteriolen und Venolen besteht sie aus einer Zelllage, in den

Kapillaren verschwindet sie völlig und es sind nur noch vereinzelte

Gefäßmuskelzellen aufzufinden. An die Media schließt sich die bindegewebige

Adventitia an, die das Gefäß im umliegenden Gewebe verankert.

Die Gefäßmuskelzellen der Arteriolen bestimmen mit ihrem Tonus den

Gefäßdurchmesser und damit den resultierenden Strömungswiderstand. Hierzu

besitzen sie einen kontraktilen Apparat aus Aktin- und Myosinfilamenten, der unter

ATP-Verbrauch zu einer Kontraktion der Muskelzelle führen kann [2]. Dieser

Apparat wird durch die Phosphorylierung und Dephosphorylierung der

regulatorischen leichten Kette des Myosins reguliert, ein höherer

Phosphorylierungsgrad führt zu einer gesteigerten Interaktion der kontraktilen

Elemente. Unter physiologischen Bedingungen herrscht ein Gleichgewicht

zwischen dem Enzym, das das Myosin phosphoryliert (Myosin Leichte Ketten

Kinase, MLCK) und dem Enzym, das es dephosphoryliert (Myosin Leichte Ketten

Phosphatase, MLCP). Ein entscheidender Faktor, der dieses Gleichgewicht

EINLEITUNG

5

beeinflusst, ist die intrazelluläre Calciumkonzentration, da die MLCK durch

Calcium aktiviert wird. Sie liegt in Ruhe bei etwa 10-7 mol/l und kann durch

spezielle Agonisten oder Membranpotentialänderungen verändert werden. Eine

Depolarisation der Zelle führt zu einer Öffnung von spannungsabhängigen

Calciumkanälen (VDCCs) und so zu einem Einstrom von Calcium [3]. Dies bewirkt

eine Aktivierung von Calciumkanälen im endoplasmatischen Retikulum (ER), was

den Calciumeinstrom ins Zellinnere noch verstärkt (Calicum-abhängige

Calciumfreisetzung). Umgekehrt führt eine Hyperpolarisation zum Schließen von

VDCCs und die Calciumkonzentration sinkt, da Ca2+ ständig in die intrazellulären

Speicher zurückgepumpt wird. Bei einem Anstieg des intrazellulären Calciums

kommt es zu einer Bindung von Calcium an das regulatorische Protein Calmodulin

und dieser Calcium-Calmodulin-Komplex bindet wiederum an die MLCK, so dass

ein aktiver Holoenzymkomplex entsteht. Dieser überträgt eine Phosphatgruppe

von ATP auf Myosin und ermöglicht so die Interaktion von Aktin und Myosin und

somit eine Kontraktion. Umgekehrt führt eine Hyperpolarisation über eine

Verminderung der intrazellulären Calciumkonzentration zu einer Erschlaffung der

Muskelzellen. Es gibt weiterhin Calcium-unabhängige Mechanismen, die den

Tonus der Gefäßmuskelzellen modulieren. So kann es durch die Hemmung der

MLCP über verschiedene Signalkaskaden zu einer Calcium-Sensitivierung

kommen, es wird dann bei gleichbleibender intrazellulärer Calciumkonzentration

ein höherer Kontraktionszustand erreicht. Analog dazu kann es durch eine

Aktivierung der MLCP durch intrazelluläre Botenstoffe wie cAMP oder cGMP zu

einer Calcium-Desensitivierung und einer Relaxation der Muskelzelle kommen.

Zusammengefasst sind die glatten Muskelzellen der Gefäßwand also durch einen

Ruhetonus charakterisiert, der durch verschiedene Einflussfaktoren in beide

Richtungen, hin zu einer Dilatation oder einer Konstriktion des Gefäßes,

beeinflusst werden kann, und der so den Gefäßwiderstand ändert und die lokale

Durchblutung reguliert.

EINLEITUNG

6

1.3 Endothelabhängige Mechanismen der Vasodilatatio n

Eine Änderung des Kontraktionszustandes eines Gefäßes kann erreicht werden,

indem ein physikalischer oder ein biochemischer Stimulus direkt auf die glatten

Muskelzellen der Gefäßwand einwirkt. Dies ist zum Beispiel beim Bayliss-Effekt

der Fall. Hier führt ein physikalischer Faktor, ein Anstieg des transmuralen Drucks,

zu einer Dehnung der Gefäßmuskelzellen und in der Folge zu einer Öffnung

mechanosensitiver Kationenkanäle und einem Einstrom von Calcium. Dies führt

zu einer Kontraktion des Gefäßes [4].

Andererseits kann der Kontraktionszustand eines Gefäßes auch durch Stimuli

beeinflusst werden, die nur mittelbar auf die Muskelzellen der Gefäßwand wirken

und primär einen Effekt auf das Endothel haben. Dieses kann daraufhin Autakoide

freisetzen, die in die Media diffundieren und dort den Gefäßtonus beeinflussen.

Ein physikalischer Stimulus, der auf diese Weise wirkt, ist die Schubspannung, die

das strömende Blut auf das Endothel ausübt [5]. Ein Anstieg des Blutflusses führt

zu einem Anstieg der Calciumkonzentration in den Endothelzellen [6] und so zu

einer Freisetzung vasodilatatorischer Mediatoren (flussinduzierte Dilatation),

insbesondere von Stickstoffmonoxid (NO) [7]. Ein typischer biochemischer

Mediator, der das Endothel aktiviert und so zu einer Gefäßdilatation führt und oft

als Testsubstanz der Endothelfunktion dient, ist Acetylcholin (ACh). Es aktiviert in

Endothelzellen über den muskarinischen M3-Rezeptor die Phospholipase C (PLC)

und diese spaltet wiederum Inositoltrisphosphat (IP3) aus Membranlipiden ab. IP3

wirkt dann auf Ionenkanäle im endoplasmatischen Retikulum und führt so zu

einem intrazellulären Calciumanstieg [8] und einer Hyperpolarisation der

Endothelzellen [9], was zu einer Freisetzung von Autakoiden führt, die eine

Gefäßdilatation bewirken.

Die klassischen Autakoide, die vom Endothel freigesetzt werden, sind NO und

Prostaglandin I2 (PGI2, Prostazyklin). NO wird im Endothel von der konstitutiv

exprimierten endothelialen NO-Synthase (eNOS) produziert, die ihrerseits von

einem Calcium-Calmodulin-Komplex bei Anstieg der intrazellulären Calcium-

konzentration aktiviert wird. Sie spaltet NO aus der Aminosäure L-Arginin ab und

es entsteht L-Citrullin. NO kann auf Grund seiner chemischen Eigenschaften in die

glatten Muskelzellen der Gefäßwand diffundieren und aktiviert dort die lösliche

EINLEITUNG

7

Guanylatzyklase (sGC), die cGMP produziert und so cGMP-abhängige

Proteinkinasen aktiviert [10-13]. Hierdurch wird einerseits ein Calcium-

unabhängiger Mechanismus der Relaxation der glatten Muskelzellen eingeleitet,

indem die Aktivität der MLCP gesteigert wird. Zusätzlich werden weitere

Zielproteine der cGMP-abhängigen Proteinkinasen aktiviert, die zu einer Senkung

des intrazellulären Calciums führen und so gleichzeitig eine Calcium-abhängige

Dilatation des Gefäßes bewirken [14].

Auch Prostazyklin wird im Endothel bei einem Anstieg des Calciums gebildet.

Durch eine Calciumerhöhung setzt die Phospholipase A2 (PLA2) Arachidonsäure

aus Membranlipiden frei. Die Cyclooxygenase (COX) bildet aus Arachidonsäure

Prostaglandin H2, welches daraufhin von der PGI2-Synthase zu Prostazyklin

umgesetzt wird. Dieses wirkt auf einen membranständigen G-Protein-gekoppelten

Prostaglandinrezeptor der Gefäßmuskelzellen und führt zur Synthese des

Botenstoffes cAMP durch die Adenylatzyklase. cAMP aktiviert nun analog zu

cGMP verschiedene Proteinkinasen und führt zu einer sowohl Calcium-

unabhängigen als auch einer Calcium-abhängigen Gefäßdilatation [15, 16]. Ein

weiterer Metabolisierungsweg der Arachidonsäure ist die Bildung von

Leukotrienen durch die Lipoxygenase (LOX), die allerdings keinen wesentlichen

Einfluss auf den Gefäßtonus haben.

Selbst nach Ausschaltung dieser beiden Signalwege durch eine pharmakologische

Blockade von eNOS und COX ist insbesondere in kleinen Blutgefäßen noch eine

Dilatation nach Stimulation des Endothels mit ACh zu beobachten. Da diese

Dilatation mit einer Hyperpolarisation der glatten Muskelzellen verbunden ist und

man bei der Entdeckung dieses Mechanismus von einem löslichen Faktor als

Mediator ausging, wurde dieser postulierte endotheliale Faktor als EDHF

(Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor) bezeichnet [17]. Auf Grund der

großen Bedeutung von EDHF für die vorliegende Arbeit soll hierauf im nächsten

Abschnitt noch näher eingegangen werden.

Die Bedeutung dieser drei endothelialen Mediatoren (NO, PGI2 und EDHF) variiert

in verschiedenen Organgebieten und in Gefäßen unterschiedlicher Größe. Es

konnte gezeigt werden, dass NO und Prostazyklin für die endothelabhängige

Dilatation vor allem in größeren Arterien verantwortlich sind, während in der

Mikrozirkulation die Bedeutung von EDHF in den Vordergrund tritt [18, 19].

EINLEITUNG

8

1.4 EDHF

Die genauen Mechanismen, die zu einer EDHF-Typ-Dilatation führen, sind bis

heute Gegenstand kontroverser Diskussionen. Eine Hyperpolarisation des

Endothels ist eine notwendige Voraussetzung für die Bildung von EDHF [9]. Sie

wird durch einen Kaliumausstrom erreicht, der durch die Öffnung von bestimmten

Ionenkanälen in der Zellmembran verursacht wird [20-22]. Hier sind Calcium-

abhängige Kaliumkanäle (KCa) beteiligt, die an Hand ihrer Leitfähigkeit in einen

Kanal mit geringer Leitfähigkeit (SKCa), einen mit mittlerer Leitfähigkeit (IKCa) und

einen Kanal mit großer Leitfähigkeit (BKCa) unterschieden werden. In

Endothelzellen werden SKCa und IKCa exprimiert, während BKCa auf glatten

Muskelzellen zu finden ist [23-27]. Ein Auslöser für die Öffnung dieser Kanäle ist

eine Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, die durch viele Faktoren

hervorgerufen wird, die das Endothel aktivieren [22]. EDHF ist nun dadurch

definiert, dass eine Hyperpolarisation der Gefäßmuskelzellen durch einen NO- und

Prostazyklin-unabhängigen Mechanismus vom Endothel erzeugt wird und so zu

einer Reduktion der dortigen Calciumkonzentration und einer Vasodilatation führt

[28].

Bisher sind verschiedene Mediatoren gefunden worden, die alle diese

Bedingungen erfüllen. Es gibt Hinweise darauf, dass verschiedene Epoxyeicosa-

triensäuren (EETs) in bestimmten Präparationen die Rolle eines EDHFs

einnehmen [29, 30]. EETs werden durch Cytochrom-P450-Epoxygenasen aus

Arachidonsäure synthetisiert. Der vermutete Mechanismus der Wirkung auf die

glatten Muskelzellen besteht in einer Öffnung von BKCa-Kanälen, einer daraus

folgenden Hyperpolarisation der Gefäßmuskelzellen und so einer Relaxation [31,

32], möglicherweise über einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor [33].

Bei der Hyperpolarisation des Endothels kommt es zu einem Ausstrom von

Kaliumionen über SKCa- und IKCa-Kanäle und es ist denkbar, dass diese

Kaliumionen als EDHF wirken. Eine Erhöhung der extrazellulären Kalium-

konzentration kann sowohl Einwärts-Gleichrichter-Kaliumkanäle (Kir) als auch die

Na+-K+-ATPase der glatten Muskelzellen aktivieren, was zu einer

Hyperpolarisation der Gefäßmuskelzellen und einer Dilatation des Gefäßes führt

[34-38].

EINLEITUNG

9

Ebenso wie für EETs und Kalium konnte auch für Wasserstoffperoxid (H2O2)

gezeigt werden, dass es in bestimmten Präparationen wie ein EDHF wirkt [39-41].

Der genaue Mechanismus der endothelialen Bildung von H2O2 und des weiteren

Signalweges ist noch nicht geklärt, möglicherweise kommt es auch hier zu einer

Öffnung von BKCa-Kanälen. In der Literatur werden noch zwei weitere Substanzen

als mögliche Effektormoleküle einer EDHF-Dilatation diskutiert, das Endo-

cannabinoid Anandamid, das möglicherweise über Cannabinoidrezeptoren der

glatten Muskelzellen zu einer Hyperpolarisation führt [42], und das C-Typ

natriuretische Peptid (CNP), das über eine Erhöhung der cGMP-Konzentration in

den Gefäßmuskelzellen wirken soll [43].

Eventuell ist EDHF jedoch gar kein chemisch identifizierbarer Faktor, der vom

Endothel in die Media des Gefäßes diffundiert. In den letzten Jahren wurde die

Theorie entwickelt, dass es sich bei NO- und Prostazyklin-unabhängigen

Dilatationen auch um eine direkte Ladungsübertragung von den Endothel- in die

glatten Muskelzellen handeln könnte [44]. In einigen in vitro-Präparationen konnte

gezeigt werden, dass diese beiden Zellschichten in der Gefäßwand durch

myoendotheliale Gap junctions (MEGJ, siehe auch Abschnitt 1.5) verbunden sind

und dass die Blockade dieser Zellverbindungen EDHF-Dilatationen abschwächt

[45-48]. In vivo-Experimente zeigten allerdings Befunde auf, die gegen einen

reinen Ladungstransfer durch MEGJ im Sinne eines EDHF sprechen [9, 49]. Eine

weitere Möglichkeit, die Bedeutung von MEGJs für EDHF-Dilatationen zu

untersuchen, besteht darin, das Membranpotential in einer der beiden

Zellschichten zu verändern und zu messen, ob sich diese Änderungen auf die

jeweils andere Zellschicht ausbreiten. Auch in diesen Versuchen konnten in vitro

Hinweise auf MEGJ und eine direkte Kopplung gefunden werden [50, 51], was

sich jedoch in in vivo-Versuchen nicht verifizieren ließ [52, 53].

In Abb. 1.1 sind die endothelabhängigen Mechanismen einer Dilatation

schematisch zusammengefasst.

EINLEITUNG

10

Abbildung 1.1: Endothelabhängige Mechanismen der Va sodilatation. Agonisten wie

Acetylcholin führen nach Rezeptorbindung zu einem Anstieg der intrazellulären

Calciumkonzentration in den Endothelzellen (EC) und lösen so über verschiedene

Mechanismen eine Relaxation der Gefäßmuskelzellen (SMC) aus: Es kommt zu einer

Aktivierung der endothelialen NO-Synthase (eNOS), die Stickstoffmonoxid (NO)

produziert, sowie zu einer Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2), die zu einem Anstieg

des Arachidonsäurespiegels führt, aus der die Cyclooxygenase (COX) Prostaglandine

(PGs) und die Lipoxygenase (LOX) Leukotriene (LTs) synthetisiert. Außerdem wird eine

EDHF-Typ-Dilatation initiiert. Mögliche Mediatoren dieser Dilatation sind Epoxyeicosa-

triensäuren (EETs), die von Cytochrom-P450-Epoxygenasen (Cyp450) aus Arachidonsäure

freigesetzt werden. Weitere mögliche Substanzen in der Rolle von EDHF sind

Kaliumionen (K+), die durch Calcium-abhängige Kaliumkanäle der Endothelzellen (IKCa

und SKCa) in den Extrazellulärraum freigesetzt werden sowie Wasserstoffperoxid (H2O2).

Die drei letztgenannten Substanzen könnten eine Hyperpolarisation der

Gefäßmuskelzellen durch eine Aktivierung Calcium-abhängiger Kaliumkanäle (BKCa),

Einwärts-Gleichrichter-Kaliumkanäle (Kir) oder die Na+-K+-ATPase in der Zellmembran der

Gefäßmuskelzellen bewirken. Schließlich könnte eine EDHF-Dilatation auch durch direkte

Übertragung einer Hyperpolarisation über myoendotheliale Gap junctions (MEGJ)

vermittelt werden. [9]

EINLEITUNG

11

Zusammenfassend ist zu sagen, dass es bisher kein schlüssiges Konzept für die

Identität von EDHF gibt. Mehrere mögliche Substanzen sind identifiziert worden,

ohne dass eine Substanz hierbei im Vordergrund steht. Die oben dargestellten

Studienergebnisse lassen vermuten, dass es keinen uniformen EDHF gibt,

sondern dass die beteiligten Mediatoren in verschiedenen Gefäßgebieten und

Präparationen sowie möglicherweise auch speziesabhängig variieren.

1.5 Koordination des Gefäßverhaltens durch Gap

junctions

Da der Bedarf an Sauerstoff und Energieträgern in bestimmten Geweben mit der

Aktivität variiert, ist es notwendig, dass die Durchblutung diesem Bedarf

angepasst ist. Insbesondere in der Skelettmuskulatur gibt es eine große Differenz

zwischen Ruhedurchblutung und Blutfluss bei körperlicher Arbeit, die

Muskeldurchblutung kann um mehr als das 20-fache ansteigen [54].

Damit solch große Durchblutungssteigerungen möglich werden, muss das

Verhalten der Widerstandsgefäße über eine große Strecke koordiniert werden.

Wenn nur die Arteriolen unmittelbar im aktiven Gewebe dilatieren, wirken die

Abschnitte des Gefäßbaums, die weiter stromaufwärts lokalisiert sind,

flusslimitierend, und es kann nicht zu einer ausreichenden Blutflusssteigerung

kommen [55, 56]. Verdeutlichen lässt sich dies, indem man das Gefäßsystem

vereinfacht als ein Rohrsystem betrachtet (siehe Abschnitt 1.1). Entsprechend der

Kirchhoffschen Regel setzt sich der Gesamtströmungswiderstand aus der Summe

der Einzelwiderstände zusammen. Unter der Annahme, dass sich der

Gefäßwiderstand in der Skelettmuskulatur gleichmäßig auf intramuskuläre

Arteriolen und auf Gefäße außerhalb des Muskels verteilt, könnte selbst bei einem

Abfall des intramuskulären Gefäßwiderstandes auf vernachlässigbar kleine Werte

maximal eine Verdoppelung des Gesamtblutflusses erreicht werden, solange die

Gefäße außerhalb des Muskels ihre ursprünglichen Durchmesser beibehalten. Die

Dilatation muss sich also in stromaufwärts gelegene Gefäßabschnitte ausbreiten.

Eine solche Ausbreitung kann experimentell untersucht werden, indem ein Gefäß

strikt lokal mit einem Vasodilatator (z.B. Acetylcholin, ACh) stimuliert wird, so dass

es an der Stimulationsstelle zu einer Dilatation kommt. Diese Gefäßerweiterung

EINLEITUNG

12

wird dann nicht nur an der Stimulationsstelle beobachtet, sondern sie breitet sich

sehr schnell (< 1 s) entlang des Gefäßes aus, so dass es auch in einer Entfernung

von bis zu 20 Millimetern von der Stimulationsstelle zu einer koordinierten

Dilatation kommt. Diese Ausbreitung erfolgt sowohl nach stromaufwärts als auch

nach stromabwärts. Ein Transport von lokal applizierten vasoaktiven Substanzen

mit dem Blutstrom ist als Auslöser dieser koordinierten Dilatation auszuschließen,

da im Experiment in der Regel ein Gefäßabschnitt stromaufwärts von der

Stimulationsstelle betrachtet wird. Daher wird dieses Phänomen als ‚aufsteigende’

oder ‚fortgeleitete Dilatation’ bezeichnet [57]. Es konnte weiterhin gezeigt werden,

dass diese aufsteigenden Dilatationen nicht durch eine flussinduzierte Dilatation

hervorgerufen werden [58]. Auch die hohe Ausbreitungsgeschwindigkeit der

Fortleitung spricht gegen eine flussinduzierte Dilatation, da diese deutlich

langsamer entstehen und ca. 30 bis 150 s benötigen würde, um ihr Maximum zu

erreichen. Die Geschwindigkeit der Ausbreitung macht ein elektrisches Signal als

Vermittler der aufsteigenden Dilatation wahrscheinlich. Sie ist allerdings nicht

nerval vermittelt, da die Blockade schneller Natriumkanäle der Nerven durch

Tetrodotoxin keinen hemmenden Einfluss auf fortgeleitete Dilatationen hat [58].

Fortgeleitete Dilatationen lassen sich außer durch ACh auch durch Bradykinin und

Adenosin (Ado) auslösen [59, 60], nicht jedoch durch den NO-Donor

Natriumnitroprussid (SNP) [61]. SNP ruft zwar eine lokale Dilatation hervor, diese

breitet sich allerdings nicht entlang des Gefäßes aus. Die Tatsache, dass nicht

jede lokale Dilatation fortgeleitet wird, zeigt, dass es spezielle Mechanismen der

Fortleitung geben muss, die durch bestimmte Agonisten aktiviert werden (wie

ACh, Bradykinin, Ado), durch andere Substanzen (wie SNP) jedoch nicht. Zwei

der drei erstgenannten Substanzen (ACh und Bradykinin) haben gemeinsam, dass

sie primär auf das Endothel wirken und hier zu einer Hyperpolarisation und einem

Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration führen [8, 59], während SNP als

NO-Donor keine endotheliale Hyperpolarisation hervorruft, sondern direkt auf die

glatten Muskelzellen wirkt und hier zu einer Relaxation führt. Dies weist darauf hin,

dass eine endotheliale Hyperpolarisation an der Entstehung von fortgeleiteten

Dilatationen beteiligt ist. Die Rolle des Endothels kann zusätzlich dadurch belegt

werden, dass aufsteigende Dilatationen nach selektiver Zerstörung des Endothels

aufgehoben wurden [62, 63].

EINLEITUNG

13

Die endothelialen Autakoide NO und PGI2 sind allerdings weder bei der Auslösung

noch bei dem Prozess der Fortleitung beteiligt [64, 65]. Eine Schlüsselrolle für die

Auslösung fortgeleiteter Dilatationen scheint daher EDHF-Dilatationen

zuzukommen, und tatsächlich führt die Blockade von KCa-Kanälen an der

Stimulationsstelle zu einer Aufhebung der Gefäßdilatation sowohl an der

Stimulationsstelle als auch an entfernten Stellen [64, 66]. Ein weiterer Hinweis auf

die Beteiligung von EDHF ist eine endotheliale Hyperpolarisation auch an den

entfernten Stellen, wie sie mit der Bildung von EDHF assoziiert ist [67]. Diese

Befunde lassen insgesamt vermuten, dass sich eine endotheliale

Hyperpolarisation entlang des Gefäßes ausbreitet, die mit der Bildung von EDHF

assoziiert ist und so aufsteigende Dilatationen auslöst bzw. ermöglicht.

Membranpotentialänderungen können sich über mehrere Zellen ausbreiten, wenn

diese Zellen miteinander elektrisch gekoppelt sind. Dies ist in Gefäßen durch

spezielle Zellkontakte, Gap junctions (GJ), gegeben. GJ stellen niederohmige

Verbindungen zwischen einzelnen Zellen dar. Sie bestehen aus Connexin-

proteinen (Cx). Sechs dieser Connexine lagern sich zusammen und bilden einen

Halbkanal (Connexon) in der Zellmembran. Dieser Halbkanal dockt an einen

weiteren Halbkanal einer benachbarten Zelle an und so bilden sich Poren, die

gegen den Extrazellulärraum abgeschlossen sind. Sie ermöglichen den Durchtritt

von Ionen und Molekülen bis zu einer Größe von 1 kDa von einer Zelle in die

benachbarte und können zur elektrotonischen Ausbreitung einer Membran-

potentialänderung über mehrere Zellen führen [68, 69].

Vaskuläre Zellen können prinzipiell zwei Arten von GJ ausbilden: Homozelluläre

GJ, die jeweils entweder Endothelzellen oder glatte Muskelzellen untereinander

verbinden und so eine longitudinale Kommunikation ermöglichen, und

heterozelluläre GJ, die Endothelzellen mit den glatten Muskelzellen verbinden

(MEGJ, siehe Abschnitt 1.4) und eine transversale Kommunikation erlauben.

Connexine werden nach ihrem Molekulargewicht benannt und in vaskulären Zellen

werden von den zwanzig bekannten lediglich vier verschiedene Connexine

exprimiert: Cx37, Cx40, Cx43 und Cx45. Von diesen vier werden Cx37 und Cx40

hauptsächlich im Endothel der Widerstandsgefäße exprimiert. Cx43 erscheint in

geringen Mengen in den Endothelzellen größerer Gefäße sowie in den glatten

EINLEITUNG

14

Muskelzellen. Cx45 findet sich dagegen fast ausschließlich in den

Gefäßmuskelzellen [60, 62, 70-74].

Tatsächlich scheinen GJ und insbesondere Cx40 für die Weiterleitung der

Hyperpolarisation entlang des Endothels bei aufsteigenden Dilatationen eine

wesentliche Rolle zu spielen, da in genetisch veränderten Mäusen, die kein Cx40

exprimieren (Cx40 knock-out-Tiere, Cx40ko), fortgeleitete Dilatationen nach

Applikation von ACh deutlich abgeschwächt sind, während die lokale Antwort

intakt ist [75]. Auch der gentechnische Austausch von Cx40 durch Cx45 führt zu

einer deutlichen Reduktion der fortgeleiteten Dilatationen, Connexine sind also in

den Arteriolen nicht beliebig austauschbar [60].

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass aufsteigende Dilatationen auf einer

Hyperpolarisation beruhen, die in Zusammenhang mit einer lokalen EDHF-

Dilatation steht und sich über homozelluläre GJ im Endothel entlang des Gefäßes

ausbreitet und so das Gefäßverhalten koordiniert.

1.6 Funktionelle Hyperämie in der Skelettmuskulatur

Wie in Abschnitt 1.5 bereits erläutert, kann es in der Skelettmuskulatur zu einer

besonders ausgeprägten Durchblutungssteigerung kommen. Dies geschieht sehr

schnell (innerhalb 1 s) nach Beginn von Muskelkontraktionen [76]. Frühere

Studien konnten zeigen, dass es eine direkte Beziehung zwischen der Perfusion

und der Kontraktionsfrequenz eines Muskels [77], der Zunahme der

Laufgeschwindigkeit bei Ratten [78, 79] und der Sauerstoffaufnahme des Muskels

[80, 81] gibt.

Die Steigerung der Durchblutung eines bestimmten Organs wird durch eine

Dilatation der Widerstandsgefäße erreicht. Im Skelettmuskel könnte

möglicherweise zusätzlich zumindest ein gewisser Anteil der Durchblutungs-

zunahme durch eine Steigerung des Perfusionsdrucks erreicht werden, indem

Muskelkontraktionen eine Pumpfunktion auf die lokalen Venen ausüben und so

den Druck im venösen System absenken. Allerdings verhindert die

pharmakologisch herbeigeführte Unfähigkeit der Gefäße zu dilatieren die

Blutflusssteigerung bei Muskelkontraktionen [82-84]. Somit ist die Rolle der

EINLEITUNG

15

Muskelpumpe zu vernachlässigen und auch im Skelettmuskel ist eine Dilatation

der Widerstandsgefäße ausschlaggebend für die Mehrdurchblutung bei Arbeit.

Trotz der physiologisch wichtigen Rolle der aktiven Hyperämie ist es bis heute

unklar, welche Mechanismen die lokale Dilatation bei muskulärer Arbeit initiieren,

die sich dann entlang des Gefäßes ausbreitet. ACh, welches als Transmitter an

der motorischen Endplatte aus motorischen Nervenendigungen freigesetzt wird,

könnte von dort zu den benachbarten Widerstandsgefäßen diffundieren und zu

einer endothelvermittelten Dilatation führen [76, 85, 86]. Eine weit verbreitete und

viel untersuchte Hypothese ist metabolischer Natur, nämlich dass lokale

Mediatoren entsprechend der Arbeitsintensität, und damit dem Bedarf an

Sauerstoff und Energieträgern, freigesetzt werden und die Durchblutung steigern.

Eine andere Hypothese geht davon aus, dass die mechanische Verformung des

Gewebes durch Muskelkontraktionen selbst zu einer Gefäßdilatation führt [87-89].

Wahrscheinlich sind verschiedene Mechanismen involviert, die möglicherweise im

Zeitverlauf differenziert auftreten. So könnten spezielle Signalwege die schnelle

erste Phase der Dilatation unmittelbar nach den ersten Kontraktionen induzieren,

die dann durch andere (z. B. metabolische) Faktoren aufrechterhalten und an den

Bedarf angepasst wird [90]. Freigesetzte Mediatoren könnten von der arbeitenden

Skelettmuskulatur selbst, von den Erythrozyten im Gefäßlumen oder von den

Endothelzellen sezerniert werden und auf die glatten Gefäßmuskelzellen wirken.

Mögliche vasodilatatorische Metabolite sind unter anderem Laktat und Protonen,

die von arbeitenden Skelettmuskelzellen freigesetzt werden. Allerdings konnte für

beide Substanzen gezeigt werden, dass es keine direkte Korrelation zwischen

ihrer Konzentration und der funktionellen Hyperämie im Skelettmuskel gibt [91].

Die Konzentration von Adenosin steigt ebenfalls im arbeitenden Skelettmuskel an

und dieser Anstieg korreliert gut mit der Durchblutung [91, 92], jedoch führt die

Blockade von Adenosinrezeptoren zu keiner Beeinträchtigung der funktionellen

Hyperämie in der Skelettmuskulatur [93, 94]. Auch die Konzentration von

Kaliumionen steigt im arbeitenden Skelettmuskel an, da Kaliumionen bei der

Repolarisation des Aktionspotentials der Muskelzellen freigesetzt werden [95], und

dies könnte ebenfalls zu einer Gefäßdilatation im Rahmen der funktionellen

Hyperämie führen [96]. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass eine lokale

Hypoxie durchblutungssteigernd wirkt [97], allerdings scheint dies kein

EINLEITUNG

16

wesentlicher Einflussfaktor bei der aktiven Hyperämie zu sein, da sowohl eine

Hyperoxie als auch eine verbesserte Sauerstoffversorgung bei Polyzythämie die

muskuläre Durchblutung nicht beeinflussen [98, 99]. Schließlich könnten auch die

endothelialen Autakoide NO und Prostazyklin sowie EDHF bei der Gefäßantwort

auf Muskelkontraktionen eine Rolle spielen. NO kann dabei nicht nur von den

Endothelzellen, sondern auch von den Skelettmuskelzellen produziert werden

[100, 101]. Außerdem kommt es in geringen Mengen gebunden an das

Hämoglobin in Erythrozyten vor und kann bei der Deoxygenierung freigesetzt

werden [102]. Nachdem die Bedeutung von NO für die Regulation des Ruhetonus

in Blutgefäßen entdeckt wurde, hoffte man, so auch die funktionelle Hyperämie

erklären zu können, allerdings ließ sich dies nicht oder zumindest nur partiell

bestätigen. Verschiedene Versuche, in denen unter anderem die NO-Produktion

gehemmt wurde, lieferten widersprüchliche Daten [103]. Bei Untersuchungen am

Menschen wurden sowohl Hinweise gegen [104-108] als auch für eine Beteiligung

von NO [109-113] erhoben. Ähnlich uneinheitliche Daten erbrachten Tierversuche

an Nagetieren und Hunden [114-120]. Die Datenlage bezüglich einer Rolle von

Prostazyklin ist ebenso widersprüchlich [121-124]. Beide Substanzen scheinen

also zumindest nicht in jeder Präparation und in jedem Versuchsaufbau zur

funktionellen Hyperämie beizutragen. Trotzdem scheint das Endothel eine

wichtige Funktion hierbei inne zu haben, da eine Zerstörung des Endothels der

zuführenden Blutgefäße im Tierversuch zu einer deutlich reduzierten

Blutflusssteigerung bei Muskelarbeit führte [125, 126]. Trotz zahlreicher

Untersuchungen gibt es also bis heute keine umfassende Aufklärung der

Mechanismen, die der funktionellen Hyperämie bei Skelettmuskelarbeit zu Grunde

liegen.

1.7 Ziel der vorliegenden Arbeit

Es gibt bis heute kein schlüssiges Konzept, wie die drastische

Durchblutungssteigerung bei muskulärer Arbeit und die hierfür notwendige

Dilatation der Widerstandsgefäße zu Stande kommt, obwohl viele beteiligte

Mechanismen gefunden wurden. Der Anteil dieser einzelnen Faktoren ist

allerdings jeweils nur gering und selbst die kombinierte Blockade verschiedener

EINLEITUNG

17

Mechanismen schwächte die Durchblutungssteigerung nur partiell ab. In den

letzten Jahren rückte das Endothel in den Fokus der Untersuchungen zur

funktionellen Hyperämie. Insbesondere EDHF-Typ-Dilatationen und hiermit

einhergehende Membranpotentialänderungen können zu der notwendigen

Koordination des Gefäßverhaltens führen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung der EDHF-Typ-Dilatation bei

der funktionellen Hyperämie im Skelettmuskel der Maus zu untersuchen. Hierzu

wurden Arteriolen im Cremastermuskel während Muskelkontraktionen mittels

Intravitalmikroskopie beobachtet. Da Calcium-abhängige Kaliumkanäle für die

Auslösung einer EDHF-Typ-Dilatation notwendig sind, wurde die funktionelle

Hyperämie in Tieren untersucht, die defizient für diese Kanäle waren. Eine weitere

Differenzierung der beteiligten Kaliumkanäle in ihre Subgruppen wurde durch die

Verwendung von Tieren mit einem selektiven knock-out einzelner Kaliumkanäle

sowie durch pharmakologische Intervention angestrebt. Ob die Ausbreitung einer

Membranpotentialänderung entlang des Endothels ebenso an der funktionellen

Hyperämie beteiligt ist, wurde schließlich an Tieren untersucht, die auf Grund

einer Defizienz für endotheliale Connexine eine gestörte Zellkopplung aufweisen.

MATERIAL & METHODEN

18

2. Material und Methoden

2.1 Versuchstiere

2.1.1 Allgemeines

Als Versuchstiere dienten Mäuse aus verschiedenen Mausstämmen. Die

untersuchten Tiere hatten zum Versuchszeitpunkt ein Gewicht zwischen 22,5 und

41 g und waren 3 bis 13 Monate alt. Die Mäuse wurden in der Tierhaltung des

Instituts für Physiologie der Universität gehalten und teils auch dort gezüchtet. Die

Tiere wurden maximal zu sechst in einem Standard-Makrolonkäfig (Typ 2)

gehalten und hatten Zugang zu Standardfutter und Trinkwasser. Alle Versuche

erfolgten nach den Richtlinien des Deutschen Tierschutzgesetzes und waren

durch das Ministerium für Umwelt, Naturschutz und Landwirtschaft des Landes

Schleswig-Holstein genehmigt (Aktenzeichen V312-72241.122-2, 02.06.2006).

Die Versuchstiere waren zum Teil genetisch modifiziert (Übersicht in Tab. 2.1).

Wt Wildtyptiere

Cx40ko Defizient für Connexin 40 (Cx40 knock-out)

Cx40KI45 Connexin 40-Gen durch Connexin 45-Gen ersetzt (Cx45 knock-in)

IKCa-ko Defizient für den IKCa-Kaliumkanal (IKCa knock-out)

dKCa-ko Defizient für den IKCa-Kaliumkanal und den SKCa-Kaliumkanal

(doppel-knock-out; induzierbarer knock-out, s.u.)

Tabelle 2.1: Versuchstiere

In Cx40ko-Tieren lag ein konventioneller knock-out für Cx40 vor [127], ebenso in

Cx40KI45-Tieren, allerdings war in diesen an Stelle der genetischen Information

für Cx40 das Gen für Cx45 eingefügt, so dass Letzteres exprimiert wurde [128]. In

IKCa-ko-Tieren lag wiederum ein konventioneller knock-out vor, so dass keine IKCa-

Kanäle exprimiert wurden [129]. dKCa-ko-Versuchstiere wurden durch Kreuzung

von IKCa-ko-Tieren mit SKCa-ko-Tieren erzeugt und von Prof. Dr. rer. nat. R. Köhler

zur Verfügung gestellt [130].

MATERIAL & METHODEN

19

Im Gegensatz zum konventionellen knock-out in IKCa-ko-Tieren handelte es sich

bei der genetischen Modifikation der SKCa-ko-Tiere um eine induzierbare

Genausschaltung. Hierbei war eine regulatorische Kassette aus verschiedenen

funktionellen Modulen zwischen dem Promotor des SKCa-Gens und dem

eigentlichen SKCa-Gen eingefügt. Auf den ursprünglichen Promotor folgte die

genetische Information für ein regulatorisches Protein, den Tetracyclin

Transaktivator (tTA), so dass dessen Expression vom SKCa-Promotor gesteuert

wurde. Zusätzlich war eine DNA-Sequenz eingefügt, die eine besonders effiziente

Transkription des tTA-Gens gewährleistet (adenovirus tripartite leader sequence).

Am Ende der eingefügten Genkassette befand sich wiederum ein Promotor (teto5

CMV), der in Anwesenheit von tTA zu einer Transkription des nachfolgenden

SKCa-Gens und so zu einer Expression des SKCa führte [131].

In derartig modifizierten dKCa-ko-Mäusen wird der IKCa nicht exprimiert, während

der SKCa überexprimiert wird, solange die Tiere kein Tetracyclin erhalten. Vor den

Experimenten wurde ihnen allerdings über mindestens 14 Tage statt des

Trinkwassers eine tetracyclinhaltige Lösung angeboten (Doxycyclin, 2 g/l).

Doxycyclin bindet an tTA und inaktiviert dieses Protein, so dass es den teto5-

Promoter nicht mehr aktiviert und die Transkription des SKCa-Gens nicht mehr

stattfindet. Zum Zeitpunkt der Versuche wurde in dKCa-ko-Tieren daher keiner

dieser beiden Kaliumkanäle exprimiert.

Cx40ko-Mäuse, Cx40KI45-Mäuse und entsprechende Wildtyptiere hatten einen

C57Bl/6-Hintergrund und waren 10-fach in diesen Hintergrund zurückgekreuzt.

IKCa- und dKCa-defiziente Tiere hatten einen SV129/C57Bl/6-Mischhintergrund und

als Kontrollen wurden Wildtyptiere mit einem entsprechenden genetischen

Hintergrund verwendet.

2.1.2 Genotypisierung

Zur Genotypisierung wurde den Mäusen im Alter von sechs Wochen ein etwa

einen Millimeter langes Stück der Schwanzspitze abgeschnitten und hieraus die

DNA extrahiert. Dafür wurden die Gewebsproben in Laird-Puffer für 24 Stunden in

einem Wasserbad zusammen mit Proteinase K bei 55 °C verdaut. Anschließend

MATERIAL & METHODEN

20

wurde die Proteinase durch 20-minütiges Erhitzen auf 95 °C inaktiviert und die

DNA mit eiskaltem Isopropanol gefällt, abzentrifugiert (13000 rcf, 15 Min.,

Microzentrifuge MC-13, Fa. Amicon, Witten) und mit Ethanol gewaschen.

Das DNA-Pellet wurde daraufhin in TE-Puffer aufgenommen und mit Hilfe der

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) weiter untersucht. Die PCR ist eine Methode,

mit der eine sehr kleine Menge einer gesuchten DNA in großer Menge amplifiziert

werden kann, wenn die vor und hinter dem gesuchten DNA-Abschnitt liegenden

Basensequenzen bekannt sind. Dies erlaubt es, Primer zu verwenden, die zu

diesen Basensequenzen komplementär sind und so mit ihnen hybridisieren. Zur

Amplifikation wird die zu untersuchende Probe zusammen mit spezifischen

Primern, einer Nukleotidlösung (dNTPs) und einer thermostabilen DNA-

Polymerase (Taq-Polymerase) in einem Thermocycler zyklisch erwärmt und

wieder abgekühlt. Beim ersten Erwärmen werden die beiden Stränge der DNA-

Doppelhelix voneinander getrennt. Wenn der Ansatz nun wieder abgekühlt wird,

binden die Primer an die ihnen komplementären Abschnitte der DNA. Beim

anschließenden Erwärmen auf das Temperaturoptimum der Taq-Polymerase

synthetisiert diese beginnend an den Primern einen neuen DNA-Strang, der

komplementär zu der Matrize ist. Bei einem erneuten Temperaturzyklus wiederholt

sich dieser Vorgang. Die Vervielfältigung erfolgte in einem Thermocycler (iCycler,

Biorad, München). Die Reaktionsansätze, die verwendeten Primer und das

verwendete Programm sind im Anhang angegeben.

Die PCR-Produkte wurden anschließend mit einer Gelelektrophorese aufgetrennt

und identifiziert. Hierbei können DNA-Fragmente in einem Agarosegel durch ein

elektrisches Feld nach ihrer Größe separiert werden. Die Zugabe des DNA-

Interkalators Ethidiumbromid macht die DNA unter UV-Licht sichtbar. Wenn nun

die Größe der gesuchten DNA-Abschnitte bekannt ist, können die Banden

zugeordnet werden, die sich in der Elektrophorese darstellen. Die amplifizierte

DNA wurde in einem 0,5 % Agarosegel, das 0,2 µg/ml Ethidiumbromid enthielt, für

35 min bei 60 mA und 120 V in einer dafür gebauten Gelkammer aufgetrennt. Als

Negativkontrolle diente Wasser und als Referenzskala DNA Ladder Plus (100 bp).

Die Länge der PCR-Produkte und exemplarische Ergebnisse sind in Abbildung 2.1

dargestellt.

MATERIAL & METHODEN

21

1: Cx40+/+

2: Cx40-/-

3: Cx40+/-

4: H2O

5: Marker

1 2 3 4 5

Genotypisierung der Cx40ko-Tiere: Von links nach rechts: In der 1. Spur findet sich die Bande

des PCR-Produkts des Cx40-Gens eines Wildtyptieres (314 bp); daneben die Bande der

funktionslosen Genkassette, durch welche das Cx40-Gen in Cx40ko-Tieren ersetzt ist (494 bp); in

der 3. Spur sieht man amplifizierte DNA eines heterozygoten Tieres, bei dem sowohl das Wildtyp-

als auch das knock-out-Allel gefunden werden; in der vierten und fünften Spur befinden sich

Wasser als Negativkontrolle sowie eine 100-bp-DNA-Ladder als Referenzskala.

1: Cx40+/+ 2: Cx40Cx45KI/Cx45KI

3: Cx40+/Cx45KI

4: H2O

5: Marker

1 2 3 4 5

Genotypisierung der Cx40KI45-Tiere: Links die Bande des Cx40-Gens eines Wildtyptieres (475

bp); rechts daneben die Bande des Cx40KI45-Allels (660 bp); in der 3. Spur beide Banden aus der

DNA eines heterozygoten Tieres; in der 4. und 5. Spur sind Wasser und der Marker aufgetragen.

1: IKCa+/+

2: IKCa-/-

3: IKCa+/-

4: H2O

5: Marker

1 2 3 4 5

Genotypisierung der IK Ca-ko-Tiere: In der 1. Spur ist die Wildtyp-Bande (160 bp), daneben die

Bande des IKCa-ko-Allels (320 bp) zu sehen; die 3. Spur zeigt beide Banden eines heterozygoten

Tieres; die 4. und 5. Spur zeigen wiederum Wasser und den Marker.

Abbildung 2.1: Exemplarische Ergebnisse der Gelelek trophorese zur Genotypisierung der

Versuchstiere

MATERIAL & METHODEN

22

Alle dKCa-ko-Versuchstiere wurden von der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. rer. nat. R.

Köhler genotypisiert. Eine Kontrolle der erfolgten Genausschaltung wurde durch

die fehlende Dilatation nach Applikation von Acetylcholin bei knock-out-Tieren

ermöglicht (siehe Abschnitt 3.3.1).

2.2 Intravitalmikroskopie

2.2.1 Anästhesie und Präparation

Als Versuchstiere für die Intravitalmikroskopie wurden männliche Mäuse

verwendet. Sie wurden durch eine intraperitoneale Injektion eines Opiats

(Fentanyl, 0,05 mg/kg KG), eines Benzodiazepins (Midazolam, 5 mg/kg KG) und

eines zentralen α2-Agonisten (Medetomidin, 0,5 mg/kg KG) narkotisiert. Nach 15

Minuten war bei allen Mäusen das Toleranzstadium erreicht. Vor der eigentlichen

Präparation wurden der Hals und die Leistenregion rasiert.

Im ersten Schritt der Präparation wurde die Trachea freipräpariert, mit zwei Fäden

aufgespannt, inzidiert und mit einem Polyethylenkatheter (PE 50, DI: 0,5 mm, DA:

1 mm) intubiert, um die Spontanatmung der Maus zu erleichtern und das Tier im

Verlauf mechanisch beatmen zu können (Übersicht über die anatomischen

Verhältnisse in Abb. 2.2).

Danach wurde die Vena jugularis freipräpariert, aufgespannt und mit einer

Mikroschere inzidiert. In diese Öffnung wurde nun mit Hilfe eines

Operationsmikroskops (Typ 308 701, Fa. Wild GmbH, Heerbrugg, Schweiz; 6-

fache Vergrößerung) ein weiterer Polyethylenkatheter (PE 10, DI: 0,28 mm, DA:

0,61 mm) eingeführt, um ab diesem Zeitpunkt die Anästhetika mittels eines

Perfusors (Braun Perfusor secura ft, Fa. B. Braun, Melsungen) kontinuierlich

intravenös zu applizieren (Fentanyl 0,001 mg/h, Midazolam 0,1 mg/h,

Medetomidin 0,01 mg/h). Hierzu wurden diese in Ringerlösung verdünnt, die mit

einer Geschwindigkeit von 0,4 ml/h infundiert wurde. So wurden auch

Flüssigkeitsverluste durch die Präparation ausgeglichen. Die intravasale Lage des

Katheters wurde durch die Aspiration von Blut kontrolliert.

MATERIAL & METHODEN

23

Abbildung 2.2: Anatomie in der Halsregion der Maus (Schema)

Die Narkosetiefe wurde anhand des Kornealreflexes der Maus sowie durch die

Reaktion auf mechanische Reize kontrolliert und die Infusionsgeschwindigkeit der

Anästhetika bei Bedarf entsprechend korrigiert.

Anschließend wurde die Maus auf eine speziell angefertigte Unterlage überführt

und die Leistenregion durch einen Schnitt eröffnet. Die Muskelpräparation erfolgte

nach der von Baez 1973 beschriebenen Methode [132] mit geringen

Modifikationen. Der Musculus cremaster wurde an seinem kaudalen Pol gefasst

und schonend von Bindegewebe befreit. Danach wurde er der Länge nach

eröffnet und mit mehreren Fäden über einem Deckglas aufgespannt

(Einzelknopfnähte mit atraumatischem monofilem Polypropylenfaden, 6/0

Prolene®). Das den Hoden und Nebenhoden mit dem M. cremaster verbindende

Bindegewebe wurde eingeschnitten und Hoden und Nebenhoden wurden in die

Bauchhöhle zurückgeschoben, um ein uneingeschränktes Blickfeld auf den M.

cremaster zu ermöglichen (Abb. 2.3).

Speicheldrüsen

V. jugularis

Trachea

MATERIAL & METHODEN

24

Abbildung 2.3: Cremasterpräparation , oben: Schema, unten: Originalbild

Ab der Eröffnung der Leiste wurde der Muskel kontinuierlich mit einer gepufferten

Elektrolytlösung (Krebslösung) superfundiert (8 ml/min). Der Versuchsaufbau für

die Superfusion beinhaltete zwei Gefäße; das größere Vorratsgefäß war über ein

Glasrohr mit der Raumluft verbunden und hatte einen Auslass in ein zweites,

kleineres Gefäß. Durch dieses Glasrohr wurde erreicht, dass im kleineren Gefäß

stets ein konstantes Flüssigkeitsniveau herrschte. So wurde der Druck in dem

nachgeschalteten System konstant gehalten und es konnte über eine

Rollerklemme ein konstanter Superfusionsfluss eingestellt werden. Die

Superfusionslösung wurde über das Lumen des doppelwandigen zweiten Gefäßes

und einen nachgeschalteten Schlangenkühler erwärmt, so dass auf dem Präparat

eine konstante Temperatur von 34 °C erreicht wurde. Die Krebslösung wurde

zusätzlich über eine Fritte mit einem Gasgemisch aus 95 % Stickstoff (N2) und 5 %

Kohlendioxid (CO2) begast, um den pH-Wert bei der gegebenen

Bikarbonatkonzentration auf 7,4 einzustellen (Abb. 2.4).

MATERIAL & METHODEN

25

Abbildung 2.4: Aufbau der Superfusionsvorrichtung (Schema)

Über eine peristaltische Pumpe (Fa. Ismatec, Wertheim-Mondfeld) konnten der

Superfusionslösung vasoaktive Substanzen zugeführt werden, die durch die

Superfusion gegenüber der ursprünglichen Konzentration 1:100 verdünnt wurden.

Im Folgenden wird als Konzentration immer die unmittelbar auf dem Präparat

herrschende Konzentration genannt.

Nach dem Umlagern der Maus auf den Mikroskopierplatz wurde sie über ein

mechanisches Beatmungsgerät (7025 Rodent Ventilator, Fa. Hugo Sachs

Elektronik, Freiburg) ventiliert (Frequenz 160 /min, Beatmungsdruck 2 cmH2O).

Die Effizienz der Beatmung konnte anhand der Thoraxexkursionen beurteilt

werden. Die Unterlage des Mikroskopiertisches war elektrisch beheizbar

(Elektrowerkstatt der Universität), so dass die ösophageal gemessene

Körpertemperatur der Maus bei 37 °C gehalten werden konnte. Nach Ende der

Präparation wurde eine 30-minütige Äquilibrierungsphase eingehalten, bevor das

eigentliche Versuchsprotokoll durchgeführt wurde. In dieser Zeit wurden

Narkosetiefe, Beatmung, Superfusionsfluss und Gefäßtonus im M. cremaster

regelmäßig kontrolliert. Nach Beendigung des Versuchsprotokolls wurden die

Versuchstiere mit einer letalen Dosis Pentobarbital i.v. getötet (0,3 ml, 48 mg).

MATERIAL & METHODEN

26

2.2.2 Mikroskopie

Die Mikrozirkulation im M. cremaster wurde mit einem Mikroskop (Nikon Eclipse

E600, Fa. Nikon, Tokyo, Japan) betrachtet (CFI Planfluor ECWD Objektiv: 20 x /

0,45, Fa. Nikon, Tokyo, Japan) und die mikroskopischen Bilder wurden mit einer

CCD-Kamera (Fa. PCO Computer Optics, Kelheim) auf einen Monitor übertragen

(600-fache Vergrößerung, siehe Abb. 2.5) und auf VHS-Kassette aufgezeichnet

(Videorecorder NV-FS2000, Fa. Panasonic, Osaka, Japan). Während der

Mikroskopie wurde der Muskel kontinuierlich weiter wie oben beschrieben mit

Krebslösung superfundiert.

Abbildung 2.5: Intravitalmikroskopie

(Beispielbild). Im oberen Bildabschnitt

eine Übersicht über einen Teil des

Gefäßbaumes im M. cremaster, unten

ein untersuchter Gefäßabschnitt als

Ausschnittsvergrößerung (links vor,

rechts nach Superfusion von 3 x 10-6 M

ACh). Der weiße Balken entspricht 20

µm.

L 32L 32L 32

MATERIAL & METHODEN

27

2.2.3 Nervenstimulation

Um Muskelkontraktionen auszulösen, wurde unter dem Mikroskop der den Muskel

versorgende Nerv aufgesucht. Als Stimulationselektrode diente eine

Platinelektrode (modifiziert nach Sarelius [133]). Diese bestand aus einem

Elektrodenhalter (Holder MEH7W15, Fa. WPI, Sarasota, USA), dessen Silberdraht

mit einem Platindraht (Durchmesser 25 µm) verbunden wurde. Um den Draht zu

stabilisieren, wurde eine ausgezogene Glaskapillare (Puller Model P2000, Fa.

Sutter Instruments, Novato, USA) über ihn gezogen, an deren Spitze er wenige

Millimeter herausragte. Die Öffnung der Kapillare wurde mit Silikon verschlossen.

Die Elektrode wurde mit Hilfe eines Mikromanipulators (Model M-152, Fa.

Narishige, Tokyo, Japan) unmittelbar an dem Nerven platziert. Als indifferente

Elektrode diente versilberter Kupferdraht (Durchmesser: 0,8 mm), der in die

Superfusionslösung eintauchte (siehe Abb. 2.6).

Zur Stimulation wurde eine Spannung angelegt, bei der es zu deutlich sichtbaren

Muskelkontraktionen kam (etwa 2,5 Volt, WPI Anapulse Stimulator 302-T, Fa.

WPI, Sarasota, USA). Die Stimulationsfrequenz betrug 10 oder 100 Hz. Beide

Stimulationsarten bewirkten makroskopisch deutlich sichtbare Muskel-

kontraktionen, bei Stimulation mit 10 Hz kam es zu Einzelzuckungen, bei 100 Hz

zu einer tetanischen Kontraktion. Der Muskel wurde für 1, 15 oder 60 Sekunden

stimuliert. Während bei der Stimulation über eine Sekunde kontinuierlich stimuliert

wurde, wurde bei den Stimulationen über 15 und 60 Sekunden ein

intermittierendes Stimulationsmuster aus 0,5 s Stimulation und 2,5 s Pause

verwendet (siehe Abb. 2.6). So konnte auch während der Stimulationszeit der

Gefäßdurchmesser ohne Beeinträchtigung durch Muskelkontraktionen betrachtet

werden. Die elektrischen Impulse wurden zur Kontrolle auf einem Oszilloskop (HM

205-3, Hameg Instruments, Mainhausen) dargestellt.

MATERIAL & METHODEN

28

Abbildung 2.6: Stimulation (Schema), oben: Aufbau, unten: zeitlicher Ablauf

2.2.4 Prinzipieller Versuchsablauf

Nach der Äquilibrierungsphase wurden die zu untersuchenden Gefäßabschnitte in

Arteriolen im M. cremaster ausgewählt. Es wurden Gefäße untersucht, die in der

zentralen Region des M. cremaster lagen, einen Ruhetonus aufwiesen und einen

Ruhedurchmesser von etwa 10 bis 20 µm hatten. Dann erfolgten die eigentlichen

Stimulationen (Superfusion mit vasoaktiven Substanzen bzw. elektrisch

herbeigeführte Muskelkontraktionen) und der Gefäßdurchmesser wurde

beobachtet.

Um die Dilatationsfähigkeit eines Gefäßes zu untersuchen, wurden Acetylcholin

(ACh) und Natriumnitroprussid (SNP) superfundiert. ACh wurde in Wasser gelöst

und auf die gewünschte Konzentration verdünnt. SNP wurde erst in

Natriumacetatlösung (1 mM) gelöst (auf 10 mM) und dann mit Wasser weiter auf

die gewünschte Konzentration verdünnt.

MATERIAL & METHODEN

29

In vielen Versuchen wurden außerdem Hemmstoffe bestimmter Enzyme

eingesetzt, um deren Einfluss auf den Gefäßdurchmesser auszuschalten. Hierbei

handelte es sich um Nitro-L-Arginin (L-NA, einen kompetitiven Hemmstoff der

endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase, eNOS) und Indomethacin (Indo, einen

kompetitiven Hemmstoff der Cyclooxygenase, COX). Sie wurden in 0,9 %iger

Natriumchloridlösung gelöst und dann kontinuierlich superfundiert (L-NA: 30 µM,

Indo: 3 µM). Mit beiden Substanzen wird nach einer Inkubationszeit von 30

Minuten eine effektive Hemmung beider Enzyme erreicht [134].

In anderen Versuchen wurde UCL 1684 eingesetzt, um den SKCa-Kaliumkanal

spezifisch zu blockieren [135-137]. Es wurde in 100 %iger DMSO-Lösung gelöst

(10 mM), mit Wasser verdünnt und dann kontinuierlich superfundiert (1 µM). Die

Experimente wurden nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten begonnen, da

nach dieser Zeit eine suffiziente Blockade des SKCa zu erwarten ist.

Um den maximalen Durchmesser der untersuchten Gefäße zu bestimmen, wurde

das Präparat am Ende jedes Versuches mit supramaximalen Konzentrationen von

ACh, SNP und Adenosin superfundiert (jeweils 30 µM) und der resultierende

Durchmesser bestimmt.

2.2.5 Stimulationen mit vasoaktiven Substanzen

Um die Wirkung von ACh und SNP in verschiedenen Konzentrationen (10-7 bis

10-5 M) auf den Durchmesser der Arteriolen zu untersuchen, wurden pro

Versuchstier bis zu zehn Gefäßstellen unmittelbar vor und nach Zugabe des

jeweiligen Agonisten aufgesucht und es wurden Bildsequenzen der

Gefäßabschnitte aufgezeichnet. Das Aufsuchen von zehn verschiedenen

Gefäßabschnitten erfolgte in etwa einer Minute. Nachdem der Ruhedurchmesser

der Gefäße wieder annähernd erreicht war, wurde dieser Ablauf mit der

nächsthöheren Konzentration wiederholt.

MATERIAL & METHODEN

30

2.2.6 Untersuchungen zur funktionellen Hyperämie

Um die Gefäßreaktion auf muskuläre Arbeit zu untersuchen, wurde pro

Versuchstier eine Arteriole im Muskel betrachtet, die in der Nähe des stimulierten

motorischen Nerven und nicht unmittelbar benachbart zu einer Vene lag, um die

Diffusion von vasoaktiven Substanzen aus dem venösen Blut auszuschließen. Der

Durchmesser dieser Arteriole wurde sowohl unter Ruhebedingungen als auch bei

muskulärer Arbeit untersucht. Die muskuläre Arbeit wurde durch elektrische

Stimulation (siehe Abschnitt 2.2.3) nach dem Protokoll in Tab. 2.2 induziert.

Stimulation Dauer (s) Frequenz (Hz) Modus

1 1 10 Kontinuierlich

2 1 100 Kontinuierlich

3 15 10 Intermittierend




Tabelle 2.2: Charakteristika der elektrischen Stimu lation zur Auslösung von Kontraktionen

Die Arteriolen wurden jeweils eine halbe Minute vor, während und zwei Minuten

nach der Stimulation aufgezeichnet. Die nächste Stimulation wurde erst

angewendet, nachdem die Gefäße ihren Ruhedurchmesser wieder erreicht hatten.

Zusätzlich wurde auch bei diesen Versuchen die durch Superfusion von ACh und

SNP (3 x 10-6 M) induzierte Durchmesseränderung untersucht.

2.2.7 Auswertung und Statistik

Die Bilder wurden zur Auswertung digitalisiert und die Auswertung erfolgte am

Computer mit handelsüblicher Laborsoftware (LABView, Fa. Texas Instruments,

Austin, USA), die im Institut für Physiologie an die Erfordernisse angepasst

worden war. Im Fall der Stimulation mit vasoaktiven Substanzen erfolgte eine

Durchmesserbestimmung der Gefäße zu einem Zeitpunkt unmittelbar vor bzw.

nach der Applikation der Agonisten. In Versuchen zur funktionellen Hyperämie

MATERIAL & METHODEN

31

erfolgte die Auswertung kontinuierlich über die Beobachtungszeit mit zwei

Messwerten pro Sekunde. In beiden Fällen wurden die Gefäßwände durch den

Auswertenden mit Hilfe der Maus bzw. der Cursortasten markiert und daraus der

Durchmesser errechnet (siehe Abb. 2.7). Die theoretisch erreichbare Auflösung

hierbei betrug 0,5 µm. Das Messsystem war zuvor mit einem Objektmikrometer

kalibriert worden.

Abbildung 2.7: Computergestützte

Auswertung des Gefäßdurch-

messers. Die Gefäßwände wurden

mit Hilfe der Cursortasten mit einem

Kasten markiert und hieraus der

Durchmesser errechnet.

Um Dilatationen in Gefäßen mit unterschiedlichem Ruhe- und Maximal-

durchmesser vergleichen zu können, wurde der Gefäßdurchmesser als Prozent

der maximal möglichen Dilatation angegeben und nach der folgenden Formel

berechnet:

% der maximalen Dilatation = [(D – D0) / (Dmax - D0)] x 100

D : Durchmesser des Gefäßes zum Beobachtungszeitpunkt

D0 : Ruhedurchmesser des Gefäßes unmittelbar vor der Stimulation

Dmax : Maximaler Durchmesser des Gefäßes

Bei einer Konstriktion des beobachteten Gefäßes erfolgte eine entsprechende

Berechnung nach der folgenden Formel:

% der maximalen Dilatation = (D / D0 x 100) – 100

MATERIAL & METHODEN

32

Der Tonus (Kontraktionszustand) eines Gefäßes wurde nach der folgenden

Formel berechnet und ist daher als dimensionslose Zahl angegeben:

Tonus = D0 / Dmax

Nach dieser Berechnung entspricht eine kleine Zahl einem hohen

Kontraktionszustand des Gefäßes.

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm Stata 8.0 (Fa. Stata Corp.

LP, College Station, USA), die graphische Darstellung mit dem Programm

SigmaPlot 2001 (Fa. SPSS Inc., Chicago, USA).

In die Analyse wurden nur Versuche einbezogen, bei denen das Protokoll

vollständig durchgeführt werden konnte. Die Ergebnisse sind im Folgenden als

Mittelwert ± Standardfehler (MW ± SEM) angegeben. Innerhalb einer Gruppe

wurden die Daten mittels des gepaarten t-tests verglichen, bei Vergleichen

zwischen verschiedenen Gruppen wurde eine Varianzanalyse durchgeführt. Bei

Mehrfachvergleichen wurde eine Korrektur nach Bonferoni angewendet.

Unterschiede wurden bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % (p ≤ 0,05) als

signifikant erachtet.

2.3 Textverarbeitung

Als Textverarbeitungsprogramm zur Verfassung der Dissertation diente Microsoft

Word 2002 (Fa. Microsoft, Seattle, USA), die Literaturverwaltung erfolgte mit

Endnote 9.0 (Fa. Thomson Scientific, Philadelphia, USA). Zum Erstellen einiger

Abbildungen dienten Microsoft Paint 5.1 und Microsoft Powerpoint 2002 (beides

Fa. Microsoft, Seattle, USA).

ERGEBNISSE

33

3. Ergebnisse

3.1 Gefäßdilatationen durch vasoaktive Substanzen

Zunächst wurde die Gefäßreaktion auf Acetylcholin (ACh) sowie auf

Natriumnitroprussid (SNP) in Wildtyp- und Cx40-defizienten Tieren analysiert. So

kann die Dilatationsfähigkeit der Gefäße beurteilt werden und es wird deutlich, ob

das Endothel in den knock-out-Mäusen trotz des veränderten Genotyps noch in

der Lage ist, eine suffiziente Gefäßdilatation hervorzurufen. Die Versuche wurden

in Anwesenheit von Indomethacin (Indo) und Nitro-L-Arginin (L-NA) wiederholt, um

den Effekt einzelner endothelialer Signalwege bei der Dilatation zu differenzieren.

3.1.1 Dilatationen nach Applikation von ACh und SNP in Wildtyptieren

Es wurden 42 verschiedene Gefäße in 5 Tieren untersucht. Das Alter der Tiere

betrug zum Zeitpunkt der Versuche 6 ± 0,6 Monate, das Gewicht 28,3 ± 1,3 g. Der

Ruhedurchmesser der betrachteten Gefäße lag bei 12,3 ± 1,3 µm und der

Ruhetonus bei 0,47 ± 0,03. Der Maximaldurchmesser war 25,1 ± 1,2 µm. Die

Applikation ansteigender Konzentrationen von ACh führte zu einer

konzentrationsabhängigen Gefäßdilatation. Eine etwas geringer ausgeprägte

Dilatation wurde bei Gabe von SNP beobachtet (Abb. 3.1). Der Ruhedurchmesser

verringerte sich nach Inkubation mit Indo und L-NA signifikant auf 7,9 ± 0,9 µm (p

≤ 0,001) und somit war der Ruhetonus unter diesen Bedingungen ausgeprägter

(0,31 ± 0,02; p ≤ 0,001). Die Gefäßantwort auf ACh war nach dieser Behandlung

bei allen verwendeten Konzentrationen signifikant reduziert (p ≤ 0,01), es verblieb

jedoch eine deutlich ausgeprägte Dilatation. Im Gegensatz dazu war die

Gefäßdilatation auf SNP im Wesentlichen unverändert (Abb. 3.1). Dies zeigt, dass

ein geringer Anteil der ACh-vermittelten Dilatation im untersuchten Gefäßgebiet

durch NO und Prostaglandine vermittelt wird, die Dilatationsfähigkeit der

Gefäßmuskulatur bleibt jedoch nach Blockade dieser beiden Signalwege

unverändert.

ERGEBNISSE

34

* *

**

*

SN P [log m ol/l]

-7 -6 -5

% d

er m

axim

alen

Dila

tatio

n

0

30

60

90

*

ACh [log m ol/l]

-7 -6 -5

% d

er m

axim

alen

Dila

tatio

n

0

30

60

90 Kontro lleIndo & L-NA

Abbildung 3.1: Dilatationen nach Applikation von AC h und SNP in Wildtyptieren. Dargestellt

ist die Gefäßdilatation, die durch Applikation steigender Konzentrationen von Acetylcholin (ACh,

links) und Natriumnitroprussid (SNP, rechts) hervorgerufen wurde. Nach Inkubation mit

Indomethacin und Nitro-L-Arginin (Indo & L-NA, offene Kreise) war die Dilatation auf ACh

signifikant abgeschwächt (p ≤ 0,01 bei allen Konzentrationen), die Dilatation auf SNP war jedoch

unverändert (rechts: *: p ≤ 0,05) (n = 42 Gefäße in 5 Tieren, MW ± SEM).

3.1.2 Dilatationen nach Applikation von ACh und SNP in Cx40-defizienten

Tieren

In Cx40ko-Tieren wurden 40 Gefäße in 4 Tieren, in Cx40KI45-Tieren 62 Gefäße in

6 Tieren untersucht. Es gab weder beim Alter (Cx40ko: 5,3 ± 0,6 Monate;

Cx40KI45: 7 ± 0,6 Monate), noch beim Gewicht der Tiere (Cx40ko: 26,4 ± 1,4 g;

Cx40KI45: 27,5 ± 0,8 g) einen signifikanten Unterschied zu den Kontrolltieren.

Weder der Ruhedurchmesser noch der Ruhetonus der Gefäße unterschied sich

von dem in Wildtyptieren (Cx40ko: 13,5 ± 1,5 µm bzw. 0,45 ± 0,04; Cx40KI45:

12,3 ± 1,0 µm bzw. 0,46 ± 0,02). Lediglich der Maximaldurchmesser der

untersuchten Gefäße der Cx40ko-Tiere (28,4 ± 1,0 µm) war etwas größer als der

in Wildtyptieren (25,1 ± 1,2 µm; p ≤ 0,05). Der Maximaldurchmesser in den

Cx40KI45-Tieren (26,5 ± 1,3 µm) unterschied sich dagegen nicht von dem der

Kontrolltiere. In beiden Genotypen kam es ähnlich wie in Wildtyptieren zu einer

zunehmenden Gefäßdilatation mit ansteigenden Konzentrationen von ACh. Diese

Dilatationen wichen nicht signifikant von denen in Wildtyptieren ab (Abb. 3.2). Das

Endothel in den gentechnisch veränderten Tieren war also in der Lage, intakte

Dilatationen auszulösen.

ERGEBNISSE

35

ACh [log m ol/l]

-7 -6 -5

% d

er m

axim

alen

Dila

tatio

n

0

30

60

90

AC h [log m ol/l]

-7 -6 -5

% d

er m

axim

alen

Dila

tatio

n

0

30

60

90

W ildtyp

C x40KI45

W ildtyp

C x40ko

Abbildung 3.2: Gefäßantwort auf ACh in Cx40-defizie nten Tieren. Die durch ACh

hervorgerufene Vasodilatation war in Cx40ko-Tieren (offene Kreise, links) und in Cx40KI45-Tieren

(offene Kreise, rechts) im Vergleich zu der Dilatation in Wildtyptieren (geschlossene Kreise)

vollständig intakt (n = 42-62 Gefäße in 4-6 Tieren, siehe Text, MW ± SEM).

In beiden Genotypen kam es auch zu einer konzentrationsabhängigen Dilatation

bei Applikation von SNP bis auf 41,6 ± 4,0 (Cx40ko) bzw. 55,5 ± 3,7 (Cx40KI45) %

der maximalen Dilatation bei der höchsten verwendeten Konzentration (10-5 M).

Diese SNP-induzierten Dilatationen unterschieden sich nicht signifikant von den

Dilatationen in der Kontrollgruppe.

3.2 Charakteristika der funktionellen Hyperämie

3.2.1 Abhängigkeit von Stimulationsdauer und -frequ enz

Die funktionelle Hyperämie wurde zunächst in Tieren mit einem genetischen Bl6-

Hintergrund untersucht. Sie waren zum Zeitpunkt der Versuche 6,3 ± 0,4 Monate

alt und 26,8 ± 0,5 g schwer. Der Ruhedurchmesser der untersuchten Gefäße

betrug 15,0 ± 0,9 µm, der Maximaldurchmesser 32,4 ± 2,0 µm.

Der Durchmesser der Arteriolen war unter Ruhebedingungen konstant.

Unmittelbar mit Beginn der Nervenstimulation kam es zu einer Dilatation, die je

nach Stimulationsart unterschiedlich stark ausgeprägt war. Nach den

Muskelkontraktionen kehrten die untersuchten Gefäße innerhalb weniger Minuten

wieder zu ihrem Ursprungsdurchmesser zurück (Abb. 3.3).

ERGEBNISSE

36

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180 210

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

1s15s 60s

Abbildung 3.3: Zeitlicher Verlauf der Dilatation in Abhängigkeit von der Stimulationsdauer.

Gefäßdurchmesser als % der maximalen Dilatation nach unterschiedlich langer Nervenstimulation

mit 100 Hz aufgetragen über die Zeit (Stimulationsbeginn bei t = 0 s). Die vertikalen gestrichelten

Linien deuten das Ende der Stimulation bei 15 und 60 s an. Die Amplitude und Dauer der Dilatation

stiegen mit zunehmender Stimulationsdauer an. Zum Zweck einer besseren Übersichtlichkeit sind

nur Mittelwerte ohne Standardfehler dargestellt (jeweils n = 10).

Das Maximum der Gefäßdilatation wurde unmittelbar nach Ende der Stimulationen

erreicht und daher wurde der Gefäßdurchmesser zum Zeitpunkt 3 s nach Ende

der Nervenstimulation in den Versuchen jeweils als Amplitude der Gefäßdilatation

verwendet (siehe auch Abb. 3.4). Durch Wahl dieses Zeitpunktes kurz nach

Stimulationsende konnten Artefakte durch Bewegungen des Präparates und durch

evtl. erforderliches erneutes Fokussieren vermieden werden.

Weiterhin hing die Amplitude der Gefäßdilatation von der Stimulationsfrequenz ab.

So wurde nach Stimulation mit 100 Hz ein signifikant größerer Gefäßdurchmesser

unmittelbar nach den Muskelkontraktionen beobachtet als nach Stimulation mit 10

Hz (p ≤ 0,01; Abb. 3.4).

ERGEBNISSE

37

Abbildung 3.4: Amplitude der

Dilatation bei verschiedenen

Stimulationen. Die Amplitude der

Gefäßdilatation am Stimulationsende

stieg mit zunehmender Stimulations-

dauer (1, 15 und 60 s) und war nach

Stimulation mit 100 Hz (grau)

signifikant größer als nach

Stimulation mit 10 Hz (weiß) (p ≤

0,01) (jeweils n = 10, MW + SEM).

3.2.2 Einfluss von Indomethacin und Nitro- L-Arginin

Um die beteiligten endothelialen Mechanismen zu differenzieren, wurden die

Stimulationen nach pharmakologischer Blockade von COX und eNOS wiederholt.

Die Behandlung mit den beiden oben genannten Substanzen führte zu einer

geringen Abnahme des Ruhedurchmessers auf 11,3 ± 1,2 µm (p ≤ 0,05).

Auch in Anwesenheit von Indo und L-NA kam es zu einer Gefäßerweiterung nach

Muskelkontraktionen bei Stimulation mit 100 Hz, die nach der Stimulation in

wenigen Minuten wieder zurückging. Die Dilatation war im Vergleich zur Kontrolle

nach Stimulation über 60 s geringfügig reduziert, jedoch nicht nach den kürzeren

Stimulationen. Die Anstiegssteilheit der Dilatation blieb nach Behandlung mit Indo

und L-NA unverändert. Der zeitliche Verlauf ist in Abb. 3.5 dargestellt (zum Zweck

einer besseren Übersichtlichkeit sind nur Mittelwerte ohne Standardfehler

abgebildet).

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

1s

10 Hz

100 Hz

60s15s

*

* *

ERGEBNISSE

38

Die maximale Amplitude der Dilatation unmittelbar nach Ende der

Muskelkontraktionen war lediglich nach der längsten Stimulation signifikant

reduziert (p ≤ 0,05), bei den kürzeren Stimulationen ergaben sich dagegen keine

signifikanten Unterschiede (Abb. 3.6).

Abbildung 3.6: Amplitude der Dilatation

bei 100 Hz-Stimulation nach Blockade

von COX und eNOS. Die Amplitude der

Gefäßdilatation nach Stimulation mit 100

Hz war nach Inkubation mit Indo und L-NA

(grau) lediglich nach der längsten

Stimulation signifikant reduziert (p ≤ 0,05),

nicht jedoch bei kürzerer Stimulation (1 s,

15 s) (n = 10, MW + SEM).

In Anwesenheit der beiden pharmakologischen Hemmstoffe kam es nach

Stimulation mit 10 Hz ebenso zu einer Gefäßdilatation, die jedoch nach keiner der

Stimulationen signifikant gegenüber den Kontrollbedingungen vermindert war

(Abb. 3.7). Eine Tendenz zu einer leichten Abschwächung war lediglich nach der

längsten Stimulation zu erkennen.

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

15 s1 s

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

60 s

Indo & L-NA

Kontrolle

Abbildung 3.5: Funktionelle Hyperämie

nach Blockade von COX und eNOS. Die

Gefäßdilatation nach Stimulation mit 100 Hz

über 1, 15 und 60 s war nach Inkubation mit

Indo und L-NA (grau) gegenüber den

Kontrollbedingungen (schwarz) lediglich bei 60

s geringfügig abgeschwächt (jeweils n = 10).

1s 60s15s

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

*

100 Hz

Kontrolle

Indo & L-NA

ERGEBNISSE

39


bei 10 Hz-Stimulation nach Blockade

von COX und eNOS. Die Gefäßdilatation

nach Stimulation mit 10 Hz war nach

Inkubation mit Indo und L-NA (grau)

gegenüber der Dilatation unter

Kontrollbedingungen (schwarz) nicht

signifikant vermindert (n = 10, MW + SEM).

Zusammengefasst zeigen diese Versuche, dass NO und Prostaglandine nicht

wesentlich zur Gefäßdilatation bei der funktionellen Hyperämie in der Maus

beitragen.

3.3 Rolle von K Ca bei der funktionellen Hyperämie

3.3.1 Rolle von endothelialen K Ca-Kanälen

Eine endotheliale Hyperpolarisation, die durch KCa-Kanäle initiiert wird, ist

möglicherweise bei der funktionellen Hyperämie beteiligt. Daher wurden Tiere

untersucht, die sowohl für den IKCa- als auch für den SKCa-Kaliumkanal defizient

waren (dKCa-ko-Tiere, siehe Abschnitt 2.1.1). Die Gefäßreaktion auf 3 x 10-6 M

ACh diente als Kontrolle, um den erfolgreichen KCa knock-out zu belegen. In

knock-out-Tieren ist keine wesentliche Dilatation nach Applikation von ACh zu

erwarten [138].

Von sieben untersuchten Tieren zeigten zwei eine deutliche Reaktion auf ACh

(39,7 und 66,8 % der maximal erreichbaren Dilatation). In den übrigen Tieren (n =

5) zeigte sich keine signifikante Dilatation nach Gabe von ACh (9,2 ± 1,8 % der

maximalen Dilatation; Spannweite: 4 – 13,2; p ≤ 0,01). In allen sieben Tieren fand

sich eine intakte Reaktion auf SNP (65,2 ± 5,5; Spannweite: 42,0 – 78,2). Das

Kontrollkollektiv zu den dKCa-ko-Tieren bestand aus fünf Wildtyptieren, die

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100 10 Hz

1s 60s15s

Kontrolle

Indo & L-NA

ERGEBNISSE

40

Wurfgeschwister der dKCa-ko-Tiere waren. In diesen ergaben sich deutliche

Reaktionen auf ACh (74,1 ± 4,1; Spannweite: 64,9 – 86,1) und SNP (49,4 ± 8,8;

Spannweite: 29,8 – 72,6). Für die weitere Analyse wurden die zwei dKCa-ko-Tiere,

in denen sich eine Reaktion auf ACh gezeigt hatte, ausgeschlossen, da

anzunehmen ist, dass der SKCa knock-out in diesen Tieren nicht vollständig war.

Es verblieben also jeweils fünf Tiere, die in die Analyse einbezogen wurden. In

diesen unterschied sich die Gefäßantwort auf ACh signifikant (p ≤ 0,001), während

die Dilatation auf SNP in beiden Genotypen identisch war (Abb. 3.8).

Abbildung 3.8: Gefäßantwort auf ACh und SNP in Wildtyp- und dK Ca-ko-Tieren. Links: Die

Dilatation auf ACh war in dKCa-ko-Tieren (hellgrau) im Vergleich zur Dilatation in Wildtyptieren

(dunkelgrau) signifikant vermindert (p ≤ 0,001). Rechts: Die Dilatation auf SNP unterschied sich im

Gegensatz hierzu nicht (p = 0,14). Dies zeigt einen erfolgten SKCa knock-out in den genetisch

veränderten Tieren (siehe Text) (jeweils n = 5, MW ± SEM).

dKCa-ko-Tiere und deren Kontrollen unterschieden sich nicht in Alter (Wildtyp (Wt):

9,2 ± 0,4 Monate; dKCa-ko: 9,2 ± 0,8 Monate) und Gewicht (Wt: 31,1 ± 2,1 g; dKCa-

ko: 27,8 ± 1,1 g). Der Ruhedurchmesser (Wt: 11,4 ± 1,5 µm; dKCa-ko: 11,2 ± 1,9

µm) und der Maximaldurchmesser (Wt: 33,9 ± 3,2 µm; dKCa-ko: 35,0 ± 2,8 µm) der

untersuchten Gefäße waren ebenfalls gleich.

Sowohl in Wildtyptieren als auch in dKCa-ko-Tieren führten die Muskel-

kontraktionen nach Nervenstimulation mit 100 Hz zu einer deutlichen

Gefäßdilatation, deren Amplitude von der Stimulationsdauer abhing. Die in

Abschnitt 3.2 dargestellten funktionellen Gesetzmäßigkeiten bezüglich der

Abhängigkeit der Dilatation von Stimulationsdauer und -frequenz galten auch hier.

Die Gefäßreaktion in dKCa-ko-Tieren war im Vergleich zur Antwort in der

ACh

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

Minimum

Maximum

Wildtyp dKCa-ko

*

SNP

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

Wildtyp dKCa-ko

ERGEBNISSE

41

Kontrollgruppe deutlich abgeschwächt und auch die Anstiegssteilheit der Dilatation

war in diesen Tieren vermindert (zeitlicher Verlauf der Dilatation in Abb. 3.9).

Die Amplitude der Dilatation am Ende der Muskelkontraktionen war um etwa die

Hälfte verringert (p ≤ 0,01; Abb. 3.10).

Die Stimulation mit 10 Hz führte in knock-out-Tieren zu keiner signifikanten

Dilatation. Der Unterschied zu Kontrolltieren war bei den längeren Stimulationen

statistisch belegbar (p ≤ 0,05 nach 15 und 60 s; Abb. 3.11).

Eine intakte Dilatation bei der funktionellen Hyperämie ist also auf das

Vorhandensein der endothelialen KCa-Kanäle angewiesen.


Dilatation in dK Ca-ko-Tieren bei 100 Hz-

Stimulation. In den dKCa-ko-Tieren war die

Gefäßantwort auf muskuläre Arbeit (grau)

bei sämtlichen Stimulationsdauern

verglichen mit Wildtyptieren (schwarz)

drastisch reduziert (p ≤ 0,01) (n = 5, MW +

SEM).

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

15 s1 s

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

60 s

dKCa-ko

Wildtyp

Abbildung 3.9: Funktionelle Hyperämie in

dKCa-ko-Tieren. Die Gefäßdilatation nach

Muskelkontraktionen (Stimulation mit 100 Hz)

über 1, 15 und 60 s war in dKCa-ko-Tieren

(grau) gegenüber der Dilatation in Wildtyp-

tieren (schwarz) deutlich abgeschwächt

(jeweils n = 5).

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100100 Hz

1s 60s15s

Wildtyp

dKCa-ko

**

*

ERGEBNISSE

42


in dK Ca-ko-Tieren bei 10 Hz-Stimulation.

In dKCa-ko-Tieren führte die Stimulation mit

10 Hz zu keiner signifikanten Gefäß-

dilatation. Der Unterschied zu Wildtyptieren

war signifikant nach 15- und 60-sekündiger

Stimulation (p ≤ 0,001 bzw. p ≤ 0,05), nicht

jedoch nach Stimulation über 1 s (p = 0,13)

(n = 5, MW + SEM).

Um zu untersuchen ob der Verlust der Dilatation durch die Aktivierung von KCa-

Kanälen in diesen Tieren durch andere endotheliale Mechanismen kompensiert

wird, wurden die Versuche in Anwesenheit von Indo und L-NA wiederholt. Sowohl

der Ruhedurchmesser der untersuchten Gefäße (11,6 ± 1,2 µm) als auch die

Dilatation nach Gabe von ACh (0,1 ± 5,0) und SNP (52,4 ± 15,1) änderten sich

durch diese Behandlung nicht. Die Gefäßdilatation nach Stimulation mit 100 Hz

war unter diesen Bedingungen vollständig ausgeprägt (Abb. 3.12). Ebenso kam es

nach Muskelkontraktionen mit 10 Hz zu keiner signifikanten Reduktion der

Dilatation (1 s: -2,6 ± 5,5; 15 s: 1,8 ± 4,1; 60 s: 15,8 ± 8,2 % der max. Dilatation).

Wie auch schon für Wildtyptiere gezeigt werden konnte (siehe Abschnitt 3.2.2),

tragen NO und Prostaglandine also auch in dKCa-ko-Tieren nicht zur Dilatation bei

der funktionellen Hyperämie bei.


in dK Ca-ko-Tieren nach Blockade von

COX und eNOS. Nach Blockade des

Einflusses von NO und Prostaglandinen

durch Indo und L-NA zeigten sich in dKCa-

ko-Tieren intakte Gefäßdilatation (n = 5,

MW + SEM).

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

1s 60s15s

Wildtyp

dKCa-ko

*

*

10 Hz%

der

max

. Dila

tatio

n

0

20

40

60

80

100

1s 60s15s

Kontrolle

Indo & L-NA

100 Hz

ERGEBNISSE

43

3.3.2 Rolle des IK Ca

Um zwischen den beteiligten endothelialen KCa-Kanälen (IKCa und SKCa) weiter zu

differenzieren, wurden Tiere untersucht, die defizient für nur den IKCa-Kanal

waren. Als Kontrollen wurden Wildtyptiere (Wurfgeschwister) verwendet. Die

genetisch modifizierten Tiere und die Kontrolltiere unterschieden sich nicht

signifikant in Bezug auf Alter (Wt: 9,8 ± 1,0 Monate; IKCa-ko: 8,4 ± 1,0 Monate) und

Gewicht (Wt: 35,2 ± 0,8 g; IKCa-ko: 34,3 ± 1,2 g). Der Ruhedurchmesser (Wt: 11,5

± 0,8 µm; IKCa-ko: 9,6 ± 1,2 µm) und der maximale Durchmesser (Wt: 32,2 ± 3,4

µm; IKCa-ko: 31,8 ± 2,5 µm) der untersuchten Gefäße waren ebenfalls nicht

verschieden. In den Wildtyptieren kam es zu Dilatationen, die nicht wesentlich von

den in Abschnitt 3.2 dargestellten Daten abwichen, die in Tieren mit einem

genetischen Bl6-Hintergrund erhoben wurden. In IKCa-ko-Tieren war die Dilatation,

die durch Superfusion von 3 x 10-6 M ACh hervorgerufen wurde, signifikant

gegenüber der Dilatation in Wildtyptieren verringert (Wt: 74,9 ± 7,2; IKCa-ko: 40,2 ±

11,4; p ≤ 0,05), während die Dilatation nach Applikation von SNP unverändert war

(Wt: 44,3 ± 4,9; IKCa-ko: 37,5 ± 4,6).

Die Dilatation in Folge der Nervenstimulation mit 100 Hz war in IKCa-ko-Tieren

nicht vermindert und im Vergleich zu Wildtyptieren tendenziell sogar eher

verstärkt. Die Anstiegssteilheit der Kurve war in beiden Genotypen identisch

(zeitlicher Verlauf in Abb. 3.13).

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

15 s1 s

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

60 s

IKCa-ko

Wt


in IK Ca-ko-Tieren (Stimulation mit 100 Hz).

In IKCa-defizienten Tieren (grau) kam es nach

Nervenstimulation zu einer intakten Gefäß-

dilatation, die im Vergleich zur Dilatation in

Kontrolltieren (schwarz) sogar tendenziell

verstärkt war (jeweils n = 5).

ERGEBNISSE

44

Die maximale Amplitude der Dilatation nach Stimulation mit 100 Hz war in diesen

Tieren nicht vermindert und bei der kürzesten Stimulation sogar signifikant größer

als in Wildtyptieren. Nach Stimulation mit 10 Hz kam es ebenso zu einer

Dilatation, die tendenziell stärker ausfiel als in Kontrolltieren. Dieser Effekt war

nach Stimulation über 60 s auch statistisch belegbar (p ≤ 0,05, Abb. 3.14).

IKCa-Kanäle tragen also nicht wesentlich zur Gefäßdilatation bei der funktionellen

Hyperämie bei.

Abbildung 3.14: Amplitude der Dilatation in IK Ca-ko-Tieren. Die Dilatation am Ende der

Stimulation mit 100 Hz (links) und 10 Hz (rechts) war in IKCa-defizienten Tieren (grau) im Vergleich

zu Kontrolltieren (schwarz) nicht vermindert, sondern sogar etwas verstärkt (p-Werte im Diagramm,

*: p ≤ 0,05) (jeweils n = 5, MW + SEM).

3.3.3 Rolle des SK Ca

In IKCa-ko-Tieren und deren Kontrollen wurde zusätzlich der SKCa mit dem

spezifischen Kanal-Blocker UCL 1684 blockiert, um die Rolle dieses zweiten

Kaliumkanals zu untersuchen. In Wildtyptieren dieser Serie war die Gefäßantwort

auf Superfusion von 3 x 10-6 M ACh nach der Inkubation mit UCL 1684 nicht

signifikant verändert (63,5 ± 4,0; p = 0,20), ebenso die Dilatation nach Applikation

von SNP (54,0 ± 8,1; p = 0,33). Der Ruhedurchmesser der untersuchten Gefäße

war in Anwesenheit von UCL 1684 ebenfalls unverändert (10,3 ± 1,1 µm). Im

Gegensatz dazu war die Gefäßdilatation nach Stimulation mit 100 Hz deutlich

abgeschwächt (zeitlicher Verlauf in Abb. 3.15).

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

1s 60s15s

10 Hz

*

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

1s 60s15s

100 Hz

Wildtyp

IKCa-ko

*

0,07

0,07

ERGEBNISSE

45

Die maximale Amplitude der Dilatation war in Anwesenheit von UCL 1684 um

etwa die Hälfte vermindert (Abb. 3.16).


Dilatation nach 100 Hz-Stimulation nach

pharmakologischer Blockade des SK Ca.

Die Gefäßdilatation nach 100 Hz-

Stimulation war in Wildtyptieren nach

Inkubation mit UCL 1684 (grau) gegenüber

den Kontrollbedingungen (schwarz)

deutlich reduziert (*:p ≤ 0,05, sonst

angegeben) (n = 5, MW + SEM).

In IKCa-ko-Tieren war die Dilatation bei Gabe von 3 x 10-6 M ACh nach Inkubation

mit UCL 1684 komplett aufgehoben, während die Gabe von 3 x 10-6 M SNP auch

hier zu voll ausgeprägten Dilatationen führte (Abb. 3.17). Der Ruhedurchmesser

der Gefäße war unter diesen Bedingungen unverändert (8,6 ± 0,7 µm).

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

15 s1 s

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

60 s

UCL 1684

Kontrolle

Abbildung 3.15: Funktio nelle Hyperämie

nach Blockade des SK Ca in Wildtyptieren

(Stimulation mit 100 Hz). Inkubation mit

dem SKCa-Blocker UCL 1684 (grau) führte zu

einer deutlichen Reduktion der Dilatation bei

muskulärer Aktivität verglichen mit den

Kontrollbedingungen (schwarz) (n = 5).

1s 60s15s

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100100 Hz

Kontrolle

UCL 1684

*

0,06

*

ERGEBNISSE

46

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

15 s1 s

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

60 s

UCL 1684

Kontrolle

Abbildung 3.17: Gefäßantwort auf ACh und SNP in IK Ca-ko-Tieren nach Blockade des SK Ca.

In IKCa-ko-Tieren war die Dilatation auf ACh nach Inkubation mit UCL 1684 (1 µM) vollständig

aufgehoben (links, p ≤ 0,05). Die Dilatation nach Gabe von SNP blieb dagegen unverändert

(rechts) (n = 5, MW ± SEM).

Die Blockade des SKCa-Kaliumkanals mit UCL 1684 reduzierte in IKCa-defizienten

Tieren wie auch schon in Wildtyptieren die Anstiegssteilheit und die

Gefäßdilatation nach 100 Hz-Stimulation insgesamt drastisch, der zeitliche Verlauf

ist in Abb. 3.18 dargestellt.

Auch die Amplitude der Dilatation am Ende der Muskelkontraktionen war nach 100

Hz- und 10 Hz-Stimulation deutlich reduziert (p ≤ 0,05; Abb. 3.19).

Zusammengefasst zeigen diese Befunde, dass ein wesentlicher Anteil der

Dilatation bei der funktionellen Hyperämie durch SKCa vermittelt wird.

SNP

% d

er m

ax. D

ilata

tion

-20

0

20

40

60

Kontrolle UCL 1684

ACh%

der

max

. Dila

tatio

n

-20

0

20

40

60

Kontrolle UCL 1684

*

Minimum

Maximum


nach Blockade des SK Ca in IK Ca-ko-Tieren.

UCL 1684 reduzierte in IKCa-defizienten Tieren

die Gefäßdilatation nach 100 Hz-Nerven-

stimulation (grau) im Vergleich zu Kontroll-

bedingungen (schwarz) deutlich (n = 5).

ERGEBNISSE

47

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

1s 60s15s

Kontrolle

UCL 1684

10 Hz

**

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

1s 60s15s

100 Hz

**

*

Abbildung 3.19: Maxima der Dilatation nach Blockade des SK Ca in IK Ca-ko-Tieren. In IKCa-

defizienten Tieren war nach Inkubation mit UCL 1684 (grau) das Maximum der Gefäßdilatation am

Ende der Muskelkontraktionen sowohl nach 100 Hz- (links) als auch nach 10 Hz-Stimulation

(rechts) gegenüber den Kontrollbedingungen (schwarz) signifikant reduziert (p<0,05; n = 5, MW +

SEM).

3.4 Rolle von Connexinen bei der funktionellen

Hyperämie

3.4.1 Rolle von Connexin 40

Die Rolle von Gap junctions bei der funktionellen Hyperämie wurde in Mäusen

untersucht, die defizient für Cx40 waren (Cx40ko-Tiere). Es wurden Versuche an

jeweils zehn Cx40ko-Tieren und zehn Wildtyptieren durchgeführt. Die Dilatationen

dieser Wildtyptiere wurden bereits in Abschnitt 3.2 dargestellt und sind hier zum

Vergleich in den Abbildungen erneut aufgetragen. Die Tiere unterschieden sich

nicht signifikant in Bezug auf Alter (Wt: 6,3 ± 0,4 Monate; Cx40ko: 7,2 ± 0,4

Monate) und Gewicht (Wt: 26,8 ± 0,5 g; Cx40ko: 29,2 ± 1,1 g). Ebenso wenig

unterschieden sich Ruhedurchmesser (Wt: 15,2 ± 0,9 µm, Cx40ko: 13,7 ± 1,3 µm)

und maximale Durchmesser der untersuchten Gefäße in diesen Gruppen

voneinander (Wt: 32,4 ± 1,9 µm; Cx40ko: 33,2 ± 2,0 µm).

In den Cx40ko-Tieren kam es durch Superfusion von ACh in einer Konzentration

von 3 x 10-6 M zu einer deutlichen Dilatation auf 74,8 ± 8,1 Prozent der maximalen

Dilatation, bei Applikation von SNP zu einer Dilatation von 49,3 ± 4,6 Prozent.

ERGEBNISSE

48

Hierin unterschieden sich die Cx40-defizienten Tiere nicht signifikant von den

Wildtyptieren (Wt: ACh: 69,1 ± 7,2; SNP: 49,6 ± 9,8), wie es auch nach der

Untersuchung der kompletten Konzentrationswirkungskurven zu erwarten war

(siehe Abschnitt 3.1).

Wie schon bei den vorangegangenen Versuchen war auch in diesen Tieren eine

deutliche Gefäßdilatation nach Muskelkontraktionen zu beobachten, die von der

Stimulationszeit und -frequenz abhing. Sie war in Cx40ko-Tieren schwächer

ausgeprägt als in Wildtyptieren (Abb. 3.20).

Die Abschwächung der Amplitude der Dilatation bei Stimulation mit 100 Hz in den

Cx40ko-Tieren war statistisch signifikant bei Stimulation über 15 und 60 s (p ≤

0,05), bei Stimulation über nur eine Sekunde bei dem gewählten Signifikanzniveau

grenzwertig nicht signifikant (p = 0,09). Bei Stimulation mit 10 Hz kam es ebenso

zu einer Dilatation, die jedoch geringer ausgeprägt war. Hier war die

Abschwächung nur nach der längsten Stimulation statistisch zu belegen (p ≤ 0,05;

Abb. 3.21).

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

15 s1 s

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

60 s

Cx40ko

Wildtyp


in Cx40ko- Tieren (Stimulation mit 100 Hz).

Die mit muskulärer Arbeit assoziierten

Gefäßdilatationen waren in Cx40ko-Tieren

(grau) verglichen mit Wildtyptieren (schwarz)

deutlich verringert (jeweils n = 10).

ERGEBNISSE

49

Abbildung 3.21: Amplitude der Dilatation in Cx40ko-Tieren. Links: Die mit Muskelkontraktionen

bei 100 Hz-Stimulation einhergehende Gefäßdilatation war in Cx40ko-Tieren (grau) im Vergleich zu

Wildtyptieren (schwarz) nach Stimulation über 15 und 60 s signifikant abgeschwächt. Nach

Stimulation über 1 s war die Dilatation ebenso abgeschwächt, dieser Effekt war jedoch grenzwertig

nicht signifikant (p = 0,09). Rechts: Nach Stimulation mit 10 Hz war die Dilatation ebenso reduziert,

bei insgesamt schwächer ausgeprägten Gefäßantworten war dieser Effekt nur bei der längsten

Stimulation signifikant (*: p ≤ 0,05, sonst p > 0,05) (jeweils n = 10, MW + SEM).

Die pharmakologische Blockade der endothelialen Synthese von NO und

Prostaglandinen mit Indo und L-NA führte auch in Cx40ko-Tieren zu einer

tendenziell abgeschwächten Dilatation nach der längsten Stimulation mit 100 Hz.

Diese Abschwächung war bei den kürzeren Stimulationen nicht zu beobachten

(Abb. 3.22). Der Ruhedurchmesser (10,5 ± 2,3 µm) sowie die Dilatation nach

Gabe von ACh (52,0 ± 7,7) und SNP (58,1 ± 6,8) blieben unter diesen

Bedingungen gegenüber unbehandelten Tieren unverändert.

Ebenso führte die Behandlung mit Indo und L-NA zu keiner Reduktion der

maximalen Amplitude der Dilatation nach 10 Hz-Stimulation (1 s: 7,4 ± 3,9; 15 s:

6,6 ± 4,0; 60 s: 10,9 ± 2,3 % der max. Dilatation).

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

*

1s 60s15s

*

1s 60s15s

Wildtyp

Cx40ko

*0,09

100 Hz 10 Hz

ERGEBNISSE

50


in Cx40ko-Tieren nach Blockade von

COX und eNOS. In Cx40ko-Tieren war die

Gefäßdilatation nach Inkubation mit Indo

und L-NA nicht signifikant gegenüber der

Dilatation unter Kontrollbedingungen

vermindert (n = 10, MW + SEM).

3.4.2 Austausch von Cx40 durch Cx45

Um die funktionelle Austauschbarkeit der vaskulären Connexine im Kontext der

funktionellen Hyperämie zu analysieren, wurden die Versuche zudem an zehn

Mäusen durchgeführt, bei denen Cx40 durch Cx45 ersetzt worden war (Cx40KI45-

Tiere). Diese Tiere waren zum Zeitpunkt der Versuche im Mittel etwas älter als die

Wildtyptiere (Wt: 6,3 ± 0,4 Monate; Cx40KI45: 7,5 ± 0,2 Monate; p ≤ 0,05), die

Gruppen unterschieden sich jedoch nicht signifikant im Gewicht (Wt: 26,8 ± 0,5 g;

Cx40KI45: 28,3 ± 0,6 g). Ebenso war der Maximaldurchmesser der untersuchten

Gefäße nicht verschieden (Wt: 32,4 ± 1,9 µm; Cx40KI45: 31,4 ± 2,0 µm), jedoch

war der Ruhedurchmesser in Cx40KI45-Tieren etwas geringer als in Kontrolltieren

(Wt: 15,2 ± 0,9 µm; Cx40KI45: 11,1 ± 1,4 µm; p ≤ 0,05).

Die Gefäße der untersuchten Tiere dilatierten wie erwartet bei Superfusion von

ACh 3 x 10-6 M (79,4 ± 5,7) und SNP 3 x 10-6 M (60,8 ± 5,0) und diese Dilatation

war wie auch schon in Cx40ko-Tieren nicht verschieden von der Dilatation in

Kontrolltieren (ACh: 69,1 ± 7,2; SNP: 49,6 ± 9,8).

Ebenso kam es in diesem Genotyp erneut zu einer Gefäßdilatation in Folge von

Muskelkontraktionen, die aber im Vergleich zu der in Wildtyptieren bei gleicher

Anstiegssteilheit etwas vermindert war (Abb. 3.23).

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

1s 60s15s

Kontrolle

Indo & L-NA

100 Hz

ERGEBNISSE

51

Die Amplitude der Dilatation in Cx40KI45-Tieren unmittelbar am Ende der

Muskelkontraktionen war wie auch schon in Cx40ko-Tieren gegenüber der

Dilatation in Wildtyptieren reduziert. Der Unterschied zwischen Cx40KI45-Tieren

und Wildtyptieren war signifikant nach Stimulation mit 100 Hz über 15 und 60 s (p

≤ 0,05; Abb. 3.24). Ein Unterschied der Gefäßdilatation in Cx40ko-Tieren und

Cx40KI45-Tieren war nicht nachweisbar.

Zusammengefasst ist die Gefäßdilatation bei der funktionellen Hyperämie also von

der Expression von Cx40 abhängig, so dass vermutlich eine interzelluläre

Kommunikation über Gap junctions bei diesem Vorgang beteiligt ist. Die Funktion

von Cx40 kann durch Cx45 nicht ersetzt werden.

Die Inkubation des Präparates mit Indo und L-NA führte in Cx40KI45-Tieren zu

keiner Änderung des Ruhedurchmessers (11,7 ± 1,9 µm) oder der Dilatation nach

Gabe von SNP (68,3 ± 5,7 % der maximalen Dilatation), lediglich die Dilatation

nach Gabe von ACh (58,3 ± 6,3; p ≤ 0,05) wurde geringfügig abgeschwächt. Wie

auch schon in den anderen Genotypen war nach dieser Behandlung bei der

funktionellen Hyperämie nur nach Stimulation über 60 s eine tendenzielle

Abschwächung der Dilatation zu beobachten, allerdings war dieser Unterschied

nicht statistisch signifikant (Abb. 3.25). Ebenso war die Dilatation nach Stimulation

mit 10 Hz nach Inkubation mit den beiden Hemmstoffen unverändert (1 s: 13,4 ±

4,6; 15 s: 16,3 ± 5,5; 60 s: 37,2 ± 6,1 % der max. Dilatation).

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

15 s1 s

Zeit (s)

-30 0 30 60 90 120 150 180

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

60 s

Cx40KI45

Wildtyp


in Cx40KI45- Tieren (Stimulation mit 100

Hz). Auch in Cx40KI45-Tieren war nach

längerer Stimulation die Gefäßdilatation

reduziert (jeweils n = 10).

ERGEBNISSE

52

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100

*

**

**

1s 60s15s

10 Hz

1s 60s15s

Wildtyp

Cx40KI45

Cx40ko

100 Hz

Abbildung 3.24: Amplitude der Dilatation in Cx40ko- und Cx40KI45-Tieren. Die erreichte

Gefäßdilatation nach verschieden lang anhaltender muskulärer Arbeit war in Cx40KI45-Tieren

(dunkelgrau) wie in Cx40ko-Tieren (hellgrau) im Vergleich zu Wildtyptieren (schwarz) bei

Stimulation über 100 Hz (links) und 10 Hz (rechts) deutlich vermindert (*: p ≤ 0,05 vs. Wildtyp)

(jeweils n = 10, MW + SEM).

Abbildung 3.25: Maximale Amplitude der

Dilatation in Cx40KI45-Tieren nach

Blockade von COX und eNOS. Auch in

Cx40KI45-Tieren war die Gefäßdilatation

bei der funktionellen Hyperämie durch

Inkubation des Muskels mit Indo und L-NA

nicht signifikant verringert und nur

tendenziell bei der längsten Stimulation

abgeschwächt (n = 10, MW + SEM).

1s 60s15s

% d

er m

ax. D

ilata

tion

0

20

40

60

80

100 100 Hz

Kontrolle

Indo & L-NA

DISKUSSION

53

4. Diskussion

4.1 Charakteristika der funktionellen Hyperämie

Die funktionelle Hyperämie in arbeitendem Skelettmuskelgewebe ist ein basales

Prinzip in der Physiologie, dennoch sind deren Grundlagen noch immer nicht gut

verstanden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die zu Grunde liegenden

Signalmechanismen in den Blutgefäßen mit Hilfe von gentechnisch veränderten

Mäusen genauer zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurden zunächst einige

Parameter der Gefäßdilatation bestimmt, die durch Stimulation eines motorischen

Nerven in der versorgten Muskulatur hervorgerufen wurde.

Das Ausmaß der erreichten Gefäßdilatation hing sowohl von der Frequenz als

auch von der Dauer der Nervenstimulation ab. So konnte gezeigt werden, dass

Einzelkontraktionen (Stimulation mit 10 Hz) eine deutlich geringere Gefäßantwort

hervorrufen als eine tetanische Kontraktion (Stimulation mit 100 Hz). Dieses

entspricht dem physiologischen Bedarf und steht in Einklang mit den Ergebnissen

früherer Studien, die allerdings zum Teil in anderen Präparationen durchgeführt

wurden [77, 90, 139, 140]. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die resultierende

Gefäßdilatation mit einer längeren Dauer der Muskelkontraktionen zunimmt, auch

dies bestätigt frühere Resultate (s.o.).

Obwohl bis heute kein schlüssiges Konzept existiert, wie es zu der ausgeprägten

Gefäßdilatation bei der funktionellen Hyperämie im Skelettmuskel kommt, wurde

schon früh postuliert, dass das Endothel als wichtiger Regulator des Gefäßtonus

eine entscheidende Rolle bei diesem Phänomen einnimmt. Hinweise hierauf

konnten auch experimentell gefunden werden, da die funktionelle Hyperämie nach

Zerstörung des Endothels deutlich reduziert war [125]. Daraufhin war es die

Hoffnung vieler Arbeitsgruppen, diese Funktion des Endothels mit der Freisetzung

von NO oder Prostaglandinen erklären zu können. Entsprechende Versuche

lieferten allerdings stets uneinheitliche und damit widersprüchliche Ergebnisse

(siehe Abschnitt 1.6). In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von NO sowie

Prostaglandinen auf die funktionelle Hyperämie in der Maus untersucht und es

zeigte sich in der verwendeten Präparation bei dem verwendeten Protokoll eine

DISKUSSION

54

kaum nachweisbare Abschwächung der Gefäßantwort. Lediglich nach der

längsten durchgeführten Stimulation (60 s) mit der höchsten Frequenz (100 Hz)

und damit einer tetanischen Muskelkontraktion wurde eine Abschwächung um

etwa 25 % gefunden. Bei allen anderen Stimulationsarten sowie bei den

Versuchen in Cx-defizienten Mäusen war die Gefäßdilatation nach Ausschaltung

von NO und Prostaglandinen voll ausgeprägt. Auch in KCa-defizienten Tieren, in

denen die Gefäßantwort unter Kontrollbedingungen bereits deutlich reduziert war,

kam es durch die pharmakologische Blockade von eNOS und COX zu keiner

weiteren signifikanten Abschwächung. Es lässt sich also ableiten, dass NO und

Prostaglandine in der untersuchten Präparation in der Maus nur unwesentlich zur

funktionellen Hyperämie beitragen und dass diese beiden endothelialen Autakoide

selbst nach dem Verlust anderer wichtigerer Funktionen des Endothels (z.B. in

KCa-defizienten Tieren) nicht in der Lage sind, die Gefäßdilatation im Sinne eines

back-up-Mechanismus aufrecht zu erhalten.

Naturgemäß stellt sich nach Betrachtung dieser Signalwege die Frage nach der

Bedeutung des dritten endothelialen Mechanismus, über den Gefäßdilatationen

hervorgerufen werden können, nämlich nach der Bedeutung von Dilatationen, die

durch den Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor (EDHF) vermittelt werden.

Diese Frage ist bis heute ungeklärt, da sie sich im Kontext der funktionellen

Hyperämie des Skelettmuskels schwer untersuchen lässt. Es ist noch umstritten,

welche chemische Substanz sich hinter EDHF verbirgt, was eine direkte

pharmakologische Blockade schwierig macht. Zusätzlich können viele der

Substanzen, die in Abschnitt 1.4 als mögliche Mediatoren einer EDHF-Dilatation

genannt wurden, auch aus den arbeitenden Skelettmuskelzellen stammen und

wären dann nicht sicher als EDHF zu charakterisieren. Darüber hinaus kann die

Dilatation, die nach Blockade von COX und eNOS nahezu unbeeinträchtigt

bestehen bleibt, nicht ohne Weiteres einem EDHF zugeschrieben werden, da

auch endothelunabhängige Mechanismen beteiligt sein könnten. Die Rolle des

Endothels und insbesondere der EDHF-Dilatation bei der funktionellen Hyperämie

im Skelettmuskel ist also bis heute nicht ausreichend bekannt. In der vorliegenden

Arbeit konnten neue Erkenntnisse gewonnen werden, die einige bisher ungeklärte

Aspekte der funktionellen Hyperämie aufzeigen und so zu einem besseren

DISKUSSION

55

Verständnis der Vorgänge bei der physiologischen Regulation der Widerstands-

gefäße in der Muskulatur führen.

4.2 Bedeutung von K Ca für die funktionelle Hyperämie

Ein Ereignis, das wesentlich an einer EDHF-Dilatation beteiligt ist, ist die Öffnung

von endothelialen KCa-Kanälen, die zu einer Hyperpolarisation der Endothelzelle

führt [20-22]. Im Endothel werden zwei verschiedene KCa exprimiert, nämlich IKCa

und SKCa (siehe Abschnitt 1.4). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden,

dass in Tieren, die defizient für diese beiden Kanäle waren, die Gefäßdilatation im

Rahmen der funktionellen Hyperämie im Vergleich zur Gefäßantwort in

Wildtyptieren drastisch reduziert war. Diese Ergebnisse konnten in einer weiteren

Versuchsreihe bestätigt werden, in der in IKCa-defizienten Tieren der Kanal SKCa

pharmakologisch blockiert wurde. Dies zeigt, dass endotheliale KCa eine

herausragende Rolle bei der funktionellen Hyperämie einnehmen, und somit ergibt

sich ein deutlicher Hinweis darauf, dass EDHF-Dilatationen einen wesentlichen

Mechanismus der Gefäßdilatation im Rahmen der funktionellen Hyperämie

darstellen.

Interessanterweise war die Gefäßdilatation in IKCa-ko-Tieren vor der Blockade des

SKCa im Vergleich zu der in Wildtyptieren keineswegs reduziert, sondern

tendenziell sogar etwas verstärkt, obwohl diese Verstärkung nur bei einigen

Stimulationsmustern statistisch signifikant war (siehe Abb. 3.14). Dagegen war bei

Wildtyptieren nach Behandlung des untersuchten Muskels mit einem

pharmakologischen Blocker des SKCa (UCL 1684) bereits eine Reduktion der

Dilatation festzustellen, deren Ausmaß vergleichbar mit der Verminderung war, die

in Tieren mit einem doppelten knock-out für beide KCa-Kanäle beobachtet wurde.

Analog dazu konnte ebenso in IKCa-defizienten Tieren eine drastische

Verminderung der Gefäßdilatation durch eine zusätzliche Blockade des SKCa

erreicht werden. Folglich ist von den beiden endothelialen KCa-Kanälen SKCa der

Kanal, der für die Dilatation im Rahmen der funktionellen Hyperämie im

Skelettmuskel entscheidend ist, während IKCa im Gegensatz dazu kaum zur

Gefäßantwort beiträgt. Diese Resultate sind insbesondere daher von großer

DISKUSSION

56

Relevanz, da sich der Einfluss der einzelnen KCa auf die Gefäßdilatation nach

endothelialer Stimulation mit Acetylcholin völlig unterschiedlich darstellt. Hier hat

die Blockade des SKCa in Wildtyptieren keinen Effekt, während die Ausschaltung

des IKCa zu deutlich abgeschwächten Dilatationen führt. Lediglich in IKCa-

defizienten Tieren führt auch die Blockade des SKCa zu einer weiteren Abnahme

der Dilatation nach Stimulation des Endothels mit Acetylcholin [141-144]. Auch

diese Ergebnisse konnten in der vorliegenden Arbeit reproduziert werden.

Dieser Unterschied in der Aktivierung endothelialer KCa in Abhängigkeit von einem

spezifischen Stimulus, der die Dilatation auslöst, belegt, dass die beiden

exprimierten Kanäle nicht lediglich eine identische Funktion innehaben. Es muss

eine differenzierte Rolle der einzelnen Kanäle geben, die vom auslösenden

Stimulus abhängt. Denkbar wäre, dass die unterschiedlichen Aktivierungsmuster

der Kanäle durch ihre jeweilige spezielle Lokalisation in der Zellmembran bedingt

sind. So konnte kürzlich gezeigt werden, dass IKCa in der Umgebung von

myoendothelialen Gap junctions sowie in der Nähe von IP3-Rezeptoren des

endoplasmatischen Retikulums (ER) zu finden sind [145, 146]. Wahrscheinlich

führt eine Stimulation des Endothels mit Acetylcholin über das PLC-IP3-System zu

räumlich begrenzten Erhöhungen des intrazellulären Ca2+, die ebenfalls an den

IP3-Rezeptoren des ER lokalisiert sind (so genannte Ca2+-Pulsare) [145]. Die

Nähe dieser lokalen Ca2+-Erhöhungen zum IKCa legt nahe, dass dieser

Kaliumkanal durch sie aktiviert wird und eine wesentliche Rolle bei der

Acetylcholin-vermittelten Gefäßdilatation einnimmt. SKCa scheint dagegen eher im

Bereich der Endothelzellgrenzen und an homozellulären Gap junctions, die die

einzelnen Endothelzellen miteinander verbinden, lokalisiert zu sein [146, 147]. Es

ist nach wie vor ungeklärt, welches Signal zur Öffnung des SKCa führt, allerdings

könnte die Lage dieser Kanäle an mechanisch beanspruchten Zellgrenzen dafür

sprechen, dass eine Verformung des Gefäßes, wie sie auch bei

Muskelkontraktionen vorkommt, zu seiner Aktivierung führt. Ein weiterer Hinweis

auf diese mögliche mechanosensitive Funktion des SKCa ist kürzlich beschrieben

worden, da dieser Kanal auch für eine intakte EDHF-Dilatation im Rahmen einer

flussinduzierten Dilatation notwendig ist [130].

DISKUSSION

57

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen also, dass endotheliale KCa-Kanäle

für die Gefäßdilatation bei der funktionellen Hyperämie in arbeitendem

Skelettmuskel von elementarer Bedeutung sind und weisen somit daraufhin, dass

eine EDHF-Dilatation beteiligt sein könnte. Im Gegensatz zu durch Acetylcholin

hervorgerufenen Dilatationen steht SKCa hierbei im Vordergrund, während IKCa

keine wesentliche Rolle einnimmt. Es muss daher eine differenzierte, Stimulus-

abhängige Aktivierung der einzelnen KCa geben, die möglicherweise mit der

Lokalisation der einzelnen Kanäle in der Zellmembran in Zusammenhang stehen

könnte.

4.3 Koordination der Gefäßdilatation durch Connexin e

Bei muskulärer Arbeit muss zusätzlich zu einer lokalen Dilatation der

intramuskulären Arteriolen auch eine Dilatation der vorgeschalteten Leitungs-

gefäße stattfinden, damit eine ausreichende Durchblutungssteigerung erreicht

werden kann (siehe Abschnitt 1.5). Ein Mechanismus, der wahrscheinlich zu

diesem Effekt beiträgt, ist die Fortleitung einer endothelialen Hyperpolarisation

entlang des Gefäßes, die zu einer aufsteigenden Dilatation führt und im

Experiment durch die lokale Gabe von Acetylcholin initiiert werden kann.

Tatsächlich konnte experimentell bestätigt werden, dass solche aufsteigenden

Dilatationen nicht nur durch pharmakologische Stimulation des Endothels, sondern

auch durch Kontraktionen einzelner Muskelfasern hervorgerufen werden [133,

148, 149], so dass eine Beteiligung dieser aufsteigenden Dilatationen an der

funktionellen Hyperämie in der Muskulatur zu erwarten ist.

In vorhergehenden Arbeiten konnte weiter gezeigt werden, dass aufsteigende

Dilatationen auf Cx40, ein Strukturprotein endothelialer Gap junctions, angewiesen

sind. Cx40-defiziente Tiere zeigen bei endothelialer Stimulation mit ACh

abgeschwächte fortgeleitete Dilatationen, erkennbar an einer reduzierten

Amplitude der Dilatation, die stromaufwärts von der Stimulationsstelle beobachtet

wird [75]. In der vorliegenden Arbeit konnte nun erstmals gezeigt werden, dass in

Cx40-defizienten Tieren auch die Gefäßdilatation im Rahmen der funktionellen

Hyperämie gegenüber Wildtyptieren abgeschwächt ist. Somit ist ein Cx40-

DISKUSSION

58

abhängiger Mechanismus bei der funktionellen Hyperämie beteiligt. Aus den

genannten Überlegungen ergibt sich, dass es sich hierbei wahrscheinlich um eine

Koordination des Gefäßverhaltens über eine gewisse Distanz zum Erreichen einer

maximal möglichen Durchblutungssteigerung handelt. Der beobachtete Effekt

beruht nicht auf einer generellen Einschränkung der endothelvermittelten

Dilatation in den genetisch modifizierten Tieren, denn die Dilatation nach globaler

Applikation von Acetylcholin auf den Cremastermuskel war in Wildtyptieren und

Cx40ko-Tieren identisch.

Weitere Versuche in Tieren, bei denen Cx40 durch ein anderes Connexin (Cx45)

ausgetauscht war, ergaben, dass auch die Dilatation in diesen Tieren gegenüber

Wildtyptieren deutlich reduziert ist. Ein wesentlicher Unterschied zwischen diesen

beiden Genotypen liegt darin, dass Cx40KI45-Tiere annähernd normotensiv sind

[150, 151], während Cx40ko-Tiere einen erhöhten Blutdruck aufweisen [152-154].

Diese Blutdruckveränderungen sind auf die veränderte Expression der Connexine

in juxtaglomerulären Renin-produzierenden Zellen der Niere zurückzuführen. Trotz

dieses Unterschieds im Blutdruck der Tiere ergab sich eine vergleichbare

Abschwächung der Dilatation in beiden Genotypen. Dies zeigt, dass die Reduktion

der funktionellen Hyperämie in Cx40ko-Tieren nicht durch die deutliche Hypertonie

dieser Tiere bedingt ist. Connexine müssen folglich eine Bedeutung für die

funktionelle Hyperämie haben, die über eine Blutdruckveränderung hinausgeht.

Cx40 hat also im Kontext der funktionellen Hyperämie spezielle Eigenschaften, die

nicht durch Cx45 übernommen werden können. Dies bestätigt frühere Versuche

zur Rolle von Connexinen bei fortgeleiteten Dilatationen in der Muskulatur. Nach

lokaler Stimulation mit Acetylcholin war Cx45 in Cx40-defizienten Mäusen

ebenfalls nicht in der Lage, den Verlust von Cx40 zu kompensieren, denn auch in

Cx40KI45-Tieren war die Amplitude der entfernten Dilatation reduziert [60]. Dies

ist jedoch nicht generell der Fall. In anderen Organen können unterschiedliche

Connexine wesentliche Funktionen natürlich exprimierter Connexine nach deren

Ausschaltung übernehmen. Dies wird zum einen dadurch belegt, dass Cx40KI45-

Tiere im Vergleich mit Cx40ko-Tieren einen deutlich reduzierten Blutdruck

aufweisen (s.o.), aber auch andere genetische Versuche, in denen Connexine

gegeneinander ausgetauscht wurden, zeigten ähnliche Ergebnisse. So ist Cx45 in

DISKUSSION

59

der Lage, die Funktion von Cx40 in der Reizleitung der Herzens nach einem

knock-out von Cx40 teilweise zu übernehmen [128]. Ein weiteres Beispiel für solch

einen funktionellen Ersatz findet man in der Organogenese. Cx43-defiziente Tiere

versterben kurz nach der Geburt an kardialen Fehlbildungen. Diese Funktion von

Cx43 in der Entwicklung des Herzens kann dadurch übernommen werden, dass

Cx32 oder Cx40 an gleicher Stelle im Genom der Maus eingefügt werden [155].

Cx40 und Cx45 unterscheiden sich zum Einen in ihrer Leitfähigkeit (etwa 200 pS

bei Cx40 und etwa 35 pS bei Cx45), zum Anderen aber auch in ihrem Gating und

ihrer Regulation [156-159]. Es ist noch nicht bekannt, welche spezielle Eigenschaft

von Cx40 für eine intakte Funktion vaskulärer Zellen notwendig ist.

Trotz der deutlichen Reduktion der Dilatation in Cx40-defizienten Tieren war nach

wie vor eine deutliche Gefäßantwort durch Muskelkontraktionen auslösbar. Dies

zeigt, dass es noch mindestens einen weiteren Mechanismus geben muss, der

diese ausgeprägte Flusssteigerung ermöglicht. Hier käme zum Einen die Diffusion

vasoaktiver Transmitter, die zum Beispiel aus den Skelettmuskelzellen stammen

könnten, oder auch ein rein mechanischer Stimulus durch die Kontraktionen in

Betracht [160]. Eine andere Möglichkeit wäre die Fortleitung eines weiteren

Signals, ähnlich der Hyperpolarisation der Endothelzellen, das sich in der glatten

Muskelschicht der Gefäße ausbreitet [49, 161, 162].

4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick

In der vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse gewonnen werden, die zu

einem besseren Verständnis der Gefäßregulation in der arbeitenden Skelett-

muskulatur führen. Es ergaben sich deutliche Hinweise darauf, dass EDHF-Typ-

Dilatationen wesentlich an der Gefäßdilatation beteiligt sind, die den notwendigen

Blutfluss für muskuläre Arbeit ermöglicht. Interessanterweise konnte zusätzlich

gezeigt werden, dass es eine differenzierte Aktivierung unterschiedlicher

beteiligter Kaliumkanäle geben muss, die von dem initialen Stimulus abhängt und

mit der Lokalisation der einzelnen Kaliumkanäle in der Zellmembran in

Zusammenhang stehen könnte. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch

endotheliales Connexin 40 eine elementare Voraussetzung für intakte

DISKUSSION

60

hyperämische Dilatationen darstellt. Insgesamt ergibt sich somit folgender

hypothetischer Mechanismus als mögliche Grundlage der funktionellen

Hyperämie:

Kontraktionen des Skelettmuskels führen zu einer Hyperpolarisation der

Endothelzellen der intramuskulären Gefäße. Diese kommt durch eine Öffnung von

SKCa-Kanälen zu Stande, die möglicherweise auf Grund ihrer Lokalisation an den

Zellgrenzen der Endothelzellen direkt durch eine mechanische Beanspruchung

aktiviert werden. Die Endothelzellhyperpolarisation initiiert eine lokale Dilatation

vom EDHF-Typ und führt so zu einem Widerstandsverlust der intramuskulären

Arteriolen. Zusätzlich breitet sich die Hyperpolarisation entlang des Gefäßes aus

und koordiniert das zelluläre Verhalten entlang des Gefäßbaumes. So wird erst die

ausgeprägte Durchblutungssteigerung, die für muskuläre Arbeit erforderlich ist,

ermöglicht. Diese Fortleitung erfolgt durch homozelluläre Gap junctions im

Endothel, die Cx40 als elementares Strukturprotein enthalten, dessen Funktion

nicht durch Cx45 ersetzt werden kann. Zusätzlich muss es weitere beteiligte

Mechanismen geben, da auch die Blockade obiger Signalwege keine komplette

Ausschaltung der hyperämischen Dilatation zur Folge hat. Allerdings scheinen

EDHF-Antworten für einen großen Anteil der Dilatation verantwortlich zu sein. Die

anderen endothelialen Autakoide (NO und Prostaglandine) tragen nur marginal zur

funktionellen Hyperämie bei.

Obwohl der beschriebene Mechanismus zu einem großen Teil auf den in dieser

Arbeit dargestellten Ergebnissen beruht, sind in der Zukunft noch weitere

Versuche erforderlich, um zentrale Aspekte zu bestätigen oder zu widerlegen.

Insbesondere das aktivierende Signal für die SKCa-Kanäle, die chemische Entität

von EDHF im Rahmen der funktionellen Hyperämie sowie weitere möglicherweise

beteiligte Signalwege und deren Anteil an der Gefäßantwort sind noch zu

entschlüsseln. Bereits in der Einleitung wurde erwähnt, dass sich die Rolle

verschiedener beteiligter Mechanismen der Dilatation wahrscheinlich im Laufe der

Gefäßantwort ändert. Unterschiedliche Signalwege könnten jeweils für die frühe

Phase der Dilatation und für die Aufrechterhaltung der Dilatation im weiteren

Verlauf verantwortlich sein. Diese verschiedenen zeitlichen Abläufe wurden in der

vorliegenden Arbeit mit dem gewählten Versuchsprotokoll nicht weiter

DISKUSSION

61

differenziert. Allerdings ist die Anstiegssteilheit der Dilatation bei SKCa-defizienten

Mäusen sowie nach Blockade des SKCa andeutungsweise reduziert. Dies spricht

für eine Beteiligung dieses Kanals an der ersten schnellen Phase der Dilatation. In

Versuchen nach Blockade von COX und eNOS sowie in Cx40-defizienten Tieren

kam es dagegen lediglich zu einer mehr oder weniger stark ausgeprägten

Verringerung der Amplitude der Dilatation, während die Anstiegssteilheit der Kurve

unverändert blieb. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Signalwege, in

denen diese Proteine involviert sind, eher zur Aufrechterhaltung der Dilatation im

Verlauf beitragen.

Um die funktionelle Relevanz der untersuchten Mechanismen zu belegen, könnten

weitere Versuche durchgeführt werden, um die körperliche Leistungsfähigkeit (z.B.

die Ausdauerleistung) in den verschiedenen Genotypen zu quantifizieren und zu

vergleichen. In solchen Versuchen an wachen Tieren könnte auch ein potentieller

Einfluss von verwendeten Anästhetika ausgeschlossen werden. Bei einem

invasiven Versuchsaufbau, wie in dieser Arbeit verwendet, ist immer eine

Anästhesie notwendig, und diese könnte einen Einfluss auf die untersuchten

physiologischen Vorgänge haben. Barbiturate und inhalative Anästhetika

beeinflussen in einigen Präparationen EDHF-Dilatationen in der Mikrozirkulation

im Sinne einer Abschwächung [163, 164], dagegen gibt es für die in dieser Arbeit

verwendeten Substanzen keine derartigen Daten.

Insgesamt ist ein besseres Verständnis der funktionellen Hyperämie nicht nur von

akademischem Interesse, sondern auch wesentlich, um die Pathologie und

eventuell neue Therapiemöglichkeiten kardiovaskulärer Erkrankungen zu

verstehen bzw. zu entwickeln. Interessanterweise konnte kürzlich gezeigt werden,

dass endotheliale KCa auch im Menschen für eine EDHF-Dilatation unabdingbar

sind [165], und es wurde postuliert, dass Öffner dieser Kanäle möglicherweise als

Medikamente für Krankheiten eingesetzt werden können, in denen die

Endothelfunktion gestört ist [166-172]. Ebenso wie bei Kaliumkanälen ist auch

vorstellbar, dass Connexine in den nächsten Jahren zusätzliche klinische

Relevanz erhalten werden. Nicht nur im Tiermodell konnte der Einfluss von

Connexinen auf die Blutdruckregulation gezeigt werden [150, 152-154], auch im

Menschen gibt es Hinweise darauf, dass Connexine an der Blutdruckregulation

DISKUSSION

62

beteiligt sind [173, 174] und dass Polymorphismen in Connexingenen mit einem

höheren Risiko für arterielle Hypertonie einhergehen [175]. Außerdem spielen

Connexine eine Rolle bei Störungen der kardialen Reizleitung und bei

angeborenen Herzfehlern [176]. Zudem gibt es weitere seltene angeborene

Erkrankungen, die mit Mutationen in Connexingenen einhergehen [177], so dass

ein tieferes Verständnis der Physiologie dieser Proteinfamilie von großer klinischer

Bedeutung ist.

ZUSAMMENFASSUNG

63

5. Zusammenfassung

Die funktionelle Hyperämie, also die Mehrdurchblutung eines Gewebes bei einem

höheren Aktivitätszustand, ist ein basales Prinzip zur Regulation der Organ-

durchblutung. Dennoch sind die zu Grunde liegenden zellulären Mechanismen

noch unverstanden. Das Endothel mit seinem großen Einfluss auf den Gefäßtonus

könnte hieran beteiligt sein, z.B. über NO und Prostaglandine. Neben diesen

traditionellen Mediatoren rückt jüngst ein weiterer endothelialer hyperpolarisations-

abhängiger Mechanismus (EDHF) in den Vordergrund der Untersuchungen. Ziel

dieser Arbeit war es, die Bedeutung dieser EDHF-Typ-Dilatation für die

funktionelle Hyperämie zu untersuchen. Hierzu wurden Gefäßdilatationen nach

Muskelkontraktionen nach pharmakologischer oder genetischer Ausschaltung

endothelialer Kaliumkanäle, die essentiell für die Auslösung einer EDHF-Dilatation

sind, mittels Intravitalmikroskopie beobachtet. Zusätzlich wurde die Rolle einer

Koordination des zellulären Verhaltens in Tieren untersucht, denen bestimmte

Gap junction-Proteine (Connexine) fehlten.

In Mäusen, denen der endotheliale Calcium-abhängige Kaliumkanal SKCa fehlte,

war die aktivitätsinduzierte Dilatation etwa halbiert. Dagegen hatte das Fehlen des

zweiten Calcium-abhängigen Kaliumkanals IKCa keine Auswirkung auf die

Dilatation. Wurde dagegen in IKCa-defizienten oder Wildtyptieren SKCa

pharmakologisch blockiert, war wiederum eine deutliche Abschwächung der

Dilatation zu beobachten. Interessanterweise war die Dilatation, die durch die

klassische endothelstimulierende Substanz Acetylcholin induziert wurde, nicht von

SKCa sondern vornehmlich von IKCa abhängig. Die Daten zeigen, dass die

Aktivierung der endothelialen SKCa-Kanäle und eine folgende Hyperpolarisation

(EDHF-Typ) wesentlich an der Dilatation beteiligt sind. Weiterhin war die Dilatation

nach Muskelkontraktionen in Tieren, denen das Gap junction-Protein Connexin 40

fehlte, reduziert, und dies konnte nicht durch die Expression von Cx45 an Stelle

von Cx40 kompensiert werden. Dies lässt vermuten, dass eine lokal ausgelöste

EDHF-Typ-Dilatation sich entlang des Endothels in einer Cx40-abhängigen Weise

ausbreitet und so die Koordination des Gefäßverhaltens sichert.

Zusammengefasst scheint eine endotheliale Hyperpolarisation für die

Gefäßerweiterung bei der Mehrdurchblutung des arbeitenden Skelettmuskels und

die Koordination des zellulären Verhaltens entscheidend zu sein.

LITERATUR

64

6. Literatur

1. Lüllmann-Rauch R. Blutgefäße. Histologie. Verstehen - Lernen - Nachschlagen. 1. Ausgabe. Stuttgart: Georg Thieme Verlag, 2003:208 - 219

2. Linke WA und Pfitzer G. Kontraktionsmechanismen. In: Schmidt RF, Lang F und Thews G. Physiologie des Menschen mit Pathophysiologie. 29. Ausgabe. Heidelberg: Springer Medizin Verlag, 2005:116 - 143

3. Ledoux J, Werner ME, Brayden JE und Nelson MT. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda) 2006;21:69-78

4. Davis MJ, Meininger GA und Zawieja DC. Stretch-induced increases in intracellular calcium of isolated vascular smooth muscle cells. Am J Physiol 1992;263:H1292-9

5. Pohl U, Holtz J, Busse R und Bassenge E. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension 1986;8:37-44

6. Ando J, Ohtsuka A, Katayama Y, Korenaga R, Ishikawa C und Kamiya A. Intracellular calcium response to directly applied mechanical shearing force in cultured vascular endothelial cells. Biorheology 1994;31:57-68

7. Lamontagne D, Pohl U und Busse R. Mechanical deformation of vessel wall and shear stress determine the basal release of endothelium-derived relaxing factor in the intact rabbit coronary vascular bed. Circ Res 1992;70:123-30

8. Tallini YN, Brekke JF, Shui B, Doran R, Hwang SM, Nakai J, Salama G, Segal SS und Kotlikoff MI. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC GCaMP2 transgenic mice. Circ Res 2007;101:1300-9

9. de Wit C und Wolfle SE. EDHF and gap junctions: important regulators of vascular tone within the microcirculation. Curr Pharm Biotechnol 2007;8:11-25

10. Molina CR, Andresen JW, Rapoport RM, Waldman S und Murad F. Effect of in vivo nitroglycerin therapy on endothelium-dependent and independent vascular relaxation and cyclic GMP accumulation in rat aorta. J Cardiovasc Pharmacol 1987;10:371-8

11. Ignarro LJ, Harbison RG, Wood KS und Kadowitz PJ. Activation of purified soluble guanylate cyclase by endothelium-derived relaxing factor from intrapulmonary artery and vein: stimulation by acetylcholine, bradykinin and arachidonic acid. J Pharmacol Exp Ther 1986;237:893-900

12. Moncada S und Higgs EA. Nitric oxide and the vascular endothelium. Handb Exp Pharmacol 2006:213-54

LITERATUR

65

13. Koeppen M, Feil R, Siegl D, Feil S, Hofmann F, Pohl U und de Wit C. cGMP-dependent protein kinase mediates NO- but not acetylcholine-induced dilations in resistance vessels in vivo. Hypertension 2004;44:952-5

14. Lincoln TM, Dey N und Sellak H. Invited review: cGMP-dependent protein kinase signaling mechanisms in smooth muscle: from the regulation of tone to gene expression. J Appl Physiol 2001;91:1421-30

15. Mitchell JA, Ali F, Bailey L, Moreno L und Harrington LS. Role of nitric oxide and prostacyclin as vasoactive hormones released by the endothelium. Exp Physiol 2008;93:141-7

16. Schroder H und Schror K. Prostacyclin-dependent cyclic AMP formation in endothelial cells. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1993;347:101-4

17. Vanhoutte PM. Endothelium-dependent hyperpolarizations: the history. Pharmacol Res 2004;49:503-8

18. Shimokawa H, Yasutake H, Fujii K, Owada MK, Nakaike R, Fukumoto Y, Takayanagi T, Nagao T, Egashira K, Fujishima M und Takeshita A. The importance of the hyperpolarizing mechanism increases as the vessel size decreases in endothelium-dependent relaxations in rat mesenteric circulation. J Cardiovasc Pharmacol 1996;28:703-11

19. Nishikawa Y, Stepp DW und Chilian WM. In vivo location and mechanism of EDHF-mediated vasodilation in canine coronary microcirculation. Am J Physiol 1999;277:H1252-9

20. Feletou M und Vanhoutte PM. Endothelium-derived hyperpolarizing factor: where are we now? Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006;26:1215-25

21. Fitzgerald SM, Bashari H, Cox JA, Parkington HC und Evans RG. Contributions of endothelium-derived relaxing factors to control of hindlimb blood flow in the mouse in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007;293:H1072-82

22. Busse R, Edwards G, Feletou M, Fleming I, Vanhoutte PM und Weston AH. EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol Sci 2002;23:374-80

23. Bychkov R, Burnham MP, Richards GR, Edwards G, Weston AH, Feletou M und Vanhoutte PM. Characterization of a charybdotoxin-sensitive intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel in porcine coronary endothelium: relevance to EDHF. Br J Pharmacol 2002;137:1346-54

24. Burnham MP, Bychkov R, Feletou M, Richards GR, Vanhoutte PM, Weston AH und Edwards G. Characterization of an apamin-sensitive small-conductance Ca(2+)-activated K(+) channel in porcine coronary artery endothelium: relevance to EDHF. Br J Pharmacol 2002;135:1133-43

25. Gauthier KM, Liu C, Popovic A, Albarwani S und Rusch NJ. Freshly isolated bovine coronary endothelial cells do not express the BK Ca channel gene. J Physiol 2002;545:829-36

LITERATUR

66

26. Jackson WF. Potassium channels in the peripheral microcirculation. Microcirculation 2005;12:113-27

27. Potocnik SJ, McSherry I, Ding H, Murphy TV, Kotecha N, Dora KA, Yuill KH, Triggle CR und Hill MA. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K(+) channels. Microcirculation 2009;16:377-90; 1 p following 390

28. Bolz SS, de Wit C und Pohl U. Endothelium-derived hyperpolarizing factor but not NO reduces smooth muscle Ca2+ during acetylcholine-induced dilation of microvessels. Br J Pharmacol 1999;128:124-34

29. Fisslthaler B, Fleming I und Busse R. EDHF: a cytochrome P450 metabolite in coronary arteries. Semin Perinatol 2000;24:15-9

30. Fleming I. Cytochrome p450 and vascular homeostasis. Circ Res 2001;89:753-62

31. Popp R, Bauersachs J, Hecker M, Fleming I und Busse R. A transferable, beta-naphthoflavone-inducible, hyperpolarizing factor is synthesized by native and cultured porcine coronary endothelial cells. J Physiol 1996;497 ( Pt 3):699-709

32. Archer SL, Gragasin FS, Wu X, Wang S, McMurtry S, Kim DH, Platonov M, Koshal A, Hashimoto K, Campbell WB, Falck JR und Michelakis ED. Endothelium-derived hyperpolarizing factor in human internal mammary artery is 11,12-epoxyeicosatrienoic acid and causes relaxation by activating smooth muscle BK(Ca) channels. Circulation 2003;107:769-76

33. Li PL und Campbell WB. Epoxyeicosatrienoic acids activate K+ channels in coronary smooth muscle through a guanine nucleotide binding protein. Circ Res 1997;80:877-84

34. Edwards G, Dora KA, Gardener MJ, Garland CJ und Weston AH. K+ is an endothelium-derived hyperpolarizing factor in rat arteries. Nature 1998;396:269-72

35. Edwards G, Gardener MJ, Feletou M, Brady G, Vanhoutte PM und Weston AH. Further investigation of endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) in rat hepatic artery: studies using 1-EBIO and ouabain. Br J Pharmacol 1999;128:1064-70

36. Edwards G und Weston AH. Potassium and potassium clouds in endothelium-dependent hyperpolarizations. Pharmacol Res 2004;49:535-41

37. de Clerck I, Boussery K, Pannier JL und Van De Voorde J. Potassium potently relaxes small rat skeletal muscle arteries. Med Sci Sports Exerc 2003;35:2005-12

38. Sobey CG und Faraci FM. Knockout blow for channel identity crisis: vasodilation to potassium is mediated via Kir2.1. Circ Res 2000;87:83-4

39. Matoba T, Shimokawa H, Kubota H, Morikawa K, Fujiki T, Kunihiro I, Mukai Y, Hirakawa Y und Takeshita A. Hydrogen peroxide is an endothelium-derived hyperpolarizing factor in human mesenteric arteries. Biochem Biophys Res Commun 2002;290:909-13

LITERATUR

67

40. Matoba T, Shimokawa H, Nakashima M, Hirakawa Y, Mukai Y, Hirano K, Kanaide H und Takeshita A. Hydrogen peroxide is an endothelium-derived hyperpolarizing factor in mice. J Clin Invest 2000;106:1521-30

41. Marvar PJ, Hammer LW und Boegehold MA. Hydrogen peroxide-dependent arteriolar dilation in contracting muscle of rats fed normal and high salt diets. Microcirculation 2007;14:779-91

42. Randall MD, Alexander SP, Bennett T, Boyd EA, Fry JR, Gardiner SM, Kemp PA, McCulloch AI und Kendall DA. An endogenous cannabinoid as an endothelium-derived vasorelaxant. Biochem Biophys Res Commun 1996;229:114-20

43. Chauhan SD, Hobbs AJ und Ahluwalia A. C-type natriuretic peptide: new candidate for endothelium-derived hyperpolarising factor. Int J Biochem Cell Biol 2004;36:1878-81

44. Griffith TM. Endothelium-dependent smooth muscle hyperpolarization: do gap junctions provide a unifying hypothesis? Br J Pharmacol 2004;141:881-903

45. Chaytor AT, Bakker LM, Edwards DH und Griffith TM. Connexin-mimetic peptides dissociate electrotonic EDHF-type signalling via myoendothelial and smooth muscle gap junctions in the rabbit iliac artery. Br J Pharmacol 2005;144:108-14

46. Berman RS, Martin PE, Evans WH und Griffith TM. Relative contributions of NO and gap junctional communication to endothelium-dependent relaxations of rabbit resistance arteries vary with vessel size. Microvasc Res 2002;63:115-28

47. Ujiie H, Chaytor AT, Bakker LM und Griffith TM. Essential role of Gap junctions in NO- and prostanoid-independent relaxations evoked by acetylcholine in rabbit intracerebral arteries. Stroke 2003;34:544-50

48. Edwards G, Feletou M, Gardener MJ, Thollon C, Vanhoutte PM und Weston AH. Role of gap junctions in the responses to EDHF in rat and guinea-pig small arteries. Br J Pharmacol 1999;128:1788-94

49. Welsh DG und Segal SS. Endothelial and smooth muscle cell conduction in arterioles controlling blood flow. Am J Physiol 1998;274:H178-86

50. Yamamoto Y, Klemm MF, Edwards FR und Suzuki H. Intercellular electrical communication among smooth muscle and endothelial cells in guinea-pig mesenteric arterioles. J Physiol 2001;535:181-95

51. Emerson GG und Segal SS. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ Res 2000;87:474-9

52. Siegl D, Koeppen M, Wolfle SE, Pohl U und de Wit C. Myoendothelial coupling is not prominent in arterioles within the mouse cremaster microcirculation in vivo. Circ Res 2005;97:781-8

LITERATUR

68

53. de Wit C, Boettcher M und Schmidt VJ. Signaling across myoendothelial gap junctions--fact or fiction? Cell Commun Adhes 2008;15:231-45

54. Joyner MJ und Wilkins BW. Exercise hyperaemia: is anything obligatory but the hyperaemia? J Physiol 2007;583:855-60

55. Lash JM. Contribution of arterial feed vessels to skeletal muscle functional hyperemia. J Appl Physiol 1994;76:1512-9

56. Segal SS. Integration of blood flow control to skeletal muscle: key role of feed arteries. Acta Physiol Scand 2000;168:511-8

57. Segal SS und Duling BR. Flow control among microvessels coordinated by intercellular conduction. Science 1986;234:868-70

58. Segal SS, Welsh DG und Kurjiaka DT. Spread of vasodilatation and vasoconstriction along feed arteries and arterioles of hamster skeletal muscle. J Physiol 1999;516 ( Pt 1):283-91

59. Duza T und Sarelius IH. Conducted dilations initiated by purines in arterioles are endothelium dependent and require endothelial Ca2+. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003;285:H26-37

60. Wolfle SE, Schmidt VJ, Hoepfl B, Gebert A, Alcolea S, Gros D und de Wit C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ Res 2007;101:1292-9

61. Chen Y und Rivers RJ. Nonvasomotor influence of sodium nitroprusside on arteriolar remote response to methacholine. J Vasc Res 2001;38:219-27

62. Looft-Wilson RC, Payne GW und Segal SS. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol 2004;97:1152-8

63. Emerson GG und Segal SS. Endothelial cell pathway for conduction of hyperpolarization and vasodilation along hamster feed artery. Circ Res 2000;86:94-100

64. Hoepfl B, Rodenwaldt B, Pohl U und de Wit C. EDHF, but not NO or prostaglandins, is critical to evoke a conducted dilation upon ACh in hamster arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002;283:H996-H1004

65. Doyle MP und Duling BR. Acetylcholine induces conducted vasodilation by nitric oxide-dependent and -independent mechanisms. Am J Physiol 1997;272:H1364-71

66. Domeier TL und Segal SS. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol 2007;579:175-86

67. Dora KA, Xia J und Duling BR. Endothelial cell signaling during conducted vasomotor responses. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003;285:H119-26

LITERATUR

69

68. Goodenough DA, Goliger JA und Paul DL. Connexins, connexons, and intercellular communication. Annu Rev Biochem 1996;65:475-502

69. Kumar NM und Gilula NB. The gap junction communication channel. Cell 1996;84:381-8

70. Haefliger JA, Nicod P und Meda P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovasc Res 2004;62:345-56

71. Yeh HI, Rothery S, Dupont E, Coppen SR und Severs NJ. Individual gap junction plaques contain multiple connexins in arterial endothelium. Circ Res 1998;83:1248-63

72. Rummery NM und Hill CE. Vascular gap junctions and implications for hypertension. Clin Exp Pharmacol Physiol 2004;31:659-67

73. Griffith TM. Which connexins connect? Circ Res 2007;101:1219-21

74. Gabriels JE und Paul DL. Connexin43 is highly localized to sites of disturbed flow in rat aortic endothelium but connexin37 and connexin40 are more uniformly distributed. Circ Res 1998;83:636-43

75. de Wit C, Roos F, Bolz SS, Kirchhoff S, Kruger O, Willecke K und Pohl U. Impaired conduction of vasodilation along arterioles in connexin40-deficient mice. Circ Res 2000;86:649-55

76. Naik JS, Valic Z, Buckwalter JB und Clifford PS. Rapid vasodilation in response to a brief tetanic muscle contraction. J Appl Physiol 1999;87:1741-6

77. Murrant CL. Stimulation characteristics that determine arteriolar dilation in skeletal muscle. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005;289:R505-R513

78. Armstrong RB und Laughlin MH. Rat muscle blood flows during high-speed locomotion. J Appl Physiol 1985;59:1322-8

79. Laughlin MH und Armstrong RB. Muscular blood flow distribution patterns as a function of running speed in rats. Am J Physiol 1982;243:H296-306

80. Bockman EL. Blood flow and oxygen consumption in active soleus and gracilis muscles in cats. Am J Physiol 1983;244:H546-51

81. Mohrman DE und Regal RR. Relation of blood flow to VO2, PO2, and PCO2 in dog gastrocnemius muscle. Am J Physiol 1988;255:H1004-10

82. Dobson JL und Gladden LB. Effect of rhythmic tetanic skeletal muscle contractions on peak muscle perfusion. J Appl Physiol 2003;94:11-9

83. Hamann JJ, Buckwalter JB und Clifford PS. Vasodilatation is obligatory for contraction-induced hyperaemia in canine skeletal muscle. J Physiol 2004;557:1013-20

84. Hamann JJ, Valic Z, Buckwalter JB und Clifford PS. Muscle pump does not enhance blood flow in exercising skeletal muscle. J Appl Physiol 2003;94:6-10

LITERATUR

70

85. Dyke CK, Dietz NM, Lennon RL, Warner DO und Joyner MJ. Forearm blood flow responses to handgripping after local neuromuscular blockade. J Appl Physiol 1998;84:754-8

86. Hellsten Y, Krustrup P, Iaia FM, Secher NH und Bangsbo J. Partial neuromuscular blockade in humans enhances muscle blood flow during exercise independently of muscle oxygen uptake and acetylcholine receptor blockade. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2009;296:R1106-12

87. Kirby BS, Carlson RE, Markwald RR, Voyles WF und Dinenno FA. Mechanical influences on skeletal muscle vascular tone in humans: insight into contraction-induced rapid vasodilatation. J Physiol 2007;583:861-74

88. Clifford PS. Skeletal muscle vasodilatation at the onset of exercise. J Physiol 2007;583:825-33

89. Koller A und Bagi Z. On the role of mechanosensitive mechanisms eliciting reactive hyperemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002;283:H2250-9

90. Armstrong ML, Dua AK und Murrant CL. Time course of vasodilation at the onset of repetitive skeletal muscle contractions. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2007;292:R505-15

91. Lott ME, Hogeman CS, Vickery L, Kunselman AR, Sinoway LI und MacLean DA. Effects of dynamic exercise on mean blood velocity and muscle interstitial metabolite responses in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2001;281:H1734-41

92. Hellsten Y, Maclean D, Radegran G, Saltin B und Bangsbo J. Adenosine concentrations in the interstitium of resting and contracting human skeletal muscle. Circulation 1998;98:6-8

93. Koch LG, Britton SL und Metting PJ. Adenosine is not essential for exercise hyperaemia in the hindlimb in conscious dogs. J Physiol 1990;429:63-75

94. Marshall JM. The roles of adenosine and related substances in exercise hyperaemia. J Physiol 2007;583:835-45

95. Hnik P, Holas M, Krekule I, Kuriz N, Mejsnar J, Smiesko V, Ujec E und Vyskocil F. Work-induced potassium changes in skeletal muscle and effluent venous blood assessed by liquid ion-exchanger microelectrodes. Pflugers Arch 1976;362:85-94

96. Armstrong ML, Dua AK und Murrant CL. Potassium initiates vasodilatation induced by a single skeletal muscle contraction in hamster cremaster muscle. J Physiol 2007;581:841-52

97. Roach RC, Koskolou MD, Calbet JA und Saltin B. Arterial O2 content and tension in regulation of cardiac output and leg blood flow during exercise in humans. Am J Physiol 1999;276:H438-45

LITERATUR

71

98. Knight DR, Schaffartzik W, Poole DC, Hogan MC, Bebout DE und Wagner PD. Effects of hyperoxia on maximal leg O2 supply and utilization in men. J Appl Physiol 1993;75:2586-94

99. Frisbee JC, Murrant CL, Wilson BA und Barclay JK. Polycythemia decreases fatigue in tetanic contractions of canine skeletal muscle. Med Sci Sports Exerc 1999;31:1293-8

100. Silveira LR, Pereira-Da-Silva L, Juel C und Hellsten Y. Formation of hydrogen peroxide and nitric oxide in rat skeletal muscle cells during contractions. Free Radic Biol Med 2003;35:455-64

101. Frandsen U, Lopez-Figueroa M und Hellsten Y. Localization of nitric oxide synthase in human skeletal muscle. Biochem Biophys Res Commun 1996;227:88-93

102. McMahon TJ, Moon RE, Luschinger BP, Carraway MS, Stone AE, Stolp BW, Gow AJ, Pawloski JR, Watke P, Singel DJ, Piantadosi CA und Stamler JS. Nitric oxide in the human respiratory cycle. Nat Med 2002;8:711-7

103. Tschakovsky ME und Joyner MJ. Nitric oxide and muscle blood flow in exercise. Appl Physiol Nutr Metab 2008;33:151-61

104. Radegran G und Saltin B. Nitric oxide in the regulation of vasomotor tone in human skeletal muscle. Am J Physiol 1999;276:H1951-60

105. Shoemaker JK, Halliwill JR, Hughson RL und Joyner MJ. Contributions of acetylcholine and nitric oxide to forearm blood flow at exercise onset and recovery. Am J Physiol 1997;273:H2388-95

106. Frandsenn U, Bangsbo J, Sander M, Hoffner L, Betak A, Saltin B und Hellsten Y. Exercise-induced hyperaemia and leg oxygen uptake are not altered during effective inhibition of nitric oxide synthase with N(G)-nitro-L-arginine methyl ester in humans. J Physiol 2001;531:257-64

107. Saunders NR, Dinenno FA, Pyke KE, Rogers AM und Tschakovsky ME. Impact of combined NO and PG blockade on rapid vasodilation in a forearm mild-to-moderate exercise transition in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005;288:H214-20

108. Saltin B. Exercise hyperaemia: magnitude and aspects on regulation in humans. J Physiol 2007;583:819-23

109. Mortensen SP, Nyberg M, Thaning P, Saltin B und Hellsten Y. Adenosine contributes to blood flow regulation in the exercising human leg by increasing prostaglandin and nitric oxide formation. Hypertension 2009;53:993-9

110. Dyke CK, Proctor DN, Dietz NM und Joyner MJ. Role of nitric oxide in exercise hyperaemia during prolonged rhythmic handgripping in humans. J Physiol 1995;488 ( Pt 1):259-65

LITERATUR

72

111. Gilligan DM, Panza JA, Kilcoyne CM, Waclawiw MA, Casino PR und Quyyumi AA. Contribution of endothelium-derived nitric oxide to exercise-induced vasodilation. Circulation 1994;90:2853-8

112. Boushel R, Langberg H, Gemmer C, Olesen J, Crameri R, Scheede C, Sander M und Kjaer M. Combined inhibition of nitric oxide and prostaglandins reduces human skeletal muscle blood flow during exercise. J Physiol 2002;543:691-8

113. Mortensen SP, Gonzalez-Alonso J, Damsgaard R, Saltin B und Hellsten Y. Inhibition of nitric oxide and prostaglandins, but not endothelial-derived hyperpolarizing factors, reduces blood flow and aerobic energy turnover in the exercising human leg. J Physiol 2007;581:853-61

114. Hussain SN, Stewart DJ, Ludemann JP und Magder S. Role of endothelium-derived relaxing factor in active hyperemia of the canine diaphragm. J Appl Physiol 1992;72:2393-401

115. Hester RL, Eraslan A und Saito Y. Differences in EDNO contribution to arteriolar diameters at rest and during functional dilation in striated muscle. Am J Physiol 1993;265:H146-51

116. Hirai T, Visneski MD, Kearns KJ, Zelis R und Musch TI. Effects of NO synthase inhibition on the muscular blood flow response to treadmill exercise in rats. J Appl Physiol 1994;77:1288-93

117. Maxwell AJ, Schauble E, Bernstein D und Cooke JP. Limb blood flow during exercise is dependent on nitric oxide. Circulation 1998;98:369-74

118. Musch TI, McAllister RM, Symons JD, Stebbins CL, Hirai T, Hageman KS und Poole DC. Effects of nitric oxide synthase inhibition on vascular conductance during high speed treadmill exercise in rats. Exp Physiol 2001;86:749-57

119. Ray CJ und Marshall JM. Nitric oxide (NO) does not contribute to the generation or action of adenosine during exercise hyperaemia in rat hindlimb. J Physiol 2009;587:1579-91

120. Lau KS, Grange RW, Isotani E, Sarelius IH, Kamm KE, Huang PL und Stull JT. nNOS and eNOS modulate cGMP formation and vascular response in contracting fast-twitch skeletal muscle. Physiol Genomics 2000;2:21-7

121. Kilbom A und Wennmalm A. Endogenous prostaglandins as local regulators of blood flow in man: effect of indomethacin on reactive and functional hyperaemia. J Physiol 1976;257:109-21

122. Wilson JR und Kapoor SC. Contribution of prostaglandins to exercise-induced vasodilation in humans. Am J Physiol 1993;265:H171-5

123. Shoemaker JK, Naylor HL, Pozeg ZI und Hughson RL. Failure of prostaglandins to modulate the time course of blood flow during dynamic forearm exercise in humans. J Appl Physiol 1996;81:1516-21

LITERATUR

73

124. McKay MK, Gardner AL, Boyd D und Hester RL. Influence of venular prostaglandin release on arteriolar diameter during functional hyperemia. Hypertension 1998;31:213-7

125. Sagach VF, Kindybalyuk AM und Kovalenko TN. Functional hyperemia of skeletal muscle: role of endothelium. J Cardiovasc Pharmacol 1992;20 Suppl 12:S170-5

126. Duza T und Sarelius IH. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol 2004;555:459-69

127. Kirchhoff S, Nelles E, Hagendorff A, Kruger O, Traub O und Willecke K. Reduced cardiac conduction velocity and predisposition to arrhythmias in connexin40-deficient mice. Curr Biol 1998;8:299-302

128. Alcolea S, Jarry-Guichard T, de Bakker J, Gonzalez D, Lamers W, Coppen S, Barrio L, Jongsma H, Gros D und van Rijen H. Replacement of connexin40 by connexin45 in the mouse: impact on cardiac electrical conduction. Circ Res 2004;94:100-9

129. Si H, Heyken WT, Wolfle SE, Tysiac M, Schubert R, Grgic I, Vilianovich L, Giebing G, Maier T, Gross V, Bader M, de Wit C, Hoyer J und Kohler R. Impaired endothelium-derived hyperpolarizing factor-mediated dilations and increased blood pressure in mice deficient of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel. Circ Res 2006;99:537-44

130. Brahler S, Kaistha A, Schmidt VJ, Wolfle SE, Busch C, Kaistha BP, Kacik M, Hasenau AL, Grgic I, Si H, Bond CT, Adelman JP, Wulff H, de Wit C, Hoyer J und Kohler R. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation 2009;119:2323-32

131. Bond CT, Sprengel R, Bissonnette JM, Kaufmann WA, Pribnow D, Neelands T, Storck T, Baetscher M, Jerecic J, Maylie J, Knaus HG, Seeburg PH und Adelman JP. Respiration and parturition affected by conditional overexpression of the Ca2+-activated K+ channel subunit, SK3. Science 2000;289:1942-6

132. Baez S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res 1973;5:384-94

133. Cohen KD, Berg BR und Sarelius IH. Remote arteriolar dilations in response to muscle contraction under capillaries. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000;278:H1916-23

134. de Wit C, von Bismarck P und Pohl U. Mediator role of prostaglandins in acetylcholine-induced vasodilation and control of resting vascular diameter in the hamster cremaster microcirculation in vivo. J Vasc Res 1993;30:272-8

135. Strobaek D, Jorgensen TD, Christophersen P, Ahring PK und Olesen SP. Pharmacological characterization of small-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels stably expressed in HEK 293 cells. Br J Pharmacol 2000;129:991-9

LITERATUR

74

136. Rosa JC, Galanakis D, Ganellin CR, Dunn PM und Jenkinson DH. Bis-quinolinium cyclophanes: 6,10-diaza-3(1,3),8(1,4)-dibenzena-1,5(1,4)- diquinolinacyclodecaphane (UCL 1684), the first nanomolar, non-peptidic blocker of the apamin-sensitive Ca(2+)-activated K+ channel. J Med Chem 1998;41:2-5

137. Liegeois JF, Mercier F, Graulich A, Graulich-Lorge F, Scuvee-Moreau J und Seutin V. Modulation of small conductance calcium-activated potassium (SK) channels: a new challenge in medicinal chemistry. Curr Med Chem 2003;10:625-47

138. Wolfle S, Kohler R, Hoyer J und de Wit C. IKCa is a major effector in EDHF-dilations in arterioles in vivo. Acta Physiol 2007;189, Supplement 653: O18-4

139. Dua AK, Dua N und Murrant CL. Skeletal muscle contraction-induced vasodilator complement production is dependent on stimulus and contraction frequency. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009;297:H433-42

140. VanTeeffelen JW und Segal SS. Rapid dilation of arterioles with single contraction of hamster skeletal muscle. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006;290:H119-27

141. Eichler I, Wibawa J, Grgic I, Knorr A, Brakemeier S, Pries AR, Hoyer J und Kohler R. Selective blockade of endothelial Ca2+-activated small- and intermediate-conductance K+-channels suppresses EDHF-mediated vasodilation. Br J Pharmacol 2003;138:594-601

142. Hinton JM und Langton PD. Inhibition of EDHF by two new combinations of K+-channel inhibitors in rat isolated mesenteric arteries. Br J Pharmacol 2003;138:1031-5

143. Gluais P, Edwards G, Weston AH, Falck JR, Vanhoutte PM und Feletou M. Role of SK(Ca) and IK(Ca) in endothelium-dependent hyperpolarizations of the guinea-pig isolated carotid artery. Br J Pharmacol 2005;144:477-85

144. Wolfle SE, Schmidt VJ, Hoyer J, Kohler R und de Wit C. Prominent role of KCa3.1 in endothelium-derived hyperpolarizing factor-type dilations and conducted responses in the microcirculation in vivo. Cardiovasc Res 2009;82:476-83

145. Ledoux J, Taylor MS, Bonev AD, Hannah RM, Solodushko V, Shui B, Tallini Y, Kotlikoff MI und Nelson MT. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:9627-32

146. Sandow SL, Neylon CB, Chen MX und Garland CJ. Spatial separation of endothelial small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels (K(Ca)) and connexins: possible relationship to vasodilator function? J Anat 2006;209:689-98

147. Dora KA, Gallagher NT, McNeish A und Garland CJ. Modulation of endothelial cell KCa3.1 channels during endothelium-derived hyperpolarizing factor signaling in mesenteric resistance arteries. Circ Res 2008;102:1247-55

LITERATUR

75

148. Berg BR, Cohen KD und Sarelius IH. Direct coupling between blood flow and metabolism at the capillary level in striated muscle. Am J Physiol 1997;272:H2693-700

149. Murrant CL und Sarelius IH. Local and remote arteriolar dilations initiated by skeletal muscle contraction. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000;279:H2285-94

150. Schweda F, Kurtz L, de Wit C, Janssen-Bienhold U, Kurtz A und Wagner C. Substitution of connexin40 with connexin45 prevents hyperreninemia and attenuates hypertension. Kidney Int 2009;75:482-9

151. Just A, Kurtz L, de Wit C, Wagner C, Kurtz A und Arendshorst WJ. Connexin 40 mediates the tubuloglomerular feedback contribution to renal blood flow autoregulation. J Am Soc Nephrol 2009;20:1577-85

152. Krattinger N, Capponi A, Mazzolai L, Aubert JF, Caille D, Nicod P, Waeber G, Meda P und Haefliger JA. Connexin40 regulates renin production and blood pressure. Kidney Int 2007;72:814-22

153. Spray DC. Hypertension in connexin40-null mice: a renin disorder. Kidney Int 2007;72:781-2

154. Wagner C, de Wit C, Kurtz L, Grunberger C, Kurtz A und Schweda F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res 2007;100:556-63

155. Plum A, Hallas G, Magin T, Dombrowski F, Hagendorff A, Schumacher B, Wolpert C, Kim J, Lamers WH, Evert M, Meda P, Traub O und Willecke K. Unique and shared functions of different connexins in mice. Curr Biol 2000;10:1083-91

156. van Veen TA, van Rijen HV und Jongsma HJ. Electrical conductance of mouse connexin45 gap junction channels is modulated by phosphorylation. Cardiovasc Res 2000;46:496-510

157. Beblo DA, Wang HZ, Beyer EC, Westphale EM und Veenstra RD. Unique conductance, gating, and selective permeability properties of gap junction channels formed by connexin40. Circ Res 1995;77:813-22

158. Bukauskas FF und Verselis VK. Gap junction channel gating. Biochim Biophys Acta 2004;1662:42-60

159. van Rijen HV, van Veen TA, Hermans MM und Jongsma HJ. Human connexin40 gap junction channels are modulated by cAMP. Cardiovasc Res 2000;45:941-51

160. Clifford PS, Kluess HA, Hamann JJ, Buckwalter JB und Jasperse JL. Mechanical compression elicits vasodilatation in rat skeletal muscle feed arteries. J Physiol 2006;572:561-7

161. Sandow SL, Looft-Wilson R, Doran B, Grayson TH, Segal SS und Hill CE. Expression of homocellular and heterocellular gap junctions in hamster arterioles and feed arteries. Cardiovasc Res 2003;60:643-53

LITERATUR

76

162. de Wit C. Different pathways with distinct properties conduct dilations in the microcirculation in vivo. Cardiovasc Res 2010;85:604-13

163. de Wit C, Esser N, Lehr HA, Bolz SS und Pohl U. Pentobarbital-sensitive EDHF comediates ACh-induced arteriolar dilation in the hamster microcirculation. Am J Physiol 1999;276:H1527-34

164. Loeb AL, Godeny I und Longnecker DE. Anesthetics alter relative contributions of NO and EDHF in rat cremaster muscle microcirculation. Am J Physiol 1997;273:H618-27

165. Gillham JC, Myers JE, Baker PN und Taggart MJ. Regulation of endothelial-dependent relaxation in human systemic arteries by SKCa and IKCa channels. Reprod Sci 2007;14:43-50

166. Grgic I, Kaistha BP, Hoyer J und Kohler R. Endothelial Ca+-activated K+ channels in normal and impaired EDHF-dilator responses--relevance to cardiovascular pathologies and drug discovery. Br J Pharmacol 2009;157:509-26

167. Sankaranarayanan A, Raman G, Busch C, Schultz T, Zimin PI, Hoyer J, Kohler R und Wulff H. Naphtho[1,2-d]thiazol-2-ylamine (SKA-31), a new activator of KCa2 and KCa3.1 potassium channels, potentiates the endothelium-derived hyperpolarizing factor response and lowers blood pressure. Mol Pharmacol 2009;75:281-95

168. Sheng JZ, Ella S, Davis MJ, Hill MA und Braun AP. Openers of SKCa and IKCa channels enhance agonist-evoked endothelial nitric oxide synthesis and arteriolar vasodilation. Faseb J 2009;23:1138-45

169. Kohler R, Kaistha BP und Wulff H. Vascular KCa-channels as therapeutic targets in hypertension and restenosis disease. Expert Opin Ther Targets 2010;14:143-55

170. Feletou M. Calcium-activated potassium channels and endothelial dysfunction: therapeutic options? Br J Pharmacol 2009;156:545-62

171. Kohler R und Ruth P. Endothelial dysfunction and blood pressure alterations in K(+)-channel transgenic mice. Pflugers Arch 2010

172. Feletou M, Kohler R und Vanhoutte PM. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Curr Hypertens Rep 2010;12:267-75

173. Hanner F, Sorensen CM, Holstein-Rathlou NH und Peti-Peterdi J. Connexins and the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2010

174. Kurtz L, Madsen K, Kurt B, Jensen BL, Walter S, Banas B, Wagner C und Kurtz A. High-Level Connexin Expression in the Human Juxtaglomerular Apparatus. Nephron Physiol 2010;116:p1-p8

175. Firouzi M, Kok B, Spiering W, Busjahn A, Bezzina CR, Ruijter JM, Koeleman BP, Schipper M, Groenewegen WA, Jongsma HJ und de Leeuw PW.

LITERATUR

77

Polymorphisms in human connexin40 gene promoter are associated with increased risk of hypertension in men. J Hypertens 2006;24:325-30

176. Gros D, Dupays L, Alcolea S, Meysen S, Miquerol L und Theveniau-Ruissy M. Genetically modified mice: tools to decode the functions of connexins in the heart-new models for cardiovascular research. Cardiovasc Res 2004;62:299-308

177. Laird DW. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem J 2006;394:527-43

ANHANG

78

7. Anhang

7.1 Verwendete Substanzen

Substanz Hersteller

Acetylcholin Sigma-Aldrich, München

Adenosin Sigma-Aldrich, München

Agarose Invitrogen, Karlsruhe

Borsäure Sigma-Aldrich, München

Bromphenolblau Merck, Darmstadt

CaCl2 x 2 H2O Merck, Darmstadt

DMSO Sigma-Aldrich, München

DNA Ladder plus Invitrogen, Karlsruhe

dNTPs peqlab, Erlangen

Doxycyclin Sigma-Aldrich, München

EDTA Merck, Darmstadt

Ethanol Roth, Karlsruhe

Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe

Fentanyl Curamed, Karlsruhe

Glycerol 87 % Sigma-Aldrich, München

Indomethacin Alpharma-isis, Langenfeld

Isopropanol Merck, Darmstadt

KCl Merck, Darmstadt

KH2PO4 Merck, Darmstadt

Nitro-L-Arginin Sigma-Aldrich, München

Medetomidin Pfizer, Karlsruhe

MgCl2 Invitrogen, Karlsruhe

MgSO4 x 7 H2O Merck, Darmstadt

Midazolam DeltaSelect, Dreieich

NaCl Merck, Darmstadt

NaHCO3 Merck, Darmstadt

Natriumacetat Merck, Darmstadt

ANHANG

79

Natriumnitroprussid Sigma-Aldrich, München

PCR-Puffer Invitrogen, Karlsruhe

Pentobarbital Merial, Halbergmoos

Primer zur PCR MWG-Biotech, Ebersberg

Proteinase K Invitrogen, Karlsruhe

Saccharose AppliChem, Darmstadt

SDS Porphyrin Systems, Lübeck

Taq-Polymerase Invitrogen, Karlsruhe

Tris-HCl (pH 8,0) Roth, Karlsruhe

Tris-Borat (pH 7,5) Sigma-Aldrich, München

UCL 1684 Tocris, Ellisville, USA

Gasgemisch 5 % CO2, 95 % N2 Linde, München

ANHANG

80

7.2 Lösungen und Puffer

Doxycyclinlösung TBE-Puffer

Doxycyclin 2 g/l Tris-Borat 89 mM

Saccharose 20 g/l Borsäure 89 mM

Trinkwasser EDTA 2 mM

Entmineralisiertes Wasser

Ladepuffer

Glycerol 87 % 3,45 ml TE-Puffer

Bromphenolblau 1 Spatelspitze Tris-HCl 10 mM

TBE-Puffer 6,55 ml EDTA 1 mM


Laird-Puffer

Tris-HCl 100 mM Superfusionslösung

SDS 0,2 % (Krebslösung)

EDTA 5 mM Na+ 138 mM

NaCl 200 mM K+ 5 mM

Entmineralisiertes Wasser Ca2+ 2,5 mM

Mg2+ 1,2 mM

Ringerlösung HCO3- 20 mM

Na+ 147 mM SO42- 1,2 mM

K+ 4 mM H2PO4- 1,2 mM

Ca2+ 2,5 mM Cl- 127,2 mM

Cl- 156 mM Entmineralisiertes Wasser


ANHANG

81

7.3 Weitere Materialien

Chirurgisches Nahtmaterial 6/0 (Prolene®) Ethicon, Hamburg

Platindraht (25 µm Durchmesser ) Chempur, Karlsruhe

Polyethylenkatheter PE 10 Schubert, München

Polyethylenkatheter PE 50 Schubert, München

7.4 PCR

7.4.1 Verwendete Primer

Tiere Primer Sequenz

IKCa-ko IKCa forward

IKCawt reverse

IKCako reverse

5’-CTTTGGATCCAGATGTTTCTTGGTGTTAAG-3’

5’-GCCACAGTGTGTCTGTGAGG-3’

5’-CGTGCAATCCATCTTGTTCA-3’

Cx40ko Cx40wt forward

Cx40wt reverse

Cx40ko forward

Cx40ko reverse

5'-GGGAGATGAGCAGGCCGACTTCCGGTGCG-3’

5'-GTAGGGTGCCCTGGAGGACAATCTTCCC-3'

5'-GGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCAC-3'

5'-CTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCG-3'

Cx40KI45 Cx40 forward

Cx40wt reverse

Cx40cx45ki reverse

5’-AGGCAGGCTCATGTGGAGCT-3’

5’-AGGCTGAATGGTATCGCACC-3’

5’-TTCTTCCAGAGCCCGGTGCTG-3’

ANHANG

82

7.4.2 Reaktionsansätze

IKCa-ko Cx40ko bzw.

Cx40KI45

Probenvolumen 1,0 µl 3,5 µl

dNTPs je 25 mM 1,0 µl 0,4 µl

PCR Puffer 2,5 µl 2,5 µl

MgCl2 50 mM 0,63 µl 1,25 µl

Primermix 100 pmol/µl 3,0 µl 0,8 µl

Taq-Polymerase 5 U/µl 0,25 µl 0,25 µl

Entmineralisiertes Wasser 16,62 µl 16,3 µl

7.4.3 Temperaturverläufe

Cx40ko

Anzahl Temperatur Zeit

Einmalig 94 °C 1 min

38 Zyklen 94 °C

65 °C

72 °C

40 s

1 min

1 min


IKCa-ko



10 Zyklen 94 °C

58 °C

72 °C

35 s

35 s

50 s

25 Zyklen 94 °C

58 °C

72 °C

35 s

35 s

50 s*


* Verlängerung um 5 s mit jedem Zyklus

Cx40KI45


Einmalig 94 °C 2,5 min

35 Zyklen 94 °C

68 °C

72 °C

40 s

30 s

40 s


DANKSAGUNG

83

8. Danksagung

Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Cor de Wit für die

Überlassung dieses spannenden Themas und die fachlich hervorragende und

freundschaftliche Betreuung im Verlauf der Erstellung dieser Promotion. Durch

seine Kompetenz und allzeit vorhandene Diskussionsbereitschaft habe ich nicht

nur einen Einstieg in die wissenschaftliche Arbeitsweise bekommen, mir wurde

auch die Freude daran vermittelt. Sowohl bei der täglichen Arbeit als auch im

Rahmen verschiedener Kongressbesuche konnte Cor de Wit mich immer wieder

aufs Neue motivieren und half mir, auch über die eine oder andere Durststrecke

hinweg den roten Faden nicht zu verlieren.

Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. med. W. Jelkmann für die freundliche

Aufnahme im Institut für Physiologie und die Unterstützung, die mir für die

vorliegende Arbeit gewährt wurde. Ebenso danke ich allen weiteren Mitarbeitern

des Institutes, die für eine stets angenehme Arbeitsatmosphäre sorgten und mir

immer mit Rat und Tat zur Seite standen. Hierbei möchte ich ganz besonders Rita

Meuer hervorheben, die mir mit ihrer technischen Erfahrung nicht nur über allerlei

Hürden des Laboralltags hinweg geholfen hat, sondern mich auch oft mit einem

Becher Tee und ein paar netten Worten bei der Stange gehalten hat. Ebenso

wertvoll war für mich die Unterstützung der anderen Doktoranden der

Arbeitsgruppe, die mich zu Beginn der Arbeit geduldig in die Technik der

Intravitalmikroskopie einführten und auf deren Hilfe ich mich auch später jederzeit

verlassen konnte – vielen Dank insbesondere an Steffi Wölfle, Volker Schmidt und

Markus Böttcher.

Auch Herrn Prof. Dr. rer. nat. Ralf Köhler möchte ich an dieser Stelle nicht

unerwähnt lassen – vielen Dank für das Bereitstellen der genetisch veränderten

Mäuse, die für diese Arbeit von elementarer Bedeutung waren, sowie für die

konstruktive Mitarbeit an der gemeinsam herausgebrachten Veröffentlichung.

DANKSAGUNG

84

Dankbar bin ich auch dem Dekanat der Universität zu Lübeck sowie der

Studienstiftung des Deutschen Volkes e.V., die mir jeweils durch ihre finanzielle

Unterstützung erst ermöglicht haben, die nötige Zeit in den experimentellen Teil

dieser Arbeit zu investieren.

Schließlich möchte ich noch die Menschen erwähnen, die mir auch außerhalb des

Labors zu jeder Zeit den Rücken frei gehalten haben und mich bei allem

unterstützt haben. Hierbei sind in erster Linie meine Eltern zu nennen, die den

Grundstein für mein Studium und damit auch für diese Arbeit gelegt haben und mir

all dies erst ermöglichten. Mindestens ebenso wichtig war für mich die

Unterstützung meiner Freundin Heike, die jederzeit viel Geduld aufgebracht hat

und immer bereit war, sich auch unausgegorene und verworrene Gedankengänge

von mir anzuhören, die am nächsten Tag schon wieder Schnee von gestern

waren.

Zu guter Letzt danke ich noch all denen, die mir geholfen haben, möglichst viele

Tippfehler in dieser Arbeit noch zu entdecken und zu korrigieren, und die sich

dafür die Zeit genommen haben, sich in dieses komplexe Thema einzudenken –

vielen Dank noch einmal an meine Eltern und an meine Schwester Maren.

LEBENSLAUF

85

9. Lebenslauf

LEBENSLAUF

86

PUBLIKATIONEN

87

10. Publikationen

Originalarbeiten

Milkau M , Köhler R, de Wit C. “Crucial importance of the endothelial K+-

channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle

contraction.” FASEB J., September 1, 2010; 24(9): 3572 – 3579. Epub 28 Apr

2010.

Kongressbeiträge mit Abstractpublikationen

Vorträge

Milkau M , de Wit C. “Arteriolar dilations in response to exercise are attenuated

in Cx40-deficient mice.” Acta Physiol. 192 (Suppl. 663): 77, 2008.

Jahrestagung der Deutschen Physiologischen Gesellschaft, Köln, 2008.

Posterpräsentationen

Boettcher M, Milkau M , de Wit C. “EDHF-type dilations require Cx40 in small

vessels suggesting a role for myoendothelial gap junctions.” J.Vasc.Res. 43:

538, 2006. Jahrestagung der Gesellschaft für Mikrozirkulation und vaskuläre

Biologie, München, 2006.

Milkau M , de Wit C. “Arteriolar dilation in response to skeletal muscle

contraction is reduced in Cx40-deficient mice.” FASEB J. 22: 1144.2, 2008.

Experimental Biology, San Diego, USA, 2008.

PUBLIKATIONEN

88

de Wit C, Milkau M , Hoyer J, Köhler R, Schmidt V. “Ca2+-dependent K+-

channels (IK1, SK3) mediate arteriolar dilation in a distinct stimulus-dependent

fashion.” Acta Physiol. 195 (Suppl. 669): =212, 2009. Jahrestagung der

Deutschen Physiologischen Gesellschaft, Giessen, 2009.

de Wit C, Milkau M , Schmidt VJ, Wolfle SE, Hoyer J, Köhler R. “Ca2+-

dependent K+-channels (IK1, SK3) mediate arteriolar dilation in a distinct

stimulus-dependent fashion.“ FASEB J. 23: 948.22, 2009. Experimental

Biology, New Orleans, USA, 2009.

Kongressbeiträge ohne Abtractpublikationen

Vorträge

Milkau M , Köhler R, de Wit C. “Mechanisms of dilation during active hyperemia

in the skeletal muscle microcirculation.” Rostock workshop on smooth muscle

function, Rostock, 2007.

Milkau M , de Wit C. “Beteiligung von endothelialen KCa und Cx40 an der

arteriolären Dilatation bei Skelettmuskelarbeit.“ Ostseephysiologentagung,

Rostock, 2008.

Posterpräsentationen

Milkau M , de Wit C. “Durchblutungsregulation in der Muskulatur – Die Rolle

von Gap Junctions.“ 1. Lübecker Doktorandentag, Lübeck, 2007.

Milkau M , de Wit C. “Wie wird ein Muskel mit Sauerstoff versorgt? –

Mechanismen der Durchblutungssteigerung.“ 2. Lübecker Doktorandentag,

Lübeck, 2008. (Auszeichnung mit Posterpreis).

endotheliale mechanismen der gefäßdilatation bei der … · regel aus der summe der...

Documents