endonucleasas de restricción
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ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
¿Qué son?Una endonucleasa de restricción es una enzima Una endonucleasa de restricción es una enzima
que se une a una molécula de DNA en una que se une a una molécula de DNA en una secuencia especifica y corta la doble cadena secuencia especifica y corta la doble cadena
en esa secuencia o cerca de ellaen esa secuencia o cerca de ella
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
En 1968 se purificó la primera endonucleasa de restricción, la K12 en E coli.
Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que sepensó que reconocía secuencias específicas del DNA.
Se abandonó porque aunque reconocía una zonadeterminada del DNA, cortaba al DNA a varias Kb de distancia.
En 1970 se aisla otra endonucleasa de restricción enHaemophilus influenzae, que reconoce una secuencia en unduplex de DNA y la rompe en ese lugar produciendo fragmentos discretos de longitud y secuencia bien definidos.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIONFenómeno de restricción: reconocimiento por parte de unabacteria de un DNA extraño y lisis del mismo en pequeñosfragmentos.
El fenómeno de restricción se descubrió en E coli, cuandose hizo crecer el bacteriófago lambda. Si la bacteria creceencontraremos varias colonias por placa. Si no crece, noencontaremos colonias.
En la cepa C de E coli crecía bien el bacteriófago , pero si este se crecía en la cepa K o la R, la eficiencia decrecimiento era mucho menor o nula. El fago era restringidopor esta cepa.
MODIFICACION- RESTRICCION
Ejemplo de restricción de crecimiento
del bacteriófago lamdaen una cepa determinada
de E. coli
La eficiencia con la que el fago
crece en una cepa depende de la
última cepa donde fue propagado.
Explicación:
•El DNA del fago es degradado en cuanto se incorpora, y a la endonucleasa responsable de esta degradación se le llama endonucleasa de restricción o enzima de restricción.
•El huésped restrictivo debe proteger a su propio DNA de la acción de las enzimas de restricción y para ello modifica a su propio DNA.
MODIFICACION- RESTRICCION
Modificación:
•Metilación de ciertas bases en un número muy limitado, justo en los lugares de reconocimiento de las enzimas de restricción.
•El DNA del fago que sobrevive algún ciclo en el huésped restrictivo se replica y también es metilado por las metilasas de la bacteria, y por tanto modificado y protegido, y puede crecer bien en una nueva reinfección.
METILACION Y RESTRICCION
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
Se conocen cuatro tipos de sistemas de restricción y modificación:
•Tipo I:
En la misma enzima tienen 2 subunidades parala restricción, 2 subunidades para la modificación (metilación) y una subunidad para el reconocimiento.
Tanto la metilación como el corte requieren de ATP.
El corte se da a alguna distancia del lugar de reconocimiento.
Poco valor para manipulación genética.
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
•Tipo II:
La restricción (división) y modificación las provocan diferentesenzimas de la bacteria, por lo que puede haber división delDNA en ausencia de modificación.
No requieren de cofactores como ATP o S-adenosilmetioninapor lo que su uso es más sencillo.
El lugar de reconocimiento generalmente es simétrico y cortanal DNA en el lugar de reconocimiento.
SISTEMAS DE RESTRICCION Y
MODIFICACION
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
•Tipo IIs:
Son parecidos a los del tipo II, pero la restricción ocurre enLugares del DNA alejados del lugar de reconocimiento, porLo que su uso en ingeniería genética también es reducido.
•Tipo III:
Tienen lugares de reconocimiento simétricos, pero se parecen en lo demás a los sistemas del tipo I, por lo que son poco útiles.
Algunas enzimas de restricción no entra dentro de esta clasificación.
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
Nomenclatura:
Tres letras: 1a letra de género de la bacteria donde se encontró
2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontró
Letra de la cepa donde se produce la enzima de restricción (si es algunacepa especial)
Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restricción, se especificapor números romanos.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Ejemplos:
HindII Haemophilus influenzae, cepa d, 2 a enzima de restricción
HindIII Haemophilus influenzae, cepa d, 3 a enzima de restricción
SmaI Serratia marcescens, 1a enzima de restricción
BamHI Bacilus amyloliquefaciens, cepa H, 1a enzima
Endonucleasas de tipo II
Reconocen y cortan secuencias de entre 4 y 8 nucleótidos, que tienen un eje rotacional de simetría: Secuencias palíndrome
Se marca con /: lugar donde actua la endonucleasa de restricción
Se marca con *: lugar donde se metilan las bases por modificación
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Cuando la enzima de restricción actua deja dos extremos5´que son complementarios entre sí:
5´- G 5´- AATTC - 3´
3´- CTTAA - 5 G - 5´
A estos extremos creados por las endonucleasas tipo IIse les denomina extremos coheisvos o pegajosos.
No todas las enzimas de restricción tipo II dejan así los extremos.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Extremos cohesivos Extremos romos
ENDONUCLEASAS DERESTRICCION
Para reconocer el tamaño delos fragmentos que se producen tras la acción de unaendonucleasa de restricciónse utiliza la electroforesisen gel de agarosa y latinción con bromurod deetidio.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Se han estudiado 10,000 bacterias paraEncontrar enzimas de restricción.
Se han encontrado 3,000 enzimas deRestricción específicas para aproximadamente 200 secuencias de DNA.
www.rebase.neb.com
Las enzimas diferentes que tienenespecificidad por la misma secuenciade DNA y que cortan en el mismo sitiose les llama isoschizomeros.
Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugaral DNA se les denomina neoeschizomeros.
RFLP
Fragmentos de Restricción de Longitud Polimorfica.
Es un método utilizado por los biólogos Es un método utilizado por los biólogos moleculares para seguir una secuencia moleculares para seguir una secuencia particular de DNA que se transmite a particular de DNA que se transmite a otras células.otras células.Es una técnica en la cual los organismos Es una técnica en la cual los organismos pueden diferenciarse mediante el análisis pueden diferenciarse mediante el análisis de los patrones derivados de la escisión de los patrones derivados de la escisión de su DNA.de su DNA.
Método 1. Extracción de DNA.1. Extracción de DNA.
Puede ser de semen, saliva, sangre o alguna Puede ser de semen, saliva, sangre o alguna otra muestra biológica.otra muestra biológica.
2. Producción de fragmentos de 2. Producción de fragmentos de restricción.restricción.
El DNA es cortado en fragmentos por enzimas El DNA es cortado en fragmentos por enzimas de restricción.de restricción.
3. Los fragmentos de DNA se colocan en 3. Los fragmentos de DNA se colocan en gel de agarosa.gel de agarosa.
Con el propósito de someterlos a una Con el propósito de someterlos a una separación en base a su diferente tamaño.separación en base a su diferente tamaño.
6. Southern blotting.6. Southern blotting.Los fragmentos de DNA separados se Los fragmentos de DNA separados se transfieren por adhesión a una membrana de transfieren por adhesión a una membrana de nylon.nylon.La membrana de nylon es expuesta a sondas La membrana de nylon es expuesta a sondas marcadas de DNA ( fragmentos sinteticos de marcadas de DNA ( fragmentos sinteticos de DNA de secuencia conocida y que DNA de secuencia conocida y que corresponden a zonas selectas de corresponden a zonas selectas de hipervariablidad)hipervariablidad)
Isotopos radioactivosIsotopos radioactivos Película de Rayos X Película de Rayos XSustancias fluorescentesSustancias fluorescentes Película fotográfica Película fotográfica
Aplicaciones de RFLPPruebas de paternidadPruebas de paternidadDeterminar el estado de Determinar el estado de
alguna enfermedadalguna enfermedadMedir tasas de recombinación Medir tasas de recombinación
en un mapeo genéticoen un mapeo genéticoCasos penales.Casos penales.