転写因子mitf抑制作用を...
TRANSCRIPT
メラニン色素産生抑制機能を有する成分の探索
① チロシナーゼ阻害作用
② 抗酸化能
③ 細胞を用いたメラニン産生の評価
マウス由来 B16 melanoma 細胞
各種刺激剤
① チロシナーゼによる酵素反応
② 酸化による重合反応
メラニン色素の
生成過程
成分の生理
機能の評価
ヨブスマソウ
(イヌドウナ)
・キク科コウモリソウ属の多年草
・5、6月頃伸びた若芽を食用とする
・秋田では標高200メートル以上、関東では1500メートル以上で生育する
・民謡「秋田おばこ」にも登場する秋田を代表する山菜
秋田の地域食資源の中からメラニン色素産生を抑制する素材を探索した結果、ヨブスマソウが非常に有効なことを見出した。
メラニン色素産生抑制機能を有する成分の探索
秋田では「ホンナ」、山形では「ボンナ」と
呼ばれ、食用山菜として親しまれている
ヨブスマソウ抽出物のチロシナーゼ阻害作用
A b s o
r b a n
c e 4
9 0 n
m
ヨブスマソウ抽出物 (mg/ml)
0 . 0
0 . 2
0 . 4
0 . 6
0
0 . 0
0 . 2
0 . 4
0 . 6
0 . 8
1 . 0
0 50 100 150
A b
s o r b
a n c e 4
9 0 n
m
熱水
MeOH
70% EtOH抽出物
熱水 熱水抽出物
MeOH MeOH抽出物
ヨブスマソウのチロシナーゼ阻害作用は70%エタノールで抽出した
ものが最も効果的であった。
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Abso
rban
ce 5
17 n
m
熱水 70%
EtOH
MeOH 熱水 70%
EtOH
MeOH
ヨブスマソウ(10 mg/ml)
モミジガサ(10 mg/ml)
Contr
ol
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Abso
rban
ce 5
17 n
m
熱水 70%
EtOH
MeOH 熱水 70%
EtOH
MeOH
ヨブスマソウ(10 mg/ml)
モミジガサ(10 mg/ml)
Contr
ol
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Ab
sorb
ance
49
0 n
m
熱水 70%
EtOH
MeOH 熱水 70%
EtOH
MeOH
ヨブスマソウ(100 mg/ml)
モミジガサ(100 mg/ml)
Co
ntr
ol
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Ab
sorb
ance
49
0 n
m
熱水 70%
EtOH
MeOH 熱水 70%
EtOH
MeOH
ヨブスマソウ(100 mg/ml)
モミジガサ(100 mg/ml)
Co
ntr
ol
キク科コウモリソウ属:ヨブスマソウ(イヌドウナ、ホンナ)と モミジガサ(シドケ)の比較
チロシナーゼ阻害作用 抗酸化能
同じキク科コウモリソウ属の山菜の中でも、モミジガサ(シドケ)よりも
ヨブスマソウ(イヌドウナ、ホンナ)の方がチロシナーゼ阻害作用と
抗酸化能が強かった
0
40
80
120
160
200
Control IBMX
Mela
nin
(mg/
mg
prote
in)
細胞のメラニン含量
熱水 70% EtOH
MeOH 熱水 70% EtOH
MeOH
ヨブスマソウ (25 mg/ml)
モミジガサ (25 mg/ml)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Control IBMX
Mel
anin
(m
g/m
g pr
ote
in)
培地に放出されたメラニン含量
熱水 70% EtOH
MeOH 熱水 70% EtOH
MeOH
ヨブスマソウ (25 mg/ml)
モミジガサ (25 mg/ml)
キク科コウモリソウ属:ヨブスマソウ(イヌドウナ、ホンナ)と モミジガサ(シドケ)の比較
モミジガサよりもヨブスマソウの方がメラニン産生抑制作用が強かった
ヨブスマソウ70%EtOH抽出物を逆相カラムHP-20で分画
1362 gのヨブスマソウから成分を70%エタノールで抽出(44.5 g)
抽出物(42.0 g)を30%エタノールに
縣濁し、逆相樹脂Daiaion HP-20を
詰めたカラムに注入
30%メタノールで溶出: 分画1 (36.3 g = 88.5%)
75%メタノールで溶出: 分画2 (1.2 g = 2.9%)
100%メタノールで溶出: 分画3 (1.9 g = 4.6%)
酢酸エチルで溶出: 分画4 (1.6 g = 3.9%)
脂溶性
低
高
ヨブスマソウ分画のチロシナーゼ阻害作用と抗酸化能
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 20 40 60 80 100
Abs
orb
ance
490
nm
濃度(mg/ml)
分画1
分画2
分画3
分画4
チロシナーゼ阻害作用
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 1 2 3 4 5 6 濃度(mg/ml)
Abs
orb
ance
517
nm
分画1
分画2
分画3
分画4
抗酸化能
チロシナーゼ阻害作用と抗酸化能はいずれも分画2が最も強く、 次いで分画1が強かった。分画3・4にはチロシナーゼ阻害作用は ほとんど見られなかった。
0
40
80
120
160
200
Mel
anin
(µg/
mg
prote
in)
Control IBMX
細胞のメラニン含量
分 画 1
分 画 2
分 画 3
分 画 4
Mel
anin
(m
g/m
g pr
ote
in) 0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Control IBMX
培地に放出されたメラニン含量
分 画 1
分 画 2
分 画 3
分 画 4
ヨブスマソウ分画のメラニン産生に及ぼす影響
チロシナーゼ阻害作用と抗酸化能はいずれも分画2が最も強く、 次いで分画1が強かったが、細胞におけるメラニン産生の抑制は 分画3が最も強く、次いで分画4が強かった
小眼球症関連転写因子 MITF による (Microphthalmia-associated transcription factor )
チロシナーゼ遺伝子の発現促進とメラニン産生
チロシン
チロシナーゼ
MITF リン酸化
DNA
UV
転写
プロモーター配列 チロシナーゼ遺伝子
色素細胞特異的
転写因子
チロシナーゼmRNA
発現増強
メラニン産生
DNA Mボックス
DNA Mボックス
DNA Mボックス
DCT遺伝子
チロシナーゼ遺伝子
TRP-1 遺伝子
DCT酵素
TRP-1 タンパク質
チロシナーゼ 酵素
メラニン 色素
MITF
転写ON
小眼球症関連転写因子 MITF は (Microphthalmia-associated transcription factor )
色素細胞のマスター転写因子である
ヨブスマソウ分画3が遺伝子発現に及ぼす影響
0
50
100
150
200 TRP-1 mRNA
TR
P-1/b-A
ctin (%
of C
ontr
ol)
IBMX
ヨブスマソウFr.3(mg/ml) 3 1.5
+ + +
- -
- 0
50
100
150
200
DCT mRNA
DC
T/b-A
ctin
(% o
f C
ontr
ol)
IBMX
ヨブスマソウFr.3(mg/ml) 3 1.5
+ + +
- -
-
0
50
100
150
200 MITF mRNA
MIT
F/b-A
ctin
(%
of C
ont
rol)
IBMX
ヨブスマソウFr.3(mg/ml) 3 1.5
+ + +
- -
- 0
50
100
150
200
250
Tyr
osi
nase
/b-A
ctin
(%
of co
ntro
l)
Tyrosinase mRNA
IBMX
ヨブスマソウFr.3(mg/ml) 3 1.5
+ + +
- -
-
ヨブスマソウ分画3がメラニン産生に及ぼす影響
0
20
40
60
80
100
120 細胞のメラニン含量
ヨブスマソウFr.3
IBMX + +
1.5 mg/ml
-
- +
0.75 mg/ml
-
Mel
anin
(mg/
mg
prote
in)
0.0
0.3
0.6
0.9 培地に放出されたメラニン含量
Mel
anin
(m
g/m
g pr
ote
in)
ヨブスマソウFr.3
IBMX + +
-
- +
- 1.5 mg/ml
0.75 mg/ml
ヨブスマソウ分画3はMITFの発現を抑制することで、 メラニン産生を低濃度で抑制した。
ヨブスマソウ分画3・4と既存のメラニン抑制剤の比較 mRNA発現
0
50
100
150
200
MITF mRNA
MIT
F/b
-Act
in(%
of
Cont
rol)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Tyr
osi
nase
/b-A
ctin
(%
of
cont
rol)
Tyrosinase mRNA
Control
IBMX Fr.3
ヨブスマソウ (1.5mg/ml)
Fr.4
アルブチン (mg/ml)
15 30
コウジ酸 (mg/ml)
15 30 - + + + + + + +
Control
IBMX Fr.3
ヨブスマソウ (1.5mg/ml)
Fr.4
アルブチン (mg/ml)
15 30
コウジ酸 (mg/ml)
15 30 - + + + + + + +
ヨブスマソウ分画3と4はMITFの発現を抑制したが、アルブチンと コウジ酸は高濃度でも抑制作用は見られなかった。
0
20
40
60
80
100
120
140 細胞のメラニン含量
Mel
anin
(mg/
mg
prote
in)
Control
IBMX Fr.3
ヨブスマソウ (1.5mg/ml)
Fr.4
アルブチン (mg/ml)
15 30
コウジ酸 (mg/ml)
15 30 - + + + + + + +
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4 培地に放出されたメラニン含量
Mel
anin
(m
g/m
g pr
ote
in)
Control
IBMX Fr.3
ヨブスマソウ (1.5mg/ml)
Fr.4
アルブチン (mg/ml)
15 30
コウジ酸 (mg/ml)
15 30 - + + + + + + +
ヨブスマソウ分画3・4と既存のメラニン抑制剤の比較 メラニン産生
ヨブスマソウ分画3と4は、アルブチンやコウジ酸よりも低濃度で 強くメラニン産生を抑制した。
刺激剤の種類によるヨブスマソウ分画3の効果の比較 mRNA発現
Forskolin
0
50
100
150
200
ヨブスマソウFr.3 (1.5mg/ml)
+ + + + - - - -
control a-MSH IBMX
MIT
F/b-A
ctin
(%
of C
ont
rol)
MITF mRNA
0
50
100
150
200
Tyr
osi
nase
/b-A
ctin
(%
of
Cont
rol)
Tyrosinase mRNA
+ + + + - - - -
control Forskolin a-MSH IBMX
ヨブスマソウ分画3は、どの刺激剤においてもMITFのmRNA発現を 強く抑制し、チロシナーゼmRNAの発現を抑制した。
刺激剤の種類によるヨブスマソウ分画3の効果の比較 メラニン産生
ヨブスマソウ Fr.3 (1.5mg/ml)
Forskolin
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
Mel
anin
(mg/
mg
prote
in)
細胞のメラニン含量
+ + + + - - - -
control a-MSH IBMX
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6 培地に放出されたメラニン含量
Mel
anin
(m
g/m
g pr
ote
in)
+ + + + - - - -
control Forskolin a-MSH IBMX
ヨブスマソウ分画3は、どの刺激剤においてもメラニン産生を抑制した。
ヨブスマソウ分画3の抗ガン作用
悪性黒色腫(B16メラノーマ) 肺ガン細胞(A549)に対して 選択的に抗ガン作用を示した
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25
濃度(mg/ml) C
ell vi
abili
ty (
% o
f C
ontr
ol)
20 ×103
cells/ml
5×103
cells/ml
B16 4A5 メラノーマ
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25
B164A5
C3H
HepG2
A549
U937
3T3-L1
濃度(mg/ml)
Cel
l vi
abili
ty (%
of
Cont
rol)
ガン細胞の種類による選択性 細胞密度による効果の相違
細胞が高密度の時に 抗ガン作用が強く発揮 された
MITF転写因子
プロモーター配列 チロシナーゼ遺伝子
DNA
mRNA核 転写
チロシナーゼ
翻訳チロシン
(アミノ酸)
酵素反応
酸化重合
生理活性組成物
抗酸化成分
チロシナーゼ阻害成分
MITF抑制成分
メラニン色素
UV、ホルモン
第2の効果
第1の効果
第3の効果
ヨブスマソウ抽出物のメラニン抑制剤としての有用性
複数の作用点の異なる有効成分を含有しているため、既存の高純度の
メラニン抑制剤と比較しても、粗抽出物でも低濃度で有効性を発揮できる
ヨブスマソウ抽出物の抗ガン剤としての有用性
紫外線UV 活性酸素
発ガン物質
DNA損傷
X
炎症 細胞増殖刺激
悪性化 高転移性
抗ガン剤耐性
癌化
X X X
促進 促進
従来の抗ガン剤のターゲット
抑制
ヨブスマソウ
分画3
悪性黒色腫
色素細胞特異的
転写因子MITF
最近になってMITFは悪性黒色種の原因遺伝子であることを示す知見が
相次いで報告されている
Nature. 480(7375), 94-98 (2011) A SUMOylation-defective MITF germline mutation predisposes to melanoma and renal carcinoma
Nature. 480(7375), 99-103 (2011) A novel recurrent mutation in MITF predisposes to familial and sporadic melanoma
新技術の特徴・従来技術との比較
• 既存のチロシナーゼ酵素阻害剤であるアルブチンやコウジ酸よりも低濃度でメラニン産生を抑制する。
• 既存のメラニン抑制剤とは異なった作用機序:色素細胞特異的転写因子MITF発現を抑制することで効果を発揮する。
• MITF抑制成分以外にも、チロシナーゼ阻害成分及び抗酸化
成分を含有し、粗抽出物で効果的に作用するため、低コストで原料を製造でき、実用性が高い。
• ヨブスマソウ/イヌドウナは秋田を中心に東北・北海道で食用山菜として利用されてきた長い歴史があり、安全・安心である。資源としても豊富に存在し、栽培も可能である。
• MITF抑制成分は、選択性の高く、かつ副作用の小さい抗ガン剤として有用な可能性がある。
実用化に向けた課題と企業への期待
○ 美白用化粧品・医薬部外品
・ 基本的に40~70%エタノール粗抽出物のままで、化粧品や医薬部外品用の原料として使用できる
・ 化粧品・医薬部外品の規格へ対応した品質基準を満たすことが課題である
○ 医薬品(抗ガン剤)
・ ヨブスマソウ分画3のMITF抑制成分の精製・構造解析
・ リード化合物からの構造の最適化
・ 医薬品としての開発
これらの課題を共同研究で解決していく
企業を募集しています!
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称:
メラニン抑制及びMITF抑制作用を有する美白用 組成物及び抗ガン剤
• 出願番号 :特願2012-025967
• 出願人 :国立大学法人秋田大学
• 発明者 :池本 敦
お問い合わせ先
秋田大学 産学連携コーディネーター 伊藤 慎一
TEL 018-889 -2702
FAX 018-837 -5356
e-mail [email protected]