elisa, rie, if e wb
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ELISA
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HISTÓRIA
Antes do desenvolvimento dos Ensaios Imu-
noenzimáticos/ELISA, a única opção era o
Radioimunoensaio, uma técnica que usa
antígenos ou anticorpos marcaDos radio-
ativamente.
O Radioimunoensaio foi primeiramente des-
crito em um estudo por Rosalyn Sussman
Yalow e Solomon Berson publicado em 1960.
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Continuação
Certas enzimas (como a peroxidase) reagem com substratos apropriados(como a 3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina), resultando em mudan-ças de cor, que podem ser usadas como um sinal.
Este sinal tem de estar associado com a pre-sença de anticorpo ou antígeno.
Este processo foi desenvolvido independe-mente por Stratis Avrameas e G.B. Pierce
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INTRODUÇÃO AO ELISA
ELISA, ou enzyme-linked immunosorbent assay
(ensaio imunoadsorvente ligado a enzima), é um
técnica de immunoensaio envolvendo a reação de
antígeno e anticorpo in vitro. ELISA é um ensaio
sensível e específico para a detecção e quantificação
de antígenos ou anticorpos. Os testes de ELISA são
usualmente feitos em placas com micropoços.
O teste de ELISA foi o primeiro teste de rastreio
comumente empregado para o HIV. Ele tem alta
sensibilidade.
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A 96-WELL MICROTITER PLATE USED FOR ELISA
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COMPONENTES DO ELISA
Anticorpo: fração IgG de soro purificado por cromatografia de alta
afinidade
Enzima: peroxidase, beta-galactosidase ou fosfatase alcalina
Substrato: O produto final corado surge por ação da enzima que
converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o
substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma
substância indicadora – ABTS: sal diamônio de 2,2´-azino-di (3-
etil-benzotiazolina-6 sulfonato cor verde com peroxidase; p-
nitrofenil fosfato cor amarela com a fosfatase alcalina
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ETAPAS DO ELISA
1. Os reagentes fixados à fase sólida são misturados
com o analito.
2. Adição do conjugado e incubação.
3. Lavagem com solução tampão contendo detergentes.
4. Substrato cromogênico é adicionado para o desen-
volvimento da cor.
5. A reação da enzima é interrompida.
6. A intensidade da cor resultante é lida em um espec-
trofotômetro ou fotocolorímetro.
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ELISA
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TIPOS DE ELISA
ELISA INDIRETO
ELISA SANDUÍCHE
ELISA COMPETITIVO
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ELISA INDIRETO
O ELISA indireto utiliza um anticorpo primário não marcado em conjunção com um anticorpo secundário marcado.
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ELISA INDIRETO
Vantagens da detecção indireta
Grande variedade de anticorpos secundários marca-
dos estão disponíveis comercialmente.
Imunorreatividade do anticorpo primário não é afe-
tada pelo anticorpo secundário.
Sensibilidade é aumentada porque cada anticorpo
primário contêm vários epítopos que podem se ligar
ao anticorpo secundário marcado, permitindo a
amplificação do sinal.
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Desvantagens da detecção indireta
Reações cruzadas podem ocorrer com o
anticorpo secundário, resultando num sinal
não específico.
Uma etapa de incubação extra é necessária
no procedimento.
ELISA INDIRETO
ELISA INDIRETO
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ELISA SANDUÍCHE OU DIRETO
1. A placa é recoberta com o anticorpo de
captura.
2. A amostra é adicionada, e qualquer antígeno
presente liga-se ao anticorpo de captura.
3. O anticorpo secundádrio ligado a enzima é
adicionado, ligando-se ao antígeno
4. O substrato é finalmente adicionado, e é
convertido pela enzima na forma detectável.
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ELISA SANDUÍCHE OU DIRETO
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DIRETO OU SANDUÍCHE
INDIRETO
ELISA INDIRETO X SANDUÍCHE
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ELISA COMPETITIVO
Neste caso o anticorpo não-marcado é incubado na presença de seu antígeno.
Estes complexos de ligação antígeno-anticorpo são então adicionados a uma placa recoberta com o antí-geno.
A placa é lavado e o anticorpo não-ligado é removido. O anticorpo secundário marcado, específico para o
anticorpo primário é adicionado. O substrato é adicionado, e a enzima remanescente
produz um sinal cromogênico. Para o ELISA competitivo, quanto maior a concentra-
ção do antígeno original, menor a intensidade do sinal cromogênico.
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ELISA COMPETITIVO
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PRECAUÇÕES
Controle negativo com sinal forte Um excessivo sinal pode ser causado por:
1. Lavagem inadequada das placas. 2. Reagentes não suficientemente diluídos3. Ligação não-específica da enzima
conjugada. 4. O aparecimento de cor nos poços de contro-
le negativo podem também indicar reativida-de cruzada do anticorpo secundário com componentes da amostra de antígeno.
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Controle positivo sem sinal Microplacas recobertas inapropriadamente. Reagentes aplicados em ordem incorreta ou
etapa omitida. O anticorpo secundário e o anticorpo primário
são incompatíveis. Enzima conjugada defeituosa ou inibida por
contaminantes. Anticorpo detector não compatível com o an-
ticorpo de captura (para ensaios sanduíche).
PRECAUÇÕES
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ELISA com sinal fraco Tampão de lavagem não adequadamente
drenado após cada etapa de lavagem. Tempos de incubação inadeguados. Reagentes muito diluídos. Enzima conjugada
defeituosa ou inibida por contaminantes. Substrato defeituoso ou contaminado. Microplacas pouco recobertas. Perda do anticorpo de captura durante a
lavagem.
PRECAUÇÕES
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APLICAÇÕES
Pesquisa de doadores de sangue para evidencição de contaminação viral por: HIV-1 e HIV-2 (presenca de anticorpos anti-HIV) Hepatite C (presença de anticorpos) Hepatitis B (testagem para anticorpos e o antígeno
viral) Dosagem de níveis hormonais
HCG (como teste para gravidez) LH (determinação do tempo de ovulação) TSH, T3 and T4 (para função tireioideana)
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Detecção de infecções: Agentes sexualmente transmissíveis como HIV,
sífilis e clamídia Hepatite B e C Toxoplasma gondii
Detecção de alergenos em alimentos. Dosagem de "fatores reumatoides" e outras doenças
autoimunes como lupus eritematoso. Dosagem de toxinas alimentos conamindaos Detecção de drogas ilícitas:
cocaína opiáceos
APLICAÇÕES
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RADIOIMUNOENSAIO
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Histórico
Yalow e Benson – Desenvolvimento da primeira técnica utilizado radioisótopos para o estudo do metabolismo iodo. Mais tarde, eles adaptaram este método para o estudo de hormônios, principalmente a insulina.
Os pesquisadores provaram que a diabetes do Tipo II era causada pela ineficiência da utilização da insulina.
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Histórico
• No ano de 1959, Drs. Rosalyn Yalow & Soloman Berson desenvolveram o radioimunoensaio, que apli-caram para quantificação da insulina.
• O RIE é o predecessor dos imunoensaios..
Dra. Rosalyn Yalow se tornou a primeira mulher a ganhar o Prêmio Nobel pelo seu traba-lho em Radioimunoensaio.
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PRINCÍPIO
O Radioimunoensaio é baseado na reação antígeno-anticorpo no qual pequenas quantidades de antígenos radioconjugados competem com antígenos endógenos pelos locais de ligação de anticorpos específicos contra o mesmo antígeno.
Em princípio, o antígeno radioconjugado de ser similar em bioatividade e/ou imunoatividade ao antigeno natural .
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Ag + Ag* + Ab AgAb + Ag*Ab + Ag* + Ag
Ag* não-ligado e Ag são lavadosRadioatividade do resíduo ligado é medidadaA concentação do antígeno é inversamente
proporcional a radioatividade
[Ag: ligantea ser medido; Ag * ligante radioconjugado]
PRINCÍPIO
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REQUIREMENTOS
Um antígeno conjugado altamente purificado
Um antissoro específicoUm método de separaçãoUm método de quantificação
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PRODUÇÃO DE ANTÍGENO CONJUGADO
Radiomarcação - Procedimento de conjugação
3 H 14 C 125 I podem ser usados como marcadores radioativos
Antígenos são conjugados com 3 H 14 C 125I
A conjugação não deve afetar especificidade antigênica & atividade de antigênica
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A maioria dos RIEs atualmente utiliza 125 I como marcador:
i. Aceleração do processo de conjugação
ii. Retenção da atividade biológica dos reagentes O método da cloramina-T é comumente utilizado
para conjugação de 125 I com proteínas. A separação do antígeno radioconjugado do
isótopo livre é feita por Filtração em gel ou HLPC
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QUANTIFICAÇÃO
Varios instrumentos sao utilizados para detecção e medida/quantificaçãoda radioatividade:
Contador de CintilaçãoContador Geiger-MullerContadores de Gás, etc..
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METODOLOGIAS
Imunoensaios Competitivos
Imunoensaios Não-Competitivos
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Imunoensaios Competitivos
O analito não ligado na amostra teste é mensurado pela sua habilidade de competir com o antígeno marcado por um número limitado de locais de ligação ao anticorpo.
A menor medição do Ag conjugdo no ensaio significa que mais do antígeno não conjugado na amostra teste está presente.
A quantidade de antígeno na amostra teste é inversamente proporcional a quantidade do conjugado medido nos formatos competitivos.
Enquanto um aumenta, o outro dimunui.
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Imunoensaios Competitivos
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Imunoensaios Competitivos
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Maior nível sensiblidade e especificidade.
Este formato é referido como um ensaio sanduiche porque o analito está ligado entre dois anticorpos altamente específicos
Imunoensaios Não-Competitivos
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A reação tipicamente inclui um excesso de anticorpo marcado no qual toda a droga ou metabólito está ligado. A quantidade do complexo Ag-Ac é então mensurada para determinar a quantidade de analito (droga/metabólito) presente na amostra. A quantidade do ragente marcado , normalmente um anticorpo, é diretamente proporcional a quantidade de antígeno presente na amostra.
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Imunoensaios Não-Competitivos
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Precisão e alta sensibilidade (detecta picogramamas de antígenos)
Facilidade de conjugação do isótopo. Detecção dos sinais sem otimização.Estabilidade contra interferência do ambiente
do ensaio.
VANTAGENS
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DESVANTAGENS
CustoVida média curta dos reagentes.Requerem equipamento contador especial.Necessidade de proteção contra os efeitos
adversos da radiotividade.Descarte dos reagentes utilizados.
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APLICAÇÕES
FarmáciaQuantificação de fármacos no soro. Detecção de abuso de drogas e intoxicação
por fármacos.Quantificação estereoespecífica– formas D &
LEstudo da cinética dos fármacos.
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APLICAÇÕES
Pesquisa
Estudo da atividade metabólica hepática in vitro
Quantificação – hormônios, mediadores, fatores de crescimento, citocinas, prostanoides etc..
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Endocrinologia Insulina, HCG, VasopressinaDetecção de desordens edocrinológicasFisiologia da função endócrina
EpidemiologiaHepatite B
APLICAÇÕES
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Imunologia ClinicaAnticorpos para Alergenos InalatóriosDiagnóstico de Alergia
OncologiaAntígeno CarcinoembriônicoDetecção precoce do Câncer e Diagnóstico
APLICAÇÕES
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RIA
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IMUNOFLUORESCÊNCIA
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IMUNOFLUORESCÊNCIA
Em 1941, Coon introduziu pela primeira vez o emprego de compostos fluores-centes como marcadores imunoquímicos para detecção de antígenos.
Os ensaios de imunofluorescência são rotineiramente utilizados atualmente nos laboratórios clínicos.
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PRINCÍPIO DA TÉCNICA
Anticorpos ou antígenos são conjugados (liga-dos de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por ra-diações UV, emite luz no espectro visível.
Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.
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PRINCÍPIO DA TÉCNICA
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A reação é feita em lâminas de mi-
croscopia (um pouco mais finas que as
comuns) e a observação tem lugar num
microscópio com luz UV.
(Microscópio de Fluorescência)
PRINCÍPIO DA TÉCNICA
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Microscópio de fluorescência com epiluminação
luz UV atinge o ma- terial examinado
fluorescência emitida chega ao observador
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PRINCÍPIO DA TÉCNICA
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PRINCÍPIO DA TÉCNICA
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SELEÇÃO DO FLUOROCROMO
O marcador deve ser estável.Apresentar alto coeficiente de absortivi-
dade molar.Bom rendimento quântico.Emissão de comprimento de onda ade-
quando.Não interferir nas reações ligante-anti-
corpo.
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SELEÇÃO DO FLUOROCROMO
(Fluoresceína)
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TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
Existem três tipos principais de ensaios de
Imunofluorescência:
Imunofluorescência Direta
Imunofluorescência Indireta
Imunofluorescência Sanduíche
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TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
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IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
1. Ag é fixado na lâmina.
2. Ac conjugado à Fluoresceína é adicionado.
3. A lâmina é lavada para remover o Ac não ligado.
4. Exame sob luz UV em um micoroscópio de fluorescência.
5. Os locais onde o Ac se ligou ao seu Ag espe-cífico apresentará fluorescência esverdead.a
Usos: Detecção direta de patógenos ou seus Ags em tecidos ou outras amostras.
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IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
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IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
É uma técnica de dupla-camada
1. Ac não conjugado (analito) é aplicado diretamente no substrato.
2. Lavagem
3. Tratamento com anti-imunoglobulina fluorocromo-conjugada.
4. Lavagem
5. Observação em microscópio de imu-nofluorescência.
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IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
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IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
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VANTAGENS DA IF INDIRETA
A fluorescência é melhor visualizada
(mais intensa) devido a maior quan-
tidade de anti-imunoglobulinas fluo-
rescentes que podem ligar-se a cada
Ac presente na primeira camada.
Alta especificidade.
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USOS
IF Direta
Detecção direta de microrganismos em
secreções, na urina, nas fezes, em
cortes de tecidos, etc. Também é
utilizada na fenotipagem de células
tumorais
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USOS
IF Indireta:
Diagnóstico sorológico de várias do-
enças infecciosas como a Doença de
Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e
complexos em doenças auto-imunes.
![Page 67: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/67.jpg)
IF IMAGENS
HIV REAGENTE HIV NÃO-REAGENTE
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IF IMAGENS
Confocal image to detect phosphorylated AKT (green) in cardiomyocytes infected with adenovirus
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IF IMAGENS
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IF IMAGENS
Concentrated groundwater methanotrophic bacteria on 0.2 m filter labeled with fluorescent antibodies.
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IF IMAGENS
IF Trypanosoma cruzi
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IF IMAGENS
IF Trypanosoma cruzi
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IF IMAGENS
Immunofluorescence image of Cryptosporidium parvum oocysts
![Page 74: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/74.jpg)
IF IMAGENS
IFA reaction of a positive human serum on Rickettsia rickettsii
![Page 75: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/75.jpg)
IF IMAGENS
Immunofluorescence - Glutamyl Prolyl tRNA synthetase antibody
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WESTERN BLOTTING
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HISTÓRICO
O western blotting, também chamado de imunoblotting, foi introduzido por Harry Towbin e col. em 1979.
“Electrophoretic transfer of proteins from poly-acrylamide gels to nitrocellulose sheets: proce-dure and some applications” Friedrich Miescher-Institut,Basel, Switzerland
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HISTÓRICO
Atualmente é uma técnica rotineira para análise de proteínas.
A especificidade da interação antígeno-anticorpo permite uma proteína alvo ser identificada numa mistura complexa de proteínas.
O western blotting pode produzir dados quantitativos e semiquantitativos sobre esta proteína alvo.
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WESTERN BLOTTING
Etapas do western blotting:
1. Separação das macromoléculas utilizan do eletroforese em gel.
2. As moléculas separadas são transferi-das (blotted) para uma secunda matriz: nitrocelulose ou difluoreto de polivinili-deno (PVDF).
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WESTERN BLOTTING
3. A membrana é bloqueada para prevenir a ligação não específica de anticorpos na superfície da membrana.
4. Detecção utilizando anticorpos es-pecíficos para a proteína alvo.
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MÉTODOS DE DETECÇÃO
i. Detecção enzimática
ii. Detecção radioativa
iii. Detecção fluorescente
iv. Detecção quimioluminescente
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DETECÇÃO QUIMIOLUMINESCENTE
![Page 83: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/83.jpg)
TIPOS DE DETECÇÃO
Detecção Direta
Detecção Indireta
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TIPOS DE DETECÇÃO
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DETECÇÃO DIRETA
Vantagens:
i. Rápida
ii. Inexistência de reatividade cruzada com Ac secundário
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Desvantagens:
i. Conjugação pode reduzir a imunorrea-tividade do Ac primário.
ii. Ac primários conjugados são caros
iii. Pouca flexibilidade na escolha do Ac primário conjugado.
iv. Sinal de amplificação baixo.
DETECÇÃO DIRETA
![Page 87: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/87.jpg)
DETECÇÃO INDIRETA
![Page 88: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/88.jpg)
DETECÇÃO INDIRETA
Vantagensi. O Ac secundário pode amplificar o sinal.ii. Uma variedade de Ac secundários conju-
gados estão disponíveis.iii. Um Ac secundário pode ser utilizado com
vários Ac primários.iv.Conjugação não afeta a imunorreatividade
do Ac primário.v. Mudando o Ac secundário permite a mu-
dança do método de detecção.
![Page 89: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/89.jpg)
DETECÇÃO INDIRETA
Desvantagens
i. Anticorpos secundários podem produ-zir reações não específicas.
ii. Etapas adicionais são requeridas em comparação com método direto.
![Page 90: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/90.jpg)
ELETROFORESE EM GEL
A separação das proteínas é feita de a-cordo com suas propriedades físicas:
Ponto isolétrico (pI) Peso molecular Carga elétrica
A proteínas são separadas por eletrofo-rese em gel de poliacrilamida (PAGE).
![Page 91: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/91.jpg)
ELETROFORESE EM GEL
As amostras são colocadas em poços no gel. Quando uma voltagem é aplicada ao longo do gel,
as proteínas irão migrar em velocidades diferentes. Estas diferentes taxas de avanço separam as ptns
em bandas dentro de cada raia.
![Page 92: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/92.jpg)
ELETROFORESE EM GEL
![Page 93: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/93.jpg)
TRANSFERÊNCIA (Blotting)
A fim de fazer as proteínas acessíveis à detecção do anticorpo, elas são movidas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou de PVDF.
A membrana é colocada face-a-face com o gel, e uma corrente elétrica é aplicada entre as placas de cada lado, então as proteínas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantém a mesma dis-posição que continham no gel.
![Page 94: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/94.jpg)
TRANSFERÊNCIA (Blotting)
![Page 95: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/95.jpg)
TRANSFERÊNCIA (Blotting)
![Page 96: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/96.jpg)
TRANSFERÊNCIA (Blotting)
Como resultado desse processo de "borramento" (blotting), as proteínas são expostas a uma fina camada para detecção.
A ligação das proteínas à membrana é baseada tanto em interações hidrofóbicas quanto em interações de cargas entre a membrana e as proteínas.
As membranas de nitrocelulose são mais baratas que as de PVDF, porém são mais frágeis e não suportam bem a repetidas amostragens.
![Page 97: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/97.jpg)
TRANSFERÊNCIA (Blotting)
A uniformidade e efetividade da transferência das proteí-nas do gel para a membrana pode ser comfirmada com a utilização de corantes: Coo-massie Brilliant Blue G-250 e Ponceau S.
Coomassie
Ponceau S
![Page 98: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/98.jpg)
TRANSFERÊNCIA (Blotting)
Membrana de nitrocelulose após coloração com Ponceau S
![Page 99: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/99.jpg)
BLOQUEIO
A membrana foi escolhida por sua habilidade de ligar proteínas.
É necessário impedir as interações não espe-cíficas entre a membrana e o anticorpo usado para a detecção da proteína alvo.
O bloqueio da ligação não específica é alcan-çado pondo-se a membrana em uma solução diluída de uma proteína - tipicamente albumi-na de soro bovino (BSA) ou leite seco desna-tado, com uma pequena quantidade de deter-gente como Tween 20 ou carbono coloidal.
![Page 100: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/100.jpg)
ETAPAS DE LAVAGEM
Assim com outros imunoensaios, o Western Blotting consiste numa série de incubações com diferentes reagentes imunoquímicos se-paradas por etapas de lavagem.
As etapas de lavagem são necessárias para:
i. Remover reagentes não ligados.
ii. Aumentar a sensibilidade.
iii. Amplificar o sinal. Soluções tampões: TBS (tris buffered saline) e
PBS (phosphate buffered saline).
![Page 101: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/101.jpg)
APLICAÇÕES DO WESTERN BLOTT
Teste confirmatório de HIV:
i. Proteínas de células conhecidas infectadas com HIV são separadas e “blotadas” em u-ma membrana.
ii. O soro a ser testado é aplicado.iii. Ac livre é lavado.iv. Adição de Ac anti-Ig humana secundário con
jugado a enzima.v. Substrato é adicionado.vi. As bandas impregnadas indicam os Ac do
paciente.
![Page 102: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/102.jpg)
WESTERN BLOTT - HIV
![Page 103: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/103.jpg)
É o teste confirmatório padrão.
Quando testado combinado com ELISA apresenta especificidade maior que 99,9%.
WESTERN BLOTT - HIV
![Page 104: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/104.jpg)
Os antigenos virais do HIV são separados como: gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17, e p15.
A interpretação depende da pre-sença/ausência de reatividade a antígenos específicos.
WESTERN BLOTT - HIV
![Page 105: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/105.jpg)
Os anticorpos no soro devem re-agir com pelo menos dois dos an-tígenos seguintes:
gp 160/120
gp 41
p 24
WESTERN BLOTT - HIV
![Page 106: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/106.jpg)
Ausência de qualquer reativida-
de às bandas é declarado como NEGATIVO.
Falsos positivos são raros.
WESTERN BLOTT - HIV
![Page 107: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/107.jpg)
Pode dar resultados indetermina-dos na:
i. Gravidez
ii. Após administração de Toxóide Tetânico
iii. Condições autoimunes
WESTERN BLOTT - HIV
![Page 108: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/108.jpg)
Teste definitivo para diagnóstico da Ence-falopatia espongiforme bovina (BSE - Do-ença da vaca louca).
Diagnóstico de algumas formas de Doença de Lyme.
Pode ser também utilizado como teste con firmatório para Hepatite B.
APLICAÇÕES DO WESTERN BLOTT
![Page 109: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/109.jpg)
SISTEMA ABO & Rh(D)
![Page 110: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/110.jpg)
ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS
Mais de 700 antígenos eritrocitários fo-ram descritos na literatura.
25 sistemas de grupos sanguíneos são descritos pela Sociedade Internacional de Transfusão Sanguínea.
Muitos antígenos eritrocitários são de al-ta frequência na maioria dos doadores, enquanto outros são extremamente ra-ros
![Page 111: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/111.jpg)
ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS
![Page 112: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/112.jpg)
SISTEMA ABO
Descoberto em 1901 pelo Dr. Karl Landsteiner
4 Fenótipos principais (A, B, AB, O)
Gen ABO localizado no cromosoma 9.
![Page 113: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/113.jpg)
PopulationO A B AB
Aborigines 61 39 0 0 Basques 51 44 4 1 Blackfoot (N. Am. Indian) 17 82 0 1 Bororo 100 0 0 0 Chinese-Canton 46 23 25 6 Chinese-Peking 29 27 32 13 English 47 42 8 3 Hawaiians 37 61 2 1 Irish 52 35 10 3 Mayas 98 1 1 1 Navajo (N. Am. Indian) 73 27 0 0 Peru (Indians) 100 0 0 0 United Kingdom (GB) 47 42 8 3 USA (blacks) 49 27 20 4 USA (whites) 45 40 11 4
DISTRIBUIÇÃO DOS ANTÍGENOS ABO
![Page 114: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/114.jpg)
DISTRIBUIÇÃO DO ALELO “A”
![Page 115: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/115.jpg)
DISTRIBUIÇÃO DO ALELO “B”
![Page 116: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/116.jpg)
DISTRIBUIÇÃO DO ALELO “O”
![Page 117: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/117.jpg)
Ligados a Proteínas ou Lipídeos na superfície dos eritrócitos
Substrato Molecular é o antígeno H (fucose)
Antígeno A N-acetyl-galactosamina (GalNAc)
Antígeno B Galactose (Gal)
SISTEMA ABO
![Page 118: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/118.jpg)
SISTEMA ABO
![Page 119: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/119.jpg)
ANTICORPOS ABO
Os anticorpos dirigidos contra os antíge-nos ABO são os mais importantes na medicina transfusional.
Os anticorpos ABO são de ocorrência na-tural.
O estímulo imune para formação de Ac ABO pode ser a exposição a substâncias semelhantes a ABH encontrados na natu-reza (ex. polissacarídeos bacterianos).
![Page 120: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/120.jpg)
A maioria dos Ac ABO de ocorrência na-tural pertencem ao isotipo IgM.
Os anticorpos ABO podem ocorrer após estimulção imune por transfusão ou gra-videz isotipo IgG.
Os anticorpos ABO são uma causa de reações hemolíticas transfusionais e do-ença hemolítica do recém-nato.
ANTICORPOS ABO
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Allele from the mother
Allele from the father
Genotype ofoffspring
Blood types ofoffspring
A A AA A
A B AB AB
A O AO A
B A AB AB
B B BB B
B O BO B
O O OO O
HEREDITARIEDADE DO GRUPAMENTO ABO
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SISTEMA Rh (D)
O sistema Rh(D) é mais com-plexo, com mais de 50 antíge-nos.
Descoberto em 1940 por Wie-ner e Landsteiner e após o trabalho em macacos Rhesus.
O gene RH está localizado no cromosoma 1.
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População Rh(D) pos Rh(D) neg
Caucasianos 86% 14%
Afro-Americanos
95% 5%
Orientais >99% <1%
DISTRIBUIÇÃO DO FATOR Rh(D)
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SISTEMA Rh
80% das pessoas Rh(D) neg expostas ao sangue Rh(D) pos desenvolverão Ig anti-D.
Ig anti-D pode também ser estimulado pela gravidez de um bebê Rh(D) po-sitivo. Sensibilização pode ser prevenida pelo uso
de anti-D imunoglobulina, pré-natal e pós-natal.
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ANTÍGENO Rh
Antígeno D
Antígeno D fraco
Antígeno D parcial
Fenótipo Rh nulo
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ANTÍGENOS Rh
O Rh consiste de 3 proteínas integrais da membrana eritrocitária: RhD, RhCcEe e uma glicoproteína com Rh (RH50, Rh A G).
O antígeno D, o mais imunogênico de todos os Ag Rh, consiste na proteína D.
A proteína D possui 9 aminoácidos especí-ficos identificados como epítopos funcionais: (Met169, Met170, Ele172, Fe223, Ala226, Glu233, Asp350, Ala353 e Gli354)
![Page 127: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/127.jpg)
Aproximadamente 1% dos indivíduos D-pos é tipado como D fraco, caracterizado pela aglutinação fraca ou inexistente com anti-D proteína RhD mutante.
Os antígenos D parciais são proteínas RhD com perda dos epítopos D.
Rh-neg (D-) reflete a deleção de todo o gene RHD – mas não da ptn RhCcEe.
ANTÍGENOS Rh
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FENÓTIPO Rhnulo
Os eritrócitos Rhnulo não possuem nenhum dos antígenos Rh como resultado da au-sência aparente da proteína RhD e RhCcEe.
As células Rhnulo são extremamente raras (<1 por 6 milhões de indivíduos).
Uma vez que indivíduos Rhnulo podem ser sensibilizados a múltiplos Ag Rh, a trans-fusão de suporte pode ser bastante difícil.
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Os genes ABO & RH não são ligados.Os antígenos ABO & Rh(D) são herados
separadamente.
Por exemplo:Uma mãe A Rh(D) pos
e um pai B Rh(D) pos
podem ter um filho O Rh(D) neg.
HEREDITARIEDADE ABO E Rh(D)
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ABO & Rh(D) 130
HEREDITARIEDADE ABO E Rh(D)
Mother
Group A AO
Rh(D) pos Dd
Father
Group B BO
Rh(D) pos Dd
Group A AO
Rh(D) pos Dd
Group B BO
Rh(D) pos Dd
Group O OO
Rh(D) neg dd
Group AB AB
Rh(D) pos Dd
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TESTES PRÉ-TRANSFUSIONAIS
O teste pré-transfusão é realizado para selecionar o hemocomponente mais a-dequado para o receptor. Os passos ge-rais neste processo incluem:
1. Identificação adequada do receptor e a-mostra coletada.
2. Revisão de todos os registros anterio-res do receptor e comparação com os resultados atuais.
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TESTES PRÉ-TRANSFUSIONAIS
3. Determinação do tipo sanguíneo ABO/ Rh e teste para anticorpos irregulares (Coombs Indireto).
4. Seleção de um hemocomponente apro-priado, compatível para o ABO/Rh do receptor.
5. Realização de exames a fim de inves-tigar incompatibilidade entre o soro do receptor e a células do doador.
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TESTE DE COOMBS
O teste de Coombs indireto permite a identifica-ção de anticorpos antieritrocitários no soro. É importante para a avaliação de gestantes Rh (-) (avaliação de sensibilização), em pacientes com Rh (-) para avaliação da variante Du e nas fases pré-transfusionais, especialmente em pacientes já transfundidos, em que pode ter ocorrido sem-sibilização para Rh e outros sistemas. .
![Page 134: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/134.jpg)
![Page 135: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/135.jpg)
PROVA DE COMPATIBILIDADE
TÉCNICA COM ALBUMINA BOVINA 22%
a) Marcar dois tubos de ensaio com a identificaçãoo I e II;b) Colocar em cada tubo 100 ul de soro do paciente e 100 ul de suspensão de hemácias a 5%; c) Colocar 2 gotas de albumina bovina a 22% no tubo I;d) Centrifugar a 2700 rpm por 1minuto e fazer a leitura dos dois tubos;e) Incubar os dois tubos a 37o C por 15 minutos, centrifugar a 2700 rpm por 1 minuto e fazer a leitura;
![Page 136: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/136.jpg)
f) Deixar o tubo II no Banho Maria como reserva e continuar apenas com o tubo I;g) Lavar três vezes com salina, desprezando bem a salina da última lavagem;h) Adicionar 2 gotas de antiglobulina humana centrifugar e fazer a leitura;i) Se o teste for negativo, adicionar 1 gota de controle de Coombs, centrifugar a 2700 rpm por 1minuto e fazer a leitura;j) Esse resultado deverá ser positivo pois essas hemácias servem como controle da reação.
PROVA DE COMPATIBILIDADE
![Page 137: Elisa, RIE, IF e WB](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081720/5571f96d49795991698f8bd8/html5/thumbnails/137.jpg)
PROVA DE COMPATIBILIDADE