Tugas Teknik Analisa DNA

Created by:

Stevanus Sugiono/ 7081009

Debby Agam/ 7081012

Aurelia L. Erna S./ 7081027

Ruth S. H./ 7081813

Budianto Gunawan/ 7081826

Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) atau dalam bahasa

indonesianya disebut sebagai uji penentuan kadar imunosorben taut-enzim,

merupakan teknik pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi

antara antibodi dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam

bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalam

suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada saat

terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya). Namun seiring dengan

perkembangan ilmu pengetahuan, teknik ELISA juga diaplikasikan dalam bidang

patologi tumbuhan, kedokteran, dll.

I. Sejarah Penemuan dan Prinsip Dasar Teknik ELISA

Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter

Perlmann dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang

imunologi (ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan

antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan

menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/ reporter/ signal.

Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simpel dapat dijabarkan sebagai

berikut:

Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan

pada suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut

dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu secara penempelan secara non

spesifik dengan adsorbsi ke permukaan microtiter, dan penempelan

secara spesifik dengan menggunakan antibodi atau antigen lain yang

bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini

digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau

antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal

(disesuaikan dengan sampel=> bila sampel berupa antigen, maka

digunakan antibodi spesifik; sedangkan bila sampel berupa antibodi,

maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan

tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan

antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut

dicampurkan suatu substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal.

Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang

bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan

antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan

menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pada ELISA

flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau

antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan

signal yang berupa pendaran flourescense.

Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif

untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan

antibodi atau antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji

kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi atau antigen yang diuji dengan

menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer atau dengan cara menentukan

jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu

kurva standar dan kadar antigen atau antibodi yang tidak diketahui dapat

ditentukan.

II. Kelebihan & Kekurangan Teknik ELISA

Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain:

• Teknik pengerjaan relatif sederhana.

• Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja,

sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)

• Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.

• Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar

antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara

antibodi dan antigen yang bersifat sangat spesifik)

• Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain:

• Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini

hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu

antigen)

• Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi

poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya

yang relatif cukup mahal.

• Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian

akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang

disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder

atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim

signal dan menimbulkan signal.

• Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat,

sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada

perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan

untuk menghentikan reaksi).

III. Alat & Bahan Yang Digunakan

Alat paling utama yang digunakan dalam teknik ELISA adalah microtiter.

Microtiter ini berupa suatu papan plastik dengan cekungan sebanyak 96 buah (8

cekungan ke arah bawah dan 12 cekungan ke samping). Microtiter ini terbuat dari

bahan polistirena. Cekungan dari microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan

diameter 0,7 cm. Berikut ini adalah gambarnya:

Selain itu, alat dan bahan lain

yang umum digunakan

dalam teknik ELISA antara

lain:

• Antigen yang

dimurnikan

(jika sampel yang hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa antibodi).

• Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau

dikuantifikasi berupa antigen).

• Larutan standard (kontrol positif dan negatif).

• Sampel yang ingin dites.

• Cairan pencuci (buffer).

• Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal

• Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal

• ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif.

IV. Macam-Macam Teknik ELISA

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik

ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat

antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi

(primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua

(sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.

Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA

sandwich.

Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagai macam jenis

teknik. Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan

teknik ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini

adalah beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain:

ELISA Direct

Teknik ELISA ini merupakan

teknik ELISA yang paling sederhana.

Teknik ini seringkali digunakan untuk

mendeteksi dan mengukur konsentrasi

antigen pada sampel. ELISA direct

menggunakan suatu antibodi spesifik

(monoklonal) untuk mendeteksi

keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.

Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang

mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel

pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk

membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu

antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-

lubang microtiter sehingga antibodi dapat berinteraksi dengan antigen yang

diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang

antibodi tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke

dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi

dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah

berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan

menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi

dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan

kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain:

• Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut

dengan enzim.

• Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan

mahal.

• Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari

antibodi pada percobaan yang berbeda.

• Amplifikasi signal hanya sedikit.

• Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan

sebelum digunakan untuk uji ELISA direct.

Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:

• Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi

• Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang

dengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi.

ELISA Indirect

Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA

yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi

dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan

suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim

signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang

diuji.

Pada ELISA indirect, pertama

microtiter diisi dengan larutan yang

mengandung antigen spesifik, sehingga

antigen spesifik tersebut dapat

menempel pada bagian dinding lubang

microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak

menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang

mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang

microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang

diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi

yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu, ke dalam lubang microtiter

dimasukkan larutan yang berisi antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal,

sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antibodi yang

diinginkan dengan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal. Selanjutnya

microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder tertaut enzim signal

yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir

ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal,

lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksi

dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan

signal yang dapat dideteksi.

ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain:

• Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA

direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi

yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi

yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi

sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya

membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi

antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim

signal.

Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain:

• Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual secara

komersial di pasar.

• Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak

terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena

penautan dilakukan pada wadah berbeda.

• Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan

memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi

sekunder.

ELISA Sandwich

Teknik ELISA jenis ini menggunakan

antibodi primer spesifik untuk menangkap

antigen yang diinginkan dan antibodi

sekunder tertaut enzim signal untuk

mendeteksi keberadaan antigen yang

diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari

ELISA sandwich mirip dengan ELISA

direct, hanya saja pada ELISA sandwich,

larutan antigen yang diinginkan tidak perlu

dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat

berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut

enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada

antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau

antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA

sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap,

sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi.

Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan

untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah

pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA

sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan

akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi.

Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang

mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat

menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas

untuk membuang antibodi penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang

microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan

dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara

antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter

kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi

penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi

antibodi detektor, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara

antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor. Selanjutnya microtiter dibilas

lagi untuk membuang antibodi detektor yang tidak berinteraksi dengan antibodi

spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang

dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibodi

detektor yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi

dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi

tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain:

• Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada

dinding lubang microtiter

• Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen

Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari

teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich

ini pada dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi

karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi,

yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA

sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan

untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua

jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang

berbeda (epitopnya harus berbeda).

ELISA Biotin Streptavidin (Jenis ELISA modern)

Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga

dikembangkan untuk mendeteksi antibodi dengan tingkat sensitivitas relatif lebih

tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibodi, dimana

prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan pada

teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detektor (antigen bertaut enzim

signal, bersifat optional apabila antibodi yang diinginkan tidak tertaut dengan

enzim signal).

Contoh dari aplikasi teknik ini

adalah teknik ELISA untuk mendeteksi

vitamin biotin yang tertaut dengan suatu

antibodi avidin dengan mengubah

antibodi avidin menjadi antibodi

streptavidin, dimana satu molekul

streptavidin dapat mengikat empat

molekul biotin (pengembangan dari

ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat

interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.

ELISA Kompetitif

Teknik ELISA jenis ini juga

merupakan pengembangan dari teknik

ELISA terdahulu. Prinsip dasar dari

teknik ini adalah dengan menambahkan

suatu kompetitor ke dalam lubang

microtiter. Teknik ELISA kompetitif ini

dapat diaplikasikan untuk mendeteksi

keberadaan antigen maupun antibodi.

Pada pendeteksian antigen, pertama microtiter diisi antibodi spesifik yang

dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik tertaut

enzim signal, sehingga antibodi spesifik tersebut dapat menempel pada bagian

dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang

antibodi spesifik yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu

larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan enzim

signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan

ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga terjadi kompetisi antara antigen

spesifik tertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat

berinteraksi dengan antibodi spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas

microtiter untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen

yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Lalu, kedalam lubang-lubang

microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal

yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen

yang telah berinteraksi dengan antibodi spesifik akan bereaksi dengan substrat dan

menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini,

pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang

berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen

spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antibodi spesifik.

Sedangkan, pada pendeteksian antibodi, pertama microtiter diisi antigen

spesifik yang dapat berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan maupun

antibodi spesifik tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat

menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter

dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada dinding

lubang microtiter. Lalu larutan yang mengandung antibodi spesifik yang telah

ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibodi

yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi

kompetisi antara antibodi spesifik tertaut enzim signal dengan antibodi yang

diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan

dengan membilas microtiter untuk membuang antibodi spesifik tertaut enzim

signal atau antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu,

kedalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat

bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibodi spesifik, sehingga enzim

yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan

bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada

proses pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya

signal yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antibodi yang diinginkan telah

menang berkompetisi dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal dan

berinteraksi dengan antigen spesifik.

Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya

purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibodi atau antigen yang

diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi

akibat sifat spesifisitas dari antibodi dan antigen.

ELISA Multiplex

teknik ELISA merupakan

pengembangan teknik ELISA yang

ditujukan untuk pengujian secara simultan,

sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan

teknik ELISA terdahulu.

V. Contoh Langkah Kerja Teknik ELISA

Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA,

yaitu:

Pendeteksian antibodi dengan ELISA indirect:

1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan

membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan

selama 30-60 menit.

2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer

3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh

antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti

larutan susu bubuk),

4. Membilas protein yang tidak melekat.

5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan

membiarkan antibodi spesifik untuk berikatan dengan antigen.

6. Membilas antibodi yang tidak terikat.

7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody

yang spesifik (sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan

dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan secara

kovalen dengan enzim.

8. Membilas kompleks antibodi-enzim yang tidak terikat.

9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang

terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.

10. Inkubasi sampai muncul warna dan

11. ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteksi,

maka makin besar kadar antibodi spesifik dalam sampel.

Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:

1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikan dengan

membiarkan larutan berisi antibodi menempel pada dinding/ permukaan

selama 30-60 menit.

2. Membilas antibodi (yang tidak terikat) dengan buffer

3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh

antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti

larutan susu bubuk),

4. Membilas protein yang tidak melekat.

5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan

antibody untuk berikatan dengan antigen spesifik dari simpel.

6. Membilas antigen yang tidak terikat.

7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat

spesifik untuk epitop yang berbeda pada antigen sampel, sehingga

terbentuk sandwich.

8. Membilas antibodi-enzim yang tidak terikat.

9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang

terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.

10. Inkubasi sampai muncul warna.

11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang

terdeteksi, maka makin besar kadar antigen spesifik dalam sampel.

VI. Aplikasi Teknik ELISA

Berikut ini adalah beberapa contoh aplikasi teknik ELISA, antara lain:

a. Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus:

- HIV-1 and HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV)

- Hepatitis C (presence of antibodies)

- Hepatitis B (test untuk keberadaan antibody dan antigen virus)

- HTLV-1 and -2 (keberadaan antibody)

b. Pengukuran level hormon

- hCG (sebagai tes kehamilan)

- LH (menentukan waktu ovulasi)

- TSH, T3 and T4 (untuk fungsi thyroid)

c. Pendeteksian infeksi

- Agen penularan secara seksual, HIV, syphilis, and chlamydia

- Hepatitis B and C

- Toxoplasma gondii

d. Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah.

e. Pendeteksian keberadaan zat obat-obatan terlarang, seperti

- cocaine

- opium

- Δ-9-tetrahydrocannabinol, campuran aktif pada marijuana

VII. Contoh Aplikasi ELISA: Tes Kehamilan Menggunakan Hormon hCG

Pada hari ke sepuluh setelah sel telur dibuahi oleh sel sperma pada saluran

Tuba fallopii, sel telur akan bergerak menuju rahim dan melekat pada dinding

rahim tersebut. Sejak saat itulah plasenta akan mengalami perkembangan dan

hCG mulai diproduksi. Human Chorionic Gonadotropin (hCG) pada dasarnya

merupakan hormon glikoprotein yang diproduksi oleh sel normal trofoblast pada

plasenta selama kehamilan yang dapat ditemukan dalam darah serta air seni.

hCG terdiri dari 2 subunit polipeptida yang terikat secara nonkovalen

dengan berat molekul total 39 kD. Subunit rantai α identik dengan subunit rantai β

dari hLH (human Luteinizing Hormone), hFSH (human Follicle Stimulating

Hormone) and hTSH (human Thyreoidea Stimulating Hormone). Subunit β

bertanggung jawab pada efek hormonal molekul hCG. Pengukuran hCG yang

sempurna dan keberadaan subunit α memberi hasil yang sama pada darah dan

urin, tapi tidak pada subunit β. Produksi hormon hCG akan bertambah banyak

selama trimester pertama, dimana level hCG yang sempurna mempunyai rentang

dari 20000 mIU/ml sampai 50000 mIU/ml (1 ng = 15 mIU).

Keberadaan hCG sudah dapat dideteksi dalam darah sejak hari pertama

keterlambatan haid, yaitu kira-kira pada hari keenam sejak pelekatan janin pada

dinding rahim. Kadar hormon tersebut akan terus menerus bertambah hingga

minggu ke 14-16 kehamilan, terhitung sejak hari terakhir menstruasi. Sebagian

besar ibu hamil akan mengalami penambahan kadar hormon hCG sebanyak dua

kali lipat setiap 3 hari. Peningkatan kadar hormon ini biasanya ditandai dengan

mual dan pusing yang sering dirasakan para ibu hamil. Selanjutnya kadar hCG

akan menurun terus secara perlahan, dan hampir mencapai kadar normal beberapa

saat setelah persalinan. Pengetesan dapat dilakukan pada saat wanita mengalami

keterlambatan siklus haid atau kira-kira 7 hari setelah berhubungan. Sampel yang

digunakan pada umumnya adalah urin. Biasanya dianjurkan menggunakan air seni

yang keluar pertama kali setelah bangun pagi, karena pada saat tersebut

konsentrasi hormon hCG relatif tinggi. Sebenarnya uji darah pada tes kehamilan

yang dilakukan di laboratorium juga memiliki prinsip kerja yang relatif sama,

yaitu mendeteksi kadar hCG. Namun, tes darah memiliki kelebihan berupa

kemampuan untuk mendeteksi usia janin bertumbuh di dalam rahim seorang ibu.

Perkiraan Kadar hCG dalam Darah kehamilan trimester kedua

Perempuan yang tidak hamil dan laki-lakiKurang dari 5 IU/ L (international units per liter)

Ibu hamil:

24-28 hari setelah haid terakhir 5–100 IU/L

4-5 minggu (1 bulan) setelah haid terakhir 50–500 IU/L

5-6 minggu setelah haid terakhir 100–10.000 IU/L

14-16 minggu (4 bulan) setelah haid terakhir

12.000–270.000 IU/L

kehamilan trimester ketiga 1.000-50.000 IU/L

Perempuan pasca menopause Kurang dari 10 IU/l

Keuntungan test kehamilan dengan menggunakan uji kadar hormon hCG

antara lain:

• Analisis yang hemat dan efektif dengan kualitas tinggi dan harganya

memadai.

• Efisien dan fleksibel: sample yang berbeda dapat dianalisis secara

simultan

dengan jumlah cekungan uji yang fleksibel.

• Spesifik: sepasang antibody mempunyai selektivitas tinggi secara spesifik

berikatan dengan ß-hCG

• Prosedur yang sederhana

Dalam pengaplikasian teknik ELISA, serum hCG selain dapat digunakan

sebagai test kehamilan untuk mengetahui keberadaan janin dalam rahim, juga

dapat digunakan untuk berbagai uji kehamilan lainnya, antara lain:

• Prediksi kehamilan yang multiple/ lebih dari 1.

• Diagnosis kehamilan yang abnormal.

• Penentuan fase kehamilan/ masa kehamilan.

• Diagnosis diferensial pada infertilitas/ ketidaksuburan pada wanita atau

pria.

• Investigasi lanjut setelah terapi untuk tumor trofoblastik.

Prinsip Kerja Tes h CG Menggunakan Teknik ELISA Sandwich.

Alat tes HCG yang menggunakan teknik ELISA tersedia dalam 2 bentuk di

pasaran, yaitu:

• Berupa alat yang digunakan dengan

cara memaparkannya pada aliran urin

saat pertama berkemih di pagi hari

selama beberapa saat. Jenis alat ini

sangat umum digunakan, karena dijual

bebas di apotek, dan penggunaannya mudah. Berikut ini adalah cara

kerjanya:

1. Pada saat alat tes mulai bekerja, akan muncul satu garis pada jendela

berbentuk lingkaran (jendela kontrol). Dimana garis tersebut merupakan

garis kontrol yang menunjukkan bahwa tes bekerja dengan benar.

2. Jendela berbentuk persegi akan menunjukkan hasil tes. Apabila garis

muncul pada jendela berbentuk persegi (jendela hasil) maka alat tes telah

mendeteksi adanya hormon hCG dan menunjukkan adanya kehamilan.

Berikut ini adalah ilustrasinya:

Hasil Negatif: Munculnya satu garis pada jendela kontrol (berbentuk

lingkaran) menandakan bahwa anda tidak hamil dan tes telah dilakukan

dengan benar

Hasil Positif: Munculnya 2 garis pada jendela

kontrol (berbentuk lingkaran) dan jendela hasil

(berbentuk persegi) menandakan anda hamil

Hasil Tidak Valid: Apabila garis pada jendela

kontrol tidak muncul berarti tes tidak dilakukan

dengan benar.

• Berupa alat digunakan dengan cara membubuhi

beberapa tetes serum pada mikrotiter. Berikut ini

adalah cara kerjanya:

1. Mengandalkan antibody anti- ß-hCG

yang terimobilisasi pada media padat yang berikatan dengan ß-hCG

yang bebas dari sampel (urin)

2. Antibodi kelinci anti- ß-hCG berkonjugasi dengan horseradish

peroxidase (HRP) sebagai larutan konjugasi antibodi-enzim.

3. Sampel tes dibiarkan untuk bereaksi simultan dengan antibody,

menghasilkan ß-hCG antara fase padat dengan antibody-enzim.

4. Setelah inkubasi, cekungan dibilas untuk membilas antibody-enzim

yang tidak terikat. Kemudian substrat HRP, TMB, ditambahkan

untuk menghasilkan warna biru.

5. Perkembangan warna dihentikan dengan penambahan stop solution

yang akan mengubah warna jadi kuning.

6. Konsentrasi ß-hCG secara langsung proporsional terhadap intensitas

warna yang dihasilkan dan diukur absorbansinya dengan

spektrofotometer.