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1
ELISAEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
ELISAEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
Prof. Dr. Fábio Gregori
ELISA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
RADIOIMUNOENSAIO
R. IMUNOENZIMÁTICAS
RI
IF
E
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2
Introdução
Introdução
ELISA
Grande sensibilidade diagnóstica
Baixo limiar de detecção
Exame direto ou indireto
Qualitativo ou quantitativo
Variadas aplicações
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3
Conceitos
SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA = é a capacidade de um teste classificar como positivo quem é realmente
positivo
ESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA = é a capacidade de um teste classificar como negativo quem é realmente
negativo
Tabela 2x2
A
C
A+C
B
D
B+D
A+B
C+D
A+B+C+D
Total
Total
CONDIÇÃO
TESTE
Sensibilidade = A / A+C Especificidade = D / B+D
VP+ = A/A+B x 100 P= A+C / A+B+C+D x 100
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4
VP
FN
FP
VN
Total
Total
CONDIÇÃO
TESTE
VP+FN FP+VN
FN+VN
VP+FP
VP+FP+FN+VN
Tabela 2x2
Ponto de corte
não infectados infectados
OD
Freq.
Ponto de corte
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5
Ponto de corte
Freq.
maior sensibilidade
maior especificidade
sens. / espec. intermediária
não infectados infectados
ODPontos de corte
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6
ELISA
ELISA
Fundo em U Fundo em V Fundo chato
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7
Leitura do sinal da reação
Antígeno
solúvel X particulado
Antígenos
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8
ELISA
PROTEINA ADSORVEA PLÁSTICOS EM
pH ALCALINO (9.6)
IMOBILIZAÇÃO DE IMUNOREAGENTES
SOLÚVEIS EM UMA FASE SÓLIDA
Imunofluorescência Direta
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9
H2 O2 H2 O + O- -
ALTERA COR
p
Y TMB
Antígeno
(DIRETO)
COR INICIAL(ou ausência de cor)
Anticorpo
(INDIRETO)
??
conhecido
Introdução
Parada da reaçãoe leitura
substratocromógeno
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10
Imunoperoxidase
ELISA
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11
ELISA
Y Y Y Y Y
YY Y Y Y
O- -OPD
H2O2
ELISA Direto +
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12
Y Y Y Y Y
Y Y Y Y YYY Y Y Y
O- -OPD
H2O2
ELISA Duplo Sanduíche +
Y Y Y Y Y
Y Y Y Y YYY Y Y Y
O- -OPD
H2O2
XELISA Duplo Sanduíche -
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ELISA de Bloqueio
animais silvestres
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Estudo de caso
Peste Suína Clássica
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15
(Possui 4 diferentes domínios)
(Proteína mais imunogênica)
→ Elisa indireto para detecção de CSFV
→Alvo: diferentes epítopos da proteína E2 do vírus
CSFV Ab - Competitivo
?
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16
CSFV Ab 2.0 - Bloqueio
→Detecta anticorpos anti-domínio A da Proteína E2 do CSFV.
→Além do domínio A (mais específico), há o B, C e D da proteína E2.
→ Vantagem de não causar reações cruzadas com outros pestivírus.
?
(Possui 4 diferentes domínios)
(Proteína mais imunogênica)
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17
CSFV Erns Elisa - Bloqueio
DIVA – Diferenciação entre indivíduos Infectados x VAcinados
Vacina – contém apenas a subunidade E2 (mais imunogênica de todas)
Infectados – contém a proteína E2, Erns , NS2-3.
?
Infectado com o
vírus de campo
Interpretações
Não vacinado - não infectado:(negativo em ambos testes indiretos anti-E2 e anti- ERNS)
Vacinado - não infectado:(positivo no anti-E2 e negativo no anti-ERNS)
Infectado: (positivo em ambos testes, seja vacinado ou não)
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CSFV Ag - Sanduíche Simples - Direto
Utilidade:
→ Rastreamento de rebanhos potencialmente infectados.
→ Em áreas endêmicas, detecção de focos residuais de PSC após a vacinação ter sido
utilizada.
Vantagem: Detecção mais precoce da doença (anticorpos em níveis detectáveis
levam aproximadamente 14 dias p.i.)
→ Material clínico: sangue, plasma, soro e amostras de tecidos.
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19
Reação de Galli Mainini
“El diagnóstico del embarazo con batracios
machos”
1914-1961
1) Colher urina da mulher com suspeita de gravidez(evitar a ingestão de líquidos – diluição).
2) Em um sapo (bufo) macho, >100 gramas de peso,inocular 10 mL de urina na via subcutânea de modoa atingir o saco linfático do animal.
3) Se grávida, há hCG, induz a liberação de espermatozóides, detectados na urina do animal após um determinado período.
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USO DE BIOTINA - AVIDINA
+ =Ac Biotina
+ =AvidinaPeroxid.
ELISA - outras apresentações
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22
ELISA QUANTITATIVO
ELISA - Quantitativo
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23
ELISA - Quantitativo
ELISA – Prática
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ELISA – Prática
ELISA – Prática
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25
ELISA – Prática
ELISA – Prática
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Pareamento dos soros
Difícil detecção
Título
de Ac
Tempo
• AUTOMATIZÁVEL
• LEITURA NÃO SUBJETIVA
• BAIXO LIMIAR DE DETECÇÃO
• CUSTO (RELATIVO)
• SENSIBILIDADE ELEVADA
•VERSÁTIL
• TRIAGEM
ELISA - Vantagens
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• PODEM OCORRER RUÍDOS
• AMPLIFICAÇÃO DE SINAIS INESPECÍFICOS
• EXIGE ALGUNS EQUIPAMENTOS (relativo)
(LEITOR/ MULTICANAL)
ELISA - Desvantagens
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Literatura Recomendada
Vol 45, 2000