eletroforese, sds-page e sequenciamento de proteínas · 23/10/2012 6 eletroforese - aplicações...
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23/10/2012
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Cronograma
Entrega do Relatório 4
Entrega do Relatório 5
Laboratório de informática Simulação computacional de purificação de proteínas Exercício de Sequenciamento
23/10
30/10 06/11
Aula: Eletroforese (SDS-PAGE) e Sequenciamento de Proteínas Prática 6- Procedimento A (Diálise) Execução e Recolhimento do exerício 7
HOJE
(Prova de Protocolo + Execução e recolhimento Exercício 10)
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Coloração Descoloração
Determinação da massa molecular
Identificação e Sequenciamento da proteína
Tratamento da amostra (SDS + -mercaptoetanol) 100 C/5 min
Diálise
Eletroforese (SDS-PAGE)
Identificação e Sequenciamento de proteínas
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Proteínas
H2PO4-/HPO4
2-
Na+/Cl-
Íons do tampão
H2O 2L H2O 2L
Antes da diálise Depois da diálise
H2O
Tampão fosfato 50 mM + NaCl 1 M (1 ml)
Tampão fosfato 0.025 mM NaCl 0.5 mM
Tampão fosfato 0.0000125 mM NaCl 0.00025 mM
Diálise Objetivo: Remover o excesso de sais (íons) que atrapalham nas etapas de caracterização da proteína.
(diluição de 2000x) (diluição de 2000x)
20 l de Tampão de Amostra: Tampão (Tris, pH 6.8)
Glicerol SDS Azul de Bromofenol -mercaptoetanol
+
-Acrescentar 20 l de tampão de amostra - Incubar em água fervente por 5 min
HOJE
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Outros métodos para separação da proteína
Filtração sob pressão Ideal para desalinizar e concentrar amostras
A amostra é forçada a passar
através de uma membrana
contendo poros de tamanho
definido colocando-se o tubo em
uma centrífuga
Diálise
Eletroforese (SDS-PAGE)
Identificação e Sequenciamento de proteínas
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Prática 6- SDS-PAGE 1) Receber o gel preparado e aplicar as amostras preparadas previamente
Poço 1: Padrão de peso molecular
Poço 2: Lisado centrifugado
Poço 3: Material DEAE
Poço 4: Padrão isolado de -galactosidase
2) Ligar a fonte
3) Eletroforese até o corante azul de bromo-fenol atingir a base do gel. Desligar a fonte.
4) Retirar o gel e colocar na solução de coloração (Azul de Coomassie) e depois na de descoloração.
5) Visualizar as bandas das proteínas. Identificar a -glicosidase.
5) Determinar o Peso Molecular.
Eletroforese
Mobilidade eletroforética: = v/E = Z/f
v = Z E f Velocidade
de migração
Carga Líquida
Força do campo elétrico (V. cm-1)
Coeficiente Friccional (resistência encontrada pelo íon; é afetado pelo tamanho/forma do íon)
+ +
Eletroforese descreve a migração de uma partícula carregada sob influência de um campo elétrico.
Voet
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Eletroforese - Aplicações
-Isolar proteínas para análise por MS -Determinar o tamanho (Mr) da proteína
-Acompanhamento de purificação de proteínas
-Acompanhar expressão de proteínas
1. Uso de um campo elétrico
2. Uso de um polímero
(poliacrilamida ou agarose)
3. Proteínas carregadas
negativamente migram para o
polo positivo
4. Migração depende da carga ,
massa, e formato das proteínas
Lenhinger
Eletroforese em Gel
PAGE – do inglês “polyacrylamide gel electrophoresis” é o tipo de eletroforese mais utilizado para análise de proteínas
Gel é formado no espaço formado entre duas placas de vidro grapeados contendo espaçadores ( 1mm)
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Fundamentos sobre a polimerização do gel de Poliacrilamida
S2O82 + e- SO4
TEMED
- Persulfato de amônio + TEMED: Formação de Radicais Livres iniciadores da polimerização
- Radicais derivados do persulfato induzem a reação de polimerização dos monômeros de acrilamida e de bis-acrilamida
Persulfato de Amônio TEMED
R + M RM
RM + M RMM
RMM + M RMMM , etc.
Porosidade do gel é dado pela % da acrilamida
Polímero de acrilamida e bis-acrilamida
Ligações cruzadas (bis-acrilamida)
[monômeros] determina o tamanho dos poros
Porcentagem de acrilamida: 5 %; 10 %, 15 %; 20 %; 30 %
Proteínas (SDS-PAGE)
Tamanho do poro
Gel serve como uma “peneira”
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Tipos de Eletroforese
Eletroforese
Não-Desnaturante (Nativa)
Separação por carga, peso molecular e forma
Desnaturante (SDS-PAGE)
Separação por peso molecular
Agente Denaturante
Torna a proteína carregada negativamente
+
SDS desnatura a proteína 1 SDS liga a 2 resíduos de aminoácidos
Resumindo: Em SDS-PAGE as proteínas são separadas basicamente pelo tamanho!
No entanto, quando em gel as proteínas são separadas segundo o seu peso molecular
Proteínas reduzidas e desnaturadas com SDS apresentam a mesma velocidade de migração quando em eletroforese livre (sem o gel, somente tampão).
v = Z E f
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Eletroforese Não-Redutora
Redutora
Não-Desnaturante (Nativa)
Separação por carga, peso molecular e forma
Desnaturante (SDS-PAGE) Separação por peso molecular
-mercaptoetanol Ou DTT
Experimentos em SDS-PAGE não-redutor e redutor permitem observar a presença de dímeros e outras proteínas contendo pontes de disulfeto.
SDS
Proteína
SDS
SDS-PAGE não redutor e redutor
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Gel de aplicação ou empilhamento
Visualização de Proteínas após Eletroforese
1. Coloração com o corante
(Coomassie blue, Prata)
2. Descoloração com ácido acético
Lenhinger
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Estimativa do Peso Molecular de Proteínas
( SDS Gel Electrophoresis)
Lenhinger
d D
Rm =d/D
D= Migração total d = Migração individual de cada banda
Mr
Mr = massa molecular (ou peso molecular)
Métodos para determinar peso molecular
Cromatografia de Exclusão
dD
Rm =d/D
Mr
Mr = massa molecular(ou peso molecular)
SDS-PAGE
Migração relativa
Eluição relativa
Método bastante sensível
Fornece valores de PM com
alta presisão
Precisão
5-10 %
Precisão
10 %
Espectrometria de Massas
Precisão
0.001 %
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Eletroforese em Gel-Bidimensional
Objetivo: Maximizar a separação de proteínas
(c) Eletroforese em gel bidimensional
Focalização isoelétrica SDS gel electrophoresis
Lenhinger
Primeira Dimensão Segunda Dimensão
Separa de acordo com o pI Separa de acordo com o tamanho
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Focalização Isoelétrica
1. Eletroforese em gradiente de pH
2. Proteínas são distribuídas ao longo
do gradiente de pH de acordo com o
valor do seu pI.
3. Cada proteína é “focalizada” em uma
faixa estreita de pH próxima ao seu
pI
Lenhinger
Eletroforese em gel bidimensional das proteínas de E. coli
- mais de 2,000 proteínas podem ser visualizadas
Lenhinger
Utilizada para comparar níveis de expressão de proteínas
Proteínas de interesse podem ser identificadas utilizando-se anticorpos
Proteínas são identificadas por espectrometria de massas
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Diálise
Eletroforese (SDS-PAGE)
Identificação e Sequenciamento de proteínas
O sequenciamento da proteína fornece informações acerca da estrutura primária
Espectrometria de massas
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Genoma
A sequência de aminoácidos pode ser determinada pela sequência do DNA do gene que o codifica
Proteoma
No entanto, sequenciamento do gene NÃO:
- Localiza pontes de disulfeto (S-S) - Identifica modificações pós-traducionais
Sequenciamento de Proteínas
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(a) Determinação da composição/proporção de aminoácidos: Hidrólise ácida (HCl 6 M)
Fig 7-6 Separação e Análise de aminoácidos por HPLC. (Voet 3ed).
1) hidrólise também pode ser realizada em meio básico, utilizando 2-4 M de NaOH
2) A hidrólise também pode ser realizada por digestão enzimática: Ex. Pronase (mistura de proteases)
3) A separação e análise dos aminoácidos pode ser feita por diversas técnicas como HPLC ou cromatografia em camada delgada (TLC).
Na TLC (thin layer chromatografy) os aminoácidos são revelados (p. ex. com nihidrina) e identificados utilizando-se padrões.
(b) Identificação da extremidade amino-terminal utilizando: Reagente de Sanger (1-fluor-2,4-dinitrobenzeno, FNDB)
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(c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetídica: Degradação de Edman
Fenilisotiocianato (PITC)
Ácido trifluoracético
(c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetídica: Degradação de Edman
Limitações:
Tempo de análise longo
Grande quantidade de amostra
Atualmente o método de
escolha para o
sequenciamento tem sido
a espectrometria de
massas
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Sequenciamento de proteínas grandes requer a clivagem parcial da
cadeia polipeptídica (enzimas)
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O sequenciamento dos peptídeos derivados da clivagem parcial da proteína pode ser feita por:
-Degradação de Edman (técnica pouco usada atualmente)
-Espectrometria de Massas (técnica mais utilizada atualmente devido a maior sensibilidade e
especificidade do método)
Identificação e Sequenciamento de Proteínas por Espectrometria de massas (MS)
Aspectos históricos
Apesar da espectrometria de massa ser utilizada a muito anos para o estudo de moléculas orgânicas, sua aplicação para o estudo de macromoléculas foi, por muito tempo, limitado por problemas técnicos.
Macromoléculas como proteínas, DNA e carboidratos são fragmentados pelos processos necessários para ionizar as moléculas no vácuo do aparelho.
Porém, com o advento de duas novas técnicas de ionização, isto mudou, e hoje a espectrometria de massas é uma ferramenta importante em biologia.
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Requisito fundamental para análise no espectrômetro de massas
Geração de íons em fase gasosa
Mas como volatilizar uma macromolécula???
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2002/fenn-lecture.html
Nobel Prizes - Chemistry 2002
John B. Fenn is the chemist who invented
the ELECTROSPRAY method (1988).
Professor of Chemistry at Yale University, USA, and at Virginia Commonwealth University, USA
Koichi Tanaka research engineer who
developed the MALDI technique (1987). Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.
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Métodos de Ionizações Brandas Proteínas são ionizadas pela aquisição de prótons (íons c/ carga positiva)
A carga é adquirida pela protonação de resíduos básicos da proteína (Lys, Arg)
[M + nH]n+
Massa da proteína
A ionização por electrospray
produz proteínas carregadas
com múltiplas cargas
A ionização por MALDI produz
proteínas monocarregadas
É possível identificar proteínas através da análise das massas do peptídeos gerados (Peptide Mass Fingerprinting) e utilização de softwares que fazem a busca dos peptídeos detectados em banco de dados (p. ex. MASCOT)
A espectrometria de massas permite determinar a massa da proteína/peptídeo com alta precisão (<0.001%). A precisão de massa na eletroforese (SDS-PAGE) é de 5-10 %.
Ainda mais, é possível realizar o sequenciamento completo de cada peptídeo. Isso é importante para identificação de novas proteínas e de modificações pós-traducionais.
Vantagens da utilização de espectrometria de massas
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Mistura de Peptídeos
Determinação das massas de cada peptídeo
por espetrometria de massas
Determinação da massa da
proteína intacta
por espectrometria de massas
Sequenciamento de cada
peptídeo por MS/MS
Digestão enzimática
*PMF = Peptide Mass Fingerprinting; **PFF = Peptide Fragmentation Fingerprinting
Identificação e
Caracterização da Proteína
Proteína Desconhecida
Busca das massas
dos peptídeos
em Banco de Dados
(PMF*)
Busca das sequências
em banco de dados de
sequências
(PFF**)
Estratégias para a identificação de proteínas por espectrometria de massas
Match
(proteína conhecida)
No Match
(proteína desconhecida)
Match
(proteína conhecida)
No Match
(proteína desconhecida)
Caracterização de uma
nova proteína
Em geral a proteína é isolada de gel 2D...
Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
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Proteínas podem ser identificadas através das massas de peptídeos gerados na sua hidrólise por enzimas conhecidas. Os dados das massas dos peptídeos são colocados em um tipo de google para proteínas (ex. Mascot)
a) Busca em banco de dados de proteínas b) Comparação dos peptídeos detectados com os peptídeos teóricos obtidos na digestão de proteínas com a protease utilizada no experimento c) Match! Identificação.
Espetro de massa dos peptídeos gerados
pela clivagem da proteína com uma protease
ex.: MASCOT
Identificação de proteínas por “ peptide mass fingerprint (PMF)”
Exemplo: Identificação da beta-glicosidase
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Tripsinização
Procedimento: Remoção da banda da -glicosidase, digestão com tripsina e análise por espectrometria de massas
MALDI-TOF
Obs. O protocolo de digestão utilizado inclui uma alquilação prévia dos tiois livres com iodoacetamida,
1179.511
963.414
1333.524
1515.656742.326
898.397
1783.703
2065.8442383.836
3313.0822938.198 4074.899
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
4x10
Inte
ns. [a
.u.]
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500m/z
Espetro de massa dos peptídeos derivados da digestão da beta-glicosidase com tripsina
Lista de peptídeos detectados
m/z 698.315
742.326
780.283
866.400
936.431
963.414
1034.066
1082.483
1121.502
1154.519
1170.517
1179.511
1361.555
1383.528
1515.656
1728.736
1783.703
1940.766
2089.867
2272.853
2288.853
2310.801
2938.198
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Busca no Mascot utilizando as massas dos peptídeos detectados
Lista de peptídeos detectados
m/z 698.315
742.326
780.283
866.400
936.431
963.414
1034.066
1082.483
1121.502
1154.519
1170.517
1179.511
1361.555
1383.528
1515.656
1728.736
1783.703
1940.766
2089.867
2272.853
2288.853
2310.801
2938.198
Modificações variáveis mais comuns
Durante o preparo da amostra para análise no espectrômetro de massa é comum realizar a
redução de pontes de disulfeto (beta-mercaptoetanol ou DTT) e a alquilação do tiolato (SH
livre) (p. ex. alquilação com iodoacetamide)
Alquilação de tióis livres
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As massas detectadas são comparados com as massas teóricas da proteína através de softwares específicos (neste exemplo utilizou-se o Biotools da Bruker)
Massas detectadas Massas teóricas
Scores acima de 86 são significantes (p<0.05)
O score obtido na busca foi de 121. Portanto o resultado é signifiante.
RESULTADO OBTIDO NO MASCOT
Parâmatros utilizados na busca pelo Mascot
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Resultado do Mascot mostrando as sequências que tiveram match (em vermelho) O match ocorre quando a massa experimental bate com a teórica
Massas que não tiveram match. Essas massas podem ser de uma outra proteína ou de peptídeos que sofreram alguma modificação.
Massas que tiveram match
Conclusões da busca no Mascot
Os dados de análises dos peptídeos derivados da digestão tríptica da banda retirada do gel de eletroforese mostram que a proteína purificada corresponde à beta-glicosidase de Spodoptera Frugiperda. A cobertura da sequência foi de 23 % com um erro de 0.5 Da. É possível atingir uma cobertura maior usando erros maiores (47 % com um erro de 2 Da), porém isso pode levar à interpretações errôneas sobre a identificação da proteína. Apesar da cobertura ser aparentemente baixa, as sequências que foram cobertas (sequências que tiveram o match) possibilitam realizar a identificação da proteína com um score de 121. Esse score indica o grau de significância do resultado e para a busca realizada, scores acima de 86 são significantes (p<0.05).
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Sequenciamento de peptídeos por espectrometria de massas
Antigamente o sequenciamento era feito pela degradação de Edman.
Atualmente o método de escolha é a espectrometria de massas.
Peptídeos podem ser fragmentados no espectrômetro de massa
A clivagem mais comum ocorre na ligação peptídica, gerando íons da série y e b.
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= 128.06 = 163.07 = 71.03
Lys (K)
Glu(E)
Espectro MS/MS de um peptídeo
b2-b1
= 147.02
Phe (F)
y2-y1
= 128.06
Gln (Q)
Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7ed. Capítulo 9, página 382-383
Seleção e fragmentação de peptídeo (MS/MS)
1179.511
963.414
1333.524
1515.656742.326
898.397
1783.703
2065.8442383.836
3313.0822938.198 4074.899
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
4x10
Inte
ns. [a
.u.]
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500m/z
Espectro de massa dos fragmentos de do íon de m/z 1179.511
Espectro de massa da mistura de peptídeos
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30/10/2012 (Turma A) 06/11/2012 (Turma B) LABORATÓRIO DE INFORMÁTICA