Eletroforese Bidimensional Eletroforese Bidimensional como Ferramenta Proteômica como Ferramenta Proteômica

Prof. Carlos André O. Ricart

CBSP-Centro Brasileiro de Pesquisa em Proteínas

Departamento de Biologia Celular

Universidade de Brasília

Por muitos anos a genômica funcional propagou a noção de que não seria necessário estudar níveis de proteínas para obter-se dados de “up and down regulation”. Tudo o que era necessário seria a determinação dos níveis de mRNA

Em 1997, Anderson apresentou um trabalho mostrando a primeira comparação da abundância de mRNA e proteínas correspondentes. A correlação foi de 0,43…

Anderson &Seihamer (1997) Electrophoresis 18, 533-537

Esses resultados vem sendo confirmados por outros grupos

A proteômica, portanto, A proteômica, portanto, parece ser a ferramenta mais parece ser a ferramenta mais

apropriada para entender-se o apropriada para entender-se o funcionamento dos genes, pois funcionamento dos genes, pois

analisa o produto final do analisa o produto final do genomagenoma

A abordagem proteômica exige A abordagem proteômica exige a separação de proteínas com a separação de proteínas com alta resolução para posterior alta resolução para posterior

análiseanálise

Apesar de antiga, até o Apesar de antiga, até o momento não surgiu uma momento não surgiu uma

metodologia capaz de resolver metodologia capaz de resolver mais proteínas mais proteínas

simultaneamente do que asimultaneamente do que a eletroforese bidimensionaleletroforese bidimensional

Eletroforese Bidimensional Eletroforese Bidimensional (2D-PAGE)(2D-PAGE)

1975 - surge a 2D-PAGE . Trabalhos de O´Farrel; Klose ; MacGillivray et al.

Etapas Básicas:

1- Focalização Isoelétrica (IEF)2-Eletroforese desnaturante em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE)

Por muitos anos a 2D-PAGE Por muitos anos a 2D-PAGE sofria do “defeito sofria do “defeito contemplativo”contemplativo”

Um gande passo no uso da 2D-Um gande passo no uso da 2D-PAGE ocorreu com o progresso PAGE ocorreu com o progresso

nas técnicas analíticas de nas técnicas analíticas de identificação de proteínas identificação de proteínas

2D-PAGE: etapas principais2D-PAGE: etapas principais

Preparação da amostra Focalização Isoelétrica SDS-PAGE Detecção Digitalização e análise de imagem

Focalização Isoelétrica (IEF)Focalização Isoelétrica (IEF)

As moléculas migram sob a ação de um campo elétrico em um gel contendo um gradiente de pH. A migração se interrompe ao atingirem seu ponto isoelétrico

Aplicada a moléculas que possam ser tanto positivamente ou negativamente carregadas (anfotéricas)

Cadeias laterais das proteínas possuem grupos ionizáveis carboxílicos(Asp,Glu), aminos (Lys), imidazóis (His) e guanidino (Arg)

R-COO- + H+ R-COOH

R-NH3+ + OH- R-NH2 + H2O

A carga líquida de uma proteína é função da soma de suas cargas negativas e positivas. A carga é zero no seu ponto isoelétrico (pI)

O pI de uma proteína pode ser alterado por modificações químicas como fosforilações

O pré-requisito para uma boa IEF é a formação de gradiente de pH estável e reprodutível

Gradientes de pHGradientes de pHA focalização isoelétrica é realizada em géis de poliacrilamida contendo um gradiente de pH que pode ser de dois tipos:

Tampões anfotéricos (“free carrier ampholytes”)

Gradientes imobilizados de pH (IPG)

Tampões anfotéricos (“free carrier Tampões anfotéricos (“free carrier ampholytes”)ampholytes”)

CH2-N-(CH2)X -N-CH2-

| |

(CH2) X (CH2) X

| |

NR2 COOH

R= H ou -(CH2) X -COOH, X=2

Propriedades:boa condutividade e solubilidade no pI, alta capacidade tamponante, baixa interação com a amostra

Gradiente de pH com“ampholytes”Gradiente de pH com“ampholytes”Com o uso dos “ampholytes” o gradiente de pH é formado sob ação de um campo elétrico

Desvantagens: resultado depende do tempo de focalização, temperatura e efeitos endosmóticos

Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH

Gradientes imobilizados de pH (IPG) Gradientes imobilizados de pH (IPG) Gradiente formado com derivados de acrilamida contendo

grupos tamponantes (“Immobilines”)

CH2 = CH-C - N - R

|| |

O H R-grupo carboxílico ou amino Método altamente reprodutível pois os grupos tamponantes

estão fixados ao gel Propicia uma alta capacidade de aplicação de amostra e

uma baixa condutividade durante a focalização Géis prontos são disponíveis comercialmente

Formação de gel de IPGFormação de gel de IPG

Gel de IPG preparado pela mistura linear de duas soluções de polimerização com diferentes Immobilines, ambas contendo monômeros de acrilamida

Diagrama de uma rede de Diagrama de uma rede de poliacrilamida com Immobilines co-poliacrilamida com Immobilines co-

polimerizadospolimerizados

-C=O | O-

-C=O | O-

-C=O | O-

-NH+ R

| R

-NH+ R

| R

Reidratação de géis de IPGReidratação de géis de IPG

Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH

Equipamentos usados no CBSP Equipamentos usados no CBSP para Focalização Isoelétricapara Focalização Isoelétrica

MultiPhor II (Amersham Biosciences)

IPGPhor (Amersham Biosciences)

IPG PhorIPG Phor

IEF: Aplicação da amostraIEF: Aplicação da amostra

Aplicação direta sobre o gel de IPG,

Aplicação simultânea à reidratação do gel

Aplicação usando “sample Aplicação usando “sample cups”cups”

A amostra deve ser aplicada em um dos extremos de pH (perto do catodo ou do anodo) onde a maioria das proteínas está carregada, minimizando perdas por precipitação

Aplicação durante a Aplicação durante a reidrataçãoreidratação

O gel de IPG é reidratado na solução contendo a amostra

Permite aplicação de maior quantidade de proteínas (>10 mg)

Minimiza a precipitação de proteínas durante a entrada no gel, principalmente para proteínas de membrana

Evita a manipulação exigida durante a aplicação usando “sample cups”

Equilibrio do gel de IPGEquilibrio do gel de IPG 15-30 min em solução contendo Tris, Uréia,

Glicerol, DTT, SDS e bromofenol 15-30 min em solução contendo Tris, Uréia,

Glicerol, iodacetamida, SDS e bromofenol Após equilíbrio retirar excesso do tampão

de equilíbrio lavando com tampão de corrida SDS-PAGE

Segunda dimensão Segunda dimensão SDS-PAGESDS-PAGE

Sistema horizontal. Ex.Mutiphor II Electrophoresis unit (Pharmacia Biotech)

Sistema vertical. Ex. SE 600, IsoDalt (Amersham), Investigator (Millipore), Protean II xi (BIO-RAD), etc.

CH2= CH | C = O | NH2

CH2= CH | C = O | NH | CH2

| NH | C=O | CH2=CH

...- CH2 - CH | C = O | NH2

- CH2 -

- CH2 -

- CH2- CH | C = O | NH | CH2

| NH | C=O | CH2-CH

CH -... | C = O | NH2

...-CH - | C = O | NH2

CH -... | C = O | NH2

Acrilamida

Metileno bisacrilamida poliacrilamida

Tamanho do poroTamanho do poro

T- concentração total de acrilamidaT= (a+b) x 100

V C - porcentagem de “crosslinker”

C = b x 100

a + b

SDS-PAGE-sistema verticalSDS-PAGE-sistema vertical

Vantagens: Possibilidade de uso de equipamento pre-existente no laboratório, permite corridas simultâneas de vários géis dependendo do sistema utilizado

SDS-PAGE-SistemaSDS-PAGE-Sistema horizontal horizontal

Vantagens:Melhor resolução segundo a. Gorg, possibilidade de uso de géis “pre-casted”

Desvantagens: permite apenas duas corridas simultâneas

Como preparar a amostra

para a 2D-PAGE?

Composição dos tampões de Composição dos tampões de amostraamostra

Tampões de amostra normalmente possuem:– Uréia– Detergente – Agente redutor– Anfólitos– Inibidores de proteases

Preparação da AmostraPreparação da Amostra

Para a focalização isoelétrica, as proteínas devem ser completamente solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e reduzidas

O processo de solubilização deve, portanto, atingir os seguintes objetivos:

– Quebrar interações macromoleculares incluindo todas as interações não covalentes e as pontes dissulfeto

– Prevenir modificações nas proteínas

– Manter as proteínas em solução durante a 2D-PAGE

Agentes Redutores– 2-mercaptoetanol era usado nos primórdios.

Sua ação tamponante destrói o gradiente de pH na região básica.

– DTT é o mais utilizado. Obs: proteínas com muita cisteína não são totalmente reduzidas com DTT.

– Tributilfosfina (TBP) é o mais potente agente redutor disponível. Obs: é volátil, tóxico e requer solvente orgânico para dissolver em água.

– Tris(carbixietil) fosfine (Pierce Co.) é uma fosfina hidrossolúvel.

Rompimento de interações não covalentes 1- Agentes caotrópicos:

– Uso de reagentes caotrópicos, como a uréia, por alterarem os parâmetros do solvente exercem profundos efeitos sobre todos os tipos de interações não covalentes.

– A tiouréia é um agente caotrópico mais eficiente que a uréia, mas pouco solúvel em água.

– A mistura uréia- tiouréia é bastante eficiente.

Paba et al (2003) Proteomics, in press

Cuidado com a carbamilação causada pela uréia!

- A uréia em água existe em equilíbrio com cianato de amônio (cujos níveis aumentam com a temperatura.- Cianato pode reagir com aminas (N-terminal ou lisinas).- Consequência: heterogeneidade artefactual de carga, bloqueio N-terminal, etc.- Como evitar: grau de pureza da uréia, evitar temperaturas acima de 37ºC, desionizar soluções de uréia e usar “scavengers” de cianato (amina primária).

Rompimento de interações não covalentes

2- Detergentes:– Rompem interações hidrofóbicas– Para a focalização isoelétrica, não podem

ter carga líquida.Devem ser não-iônicos ou zwitterionicos

– SDS deve ser evitado!!– Os mais compatíveis com as

necessidades são o Triton X-100 e o CHAPS

Mantendo as proteínas intactas

– Hidrolases (fosfatases, glicosidases e proteases)

– Proteases são resistentes à uréia e a detergentes

– Inibidores de proteases nem sempre são suficientes

– Solubilização em SDS quente– Homogeinização da amostra em TCA

diluído ou TCA-acetona

Paba et al (2003). Proteomics, in press

Remoção de sais

– Os sais interferem diretamente no processo eletroforético. Eles migram através do gradiente de pH produzindo calor e acumulam-se nas duas extremidades. Isso causa zonas de alta condutividade, queda de voltagem e diminuição do campo elétrico. Nessa zonas, as proteínas não focalizam e aparecem como faixas. As tiras de IPG incham nessas zonas de aalta condutividade devido ao acúmulo de água.Remoção por precipitação ou diálise.

DetecçãoDetecção

Fatores importantes:– Faixa dinâmica de detecção– Linearidade– Reprodutibilidade entre experimentos– Variabilidade inter proteína– Compatibilidade com métodos de identificação

Principais métodosPrincipais métodos

Coomassie Blue Nitrato de Prata Reagentes fluorescentes Marcação radioativa

Apesar da enorme quantidade de trabalho proteômico, continuamos observando a ponta do iceberg.

A grande maioria das proteínas proteínas raras (e preciosas) ainda estão escondidas.

Todos estão identificando as mesmas proteínas (as mais abundantes)

Por que? Por que?

A abundância das proteínas varia muito Ex: Nas células Humanas

– Actina (108 cópias /célula) – Receptores celulares e fatores de transcrição

(102-103 cópias /célula)– Dinamic range 105-106 !!!!

– Dinamic range 2D-PAGE = ~104

Obs: a situação é ainda pior em certas amostras como o soro sanguíneo onde albumina é presente em concentrações de 40 mg/mL e citocinas em pg/mL .

Faixa dinâmica de 109

Como resolver este problema?Como resolver este problema?

Uma opção é o pré Uma opção é o pré fracionamento da amostrafracionamento da amostra

Tipos de fracionamento

– Celular

– Cromatográfico

– Eletroforético

Outra opção é o uso de Outra opção é o uso de gradientes estreitos de pH gradientes estreitos de pH (“narrow pH gradients”)(“narrow pH gradients”)

Paba et al (2003) Proteomics, in press

Limitações da abordagem 2D-Limitações da abordagem 2D-PAGE/MSPAGE/MS

Dificuldade de automação

Incapaz de detectar, identificar e quantificar todas as proteínas de amostras complexas simultaneamente

Dificuldade de resolver proteínas extremamente ácidas ou básicas, assim como as muito hidrofóbicas.

““2D or not 2D?” 2D or not 2D?”

Se o objetivo é prover uma lista de todas as proteínas presentes em uma amostra, metodologias baseadas em cromatografia multidimensional acoplada à espectrometria de massa em sequência (MS/MS) pode fornecer resultados superiores

Se o objetivo for observar mudanças quantitativas na expressão de proteínas ou suas modificações pós traducionais durante um processo biológico, os géis bidimensionais ainda são inigualáveis.

Tripomastigotas Amastigotas