eletroforese · 2 eletroforese É um processo que consiste na separação dos componentes de um...
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Eletroforese
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Eletroforese� É um processo que consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico. � É usado para separar e analisar biomoléculas.
� Princípio: Substâncias em solução que possuem carga elétrica livre,
deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico de sentido invariável.
� Para que uma partícula se mova é necessário que possua carga elétrica livre, isto é, excesso ou diferença de elétrons.
� Portanto: - para o ânodo (+) dirigem-se os ânions- para o cátodo (-) dirigem-se os cátions
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EletroforeseE
N E
N
N
NE P E
ii
ii
ii i i
i
= = =∑
∑ ∑
� As moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a carga elétrica e a forma.
� Separa-se partículas de mesma carga, porém com quantidades diferente de carga.
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�Moléculas grandes migramlentamente, enquanto moléculas pequenas movem-se rapidamente.
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EletroforeseE
N E
N
N
NE P E
ii
ii
ii i i
i
= = =∑
∑ ∑
� Suportes:
Meio sólido: - Papel- Acetato de celulose
Meio semi-sólido: - Gel de amido- Gel de agarose- Gel de poliacrilamida
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E
N E
N
N
NE P E
ii
ii
ii i i
i
= = =∑
∑ ∑ ( )2
2 22 2/
3 3 2 3A A A A
c mPV N mu N m N c N average kinetic energy molecule
= = = =
Eletroforese
�Marcadores de peso molecular são usadospara estimar o tamanho das moléculasdas amostras.
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Eletroforese: a concentração do gel
�A concentração do gel definirá o tamanho dos poros a serematravessados pelasmoléculas emmigração.
�Geis muitoconcentrados oferecerãomaior resistência àmigração das moléculas.
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Eletroforese
� LipoProteínas – unidade de transporte lipídico
� Identificação de 4 faixas lipoproteicas
- Quilomicrons
- Lipoproteína Beta
- Lipoproteína Pré-beta
- Lipoproteína Alfa
- Ultracentrifugação
- Separação por eletroforese
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Eletroforese
� Hemoglobina
- Hemoglobina S
- Hemoglobina C
- Talassemia Beta
- Hemoglobina anormais- Carga elétrica- Ponto isoelétrico
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Eletroforese
� Hemoglobina S
- Indivíduos heterozigotos (AS)- Traço siclêmico- Geralmente assintomáticos
- Hemoglobinopatia estrutural* substituição do ácido glutâmico pela valina
- Indivíduos homozigotos (SS)- Anemia hemolítica congênita( anemia falciforme)
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Eletroforese
� Proteínas: - aminoácidos como eletrólitos
� Proteínas séricas:- Albumina- Globulinas (α1, α2, β, δ)
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Eletroforese: métodos de leitura
Densitometria
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Espectrofotometria
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energia frequência de infra- visível ultra- raios-X raios-γγγγ radiante rádio vermelho violeta _______________________________________________________________________________________ Técnica NMR Absorção Absorção Absroção Absorção Técnicas radio- Analítica Microondas Fluorescência Difração métricas Fosforescência Fotometria de chama Espectroscopia de emissão _______________________________________________________________________________________ Interação desintegração vibração e excitação eletrônica dos elétrons desintegração com a do rotação das átomos de uma moléculs internos são do núcleo matéria núcleo moléculas deslocados
_______________________________________________________________________________________
Aplicações da espectroscopia
Rotação
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• A região do espectro do ultravioleta é na faixa de 200 a 400 nme a da luz visível é entre 400 e 800 nm.
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O que faz com que alguns raios interajam e outros passem através das coisas?
Dois requerimentos devem ser observados para que uma determinadaradiação possa ser absorvida por uma molécula:
1 - A radiação incidente deve ser de frequência equivalente aquela rotacional ou vibracional, eletrônica ou nuclear da molécula,
2 - A molécula deve ter um dipolo permanente ou um dipolo induzido, ou seja, deve haver algum trabalho que a energia absorvida possa fazer.
Interação da radiação com a matéria
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Leis de absorção
IoI1
Io = 100I1 = 50
Io = 100 I1 = 50I2 = 25
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Esquema dos principais componentes de um espectrofotômetro
• A amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de quartzo quando a radiação for na região espectral do ultravioleta. Quando for na região da luz visível usa-se os de vidro por ter uma melhor dispersão.
• Os detectores devem ser altamente sensíveis.• Os dados obtidos pelo detector são enviados para um
dispositivo de processamento de dados.