electron paramagnetic resonance measurements of free

8/7/2019 Electron paramagnetic resonance measurements of free

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 5 , p p . 5 7 0 3 - 5 7 0 7 , A u g u s t 1 9 8 8M e d i c a l S c i e n c e s

E l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e m e a s u r e m e n t s o f f r e er a d i c a l s i n t h e i n t a c t b e a t i n g h e a r t : A t e c h n i q u e f o r d e t e c t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f f r e e r a d i c a l s i n w h o l e b i o l o g i c a l t i s s u e s( i n v i v o e l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e / l o o p - g a p r e s o n a t o r / f r e e r a d i c a l m e t a b o l i s m / o x i m e t r y / r e p e r f u s i o n )

J A Y L . Z W E I E R * AND PERIANNAN KUPPUSAMYT h e E l e c t r o n P a r a m a g n e t i c R e s o n a n c e L a b o r a t o r i e s , D e p a r t m e n t o f M e d i c i n e , C a r d i o l o g y D i v i s i o n , T h e J o h n s H o p k in s M e d i c a l I n s t i t u t i o n s ,B a l t i m o r e , MD 2 1 2 2 4C o m m u n i c a t e d b y W i l l i a m A . H a g i n s , A p r i l 2 5 , 1 9 8 8 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w M a r c h 1 8 , 1 9 8 8 )ABSTRACT F r e e r a d i c a l s h a v e b e e n h y p o t h e s i z e d t o b ei m p o r t a n t m e d i a t o r s o f d i s e a s e i n a v a r i e t y o f o r g a n s a n d t i s -s u e s . E l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e ( E P R ) s p e c t r o s c o p yc an b e a p p l i e d t o d i r e c t l y m e a s u r e f r e e r a d i c a l s ; h o w e v e r , i th a s n o t b e e n p o s s i b l e t o m e a s u r e i m p o r t a n t b i o l o g i c a l r a d i c a l si n s i t u b e c a u s e c o n v e n t i o n a l s p e c t r o m e t e r d e s i g n s a r e n o t s u i t -a b l e f o r t h e p e r f o r m a n c e o f m e a s ur e m e n t s o n w h o l e o r g a n s o rt i s s u e s . We r e p o r t t h e d e v e l o p m e n t o f a n E PR s p e c t r o m e t e rd e s i g n e d f o r o p t i m u m p e r f o r m a n c e i n m e a s u r i n g f r e e r a d i c a l si n i n t a c t b i o l o g i c a l o r g a n s o r t i s s u e s . T h i s s p e c t r o m e t e r c o n -s i s t s o f a 1 - t o 2 - G H z m i c r o w a v e b r i d g e w i t h t h e s o u r c e l o c k e dt o t h e r e s o n a n t f r e q u e n c y o f a r e c e s s e d g a p l o o p - g a p r e s o n a -t o r . W i t h t h i s s p e c t r o m e t e r , r a d i c a l c o n c e n t r a t i o n s a s l o w a s0 . 4 j s M c a n b e m e a s u r e d . I s o l a t e d b e a t i n g h e a r t s w e r e s t u d i e di n w h i c h s i m u l t a n e o u s r e a l t i m e m e a s u r e m e n t s o f f r e e r a d i c a l sa n d c a r d i a c c o n t r a c t i l e f u n c t i o n w e r e p e r f o r m e d . T h i s i n v i v oE P R t e c h n i q u e w a s a p p l i e d t o s t u d y t h e k i n e t i c s o f f r e e r a d i c a lu p t a k e a n d m e t a b o l i s m i n n o r m a l l y p e r f u s e d a n d g l o b a l l yi s c h e m i c h e a r t s . In a d d i t i o n , w e s h o w t h a t t h i s t e c h n i q u e c a nb e u s e d t o n o n i n v a s i v e l y m e a s u r e t i s s u e o x y g e n c o n s u m p t i o n .T h u s , i t i s d e m o n s t r a t e d t h a t E P R s p e c t r o s c o p y c a n b e a p p l i e dt o d i r e c t l y m e a s u r e i n v i v o f r e e r a d i c a l m e t a b o l i s m a n d t i s s u eo x y g e n c o n s u m p t i o n . T h i s t e c h n i q u e o f f e r s g r e a t p r o m i s e i nt h e s t u d y o f i n v i v o f r e e r a d i c a l g e n e r a t i o n a n d t h e e f f e c t s o ft h i s r a d i c a l g e n e r a t i o n o n w h o l e b i o l o g i c a l t i s s u e s .E l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e ( E P R ) s p e c t r o s c o p y w a sd e v e l o p e d i n t h e l a t e 1 9 4 0 s . A d v a n c e s i n m i c r o w a v e s o u r c ea n d s i g n a l p r o c e s s i n g t e c h n o l o g y e n a b l e d t h e d e v e l o p m e n to f i n s t r u m e n t a t i o n c a p a b l e o f p e r f o r m i n g s e n s i t i v e m e a s u r e -m e n t s o f f r e e r a d i c a l s a n d p a r a m a g n e t i c i o n s i n s o l i d s a n ds m a l l c h e m i c a l s a m p l e s . S i n c e t h a t t i m e , E P R s p e c t r o s c o p yh a s b e c o m e a n i m p o r t a n t t e c h n i q u e f o r s t u d y i n g t h e m a n yc h e m i c a l r e a c t i o n m e c h a n i s m s i n v o l v i n g f r e e r a d i c a l i n t e r -m e d i a t e s . O v e r t h e p a s t d e c a d e , f r e e r a d i c a l s h a v e b e e n r e c -o g n i z e d t o b e i m p o r t a n t m e d i a t o r s o f a l a r g e v a r i e t y o f c l i n i -c a l d i s e a s e p r o c e s s e s i n c l u d i n g h e a r t a t t a c k , s t r o k e , r e s p i r a -t o r y d i s t r e s s s y n d r o m e , a c u t e t u b u l a r n e c r o s i s o f t h e k i d n e y ,r e p e r f u s i o n i n j u r y o f a v a r i e t y o f o r g a n s , a n d o n c o g e n e s i sa n d t u m o r p r o m o t i o n ( 1 , 2 ) . E v e n t h e p r o c e s s o f a g i n g h a sb e e n p r o p o s e d t o b e s e c o n d a r y t o t h e f o r m a t i o n o f r e a c t i v eo x y g e n f r e e r a d i c a l s ( 3 ) . T h u s , f r e e r a d i c a l s a r e t h o u g h t t om e d i a t e m a n y o f t h e m o s t p r e v a l e n t d i s e a s e s c a u s i n g m o r -b i d i t y a n d m o r t a l i t y i n t h e U n i t e d S t a t e s t o d a y .E P R s p e c t r o s c o p y h a s b e e n w i d e l y a p p l i e d t o s t u d y b i o -l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l p r o b l e m s o f i s o l a t e d p r o t e i n s a n de n z y m e s i n v o l v i n g f r e e r a d i c a l s a n d p a r a m a g n e t i c m e t a li o n s ; h o w e v e r , s i m i l a r m e a s u r e m e n t s h a v e n o t b e e n m a d e i ni n t a c t b i o l o g i c a l t i s s u e s . C o n v e n t i o n a l s p e c t r o m e t e r d e s i g n s

t h a t a r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e a r e t y p i c a l l y b u i l t w i t h m i -c r o w a v e f r e q u e n c i e s o f 8 - 1 0 GHz ( X - b a n d ) o r 3 5 - 4 0 GHz( Q - b a n d ) w i t h s t a n d a r d r e c t a n g u l a r o r c y l i n d r i c a l r e s o n a n tc a v i t i e s . W i t h t h e s e s p e c t r o m e t e r d e s i g n s , t h e maximumt h i c k n e s s o f t h e n o n f r o z e n a q u e o us s a m pl e t h a t c a n b e s t u d -i e d i s a p p r o x i m a t e l y 1 o r 0 . 2 mm, r e s p e c t i v e l y .We r e p o r t t h e d e v e l o p m e n t o f a n E P R s p e c t r o m e t e r d e -s i g n e d t o e n a b l e h i g h s e n s i t i v i t y E P R m e a s u r e m e n t s o fw h o l e b i o l o g i c a l o r g a n s a n d t i s s u e s . U s i n g t h i s s p e c t r o m e -t e r , we m e a s u r e p h y s i o l o g i c ( A u M ) c o n c e n t r a t i o n s o f f r e e r a d -i c a l s i n t h e i n t a c t b e a t i n g h e a r t . T h i s t e c h n i q u e p r o v i d e s n o n -d e s t r u c t i v e m e a s u r e m e n t s o f t h e k i n e t i c s o f f r e e r a d i c a l u p -t a k e a n d m e t a b o l i s m i n t h e i n t a c t b e a t i n g h e a r t . S i m u l t a -n e o u s m e a s u r e m e n t s o f c a r d i a c c o n t r a c t i l e f u n c t i o n a n d f r e er a d i c a l c o n c e n t r a t i o n s w e r e p e r f o r m e d , e n a b l i n g d i r e c t r e a lt i m e c o r r e l a t i o n o f t h e e f f e c t s o f f r e e r a d i c a l s o n h e a r t f u n c -t i o n . I n a d d i t i o n , t h i s i n v i v o E P R t e c h n i q u e w a s a p p l i e d t on o n i n v a s i v e l y m e a s u r e o t h e r i m p o r t a n t t i s s u e p r o p e r t i e s i n -c l u d i n g t i s s u e o x y g e n c o n s u m p t i o n .METHODS

L u m p e d c i r c u i t r e s o n a t o r d e s i g n s w e r e d e s c r i b e d a s e a r l y a s1 9 4 0 a n d r e c e n t l y t h e s e r e s o n a t o r s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e dt o b e u s e f u l f o r a p p l i c a t i o n t o NMR a n d E P R s p e c t r o s c o p y( 4 , 5 ) . T h e s e d e s i g n s w e r e r e f e r r e d t o i n i t i a l l y a s s p l i t - r i n gr e s o n a t o r s a n d s u b s e q u e n t l y t h e t e r m l o o p - g a p r e s o n a t o r h a sb e e n c o i n e d t o e n c o m p a s s a b r o a d r a n g e o f v a r i a t i o n s o ft h e s e d e s i g n s ( 5 ) . T h e s p l i t - r i n g r e s o n a t o r o r l o o p - g a p r e s o -n a t o r d e s i g n s c a n b e v i s u a l i z e d a s a s p l i t c o n d u c t i n g c y l i n d e rw i t h a n i n d u c t i v e r i n g , o r l o o p , a n d t w o a i r g a p p l a t e c a p a c i -t o r s ( F i g . 1 ) . T h e c r i t i c a l d i m e n s i o n s o f t h i s r e s o n a t o r i n -c l u d e r , t h e r e s o n a t o r r a d i u s ; t , t h e g a p s i z e ; w , t h e w i d t h o ft h e c a p a c i t i v e p l a t e s ; n , t h e n u m b e r o f g a p s ; z , t h e r e s o n a t o rl e n g t h . T h i s r e s o n a t o r i s p l a c e d w i t h i n a c o n d u c t i n g s h i e l d o fr a d i u s R , w h i c h m u s t b e l e s s t h a n t h e c u t o f f w a v e l e n g t h f o rt h e l o w e s t e x c i t e d p r o p a g a t i o n a l m o d e o f c y l i n d r i c a l w a v e -g u i d e t o s u p p r e s s t h e e x t e r n a l r a d i a t i o n o f m i c r o w a v e e n e r g yo b s e r v e d w h e n t h e r e s o n a t o r d i m e n s i o n s a p p r o a c h q u a r t e rw a v e l e n g t h . C o u p l i n g o f m i c r o w a v e p o w e r i s a c h i e v e d v i aa n i n d u c t i v e c o u p l i n g l o o p . T h e r e s o n a n c e f r e q u e n c y , v , o ft h i s r e s o n a t o r i s d e f i n e d b y t h e e q u a t i o n

2 = r + -2 ( r + w ) 2 ) ( 7 r W e L )l + 2 ( t 1 ) 1 / 2

X 1 + 2 . 5 ( t / w ) '[]A b b r e v i a t i o n s : E P R , e l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e ; TEMPO,2 , 2 , 6 , 6 - t e t r a m e t h y l p i p e r i d i n y l o x y r a d i c a l .* T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d a t : D i v i s i o n o f C a r -d i o l o g y , F r a n c i s S c o t t K e y M e d i c a l C e n t e r , B u i l d i n g B 1 S o u t h ,4 9 4 0 E a s t e r n A v e n u e , B a l t i m o r e , MD 2 1 2 2 4 .

5 7 0 3

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


2/5

5 7 0 4 M e d i c a l S c i e n c e s : Z w e i e r a n d K u p p u s a m y

F I G . 1 . D i a g r a m o f t h e l o o p - g a p r e s o n a t o r .a n d t h e Q i s d e f i n e d b y t h e e q u a t i o n1 r 2 \

r + R 2 - ( r + W ) 2 )+ + W + ) ( r ) 2 ]

w h e r e 8 = ( 1 / I r p . V c O ) 1 / 2 , e i s t h e d i e l e c t r i c c o n s t a n t , A . i s t h es u s c e p t i b i l i t y , a n d o - i s t h e c o n d u c t i v i t y .L o o p - g a p r e s o n a t o r s a r e s u p e r i o r t o c o n v e n t i o n a l c a v i t yr e s o n a t o r s f o r a c c o m m o d a t i n g l a r g e a q u e o us s a mp l e s b a s e do n t h e f a c t t h a t t h e m ax im um E f i e l d i s l o c a l i z e d w i t h i n t h eg a p a n d t h e m a x i m u m H f i e l d i s l o c a l i z e d i n t h e b o r e . T h u s ,maximum H f i e l d a n d m i n i m u m E a r e o b s e r v e d a t a s a m p l ei n t h e c e n t e r o f t h e r e s o n a t o r b o r e m i n i m i z i n g t h e l o s s i nr e s o n a t o r Q o b s e r v e d f r o m l o a d i n g w i t h a l o s s y d i e l e c t r i ca q u e o u s s a m p l e . T h e r e f o r e , r e l a t i v e l y h i g h Q v a l u e s c a n b eo b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f h i g h f i l l i n g f a c t o r s , w h i c h e n -a b l e s h i g h s e n s i t i v i t y t o b e o b t a i n e d i n E P R a p p l i c a t i o n s .T h e maximum a t t a i n a b l e s e n s i t i v i t y f o r E P R m e a s u r e m e n t sa t a n y g i v e n f r e q u e n c y i s d e f i n e d b y t h e e q u a t i o n ( 6 , 7 )C m i n = K / Q U n ( c o 2 ( P W ) 1 1 2 , [ 3 ]

w h e r e cn i s t h e m i n i m u m d e t e c t a b l e r a d i c a l c o n c e n t r a t i o n ,Q u i s t h e u n l o a d e d Q o f t h e r e s o n a t o r , q i s t h e f i l l i n g f a c t o r ,w O i s t h e m i c r o w a v e f r e q u e n c y , P w i s t h e a p p l i e d m i c r o w a v ep o w e r , a n d K i s a f r e q u e n c y - i n d e p e n d e n t c o n s t a n t . T h u s ,m a x i m u m s e n s i t i v i t y i s o b t a i n e d w h e n t h e f i l l i n g f a c t o r , t h eQ , a n d t h e r e s o n a n c e f r e q u e n c y a r e m a x i m i z e d .T h e m a g n i t u d e o f E f r i n g e f i e l d s e x t e n d i n g o u t s i d e t h e g a pi n t o t h e r e s o n a t o r b o r e i n c r e a s e s a s t h e r a t i o t i w i n c r e a s e s .T h e r e f o r e , we o b s e r v e t h a t t i w s h o u l d b e < 0 . 2 .From t h e e q u a t i o n s f o r v a n d Q t h e o r e t i c a l p r e d i c t i o n s o fr e s o n a t o r d i m e n s i o n s y i e l d i n g o p t i m u m Q w e r e p e r f o r m e d .T h e s e p r e d i c t i o n s w e r e t h e n e x p e r i m e n t a l l y t e s t e d . A r u g g e dv e r s a t i l e r e s o n a t o r d e s i g n w a s c o n s t r u c t e d s u i t a b l e f o r i nv i v o t i s s u e E P R a p p l i c a t i o n s . As s h o w n i n F i g . 2 , t h i s r e s o -n a t o r d e s i g n c o n s i s t e d o f a n o u t e r s h i e l d ( R = 2 . 0 6 c m ) , a ni n n e r l o o p g a p r e s o n a t o r i n s e r t r o d , t h e r e s o n a t o r h a l v e s t h a ta t t a c h t o t h e i n s e r t r o d , a c o u p l i n g l o o p , a n d a m e c h a n i c a lm i c r o m e t e r c o n t r o l l e d s t a g e u s e d t o p r e c i s e l y move t h e r e s o -n a t o r w i t h r e s p e c t t o t h e c o u p l i n g l o o p . T h e s h i e l d w a s m a -c h i n e d f r o m r e x o l y t e p l a s t i c b l o c k s a n d a s e r i e s o f r e s o n a t o ri n s e r t s a n d r e so n a t o r h a l v e s w e r e a l s o m a c h i n e d f r o m r e x o -l y t e . T h e s h i e l d w a s s i l v e r e d w i t h a 1 0 - , g m t h i c k n e s s o f s i l v e rd e p o s i t e d b y i o n b e a m d e p o s i t i o n . T h e r e s o n a t o r h a l v e sw e r e c o a t e d w i t h p u r e 9 9 . 9 % s i l v e r f o i l , w h i c h w a s a t t a c h e dt o t h e p l a s t i c w i t h t r a n s f e r a d h e s i v e . F o r o p t i m u m p e r f o r m -a n c e i n E P R a p p l i c a t i o n s w i t h maximum Q , t h e s i l v e r e d c o n -d u c t i n g s u r f a c e o f t h e r e s o n a t o r m u s t b e a t l e a s t 1 0 t i m e s t h em i c r o w a v e f r e q u e n c y s k i n d e p t h ; h o w e v e r , t o a c h i e v e a d -

F I G . 2 . D i a g r a m o f t h e l o o p - g a p r e s o n a t o r d e s i g n u s e d f o r s t u d -i e s o f i n t a c t b i o l o g i c a l t i s s u e s . A , c o u p l i n g a d j u s t m e n t m i c r o m e t e r ;B , s u p p o r t r a i l ; C , s a m p l e t u b e ; D , s a m p l e t u b e h o l d e r ; E , r e s o n a t o rs u p p o r t r o d ; F , s p r i n g - l o a d e d r e s o n a t o r c o u p l i n g a d j u s t m e n t s t a g e ;G , s h i e l d ; H , s e m i r i g i d c o a x c o u p l i n g l o o p ; I , r e s o n a t o r h a l v e s . T h eo u t e r s h i e l d , G , i s s h o w n p a r t i a l l y p e e l e d o p e n t o i l l u s t r a t e t h e r e s o -n a t o r a n d c o u p l i n g l o o p w i t h i n .q u a t e f i e l d m o d u l a t i o n p e n e t r a t i o n a t f r e q u e n c i e s o f 5 0 o r1 0 0 k H z , t h e t h i c k n e s s c a n n o t e x c e e d 2 5 -5 0 g m . T h e r e f o r e ,t h e r e s o n a t o r w a s s i l v e r e d w i t h f o i l 2 5 a m t h i c k . T h e c o u -p l i n g l o o p c o n s i s t e d o f a s h o r t l e n g t h o f 3 - m m - d i a m e t e r s e m i -r i g i d c o a x w i t h i n n e r c o n d u c t o r l o o p e d a n d s o l d e r e d t o t h eo u t e r c o n d u c t o r . C o u p l i n g o f m i c r o w a v e p o w e r w a s v a r i e db y m o v i n g t h e r e s o n a t o r w i t h r e s p e c t t o t h e c o u p l i n g l o o pw i t h p r e c i s e m o v e m e n t a c h i e v e d b y u s i n g t h e m i c r o m e t e rc o n t r o l l e d s t a g e . A s e r i e s o f 4 0 0 r e s o n a t o r s w e r e b u i l t a n dt e s t e d w i t h v a r i o u s d i m e n s i o n s o f r , t , w , a n d n . T o a c c o m -m o d a t e a q u e o u s s a m p l e s i z e s a s l a r g e a s 1 0 - 2 0 mm d i a m e -t e r , t h e r e s o n a n t f r e q u e n c y m u s t b e i n t h e r a n g e o f 1 - 2 G H z ,L - b a n d , o r b e l o w . I t w a s o b s e r v e d t h a t t h e e x p e r i m e n t a l l ym e a s u r e d r e s o n a n c e f r e q u e n c i e s m a t c h e d t h e t h e o r e t i c a l l yp r e d i c t e d v a l u e s t o w i t h i n 5% a c c u r a c y ; h o w e v e r , s i g n i f i c a n td e v i a t i o n s i n t h e m e a s u r e d Q v a l u e s w e r e o b s e r v e d . An o p t i -m u m ( f i l l i n g f a c t o r x Q ) p r o d u c t w a s o b s e r v e d f o r a q u e o u ss a m p l e s o f 1 3 - 1 5 mm d i a me t e r w it h r e s o n a t o r d i m e n s i o n s r= 1 3 m m , t = 0 . 2 5 m m, w = 3 m m , n = 2 , a n d z = 2 5 m m.T h e r e s o n a n t f r e q u e n c y o f t h i s r e s o n a t o r w a s 1 . 1 GHz w i t ha n u n l o a d e d Q o f 2 0 0 0 a n d a Q o f 6 0 0 w h e n t h e r e s o n a t o rw a s f i l l e d w i t h a 1 3 - m m a q u e o u s s a m p l e . I t w a s o b s e r v e dt h a t t h e Q o f t h e s a m p l e c o n t a i n i n g r e s o n a t o r c o u l d b e f u r -t h e r i n c r e a s e d b y r e c e s s i n g t h e g a p s w i t h s e m i c y l i n d r i c a lh o l e s ( F i g . 3 ) . R e c e s s i n g t h e g a p s h a s t h e e f f e c t o f d e c r e a s -i n g E f r i n g e f i e l d a t t h e s a m p l e , d e c r e a s i n g d i e l e c t r i c l o s s ,a n d i n c r e a s i n g r e s o n a t o r Q w i t h o n l y a s m a l l e f f e c t i v e d e -c r e a s e i n r e s o n a t o r f i l l i n g f a c t o r . T h e r e c e s s e d l o o p - g a p r e s -o n a t o r w i t h d i m e n s i o n s r = 1 3 mm , t = 0 . 2 5 m m , w = 3 mm,n = 2 , z = 2 5 m m , a n d r e c e s s i o n r a d i u s a = 4 mm h a d ar e s o n a n t f r e q u e n c y o f 1 . 1 G H z , w i t h a Q o f 1 0 0 0 w h e n l o a d -e d w it h a 1 3 - m m - d i a m e t e r a q u e o u s s a m p l e . F i e l d m o d u l a t i o nw a s a c h i e v e d w i t h 8 - c m - d i a m e t e r 1 0 0 - t u r n m o d u l a t i o n c o i l sm o u n t e d o n t h e s i d e w a l l s o f t h e r e s o n a t o r s h i e l d . T h e m o d u -

F I G . 3 . D i a g r a m o f t h e r e c e s s e d l o o p - g a p r e s o n a t o r u s e d i n t h es t u d i e s o f i n t a c t h e a r t s . G a p s a r e r e c e s s e d b y a s e m i c y l i n d r i c a l h o l eo f r a d i u s a .

P r o c . N a t L Acad S c i . USA 8 5 ( 1 9 8 8 )


3/5

P r o c . N a t l . Acad S c L USA 8 5 ( 1 9 8 8 ) 5 7 0 5l a t i o n a m p l i t u d e a n d s i g n a l p h a s e w e r e c a l i b r a t e d w i t h ap o i n t s a m p l e o f t h e d i p h e n y l p i c r y l h y d r a z y l r a d i c a l .R e s o n a t o r s w e r e t e s t e d w i th a n E I P 9 31 o r W a v e t e k 2 0 0 5m i c r o w a v e s w e e p e r . M e a s u r e m e n t s o f r e s o n a n t f r e q u e n c y ,Q , a n d H 1 f i e l d s w e r e p e r f o r m e d . U n l o a d e d Q w a s m e a s u r e da s t w i c e t h e r e s o n a n c e w i d t h a t h a l f - p o w e r a b s o r p t i o n w i t ht h e r e s o n a t o r c r i t i c a l l y c o u p l e d . H 1 f i e l d v a l u e s w e r e m e a -s u r e d w i t h a c o p p e r s p h e r e a s d e s c r i b e d ( 8 ) .E P R s p e c t r a w e r e o b t a i n e d a t L - b a n d , 1 - 2 G H z , u s i n g as p e c i a l l y d e s i g n e d m i c r o w a v e b r i d g e c o n t a i n i n g a c a v i t y s t a -b i l i z e d t r a n s i s t o r o s c i l l a t o r a s t h e f r e q u e n c y s o u r c e , a d i r e c -t i o n a l c o u p l e r w i t h a t e s t p o r t c o n n e c t e d t o a f r e q u e n c yc o u n t e r , a v a r i a b l e a t t e n u a t o r w i t h a 6 0 - d B r a n g e , a t h r e e -p o r t c i r c u l a t o r , a s h o t k e y d i o d e d e t e c t o r , a n d a p r e a m p l i f i e rs t a g e w i t h o u t p u t c o n n e c t e d t o t h e i n p u t o f t h e s i g n a l c h a n -n e l l o c k - i n a m p l i f i e r . T h e o s c i l l a t o r h a d a maximum p o w e ro u t p u t o f d 1 0 0 mW a n d w a s l o c k e d t o t h e r e s o n a n t f r e q u e n -c y o f t h e s a m p l e r e s o n a t o r w i t h a n AF C f e e d b a c k l o o p .I s o l a t e d r a t h e a r t s w e r e p e r f u s e d b y t h e m e t h o d o f L a n -g e n d o r f f a t 3 7 0 C w i t h a K r e b s b i c a r b o n a t e - b u f f e r e d p e r f u s -a t e c o n s i s t i n g o f 1 1 7 mM N a C l , 2 4 . 6 mM NaHCO3, 5 . 9 mMK C 1 , 1 . 2 mM M g C l 2 , 2 . 0 mM C a C l 2 , 1 6 . 7 mM g l u c o s e , b u b -b l e d w i t h 9 5 % 0 2 / 5 % C O 2 a s d e s c r i b e d ( 9 ) .

RESULTSE v a l u a t i o n o f S e n s i t i v i t y . S t u d i e s w e r e p e r f o r m e d t o e v a l u -a t e t h e s e n s i t i v i t y o f t h e s p e c t r o m e t e r f o r p e r f o r m i n g E P Rm e a s u r e m e n t s o n f r e e r a d i c a l s i n l a r g e a q u e o u s s a m p l e s .S a m p l e t u b e s o f 1 3 a n d 1 5 mm w e r e s t u d i e d w i t h s a m p l ev o l u m e s o f 1 - 2 m l . A s s h o w n i n F i g . 4 , s p e c t r u m A , w i t h 2 -m i n s p e c t r a l a c q u i s i t i o n s , s i g n a l / n o i s e r a t i o s o f > 1 2 0 0 w e r eo b t a i n e d o n 1 . 0 mM s o l u t i o n s o f 2 , 2 , 6 , 6 - t e t r a m e t h y l p i p e r i -d i n y l o x y r a d i c a l ( T E M P O ) ; w i t h a r a d i c a l c o n c e n t r a t i o n o fo n l y 2 E L M , a s i g n a l / n o i s e r a t i o > 5 w a s o b s e r v e d ( F i g . 4 ,s p e c t r u m B ) . T h u s , f r e e r a d i c a l c o n c e n t r a t i o n s a s l o w a s 0 . 4, u M w e r e d e t e c t a b l e .

3 3 9 364 3 8 9 4 1 4 4 3 9M A G N E T I C H E L D ( G A U S S )

F I G . 4 . S p e c t r u m A , E P R s p e c t r u m o f a n a q u e o u s 1 . 0 mM TEM-P O s o l u t i o n f i l l i n g a 1 3 - m m c y l i n d r i c a l t u b e . T h e r e s o n a n t f r e q u e n c yi s 1 . 0 8 5 GHz w i t h a m o d u l a t i o n a m p l i t u d e o f 0 . 5 G , m o d u la t io n f r e -q u e n c y o f 5 0 k H z , m i c r o w a v e p o w e r o f 1 0 0 m W, a n d a c q u i s i t i o nt i m e o f 2 m i n . S p e c t r u m B , E P R s p e c t r u m o f a n a q u e o u s 2 AMT E M P O s o l u t i o n f i l l i n g a 1 3 - m m c y l i n d r i c a l t u b e . T h e s p e c t r u m w a sa c q u i r e d a s d e s c r i b e d f o r S p e c t r u m A . S p e c t r u m C , E P R s p e c t r u mo f a p e r f u s e d r a t h e a r t i n a 1 3 - m m t u b e . T h e h e a r t w a s p e r f u s e d w i t ha s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 . 0 mM TEMPO. A 2 - m i n a c q u i s i t i o n w a s p e r -f o r m e d 5 m i n a f t e r s t a r t i n g t h e r a d i c a l i n f u s i o n . T h i s s p e c t r u m w a so b t a i n e d a s d e s c r i b e d f o r s p e c t r u m A , e x c e p t t h a t t h e r e s o n a n t f r e -q u e n c y was 1 . 0 9 5 G H z .

R a d i c a l U p t a k e a n d C l e a r a n c e i n t h e P e r f u s e d H e a r t .H e a r t s w e r e r e m o v e d f r o m r a t s ( 2 0 0 g ) a n d p e r f u s e d i n aL a n g e n d o r f f m o d e w i t h a c o n s t a n t c o r o n a r y f l o w o f 1 0m l / m i n , y i e l d i n g a p e r f u s i o n p r e s s u r e o f = 8 0 mmHg. A l e f tv e n t r i c u l a r b a l l o o n w a s i n s e r t e d f r o m t h e l e f t a t r i u m t o t h el e f t v e n t r i c l e t o e n a b l e c o n t i n u o u s m e a s u r e m e n t o f l e f t v e n -t r i c u l a r p r e s s u r e s a n d h e a r t r a t e . T h e h e a r t s w e r e i n s e r t e di n t o 1 3 - m m t u b e s a n d t h e t u b e p l a c e d w i t h i n t h e r e s o n a t o r( F i g . 5 ) . A d r a i n a g e c a t h e t e r w a s i n s e r t e d a t t h e b o t t o m o ft h e t u b e a n d c o n n e c t e d t o a n a s p i r a t i o n pump t o r e m o v e e f -f l u e n t p e r f u s a t e p r e v e n t i n g f l o o d i n g o f t h e r e s o n a t o r . R e -m o v a l o f p e r f u s a t e s o l u t i o n f r o m a r o un d t h e h e a r t r e s u l t e d i nh i g h e r r e s o n a t o r Q v a l u e s a n d h i g h e r s e n s i t i v i t y E P R m e a -s u r e m e n t s . I n a d d i t i o n , r e m o v a l o f a l l e f f l u e n t p e r f u s a t e e n -a b l e d m e a s u r e m e n t s o f r a d i c a l u p t a k e a n d c l e a r a n c e f r o mt h e h e a r t , e l i m i n a t i n g t h e p r o b l e m o f a n e f f l u e n t p e r f u s a t es i g n a l . T h e m i c r o w a v e b r i d g e AF C l o o p f u n c t i o n e d t o m i n i -m i z e t h e f r e q u e n c y n o i s e t h a t r e s u l t e d f r o m t h e m o t i o n o f t h eb e a t i n g h e a r t .C o n t r o l s p e c t r a w e r e r e c o r d e d a n d t h e n a n i n f u s i o n o f t h eT E M P O f r e e r a d i c a l w a s s t a r t e d w i t h a c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 0mM i n t h e p e r f u s a t e s o l u t i o n . R e p e t i t i v e 2 - m i n E P R a c q u i s i -t i o n s w e r e t h e n p e r f o r m e d f o r 3 0 m i n . I n f u s i o n o f t h e r a d i c a lw a s t h e n s t o p p e d a n d r e p e t i t i v e 2 - m i n s p e c t r a w e r e a c q u i r e dt o m e a s u r e t h e k i n e t i c s o f r a d i c a l c l e a r a n c e . T h e l e f t v e n t r i c -u l a r d e v e l o p e d p r e s s u r e o f t h e s e h e a r t s w a s = 1 2 0 m mH gw i t h a f i x e d d i a s t o l i c p r e s s u r e o f 1 2 m mH g a n d a n i n t r i n s i ch e a r t r a t e o f 2 0 0 - 2 5 0 b e a t s p e r m i n . I n f u s i o n o f t h e r a d i c a l -c o n t a i n i n g p e r f u s a t e h a d n o e f f e c t o n c o n t r a c t i l e f u n c t i o n o rh e a r t r a t e . P r i o r t o i n f u s i o n o f t h e T E M P O r a d i c a l , n o E P Rs i g n a l w a s o b s e r v e d . I m m e d i a t e l y a f t e r t h e s t a r t o f t h e i n f u -s i o n , h o w e v e r , t h e p r o m i n e n t t r i p l e t T E M P O s i g n a l w a sc l e a r l y s e e n w i t h g o o d s i g n a l / n o i s e r a t i o s o f > 4 0 0 ( F i g . 4 ,s p e c t r u m C ) . T h e i n t e n s i t y o f t h e s i g n a l i n c r e a s e d r a p i d l yo v e r t h e f i r s t 5 m i n o f i n f u s i o n w i t h a h a l f maximum a f t e r 2m i n , f o l l o w e d b y a f u r t h e r g r a d u a l i n c r e a s e o v e r t h e n e x t 1 0m i n o f a d m i n i s t r a t i o n .T o g e t a n u n d e r s t a n d i n g o f t h e n a t u r e a n d r a t e o f r a d i c a lc l e a r a n c e a n d u p t a k e we p e r f o r m e d a n o n l i n e a r ( e x p o n e n -t i a l ) l e a s t - s q u a r e s f i t t i n g o f t h e o b s e r v e d i n t e n s i t y d a t a t of u n c t i o n s o f t h e f o r m I = I o e x p ( - k t ) o r I = I o [ l - e x p ( - k t ) ] ,r e s p e c t i v e l y , u s i n g s t a n d a r d f i t t i n g r o u t i n e s . A s s h o w n i nF i g . 6 t h e t i m e c o ur s e o f r a d i c a l u p t a k e c o u l d b e p r e c i s e l ym o d e l e d a s a f i r s t - o r d e r e x p o n e n t i a l p r o c e s s w i t h a r a t e c o n -s t a n t k = 0 . 8 5 0 . 0 5 m i n m .

P E R F U S I O N CENTERINGCANNULA RING

TRANSDUCERAORTA

PERFUSIONDRAINF I G . 5 . D i a g r a m o f p e r f u s e d h e a r t p r e p a r a t i o n .

M e d i c a l S c i e n c e s : Z w e i e r a n d K u p p u s a m y


4/5

5 7 0 6 M e d i c a l S c i e n c e s : Z w e i e r a n d K u p p u s a m y1 0 0

xaE 75-R( ; O ~ ~U P T A K E> 50 0 C L E A R A N C Ez 2 5

0 0 5 1 0 1 5 20T I M E ( m i n )

F I G . 6 . G r a p h o f k i n e t i c s o f r a d i c a l u p t a k e ( o ) a n d c l e a r a n c e ( e )i n t h e i s o l a t e d p e r f u s e d h e a r t . F o r m e a s u r e m e n t s o f r a d i c a l u p t a k e ,h e a r t s w e r e p e r f u s e d w i t h 1 . 0 mM T E M P O s t a r t i n g a t t i m e 0 a n dr e p e t i t i v e 2 - m i n E P R a c q u i s i t i o n s o f 1 0 0 - G s w e e p s w e r e p e r f o r m e d .T h e s i g n a l i n t e n s i t y w a s d e t e r m i n e d f r o m d o u b l e i n t e g r a t i o n o f t h es i g n a l . K i n e t i c d a t a w e r e f i t w i t h a s i n g l e e x p o n e n t i a l w i t h r a t e c o n -s t a n t k = 0 . 8 5 m i n - . F o r m e a s u r e m e n t s o f r a d i c a l c l e a r a n c e , r a d i c a li n f u s i o n w a s s t o p p e d a f t e r 3 0 m i n a t t i m e 0 a n d r e p e t i t i v e 2 - m i n a c -q u i s i t i o n s w e r e p e r f o r m e d . T h e p r o c e s s o f r a d i c a l c l e a r a n c e r e -q u i r e d f i t t i n g w i t h a l i n e a r c o m b i n a t i o n o f 2 e x p o n e n t i a l s , o n e w i t hr a t e c o n s t a n t k = 2 . 2 m i n ' w i t h a w ei gh t o f 6 5 % a n d t h e o t h e r w i t hr a t e c o n s t a n t k = 0 . 4 m i n - w i t h a w e i g h t o f 3 5 % .C l e a r a n c e o f t h e r a d i c a l f r o m t h e h e a r t a f t e r t e r m i n a t i o n o fi n f u s i o n w a s o b s e r v e d t o p r o c e e d i n m o r e t h a n a s i n g l ep h a s e . A s i n g l e e x p o n e n t i a l f u n c t i o n w a s n o t s u f f i c i e n t t o f i tt h e o b s e r v e d d a t a s a t i s f a c t o r i l y . A p l o t o f l o g ( i n t e n s i t y ) v s .t i m e s h o w e d c l e a r l y t h e i n v o l v e m e n t o f t w o p r o c e s s e s ( F i g .7 I n s e t ) . T h e r e f o r e , t h e d a t a w e r e f i t t e d w i t h a l i n e a r c o m b i -n a t i o n o f t w o e x p o n e n t i a l s , w h i c h y i e l d e d t h e r a t e c o n s t a n t sf o r t h e t w o p r o c e s s e s a s 2 . 2 0 . 2 m i n - a n d 0 . 4 0 0 . 0 4m i n - . T h e f a s t e r p r o c e s s a c c o u n t e d f o r - 6 5 % o f t h e r a d i c a ll o s s , p r o b a b l y r e p r e s e n t i n g t h e v a s c u l a r w a s h o u t , w h i l e t h es l o w e r p r o c e s s , w h i c h a c c o u n t e d f o r 3 5 % o f t h e l o s s , m a y b ed u e t o c e l l u l a r e n z y m e r e d u c t i o n .M e a s u r e m e n t o f R a d i c a l M e t a b o l i s m i n t h e I s c h e m i c H e a r t .H e a r t s w e r e p e r f u s e d w i t h 1 . 0 mM T E M P O a s d e s c r i b e da b o v e f o r 3 0 m i n a n d t h e n s u b j e c t e d t o g l o b a l i s c h e m i a w i t h

p e r f u s i o n s t o p p e d . R e p e t i t i v e 2 - m i n E P R a c q u i s i t i o n s w e r et h e n p e r f o r m e d f o r 3 0 m i n . A g r a d u a l d e c r e a s e i n r a d i c a lc o n c e n t r a t i o n s w a s o b s e r v e d t h a t c o u l d b e p r e c i s e l y f i t w i t ha s i n g l e f i r s t - o r d e r e x p o n e n t i a l w i t h a r a t e c o n s t a n t o f 0 . 4 0 +0 . 0 1 m i n - ( F i g . 7 ) . T h i s o b s e r v e d r a t e c o n s t a n t w a s i d e n t i -10 0x0E 7 5> 5 0zw 2 5z

0 5 1 0T I M E ( m i n . )

( I )V I )D :0

I 11 5 2 0

F I G . 7 . G r a p h o f k i n e t i c s o f f r e e r a d i c a l m e t a b o l i s m i n t h e i s c h e -m i c h e a r t . T h e h e a r t w a s l o a d e d w it h a 3 0 - m i n i n f u s i o n o f 1 . 0 mMT E M P O f o l l o w e d b y i n d u c t i o n o f i s c h e m i a a t t i m e 0 . M e a s u r e m e n t sw e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n F i g . 5 . K i n e t i c d a t a o f r a d i c a l d e c a yw e r e f i t w i t h a s i n g l e e x po n e nt i al w i th r a t e c o n s t a n t k = 0 . 4 0 m i n - ' .( I n s e t ) S e m i l o g a r i t h m i c p l o t o f r a d i c a l d e c a y ( o ) i s l i n e a r . A l s os h o w n , f o r c o m p a r i s o n , a r e d e c a y d at a o f t h e p e r f u s e d h e a r t ( A ) ,w h i c h i s n o n l i n e a r a n d r e q u i r e d t w o e x p o n e n t i a l f u n c t i o n s f o r f i t -t i n g .

c a l t o t h a t o f t h e s l o w e r p r o c e s s o b s e r v e d d u r i n g r a d i c a lc l e a r a n c e o f t h e n o r m a l l y p e r f u s e d h e a r t .M e a s u r e m e n t o f M y o c a r d i a l O x y g e n C o n s u m p t i o n . M o l e c -u l a r o x y g e n i s t h e o n l y c o m p o n e n t i n a i r t h a t i s p a r a m a g n e t i ca n d i t e x i s t s i n t h e t r i p l e t g r o u n d s t a t e w i t h a s p i n S = 1 . I ns o l u t i o n , i t c a n u n d e r g o H e i s e n b e r g e x c h a n g e i n t e r a c t i o nw i t h o t h e r p a r a m a g n e t i c s p e c i e s , s u c h a s t h e s p i n l a b e lTEMPO. T h i s e x c h a n g e i n t e r a c t i o n w i l l r e s u l t i n a b r o a d e n -i n g o f t h e o b s e r v e d E P R l i n e . T h e m a g n i t u d e o f t h i s b r o a d e n -i n g d e p e n d s o n t h e e x c h a n g e r a t e , w , w h i c h i n t u r n i s g o v -e r n e d b y S m o l u c h o w s k i e q u a t i o n

C o = 4 1 r R { D ( 0 2 ) + D ( T E M P O ) } [ 0 2 ] , [ 4 ]w h e r e R i s t h e i n t e r a c t i o n d i s t a n c e b e t w e e n o x y g e n a n d t h es p i n l a b e l , w h i c h i s g e n e r a l l y a s s u m e d t o b e 4 . 5 A , D ( 0 2 ) a n dD(TEMPO) a r e , r e s p e c t i v e l y , t h e d i f f u s i o n c o n s t a n t s o f o x y -g e n a n d TEMPO, a n d [ 0 2 ] i s t h e c o n c e n t r a t i o n o f o x y g e n .N o r m a l l y i n a q u e o u s s o l u t i o n s D(TEMPO) i s much s m a l l e rc o m p a r e d t o D ( 0 2 ) a n d s o i t c a n b e o m i t t e d . T h e e x c h a n g er a t e c o i s r e l a t e d t o t h e o b s e r v e d p e a k t o p e a k w i d t h o f aL o r e n t z i a n E P R d e r i v a t i v e l i n e , H p - p , a s

c ) =(= / 2 ) y H p p , [ 5 1w h e r e y i s t h e g y r o m a g n e t i c r a t i o . C o m b i n i n g E q s . 4 a n d 5

H p - p = ( 8 1 r R / y V / 3 ) D ( 0 2 ) [ O 2 . [ 6 ]T h us , o n e c a n c o m p u t e t h e [ 0 2 ] f r o m t h e m e a s u r e d E P R l i n ew i d t h c h a n g e s , A H .I n o u r e x p e r i m e n t s , we c a r e f u l l y m e a s u r e d t h e l i n e w i d t hi n n o r m a l l y p e r f u s e d h e a r t s a n d t h e l i n e w i d t h c h a n g e s o b -s e r v e d d u r i n g i s c h e m i a . D u r i n g n o r m a l p e r f u s i o n t h e l i n ew i d t h r e m a i n e d i n v a r i a n t a t 1 . 7 3 0 . 0 2 G . T h i s v a l u e d i d n o tc h a n g e d u r i n g t h e w a s h o u t o f t h e s p i n l a b e l , e v e n w h e n t h es p i n l a b e l c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d b y a f a c t o r o f 1 0 . H o w e v -e r , a f t e r t h e i n d u c t i o n o f i s c h e m i a , t h e w i d t h o f t h e l i n e g r a d -u a l l y d e c r e a s e d a n d t h e l i n e c o n t i n u e d t o s h a r p e n w i t h i n -c r e a s i n g d u r a t i o n o f i s c h e m i a . T h i s i s i n a c c o r d a n c e w i t h t h ed e c r e a s e i n o x y g e n c o n c e n t r a t i o n t h a t w o u l d b e e x pe c t e d t oo c c u r i n i s c h e m i c m y o c a r d i u m . A maximum l i n e w i d t hc h a n g e o f 0 . 4 0 G w a s o b s e r v e d a f t e r 2 0 m i n o f i s c h e m i a ,a f t e r w h i c h e i t h e r t h e c h a n g e w a s i n s i g n i f i c a n t o r t h e l i n ei n t e n s i t y w a s t o o l o w t o g e t a p r e c i s e v a l u e f o r t h e l i n e w i d t h .We c a l c u l a t e d t h e o x y g e n c o n c e n t r a t i o n b y u s i n g t h e o b -s e r v e d l i n e w i d t h d a t a , a n d t h e v a l u e s a r e s h o w n i n F i g . 8 .

U . b U -0 . 4 0 60 . 3 0 40 . 2 0 0~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2 10 . 1 0 20 . 0 0 -0Ae r- e A e c : onU 3 ) I U

T I M E ( m i n . ) I l 2 0

; 0 0

e0 0r - l0 00 0 J

F I G . 8 . G r a p h o f m y o c a r d i a l o x y g e n c o n c e n t r a t i o n s i n t h e i s c h e -m i c h e a r t a s a f u n c t i o n o f t h e d u r a t i o n o f i s c h e m i a . O x y g e n c o n c e n -t r a t i o n w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e m e a s u r e d E P R l i n e w i d t h s . E P Rm e a s u r e m e n t s w e r e m a d e a s d e s c r i b e d i n F i g s . 5 a n d 6 . K i n e t i c s o fo x y g e n c o n s u m p t i o n w e r e m o d e l e d w i t h a s i n g l e e x p o n e n t i a l f u n c -t i o n k = 0 . 5 4 m i n ' .

P r o c . N a t L Acad S c i . USA 8 5 ( 1 9 8 8 )


5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 5 ( 1 9 8 8 ) 5 7 0 7T h e oxygen c o n c e n t r a t i o n f a l l s o f f v e r y r a p i d l y f r o m a b a s ev a l u e o f 5 0 0 tM t o 2 4 0 t t M , t h e c o n c e n t r a t i o n o f oxygen i na i r , i n l e s s t h a n a m i n u t e , a n d i n = 1 0 m i n t h e v a l u e a p p r o a c h -es z e r o . F i t t i n g t h e d a t a w i t h a s i n g l e e x p o n e n t i a l m o d e l g a v ea v a l u e o f 0 . 5 4 + 0 . 0 4 m i n - a s t h e r a t e c o n s t a n t f o r oxygenc o n s u m p t i o n d u r i n g i s c h e m i a .

DISCUSSIONF r e e r a d i c a l s h a v e b e e n p r o p o s e d t o b e i m po r t a n t m e d ia t o r so f c e l l i n j u r y i n a n u m b e r o f organs a n d t i s s u e s . R e c e n t l y , i th a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t f r e e r a d i c a l s a re g e n e r a t e d i n0 . 1 - 1 u M c o n c e n t r a t i o n s on r e p e r f u s i n g i s c h e m i c t i s s u e s( 1 0 , 1 1 ) . I n t h i s s t u d y , we h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t l o w m i c r o -m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f f r e e r a d i c a l s ca n b e m e a s u r e d i nl a r g e 1 3 - t o 1 5 - m m - d i a m e t e r aqueou s s a m p l e s a n d , more i m -p o r t a n t l y , i n w h o l e b i o l o g i c a l organs a n d t i s s u e s o f s i m i l a rs i z e . We h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t h i g h s e n s i t i v i t y E P R m e a -s u r e m e n t s ca n b e p e r f o r m e d on t h e s e i n t a c t b i o l o g i c a l t i s -sues b y u s i n g a n L - b a n d m i c r o w a v e b r i d g e w i t h a l o o p - g a pr e s o n a t o r d e s i g n . T h i s i n v i v o E P R t e c h n i q u e was a p p l i e d t om e a s u r e t h e k i n e t i c s o f f r e e r a d i c a l u p t a k e a n d c l e a r a n c e i nt h e p e r f u s e d h e a r t . H i g h q u a l i t y m e a s u r e m e n t s w e r e o b t a i n -a b l e w i t h s h o r t a c q u i s i t i o n t i m e s e n a b l i n g p r e c i s e m e a s u r e-m e n t s a n d m o d e l i n g . I t was o b s e r v e d t h a t t h e u p t a k e o f t h eT E M P O r a d i c a l c o u l d b e a c c u r a t e l y m o d e l e d as a f i r s t - o r d e re x p o n e n t i a l process w i t h a r a t e c o n s t a n t o f 0 . 8 5 m i n - ' .C l e a r a n c e o f t h e r a d i c a l on t e r m i n a t i o n o f i n f u s i o n , h o w e v -e r , w a s m o r e c o m p l e x , c o n s i s t i n g o f t w o d i s t i n c t e x p o n e n t i a lprocesses w i t h d i f f e r e n t r a t e c o n s t a n t s . T h e f a s t e r processp r o c e e d e d w i t h a r a t e c o n s t a n t o f 2 . 2 m i n - ' a n d a c c o u n t e df o r 65% o f t h e r a d i c a l l o s s ; t h e s l o w e r process p r o c e e d e dw i t h a r a t e c o n s t a n t o f 0 . 4 m i n - ' , a c c o u n t i n g f o r 3 5% o f t h er a d i c a l l o s s . I n t h e i s c h e m i c h e a r t , i t w a s o b s e r v e d t h a tT E M P O s i g n a l a l s o d e c r e a s e d as a f u n c t i o n o f t i m e a n d t h i sprocess w a s p r e c i s e l y m o d e l e d a s a s i m p l e f i r s t - o r d e r e x po-n e n t i a l d e c a y w i t h a r a t e c o n s t a n t o f 0 . 4 m i n - . S i n c e i n t h ei s c h e m i c organ t h e r e i s no w a s h o u t , t h e l o s s o f s i g n a l mustb e s o l e l y d u e t o m e t a b o l i s m o f t h e r a d i c a l . T h e a d d i t i o n a lr a p i d process o f r a d i c a l c l e a r a n c e o b s e r v e d i n t h e p e r f u s e dh e a r t i s p r e s um a b l y d u e t o v a s c u l a r w a s h o u t . T h e s l o w e rp r o c e s s o f E P R s i g n a l d e c a y o b s e r v e d i n b o t h n o r m a l l y p e r -f u s e d a n d i s c h e m i c h e a r t s i s p r o b a b l y d u e t o enzyme r e d u c -t i o n o f t h e T E M P O r a d i c a l . I t i s w e l l k n o w n t h a t n i t r o x i d er a d i c a l s a r e r e d u c e d b y c e l l s a n d b i o l o g i c a l t i s s u e s . C e l l u l a rr e d u c t i o n o f n i t r o x i d e r a d i c a l s h a s b e e n one o f t h e m a j o rp r o b l e m s e n c o u n t e r e d i n a p p l y i n g s p i n - l a b e l i n g a n d s p i n -t r a p p i n g t e c h n i q u e s t o t h e s t u d y o f c e l l s ( 1 2 ) . L a c k o f k n o w l -e d g e r e g a r d i n g t h e r a t e o f c e l l u l a r b r e a k d o w n o f s p i n - t r a pa d d u c t s h a s m a d e i t d i f f i c u l t t o a c c u r a t e l y d e t e r m i n e t h e ac-t u a l r a t e o f r a d i c a l g e n e r a t i o n i n c e l l s a n d t i s s u e s , s i n c e t h eo b s e r v e d c o n c e n t r a t i o n o f s p i n - t r a p a d d u c t s or o t h e r r a d i -c a l s i s m o d u l a t e d b y t h e r a t e o f r a d i c a l g e n e r a t i o n a s w e l l a st h e r a t e o f r a d i c a l d e s t r u c t i o n . T h u s , measurements o f t h er a t e o f c e l l u l a r r a d i c a l m e t a b o l i s m i n w h o l e b i o l o g i c a l t i s s u e sa r e o f c r i t i c a l i m p o r t a n c e i n u n d e r s t a n d i n g a n d c h a r a c t e r i z -i n g t h e m e c h a n i s m s o f b i o l o g i c a l f r e e r a d i c a l g e n e r a t i o n .

A l l b i o l o g i c a l t i s s u e s c o n s u m e oxygen, a n d t h i s process o foxygen c o n s u m p t i o n i s o f c r u c i a l i m p o r t a n c e i n s u p p l y i n gt h e energy n e e d s o f c e l l s a n d t i s s u e s . I n t h e h e a r t , 90 % o f t h eATP g e n e r a t e d i s d e r i v e d f r o m m i t o c h o n d r i a l o x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o n w i t h t h e energy r e q u i r e d f o r t h e g e n e r a t i o no f ATP d e r i v e d f r o m t h e f o u r - e l e c t r o n r e d u c t i o n o f m o l e c u -l a r o x y gen t o w a t e r ( 1 3 ) . I n c o m p l e t e r e d u c t i o n o f 02 r e s u l t si n f o r m at i o n o f t h e s u p e r o x i d e a n i o n r a d i c a l O - j , h y d r o g e np e r o x i d e ( H 2 0 2 ) , a n d t h e h y d r o x y l r a d i c a l O H - , w h i c h a rei m p o r t a n t m e d i a t o r s o f c e l l u l a r o x i d a t i v e i n j u r y . T h e r e f o r e ,t h e p r o c e s s o f 0 2 c o n s u m p t i o n i s o f g r e a t i m p o r t a n c e i n t h enormal metabolism and p a t h o l o g y o f b i o l o g i c a l organs a n dt i s s u e s . I n t h i s s t u d y , we have d e m o n s t r a t e d t h a t E P R s p e c -t r o s c o p y ca n be a p p l i e d t o n o n i n v a s i v e l y m e a s u r e c e l l u l a r

0 2 c o n s u m p t i o n i n t h e i s o v o l u m i c b e a t i n g h e a r t . T h i s E P Rt e c h n i q u e c a n b e s i m i l a r l y a p p l i e d t o o t h e r o r g a n s a n d t i s -s u e s . M e a s u r e m e n t s o f t h e m e a n o x y g e n c o n c e n t r a t i o n w i t h -i n t h e o r ga n c a n b e p e r f o r m e d w i t h o u t m e c h a n i c a l p e r t u r b a -t i o n o f t h e t i s s u e , a s w o u l d o c c u r w i t h o x y g e n e l e c t r o d et e c h n i q u e s . T h e l o w ( l e s s t h a n m M) c o n c e n t r a t i o n s o f n i -t r o x i d e r a d i c a l r e q u i r e d d i d n o t h a v e a n y d e t e c t a b l e e f f e c t o nc a r d i a c f u n c t i o n . E P R o x i m e t r y h a s t h e u n i q u e p r o p e r t y o ft a r g e t i n g t h e s p e c i f i c a r e a o f d i s t r i b u t i o n o f t h e n i t r o x i d e r a d -i c a l u s e d . T h u s , t h i s t e c h n i q u e c o u l d b e a p p l i e d t o s p e c i f i c a l -l y m e a s u r e o x y g e n c o n c e n t r a t i o n s i n d i f f e r e n t c e l l u l a r l o c a -t i o n s w i t h i n w h o l e b i o l o g i c a l t i s s u e s . F o r e x a m p l e , t h e 0 2c o n c e n t r a t i o n a d j a c e n t t o c e l l m e m b r a n e s c o u l d b e d i s t i n -g u i s h e d f r o m t h e c o n c e n t r a t i o n w i t h i n t h e c e l l v i a t h e u s e o fl i p o p h i l i c r a d i c a l p r o b e s t h a t w o u l d l o c a l i z e w i t h i n c e l l u l a rm e m b r a n e s a n d h y d r o p h i l i c p r o b e s t h a t w o u l d l o c a l i z e i n t h ec y t o s o l . T h u s , E P R o x i m e t r y c a n p o t e n t i a l l y p r o v i d e i n f o r -m a t i o n t h a t c a n n o t b e o b t a i n e d w i t h o t h e r t e c h n i q u e s . T h et e c h n i q u e o f p e r f o r m i n g r e a l t i m e m e a s u r e m e n t s o f o x y g e nc o n s u m p t i o n a n d f r e e r a d i c a l g e n e r a t i o n o r m e t a b o l i s ma l o n g w it h s i mu lt a n e o u s m e a s u r e m e n t s o f c o n t r a c t i l e f u n c -t i o n i s a u n i q u e a n d p o w e r f u l m e t h o d o f s t u d y i n g f r e e r a d i c a lb i o l o g y a n d i t s p h y s i o l o g i c a l a n d p a t h o l o g i c a l e f f e c t s o n t h eh e a r t . T h e s e t e c h n i q u e s , w h i c h h a v e b e e n d e v e l o p e d a n d a p -p l i e d t o s t u d y t h e h e a r t , c a n b e s i m i l a r l y a p p l i e d t o o t h e rb i o l o g i c a l o r g a n s a n d t i s s u e s . C o m p a r e d t o o t h e r b i o l o g i c a lo r g a n s , t h e h e a r t i s r e l a t i v e l y d i f f i c u l t t o s t u d y w i t h E P Rs p e c t r o s c o p y b e c a u s e o f i t s m o b i l i t y a n d b e c a u s e o f i t sc h a n g e o f s h a p e a s a f u n c t i o n o f t h e c a r d i a c c y c l e . I n a d d i -t i o n , t h e h o l l o w c h a m b e r s o f t h e h e a r t d e c r e a s e t h e e f f i c i e n -c y o f r e s o n a t o r f i l l i n g . T h e r e f o r e , i n o t h e r b i o l o g i c a l t i s s u e si t s h o u l d b e p o s s i b l e t o a t t a i n s e n s i t i v i t i e s e q u a l o r g r e a t e rt h a n t h o s e we h a v e o b s e r v e d f o r t h e h e a r t .T h u s , E P R s p e c t r o s c o p y c a n b e a p p l i e d t o m e a s u r e f r e er a d i c a l s i n w h o l e b i o l o g i c a l o r g a n s a n d t i s s u e s . T h i s t e c h -n i q u e i s n o n d e s t r u c t i v e , e n a b l i n g s i m u l t a n e o u s m e a s u r e -m e n t s o f f r e e r a d i c a l c o n c e n t r a t i o n s a n d o r g a n f u n c t i o n . I na d d i t i o n , m e a s u r e m e n t s o f t i s s u e o x y g e n c o n c e n t r a t i o n s a n dc o n s u m p t i o n c a n b e s i m u l t a n e o u s l y p e r f o r m e d . T h i s t e c h -n i q u e o f f e r s g r e a t p r o m i s e i n m e a s u r i n g a n d a s s e s s i n g t h ep a t h o l o g i c a l e f f e c t s o f f r e e r a d i c a l s i n w h o l e b i o l o g i c a l o r -g a n s a n d t i s s u e s .

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t hG r a n t s H L - 1 7 6 5 5 - 1 3 a n d H L - 3 8 3 2 4 a n d S q u i b b A m e r i c a n H e a r t A s -s o c i a t i o n C l i n i c i a n S c i e n t i s t A w a r d .1 . W e i s f e l d t , M . L . , Z w e i e r , J . L . & F l a h e r t y , J . T . ( 1 9 8 8 ) i nH e a r t D i s e a s e : C l i n i c a l U p d a t e , e d . B r a u n w a l d , E . ( S a u n d e r s ,P h i l a d e l p h i a ) , i n p r e s s .2 . T a y l o r , A . E . , M a t a l o n , S . & W a r d , P . ( 1 9 8 6 ) P h y s i o l o g y o fO x y g e n R a d i c a l s ( W i l l i a m s & W i l k i n s , B a l t i m o r e ) .3 . A r m s t r o n g , D . , S o h a l , R . S . , C u t l e r , R . G . & S l a t e r , T . F . ,e d s . ( 1 9 8 4 ) A g i n g , F r e e R a d i c a l s i n M o l e c u l a r B i o l o g y , A g i n g ,a n d D i s e a s e ( R a v e n , New Y o r k ) , V o l . 2 7 .4 . H a r d y , W. N . & W h i t e h e a d , L . A . ( 1 9 8 1 ) R e v . S c i . I n s t r u m .5 2 , 2 1 3 - 2 1 6 .5 . F r o n c i s z , W . & H y d e , J . S . ( 1 9 8 2 ) J . M a g n . R e s . 4 7 , 5 1 5 - 5 2 1 .6 . F e h e r , G . ( 1 9 5 7 ) B e l l S y s t . T e c h . J . 3 6 , 4 4 9 - 4 6 0 .7 . P o o l e , C . P . ( 1 9 6 7 ) E l e c t r o n S p i n R e s o n a n c e : A C o m p r e h e n -s i v e T r e a t i s e o n E x p e r i m e n t a l T e c h n i q u e s ( I n t e r s c i e n c e , NewY o r k ) , p p . 5 2 3 - 5 9 5 .8 . F r e e d , J . H . , L e n i a r t , D . S . & H y d e , J . S . ( 1 9 6 7 ) J . C h e m .P h y s . 4 7 , 2 7 6 2 - 2 7 6 3 .9 . Z w e i e r , J . L . & J a c o b u s , W. E . ( 1 9 8 7 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 2 ,8 0 1 5 - 8 0 2 1 .1 0 . Z w e i e r , J . L . ( 1 9 8 8 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 1 3 5 3 - 1 3 5 7 .1 1 . Z w e i e r , J . L . , F l a h e r t y , J . & W e i s f e l d t , M . L . ( 1 9 8 7 ) P r o c .N a t I . A c a d . S c i . USA 8 4 , 1 4 0 4 - 1 4 0 7 .1 2 . S a m u n i , A . , C a r m i c h a e l , A . J . , R u s s o , A . , M i t c h e l l , J . B . &R i e s z , P . ( 1 9 8 6 ) P r o c . N a t I . A c a d . S c i . USA 8 3 , 7 5 9 3 - 7 5 9 7 .1 3 . K o b a y a s h i , K . & N e e l y , J . R . ( 1 9 7 9 ) C i r c . R e s . 4 4 , 1 6 6 - 1 7 5 .

M e d i c a l S c i e n c e s : Z w e i e r a n d K u p p u s a m y

electron paramagnetic resonance measurements of free

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