ELECTROFOREZA ADNELECTROFOREZA ADN

STRUCTURA CHIMICSTRUCTURA CHIMICĂĂ A A ACIZILOR NUCLEICIACIZILOR NUCLEICI

Acizii nucleici (ADN şi ARN) sunt molecule informaţionale care permit stocarea, transmiterea şi exprimarea mesajului genetic. Acizii nucleici sunt formaţi din catene polinucleotidice realizate prin stabilirea de legături covalente între nucleotide. Prin hidroliza acizilor nucleici în mediu acid se formează baze azotate, pentoze şi acid fosforic.

Bazele azotate care intră în compoziţia acizilor nucleici pot fi baze purinice (adenina, guanina) sau baze pirimidinice (uracil, timină, citozină). ADN conţine timină, iar ARN conţine uracil.

Pentozele se găsesc sub formă ciclică, β-furanozică. ADN conţine D2-deoxiriboză, iar ARN conţine D2-riboză.

Structura nucleotidelor

Toate legăturile internucleotidice au aceeaşi orientare de-a lungul unui lanţ polinucleotidic, astfel că fiecare catenă are o anumită polaritate. In ADN cele două lanţuri polinucleotidice sunt antiparalele, adică unul evoluează în direcţia 5'→3', iar celălalt evoluează în direcţia 3'→5'.

În mod convenţional, monomerii din secvenţa ADN sau ARN sunt reprezentaţi prin literele A, T, G, C, U. Structura unei catene este scrisă întotdeauna în direcţia 5'→ 3' (capătul 5' la care gruparea –OH de la C5' este liberă şi capătul 3' la care gruparea –OH de la C3' nu este angajată într-o legătură internucleotidică).

ELECTROFOREZA ADNELECTROFOREZA ADN

Moleculele de ADN la pH fiziologic sunt încărcate negativ datorită grupărilor fosfat. Aceste molecule de ADN bicatenar vor migra către polul pozitiv la aplicarea unui câmp electric. Densitatea de sarcină este uniformă de-a lungul secvenţei astfel că în cazul fragmentelor liniare migrarea va fi invers proporţională cu mărimea acestor fragmente.

Fragmentele de ADN de dimensiuni mici (mai mici de 500 de nucleotide) pot fi separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă. Fragmentele de ADN mai mari se pot separa prin electroforeză în gel de agaroză, evidenţierea făcându-se cu ajutorul bromurii de etidiu.

Bromura de etidiu are proprietatea de a se insera între bazele azotate şi de a forma complexe necovalente de ADN. Bromura de etidiu poate fi vizualizată cu o lampă UV. Limita de detecţie a ADN este de 0,1 – 0,5 ng.

Solubilitatea ADN-ului Solubilitatea ADN-ului în apîn apăă

- Inelele glucidice, legate prin resturi fosfat constituie scheletul extern al dublului helix, în timp ce bazele azotate hidrofobe, sunt orientate spre interior şi perpendicular pe axa helixului;

- Solubilitatea ADN-ului în apă se datorează tocmai orientării grupărilor fosfat spre exteriorul duplexului;

- Toate grupările fosfat la pH = 7 sunt ionizate şi încărcate negativ.

ADADNNELECTROFOREZA ELECTROFOREZA

ÎN GEL DE AGAROZĂÎN GEL DE AGAROZĂ

Electroforeza este o metodElectroforeza este o metodăă simpl simplăă şşi eficienti eficientăă pentru pentru separarea, identificarea separarea, identificarea şşi purificarea fragmentelor de i purificarea fragmentelor de ADN de 0,5-25 Kb. ADN de 0,5-25 Kb.

La aplicarea unui câmp electric moleculele de ADN vor La aplicarea unui câmp electric moleculele de ADN vor migra cmigra căătre anod (polul înctre anod (polul încăărcat pozitiv) datoritrcat pozitiv) datorităă sarcinii negative a grupsarcinii negative a grupăărilor fosfat. rilor fosfat.

MaterialeMateriale

  Tampon pentru electroforezTampon pentru electroforezăă

  SoluSoluţţie de bromurie de bromurăă de etidium de etidium

  AgarozAgarozăă

Loading bufferLoading buffer

  Marker de masMarker de masăă

Tampon pentru electroforezTampon pentru electroforezăă

TAETAE sau sau TBETBE

TAE - Tris/Acetat/EDTATAE - Tris/Acetat/EDTA

TBE -TBE - Tris/Borat/EDTATris/Borat/EDTA

Bromura de etidiuBromura de etidiu

agent mutagen agent mutagen şşi cancerigen i cancerigen

(se insereaz(se insereazăă între bazele azotate din între bazele azotate din structura ADN-ului);structura ADN-ului);

sarcina globalsarcina globalăă a moleculei este pozitiv a moleculei este pozitivăă;;

se adaugse adaugăă în gel pîn în gel pînăă la o colora la o coloraţţie slab ie slab roz;roz;

AgarozaAgaroza

        polimer linear compus din reziduuri polimer linear compus din reziduuri alternative de D alternative de D şşii L-galactozL-galactozăă reunite prin reunite prin leglegăături turi (1-3) şi (1-3) şi (1-4) glicozidice;(1-4) glicozidice;

Loading bufferLoading buffer-ul-ul

        conconţţine sucrozine sucrozăă si glicerol care vor creste si glicerol care vor creste greutatea probei cu ADN si o vor mentine in gel ;greutatea probei cu ADN si o vor mentine in gel ;

        albastru de brom fenolalbastru de brom fenol

la adaugarea solula adaugarea soluţţiei care coniei care conţţine ADN ine ADN se coloreazse coloreazăă în albastru datorit în albastru datorităă schimb schimbăării de rii de pH;pH;

pepermite vizualizarea frontului de rmite vizualizarea frontului de migrare în gel.migrare în gel.

Protocolul de lucruProtocolul de lucru

ProtocolulProtocolul de lucru de lucru cuprinde patru etape:cuprinde patru etape:

1.1.  Prepararea geluluiPrepararea gelului;;

2.2. IncIncăărcarea probelor de ADN în rcarea probelor de ADN în godeurigodeuri;;

3. Mi3. Migrareagrarea gelului la un anumit voltaj gelului la un anumit voltaj şşi o i o anumită perioadă de timp;anumită perioadă de timp;

4.4.  Vizualizarea ADN-uluiVizualizarea ADN-ului..

1.1.            Prepararea geluluiPrepararea gelului

- - se preparse preparăă volumul necesar de tampon pentru volumul necesar de tampon pentru electroforezelectroforezăă – TAE 1x – TAE 1x

(dintr-o solu(dintr-o soluţţie stoc TAE 50x );ie stoc TAE 50x );

- - sese cânt cântăărereşşte cantitatea necesarte cantitatea necesarăă de agaroz de agarozăă – gel de – gel de concentraconcentraţţie ie 22%;%;

  - - se dizolvse dizolvăă agaroza în tamponul de electroforez agaroza în tamponul de electroforezăă până până la fierbere;la fierbere;

- - se toarnse toarnăă gelul în cuva de migrare gelul în cuva de migrare şşi se îndepi se îndepăărteazrteazăă eventualele bule de aer, înainte de înteventualele bule de aer, înainte de întăărirea gelului;rirea gelului;

22..  IncIncăărcarea probelor de ADN în rcarea probelor de ADN în godeurigodeuri

- - SubmersSubmers

3. 3. MigrareaMigrarea geluluigelului

- 80 V80 V- 90 min.90 min.

44.. Vizualizarea ADN-uluiVizualizarea ADN-ului

- - Colorarea geluluiColorarea gelului

- - Expunere directExpunere directăă la UV a gelului, în care a fost la UV a gelului, în care a fost încorporatîncorporatăă bromura de etidium bromura de etidium

FACTORI CARE INFLUENFACTORI CARE INFLUENŢŢEAZEAZĂĂ MIGRAREA ADN MIGRAREA ADN ÎÎN N GELGELULUL DE AGAROZ DE AGAROZĂĂ

1.Mărimea fragmentelor de ADN - fragmentele de ADN linear migrează în gelul de agaroză cu o mobilitate care este invers proporţională cu masa moleculară;

2. Concentraţia gelului de agaroză – gelurile mai concentrate sunt folosite pentru migrarea fragmentelor de ADN mai mici;

3. Tamponul TAE este cel mai folosit;

4. Bromura de etidiu – moleculă încărcată pozitiv, se intercalează între bazele azotate din AND modificând mobilitatea acestuia, prin scăderea sarcinii negative a ADN-ului;

5. Voltajul – odată cu creşterea voltajului aplicat, fragmentele de ADN mai mari vor migra proporţional mai rapid decât cele mai mici. Rezoluţia cea mai bună la migrarea fragmentelor mai mari de 2 kb se obţine prin mentinerea unui voltaj de max. 5 V/ cm (valoarea în cm se referă la distanţa dintre electrozi).

Prepararea gelului de agaroză 2% Nr. Crt.

Recipient Operaţia volum/timp Obs.

1.1.   ErlenmeyerErlenmeyer AgarozAgarozăă 1 g1 g --

2. 2. ErlenmeyerErlenmeyer TAE 1xTAE 1x 50 mL50 mL --

3.3.   ErlenmeyerErlenmeyer Încălzire pe Încălzire pe flacflacăărrăă

-- Fără fierbere până la Fără fierbere până la dizolvarea completă a dizolvarea completă a agarozeiagarozei

4.4.   ErlenmeyerErlenmeyer Bromura de etidiuBromura de etidiu 4 μL4 μL Adăugare la niAdăugare la nişăşă

Turnarea gelului în camera de migrare Nr. Crt. Recipient Operaţia volum/timp Obs.

1.   Cuva de migrare de migrare Se fixează suportulSe fixează suportul

pentru gel înpentru gel în cuvă cuvă

în poziţia închisîn poziţia închis

200 μL200 μL

--

2.   Cuva de migrareCuva de migrare Se fixează piepteneleSe fixează pieptenele -- Cu grijă, fărăCu grijă, fără

formare de spumăformare de spumă

3.   Cuva de migrareCuva de migrare Se toarnă gelului în Se toarnă gelului în

cuva de migrare cuva de migrare

cu pieptencu piepten

03 min.03 min.

--

4.   Cuva de migrareCuva de migrare Răcire la temperatura Răcire la temperatura

camereicamerei

600 μL600 μL La temperaturaLa temperatura

camereicamerei

5.   Cuva de migrareCuva de migrare Se întoarce suportul Se întoarce suportul

pentru gel în pentru gel în

poziţia de lucrupoziţia de lucru

-- --

6.   Cuva de migrareCuva de migrare Se scoate piepteneleSe scoate pieptenele -- --

7.   Cuva de migrareCuva de migrare Se toarnă tamponul în Se toarnă tamponul în

cuvă până la semnul Fill cuvă până la semnul Fill max.max.

01 min.01 min. --

Pregătirea şi aplicarea probelor

Nr. Crt.

Recipient Operaţia volum/timp Obs.

1.1.   Microtuburi EpendorffMicrotuburi Ependorff Se aleg eprubete Se aleg eprubete Ependorff de mEpendorff de măărimea rimea necesarnecesarăă şşi în numărul i în numărul egal cu numărul de dinegal cu numărul de dinţţi i ai pieptenelui (numărul ai pieptenelui (numărul de godeuri formate)de godeuri formate)

-- --

2. 2. Microtuburi EpendorffMicrotuburi Ependorff ADN ADN

(genomic/frunză/marker (genomic/frunză/marker de masă) de masă)

20 μL20 μL --

3.3.   Microtuburi EpendorffMicrotuburi Ependorff Loading bufferLoading buffer 5 μL5 μL --

4.4.   Microtuburi EpendorffMicrotuburi Ependorff Aplicare submersAplicare submersăă în în godeuri a probelor godeuri a probelor

25 μL25 μL --

Migrarea probelor

Nr. Crt. Recipient Operaţia volum/timp Obs.

1.1.   Aparatul de Aparatul de electroforezelectroforezăă

80 V80 V 60 min. 60 min. Se are grijSe are grijăă ca ca probele sprobele săă fie la fie la polul negativ polul negativ [[--]]

Vizualizarea probelor

Nr. Crt.

Recipient Operaţia volum/timp Obs.

1.1.   Aparatul de electroforeză

În lumină albă (de ziuă sau bec incandescent/cu fluorescenţă)

-- - linia frontului

2. 2. Transluminator În lumină UV -- - benzi fluorescente roz