efectos teratogÉnicos del nitrato de plomo en el
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EFECTOS TERATOGÉNICOS DEL NITRATO DE PLOMO EN EL DESARROLLO
EMBRIONARIO DEL PEZ CEBRA Danio rerio (Hamilton, 1822) A CINCO DOSIS
SUBLETALES.
PRESENTADO POR
Carolina Alvarez Garzón
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD CIENCIAS
CARRERA BIOLOGÍA
BOGOTÁ D.C
JUNIO
2011
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EFECTOS TERATOGÉNICOS DEL NITRATO DE PLOMO EN EL DESARROLLO
EMBRIONARIO DEL PEZ CEBRA Danio rerio (Hamilton, 1822) A CINCO DOSIS
SUBLETALES.
PRESENTADO POR
Carolina Alvarez Garzón
INGRID SCHULER
Decana Académica
ANDREA FORERO
Directora Carrera de Biología
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EFECTOS TERATOGÉNICOS DEL NITRATO DE PLOMO EN EL DESARROLLO
EMBRIONARIO DEL PEZ CEBRA Danio rerio (Hamilton, 1822) A CINCO DOSIS
SUBLETALES.
PRESENTADO POR
Carolina Alvarez Garzón
EDILMA GUEVARA ROZO MSc
Directora
NUBIA PERDOMO DE PARRA MSc
Jurado
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica
y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en
ellas el anhelo de buscar la Verdad y la Justicia”
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AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Madre Tierra por dejarme existir y pertenecer a este mundo.
Agradezco a mis padres Elsa y Fredy, por enseñarme todo lo que soy, por creer en mis sueños y
apoyarme incondicionalmente en la realización de estos. A mis hermanos Andrea y David por su
comprensión, compañía y tolerancia durante este proceso.
A mis Abuelas que son la inspiración de mi vida. Gracias por mostrarme que a pesar de todos los
tropiezos, siempre debemos levantarnos y seguir adelante.
A Guillermo por su amor, comprensión, tolerancia y presencia durante estos cinco años de vida.
Mil gracias por estar ahí, junto a mí, junto al cañón sin desfallecer.
A Edilma Guevara por sus aportes a este trabajo, por tener paciencia conmigo y compartir
siempre sus conocimientos.
A Angélica Rodríguez, gracias por su amistad incondicional, por su gran ayuda siempre, por su
paciencia y comprensión, gracias por todos los momentos que me hiciste reír a carcajadas y
también aquellos que me hiciste llorar.
Gracias a todos aquellos que estuvieron en mi camino durante estos cinco años de vida, los llevo
a todos en el corazón y todos me enseñaron grandes cosas.
Finalmente le doy gracias a la vida por permitirme vivir, ser feliz y estar triste, por hacerme
zancadillas pero también enseñarme a levantarme, por darme la oportunidad de aprender cada día
más sobre cualquier cosa, no solo aquello que te llena de conocimiento académico sino y lo más
importante aquello que hace que el alma se sienta mejor.
GRACIAS TOTALES…
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TABLA DE CONTENIDO
Págs
1. Resumen…………………………………………………………………… 7
2. Introducción………………………………………………………………. 8
3. Planteamiento del Problema y Justificación……………………………… 10
4. Marco Teórico
4.1. Características generales del Plomo…………………………………. 11
4.2. Toxicología del plomo……………………………………………….. 11
4.3. Pez Cebra……………………………………………………………… 13
4.4. Pruebas de Toxicidad………………………………………………… 14
4.5. Teratogenia…………………………………………………………… 15
4.6. Malformaciones congénitas…………………………………………. 15
4.7. Antecedentes…………………………………………………………. 16
5. Objetivos
5.1. Objetivo General……………………………………………………… 19
5.2. Objetivos Específicos………………………………………………… 19
6. Metodología
6.1. Procedimiento en Laboratorio……………………………………….. 20
6.2. Diseño experimental…………………………………………………. 20
6.3. Tratamiento estadístico de los datos………………………………… 21
7. Resultados
7.1. Mortalidad…………………………………………………………… 22
7.2. Malformaciones………………………………………………….. … 25
8. Discusión………………………………………………………………… 36
9. Conclusiones…………………………………………………………….. 40
10. Recomendaciones……………………………………………………….. 41
11. Bibliografía Citada…………………………………………………………. 42
7
1. RESUMEN
El nitrato de plomo es un contaminante acuático que genera impacto negativo sobre diferentes
ecosistemas, afectando el desarrollo de organismos como los peces.
Este estudio se realizó con el fin de evaluar el efecto teratogénico de cinco concentraciones
subletales de nitrato de plomo sobre el desarrollo embrionario del Pez Cebra (Danio rerio). Se
llevó a cabo un bioensayo exponiendo 360 ovocitos a cinco concentraciones diferentes de nitrato
de plomo (3 ppm, 1 ppm, 0.8 ppm, 0.5 ppm, 0.1 ppm) a un tiempo de 144 horas de exposición, se
evaluó el porcentaje de mortalidad y la incidencia de malformaciones en cada una de las dosis
subletales utilizadas cada 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 y 144 horas.
La mortalidad no fue superior al 50% en ninguna de las concentraciones utilizadas, sin embargo
se evidenció que la mortalidad depende de las concentraciones. Por otro lado se reportaron ocho
malformaciones; cuatro asociadas con el desarrollo de la columna vertebral como cifosis,
lordosis, escoliosis y espina bífida con un 59 % de incidencia. Otras como edema pericárdico,
hemorragia cefálica, hipertrofia de aletas caudales y vitelo adicional que no fueron muy
frecuentes con un 41 % de incidencia. En el caso de las malformaciones se demostró que a mayor
concentración y mayor tiempo de exposición, la cantidad de malformaciones presentes era más
amplia que al comienzo del experimento.
Con estos resultados se puede inferir que el nitrato de plomo es un agente teratogénico para los
embriones del Pez Cebra (Danio rerio) incidiendo altamente en la cantidad de malformaciones
que estos presentan.
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2. INTROCUCIÓN
Uno de los problemas ambientales más importantes y críticos de la actualidad es la
contaminación acuática debido a las actividades industriales antrópicas. Los metales pesados son
el tipo de contaminante que más impacto genera ya que su toxicidad, persistencia y capacidad de
bio-acumulación afecta la capacidad de supervivencia de los organismos perturbando la dinámica
poblacional de las especies y de esta manera la estructura y función ecosistémica [1].
El plomo es un metal inorgánico que genera múltiples efectos adversos en los organismos
expuestos a este compuesto; puede afectar su capacidad de aprendizaje y reproducción, retardar
su crecimiento y generar numerosas lesiones en su metabolismo. Además tiene la capacidad de
almacenarse en los huesos aumentando su concentración en la cadena alimenticia hasta llegar a
los humanos [2].
A diferencia de otros metales el plomo es un compuesto sin función fisiológica en lo seres vivos,
en cambio genera alta toxicidad en los organismos expuestos a este elemento. Los esfuerzos por
reducir los contenidos y emisiones de plomo no han sido suficientes pues sigue siendo un gran
contamínate hasta el punto de encontrarse en la dieta humana [2,3]
El Pez Cebra (Danio rerio) es una especie pequeña, de agua dulce que se utiliza como un modelo
biológico para realizar bioensayos. La facilidad de su cultivo, su gran desove y el tamaño de sus
huevos fertilizados, hacen de esta especie un modelo excelente para estudiar teratogénesis
inducida por sustancias toxicas. El desarrollo embrionario del Pez Cebra (Danio rerio) es rápido
(72 h desde la fecundación hasta la eclosión a 28 ◦ C), sus huevos son fácilmente visibles debido
a la transparencia de su corion y embrión. Además el proceso de su embriogénesis se encuentra
ampliamente descrito por etapas [4, 5, 6, 7].
La toxicología ambiental permite analizar los efectos de los contaminantes evaluando la
naturaleza de estos y las dosis que afectan, ya sea de manera toxica o nociva a los diferentes
niveles estructurales de los seres vivos [8]. La evaluación de la toxicidad de metales pesados en
diversos organismos, es de gran importancia puesto que es una herramienta que define y describe
9
las alteraciones físicas que experimenta dichos organismos ante un contaminante ya sea
específico o combinado [9].
La toxicidad o teratógenia de los contaminantes genera alteración en la morfogénesis temprana,
lo cual influye en la aparición de malformaciones en estadios tardíos del desarrollo o incluso
después de su eclosión. Algunos de estos problemas van a repercutir durante la etapa de alevín
con saco vitelino causando mortalidades variables en los organismos [9].
Este estudio tiene como objetivo establecer los efectos adversos en el desarrollo del Pez Cebra
(Danio rerio) causados por el nitrato de plomo; determinando las malformaciones morfológicas
macroscópicas, la toxicidad de este compuesto sobre esta especie y por ultimo analizar las
relaciones entre las concentraciones, los tiempos de exposición y las malformaciones.
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3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Problema científico y Justificación
Uno de los metales pesados de uso común dentro de la industria es el plomo, el cual es utilizado
en la elaboración de pigmentos, cables de energía y baterías eléctricas, entre otros [9]; las
deposiciones de desechos industriales o lixiviados de rellenos sanitarios han aumentado las
concentraciones de plomo en el agua en forma de sal inorgánica (Nitrato de PlomoPb (NO3)2)
acumulándose rápidamente [2, 10, 11]. Altas concentraciones de nitrato de plomo en el agua
ocasionan efectos irreversibles en organismos acuáticos [2, 12], estos pueden ser teratogénicos,
afectando sensiblemente la supervivencia de las larvas acuáticas, como los peces [13]. Se realizan
pruebas toxicológicas para conocer los efectos de sustancias toxicas a distintos niveles de
organización trófica, con el propósito de aportar herramientas para el control de calidad de agua
por vertimientos y evaluación de compuestos específicos [8]. Las pruebas in vitro sirven para
determinar un estimado cuantitativo y cualitativo del potencial teratogénico permitiendo
pronosticar sus efectos in vivo [14]. Estos bioensayos son una fuente importante de información
para la evaluación de ecosistemas intervenidos por el hombre lo que permite realizar planes de
manejo de aguas, evitando y previendo la extinción de diferentes especies [15].
Para obtener información sobre las alteraciones que se generan en organismos acuáticos debido a
la contaminación del agua con este metal pesado es pertinente realizar investigaciones en
organismos con alta sensibilidad a cambios ambientales. Uno de estos organismos es el Pez
Cebra (Danio rerio) que es utilizado como modelo biológico en estudios que buscan entender las
dinámicas de diversas sustancias toxicas. Este pez presenta ventajas debido a la amplia
información que se tiene sobre su morfología, bioquímica y fisiología tanto en los estadios
tempranos de desarrollo como en sus formas juveniles y adultas. Lo anterior hace que el uso del
Pez Cebra (Danio rerio) sea ideal para la identificación de efectos adversos sobre la exposición a
cualquier sustancia química [5, 6, 7, 16]. Por este motivo este estudio tiene como objetivo realizar
una evaluación de los efectos teratogénicos del nitrato de plomo sobre el desarrollo embrionario
del Pez Cebra (Danio rerio).
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4. MARCO TEORICO
4.1 Características generales del plomo
El plomo es un metal pesado no esencial y altamente tóxico. Su densidad es de 11,34 g/cm3, es
altamente maleable, dúctil y bajo conductor eléctrico. Es constituyente de más de 200
compuestos en la naturaleza pero es relativamente raro encontrarlo en la corteza terrestre (0,016g
Pb/Kg), sus emisiones naturales consisten en la degradación de rocas, actividades ígneas y
decaimiento radioactivo, sin embargo la emisión antropogénica ha incrementado las
concentraciones de plomo generando concentraciones más altas que las naturales, tanto en
ambientes sólidos como acuosos [2].
Es un metal muy usado en la industria, en la fabricación de pigmentos, recubrimientos,
recipientes, ungüentos, baterías eléctricas e incluso algunos licores. Además presenta
aplicaciones en la metalurgia como munición de armas, metal para cojinetes, cobertura de cables,
compuestos de calafateo, plomo laminado, soldaduras, vidriado de cerámica y ciertos tipos de
cristal [2]. De igual manera, es utilizado en la fabricación de insecticidas, plaguicidas y gasolinas
que contienen aditivos de plomo [17], aunque estos han disminuido ante la prohibición de su uso
[18].
El nitrato de plomo Pb (NO3)2 es una sustancia cubica, cristalina e incolora, con una densidad de
4.53 g/cm3. Este compuesto se produce disolviendo plomo, monóxido o carbonato de plomo en
ácido nítrico [19]. Es uno de los pocos compuestos del plomo que es soluble [11] y su uso
principal, desde la edad media, ha sido la producción de pigmentos. Debido a que es un
compuesto altamente soluble en el agua, puede contaminarla fácilmente, ya que los desechos de
aguas negras de las industrias mencionadas anteriormente llegan directamente a cuerpos de agua.
4.2 Toxicología del plomo
El plomo es una sustancia tóxica no específica a nivel molecular que inhibe la actividad de
múltiples enzimas; entre los efectos más estudiados están los desórdenes sanguíneos por anemias
12
y nerviosos afectando funciones cerebrales relacionadas con el aprendizaje, la supervivencia y el
comportamiento; además de la reproducción [2].
La susceptibilidad por toxicidad por plomo se encuentra principalmente en individuos jóvenes,
donde puede afectar el desarrollo del sistema nervioso central [20], sin embargo existen
diferencias en el proceso toxicológico por múltiples factores como la edad, sexo, condiciones
ambientales y fisiológicas [2]; en términos generales es la dieta el aspecto más relevante para el
incremento hasta niveles tóxicos de este compuesto.
Se han identificado múltiples efectos adversos en varios órganos y sistemas incluyendo el
hematopoyético, renal, cardiovascular, reproductivo e inmunitario, se conoce que el plomo puede
generar encefalopatías en gatos y perros expuestos a elevadas dosis, también afecta los huesos y
se ha demostrado que es cancerígeno en ratas y ratones tratados con nitrato de plomo [21]. Es
agente causal de anomalías congénitas en embriones debido a que es capaz de atravesar la barrera
placentaria y afectar directamente al embrión. Se demostró que este compuesto puede transferirse
de madre a hijo por medio de la leche mediante el trabajo con ratas en periodos de lactancia [22].
Los efectos teratogénicos del plomo se asocian a malformaciones de la columna vertebral y
medula espinal, estas alteraciones fueron descritas en hamsters después de la exposición a este
compuesto. Además se ha demostrado gameto-toxicidad y efectos reproductivos en las crías de
varias especies, estos efectos se evidencian en el cambio de tamaño (enanismo o gigantismo),
peso y supervivencia de las crías [22].
La toxicología del plomo en los peces es muy similar a la descrita para mamíferos, pues afecta las
funciones orgánicas de manera similar en los mismos órganos y tejidos. Generalmente es más
evidente en estados inmaduros como alevinos [23]. En peces, se ha reportado que la exposición al
plomo impide la captación de oxígeno por las branquias debido a la excesiva producción de
moco, que las recubre y aísla. En los organismos expuestos a su incidencia se ha relacionado con
inmunodepresión. La exposición al plomo por largos periodos de tiempo en peces induce efectos
subletales en la morfología e inhibe la acción enzimática de encimas como la delta-ALAD, así
como infertilidad, daños musculares y formaciones tumorales [2].
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4.3 Pez Cebra (Danio rerio)
El Pez Cebra (Danio rerio) habita naturalmente los ríos del norte de India, Paquistán y Nepal.
Actualmente es un pez ornamental encontrándose difundido por todo el mundo con fines
industriales. Esta especie pertenece a la familia Cyprinidae. Los adultos de este pez son
aproximadamente de 3-5 cm de largo, de modo que se pueden manejar fácilmente en grandes
cantidades en el laboratorio [24]. El desarrollo embrionario de este pez es similar al de otros
vertebrados, incluidos las humanos, [7,16, 25, 26, 27]. Este desarrollo embrionario es muy
rápido, en las primeras 24 horas después de la fertilización la mayoría de los órganos están
desarrollados y en menos de 96 horas eclosiona y reabsorben el vitelo. La madurez sexual se
alcanza hacia el tercer mes de vida. Una sola hembra puede poner hasta 200 huevos por semana
[24].
Las características anteriormente mencionadas han popularizado el uso de esta especie como
modelo biológico, siendo empleado en estudios de desarrollo, farmacológicos y toxicológicos.
Estas pruebas pueden ser realizadas en un formato miniaturizado, que reduce las cantidades de
productos químicos para desplegar y el volumen de residuos potencialmente peligrosos [16]. Por
otro lado el pequeño tamaño de los huevos y embriones permite la operación de las pruebas de
detección de alto rendimiento, por lo tanto se genera una base de datos de muchas muestras
repetidas para la evaluación estadística y la validación de los resultados [28].
El desarrollo embrionario del pez cebra ha sido caracterizado por Kimmel y col. (1995), ellos
definen siete periodos de embriogénesis (cigoto, clivajes, blástula, gástrula, segmentación, y
periodo de eclosión). Estos periodos se encuentran determinados por etapas que muestran el
desarrollo del cigoto hasta los tres primeros días de vida. Este autor describe el desarrollo como
asincrónico ya que después de fertilizar una postura de huevos simultáneamente e incubarlos a
una temperatura óptima sin aglomeración, (25º C, 5-10 embriones/ml) estos se encontraban en
diferentes estadios al mismo tiempo [4].
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4.4 Pruebas de Toxicidad
Los ensayos biológicos o pruebas de toxicidad son herramientas para estimar el efecto de agentes
físicos y químicos sobre organismos bajo condiciones experimentales específicas y controladas.
Estos efectos pueden ser tanto de inhibición como de magnificación, evaluados por la reacción de
los organismos tales como muerte, crecimiento, proliferación, multiplicación, cambios
morfológicos, fisiológicos o histológicos [29].
La toxicidad se define entonces como la capacidad de una sustancia para ejercer un efecto nocivo
sobre los organismos o la biocenosis dependiendo de las propiedades químicas del compuesto su
concentración, tiempo de exposición, frecuencia de exposición y su relación con el ciclo de vida
del organismo [29].
En este caso se debe definir concretamente algunos conceptos aplicables al trabajo que se va a
desarrollar:
CE50/CI50: concentración efectiva o de inhibición media. Concentración del material
en agua, suelo o sedimento que se estima afecta al 50% de los organismos de ensayo.
La CE50 y sus límites de confianza (95%) son usualmente derivados de análisis
estadístico [29].
CL50: concentración letal media, concentración del material en agua, suelo o
sedimento que se estima letal para el 50% de los organismos de ensayo. La CL50 y sus
límites de confianza (95%) son usualmente derivados de análisis estadístico [29].
IT: Índice de teratogenicidad es el equivalente a los resultados de las CL50 dividido
CE50 [29].
15
4.5 Teratogenia
Teratogenia viene del griego “terato” que significa monstro, hace referencia a los efectos
negativos producidos durante el desarrollo embrionario y su etiología. Se puede evidenciar como
malformaciones, las cuales son producidas cuando se expone el organismo a diferentes
concentraciones de agentes tóxicos ya sean físicos (rayos X) o químicos (metales pesados)
durante su embriogénesis [30].
4.6 Malformaciones congénitas
Las malformaciones congénitas hacen referencia a aquellas características que se adquieren
durante el desarrollo embrionario y por ende se presentan en el momento de la eclosión [31].
En este estudio se reportan malformaciones implicadas en el desarrollo de la espina dorsal, estas
suelen presentarse como desviaciones en la columna vertebral debido a daños parciales en el
esclerotoma generando una curva en la columna vertebral. Estas malformaciones pueden ser en
diferentes sentidos y se puede evaluar según el grado de curvatura.
La escoliosis es la curvatura lateral de la espina dorsal usualmente en forma de una S o una C,
estas pueden llegar a ser muy severas afectando la movilidad (Figura 8) [32]. La cifosis es la
curvatura excesiva de la columna torácica hacia la parte ventral del cuerpo. En diversos grados
puede afectar la movilidad de los embriones (Figura 9) [32]. La lordosis es la curvatura excesiva
de la columna en la región lumbar hacia la parte dorsal del cuerpo. En diversos grados puede
afectar la movilidad de los embriones (Figura 9) [32].
Otras anormalidades incluyen la fusión dorsal incompleta de las vértebras alrededor de la medula
espinal generando espina bífida (Figura 10) [33]. El vitelo adicional, se genera cuando los
blastómeros en el estadio de blástula se proliferan aceleradamente y en desorden formando lo que
se conoce como un ex ovado [27].
16
Por otro lado se encontró edema pericárdico, este se presenta como una acumulación de líquido
en el espacio intersticial del pericardio aumentado su tamaño y alterando la contracción cardiaca
lo cual puede causar la muerte del embrión (Figura 11) [34].
Se evidenció hemorragia cefálica, esta tiene lugar cuando existe una ruptura de un vaso
sanguíneo encefálico debido a un pico de hipertensión o a un aneurisma congénito, al derramarse
la sangre sobre los tejidos cerebrales se genera apoptosis, en algunos casos se puede generar
derramamiento en la cúpula óptica del embrión (Figura 8 y 12) [34].
La hipertrofia en la aleta caudal, se presenta cuando existe algún tipo de desorden o anomalía en
los tejidos de esta estructura. Se evidencia como un desorden de tejidos aumentando la
proporción del tamaño de la aleta caudal (Figura 13) [5].
4.7 Antecedentes
Existen varios trabajos sobre toxicidad en embriones de Pez Cebra (Danio rerio) que sustentan la
teratogenicidad tanto de metales pesados como de herbicidas, plaguicidas o diversos
medicamentos. Para la evaluación de dichos experimentos diferentes autores utilizan la prueba
estandarizada FET con embriones de este pez.
Samson & Shenker (2000) exponen embriones de pez cebra en diferentes estadios a dos
concentraciones de cloruro de metilmercurio hasta las 32 horas después de la fertilización;
concluyen que los efectos teratógenos de este compuesto son dos: primero, daños tisulares a nivel
medio del pliegue de la aleta caudal y segundo, flexión en la parte posterior de la región de la
cola; por otro lado describen el periodo de las 18 a las 20 horas después de la fertilización como
el más crítico de exposición a este compuesto, el cual corresponde al tiempo de formación de las
dos estructuras más afectadas [5].
Otro estudio desarrollado en pez cebra expuesto a un metal pesado concluye que los efectos
teratógenos en el desarrollo dependen del tiempo y concentración de exposición; en este caso se
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utilizó cadmio y los efectos predominantes observados fueron la mortalidad, edema y alteraciones
de la columna como cifosis vertebral, escoliosis, y lordosis [35].
Según Chan & Cheng (2003) el cadmio produce apoptosis durante el desarrollo embrionario, lo
que genera después de un tiempo diversas malformaciones congénitas; estos autores exponen
embriones de pez cebra a una concentración de cadmio (100µM) durante el periodo de tiempo
desde las 5 horas hasta las 28 horas después de fertilización [36].
Existen también estudios sobre el efecto adverso de otras sustancias como el etanol el cual causa
degeneración en el sistema nervioso central lo que conlleva a defectos en el sistema
cardiovascular, en las estructuras faciales y en las aletas, como conclusión se determina que el
efecto depende de las concentraciones y el tiempo de exposición del compuesto [37].
Según Cook y col. (2005) el pesticida Malatión reduce las tasas de sobrevivencia y retarda el
desarrollo embrionario del pez; concuerda con la hipótesis de la correlación dependiente entre las
malformaciones, las dosis y el tiempo de exposición a la sustancia [38].
Para Tsay y col. (2007) el bioensayo con benzoato de sodio arrojó resultados deletéreos para los
embriones de Pez Cebra (Danio rerio) que fueron expuestos a concentraciones desde 0 ppm hasta
2000 ppm, encontrando malformaciones en pronefros, defectos en la glándula de incubación y
edema en el saco pericárdico [39].
Estudios en otras especies de desarrollo acuático demuestran la toxicidad de plomo y sus efectos
teratogénicos. Burden y col. (1995) evidencian que existe un mayor grado de afectación en
estadios tempranos del desarrollo del pez Oncorhynchus mykiss al exponerlo a 4 concentraciones
diferentes de plomo disuelto en agua [40].
Alves y col. (2006) estudian el efecto que se presenta en la morfología y en la inhibición
enzimática del plomo inorgánico (Pb III) en el pez Hoplias malabaricus, demostrando daños en
el cito-esqueleto y el núcleo de los eritrocitos [41]. Ramsdorf y col. (2008) evaluaron la
actividad genotóxica del plomo inorgánico en el mismo pez Hoplias malabaricus en la sangre y
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el riñón, determinando que los efectos genotóxicos del plomo se ven a concentraciones de 21 y
63 µg Pb+2
/ g sin diferencias entre los efectos en los dos tejidos [42].
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5. OBJETIVOS
5.1 General
Determinar los efectos teratogénicos durante el desarrollo embrionario del Pez Cebra (Danio
rerio) causados por la exposición a 3 ppm, 1 ppm, 0.8 ppm, 0.5 ppm y 0,1 ppm de nitrato de
plomo en un tiempo de 144 horas.
5.2 Específicos
Especificar el porcentaje de mortalidad en cada una de las concentraciones utilizadas.
Describir las malformaciones morfológicas macroscópicas presentes en los embriones del
Pez Cebra (Danio rerio) expuestas a cinco concentraciones subletales de nitrato de plomo.
Relacionar las malformaciones encontradas de acuerdo a las concentraciones y el tiempo
de exposición.
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6. METODOLOGÍA
6.1 Procedimiento en laboratorio
5.2 Diseño Experimental
El n-muestreal fue establecido por literatura, teniendo en cuenta el estudio realizado por
Selderslaghs y col. (2009), en el cual la muestra era de 20 huevos por tratamiento, en este estudio
se trabajó con el mismo número de embriones por replica. Se realizaron seis tratamientos con las
siguientes concentraciones: 0,1 ppm, 0,5 ppm, 0,8 ppm, 1 ppm y 3 ppm y el control.
Producto a Obtener Actividades Implicadas Proposito Metodológico a
Desarrollar
Evaluación de Fertilidad de los Huevos de Danio rerio
Huevos fertilizados puestos en las diferetnes conentraciones.
Cada concentracion tuvo 3 replicas y en cada replica
huvo 20 huevos
Se evaluó hasta las 144 horas de expocicion
(0, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 y 144)
Embriones Muertos fueron removidos, se reporto en
tablas de mortalidad, concentracion, tiempo de
exposición
Tomar una submuestra y fijar en formol buferizado
Realizó dercripción macroscopica del embrion
teniendo en cuenta caracteristicas normales
Se realizaron fotografias de los embriones malformados
360 Huevos fertilizados.
5 Concentraciones de Nitrato de plomo. (0.1 ppm, 0.5 ppm, 0.8 ppm, 1 ppm y
3 ppm)
Control
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Los embriones de cada concentración fueron evaluados hasta las 144 horas de exposición, en
intervalos de 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 horas; aquellos embriones muertos fueron
removidos y reportados en una tabla de mortalidad por concentración y los vivos se evaluaron
macroscópicamente para evidenciar las malformaciones [7].
6.3 Tratamiento estadístico de los datos
Para los datos de mortalidad y malformaciones obtenidos de los bioensayos se aplicará un diseño
completamente aleatorizado con igual número de réplicas, empleando una prueba de Ji Cuadrado
(χ2), con el fin de comparar la mortalidad entre el grupo control y los grupos experimentales [43].
Adicionalmente se realizarán graficas comprando los diferentes tratamientos, las malformaciones
y las horas de exposición de cada tratamiento.
22
7. RESULTADOS
7.1 Mortalidad
Al establecer el porcentaje de mortalidad de los embriones de Pez Cebra (Danio rerio) en cada
uno de los tratamientos, fue necesario introducir la variable de muerte por agente fúngico, el cual
se presentó desde el inicio del experimento y su comportamiento vario según los tratamientos
(Tabla 1; Figura 1).
Tabla 1. Porcentaje de mortalidad acumulada de embriones de Pez Cebra (Danio rerio) en 5
tratamientos de dosis subletales de nitrato de plomo. (Muertos) Muertos por plomo. (Muertos H)
Muertos por hongo. (% Mortalidad), Porcentaje de mortalidad por plomo. (% Mortalidad H),
Porcentaje de mortalidad por hongo.
TRATAMEIEMTO VIVOS MUERTOS MUERTOS H % MORTALIDAD % MORTALIDAD H
0,1 ppm 41 5 14 8 23
0,5 ppm 43 11 6 18 10
0,8 ppm 45 11 4 18 7
1 ppm 42 14 4 23 7
3 ppm 49 5 6 8 10
PORCENTAJE DE MORTALIDAD DE EMBRIONES DE PEZ CEBRA (Danio rerio) EXPUESTOS A 5
DOSIS SUBLETALES DE NITRATO DE PLOMO
23
Los embriones expuestos a la concentración de 0,1 ppm de Pb (NO3)2 mostraron síntomas de
toxicidad, y de baja mortalidad 8 % por este compuesto (Tabla 1), sin embargo se presentó un 23
% de mortalidad por el agente fúngico (Tabla 1). Las primeras horas de exposición fueron
determinantes en la mortalidad por el agente fúngico, pero no fueron representativas para la
exposición al nitrato de plomo (Figura 1).
En tanto que la concentración de 0,5 ppm presentó 18 % de mortalidad por nitrato de plomo
(Tabla 1), evidenciándose desde las primeras horas de exposición y estabilizándose a las 72
horas. El 10% de la población presentó mortalidad por agente fúngico (Tabla 1), lo cual indica
que para esta concentración la mortalidad por nitrato de plomo fue más representativa que en el
anterior tratamiento (Figura 1).
Los embriones que se encontraban en la concentración de 0.8 ppm presentaron un 18% de
mortalidad por nitrato de plomo (Tabla 1), estos alcanzaron el periodo de eclosión hasta las 72
horas. El porcentaje de mortalidad por el agente fúngico fue menos representativo que en la
concentración anterior con un 7% (Tabla 1) del total de la población (Figura 1).
Los embriones de Pez Cebra (Danio rerio) expuestos a 1 ppm presentaron un porcentaje de
mortalidad por nitrato de plomo del 23% (Tabla 1); por otro lado el porcentaje de mortalidad por
el agente fúngico fue de 7% (Tabla 1) lo anterior mostró mismo porcentaje del tratamiento
anterior, indicando que a medida que la concentración de nitrato de plomo aumenta, disminuye la
mortalidad por este agente (Figura 1).
Por último los embriones expuestos a 3 ppm presentaron un porcentaje de mortalidad por nitrato
de plomo del 8% (Tabla 1), porcentaje similar al presentado por el agente fúngico 10% (Tabla 1),
esto indica que para esta concentración la mortalidad no fue un factor representativo en ninguno
de los dos casos (Figura 1).
Como conclusión podemos ver en la Figura 1, que el porcentaje de mortalidad por nitrato de
plomo y por agente fúngico es inverso, es decir que, a menor concentración de plomo, existe
24
mayor porcentaje de mortalidad por agente fúngico, mientras que a mayores concentraciones de
nitrato de plomo existe menor porcentaje de mortalidad por agente fúngico (Figura 1).
El análisis de mortalidad se estableció utilizando una prueba de Ji Cuadrado (ᵡ2) comparando los
individuos vivos y muertos en cada uno de los tratamientos. Se obtuvo un ᵡ2= 23,69 (Ji cuadrado
calculado), que comparado con el ᵡ2
de tablas con 5 grados de libertad y un α de 0.05 (ᵡ2
=11,07)
determina que el Ji cuadrado calculado es mayor al de las tablas lo cual indica que se acepta la
hipótesis alterna, es decir, que la mortalidad es dependiente de la concentración de nitrato de
plomo (Tabla 2.)
Tabla 2. Prueba de Ji Cuadrado para la mortalidad y las concentraciones (ppm) de nitrato de
plomo.
25
7.2 Malformaciones
La mayoría de las malformaciones presentes en los 5 tratamientos de nitrato de plomo fueron
evidentes a partir de la eclosión de los embriones de Pez Cebra (Danio rerio) entre las 48 y 72
horas de exposición al plomo, no obstante una vez se fijaron los embriones y se removió el corión
se identificaron otras malformaciones.
Debido a que las 5 concentraciones utilizadas en este estudio son dosis subletales en todas ellas
se presentó algún tipo de malformación (Tabla 3).
Tabla 3. Malformaciones en embriones de Pez Cebra (Danio rerio) según las cinco dosis
subletales de nitrato de plomo.
MALFORMACIONES PRESENTES EN EMBRIONES DE PEZ CEBRA (Danio rerio)
EXPUESTOS A CINCO DOSIS SULETALES DE PLOMO
Grupos de 60 peses
MALFORMACIÓN 0,1
ppm
0,5
ppm
0,8
ppm
1
ppm
3
ppm
TOTAL
MALFORMACIONES
Deshidratación del Corión 0 3 0 0 0 3
Vitelo Adicional 1 0 0 0 0 1
Columna Bífida 1 0 0 0 0 1
Cifosis 6 22 26 32 39 125
Escoliosis 4 5 3 6 10 28
Lordosis 2 3 2 1 7 15
Hipertrofia Aletas 5 2 1 0 2 10
Hemorragia Cefálica 0 2 18 5 28 53
Edema Pericárdico 2 5 15 5 22 49
Total 21 42 65 49 108 285
% 35% 70% 100% 82% 100% 79%
Los embriones de Pez Cebra (Danio rerio) expuestos a menor concentración (0,1 ppm Pb
(NO3)2) tuvieron un 35 % de malformaciones (Tabla 3). Las primeras malformaciones se
observaron en estadios tempranos del desarrollo, en estos se evidenció vitelo adicional (Figura
10) y columna bífida (Figura 10). El resto de horas de exposición exhibieron malformaciones
implicadas con el desarrollo de la espina dorsal. La cifosis (Figura 9) y escoliosis (Figura 8) se
26
presentaron desde la hora 12 de exposición del tratamiento coincidiendo con los primeros
estadios del desarrollo. Adicionalmente a partir del estadio post eclosión se aprecian hipertrofias
(Figura 13) en el desarrollo de la aleta caudal (Figura 2).
En la concentración de 0,5 ppm de Pb (NO3)2 se observa un total de 70% de malformaciones. De
este 70 % el 100% presentó alteraciones implicadas con el desarrollo de la espina. La cifosis
(Figura 9) es la malformación más abundante en este tratamiento con 22 individuos, esta se
presenta en menor proporción en los primeros estadios y aumenta su incidencia a medida que
avanza el tratamiento, siendo más numerosa a partir de la eclosión de los embriones. El edema
pericárdico (Figura 11) se presentó desde las 24 horas de exposición de este tratamiento y
perduró durante las 144 horas del experimento (Figura 3). La deshidratación del corion se
evidenció en dos oportunidades durante el estudio, sin embargo no es un problema permanente
durante el resto del experimento.
Dentro de las malformaciones encontradas para la concentración de 0,8 ppm se aprecia un total
de 100%; el 50% de embriones con edema pericárdico (Figura 11) y hemorragia cefálica (Figura
27
12). En esta concentración se hace evidente los problemas de formación de columna vertebral,
pues se presenta cifosis (Figura 9) en el 40 % de los embriones malformados; esta se ve desde las
72 horas de exposición o después del periodo de eclosión. La escoliosis tiene un 5 % de
incidencia (Figura 8) y por último la lordosis tiene un 3 % (Figura 9), observándose solo después
de la eclosión de los embriones (Figura 4).
Los embriones expuestos a la concentración de nitrato de plomo de 1 ppm mostraron un total del
82% de malformaciones con una mayor prevalencia de problemas en el desarrollo de la espina
dorsal. Una marcada presencia de cifosis (65%) (Figura 9) desde las 96 horas de exposición, sin
embargo desde las 12 horas se notaron 6 escoliosis (Figura 9), lo cual indica que estos problemas
se presentan desde el periodo de segmentación en los estadios de formación de somitas (Figura
5).
28
29
Para la concentración de 3 ppm se denota una completa acumulación de las malformaciones
desde las 72 horas de exposición hasta las 144 horas del experimento con un total de 100% de
embriones malformados (Tabla 3). Se presentan en mayor proporción las malformaciones
anteriormente mencionadas, con una incidencia en hemorragia cefálica (Figura 12), cifosis
(Figura 9) y edema pericárdico (Figura 11). Existe una menor incidencia de lordosis (Figura 9),
escoliosis (Figura 8) y presencia casi nula de hipertrofia de aletas (Figura 13). Al presentarse
estas alteraciones desde la hora 72 en la cual los embriones se encontraban en el periodo de
eclosión y formación de vejiga natatoria, se puede concluir que el efecto del plomo internamente
se da en los primeros estadios y su evidencia morfológica se presenta después de la eclosión
(Figura 6).
El análisis de incidencia de malformaciones se estableció utilizando una prueba de Ji Cuadrado
(ᵡ2) comparando los individuos malformados y no malformados en cada uno de los tratamientos.
Se obtuvo un ᵡ2= 115,17 (Ji cuadrado calculado), que comparado con el ᵡ
2 de tablas con 5 grados
de libertad y un α de 0.05 (ᵡ2
=11,070) determina que el Ji cuadrado calculado es mayor al de las
30
tablas lo cual indica que se acepta la hipótesis alterna, es decir, que la presencia de
malformaciones es dependiente de la concentración de nitrato de plomo (Tabla 4.)
Tabla 4.Prueba de Ji Cuadrado para la malformaciones y las concentraciones (ppm) de nitrato de
plomo.
Se observó que la malformación con mayor presencia en este estudio fue la cifosis, siendo esta la
más abundante entre las concentraciones con un porcentaje de incidencia del 44%, esta sumada
con el resto de las malformaciones asociadas al desarrollo de la columna vertebral suman un total
del 59,4% de malformaciones presentes en este estudio (Tabla 3).
31
Aquellas malformaciones asociadas a edema pericárdico y hemorragia cefálica suman un total de
36 % del total de las malformaciones presentadas. Las malformaciones que se presentaron en
menor proporción fueron la deshidratación de corion, la columna bífida, el vitelo adicional e
hipertrofia de aletas con un total del 5 % (Tabla 3).Por ultimo del total de 360 embriones de Pez
Cebra (Danio rerio) expuestos a las cinco concentraciones subletales, el 79 % de estos presento
algún tipo de malformación (Tabla 3).
En la Figura 7 se relacionan las malformaciones, las concentraciones y los tiempos de exposición
lo cual indica que existe una relación de dependencia entre las tres variables estudiadas. A mayor
concentración y un tiempo de exposición más duradero, habrá mayor cantidad de
32
malformaciones. Del mismo modo se nota como a medida que las concentraciones son menores
la cantidad de malformaciones también disminuye.
Figura 8. Embriones de Pez Cebra (Danio rerio) con escoliosis. (A). Embrión con escoliosis
severa en forma de c y hemorragia en la cúpula óptica. (B). Embrión con desarrollo normal de la
columna vertebral. (C). Embrión con escoliosis en forma de s. (D). Embrión con desarrollo
normal.
B
C D
A
33
Figura 9. Embrión de Pez Cebra (Danio rerio) con Cifosis. (A). Embrión con cifosis severa e
hipertrofia de aleta cauda. (B). Embrión con desarrollo normal. (C). Embrión con lordosis leve.
A B
C
A B
34
Figura 10. Malformaciones en embriones de Pez Cebra (Danio rerio). (A). Embrión con
columna bífida y vitelo adicional (ex ovado). (B). Embrión con desarrollo normal.
Figura 11. Embriones de Pez Cebra (Danio rerio). (A). Embrión con edema pericárdico. (B).
Embrión de pez cebra normal.
Figura 12. Embriones de Pez Cebra (Danio rerio). (A). Embrión con hemorragia encefálica. (B)
Embrión con desarrollo normal.
B A
A B
35
Figura 13. Aleta caudal de Pez Cebra (Danio rerio). (A). Aleta caudal con hipertrofia, desorden
tisular. (B) Aleta caudal con desarrollo normal.
A B
36
8. DISCUSIÓN
El impacto de los metales pesados sobre el desarrollo embrionario del pez cebra ha sido estudiado
ampliamente; se ha demostrado que el efecto teratogénico se relaciona de manera directa con la
dosificación y el tiempo de exposición a estos compuestos. El nitrato de plomo afecta la
sobrevivencia, la eclosión y la morfología en los primeros estadios de vida del Pez Cebra (Danio
rerio); aunque en este estudio se utilizaron cinco dosis subletales se llego a la conclusión que la
mortalidad es una variable determinante en este tipo de experimentos. Se presentó una relación
directa a la dosis empleada, es decir que entre mayor fuera la dosis mayor sería la mortalidad, si
embargo esta relación no es proporcional [44].
La mortalidad observada en los cinco diferentes tratamientos no supero el 50 % de la población
estudiada, no obstante el mayor porcentaje de mortalidad (23%) se presento en la dosis de 1 ppm
de Pb (NO3)2 y tan solo un 8 % de la población no sobrevivió a la dosis de 3 ppm. Según autores
existen toxinas que no actúan a altas concentraciones pues se inhibe completamente su acción en
el organismo, en el caso del plomo es posible que afecte de otras maneras los primeros estadios
de su desarrollo. Ansavy & Kumar (1984) sugieren que los embriones son más resistentes a las
toxinas mientras su saco vitelino se reabsorbe completamente, una vez esto ha sucedido entonces
la exposición a esta toxina incrementará, pues el organismo se ve obligado a buscar alimento en
el medio en el que crece [38].
Según Osorio (2010) las dosis letales medias de nitrato de plomo para trucha arcoíris
(Oncorhynchus mykiss) son 3 ppm, 1 ppm y 0,5 ppm. Para el presente estudio no existió dosis
letal media, ya que existe la posibilidad de que la absorción del nitrato de plomo sea
completamente diferente para las dos especies debido a una diferencia en el metabolismo de
estos.
El plomo se encuentra completamente disponible para el pez cuando este ha reabsorbido su vitelo
y busca alimento, es decir, que solo una pequeña dosis del medio puede absorberse vía
respiratoria [45]. Este es transportado por la sangre y distribuido a tejidos blandos como hígado,
riñón, medula ósea y sistema nervioso central impidiendo su continuo desarrollo, cuando el
37
plomo se ha distribuido por el organismo se acumula en los huesos donde no es toxico [46]. Lo
anterior deja en evidencia porqué la mortalidad se da en las primeras horas de exposición de este
compuesto y posteriormente se evidencian malformaciones [5, 38].
Así mismo, el agente fúngico fue una variable determinante en el porcentaje de mortalidad de los
embriones de Pez Cebra (Danio rerio). El comportamiento de la mortalidad (Figura 1) sugiere
que a menores dosis de nitrato de plomo existe una mayor mortalidad causada por hongo y que a
mayores dosis de nitrato de plomo existe una baja mortalidad causada por este agente. Estos
resultados sugieren que el plomo resulta ser un controlador directo del hongo, situación que
evidencia su uso intensivo como plaguicida o pesticida.
Las malformaciones que se observaron en los embriones del Pez Cebra (Danio rerio), fueron
desarrolladas durante la embriogénesis y repercuten en los estadios más avanzados, causando
retardo del crecimiento parcial, completo o alteraciones funcionales [9]. Similares tipos de
malformaciones se han encontrado en diversos estudios con teratógenos diferentes, esto quiere
decir que la mayoría de las respuestas son reacciones inespecíficas de las etapas tempranas del
desarrollo frente a los tóxicos [13].
Los reportes más comunes de malformaciones debido a sustancias toxicas ocurren durante la
formación del sistema esquelético, como las deformidades en las vertebras, esto puede asociarse
en parte a su carácter visible con respecto a otras anomalías que no son tan notorias y que pueden
incidir en la mortalidad de los embriones de los peces [33]. En este estudio se encontró mayor
número de malformaciones del desarrollo del sistema óseo (cifosis, escoliosis, lordosis Figuras 8
y 9), esto se debe a que el plomo afecta de manera directa a la formación del hueso ya que en este
estudio se presentaron reabsorciones óseas [40]. El plomo interfiere en el metabolismo del calcio,
reemplazándolo y comportándose como un segundo mensajero intracelular alterando su
distribución en los compartimentos de la célula lo que conlleva a que el calcio disponible para el
desarrollo del sistema óseo sea limitado [9].
38
Cuando se evalúan dosis subletales se esperan encontrar malformaciones que no comprometan la
supervivencia de las larvas como las implicadas con la movilidad de las mismas, esta situación se
hizo evidente en este estudio.
Por otro lado las malformaciones como el edema pericárdico (Figura 11) o la hemorragia cefálica
(Figura 12) comprometen de manera directa la sobrevivencia de las larvas. El plomo interfiere en
la neurotransmisión y tono vascular lo que explicaría que contracciones involuntarias hicieran
que las larvas eclosionaran antes de tiempo. Este problema genera también hipertensión y
neurotoxicidad efecto que se puede relacionar con las hemorragias cefálicas encontradas en el
desarrollo de las larvas, estas pueden estar ocasionadas por la acumulación de plomo en el
espacio endoneural lo cual produce edemas, aumenta la presión y termina generando hemorragia
y daño axonal causando posteriormente la muerte [46].
Según Samson & Shenker (2000), los periodos más críticos para anormalidades de la aleta caudal
comienzan a partir de las 18 horas después de fertilización, pues es el momento en el cual la parte
medial de esta estructura comienza su desarrollo; para este estudio los primeros indicios de
hipertrofias en la aleta caudal comienzan alrededor de las 24 horas de exposición al compuesto lo
cual concuerda con lo planteado por estos autores, no obstante después de la eclosión esta
anormalidad es aún más evidente [5].
Otra de las malformaciones presentes en este estudio fue el edema pericárdico, reportado por
diferentes autores. Se planea que estos edemas pueden ser causados por la súper hidratación del
órgano implicado, debido a problemas de la regulación osmótica derivados de la acumulación de
toxina [13, 38, 47]. Según Reimers y col. (2004), reportan este tipo de edemas asociadas a
crecimiento de larvas de pez cebra en etanol.
Según Bartzke & Delov (2010) concluyen que existe una relación directa entre la presencia de
metales pesados en el ambiente y los efectos teratogenicos sobre el desarrollo del Pez Cebra
(Danio rerio) argumentado que el efecto también se determina de acuerdo a la concentración de
estos elementos y el tiempo de exposición [45].
39
Los estadios de desarrollo tempranos son más sensibles a anormalidades, se indica que entre
mayor sea el periodo de exposición se inducen a amoralidades severas. Comenzando por los
periodos de segmentación del desarrollo embrionario del pez cebra, se concluye que los estadios
tardíos en el desarrollo demuestran mayor número de anormalidades mientras que estadios
tempranos muestran mayor porcentaje de mortalidad [5].
Los resultados de este estudio demuestran gran sensibilidad en la evaluación de diferentes
teratógenos, es por esto que el Pez Cebra (Danio rerio) puede ser un excelente modelo para
predecir el potencial teratogénico de químicos contaminantes pues presenta ventajas como costos
efectivos, rápido desarrollo y la simplicidad de su desarrollo con respecto al de los humanos [45].
40
9. CONCLUSIONES
Las dosis subletales de nitrato de plomo 3 ppm, 1 ppm, 0.8 ppm, 0.5 ppm, 0.1 ppm aplicadas en
el desarrollo embrionario del Pez Cebra (Danio rerio), causaron anomalías congénitas
morfológicas evidentes.
La mortalidad tiene una relación directa con las dosis empleadas, sin embargo no existe para este
estudio una proporcionalidad en esta relación.
El desarrollo de malformaciones tiene una relación directamente proporcional a las dosis de
nitrato de plomo empleadas. El mayor número de malformaciones se presentó en la dosis de 3
ppm, se evidenció un 100% de la población con anomalías en su morfología.
Las malformaciones más frecuentes fueron: cifosis con 125 individuos, hemorragia cefálica con
53 individuos y por ultimo edema pericárdico con 49 individuos. Las malformaciones menos
frecuentes fueron: escoliosis con 25 individuos, lordosis con 15 individuos, hipertrofia de aletas
con 10 individuos y por último vitelo adicional y columna bífida.
Existe una relación directamente proporcional entre las tres variables estudiadas, es decir que a
mayor concentración y duración, habrá posiblemente mayor cantidad de anomalías morfológicas
y que a menor concentración y menor duración posiblemente habrá un menor número de
anomalías.
Hay un efecto mayor del nitrato de plomo sobre el desarrollo de la columna vertebral del Pez
Cebra (Danio rerio) que aumenta considerablemente a medida que el tiempo de exposición al
compuesto también aumenta.
41
10. RECOMENDACIONES
Realizar experimentos para determinar las dosis letales medias para esta especie con el fin de
encontrar el límite entre la mortalidad y la anomalía.
Realizar un análisis histológico de los primeros estadios del desarrollo del Pez Cebra (Danio
rerio), ya que es probable que el nitrato de plomo afecte órganos vitales internos, ocasionando su
muerte.
Evaluar la influencia de otros metales pesados como cobre, zinc, cadmio, sobre el desarrollo
embrionario del Pez Cebra Danio rerio.
Realizar este estudio en condiciones naturales evaluando el efecto de contaminantes sobre el
desarrollo embrionario del Pez Cebra Danio rerio, con el fin de desarrollar planes de manejo de
aguas contaminadas.
42
11. BIBLIOGRAFÍA CITADA
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