ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON

Année 2007 - Thèse n° 47

APPLICATIONS DU TEST DE COOMBS EN MEDECINE VETERINAIRE CANINE

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 4 septembre 2007 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

Gerber Emmanuelle Née le 23 février 1982

à Colmar

"Toujours imbus des principes d'honnêteté qu'ils auront puisés et dont ils auront vu des exemples dans les Ecoles, ils ne s'en écarteront jamais.

Ils distingueront le pauvre du riche. Ils ne mettront point à un trop haut prix des talents qu'ils ne devront qu'à la bienfaisance

et à la générosité de leur patrie. Enfin, ils prouveront par leur conduite qu'ils sont tous également convaincus que la fortune

consiste moins dans le bien que l'on a que dans celui que l'on peut faire."

Serment de Bourgelat (1777)

A Monsieur le Professeur Jérôme Etienne,

Doyen de la faculté de Médecine de Lyon, Qui m’a fait l’honneur d’accepter la présidence de mon jury de thèse.

Avec toute ma gratitude et mes hommages respectueux.

A Monsieur le Professeur Luc Chabanne,

De l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui m’a fait l’honneur d’encadrer ce travail et de me guider tout au long de sa réalisation.

Merci pour vos conseils.

A monsieur le Professeur Jean Luc Cadoré,

De l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui m’a fait l’honneur d’accepter de juger ce travail sans hésitation.

Sincères remerciements.

A madame le Docteur Pastor Mélanie,

De l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui m’a fait le plaisir de me suggérer ce sujet de travail

Et qui a accepté de m’aider dans l’élaboration de ce travail. Merci.

A Xavier,

Comment décrire tout ce que tu représentes pour moi en quelques lignes ? Une thèse n’y suffirait pas…

Tu es celui avec qui et pour qui j’avance chaque jour un peu plus vers le bonheur.

Merci pour tout ce que tu m’as apporté, tout ce que tu m’apportes et, je l’espère, tout ce que tu

m’apporteras encore.

A MA FAMILLE A mes parents, Pour m’avoir soutenue en toute circonstance. Pour m’avoir permis d’assouvir chacune de mes passions, l’équitation d’abord, mon métier ensuite. Pour votre amour et pour avoir fait de moi ce que je suis aujourd’hui. A Célia la plus petite de mes petites soeurs, Trouve ici toute la tendresse que je te porte, même si je ne te le montre certainement pas assez. A Stéphanie la plus grande des petites soeurs, Pour tous ces moments passés à se chamailler pour des broutilles, à se tirer les cheveux et à se faire pleurer. Pour ces trop rares instants de confidences. A papi et mamie, Pour l’affection inconditionnelle que vous nous portez à toutes les trois, Malgré l’éloignement et la rareté de mes appels téléphoniques, sachez combien vous comptez pour moi. A pépé et mémé, J’aurai tellement apprécié que vous soyez là pour partager ce moment avec moi, et vous certainement encore plus. A Aline, ma cousine d’Australie ( !), En souvenir de notre enfance passée à construire des cabanes, à essayer de monter un club nature, à raconter nos secrets à la « boite aux lettres jaune », à faire des batailles de crêpes. En souvenir de ton mariage pour lequel tu m’as fait l’immense plaisir de me demander d’être ton témoin. J’espère encore partager beaucoup avec toi malgré mon éloignement et mes nouvelles qui s’espacent de plus en plus… désolée pour ce silence, sache que je pense souvent à vous.

A MES AMIS A Clément, Pour ta présence dans les bons comme les mauvais moments ; tu es l’ami que chacun espère trouver un jour. A Arno, Pour ton calme et ta disponibilité. J’espère que ta vie avec Gaëlle sera à l’avenir plus facile, vous le méritez. A Anne Laure, Pour ton caractère bien trempé derrière lequel se cache une grande gentillesse ainsi qu’une générosité exceptionnelle. Je sais que tu vas trouver l’âme sœur, tu es une fille formidable ! A Alex et Neige, Pour les soirées bières-pizzas, pour les soirées Vodka-baignoire... A la vôtre !!! A Bruno et Amélie, A Bruno pour sa perfection et à Amélie pour sa « sportivité ». Vous êtes adorables tous les deux, je vous souhaite beaucoup de bonheur. A Dron, Pour ta vision décalée de toutes les choses de la vie, qui m’a fait beaucoup rire. A Ped et Kitty, En souvenir des vacances à la mer, des trajets en voiture Nord Est-Lyon et de toutes les soirées OBI qui sont vraiment de la « Connerie » euh pardon « Folie ». Merci à toi Ped, pour ton coté déjanté heureusement bien tempéré par Kitty ! A Kro et Aurélie, Pour toutes ces moments passés avec vous à refaire le monde ! A Yoko, mon cher fils de clinique, Tu m’as surprise par tes qualités au cours de notre année de clinique commune. Conserve ce grand cœur et laisse ton foie un peu tranquille ensuite seulement ta dulcinée te tombera dans les bras ;-).

A TOUTES CES PERSONNES QUI M’ONT FORMEES

A tous mes professeurs, Merci d’avoir cru en moi. Aux vétérinaires qui m’ont accueilli en stage ou en remplacement, Merci de m’avoir fait confiance. Et tout particulièrement, merci: *Patrice et Brigitte pour votre accueil si chaleureux et votre sympathie. *Aux vétos de la Clinique des Roches (Villefontaine), pour m’avoir fait confiance tous ces week end de garde. Et surtout pour être la preuve vivante qu’il est possible de travailler en couple!! Dédicace particulière à Céline et Guillaume ! *Louis Phillipe, autrement dit au Doc’, pour m’avoir donnée confiance en moi surtout pour les chirurgies, pour m’avoir appris à faire de vrais nœuds de matelot breton et pour m’avoir permis de découvrir ta clientèle alsacienne si sympathique ! Merci aussi à leurs ASV ; Danièle sans qui je crois que j’aurai été perdue cet été 2006 et Peggy si spontanée et si efficace.

Enfin un Grand Merci à Babette et Slim, Pour toutes ces heures passées au labo d’hémato avec vous, pour votre aide si précieuse dans la réalisation de mes tests de Coombs, pour le thé de 11 heures et les ragots colportés. A toi Slim, je te souhaite de trouver au moins le bonheur puisque que tu ne crois plus au grand Amour. A toi Babette, pour ton regard si calme et si raisonné sur la vie.

AUX ANIMAUX

Aux chevaux. A Siam, Parti brutalement, trop tôt. A Bounty, Si tu n’avais pas besoin de litière tu pourrais être le chat parfait. A Tayot, Le chat parfait!

A tous ces chiens qui ont donné leur sang pour la science et pour le test de Coombs !

A toux ceux qui au moins auront lu ces premières pages, MERCI !

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SSOOMMMMAAIIRREE

SOMMAIRE............................................................................................................................. 1

TABLE DES ILLUSTRATIONS............................................................................................ 7

TABLE DES TABLEAUX ...................................................................................................... 9

LISTE DES ANNEXES ......................................................................................................... 11

LISTE DES ABREVIATIONS.............................................................................................. 13

INTRODUCTION.................................................................................................................. 15

L E TES T DE COOMBS, ORIGINE, PRINCIPE ET DEFINITION ............................. 17

I. Historique........................................................................................................................... 19

A) La découverte du test à l’antiglobuline........................................................................ 19

B) Le test direct à l’antiglobuline..................................................................................... 20

C) Les utilisations du test au cours du XXème siècle......................................................... 21 1 Anémies hémolytiques acquises.................................................................................. 21 2 Agglutinations bactériennes ....................................................................................... 21 3 Détection des anticorps « réagines » ............................................................................ 21 4 L’antiglobuline, molécule d’étape dans les tests immunologiques...................................... 22

II. Interactions antigène-anticorps in vitro.............................................................................. 23

A) Facteurs influençant l’agglutination ............................................................................ 23 1 La sensibilisation..................................................................................................... 23

(a) Complémentarité stérique ................................................................................... 23 (b) Complémentarité électrique et affinité ................................................................... 24

2 Agglutination.......................................................................................................... 24 (a) Potentiel ζ (zêta)................................................................................................ 25 (b) Théorie des ponts ou du réseau............................................................................. 26 (c) Anticorps complets et incomplets ......................................................................... 28

(i) Hémagglutination directe..................................................................................................................................28 (ii) Hémagglutination artificielle..........................................................................................................................29

B) Immunoglobuline G et complément............................................................................. 30 1 Le complément ........................................................................................................ 30

(a) Voie classique et voie des lectines ........................................................................ 30 (b) La voie alterne .................................................................................................. 31

2 Complément et hématies............................................................................................ 32

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III. Tests de Coombs : définition et principe .......................................................................... 35

A) Le test de Coombs direct à chaud................................................................................ 35 1 Définition............................................................................................................... 35 2 Principe de réalisation du test de Coombs direct ............................................................. 35 3 Production de l’antiglobuline...................................................................................... 36

B) Test de Coombs à froid : cas part iculier des anticorps froids .........................................38

C) Test de Coombs indirect............................................................................................. 38 1 Principe.................................................................................................................. 38 2 Réalisation.............................................................................................................. 38

IV. Indications du test de Coombs en médecine vétérinaire.................................................... 41

A) Diagnostic des anémies suspectes d’une origine immunologique................................... 41 1 Définition............................................................................................................... 42 2 Classification des anémies hémolytiques à médiation immune.......................................... 42

(a) Classification selon l’origine de l’anémie............................................................... 42 (b) Classification selon l’antigène impliqué dans l’anémie immunologique........................ 43

3 Nature du revêtement anticorps................................................................................... 45 (a) Site de destruction des hématies selon les anticorps impliqués.................................... 46 (b) Classes des anticorps.......................................................................................... 47 (c) Isotype de l’anticorps et clinique.......................................................................... 48

4 Diagnostic d’une anémie immunologique ..................................................................... 49

B) Intérêt du test de Coombs dans le suivi du traitement de l’animal.................................. 50

C) Conduite diagnostique et pronostique des maladies auto-immunes systémiques.............. 50

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L E TES T DE COOMBS EN PRATIQUE : PRES ENT ET FUTUR EN MEDECINE

VETERINAIRE ......................................................................................... 53

I. Réalisation du test de Coombs direct à chaud : méthodologie............................................. 55

A) Prélèvement de l’échantillon et condit ions d’envoi....................................................... 57

B) Lavage des hématies .................................................................................................. 57 1 Intérêt des lavages.................................................................................................... 57 2 Technique............................................................................................................... 58

C) Préparation de la suspension érythrocytaire.................................................................. 59

D) Choix du réactif......................................................................................................... 59

E) Préparation de la gamme de dilut ion de l’antiglobuline................................................. 61

F) Test........................................................................................................................... 62

G) Incubation................................................................................................................. 63 1 Durée d’incubation................................................................................................... 63 2 Température d’incubation.......................................................................................... 63 3 pH d’incubation....................................................................................................... 63

H) Création de témoins................................................................................................... 64 1 Témoins positifs ...................................................................................................... 64 2 Témoins négatifs ...................................................................................................... 64

I) Lecture du test ............................................................................................................ 65

J) Interprétation et sanction ............................................................................................. 65

II. Interprétation des résultats................................................................................................ 67

A) Test de Coombs direct à froid posit if........................................................................... 67

B) Test de Coombs direct à chaud.................................................................................... 68 1 Premier et deuxième cas : test positif aux immunoglobulines............................................ 68 2 Troisième cas : test positif au complément .................................................................... 69

III. Valeur diagnostique du test de Coombs en médecine vétérinaire..................................... 71

A) Praticabilité............................................................................................................... 71

B) Fiabilité..................................................................................................................... 71 1 Exactitude .............................................................................................................. 71 2 Précision ................................................................................................................ 72 3 Détectabilité............................................................................................................ 72

C) Critères d’efficacité.................................................................................................... 73 1 Spéci ficité du test de Coombs..................................................................................... 73

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(a) Définition des faux-positifs ................................................................................. 73 (b) Origine des faux-positi fs ..................................................................................... 74

(i) Des causes techniques........................................................................................................................................74 (ii) Des causes biologiques....................................................................................................................................74

(c) Amélioration de la spécifi cité du test de Coombs..................................................... 76 2 Sensibilité............................................................................................................... 77

(a) Définition et origine des faux-négati fs ................................................................... 77 (i) Une mauvaise condition de pratique du test..................................................................................................77 (ii) Autres raisons....................................................................................................................................................78

(b) Amélioration de la sensibilité du test de Coombs..................................................... 78 (i) Test de Coombs direct à froid..........................................................................................................................78 (ii) Solutions salines à faible concentration........................................................................................................79 (iii) Prétraitement enzymatique.............................................................................................................................79 (iv) Utilisation de substances macromolécualires.............................................................................................79 (v) Techniques alternatives au test de Coombs..................................................................................................79

3 Bilan : sensibilité et spécificité du test de Coombs direct.................................................. 80

IV. Techniques alternatives au test de Coombs ...................................................................... 81

A) Test direct à l’antiglobuline liée à une enzyme (DELAT). ............................................ 81 1 Principe du test........................................................................................................ 81 2 Réalisation.............................................................................................................. 81 3 Avantages............................................................................................................... 82 4 Inconvénients .......................................................................................................... 82

B) Test par immunofluorescence (cytométrie de flux directe) ............................................ 83 1 Principe et réalisation................................................................................................ 83 2 Avantages et inconvénients ........................................................................................ 83

C) Gel tests.................................................................................................................... 84 1 Principe du test........................................................................................................ 84 2 Réalisation.............................................................................................................. 85 3 Avantages et inconvénients ........................................................................................ 86

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DETERMINATION DU SEUIL DE POSITIVITE DU TES T DE COOMBS : ETUDE

EXPERIMENTALE . .................................................................................... 89

I. Matériel et méthode............................................................................................................ 91

A) Echantillon................................................................................................................ 91

B) Réalisation de tests de Coombs direct.......................................................................... 92 1 Réalisation des tests de Coombs.................................................................................. 92 2 Choix du réacti f....................................................................................................... 95 3 Bilan ..................................................................................................................... 96

II. Résultats............................................................................................................................ 97

A) Définit ion de la posit ivité du test de Coombs direct...................................................... 97

B) Résultats.................................................................................................................... 97

C) Définit ion d’un seuil .................................................................................................. 98 1 Seuil du test de Coombs direct à chaud......................................................................... 99 2 Seuil de positivité du test de Coombs direct à froid ....................................................... 100

III. Discussion...................................................................................................................... 101

A) Représentativité de l’échantillon............................................................................... 101 1 Etude de la répartition des populations canines en fonction du sexe.................................. 102 2 Etude de la répartition des populations canines en fonction des classes d’âge..................... 103 3 Etude de la répartition des populations canines en fonction des races................................ 103

B) Seuil de posit ivité du test de Coombs ........................................................................ 105

CONCLUSION..................................................................................................................... 107

ANNEXES............................................................................................................................. 109

BIBLIOGRAPHIE............................................................................................................... 123

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TTAABBLLEE DDEESS IILLLLUUSSTTRRAATTIIOONNSS

Figure 1 : Carlo Moreschi, d’après (COOMBS, 1998)........................................................... 20 Figure 2 : Complémentarité stérique, d’après (DAGUET, 1971)........................................... 23 Figure 3 : Potentiel ζ, d’après (BACH, 1993)......................................................................... 25 Figure 4 : Structure d’une immunoglobuline, d’après (DAGUET, 1971).............................. 26 Figure 5 : Théorie des ponts, d’après (TIZARD, 2004)..........................................................27 Figure 6 : Agglutination érythrocytaire en fonction du potentiel ζ, d’après (BACH, 1993)... 28 Figure 7 : Voies classique et alterne d'activation du complément, d’après (TIZARD, 2004).32 Figure 8 : Principe de réalisation du test de Coombs direct à chaud, d’après CHABANNE,

2004)................................................................................................................................. 36 Figure 9 : Production de l’antiglobuline, d’après (CHABANNE, 2004)................................ 37 Figure 10 : Principe du test de Coombs indirect, d’après (SLAPPENDEL, 1986)................. 39 Figure 11 : Représentation schématique du mécanisme de fixation des anticorps sur l’hématie

lors d’AHMI, d’après (DAY, 1999)................................................................................. 45 Figure 12 : Exemple de méthodologie de réalisation du test direct à l’antiglobuline selon la

technique sur tube (notice d’utilisation des laboratoires MP biomedicals, Solon, OH, USA)................................................................................................................................. 56

Figure 13 : Principe du lavage des hématies, d’après (CHABANNE, 2004).......................... 58 Figure 14 : Représentation schématique du phénomène de zone, d’après (GENETET, 1997).

.......................................................................................................................................... 62 Figure 15 : Cas particuliers des anticorps qui s’éluent (IgM) : l’agglutination à partir du

complément, d’après (CHABANNE, 2004)..................................................................... 67 Figure 16 : Représentation schématique du DELAT, d’après (JONES et al., 1987;

WARDROP, 2005)........................................................................................................... 82 Figure 17 : Représentation schématique des résultats obtenus lors du gel test et gradation de

ces résultats, d’après (WARDROP, 2005)....................................................................... 85 Figure 18 : Représentation schématique d’une carte de gel-test, d’après (LAPIERRE et al.,

1990)................................................................................................................................. 85 Figure 19 : Hémogramme : valeurs de référence chez le chien, d’après (JAIN, 1973).......... 91 Figure 20 : Centrifugeuse utilisée dans l’étude. ...................................................................... 92 Figure 21 : Réalisation de la suspension érythrocytaire.......................................................... 93 Figure 22 : Microplaque à fond conique ................................................................................. 94 Figure 23 : Lecture du test de Coombs direct.......................................................................... 95 Figure 24 : Répartition des chiens positifs au test de Coombs direct à chaud ........................ 99 en fonction du titre pour lequel une agglutination est observée............................................... 99 Figure 25 : Répartition des chiens positifs au test de Coombs direct à froid ........................ 100 en fonction du titre pour lequel une agglutination est observée............................................. 100 Figure 26 : Représentation graphique de la distribution comparée de la variable « sexe »,

entre la population de référence et l’échantillon. ........................................................... 102 Figure 27 : Représentation graphique de la distribution comparée de la variable « classes

d’âge », entre la population de référence et l’échantillon .............................................. 103 Figure 28 : Représentation graphique de la distribution comparée de la variable « race » entre

la population de référence et l’échantillon ..................................................................... 104

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TTAABBLLEE DDEESS TTAABBLLEEAAUUXX

Tableau 1 : Propriétés des différents isotypes d’immunoglobulines, d’après (TIZARD, 2004).

.......................................................................................................................................... 27 Tableau 2 : Maladies associées à une anémie hémolytique à médiation immune chez le chien

et le chat, d’après (WERNER, 1980). .............................................................................. 43 Tableau 3 : Classification pathogénique des anémies immunologiques (DAY, 1998)........... 44 Tableau 4 : Classification des AHMI, d’après (STEWART & FELDMAN, 1993; PELLERIN

et al., 1994)....................................................................................................................... 46 Tableau 5 : Comparaison de la sensibilité du test de Coombs sur 11 chiens atteints d’anémie

hémolytique à médiation immune, d’après (JONES et al., 1990).................................... 60 Tableau 6 : Comparaison du test de Coombs direct à 37°C réalisé avec deux antiglobulines

différentes, d’après (KUCINSKIENE et al., 2005).......................................................... 60 Tableau 7 : Comparaison du test de Coombs direct réalisé à 37°C et à 4°C, d’après

(KUCINSKIENE et al., 2005). ........................................................................................ 63 Tableau 8 : Interprétation du test de Coombs direct, d’après (SLAPPENDEL, 1979);

(SCHLAM, 1980; JONES, 1984)..................................................................................... 70 Tableau 9 : Détectabilité des épreuves sérologique usuelles, d’après (PASTORET et al.,

1990)................................................................................................................................. 72 Tableau 10 : Différents type d’anticorps détecté par le TCD lors de l’étude de 1979 de

Slappendel (SLAPPENDEL, 1979). ................................................................................ 73 Tableau 11 : Interprétation du test de Coombs direct ; faux-positifs et faux-négatifs, d’après

(SLAPPENDEL, 1979; SCHLAM, 1980; JONES, 1984). .............................................. 80 Tableau 12 : Sensibilité et spécificité comparées du TCD réalisé de manière classique sur

plaque et de la cytométrie de flux. ................................................................................... 83 Tableau 13 : Protocole utilisé dans le cadre de l’étude. .......................................................... 96 Tableau 14 : Résultats positifs des tests de Coombs direct à chaud et à froid en fonction du

titre d’antiglobuline .......................................................................................................... 97 Tableau 15 : Modalités de chaque variable démographique prises en compte pour l’étude de

la représentativité de l’échantillon. ................................................................................ 102 Tableau 16 : Répartition des populations canines selon leur sexe. ....................................... 102 Tableau 17 : Répartition des populations canines selon leur classe d’âge............................ 103 Tableau 18 : Répartition des populations canines selon leur race......................................... 104

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LLIISSTTEE DDEESS AANNNNEEXXEESS

Annexe 1 : Notice de l’antiglobuline VMRD (Pullman, WA, USA)………………… 113 Annexe 2 : Notice de l’antiglobuline utilisée sur l’échantillon (MP Biomedicals (Solon, OH, USA))…………………………………………………………………….

116

Annexe 3 : Fiche établie pour chaque chien de l’échantillon……………………........ 118 Annexe 3 : Sexe des chiens de l’échantillon…………………………………………. 119 Annexe 4 : Race des chiens de l’échantillon ………………………………………… 120 Annexe 5 : Age des chiens de l’échantillon …………………………………………. 121 Annexe 6 : Hémogramme des chiens de l’échantillon ………………………………. 122 Annexe 7 : Résultats des tests de Coombs …………………………………………... 123

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LLIISSTTEE DDEESS AABBRREEVVIIAATTIIOONNSS

AHMI Anémie Hémolytique à Médiation Immune ACD Acide citrique-citrate-dexose BFI Basse Force Ionique CPD Citrate-Phosphate Dexose DELAT Direct Enzyme-Linked Antiglobulin Test EDTA Ethylène Diamine Tetra-Acétique ELISA Enzyme-Linked immunoSorbent Assay Fab Fragment variable Fc Fragment constant IFD Immunofluorescence Directe IgA Immunoglobuline A IgG Immunoglobuline G IgM Immunoglobuline M L.E.S. Lupus Erythémateux Systémique L.I.S.S. Low Ionic Saline Solution MrPAH Mixed reverse Passive Antiglobulin Haemagglutination p. cent Pour cent (%) PVP PolyVinylePyrolydone RAST Radio-Allergo-Sorbent-Test RCLAAR Red Cell Linked Antigen-Antiglobulin Reaction Rh Rhésus TCD Test de Coombs Direct TCI Test de Coombs Indirect

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IINNTTRROODDUUCCTTIIOONN

Les maladies auto-immunes sont des maladies encore méconnues ou mal connues en

médecine vétérinaire car respectivement insuffisamment ou abusivement diagnostiquées. La plus connue de ces maladies est l’anémie hémolytique à médiation immune, dont la

première découverte chez le chien est rapportée en 1954 par Miller (MILLER et al., 1954), exactement 50 ans après la première description faite chez l’homme (DONATH & LANDSTEINER, 1904; MILLER et al., 1954).

L’origine immunologique de l’affection n’a été prouvée qu’en 1945 (COOMBS et al., 1945) grâce au développement d’un nouveau test : le test de Coombs ou test à l’antiglobuline.

Ces maladies immunologiques sont d’un diagnostic diff icile car les anomalies du

système immunitaire concomitantes à la maladie peuvent sensibiliser le patient à de nombreuses autres affections rendant le tableau clinique souvent très polymorphe.

C’est pourquoi la recherche de paramètres biologiques fiables et accessibles se révèle

nécessaire pour une démarche diagnostique rigoureuse. Le test de Coombs est un paramètre souvent évoqué et fréquemment utilisé dans un but diagnostic de telles maladies. Bien connu et utilisé en médecine humaine, cet outil biologique est intéressant mais il convient de mieux l’évaluer ; de nombreuses publications rapportent en effet un manque de spécificité et de sensibilité du test de Coombs.

Quel est le principe du test de Coombs, dans quels cas permet-il le diagnostic d’une anémie auto-immune ? Les réponses à ces interrogations sont apportées dans la première partie de ce travail. La seconde partie, plus pratique, fait le point sur les connaissances actuelles concernant le protocole de réalisation de ce test. Enfin une troisième partie, expérimentale, permet de définir un seuil de positivité pour les tests de Coombs directs à chaud et à froid; seuil qui est le point clef lors de l’interprétation du résultat d’un test de Coombs.

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Première partie -

Le test de Coombs, origine, principe et définition

Étude bibliographique

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I. Historique

Le test de Coombs doit son nom à un vétérinaire, Sir Robin Coombs, qui le mit au point en 1945 lors d’études effectuées avec les scientifiques Rob Race et Arthur Mourant à l’Université de Cambridge en Angleterre (COOMBS, 1994; COOMBS, 1998).

A) La découverte du test à l’antiglobuline

L’histoire du test de Coombs débute lorsque qu’éclate la seconde guerre mondiale. Le nombre important de transfusions sanguines réalisées à cette époque poussa le gouvernement britannique à encourager la recherche dans ce domaine. Le système ABO était alors le seul phénotype globulaire connu. C’est en 1940 que Landsteiner et Wiener découvrirent le système Rhésus (Rh) et prouvèrent son importance clinique. Par la suite le docteur Race réalisa un travail de recherche fondamental sur ce nouveau système sanguin, travail qui fut la base de la nomenclature génétique et immunologique de ce système. L’une des premières publications de Race sur ce sujet démontre l’existence d’anticorps particuliers qu’il nomma anticorps « incomplets » (RACE, 1944) : normalement en milieu salin on observe une agglutination lorsque les anticorps Rh (plus connu sous le nom d’anticorps anti-D) sont mis en présence de globules rouges D positifs. Or Race remarqua que certains anticorps, pourtant combinés avec les globules rouges D positifs, ne provoquaient pas d’hémagglutination. Ces anticorps n’étaient détectables que lors de l’utilisation d’un test dit « bloquant ». Celui-ci consistait en la mise en solution de globules rouges D positifs dans un sérum contenant les anticorps « incomplets » qui rendaient alors l’agglutination possible et visible (WIENER, 1984).

Entre 1944 et 1945 le vétérinaire et immunologiste Robin Coombs, rencontra Arthur

Mourant et Rob Race. C’est alors qu’il entendit parler pour la première fois de ce que Rob Race appelait les anticorps Rh « incomplets » ou « bloqués ». Coombs fut intéressé par ces molécules et commença par les étudier grâce à l’électrophorèse (COOMBS, 1998).

L’histoire raconte que Coombs eu l’idée du test à l’antiglobuline lors d’un voyage en

train de Londres à Cambridge alors qu’il lisait des articles sur la théorie de Paul Ehrlich concernant les « chaînes latérales » (théorie selon laquelle la réaction immunitaire fait intervenir les chaînes latérales des récepteurs présents à la surface des cellules, qui ne se lient qu'à certains groupes chimiques des toxines). C’est à ce moment qu’il eut une vision des hématies et des anticorps incomplets. A l’image de Kekulé et sa vision de l’atome de carbone tétravalent, il pressentit la nécessité de l’intervention d’une autre molécule qui viendrait se lier aux anticorps de deux hématies différentes et qui favoriserait ainsi l’agglutination (COOMBS, 1998).

En effet en utilisant un anticorps anti-anticorps (autrement dit, une antiglobuline) en milieu salin, des « ponts » peuvent être formés entre les cellules permettant ainsi leur agglutination.

Quelques temps auparavant, le docteur Carlo Moreschi (figure 1), avait déjà décrit le

principe général de ce test, cependant son travail avait eu très peu d’écho (MORESCHI, 1908), et ce n’est que de nombreuses années plus tard que les trois chercheurs découvrirent ses publications.

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Figure 1 : Carlo Moreschi, d’après (COOMBS, 1998).

B) Le test direct à l’antiglobuline

Coombs, Mourant et Race travaillèrent plusieurs semaines afin de mettre au point un anti-sérum dirigé contre les globulines humaines.

Ils émirent l’hypothèse que les anticorps dirigés contre les globulines humaines

pouvaient être produits par des lapins immunisés avec ces globulines. Les anticorps contenus dans le sérum de ces lapins (antiglobulines humaines) pouvaient ensuite se f ixer aux hématies sensibilisées par les anticorps incomplets. Ils prouvèrent de cette manière l’efficacité et la sensibilité du test à l’antiglobuline. A la suite de ces recherches, Coombs déclara avec perspicacité : « ce test doit avoir de nombreuses applications pratiques car il permet certainement de détecter des degrés très fins de sensibilisation cellulaire dans tous les systèmes de réactions anticorps-antigène » (COOMBS et al., 1945).

Les trois scientifiques poursuivirent donc leurs recherches en testant les globules rouges de nouveaux nés suspects d’anémie hémolytique, car il était connu que l’agglutination spontanée des hématies de ces enfants était très rare. Ils prouvèrent alors que la majorité des sérums des enfants malades réagissaient positivement au test. Par ailleurs c’est au cours de ces recherches que les scientifiques découvrirent le système Kell (COOMBS et al., 1946).

Fort de ses connaissances vétérinaires, Coombs prouva l’utilité de son test dans le

diagnostic des anémies hémolytiques dans les espèces animales comme les muletons, les poulains pur-sang et les porcelets (COOMBS, 1998; WARDROP, 2005).

- 21 -

C) Les utilisations du test au cours du XXème siècle

1 Anémies hémolytiques acquises

En 1946, Borman, Doud et Louttit (BORMAN et al., 1946) documentèrent l’utilité du test à l’antiglobuline dans le cadre de la détection d’une autosensibilisation des globules rouges chez les patients atteints de ce qu’ils appelèrent « une anémie hémolytique acquise ». C’est par ailleurs lors de ces recherches que l’attention des scientifiques fut attirée sur l’utilisation d’une dose optimale d’antiglobuline afin d’éviter les faux-négatifs dus aux phénomènes de zone (VAN LOGHEM et al., 1950).

2 Agglutinations bactériennes

Les résultats de certaines études ont permis de révéler l’utilité du test dans la détection d’agglutinations bactériennes.

Ainsi Morgan et Schütze travaillèrent sur la détection de l’agglutination provoquée par les bactéries du genre Shigella shiga et Salmonella typhi (MORGAN & SCHUTZE, 1946). De même d’autres travaux prouvèrent que l’utilisation de l’antiglobuline permettait de révéler une fièvre Q chronique pour laquelle un simple test d’agglutination du sérum était négatif, alors qu’il était positif lors d’une fièvre Q aiguë (COOMBS & STOKER, 1951). La découverte des différents isotypes (ou classes) d’immunoglobulines (IgG, IgM, et IgA) permit de comprendre ce phénomène : les cas de brucelloses aigues provoquaient la formation d’IgM, tandis que les cas chroniques n’étaient révélés que par des réactifs spécifiques d’IgG et/ou d’IgA (KERR et al., 1967).

Un test spécifique fut alors adapté pour détecter les agglutinations bactériennes : le MrPAH ou Mixed reverse Passive Antiglobulin Haemagglutination (COOMBS et al., 1978).

3 Détection des anticorps « réagines »

Pendant longtemps (de 1921 à 1967), un problème majeur en immunologie fut l’absence de test permettant de détecter les anticorps responsables des maladies allergiques telles que le rhume des foins, l’asthme ou toutes autres expressions de réactions anaphylactiques. Ces anticorps spécifiques étaient désignés sous le terme de « réagines » (aujourd’hui IgE). Ce type d’anticorps thermolabiles ne pouvait alors être mis en évidence que par des tests cutanés de sensibilisation (intradermoréaction par exemple).

S’appuyant sur le même principe que celui du test à l’antiglobuline est né le test RCLAAR (red cell linked antigen-antiglobulin reaction) (COOMBS et al., 1968) .

L’antiglobuline fut par la suite marquée par un radio-isotope ce qui donna naissance au test RAST (Radio-allergo-sorbent-test), test de référence dans la détection des IgE (TIZARD, 2004).

- 22 -

4 L’antiglobuline, molécule d’étape dans les tests immunologiques

De nos jours l’antiglobuline est indispensable car elle est très souvent utilisée au cours d’une des étapes de réalisation de nombreux tests immunologiques. Bien souvent l’antiglobuline porte un marqueur qui peut être un fluorochrome dans les techniques par immunofluorescence (WELLER & COONS, 1954), un radio-isotope (comme l’125Iode) utilisé en radio-immunologie, ou une enzyme utilisée en immunocytochimie et en immunoenzymologie.

Grâce à cette découverte, l’utilisation du test de Coombs permit par la suite la

découverte des groupes sanguins humains, notamment des systèmes Kell, Duffy et Kidd, et il assura une sécurité supplémentaire lors des transfusions (BECK & TILZER, 1996).

Selon de nombreux auteurs, aucun autre système n’a actuellement surpassé le

test à l’antiglobuline dans le domaine de la détection des alloanticorps incomplets (ou IgG).

En 1962, l’American Association of Blood Bank Transfusion Standards for

Accreditation of a Blood Bank Transfusion Service inclue le test à l’antiglobuline dans le protocole à mettre en place avant toute transfusion (BECK & TILZER, 1996).

Ce test fut donc un test phare en hématologie car il a permis de mieux

comprendre et d’explorer certaines réactions antigène-anticorps. Cette étude se poursuit dans la logique de Coombs et ses collaborateurs et va permettre

à présent d’explorer les interactions antigène-anticorps.

- 23 -

II. Interactions antigène-anticorps in vitro

Pour comprendre le principe du test de Coombs, il est indispensable de connaître la nature des mécanismes régissant les interactions entre les anticorps et les antigènes, ainsi que le rôle des immunoglobulines et du complément parfois présents sur les globules rouges.

Dans le cadre de l’immuno-hématologie, l’interaction entre un antigène

érythrocytaire et son anticorps complémentaire se manifeste par l’observation d’une agglutination, d’une hémolyse et / ou d’une précipitation (American Association of Blood Banks Technical Manual Committee, 2002). La plupart des tests dans ce domaine utilisent l’agglutination car elle est le reflet de la fixation des anticorps sur les cellules exprimant des antigènes membranaires.

A) Facteurs influençant l’agglutination

L’agglutination se déroule en deux étapes : la sensibilisation, correspondant à la phase de liaison entre un anticorps et un antigène érythrocytaire, et l’agglutination sensu stricto correspondant cette fois ci à la formation de ponts entre les cellules sensibilisées. Un certain nombre de conditions doit être réuni pour que ces deux étapes se déroulent correctement.

1 La sensibilisation

La sensibilisation est une réaction stéréospécifique entre un antigène et son anticorps complémentaire.

(a) Complémentarité stérique

La sensibilisation n’est effective que si la complémentarité est parfaite entre les épitopes (sites antigéniques de liaison) et les paratopes (régions de liaison des anticorps aux antigènes) (figure 2). Ces interactions spécifiques tiennent aux configurations spatiales particulières des anticorps qui assurent une complémentarité stérique à la molécule ou à une partie de la molécule d’antigène avec laquelle l’anticorps réagit (DAGUET, 1971).

Figure 2 : Complémentarité stérique, d’après (DAGUET, 1971).

Paratope (Ac) (Ac)

Epitope (Ag) (Ac)

Anticorps (Ac) (Ac)

Antigène (Ag) (Ac)

-

+ -

- +

+

- 24 -

(b) Complémentarité électrique et affinité

En plus de cette complémentarité stérique, la stéréospécificité nécessite une complémentarité électrique résultant de la superposition de forces attractives et répulsives non covalentes de faible énergie et pouvant être aussi bien des liaisons hydrogènes, électrostatiques (appelées aussi liaisons ioniques), des interactions apolaires (nommées également liaisons hydrophobes) ou bien des forces de Van Der Waals. C’est ce qui explique que la réaction entre un antigène et son anticorps est une réaction d’équilibre (BERZOFSKY et al., 1993; PAUL, 1993).

Chacune de ces liaisons a des propriétés thermodynamiques différentes. Certaines conditions physico-chimiques influencent la réversibilité de la réaction. Par exemple, la chaleur, l’acidif ication du milieu ou l’apport d’ions en grande quantité dissocient les liaisons. D’autre part, l’intensité de ces liaisons varie au minimum à l’inverse de la distance séparant l’antigène de l’anticorps. Elles sont donc d’autant plus fortes que cette distance est faible, c'est-à-dire que les structures sont complémentaires car cela permet aux forces d’attraction de s’exercer pleinement.

En d’autres termes, la stabilité et la force, c'est-à-dire la sensibilité de la liaison antigène-anticorps sera d’autant plus grande que les aires de contact seront étendues (BACH, 1993; GENETET, 1997).

L’affinité de la réaction entre un antigène (Ag) et un anticorps (Ac) à l’équilibre se

note : [Ag/Ab]

K0= [ Ag ]

Avec : [Ag] concentration en antigènes libres [Ac] concentration en sites anticorps libres K0 constante d’équilibre d’affinité (ou d’association) du système Plus la constante d’affinité K0 est élevée, plus il y aura d’anticorps combinés avec les

antigènes lorsque l’équilibre sera atteint (HUGHES-JONES, 1963). De même, plus la constante d’affinité est élevée, plus la liaison entre l’antigène et l’anticorps est difficile à rompre.

Cette double complémentarité (stérique et électrique) assure la spécificité de la

réaction antigène-anticorps, c'est-à-dire qu’un site anticorps ne peut se fixer qu’à un épitope et un seul. Habituellement un antigène porte plusieurs épitopes qui seront reconnus par autant de d’anticorps différents, chacun étant spécifique d’un seul épitope de l’antigène.

2 Agglutination

Lorsque les globules rouges ont été sensibilisés, un nombre important de facteurs va entrer en jeu et favoriser ou empêcher l’agglutination.

Comment et pourquoi les immunoglobulines ajoutées à la solution d’hématies

sensibilisées, permettent-elles l’agglutination ?

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(a) Potentiel ζ (zêta)

En milieu salin neutre, il existe entre les hématies une différence de potentiel électrique ou potentiel ζ (zêta), résultant de forces antagonistes : la tension inter faciale (qui tend à agréger les cellules entre elles) et les forces de répulsion (prédominantes) qui s’opposent à l’agrégation des cellules et assurent la stabilité de la suspension (OSS & ABSOLOM, 1983).

Dans ce milieu, les cations sont attirés par les anions de l’acide N-acétyl-neuraminique

de la membrane érythrocytaire. Les cations s’accumulent autour de l’hématie et forment un nuage cationique dont la densité maximale est proche de la membrane érythrocytaire (couche interne). Au niveau de la couche externe (plan de clivage) la densité du nuage cationique est plus faible.

Le potentiel ζ est la différence entre les charges électriques situées à la surface des hématies (nuage interne) et celles du nuage externe (figure 3).

La différence de potentiel entre ce nuage de cations solidaires de l'hématie et le milieu neutre est de -15 mV. Ce potentiel ζ est déterminé grâce à la mesure de la mobilité des hématies dans un champ électrique. Selon Pollack, le potentiel ζ est proportionnel à la charge σ des hématies, inversement proportionnel à la constante diélectrique D du milieu, et à la racine carrée de la force ionique µ (STRATTON et al., 1973), soit :

ζ = f(σ / D.µ-2)

Avec : σ charge des hématies D constante diélectrique du milieu µ force ionique du milieu f constante

Figure 3 : Potentiel ζ, d’après (BACH, 1993). Les particules élect ronégatives (hématies) sont entourées d’un nuage cationique proche de la particule

(couche interne) et d’un second nuage cationique, plus éloigné. La différence de potentiel (en mV) de ces deux couches correspond au potentiel ζ.

Particules électronégatives

+ +

+ +

+

+

+ +

+

+

+

+ +

+ +

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

Couche interne Couche anionique

Couche cationique Couche externe

- 26 -

(b) Théorie des ponts ou du réseau

Afin de comprendre la théorie des ponts, il est nécessaire de se souvenir de la structure d’un anticorps.

Le schéma de Porter (PORTER, 1973) de la structure des immunoglobulines montre

que ces molécules sont constituées de deux chaînes lourdes (en violet sur la figure 4) et deux chaînes légères (en vert sur la figure 4), et qu’elles peuvent se dissocier après traitement par une enzyme, en une partie Fc constituée de deux fragments de chaînes lourdes, et en deux fragments Fab, qui contiennent le site anticorps de liaison à l'antigène (TIZARD, 2004).

Figure 4 : Structure d’une immunoglobuline, d’après (DAGUET, 1971). Les immunoglobulines sont constituées par deux chaînes lourdes (H), en violet sur la figure et deux

chaînes légères (L), en vert sur le dessin. Les chaînes légères sont constituées d’une partie constante (CL) et d’une partie variable (VL). Les chaînes lourdes sont constituées d’une partie variable (VH) et de plusieurs parties

constantes (CH1, CH2, CH3)

Les domaines constants sont caractérisés par une séquence en acides aminés très proche d'un anticorps à l'autre, caractéristiques de l'espèce et de l'isotype. Chaque chaîne légère en possède un exemplaire noté CL. Les chaînes lourdes comportent, selon l'isotype (tableau 1), trois ou quatre domaines constants CH1, CH2, CH3 et CH4. Les domaines constants ne sont pas impliqués dans la reconnaissance de l'antigène, mais interviennent dans l'activation du système du complément. Les cellules immunitaires possédant les récepteurs aux fragments constants (RFc) sont capables de lier les anticorps.

Fc

Fab Paratope

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IgG IgA IgM IgE IgD Localisation Sang Muqueuses

Sécrétions Lymphocytes B Sang

Basophile Mastocytes

Lymphocytes B

Proportion 70-75% 15-20% des anticorps sériques

10% Moins de 1% Moins de 1%

Valence 2 2 à 4 2 à 10 2 2 Rôle Neutralisation

des toxines, bactéries et virus

Agglutination Neutralisation des bactéries et des virus

Agglutination Voie classique du complément

Allergie Neutralisation des parasites

Activation des lymphocytes B

Tableau 1 : Propriétés des différents isotypes d’immunoglobulines, d’après (TIZARD, 2004).

Les anticorps (historiquement nommés Ig car ils ont servi à la définition du terme immunoglobuline) sont subdivisés en classes ou isotypes, selon la structure des domaines constants des chaînes lourdes : les chaînes γ, α, µ, ε et δ correspondent respectivement aux immunoglobulines IgG, IgA, IgM, IgE et IgD. Il existe également

des sous-classes d'immunoglobulines, reflétant des différences plus fines entre chaînes lourdes. L'homme possède ainsi quatre sous-classes d'IgG et 2 sous-classes d'IgA. Il existe également des isotypes de chaînes

légères, celles-ci pouvant être κ (kappa) ou λ (lambda).

Un anticorps possède également quatre domaines variables situés aux extrémités des deux « bras ». L'association entre un domaine variable porté par une chaîne lourde (VH) et le domaine variable adjacent porté par une chaîne légère (VL) constitue le site de reconnaissance (ou paratope) de l'antigène. Ainsi, une molécule d'immunoglobuline possède deux sites de liaison à l'antigène ; un au bout de chaque bras. Ces deux sites sont identiques, d'où la possibilité de lier deux molécules d'antigène par anticorps.

On suppose donc qu'un site anticorps se lie à l'antigène situé sur une hématie, et

que le second site de l'immunoglobuline se lie à l'antigène situé sur une seconde hématie, constituant ainsi un "pont" moléculaire entre les deux hématies qui se trouvent donc agrégées entre elles (figure 5). De proche en proche le nombre d'hématies est de plus en plus important, jusqu'à constituer des agglutinats importants et visibles à l'oeil nu.

Figure 5 : Théorie des ponts, d’après (TIZARD, 2004).

Hématie 2

Héma-

tie 1 Immunoglobuline

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(c) Anticorps complets et incomplets

Cependant tous les anticorps ne sont pas suffisamment efficaces pour provoquer une agglutination cellulaire (BACH, 1993; TIZARD, 2004).

En milieu salin, l’agglutination spontanée des hématies est le fait d’anticorps dits

complets ou agglutinants, principalement d’isotype IgM car ils possèdent des sites anticorps suffisamment éloignés et un poids moléculaire plus élevé (900 kDa pour les IgM et 160 kDa pour les IgG) pour pouvoir passer outre le potentiel ζ. Dans les autres cas, essentiellement les anticorps d’isotype IgG, on parle d’anticorps incomplets, ils sont alors simplement revêtants (figure 6).

Mais il existe également des anticorps IgG agglutinants. En effet la notion d’anticorps

agglutinant et non agglutinant est relative car elle dépend de la structure moléculaire de l’anticorps (IgG ou IgM), mais aussi de la densité des déterminants antigéniques présents à la surface des cellules et du milieu lui-même (force ionique).

Figure 6 : Agglutination érythrocytaire en fonction du potentiel ζ, d’après (BACH,

1993).

(i) Hémagglutination directe

Comme nous venons de le voir, l’agglutination des hématies en suspension dans une solution physiologique (NaCl, 0,15M) peut être réalisée par les anticorps « agglutinants » ou « complets » spécifiquement fixés à leur surface, sans recours à des modifications artificielles du milieu. Cette agglutination peut être obtenue à la température de 4°C, 22°C ou éventuellement 37°C.

IgG

IgM

Couche externe

Couche interne

Potentiel ζ

Hématie Hématie

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(ii) Hémagglutination artificielle

Les IgG présentent une distance entre leurs sites de liaison trop faible pour pouvoir provoquer une agglutination. Par conséquent, elles se fixent sur les membranes érythrocytaires mais ne produisent pas d’agglutination in vitro en milieu salin neutre (NaCl à 0,9%). Cette agglutination peut cependant être obtenue in vitro, à 37°C, grâce à des artifices techniques qui réduisent la charge négative des hématies (cas des protéases) ou augmentent la constante diélectrique du milieu (cas des macromolécules comme l’albumine, le dextran ou le PVP), et permettent de passer outre le potentiel ζ.

• La mise en suspension des hématies dans un milieu macromoléculaire

(albumine, dextran, PVP) permet de sensibiliser l’agglutination, par augmentation de la constante diélectrique du milieu.

• En traitant les hématies par une enzyme comme la papaïne, la trypsine, la

broméline ou la f icine (JONES & DARKE, 1975; OSS & ABSOLOM, 1983; BARKER & JONES, 1993b) ; on supprime un certain nombre de charges négatives à la surface de l'hématie grâce à la protéolyse de l’acide N-acétyl-neuraminique, ce qui diminue le potentiel zêta par la diminution de σ (charge des hématies), et permet alors à une IgG de provoquer une agglutination. Cela est vérifié chez le chien, espèce pour laquelle le potentiel ζ est plus élevé que chez l’homme pour lequel l’effet de la papaïne sur le potentiel n’est pas jugé suffisant pour être seul responsable de l’agglutination. Ce traitement permet également une meilleure accessibilité de certains épitopes (dégagement stérique et augmentation du nombre de sites antigéniques accessibles) et la redistribution des sites antigéniques à la surface de l'hématie. Mais ces enzymes détruisent aussi d'autres antigènes des hématies (antigènes FY en particulier) et ne permettent donc pas de mettre tous les anticorps en évidence. Par contre cette technique est très sensible pour mettre en évidence les anticorps des systèmes Rhésus, P1, et Lewis (CHABERT et al., 1997). Chaque enzyme est ainsi plus ou moins adaptée à la recherche de certains anticorps.

• Enfin, la technique à l'antiglobuline permet de mettre en évidence, de façon spécifique, la présence d'un anticorps fixé sur une hématie. Au premier anticorps fixé sur l'antigène de groupe sanguin, anticorps incapable de diminuer suffisamment à lui seul le potentiel zêta du globule, on ajoute des immunoglobulines animales qui reconnaissent l'immunoglobuline fixée et viennent y adhérer (d’où le nom d’antiglobuline). La masse moléculaire de l'ensemble du complexe fixé sur l'antigène augmentant d'autant, l'agglutination peut avoir lieu.

La réaction d’agglutination comporte deux étapes : la fixation de l’anticorps à

son antigène spécifique qui a toujours lieu et l’agglutination des hématies sensibilisées par les anticorps qui ne se produit pas systématiquement. La réaction d’agglutination fait intervenir plusieurs facteurs que sont : la classe d’immunoglobuline de l’anticorps, la concentration en anticorps, le nombre de sites antigéniques à la surface des hématies et leur localisation, la température, le pH et le potentiel ζ.

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L’agglutination directe des hématies concerne essentiellement les IgM, mais toutes n’en sont pas capables. Un petit nombre d’IgM peuvent ainsi réagir comme des anticorps incomplets en s’éluant à 37°C. Cependant leur responsabilité peut être indirectement reconnue car les hématies porteuses d’IgM fixent de façon irréversible la fraction C3 du complément. C’est pourquoi l’antiglobuline doit pouvoir réagir lorsque les globules rouges présentent des protéines du complément (essentiellement C3) à leur surface.

B) Immunoglobuline G et complément

1 Le complément

Le système du complément est un ensemble de protéines membranaires ou circulantes. Leur rôle initialement reconnu était de compléter l'action des immunoglobulines sériques, d'où leur nom. Lors des étapes précoces d’une infection, la cascade du complément peut être activée via trois voies distinctes. Chacune de ces voies présente une séquence de réactions menant à l’activation d’une protéase appelée “ C3 convertase ”. Ces réactions consistent en une activation séquentielle de protéases dans laquelle un zymogène (précurseur de pleine longueur) est clivé en deux fragments : un long ; qui est une protéase à sérine active (codé avec l’indice b) et un court qui joue le rôle de médiateur soluble (codé avec l’indice a).

Les différentes voies (classique et alterne) activant le complément aboutissent donc à la formation d'une C3 convertase, point de départ de la voie effectrice commune qui détruit la cible en formant un canal transmembranaire, permettant l'entrée de molécules d'eau dans la cellule. Les principales protéines du complément sont numérotées de C1 à C9 (BACH, 1993; BERZOFSKY et al., 1993; PAUL, 1993).

Le système du complément possède plusieurs fonctions importantes : la cytolyse d'une

cellule ou d'un agent pathogène, l'activation du système immunitaire par les petits fragments de clivage pro-inflammatoires, l'opsonisation de certains agents permettant leur phagocytose, et le métabolisme des complexes immuns circulants grâce aux récepteurs des fragments du complément.

Deux voies possibles d’activation du complément existent : la voie classique et la

voie alterne (figure 7).

(a) Voie classique et voie des lectines

La voie classique est activée par le complexe antigène-anticorps. Seules les IgG1, IgG3, les IgM, et faiblement les IgG2 sont capables d'entraîner la cascade des évènements. La fixation de deux ou plusieurs immunoglobulines d'IgG ou une molécule d'IgM pentamérique, à la surface d'un micro-organisme, permet à leur région Fc de fixer le premier composant de la voie classique : C1. C1 est un gros complexe, composé de trois sous composants: C1q, C1r et C1s. Quand C1q lie le complexe antigène-anticorps, il active C1r, qui devient protéolytique, et clive C1s pour amorcer la cascade de protéolyse.

La voie des lectines est initiée par la protéine de liaison du mannose ou MBP (Mannan Binding Protein). En effet le mannose est un sucre présent sur de nombreuses molécules membranaires des bactéries ou virus.

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Dans ces deux voies, la C3 convertase est formée à partir des molécules C4b et C2b fixées à la membrane, C4 et C2 ayant été clivés par le complexe C1 de la voie classique ou le complexe MBP (Mannose Binding Protein) de la voie des lectines.

(b) La voie alterne

La voie alterne du complément est initiée par des composants qui s’activent spontanément à la surface des agents infectieux. La protéine C3 possède la particularité de se cliver spontanément, donnant le facteur C3b qui se lie au facteur B. Dans la voie alterne, la C3 convertase est formée par les facteurs C3b complexés à Bb. Bb est issu du clivage du facteur B par une protéase plasmatique, le facteur D.

Les C3 convertases clivant C3 en C3b et C3a ; la voie alterne peut ainsi servir de boucle d’amplification à toutes les voies.

Le C3b est le principal effecteur et agit comme une opsonine en se liant de façon covalente à l’agent pathogène afin de permettre une destruction par les phagocytes équipés du récepteur au C3b. Le C3a est un médiateur de l’inflammation.

Le C3b peut se lier à la C3 convertase afin de former une C5 convertase produisant à

partir du C5, le C5a, le plus important médiateur de l’inflammation et le C5b qui initie les événements tardifs de l’activation du complément. Ces événements tardifs correspondent à une séquence de réactions de polymérisation dans laquelle les composants terminaux du complément interagissent afin de former le complexe d’attaque membranaire (C5b, C6, C7, C8 et C9). Ce complexe est capable de créer un pore dans la membrane des cellules des micro-organismes pouvant mener à leur destruction.

L’activation du complément nécessite la présence dans le milieu de tous les

composants du complément, de calcium et de magnésium ionisé (d’où l’impossibilité d’une activation du complément lorsque le sang est prélevé sur EDTA qui chélate ces ions).

L’hémolyse in vitro est liée à la réaction antigène-anticorps, puis à l’activation de la voie classique du complément jusqu’à C9, aboutissant à des lésions membranaires et à la lyse des hématies.

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Figure 7 : Voies classique et alterne d'activation du complément, d’après (TIZARD,

2004). Le système du complément est constitué d’environ 25 protéines qui complètent l’action des anticorps

dans la défense immunitaire. Les facteurs du complément circulent sous forme inactivée dans le sang. Lorsque la première protéine du complément est activée (par un antigène se liant à un anticorps par exemple) la cascade enzymatique s’active. Le produit final est un cylindre de protéines s’enchâssant dans la membrane cellulaire.

Sous l’action des fluides et des molécules entrant ou sortant de la cellule, celle-ci éclate.

2 Complément et hématies

Il est assez rare de trouver des IgG et/ ou des protéines du complément sur les surfaces membranaires des hématies saines. Si l’on considère des hématies normales (c'est-à-dire des hématies pour lesquelles le test à l’antiglobuline s’est révélé être négatif) on peut compter entre 5 et 90 molécules d’IgG par hématie, avec une moyenne de 39 immunoglobulines G (MERRY et al., 1982). Le nombre de protéines du complément C3 par globule rouge varie bien plus. On peut ainsi en compter entre 5 et 560 par hématie (ROSENFIELD & JAGATHAMBAL, 1978; MERRY A.H. et al., 1983) .

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Pour 1000 IgG liées, on observe une hémagglutination complète. Pour seulement 100 molécules d’IgG ou 100 molécules du complément par hématie, il arrive que le test direct à l’antiglobuline soit faiblement positif (FISHER et al., 1974; MERRY A.H. et al., 1984). C’est pourquoi, certains individus sains présentant des molécules du complément ou des IgG sur leurs membranes érythrocytaires, peuvent induire des résultats faussement positifs.

Il a été suggéré que la présence de ces molécules pouvait être également un signal

moléculaire permettant l’apoptose des hématies sénescentes (KAY, 1975; CHRISTIAN et al., 1993). En effet, ces auteurs ont découvert que les érythrocytes n’étaient lysés qu’en présence d’IgG, et que les hématies jeunes n’étaient que très peu recouvertes d’immunoglobulines, alors que les érythrocytes plus âgés en présentaient un nombre plus important. Cela indiquerait donc que les IgG, fixées in situ sur les globules rouges les plus âgés, les rendent plus vulnérables à la phagocytose par les macrophages. Bien qu’une corrélation entre la quantité de molécule du complément ou d’IgG fixées sur les hématies et leur lyse puissent être établie, il est certain que d’autres facteurs interviennent dans l’activation du complément après fixation des anticorps sur la membrane érythrocytaire. On peut ainsi citer la classe ou sous-classe d’immunoglobuline (IgM >> IgG3 > IgG1), le type de liaison entre les hématies et le complément et l’activité des macrophages (activation jusqu’au C3b) (GARRATTY, 1987)

A présent que l’essentiel de la réaction antigène-anticorps a été détaillé; le principe du

test de Coombs peut être abordé. Deux tests sont utilisés tant en médecine humaine qu’en médecine vétérinaire : le test

direct à l’antiglobuline (test de Coombs direct ou TCD) et le test indirect à l’antiglobuline (test de Coombs indirect ou TCI).

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III. Tests de Coombs : définition et principe

A) Le test de Coombs direct à chaud

1 Définition

Le test de Coombs direct ou test à l’antiglobuline spécifique d’espèce met en évidence d’éventuels anticorps fixés sur les globules rouges et susceptibles d’entraîner leur destruction.

Il vise à créer une agglutination des hématies du malade, réaction par ailleurs facile à observer en laboratoire.

En pratique, c’est la méthode de référence dans le diagnostic des Anémies Hémolytiques à Médiation Immune (AHMI) chez l’homme, le chien et le chat. Il démontre en effet la sensibilisation des hématies soit par une immunoglobuline, soit par le complément, soit par les deux (CHABANNE, 2004; TIZARD, 2004).

2 Principe de réalisation du test de Coombs direct

Il s’agit d’une réaction antigène-anticorps d’agglutination artificielle qui fait intervenir des antigènes particulaires et des anticorps. Les antigènes particulaires représentés par les hématies, sensibilisées ou non, sont des particules figurées, c'est-à-dire non solubles et observables en microscopie optique.

Les anticorps sont en fait des anticorps anti-anticorps ou antiglobuline. Comme nous l’avons vu, l’agglutination est un phénomène complexe, qui conduit à la

formation d’un réseau constitué d’éléments initialement libres. Ces éléments figurés, ici les hématies, se retrouvent unis les uns aux autres par les molécules d’anticorps pour former des agglutinats visibles à l’œil nu (f igure 8).

Il faut se souvenir que cette agglutination artificielle ne se réalise que pour les

anticorps incomplets, revêtants mais non agglutinants. Les anticorps complets ou agglutinants, réalisent, eux, une agglutination spontanée sur lame.

Le test se décompose en deux phases qui correspondent aux deux étapes de l’agglutination. Au cours de la première phase, on observe la f ixation spécifique des anticorps sur leurs sites antigéniques ; il s’agit donc de l’étape de sensibilisation des hématies. Dans la deuxième phase, si les conditions expérimentales le permettent, il y a formation des agglutinats.

Cette deuxième phase, dépendant de nombreux paramètres, explique pourquoi il est important de bien respecter les conditions expérimentales. De ce fait un lavage mal réalisé, une température d’exécution non respectée ou une quantité d’antiglobuline trop importante, peuvent provoquer l’apparition de faux-négatifs.

- 36 -

Antiglobulines : immunoglobulines de

lapin anti-immunoglobulines de

chien

Hématies sensibilisées de chien

Agglutination : test de Coombs direct

positif

Figure 8 : Principe de réalisation du test de Coombs direct à chaud, d’après

CHABANNE, 2004).

3 Production de l’antiglobuline

Le réactif "antiglobuline" spécifique d’espèce est obtenu par immunisation d'un animal (un lapin ou une chèvre par exemple) par un sérum humain, canin, félin ou équin. Ce sérum contient les immunoglobulines (IgG, IgM) ou des facteurs du complément issus de l’espèce pour laquelle on veut utiliser le réactif et il est injecté de manière régulière, à intervalle de temps précis (généralement une fois par semaine pendant cinq semaines) à l’animal choisi. Pour le lapin ou la chèvre, ces immunoglobulines sont antigéniques, et de ce fait ils synthétiseront des anticorps de lapin ou de chèvre anti-"immunoglobulines humaines, canines, félines ou équines" (figure 9). Une semaine après la dernière injection, l’animal est saigné et le sérum est isolé par centrifugation. C’est ainsi qu’est obtenu un sérum de lapin ou de chèvre anti-immunoglobulines humaines, canines, félines ou équines. Cette antiglobuline, d'origine animale, se f ixe donc spécifiquement aux épitopes isotypiques des immunoglobulines humaines, canines, félines ou équines.

- 37 -

Figure 9 : Production de l’antiglobuline, d’après (CHABANNE, 2004).

Le réactif était primitivement polyspécifique (anti-IgG, anti-IgM, et anti-C3), puis

des réactifs monospécifiques ont été développés, afin de reconnaître spécifiquement une classe d'immunoglobulines, IgG, IgA, IgM, ou des fractions du complément, C4, C3b et C3d susceptibles d'être fixées sur les érythrocytes. Certains produits vétérinaires sont bispécifiques (IgG et C3d).

Ces réactifs peuvent être préparés soit par des techniques polyclonales, soit par des

techniques monoclonales (PAUL, 1993; MOULDS, 2006). Les anticorps polyclonaux sont un mélange d'anticorps reconnaissant différents épitopes sur un antigène donné, chaque idiotype étant sécrété par un clone de plasmocyte (cellules sécrétrices d'anticorps) différent. Au cours de la réponse immunitaire, un organisme synthétise des anticorps dirigés contre plusieurs épitopes d'un antigène : la réponse est dite polyclonale. In vivo, la réponse est toujours polyclonale, sauf cas exceptionnels. Les techniques de production polyclonales sont plus faciles à mettre en place mais elles varient d’un lot à l’autre et sont également peu adaptées aux productions massives. Les techniques monoclonales sont plus difficiles à mettre en œuvre mais sont plus stables et reproductibles. En effet, les anticorps monoclonaux sont des anticorps ne reconnaissant qu'un seul type d'épitope sur un antigène donné. Ils sont par définition tous identiques et produits par un seul clone de plasmocyte. La production d'anticorps monoclonaux in vitro a longtemps été rendue difficile en raison de la faible durée de vie des plasmocytes. Les anticorps étaient alors obtenus in vivo en injectant chez l'animal un antigène donné et en recueillant les anticorps dans le sang. Cette méthode était très coûteuse, donnait des anticorps en faible quantité et pollués par de nombreuses impuretés. Une avancée majeure a été faite à la fin des années 1970 par César Milstein et Georges Köhler avec la technique des hybridomes. L'antigène est injecté chez l'animal (rat ou souris), et des cellules de la rate sont prélevées au bout de quelques semaines. Parmi ces cellules se trouvent

Sérum isolé par centri fugation

Antiglobuline de lapin anti

immunoglobuline de chien

Production d’anticorps par le lapin

Immunoglobulines canines

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des plasmocytes sécrétant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène choisi. Les plasmocytes sont alors fusionnés in vitro avec des cellules de myélomes, qui sont des cellules tumorales ayant la propriété de se multiplier indéfiniment. Les cellules hybrides ainsi obtenues sont appelées hybridomes et, après sélection et multiplication dans un milieu de culture approprié, produisent des anticorps monoclonaux, très purs et en quantités importantes.

Les réactifs sont par la suite vendus sous formes lyophilisées ou diluées. En médecine vétérinaire des réactifs polyspécifiques pour les espèces canines, équines

et félines sont commercialisées. Pour l’espèce féline des réactifs monospécifiques sont disponibles.

B) Test de Coombs à froid : cas particulier des anticorps froids

Son principe est identique à celui du test de Coombs direct mais on cherche ici à mettre en évidence des anticorps ayant une activité à froid et ayant tendance à s’éluer spontanément à 37°C (classe IV ou V).

Après réception du prélèvement, les hématies sont conservées pendant 12 heures à 4°C

puis lavées à froid (milieu salin à 4°C et centrifugations réfrigérées). Enfin l’incubation des hématies avec l’antiglobuline à lieu à 4°C.

Il est important de noter que l’interprétation de la présence d’anticorps froids fait l’objet de nombreuses discussions.

C) Test de Coombs indirect

1 Principe

Il existe parallèlement à la présence d’anticorps fixés à la surface des hématies des anticorps libres dans le sérum.

Le principe du TCI est de détecter des auto-anticorps anti-globule rouge, libres dans le sérum du patient ou dans un éluat préparé à partir de ces globules rouges (technique d’élution-fixation, voir page 76 de ce travail) en les incubant avec des globules rouges normaux (DAY, 2000). Comme pour le TCD, cette méthode est basée sur la capacité de l’antiglobuline à agglutiner les globules rouges de chiens sains, ceux-ci ayant au préalable été incubés avec les auto-anticorps contenus dans le sérum du malade.

2 Réalisation

Le sang du patient est prélevé sur tube sec puis centrifugé ce qui permet de récupérer son sérum. Le sérum du patient prélevé est mis en contact avec les hématies d’un donneur sain. Ces hématies sont alors sensibilisées par les auto-anticorps présents dans le sérum. La

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Sérum du chien contenant les immunoglobulines

circulantes

Ajout des hématies d’un

donneur de même groupe

sanguin

Ajout de l’antiglobuline

Agglutination : test de Coombs indirect positif

procédure est ensuite la même que celle du test direct ; des lavages sont réalisés et le sérum est mis en solution avec des antiglobulines. S’il y a agglutination, c’est que le sérum contenait des auto-anticorps et le test est positif (figure 10) (SLAPPENDEL, 1986).

Les alloanticorps anti-antigène de groupes sanguins peuvent aussi générer une

réaction positive. Chez les chiens les alloanticorps « naturels » sont rares et présents dans tous les cas en titre faible ; aussi ils interfèrent peu. Il en va différemment dans les espèces féline et équine ainsi que chez les chiens transfusés où ce test ne peut être appliqué que si l’on a des hématies saines de même groupe sanguin que celles de l’animal malade (CHABANNE, 2004).

Ce test est souvent utilisé en médecine humaine lors de transfusion sanguine. En effet

il permet de détecter la présence d’anticorps incomplets éventuellement présent dans le sérum d’un patient et dirigés contre les globules rouges du donneur (American Association of Blood Banks Technical Manual Comittee, 2002b).

Cette procédure peut être améliorée par l’utilisation d’agents permettant d’augmenter l’agglutination et/ ou de diminuer le temps d’incubation (milieu basse force ionique (BFI), albumine, polyéthylène glycol (PEG) (MAN & OVERBREEKE, 1990; American Association of Blood Banks Technical Manual Comittee, 2002a).

Le test de Coombs indirect est beaucoup moins souvent utilisé en médecine

vétérinaire qu’en médecine humaine. La plupart du temps il est utilisé en cas de résultat positif au TCD, car il améliore sa spécificité en détectant des auto-anticorps.

Quelques laboratoires vétérinaires l’utilisent pour réaliser les tests de compatibilités majeures. On lui reproche cependant un manque de sensibilité.

Figure 10 : Principe du test de Coombs indirect, d’après (SLAPPENDEL, 1986).

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Le test de Coombs direct permet donc de mettre en évidence la présence d’anticorps

anti-érythrocytaires (IgG et/ou IgM) ou de fractions du complément à la surface des hématies. Il est particulièrement utilisé pour détecter les Anémies Hémolytiques à Médiation Immune (AHMI) ou pour éviter des réactions d’hémolyse lors de transfusion sanguine.

Le test de Coombs indirect détecte les anticorps anti-érythrocytaires libres dans le

plasma ou le sérum. Il est utilisé notamment pour la détermination des groupes sanguins (système ABO et Rh). En médecine vétérinaire ce test est utile dans la réalisation des tests de compatibilité majeure ou dans la recherche d’un phénotype érythrocytaire particulier.

Les indications du test de Coombs direct à chaud sont détaillées dans la partie

suivante.

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IV. Indications du test de Coombs en médecine vétérinaire

Les premières utilisations du test de Coombs en médecine vétérinaire sont rapportées

par Coombs lui-même. Miller et ses collaborateurs (MILLER et al., 1954) ont été les premiers à utiliser ce test

chez le chien. Peu de temps après Lewis en fait une utilisation similaire (LEWIS et al., 1963). En 1973, un test à l’antiglobuline direct positif est utilisé chez un chat par Scott et ses collaborateurs (SCOTT et al., 1973). Ils remarquèrent ainsi que le faible nombre de test de Coombs direct positif concernant les chats était très certainement du à l’utilisation de réactifs non spécifique d’espèce.

En ce qui concerne les chevaux, une étude a permis de révéler la présence de protéines du complément sur les membranes érythrocytaires lors d’anémie infectieuse équine touchant les poneys. Les scientifiques ont utilisé un anticorps anti-C3 non commercialisé (McGUIRE et al., 1969). Ils concluaient alors que l’hémolyse observée lors de cette maladie virale, était probablement à médiation immune. Quelques autres études concernant la recherche d’AHMI par l’intermédiaire du test à l’antiglobuline suivirent (LOKHORST & BREUKINK, 1975; MESSER & HARNOLD, 1991). C’est ainsi que le test a été utilisé comme aide au diagnostic lors d’anémie hémolytique néonatale chez les poulains, mais également chez les nouveaux nés dans d’autres espèces (STORMON, 1975).

De nos jours, en médecine vétérinaire, le test de Coombs est indiqué lors :

• du diagnostic des anémies suspectes d’une origine immunologique, notamment lors d’anomalies du frottis sanguin, telles que la sphérocytose, ou d’images d’érythrophagocytose. Si l’anémie est d’origine hémolytique il faut écarter l’origine parasitaire (comme la babésiose), et exclure d’autres causes d’hémolyses (notamment après lecture du frottis et visualisation de corps de Heinz ou d’anomalies érythrocytaires d’origine corpusculaires) ;

• du suivi du traitement des anémies immunologiques; • de la conduite diagnostique et pronostique des maladies auto-immunes

systémiques comme le lupus érythémateux systémique.

A) Diagnostic des anémies suspectes d’une origine immunologique

Les AHMI ont été observées le plus souvent chez l’homme et le chien, mais aussi chez le cheval et le chat, plus rarement chez le veau (FENGER et al., 1992). Elles sont caractérisées par la présence d’anticorps se fixant sur les hématies et induisant un processus pathologique qui aboutit à la destruction des globules rouges. Il est donc intéressant de pouvoir détecter ces anticorps.

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1 Définition

Le terme « anémie » est utilisé pour désigner une baisse de la concentration d’hémoglobine dans le sang circulant au-dessous de 12 g / 100 mL chez le chien, accompagnée d’une diminution de la capacité de transport en oxygène.

Les anémies peuvent être périphériques, c'est-à-dire dues à un excès de pertes des

hématies, par hémorragie ou par hyperhémolyse, ou elles peuvent être la conséquence d’une diminution de la production médullaire et sont qualifiées alors d’anémies centrales.

Les anémies immunologiques ou « à médiation immune » sont des anémies

caractérisées par la présence d’anticorps à la surface des hématies ou des précurseurs érythropoïétiques.

Les anticorps sont le plus fréquemment présents sur un déterminant antigénique du globule rouge circulant c'est-à-dire sur les hématies matures. Les anémies immunologiques sont donc la plupart du temps des anémies périphériques par hyperhémolyse.

Les anticorps présents à la surface des érythrocytes sont à l’origine de leur destruction, soit directement par activation du complément avec pour conséquence une hémolyse intravasculaire, soit beaucoup plus souvent par la reconnaissance des hématies sensibilisées par les phagocytes dans différents organes, en particulier le foie et la rate, à l’origine d’une hémolyse extravasculaire.

2 Classification des anémies hémolytiques à médiation immune

Par définition, les AHMI sont des réactions d’hyperhémolyse faisant intervenir des anticorps dirigés contre les propres hématies du malade. Ce sont donc des réactions immunologiques d’hypersensibilité de type II.

(a) Classification selon l’origine de l’anémie

Les anémies immunologiques sont qualifiées de primaires ou idiopathiques lorsqu’ aucune cause sous-jacente ou maladie associée ne peut être identifiée (cas le plus courant chez le chien : 60 à 75 p. cent des cas d’AHMI), au contraire elles sont dites secondaires quand elles accompagnent ou se développent parallèlement à un autre processus pathologique (cas fréquemment rencontré dans l’espèce féline) (tableau 2). Les AHMI secondaires représentent 25 à 40 p. cent des cas d’AHMI chez le chien. Elles précèdent, accompagnent ou suivent une autre maladie qui est parfois peu exprimée cliniquement, mais qu’il convient toujours de rechercher. En effet le pronostic, le traitement et l’efficacité de celui-ci dépendent de la cause primitive de l’AHMI. En France, la piroplasmose est la maladie la plus fréquemment associée à une AHMI : 50 p. cent des cas d’AHMI lui serait ainsi imputés (PERSON et al., 1988).

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Néoplasie • Lymphosarcome

• Leucose lymphoïde • Leucose myéloïde • Myélome • Hémangiosarcome • Carcinome

Maladies auto-immunes • Lupus érythémateux disséminé • Polyarthrite rhumatoïde

Maladies parasitaires • Dirofilariose • Babésiose (piroplasmose) • Leismaniose

Maladies infectieuses • Infection par le FeLV, le virus de la PIF • Bronchopneumonie • Haemobartonellose • Erhlichiose

Médicaments • Thrimétoprime /sulfamide • Pénicillines • Céphalosporines • Lévamisole (chien) • Propylthiouracil (chat) • Méthimazole (chat) • Anti-inflammatoires non stéroïdiens

(phénylbutazone) • Dipyrone • Quinine et quinidine • Chlorpromazine • Vaccins • Piqûre d’abeille

Tableau 2 : Maladies associées à une anémie hémolytique à médiation immune chez le chien et le chat, d’après (WERNER, 1980).

(b) Classification selon l’antigène impliqué dans l’anémie immunologique

La classification précédente ne préjuge pas du mécanisme pathogénique à l’origine de l’anémie, mais seulement de l’existence ou non d’une affection intercurrente. Cette classification pratique est à l’origine de confusion avec une classification d’avantage basée sur le mécanisme pathogénique (tableau 3).

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Mécanisme Antigène cible Dénomination Etiologie associée

Auto-immun

Antigène

érythrocytaire normal (auto-

antigène)

-AHAI idiopathique -AHAI secondaire

? • Maladies auto-immunes (LES)

• Autres affections (hémopathies malignes…)

• Rares médicaments (alpha méthyl-dopa)

Immun secondaire ou

immuno-allergique

Antigène

érythrocytaire étranger

ou complexe immun

(xéno-antigène)

-AH post-infectieuse -AH immuno-allergique -AH paranéoplasique

-Maladie virale, bactérienne ou parasitaire -Médicaments -Affections tumorales

Allo-immun

Antigènes de

groupes sanguins (allo-antigène)

-Maladie hémolytique néonatale -AH post-transfusionnelle

Tableau 3 : Classification pathogénique des anémies immunologiques (DAY, 1998).

Ainsi, les anémies immunologiques primaires ou idiopathiques sont le plus souvent

assimilées à des anémies hémolytiques auto-immunes alors que la présence d’auto-anticorps anti-hématies n’est pas forcément démontrée. Or une anémie immunologique auto-immune (AHAI) sensu stricto résulte de la reconnaissance par les anticorps (auto-anticorps) d’un antigène normal (auto-antigène) sur la surface de l’hématie (ROITT et al., 1998). Inversement un mécanisme auto-immun peut être prouvé dans un certain nombre d’anémies immunologiques secondaires, par exemple lors de lupus érythémateux systémique (LES).

Les anémies immunologiques secondaires ou immuno-allergiques sont dues à la

reconnaissance par les anticorps d’un antigène qui n’appartient pas à la membrane érythrocytaire normale (DODDS, 1983). L’organisme produit alors normalement des anticorps contre cet élément étranger. L’antigène reconnu peut être : un xéno-antigène (médicament ou antigène infectieux (PERSON et al., 1988)) fixé sur l’hématie, un néo-antigène (un déterminant antigénique du globule rouge modifié par l’action d’une maladie intercurrente ou d’un médicament (STEP et al., 1991)), un antigène cryptique (un antigène auparavant caché ou séquestré se retrouvant exposé suite à une modif ication membranaire) ou un complexe immun adsorbé à la surface de l’hématie (f igure 11).

Enfin l’allo-immunisation est à l’origine d’anémies immunologiques allo-immunes

dans le cadre particulier des incompatibilités néonatales ou transfusionnelles.

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Figure 11 : Représentation schématique du mécanisme de fixation des anticorps sur l’hématie lors d’AHMI, d’après (DAY, 1999).

3 Nature du revêtement anticorps

Les anticorps formés lors des AHMI sont des immunoglobulines G ou des immunoglobulines M, ayant une fonction agglutinante ou hémolytique (CHABANNE & FOURNEL, 1994; PELLERIN et al., 1994). La plupart des AHMI sont médiées par des IgG, rarement par des IgM (JAIN, 1973; SLAPPENDEL, 1979). Des taux très faibles d’agglutinines froides (IgM) peuvent être retrouvées naturellement chez l’homme, le chien, le cheval, sans conséquence clinique.

Une classification des anémies immunologiques peut être ainsi définie en tenant

compte du comportement thermique (froid ou chaud), de la classe (IgG ou IgM) et de la fonction des anticorps (agglutinante ou hémolytique) (tableau 4).

Hématie

Auto-immune

Allo-immune

Antigène étranger fixé sur l’hématie

Modification de l’antigène normal par fixation d’un haptène

Révélation d’antigènes masqués

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Cla

sse Nom des

anticorps Classe d’Ac.

Complé-ment

Diagnostic Site de destruc-

tion majeur

Commen-taires

Critères biologiques

I Auto-agglutinine

IgG (IgM)

- Agglutina-t ion

spontanée

Extra vasculaire

Evolution suraiguë Pronostic grave

Agglutina-t ion spontanée à + 37°C

II Hémoly-sine

IgM (IgG)

C1-C9 TCD à 37°C Intra vasculaire

Aigue ou suraiguë Anémie sévère Hémoglo-binémie Hémoglo-binurie

TCD posit if à + 37°C

III Anticorps incomplet

IgG C1-C3b TCD à 37°C Extra vasculaire

(rate)

Aigue ou chronique Le plus fréquent

TCD posit if à + 37°C

IV Aggluti-nine froide

IgM (IgG)

C1-C3b Agglutina-t ion

spontanée à 4°C

Extra vasculaire

(foie)

Chronique Cyanose Extrémités nécrosées (doigts, nez, oreilles)

Agglutina-t ion spontanée à + 4°C

V Hémoly-sine froide

IgM (IgG)

C1-C9 TCD à 4°C Intra vasculaire

Chronique Hémolyse à froid

TCD posit if à + 4°C

Tableau 4 : Classification des AHMI, d’après (STEWART & FELD MAN, 1993; PELLERIN et al., 1994).

(a) Site de destruction des hématies selon les anticorps impliqués

L’hémolyse des globules rouges est le plus souvent extravasculaire. En effet les IgG sont des immunoglobulines monomériques (elles ne possèdent que deux sites de liaisons antigénique), de ce fait elles ne peuvent provoquer l’agglutination cellulaire de façon spontanée (excepté s’il existe un grand nombre d’anticorps). Ce sont donc les macrophages possédant des récepteurs pour la fraction Fc des immunoglobulines qui vont lyser les globules rouges. Cette lyse par les macrophages est réalisée lors de leur passage dans les tissus riches en cellules phagocytaires : la rate primairement puis le foie lorsque la production d’immunoglobulines devient importante et que les hématies sont recouvertes par un grand nombre de ces molécules. Ceci explique la splénomégalie et l’hépatomégalie souvent observées lors d’AHMI.

Les facteurs du complément peuvent également être présents à la surface de la membrane du globule rouge et provoquer une hémolyse aussi bien intra- qu’ extravasculaire. S’ils ne sont activés que jusqu’au stade C3b, l’hémolyse sera extravasculaire et on pourra

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observer des sphérocytes sur le frottis sanguin. Ceux-ci sont plus ‘rigides’ que les globules rouges sains et seront détruits par le foie ou la rate.

Notons que les globules rouges porteurs d’IgG seules ou d’IgG associées au C3b sont lysés plus souvent dans la rate alors que les globules rouges porteurs de C3b et / ou d’IgM sont lysés préférentiellement dans le foie (Mc CULLOUGH, 2003).

Lors d’hémolyse intravasculaire (BARKER & ELSON, 1993), plus rare,

l’ensemble des facteurs du complément sont activés et provoquent la lyse de la membrane érythrocytaire. Cette hémolyse s’explique par l’activation de la voie classique du complément. Les IgM, pentamériques, provoquent l’agglutination des hématies et fixent le facteur C1 du complément, d’où l’activation de la cascade du complément et la destruction des hématies. L’importance de l’hémolyse est fonction du taux d’anticorps circulant, de leur amplitude thermique, de leur attachement à la surface des globules rouges et du degré d’activation du complément. Ainsi ces réactions peuvent être induites par un petit nombre d’IgM, mais nécessites par contre une forte densité d’IgG pour permettre la fixation du composant C1 du complément (PELLERIN et al., 1994).

Les hématies opsonisées pourraient être détruites par cytotoxicité directe par les

cellules NK (Natural Killer) qui possèdent un récepteur pour la fraction Fc des IgG (PELLERIN et al., 1994). Des études récentes ont montrées que le stress oxydatif pouvait également jouer un rôle dans la pathogénie ou la progression des AHMI (PESILLO et al., 2002).

La voie de destruction des érythrocytes dépend donc de nombreux facteurs comme la

sous-classe des anticorps, leur affinité, leur titre, leur comportement thermique, leur capacité à activer ou non le complément et à activer le système phagocytaire.

Les anticorps sont également « classés » et selon leur classe il est possible d’expliquer

l’évolution aiguë ou suraiguë de la maladie mais aussi d’évaluer la réponse au traitement.

(b) Classes des anticorps

Les anticorps chauds sont divisés en trois classes :

• La classe I regroupe les anticorps capables de provoquer l’auto-agglutination des globules rouges. Il y a ensuite phagocytose des agglutinats et donc hémolyse extravasculaire. Il peut s’agir d’IgG en grande quantité ou d’IgM en faible quantité. On observe dans ce cas une agglutination sur lame (HALLIWELL, 1978). Le plus souvent il s’agit d’une anémie sévère, aiguë voire suraiguë et le pronostic est par conséquent réservé.

• La classe II est constituée des hémolysines, capables de f ixer le complément et donc de provoquer également une hémolyse intra-vasculaire. Classiquement il s’agit d’IgM, mais les IgG peuvent également avoir le même rôle si elles sont présentent en grande quantité (STEWART & FELDMAN, 1993). Le test de Coombs est ici nécessaire pour les détecter car il n’y a pas d’auto-agglutination visible (HALLIWELL, 1978).

• La classe III concerne les anticorps les plus souvent impliqués dans les AHMI chez le chien car ils provoquent une hémolyse extravasculaire. Le test de

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Coombs est alors nécessaire au diagnostic et c’est à ce titre qu’il a sa plus grande utilité car cette classe regroupe les anticorps incomplets (STEWART & FELDMAN, 1993). Ils provoquent une affection chronique.

Les anticorps froids réagissent plus fortement à des températures basses (+ 4°C) qu’à

des températures élevées. Leur pouvoir pathogène dépend donc de leur amplitude thermique. Il faut différencier les agglutinines froides qui ne se f ixent sur les globules rouges

qu’entre 10 et 15°C et qui sont donc inoffensives, des auto-anticorps actifs jusqu’à des températures de 30°C qui eux peuvent être associés à la maladie des hémagglutinines froides car la température dans la circulation périphérique peut descendre sous les 30°C. Ils entraînent alors une agglutination intravasculaire dans les vaisseaux de petit calibre provoquant une nécrose ischémique (HALLIWELL, 1978). Si la cascade du complément est activée et aboutit au complexe d’attaque membranaire, une hémolyse intravasculaire est possible.

Les anticorps « froids » sont essentiellement des IgM . Ils sont divisés en deux classes ; IV et V :

• La classe IV est constituée des agglutinines froides provoquant l’agglutination à des températures inférieures à 37°C et donc une agglutination spontanée sur lame à 4°C. Ces agglutinines sont inoffensives car elles ne se fixent sur les hématies qu’à des températures comprises entre 10 et 15°C, incompatibles avec la vie. Elles sont retrouvées naturellement dans le sérum de nombreux animaux normaux (SLAPPENDEL, 1979; WERNER & GORMAN, 1984).

• La classe V regroupe les hémolysines froides qui peuvent induire la destruction des globules rouges sans qu’aucune agglutination ne survienne. Le test de Coombs direct à froid est alors nécessaire car il n’y a pas d’agglutination sur lame.

(c) Isotype de l’anticorps et clinique

Les AHMI les plus souvent rencontrées sont dues à l’action des IgG, seules ou associées au complément.

• Lorsque l’IgG est présente sur les globules rouges, avec ou sans complément

(classe I et III), la maladie est le plus souvent idiopathique, aigue et transitoire. L’évolution clinique se fait par poussées successives d’hémolyses, parfois sévères, et de rémissions. Ces formes à IgG répondent bien à la thérapeutique par les corticostéroïdes, et ne sont généralement pas secondaires à une maladie sous-jacente.

• En revanche lorsqu’il s’agit d’une forme à IgM (classe II, IV et V), la maladie

est moins sensible au traitement par les corticostéroïdes, et le plus souvent secondaire à une maladie primaire (infectieuse, tumorale, ou autre maladie auto-immune). Ces forment peuvent être dépistées directement ou indirectement par la présence de C3b (les IgM ayant été éluée lors des lavages). Le pronostic des formes à IgM ou C3 est plus sombre que celui de formes à IgG.

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En conclusion, du fait du mécanisme pathogénique des AHMI faisant intervenir les

IgG, les IgM et / ou le complément ; le test de Coombs est tout à fait indiqué en tant qu’examen complémentaire dans le cas d’une suspicion clinique associée à un hémogramme signif icatif.

4 Diagnostic d’une anémie immunologique

Il est principalement biologique. Après confirmation de l’anémie et détermination de son caractère régénératif ou non, il est fondamental de mettre en évidence le caractère immunologique de l’hémolyse en démontrant la présence d’immunoglobulines ou de facteurs du complément f ixés in vivo à la surface des hématies du patient. Cette étape fait appel le plus souvent au test de Coombs direct. Les étapes ultérieures visent à préciser la nature et les caractéristiques des anticorps fixés à la surface des hématies en déterminant leurs isotypes et leur spécificité vis-à-vis des auto-antigènes. Des tests simples peuvent être réalisés avant le test de Coombs, qui peuvent donner une orientation diagnostique.

Certains éléments d’orientation sont des indications à la réalisation d’un test de

Coombs direct. Il s’agit de l’auto-agglutination, de particularités révélées à l’examen du frottis sanguin et de la mise en évidence d’une fragilité osmotique.

• Une auto-agglutination sur lame peut indiquer la présence d’IgM ou

d’anticorps complets. Elle peut apparaître à température ambiante (agglutinines de classe I) ou uniquement lorsque le sang est refroidi (agglutinines de classe IV).

• L’examen d’un frottis sanguin coloré permet parfois de révéler la présence de

sphérocytes. Il s’agit de petites hématies sphériques, uniformément colorées et dépourvues de zone centrale claire car elles ne sont plus biconcaves. Il s’agit d’un bon argument en faveur de l’existence d’une anémie immunologique. L’apparition de sphérocytes peut s’expliquer par l’existence d’une rigidit é membranaire liée au revêtement anticorps et comme la résultante d’une érythrophagocytose partielle. Lors de l’examen du frottis sanguin, on peut donc également observer des images d’érythrophagocytose partielles.

• La fragilité osmotique des hématies est augmentée lors d’anémie

immunologique. C’est le reflet de la présence de sphérocytes moins résistants. Un test relativement simple peut être effectué dans ce but avec du sérum physiologique à 0,54 p.cent chez le chien (3 volumes de NaCl 9 p. mille et 2 volumes d’eau distillée) : 5 gouttes de sang prélevée sur EDTA sont mises en solution dans 5 mL de la solution. Après incubation pendant 5 minutes puis centrifugation, on constate une hémolyse dans 85% des cas lors d’anémie immunologique chez les carnivores.

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B) Intérêt du test de Coombs dans le suivi du traitement de l’animal

Le suivi est très important car il a une valeur pronostic non négligeable notamment dans le cas d’AHMI. Dans une étude de Michael Day (DAY, 1996) le suivi du traitement de 14 chiens anémiés a été réalisé par un suivi de l’hématocrite ainsi que de l’évolution du titre du test à l’antiglobuline. Cette étude montre que l’évolution des valeurs du test de Coombs est un indicateur de guérison important à prendre en compte.

Il est généralement admis que le contrôle d’une anémie hémolytique peut se faire par un test de Coombs. Selon Person (PERSON et al., 1988) un contrôle est conseillé deux mois après un accès aigu, afin de rechercher une éventuelle négativation, ou bien tous les deux à trois mois, lors de passage à la chronicité (PERSON et al., 1988). Le protocole utilisé à l’ENVL préconise un contrôle 10 à 15 jours après le début du traitement, à renouveler selon cette périodicité jusqu’à négativation du test de Coombs.

En effet, lorsque les critères hématologiques et cliniques sont redevenus normaux et que le test de Coombs s’est négativé, le chien peut être considéré comme guéri. Cependant il peut s’agir d’une simple rémission. Il faut être très prudent sur ce point car pour 50 p. cent des chiens rétablis il ne s’agit que d’une rémission. La conduite à tenir la plus raisonnable semble donc de surveiller régulièrement l’animal et de reprendre le traitement à la moindre alerte.

C) Conduite diagnostique et pronostique des maladies auto-immunes systémiques

Dans un certain nombre d’anémies immunologiques secondaires, il est possible de prouver l’existence d’un mécanisme auto-immun.

Ainsi le lupus érythémateux systémique est une maladie auto-immune caractérisée

par : l’atteinte de très nombreux tissus et organes, dont les articulations, les reins, la peau, les cellules sanguines, ce qui explique le tableau clinique très polymorphe de la maladie, mais aussi par la présence de nombreux signes d’auto-immunité dont les anticorps antinucléaires sériques, responsables de l’essentiel de la pathogénie par formation puis dépôts de complexes immuns circulants (CHABANNE, 2002).

Les anomalies immunitaires du LES sont caractérisées par la production d’auto-

anticorps. Parmi ceux-ci, les anticorps anti-nucléaires sont le support actuel du diagnostic biologique du LES et ce dans toutes les espèces. Les anticorps antinucléaires sont présents dans 97 à 100 p.cent des cas de lupus chez l’homme et chez le chien dans les études récentes.

Les anticorps anti-érythrocytaires peuvent aussi être détectés par des tests de

Coombs, mais ils sont rarement retrouvés par cette technique car ils ne sont présents qu’en très faible quantité et le test manque de sensibilité. Cependant l’utilisation de techniques plus sensibles que le test de Coombs devrait autoriser une utilisation du test dans ce cadre, en particulier dans les cas où il n’y a pas d’anémie hémolytique clinicalement exprimée ; enfin notons que de nombreux auteurs considèrent encore une anémie hémolytique auto-immune comme un signe de lupus alors que les anémies hémolytiques auto-immunes à test de Coombs positif sont associées à un LES dans moins de 35 p. cent des cas (CHABANNE, 2002).

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En conclusion, dans le cas d’une suspicion d’un LES, le test de Coombs n’est pas

l’examen complémentaire de choix, il permet uniquement de rechercher d’autres phénomènes auto-immuns concomitants ou secondaires à la maladie, comme une anémie hémolytique.

Le test de Coombs en médecine vétérinaire est un examen complémentaire de choi x

lors d’une forte suspicion clinique d’AHMI , mais aussi lors d’anomalies caractéristiques révélées par la lecture du frottis sanguin (sphérocytes, érythrophagocytose). Il est également un bon indicateur de l’évolution de l’anémie à médiation immune lors du suivi de l’animal malade et l’évolution de ses titres est par conséquent un facteur pronostic à ne pas négliger.

En ce qui concerne les maladies auto-immunes systémiques, il est une aide au diagnostic lorsque ces affections sont associées à une AHMI. En effet il révèle la présence effective d’un phénomène à médiation immune.

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Deuxième partie -

Le test de Coombs en pratique : présent et futur en médecine vétérinaire

Étude bibliographique

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I. Réalisation du test de Coombs direct à chaud : méthodologie

De nombreuses procédures permettant la réalisation du test de Coombs existent et

diffèrent toutes selon le laboratoire produisant le réactif. C’est pourquoi il est recommandé de suivre la notice livrée avec l’antiglobuline (figure 12, annexes 1 et 2). En médecine humaine, de nombreuses publications font état des méthodes et du type de matériel à utiliser pour réaliser un test de Coombs direct le plus sensible et le plus spécifique possible. Il existe très peu de publication vétérinaire sur le sujet.

Dans une étude publiée en 1990, Jones et collaborateurs (JONES et al., 1990) ont

analysé les différents facteurs pouvant influencer les performances du test de Coombs direct. Ils ont ainsi cherché à optimiser ce test dans l’espèce canine en utilisant une

suspension érythrocytaire diluée à 10 p.cent. Les échantillons de sang provenaient tous de chiens suspects d’anémie hémolytique à médiation immune. Les témoins positifs étaient des globules rouges canins recouverts par des IgG et des protéines du complément (C3). Les témoins négatifs étaient des hématies de chiens sains. Le réactif utilisé est un réactif polyspécifique (anti-IgG et anti-C3). Ils en ont tiré quelques données toujours d’actualité qui seront exposées dans les paragraphes suivants.

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Prélèvement et préparation des échantillons de sang. Prélever environ 4 mL de sang dans un tube sec ou un tube EDTA. Pour les échantillons devant être transportés vers un laboratoire, il est recommandé d’utiliser de préférence un tube sec. Pour les échantillons prélevés sur tube EDTA, centrifuger et séparer les hématies du plasma. Pour les échantillons réalisés sur tubes secs, ôter le sérum et casser doucement les caillots sanguins afin de remettre en suspension les globules rouges. Centrifuger et laisser décanter. Réaliser 3 lavages successifs : ajouter du PBS à l’échantillon, centrifuger durant 10 minutes et à 37°C. Retirer le sérum puis recommencer l’opération deux fois.

Prélever 0,1 mL de l’échantillon préparé et le placer dans le tube de 10 ou 12*75mm. Mettre en suspension dans 4,9 mLde solution saline classique (NaCl) ou dans une solution de type PBS (Phosphate-Buffered-Saline). Ceci permet d’obtenir 5 mL d’une suspension érythrocytaire à 2%. Afin d’éviter une dilut ion ou une neutralisation du réactif (antiglobuline) ; laisser complètement décanter le dernier lavage. Contrôle négatif : prélever un animal sain non anémié et réaliser le test.

Procédure du test Dilution du réactif de Coombs

Etiqueter trois tubes : 1/2, 1/4 et 1/8, et dans chaque tube ajouter 0,5 ml de solution saline classique. Pipetter 0,5 ml de réactif et le placer dans le tube 1/2. Bien mélanger et transférer 0,5 mL du tube 1/2 dans le tube 1/4. Transférer 0,5 mL du tube 1/4 dans le tube 1/8. Ces étapes permettent d’obtenir un réactif aux dilut ions de 1/2, 1/4 et 1/8.

Réalisation du test de Coombs Etiqueter 8 tubes : CS, C1/2, C1/4, C1/8, PS, P1/2, P1/4, P1/8. Ajouter 4 tubes pour chaque patient supplémentaire à tester. Placer 0,1 mL de la solution érythrocytaire lavée du témoin négatif, dans chaque tube de la série C. Placer 0,1 mL de la solution érythrocytaire lavée du patient, dans chaque tube de la série P. Prélever 0,1 mL de solution saline classique ou de PBS à placer dans les tubes CS et PS. Prélever 0,1 mL du sérum de Coombs dilué au 1/2, 1/4 et 1/8, et les placer respectivement dans les tubes notés C1/2, C1/4, C1/8 et P1/2, P1/4, P1/8. Mélanger doucement et laisser incuber 30 minutes à 37°C. Observer l’apparit ion d’agglutination dans les tubes. Si aucune agglutination n’est visible à l’œil nu, utiliser un microscope. Le test de Coombs peut également être réalisé sur plaque. Dans ce cas la préparation de la suspension érythrocytaire ainsi que les dilut ions du réactif sont les mêmes. Par contre les volumes de solution saline, de suspension érythrocytaire et de réactif de Coombs sont de 0,025 mL au lieu de 0,1 mL.

Interprétation Un titre important d’agglutination (comparé au témoin négatif) pour l’échantillon d’un patient indique que les hématies de ce patient sont recouvertes par des anticorps ou des protéines du complément. Le test n’est considéré posit if que si le témoin négatif ne présente pas d’agglutination ou si elle est moins importante que celle observée pour l’échantillon du patient.

Figure 12 : Exemple de méthodologie de réalisation du test direct à l’antiglobuline selon

la technique sur tube (notice d’utilisation des laboratoires MP biomedicals, Solon, OH, USA).

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A) Prélèvement de l’échantillon et conditions d’envoi

Pour la réalisation d’un test de Coombs direct on travaille sur les hématies du malade ; Il convient donc de prélever le sang veineux périphérique sur anticoagulant fixant ou complexant le calcium : EDTA (Ethylène Diamine Tetra-Acétique), ACD (Acide citrique Citrate-Dexose), ou CPD (Citrate Phosphate Dextrose).

Il est très important que le milieu contenu dans le tube soit un agent chélateur du calcium, car la présence de calcium dans le prélèvement provoque une fixation non spécifique du complément sur les globules rouges, à l’origine de réactions faussement positives. L’héparine, favorisant l’adsorption non spécifique du complément sur les hématies, n’est donc pas un anticoagulant adapté dans le cas de la réalisation du test de Coombs, car elle est à l’origine de faux-positifs.

Selon certaines publications une hémolyse pourrait survenir lorsque le prélèvement sanguin est réalisé sur EDTA, ce qui pourrait conduire à une diminution du titre du TCD. Cependant cette hémolyse semble plus être liée à la manipulation qu’à l’anticoagulant. Par ailleurs, l’EDTA peut induire une modif ication morphologique des hématies s’il est présent en grand excès et cela pourrait avoir un effet sur la fragilité des hématies et la fixation des anticorps. Il semblerait que le citrate soit plus indiqué que l’EDTA pour réaliser les prélèvements (JONES et al., 1990) mais ce dernier reste l’anticoagulant le plus utilisé (WARDROP, 2005).

D’après les laboratoires délivrant l’antiglobuline, il est possible de réaliser les prélèvements sur tubes secs. Cependant, les résultats alors obtenus doivent être interprétés avec précaution. En effet l’utilisation de tubes secs conservés à 4°C ou stockés à température ambiante permettent la liaison du complément in vitro et peuvent donc entraîner l’apparition de faux-positifs. Mais les tests de Coombs direct négatifs sur tubes secs sont considérés comme valides (WARDROP, 2005).

Les prélèvements sur ACD et CPD permettent une meilleure conservation des

hématies et sont donc mieux adaptés en cas de voyage des prélèvements sur plus de 24 heures. L’envoi au laboratoire a lieu le plus rapidement possible, sous couvert du froid. Le laboratoire destinataire doit avoir les réactifs appropriés, spécifiques à l’espèce étudiée : une antiglobuline humaine ne peut, en aucun cas, être utilisée chez le chien, pas d’avantage qu’une antiglobuline de chien chez le chat et inversement (CHABANNE, 2004).

Le délai entre le prélèvement et la réalisation du test de Coombs doit être le plus court

possible et ne doit en aucun cas excéder quarante huit heures.

B) Lavage des hématies

1 Intérêt des lavages

Le lavage des hématies a pour but de séparer les hématies du plasma afin d’éliminer toutes les immunoglobulines présentes dans le plasma et susceptibles d’interagir avec l’antiglobuline. D’autre part il permet d’éliminer d’éventuelles protéines sériques adsorbées à la surface des hématies (figure 13). Ces protéines pourraient masquer une réponse positive par leur fixation de l’antiglobuline.

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Protéines adsorbées Immunoglobuline du plasma

Lavages

Figure 13 : Principe du lavage des hématies, d’après (CHABANNE, 2004).

2 Technique

Les lavages doivent être ininterrompus , car un délai trop important entre les différentes étapes peut favoriser une élution des anticorps revêtant la membrane érythrocytaire. Pour les mêmes raisons, ils ne doivent pas être trop décapants au risque d’entraîner un résultat faussement négatif.

Le lavage consiste en trois à cinq centrifugations de l’échantillon après ajout de la

solution de lavage. Les données bibliographiques donnent différentes valeurs de centrifugations allant de 800 g pendant 5 minutes à 1500 g pendant 5 minutes.

Dans l’étude de Jones (JONES et al., 1990), trois solutions de lavage des hématies ont été testées. Pour chaque type de solution, il était réalisé une centrifugation préalable à 1500 g pendant cinq minutes et une élimination du surnageant. Puis chaque échantillon était lavé six fois. Ces solutions de lavage étaient: une solution de PBS (phosphate buffered saline) de pH 7,4, une solution BFI (base force ionique), et une solution de NaCl à 0,9 p.cent. Les résultats de l’étude montrent une hémolyse pour certains échantillons lavés avec les solutions de BFI et de NaCl 0,9 p.cent. Or l’hémolyse est préjudiciable au test car elle diminue le titre observé.

Par contre aucune hémolyse n’est observée sur les échantillons traités avec le PBS. Elle serait donc la meilleure solution de lavage des hématies.

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C) Préparation de la suspension érythrocytaire

Elle est réalisée en diluant le concentré globulaire. Suivant les études on note une grande variation du pourcentage de dilution des

hématies, qui fluctue entre 0,8 et 10 p.cent. Cependant, bien que les écarts soient importants, il n’existe pas d’étude particulière permettant de juger de l’influence de cette dilution sur le résultat du test.

La composition liquide du diluant est un autre facteur influençant la suspension

érythrocytaire. En effet, si dans la très grande majorité des cas, le test de Coombs est réalisé en milieu salin physiologique (NaCl 0,9 p.cent ou PBS), des artifices peuvent être utilisés, facilitant ainsi la réaction d’agglutination. En effet, comme nous l’avons déjà vu précédemment, il est possible de réaliser le test à l’antiglobuline dans un milieu macromoléculaire (albumine ou dextran), ou bien de traiter préalablement les hématies par des enzymes (papaïne ou broméline par exemple) (JONES & DARKE, 1975; OSS & ABSOLOM, 1983; BARKER & JONES, 1993b).

Une dernière possibilité de faire varier la solution de dilution des hématies est de

modifier la force ionique. En effet, rappelons qu’en abaissant la force ionique il est possible d’accélérer la fixation des anticorps sur l’antigène. C’est ainsi que l’utilisation de solutions BFI permettes de raccourcir le temps d’incubation, avec un résultat supérieur ou égal (en ce qui concerne la sensibilité du test) aux autres méthodes (LAPIERRE et al., 1990).

D) Choix du réactif

Différents types d’antiglobulines peuvent être utilisés. Dans l’étude menée par Jones et ses collaborateurs, différents réactifs ont ainsi pu être

testés. On observe alors des différences très marquées entre des antiglobulines polyvalentes, des antiglobulines monovalentes (anti-IgG ou anti-C3) et une antiglobuline bivalente (anti-G et anti-C3). 12 chiens sur les 23 chiens suspects d’AHMI présentèrent un test direct négatif à la fois avec un réactif monospécifique et un réactif polyspécifique.

Grâce à l’utilisation d’un réactif monospécifique la classe des immunoglobulines mises en jeu dans les AHMI des 11 chiens positifs a pu être observée. Ainsi 6 des chiens étaient positifs aux réactifs contenant une IgG et à celui contenant le complément (C3), 2 n’étaient positifs qu’à l’IgG et 1 présentait à la fois des IgG, des IgM et du C3. Par conséquent l’utilisation d’un réactif combiné c'est-à-dire contenant deux antisérums monospécifiques (anti-IgG et anti-C3) a donné plus de résultats positifs que l’utilisation d’un réactif polyspécifique (tableau 5).

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Antiglobuline Polyvalente 1

Polyvalente 2

Anti-IgG Anti-C3 Bivalente (Anti IgG et

anti-C3) Sensibilité du test

de Coombs 63,6% 36,3% 81,8% 81,8% 90,9%

Tableau 5 : Comparaison de la sensibilité du test de Coombs sur 11 chiens atteints d’anémie hémolytique à médiation immune, d’après (JONES et al., 1990).

Cette étude compare en fait la réaction positive avec chacune des antiglobulines sur les 11 des 23 chiens qui ont au moins réagi à l’un des tests de Coombs. Il est donc difficile de déterminer laquelle est la plus performante, surtout que l’échantillon reste de très petite taille, ce qui favorise une grande amplitude des résultats.

Cependant, de façon générale on obtient une bonne sensibilité avec un sérum anti-

IgG et anti C3, mélangés à volumes égaux. L’utilisation de sérums monospécifiques anti-IgG, anti-IgM et anti-C3 permet d’être plus précis, mais l’intérêt d’un sérum anti-IgM est discutable. En effet les globules rouges porteurs d’IgM agglutinent rarement avec un sérum anti-IgM car ces dernières sont éluées à 37°C. Cependant ils fixent souvent de façon irréversible la fraction C3 du complément qui persiste après les lavages à 37°C et ils réagissent donc avec un sérum anti-C3 (JONES et al., 1990). Les IgM peuvent ainsi être dépistées par le TCD « anti-complément » (anti-C3) ou par un TCD à froid qui évite leur élution au cours des lavages.

Les réactifs anti-IgA sont rarement utilisés chez le chien, car la présence d’IgA sur les globules rouges lors d’AHMI est très rare (CHABANNE, 2004).

L’anti-sérum polyspécifique anti-IgG et C3 est un réactif à large spectre, dont

l’utilisation est recommandée pour diagnostiquer les AHMI. L’utilisation des anticorps monospécifiques peut permettre de reconnaître les rôles respectifs des IgG, IgM et C3 (POITOUT et al., 1995; OVERMANN et al., 2007).

Une étude récente (KUCINSKIENE et al., 2005) utilisant deux antiglobulines

différentes (l’une issue d’un lapin et l’autre issu d’une chèvre) montre que le type d’antiglobuline choisie influence les résultats des tests (tableau 6) :

Sérum de lapin anti IgG canine + -

+ 4 1 Sérum de chèvre anti IgG canine - 3 7

Tableau 6 : Comparaison du test de Coombs direct à 37°C réalisé avec deux antiglobulines différentes, d’après (KUCINSKIENE et al., 2005).

Ainsi avec l’antiglobuline de chèvre anti-IgG canine, 5 chiens se sont révélés positifs, alors qu’avec l’antiglobuline de lapin, 7 chiens se sont révélés positifs.

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E) Préparation de la gamme de dilution de l’antiglobuline

L’ajout de l’antiglobuline doit être rapide afin d’éviter tout faux-négatifs causé par la dissociation de l’hématie et de l’anticorps sensibilisant ou du complément.

Chaque puit de la microplaque à fond conique ou chaque tube contient une concentration différente d’antiglobuline, ce qui constitue la gamme de dilution. Celle-ci permet une appréciation quantitative de la sensibilisation érythrocytaire, tout en évitant les faux-négatifs liés au phénomène de zone (figure 14).

En effet lorsque la concentration en antiglobuline est trop élevée par rapport à la quantité d’anticorps présents à la surface des hématies, l’agglutination est inhibée (CHABANNE, 2004). C’est ainsi que certaines études indiquent que les immunoglobulines humaines favorisent un effet de zone lorsqu’elles sont testées contre des cellules faiblement sensibilisées (VAN LOGHEM et al., 1950). Il est vraisemblable qu’en grand excès d’anticorps l’attachement simultané des deux sites anticorps d’une même molécule d’immunoglobuline à deux cellules devient improbable ce qui s’oppose à l’agglutination. Par conséquent certains sérums perdent leur pouvoir agglutinant à forte concentration et doivent être dilués 100 à 1000 fois pour devenir agglutinant, réalisant ainsi un phénomène de prozone analogue à celui observé lors d’immunoprécipitation.

Pourtant l’utilisation d’un sérum d’antiglobuline plus dilué entraîne parfois l’apparition de résultats positifs au test de Coombs direct chez des patients qui avait présenté un résultat négatif avec un sérum d’antiglobuline plus concentré. Il est intéressant de noter qu’un grand nombre de laboratoires vétérinaires dilue les tubes sans que le fabricant ne l’ait conseillé. Mais l’efficacité de cette pratique n’est que très peu documentée (WARDROP, 2005). Une seule étude vétérinaire a été réalisée sur ce sujet (OVERMANN et al., 2007) et elle tend à démontrer que ce phénomène de « prozone » existe aussi chez les chiens. En effet la réalisation de tests de Coombs sur une série de dilution allant jusqu’au 1/2048 leur a permis de détecter 6 cas qui se seraient révélés négatifs lors de l’utilisation d’une gamme de dilution plus classique. Par conséquent la réalisation d’une série de dilution importante est nécessaire lorsque l’on a besoin d’un test sensible.

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Figure 14 : Représentation schématique du phénomène de zone, d’après (GENETET, 1997).

Zone 1 : cette zone se caractérise par un excès d’antigène par rapport aux anticorps apportés. Ces anticorps ne sont alors pas en quantité suffisante pour entraîner la formation du réseau à l’origine de l’agglutination.

Zone 2 : c’est la zone d’équivalence où on observe une agglutination maximale. Zone 3 : dans cette zone, on a des quantités trop importantes d’anticorps par rapport aux antigènes. Ces

anticorps vont saturer les sites antigéniques. Il y a lors compétition des immunoglobulines pour les épitopes. Chaque immunoglobuline ne peut statistiquement fixer qu’un seul épitope. Il n’y a donc pas de formation de ponts entre les hématies et donc pas d’agglutination.

F) Test

Le test de Coombs peut être réalisé sur tubes, lames ou microplaques à fond conique.

La technique sur microplaques à fond conique permet de réaliser un nombre plus

important de dilution du réactif et d’utiliser de plus petits volumes à la fois d’antiglobuline et de suspension érythrocytaire par puits.

Le test consiste alors en la mise en suspension des hématies du patient avec

l’antiglobuline.

Anticorps précipités

Antigènes en quantité croissante

Zone 1 Zone 2 Zone 3

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G) Incubation

1 Durée d’incubation

Dans l’étude menée par Jones et collaborateurs, le temps d’incubation choisi était de une heure. Il peut être plus ou moins important en fonction du type d’anticorps car la f ixation de certains d’entre eux nécessite un contact prolongé. La solution BFI permet de diminuer ce paramètre de façon parfois spectaculaire (LAPIERRE et al., 1990).

La durée d’incubation varient de 30 minutes à 2 heures, selon les fabricants et les auteurs. Dans tous les cas elle est nécessaire avant d’effectuer la lecture.

2 Température d’incubation

L’optimum thermique des anticorps dépend de leur classe. Classiquement, les IgM ont un optimum thermique voisin de 4°C, tandis que celui des IgG est proche de 37°C.

En immuno-hématologie, les réactions les plus courantes sont conduites à 37, 22 (température ambiante) ou 4°C mais uniquement dans le cas d’une suspicion de maladie des agglutinines froides car la réalisation d’incubation à 4°C en routine est très controversée.

Ainsi dans une étude récente (KUCINSKIENE et al., 2005) on peut voir que sur 26

chiens anémiés et référés pour une suspicion d’AHMI; 9 sont positifs à 4°C et 6 à 37°C ;le test à 4°C semblerait donc plus sensible (tableau 7).

TCD à 37°C + -

+ 6 3 TCD à 4°C - 0 17

Tableau 7 : Comparaison du test de Coombs direct réalisé à 37°C et à 4°C, d’après (KUCINSKIENE et al., 2005).

3 pH d’incubation

Le pH, de même que la force ionique, a un rôle sur le déroulement de la réaction d’agglutination.

Même s’il existe des anticorps ayant un pH optimum très précis et si certaines techniques utilisent des solutions à pH bas, l’incubation est généralement réalisée à pH physiologique.

Il semble que le maintient du pH, notamment pendant les lavages précédents l’ajout

d’antiglobuline, soit important (LAPIERRE et al., 1990).

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H) Création de témoins

1 Témoins positifs

En médecine humaine cette étape est très fréquente. Il s’agit de mettre en solution des hématies sensibilisées par des IgG avec le réactif. Cela permet d’évaluer certaines conditions de réalisation du test comme les lavages car des résidus de plasma peuvent persister dans la suspension érythrocytaire si le lavage est mal réalisé et dans ce cas de faux-négatifs peuvent être observés. En effet les anticorps présents dans le plasma se combinent avec l’antiglobuline et empêchent la formation du réseau (SOUTH, 1988; American Association of Blood Banks Technical Manual Comittee, 2002b). Si les globules rouges témoins (recouverts par les IgG) ne sont pas agglutinés, le test est considéré comme invalide, notamment dans le cas des tests effectués sur des échantillons s’étant révélés être négatifs.

En médecine vétérinaire il est beaucoup plus rare d’utiliser un témoin positif , car

il est difficile d’obtenir des cellules sensibilisées des différentes espèces. Un laboratoire (VMRD, Pullman, WA, USA) proposent des antiglobulines canines dirigées contre les hématies des moutons, pouvant être utilisées comme témoin positif dans le test à l’antiglobuline canine. Cependant le panel de globules rouges de moutons et par conséquent la sensibilisation de ces globules rouges doit être effectué par le laboratoire produisant les anticorps (WARDROP, 2005).

2 Témoins négatifs

Des témoins négatifs doivent impérativement être réalisés en parallèle du test. Ils peuvent être:

-un témoin d’auto-agglutination : il est constitué d’une suspension des globules

rouges du malade mis en présence de soluté isotonique de NaCl sans antiglobuline, afin de vérifier que les hématies du malade ne s’auto-agglutinent pas spontanément. Une auto-agglutination du témoin signe la présence d’agents de sensibilisation immune sur les hématies. Dans ce cas la mise en œuvre du test de Coombs n’a plus d’intérêt, puisque celui-ci sert à révéler la présence sur les hématies d’anticorps non spontanément agglutinants. Chez le chat, une pseudo-agglutination en rouleaux par les érythrocytes est fréquente. L’ajout d’une goutte de sang à quelques gouttes de soluté isotonique de NaCl (une goutte dans le cas d’un chien, deux ou trois dans le cas d’un chat) entraîne la dissociation des rouleaux mais pas des vrais agglutinats ; ce qui permet de différencier une pseudo-agglutination d’une agglutination vraie.

Toutefois, si le revêtement anticorps est d’isotype IgG, l’auto-agglutination peut également disparaître. Il est à noter qu’une auto-agglutination peut être constatée dès la prise de sang, à température corporelle ou n’apparaître que lorsque le sang est refroidi, ce qui est le cas le plus fréquent (CHABANNE, 2004).

-on peut également réaliser un vrai témoin négatif : une suspension des globules

rouges d’un animal témoin sain est mise en présence du sérum d’antiglobuline spécifique d’espèce, afin de contrôler la bonne conservation de l’antisérum (PELLERIN et al., 1994).

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I) Lecture du test

La lecture du test sur microplaques à fond conique se fait soit à l’œil nu (éventuellement sur miroir de Kahn), soit de façon plus minutieuse (notamment en cas de doute) au microscope (au grossissement 100). Une réaction négative se traduit par une sédimentation au fond de la microcupule, alors qu’une réaction positive se traduit par un voile d’agglutination.

Les réactions peuvent également être lues après coulage des hématies : la plaque est

fortement inclinée suivant un angle de 60 à 80 degrés et la lecture est effectuée après un temps de latence de quelques minutes. Les hématies libres ont coulées et forment un fin trait vertical, alors que les agglutinats sont restés au fond du puit ou ont sédimenté en amas. Le titre correspond à la plus faible dilution de l’antisérum entraînant une réaction positive.

J) Interprétation et sanction

Un test de Coombs direct positif avec une antiglobuline polyvalente permet d’affirmer que les hématies sont sensibilisées par un anticorps.

Lors d’anémie régénérative hémolytique, un TCD positif permet de comprendre le

mécanisme de lyse des globules rouges (lyse immunologique), et justifie la mise en place d’un traitement immunosuppresseur.

En l’absence d’anémie avérée, un TCD positif ne permet pas de porter à lui seul le

diagnostic d’une anémie immunologique. En effet un certain nombre d’artéfacts ou de circonstances techniques peuvent conduire à de fausses positivités.

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Elution des anticorps ; restent les

fractions C3 du complément

Ajout de l’antiglobuline anti-C3 ; agglutination

Antiglobuline Anticorps Hématie sensibilisée Complément

II. Interprétation des résultats

A) Test de Coombs direct à froid positif

Il est important de noter que l’interprétation de la présence d’anticorps froids fait l’objet de nombreuses discussions.

Certains auteurs recommandent la réalisation systématique du TCD à froid afin de

rechercher ces auto-anticorps froids pathogènes (JONES et al., 1990), bien qu’il soit difficile de discerner les anticorps froids pathogènes des anticorps froids non pathogènes, et cela même si le test est répété entre 25 et 30°C.

D’autres auteurs préfèrent réaliser le TCD uniquement à 37°C et utiliser le C3 seul et fixé sur les membranes érythrocytaires comme marqueur d’auto-anticorps froids (BARKER, 2000). En effet les IgM sont généralement spontanément éluées lors des lavages du test à 37°C. Cependant les hématies sensibilisées par les IgM fixent de manière irréversible la fraction C3 du complément (figure 15). Il suffit d’utiliser une valence anti-C3 pour révéler la présence de complément et probablement la présence avant lavage d’IgM.

Figure 15 : Cas particuliers des anticorps qui s’éluent (IgM) : l’agglutination à partir du

complément, d’après (CHABANNE, 2004).

Par Ailleurs quelques auteurs préconisent de ne pas valider le TCD réalisé à 4°C car il

est possible d’observer des agglutinations spontanées chez le chien. Des études ont ainsi montrées que le test de Coombs à froid se révélait positif dans la moitié des cas de chiens non anémiés (SLAPPENDEL, 1979; WERNER & GORMAN, 1984; SLAPPENDEL, 1986; CHABANNE & FOURNEL, 1994). En effet il semblerait qu’il existe naturellement chez le chien et le chat, à l’image de ce qui retrouvé chez l’homme, des anticorps froids (agglutinines froides) susceptibles de donner des réactions positives dans de nombreux cas en

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dehors de toute anémie. Ce type d’anticorps dit « anticorps naturels » correspond généralement à des alloanticorps présents à des titres très faibles.

Le seul cas sur lequel tous les auteurs s’accordent à accepter la signif ication

diagnostique d’AHMI lors d’une positivité d’un TCD à froid est celui d’un patient présentant des signes d’affections à anticorps froids, comme la nécrose des extrémités. Cependant même dans ce cas, le test positif n’est qu’un support au diagnostic et non pas une confirmation de l’affection (JAIN, 1973).

Il est à noter que le TCD à froid est souvent plus fortement positif et plus persistant

que le TCD à chaud lors d’anémie immunologique centrale (PELLERIN et al., 1994).

B) Test de Coombs direct à chaud

D’une façon générale, il existe quatre résultats possibles au test de Coombs direct à chaud. Dans les trois premiers, le test est positif. Dans le dernier cas le test est négatif.

• Le premier type correspond à la présence d’immunoglobulines seules, le plus

souvent de la classe des IgG. • Le second type traduit la présence d’immunoglobulines (IgG ou IgM )

associées au complément. • Dans le troisième cas, seul le complément est présent. • Enfin dans le dernier cas, le test apparaît négatif et traduit donc le fait que ni

les immunoglobulines, ni le complément n’est décelé à la surface des hématies. • Pour finir, le cas des faux-positifs et des faux-négatifs sera abordé dans la

partie suivante de ce travail.

1 Premier et deuxième cas : test positif aux immunoglobulines

Chez le chien les réactifs montrent le plus souvent que l’hématie est sensibilisée par une IgG seule ou associée au complément (en particulier du C3d) et présents à la surface des hématies.

Lorsque le test de Coombs est positif et qu’il est associé à des signes cliniques

d’hémolyse, il revêt toujours une signification précise : il traduit soit une AHMI latente, soit une AHMI déclarée, ceci même lorsque le titre en immunoglobuline décelé est faible. Pour certains auteurs le type d’anticorps et / ou de protéines du complément fixés à la surface des globules rouges permet de préciser l’origine de l’anémie. Ainsi pour un TCD positif :

-de type IgG, la nature immune de l’anémie serait très probable (SLAPPENDEL, 1979).

-de type « IgG + C », l’interprétation est plus discutable car il n’est pas certain que le complément soit fixé sur le complexe IgG-antigènes membranaires.

Lorsqu’il est décelé des immunoglobulines associées au complément, l’hémolyse est souvent plus sévère. De même l’association des IgG et des IgM entraîne une hémolyse de type aiguë et grave (SLAPPENDEL, 1986). Par contre il n’y a pas de lien clair entre le titre en anticorps fixés sur les globules rouges et la sévérité de l’anémie, bien que des réactions à titre

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faible soit plus fréquemment associées à des AHMI secondaires qu’à des AHAI (DAY, 2000; MILLER, 2003). Par conséquent l’ intensité du TCD ne présage en rien de la sévérité de l’hémolyse observée cliniquement.

2 Troisième cas : test positif au complément

Il correspond à un test de Coombs positif associé à la seule présence du complément sur les hématies (SLAPPENDEL, 1986). Dans ce cas il est encore plus difficile d’établir la sensibilisation exacte des hématies. Plusieurs possibilités sont à étudier.

• Le complément est fixé sur les hématies par un taux indétectable

d’immunoglobuline , dans ce cas le diagnostic est une AHMI. • Le complément peut être également fixé de manière transitoire et être

rapidement élué. Dans ce cas le TCD est positif malgrè une activation insuffisante du complément pour provoquer des dommages cellulaires.

• Le complément est fixé sur les hématies par un autre mécanisme tel que des complexes immuns circulants se fixant sans spécificité sur les hématies. Ceci se produit dans de nombreuses situations pathologiques comme lors d’une infection, d’une néoplasie, d’une connectivite, d’une hémopathie lymphoïde, d’une vascularite, d’une infection rénale, ou bien lors d’administration médicamenteuse, ou encore lors de lipodystrophie. Dans tous ces cas il n’y a pas d’hémolyse.

• Il s’agit d’agglutinines froides : le sérum du patient contient une très grande quantité d’anticorps anti-érythrocytaires ne se f ixant sur la membrane des hématies qu’à basse température. Ce sont les IgM fixant le complément (voir partie précédente). Pour confirmer la sensibilisation par les IgM un test de Coombs à froid peut être réalisé, évitant par ce procédé leur élution.

Lorsque le sérum de Coombs est spécifique du complément, un test fortement positif est associé le plus souvent à des signes d’hémolyse intravasculaire. Cependant les TCD positifs au complément seul sont plutôt communs chez le chien lors d’affections diverses et sont rarement associés à des hémolyses sérieuses.

Finalement, l’interprétation d’un test de Coombs positif en médecine vétérinaire peut

se résumer comme suit :

• Lorsqu’il est de type IgG, la nature immune de la maladie est très probable. • Lorsqu’il est de type (IgG + complément), la signification diagnostique est

discutable car il n’est pas certain que le complément soit fixé sur le complexe IgG- (antigène membranaire).

• Dans le cas des AHMI avec un test de Coombs positif de type complément pur, il parait encore plus difficile de définir la sensibilisation exacte des hématies. I l est possible qu’une partie des tests de Coombs de type « complément » correspondent à la fixation transitoire d’IgM, rapidement éluée de l’hématie.

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Réponse Mécanisme Cause

Positive

• Présence d’auto-anticorps sur les

hématies

• Présence d’allo-anticorps

• Présence de xéno-anticorps (ou de complexes antigènes-anticorps adsorbés)

• AHAI

• Allo-immunisation post-transfusionnelle ou foeto-maternelle

• Néoplasies (AH paranéoplasiques)

• AH post-infectieuses • AH immuno-allergiques

médicamenteuses

Négative

• Absence d’IgG, d’IgM ou de

complément

• Absence d’anémie à

médiation immune

Tableau 8 : Interprétation du test de Coombs direct, d’après (SLAPPENDEL, 1979); (SCHLAM, 1980; JONES, 1984).

Parfois les tests peuvent être faussement positifs ou faussement négatif. En effet le test

à l’antiglobuline manque de spécificité et de sensibilité, deux critères permettant d’évaluer la valeur diagnostique du test.

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III. Valeur diagnostique du test de Coombs en médecine vétérinaire

Pour donner la valeur diagnostique d’un test, il faut pouvoir juger de ses qualités intrinsèques.

Cette évaluation repose sur la détermination de trois qualités essentielles d’une épreuve d’immunodiagnostic que sont la praticabilité , la fiabilité et les critères d’efficacité.

A) Praticabilité

La praticabilité correspond à la facilité de mise en œuvre d’une épreuve d’immunodiagnostic et dépend :

• Du coût d’investissement et de maintenance ; • De la technicité requise pour la réalisation de l’épreuve ; • De la diffusion et de la disponibilité du matériel nécessaire ; • Du risque éventuel pour le manipulateur et l’environnement

Pour le test de Coombs sur plaque, l’investissement principal consiste en l’achat d’une centrifugeuse. En ce qui concerne les plaques et le réactif le coût actuel d’un seul test est d’environ 40€.

Il n’y a pas de problème d’approvisionnement en matériel puisqu’il est diffusé par la société MP Biomedical qui possède des distributeurs au niveau international. Les inconvénients majeurs sont les délais de livraison parfois très long (3 mois lors de l’expérimentation).

Quant à la technicité requise pour les manipulations lors de la réalisation d’un test, celle-ci est minime. En revanche, la lecture des plaques requiert une grande technicité et dans certains cas une grande part de subjectivité entre en compte dans l’interprétation des tests. Enfin il n’existe pas de risque particulier pour le manipulateur.

En conclusion le test de Coombs est un test pratique à condition qu’il soit lu par un

technicien de laboratoire expérimenté.

B) Fiabilité

La fiabilité du test se décompose en quatre paramètres : l’exactitude, la précision, la détectabilité et la sensibilité.

1 Exactitude

Ce paramètre, appelé aussi justesse, mesure la capacité d’une épreuve à donner le résultat exact. En d’autres termes, il exprime la qualité de l’accord entre l’estimation de la valeur mesurée et la valeur vraie.

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Son appréciation implique de connaître la valeur absolue des échantillons de référence (produit étalon auquel est attribué un titre). En général, l’appréciation de l’exactitude est meilleure pour les techniques quantitatives. Or la technique sur plaque du test de Coombs est une épreuve semi quantitative, son exactitude doit être moins bonne que la technique sur gel par exemple.

2 Précision

Le terme de précision recouvre deux notions. La première est relative à la taille des intervalles de mesure. Or le test de Coombs se réalise sur une échelle de mesure de type discontinue et logarithmique. La précision des mesures, dans le cadre de cette interprétation est donc moyenne.

La deuxième signification du terme précision exprime la capacité de l’épreuve à donner des résultats cohérents lors de mesures répétées, effectuées sur un même échantillon dans des conditions constantes. On parle aussi de reproductibilité .

Le coefficient de variation permet d’évaluer la précision intrinsèque de l’épreuve. C’est le rapport de l’écart type des mesures obtenues, à la moyenne, calculé au cours d’une ou plusieurs séances. Bien entendu le coefficient est généralement plus faible quand il se rapporte à des résultats enregistrés sur une séance plutôt que sur plusieurs séances. Néanmoins, cette dernière valeur traduit mieux la qualité de l’épreuve. Etant donnée la grande part de subjectivité dans la lecture du test, la reproductibilité doit être faible.

3 Détectabilité

Ce paramètre exprime la plus petite quantité détectable du produit recherché ou titré. En d’autres termes, il exprime la plus faible concentration qui peut être distinguée du blanc réalisé dans les mêmes conditions.

Les détectabilités des épreuves sérologiques usuelles sont données dans le tableau suivant :

Epreuves Dosage d’anticorps

Epreuve radioimmunologique (RIA) 10-5-10-4 Epreuve immunoenzymatique (ELISA) 10-4 Neutralisation virale 10-5-10-4 Inhibition de l’hémagglutination 0.001-0.005 Neutralisation de toxines 0.003-0.01 Fixation du complément 0.05-1 Agglutination 0.05-10 Hémagglutination passive 0.01-0.1 Ring-test 2-15 Immunodiffusion en gélose 0.3-30 Anaphylaxie cutanée passive 0.008-32

Tableau 9 : Détectabilité des épreuves sérologique usuelles, d’après (PASTORET et al., 1990).

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C) Critères d’efficacité

L’efficacité d’une épreuve d’immunodiagnostic peut se définir comme l’aptitude à déceler les variations physiologiques ou pathologiques. Elle se mesure par rapport à une situation de référence considérée comme la plus proche de la vérité ou simplement fixée comme référence (PASTORET et al., 1990).

Les critères d’eff icacité d’une épreuve sont la sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives.

Par définition, la sensibilité est la proportion de sujets malades ou infectés révélés

par l’épreuve d’immunodiagnostic parmi l’ensemble des sujets malades ou infectés. La spécificité est la proportion de sujets classés indemnes par l’épreuve d’immunodiagnostic parmi l’ensemble des sujets indemnes.

Sensibilité et spécificités varient souvent en sens inverse et, pour une méthode donnée, leur valeur dépend du seuil de positivité, frontière entre les sérums positifs et les sérums négatifs.

1 Spécificité du test de Coombs

(a) Définition des faux-positifs

La spécificité du test est liée à la nature de l’anticorps. On peut en effet parler de spécificité, de nature immunohistochimique, ou d’isotype.

En 1979, Slappendel (SLAPPENDEL, 1979) publie un rapport sur la signif ication

diagnostique du test direct à l’antiglobuline. Cette étude a été menée sur 371 chiens anémiés. En ce qui concerne les commémoratifs et l’anamnèse, tous ces chiens, sans antécédents traumatiques, présentaient un hématocrite inférieur à 40%, et tous étaient suspects de diverses maladies. Seuls 37 chiens étaient suspects d’AHMI sans autre maladie associée, c'est-à-dire qu’ils présentaient en plus d’un hématocrite bas, des signes d’hémolyse. Dans cette étude, le test de Coombs direct, utilisant un réactif monospécifique, s’est révélé positif sur 134 chiens (36,1 p.cent) et négatif sur les 35 chiens sains. Les anticorps et / ou compléments trouvés chez ces chiens sont rapportés dans le tableau 10 :

Antiglobuline IgG IgG et C3 IgM et C3 C3 Résultat

ambigu Résultats (sur 134 chiens)

15 (11,2%) 41 (30,6%) 2 (1,5%) 74 (55,2%) 2 (1,5%)

Tableau 10 : Différents type d’anticorps détecté par le TCD lors de l’étude de 1979 de Slappendel (SLAPPENDEL, 1979).

Une hémolyse était visible surtout chez les chiens présentant des IgG ou des IgG associées au complément sur leurs hématies. Les auteurs remarquèrent également une grande corrélation entre les chiens positifs au complément seul et présentant des maladies inflammatoires, des maladies myéloprolifératives et lymphoprolifératives. Les signes d’hémolyse chez ces chiens étaient absents ou minimes. L’auteur a supposé alors que le

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complément était fixé sur un anticorps ou un complexe antigène-anticorps qui eux même n’entraient en contact avec le globule rouge que de manière temporaire, ce qui était insuffisant pour provoquer des dommages cellulaires. Ou bien les anticorps étaient bien présents sur les globules rouges, mais en concentration trop faible pour être détectés par le test de Coombs. Les conclusions de l’auteur étaient alors qu’un résultat positif avec l’IgG était peu en faveur d’une AHMI, et qu’une réaction positive avec le complément seul était très communément retrouvée lorsque l’animal présentait d’autres affections et étaient rarement associée à une hémolyse importante.

Ces recherches nous prouvent que le test de Coombs direct est un test manquant de

spécificité, en effet, bien qu’un test de Coombs direct peut être un examen complémentaire de choix lors de suspicion d’AHMI, il doit être interprété avec beaucoup de précautions si aucun autre signe d’appel de cette affection n’est présent.

(b) Origine des faux-positifs

Les faux-positifs connaissent différentes causes :

(i) Des causes techniques

o Utilisation de tubes sales. o Une solution saline contaminée par des métaux lourds, de la silice colloïdale, ou

des bactéries. o Une centrifugation trop intense. o Une lecture tardive ou une utilisation de sang mal conservé (le complément peut

alors s’adsorber de façon non spécifique in vitro sur les globules rouges) (WARDROP, 2005)

o La présence de calcium ionisé libre dans le prélèvement conduisant à une fixation

du complément non immune sur les globules rouges. o De façon moins courante : une utilisation du sang stoqué dans des tubulures ayant

servi à l’administration de dextrose, une utilisation de tube contenant du gel siliconé.

(ii) Des causes biologiques

o Patients bactériémiques : il a été démontré chez l’homme qu’il existe des crypto- antigènes dits de « Thomsen-Freidenreich » naturellement présents à la surface des globules rouges et normalement cachés par l’acide N-acétyl-neuraminique. Mais il arrive qu’ils soient exposés ou activés suite à l’action de neuraminidases bactériennes, notamment lors de bactériémie (WARDROP, 2005).

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o Présence d’auto-anticorps naturels réactifs à froid : comme il l’a déjà était décrit dans ce travail, il existe des agglutinines non pathogènes et réactives à froid chez les animaux en bonne santé (IgM fixant le complément). Ainsi le stockage des échantillons sanguins à 4°C ou la réalisation de TCD à des températures inférieures à 37°C peuvent entraîner la fixation de ces auto-anticorps non pathogènes sur les globules rouges (BARKER, 2000).

o Réaction croisée entre les réactifs antiglobulines et la membrane des globules

rouges : le réactif de Coombs peut en effet contenir des anticorps dirigés contre l’albumine, la transferrine ou une autre protéine plasmatique fixée à la surface de l’hématie, cela surtout lorsque l’antiglobuline est mal purifiée (BARKER, 2000). Il peut également s’agir d’hétéro-agglutinines naturellement présentes dans l’antisérum hétérologue et qui se lient à des antigènes non définis de la membrane érythrocytaire (LEWIS et al., 1963).

o Transfusion sanguine : des allo-anticorps post-transfusionnels peuvent interférer

avec le résultat du TCD si une transfusion est réalisée 2 à 30 jours avant le test (HALLIWELL, 1978; FORD, 1980).

o Patients asymptomatiques : comme nous l’avons vu précédemment les globules

rouges « normaux » portent une petite quantité d’IgG et de complément à leur surface, ce qui peut induire des faux-positifs. Par ailleurs, de faibles taux d’immunoglobulines liées aux globules rouges pourraient être détectés chez au moins 78 p. cent des chiens qui ont une anémie quelle qu’en soit l’origine (BARKER, 2000), ce qui n’est donc pas spécifique d’une anémie hémolytique.

o Modifications des antigènes membranaires : des anticorps non pathogènes

peuvent se lier à des épitopes révélés par des changements membranaires érythrocytaires. Ces changements membranaires peuvent survenir lors du passage des globules rouges au travers un néoplasme (STEWART & FELDMAN, 1993), au cours d’une CIVD (Coagulation Intra-Vasculaire Disséminée), si le prélèvement est mal conservé ce qui conduit à des altérations membranaires (THEBAULT, 2005) ou lorsque les épitopes sont induits par l’anticoagulant ou une activation cellulaire (SCOTT, 2000).

o Adsorption non spécifique d’immuns complexes ou d’anticorps (PELLERIN et

al., 1994). De nombreuses publications en médecine humaine rapportent l’adsorption de particules médicamenteuses à la surface des globules rouges et le fait que le TCD mette en évidence des anticorps dirigés contre ces particules, alors que ces anticorps ne sont pas pathogènes pour les globules rouges. Ce phénomène peut également survenir lors d’infection par des hémoparasites comme Babesia canis ou lors de dirofilariose (HALLIWELL, 1978). D’autre part, lors d’atteinte infectieuse, inflammatoire, néoplasique et immunologique il n’est pas observé d’AHMI. Mais un excès d’anticorps plasmatiques circulent et peuvent se fixer de façon non spécifique aux érythrocytes et induire un TCD faussement positif (THEBAULT, 2005). En outre lorsque des techniques très sensibles sont utilisées, des traces de C3 peuvent être détectées régulièrement chez des individus sains (JONES et al., 1992). Enfin lors d’une hypergammaglobulonémie, lors d’une gammapathie monoclonale ou polyclonale, ont peut observer une liaison non

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spécifique des immunoglobulines aux globules rouges, cela du fait de leur très forte concentration (WARDROP, 2005).

Ainsi diverses maladies autres que les AHMI peuvent induire un test de Coombs

positif chez le chien et le chat : néoplasie, maladies parasitaires (piroplasmose, leishmaniose) (SLAPPENDEL, 1979; KLAG et al., 1993), maladies inflammatoires et autres maladies auto-immunes. Certains auteurs considèrent que les tests de Coombs positifs uniquement avec un sérum monospécifique anti-C3 sont rarement dus à une AHMI, mais souvent à un phénomène inflammatoire (SLAPPENDEL, 1979; COTTER, 1992).

(c) Amélioration de la spécificité du test de Coombs

Il est possible d’améliorer la spécificité du test en respectant quelques règles simples lors des manipulations au laboratoire. I l est ainsi recommandé :

• d’adsorber l’anti-sérum sur des globules rouges d’animaux sains afin

qu’ils réagissent avec les immunoglobulines naturelles des globules rouges, puis de recueillir le surnageant pour l’utiliser comme anti-sérum (JONES et al., 1990) ;

• d’utiliser une antiglobuline suffisamment purifiée, ce qui évite les reconnaissance de transferrine, d’albumine ou d’un antigène spécifique d’espèce ;

• de ne pas réaliser le test à 4°C, ni de conserver le sang à 4°C. Les globules rouges des chiens sains pouvant agglutiner avec des IgM naturelles à cette température ;

• de faire suffisamment de lavages pour éliminer les protéines sériques adsorbées de façon réversible sur les membranes érythrocytaires.

Ces conditions de réalisation du test à l’antiglobuline doivent être respectées car cela

permet de diminuer de façon considérable le nombre de faux-positifs. Mais le respect de ces quelques règles ne suffit parfois pas. Donc face à un test de Coombs direct positif, d’autres tests sont nécessaires pour déterminer plus précisément la nature de l’anticorps fixé à la surface des hématies. C’est le but :

• du test direct réalisé avec des antiglobulines monospécifiques (voir pages 59 et 60 de ce travail « choix de l’antiglobuline »),

• du test de Coombs indirect (voir pages 36-37), • de l’épreuve d’élution-fixation . L’élution consiste en la rupture des forces de

liaison unissant les globules rouges aux anticorps par le biais de méthodes physico-chimiques. La fixation permet la détermination de l’activité sérologique et de la spécificité des anticorps en utilisant des hématies de composition antigénique connue qui vont fixer les anticorps élués. L’éluat est sans activité sérologique si seul le complément est fixé sur les hématies (WARDROP, 2005). Comme le TCI, ce test permet de détecter d’éventuels auto-anticorps qui réagissent avec les hématies saines, c'est-à-dire dépourvues de xéno-antigènes. La technique d’élution par la chaleur (15 min à 56°C) est la meilleure lorsque l’anticorps est actif à basse température. Par contre les techniques par addition d’éther, d’acide (abaissement du pH) ou de

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chlorure de sodium hypertonique (abaissement de la force ionique) sont préférables lorsque l’anticorps est actif à 37°C.

Ainsi de nombreuses méthodes sont décrites pour améliorer la spécificité du

TCD, mais très peu sont utilisées en pratique (BARKER et al., 1991). Les faux-positifs semblent fausser les TCD de façon non négligeable, pourtant ils sont

plus rares que les faux-négatifs (THEBAULT, 2005).

2 Sensibilité

(a) Définition et origine des faux-négatifs

Parfois, dans 37,5 p.cent des cas en moyenne, une hémolyse auto-immune peut s’accompagner d’un test de Coombs direct négatif (WERNER, 1980; JACKSON & KRUTH, 1985; SLAPPENDEL, 1986). En effet la sensibilité du test est liée à l’importance du revêtement anticorps (pour les IgG, le seuil de positivité est de 150 molécules d’immunoglobulines par hématies) et à la nature de l’anticorps en cause (comportement thermique avec élution rapide des IgM, spécificité anti-IgA absente de l’antiglobuline polyvalente…). Par conséquent ces faux-négatifs ont plusieurs origines :

(i) Une mauvaise condition de pratique du test

• Une élution spontanée des anticorps pouvant survenir suite à : o Un délai d’acheminement trop long o Un pH de la solution de lavage non adéquat o Une interruption de l’étape de lavage o Un lavage trop décapant o L’utilisation d’une solution de lavage autre qu’une solution isotonique o Un ajout tardif de l’antiglobuline à la suspension érythrocytaire o Une agitation excessive lors de la lecture du test o Une centrifugation insuffisante

• Le milieu de prélèvement sanguin n’est pas adéquat. Il est préférable, comme il l’a déjà été vu, d’utiliser l’acide citrique dextrosé ou l’EDTA.

• Une mauvaise réactivité de l’antiglobuline. Cela peut survenir si le réactif est

mal préparé et est contaminé par des bactéries, du sang ou du sérum ou s’il a subit des congélations répétées (WARDROP, 2005).

• La présence de résidus plasmatiques. Si le lavage est incomplet et qu’il existe

des protéines sériques résiduelles, il peut être observé des faux-négatifs car ces résidus neutralisent le réactif en se combinant aux antiglobulines.

• L’utilisation d’antisérum inadapté en force ou en direction : une mauvaise

dilution ou l’utilisation d’une antiglobuline non spécifique d’espèce favorisent les faux-négatifs (FORD, 1980). Enfin un faux-négatifs peut être induit lorsque

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le test de Coombs n’est pas réalisé en présence de la molécule suspecte dans les cas d’AHMI iatrogène (JAIN, 1973).

• La pratique du test à des températures non adaptées à la température

d’activité des anticorps recherchés.

(ii) Autres raisons

D’autres raisons peuvent être évoquées lorsque les manipulations sont bien faites et que des résultats négatifs apparaissent :

• Le diagnostic peut être fiable, c'est-à-dire qu’il s’agit d’un vrai négatif et

l’animal possède des auto-anticorps froids dans son sérum. Dans ce cas les hématies peuvent ne pas être couvertes d’anticorps sérique ou de complément. La détection des auto-anticorps sériques ne pourra se faire qu’à 4°C.

• Les auto-anticorps en causes peuvent également être des IgA (MIESCHER &

DAYER, 1976; SALMON, 1986);

• Les auto-anticorps fixés sur les hématies peuvent également l’être en nombre insuffisant, et ne sont donc pas détectables par le test. Il est nécessaire qu’il y ait au moins 500 molécules IgG et 100 molécules IgM par hématie pour que les immunoglobulines puissent être détectées par le TCD. Cependant des quantités inférieures au seuil de détection sont rarement rencontrées (moins de 2 p. cent des cas) (LEWIS & PICUT, 1989).

• Si le malade vient de se faire transfuser on peut également prévoir un

blocage de l’érythropoïèse ou un épisode d’érythroblastopénie diminuant le taux d’hématies du malade celles, restantes, provenant du sang transfusé il existe un risque accru de faux-positifs par allo-immunisation;

• Le patient peut être dans une phase de rémission de son AHMI, ou bien il a

reçu des corticostéroïdes pendant plus d’une semaine qui peuvent entraîner une négativation du test. Cela est cependant rare (JACKSON & KRUTH, 1985).

(b) Amélioration de la sensibilité du test de Coombs

Les tests permettant une amélioration de la sensibilité ont en général une spécificit é moins bonne que celle du TCD.

(i) Test de Coombs direct à froid

Afin d’augmenter la sensibilité du test il est possible de réaliser un test de Coombs direct à froid qui mettra en évidence les anticorps ayant une activité à froid et ayant tendance à s’éluer à chaud.

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(ii) Solutions salines à faible concentration

Il est également possible d’utiliser comme solution de lavage et de suspension des solutions salines à faible concentration (« low ionic salin solution » ou L.I.S.S.) qui favorisent l’interaction antigène-anticorps. Cela augmenterait ainsi la sensibilité du test en dévoilant des sites antigéniques peu accessibles à certains anticorps (JONES & DARKE, 1975; LEWIS & PICUT, 1989). Cependant il y aurait une augmentation du nombre de faux-positifs étant donnée la dénaturation de la membrane érythrocytaire (BARKER, 2000).

(iii) Prétraitement enzymatique

Les hématies du malades peuvent également être soumises à un traitement enzymatique (en général la papaïne) qui a une action réductrice sur l’acide sialique des hématies et augmente ainsi l’accessibilité des anticorps aux sites antigéniques (voir page 29 de ce travail).

Cependant cette méthode accroît le nombre de faux-positifs car elle dénature une partie de la membrane érythrocytaire.

(iv) Utilisation de substances macromolécualires

Des substances macromoléculaires hydrosolubles comme l’albumine, la polyvinylepyrolidone (PVP) ou le dextran, peuvent favoriser l’agglutination des hématies par diminution du potentiel ζ. Elles sont parfois utilisées comme artifices techniques. L’exemple du test au polybrène® est interessant à détailler (CHABANNE, 2004) : le polybrène® est un polymère d’ammonium quaternaire : le bromide d’héxadimethrine. Ce polycation rompt le potentiel ζ, et provoque une agrégation non spécifique (pseudo-agglutination) des hématies. Si les hématies ont un revêtement anticorps, l’agrégation facilite la survenue d’une réaction antigène-anticorps avec les anticorps agglutinants, comme avec les anticorps non agglutinants ou incomplets. L’action du polybrène est ensuite neutralisée à l’aide d’une solution de citrate sodique : l’agrégation non spécifique disparaît sous l’effet de la neutralisation du polycation, mais si une réaction antigène-anticorps s’est produite; l’agrégation non spécifique laisse place à une agglutination immunologique qui persiste malgré la neutralisation. Ce test permet de détecter un revêtement par des anticorps incomplets sans avoir recours à l’antiglobuline et de mettre en évidence un revêtement de faible importance, ou dont l’isotype est autre que ceux habituellement recherchés. Il en résulte une augmentation de la sensibilité.

(v) Techniques alternatives au test de Coombs

Enfin, il est de plus en plus courant d’utiliser des techniques alternatives au test de Coombs. Se sont ces différentes techniques qui vont être décrites dans la partie suivante.

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3 Bilan : sensibilité et spécificité du test de Coombs direct

Réponse Mécanisme Cause Faux-positifs

• Fixation non immunologique de complément

• Reconnaissance de la transferrine, de l’albumine…

• Reconnaissance d’un antigène d’espèce

• Altération membranaire • Présence d’anticorps ou

de complément non fixés

• Prélèvement sur héparine • Certains états inflammatoires

• Antiglobuline insuffisamment purifiée

• Antiglobuline insuffisamment purifiée (activité anti-espèce)

• Mauvaise conservation des hématies • Lavages insuffisants

Faux-négatifs

• Quantité d’anticorps revêtant insuffisants

• Anticorps d’isotype IgA • Antiglobuline trop

concentrée • Elution spontanée des

anticorps

• Absence de reconnaissance des Ig

• Manque de sensibilité (moins de 500 Ig par hématie)

• Pas de spécificité IgA • Phénomène de zone • Délai d’acheminement trop long ou

lavages ou température du test non adaptés au comportement thermique de l’anticorps

• Antiglobuline non adaptée à l’espèce considérée

Tableau 11 : Interprétation du test de Coombs direct ; faux-positifs et faux-négatifs, d’après (SLAPPENDEL, 1979; SCHLAM, 1980; JONES, 1984).

En conclusion le test de Coombs est un test peu efficace étant donné son manque de

spécificité et de sensibilité. Cependant l’interprétation des résultats doit toujours être corrélée aux données cliniques de l’animal. Devant un tableau clinique fortement évocateur d’une AHMI des investigations supplémentaires ou des artifices techniques peuvent permettrent d’améliorer la sensibilité et la spécificité du test. Il existe aussi de nouvelles techniques couramment utilisées en médecine humaine qui assurent une meilleure efficacité.

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IV. Techniques alternatives au test de Coombs

Les procédures relativement simples de mise en oeuvre de ces nouveaux tests et l’accès de plus en plus facile à certains équipements comme la cytométrie en flux, permettront certainement de remplacer la méthode standard sur tube ou microplaque à fond conique. C’est ainsi qu’en médecine vétérinaire trois tests alternatifs ont été mis à l’épreuve et comparés au test de Coombs direct : le DELAT (Direct Enzyme-Linked Antiglobulin Test), l’immunofluorescence, et le gel-test.

A) Test direct à l’antiglobuline liée à une enzyme (DELAT).

1 Principe du test

Il s’agit d’une technique immuno-enzymatique, dans laquelle l’antiglobuline est marquée par une enzyme. On parle de test direct à l’antiglobuline liée à une enzyme (Direct Enzyme-Linked Antiglobulin Test : DELAT). Il s’agit en fait une adaptation du test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) à la détection des anticorps anti-érythrocytaires. Les modif ications du test ELISA pour parvenir au test DELAT ont été réalisées par Postoway et ses collaborateurs (POSTOWAY et al., 1974).

2 Réalisation

Le test comprends deux types d’anticorps (BARKER, 2000) :

• Des anticorps dits « primaires » : ce sont des anticorps canins anti-IgG, anti-IgM et anti-C3 et préparés chez le lapin qui peuvent se fixer sur les immunoglobulines et / ou les protéines du complément liés aux hématies du chien malade.

• Des anticorps dits « secondaires » : ce sont des anticorps conjugués c'est-à-dire liés à une enzyme phosphatase alcaline, préparés chez le mouton, et anti-IgG de lapin.

Les globules rouges sont mis en suspension après lavage dans des cupules de

microtitration, puis ils sont incubés avec les anticorps primaires, lavés et ensuite incubés avec les anticorps secondaires. Le substrat enzymatique (p-nitrophényl phosphate) est alors ajouté, ce qui permet à la réaction enzymatique d’avoir lieu. Après centrifugation, il y a transfert sur une plaque à microtitration propre. La lecture de la réaction se fait par spectrophotométrie (JONES et al., 1987; WARDROP, 2005).

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Figure 16 : Représentation schématique du DELAT, d’après (JONES et al., 1987;

WARDROP, 2005).

3 Avantages

Toutes les études s’accordent à dire que le DELAT est plus sensible que le TCD. Il permet notamment de détecter des quantités d’immunoglobulines plus faibles liées aux hématies (JONES et al., 1987; BARKER et al., 1992; JONES et al., 1992)

Il est à noter que les auteurs ne parlent pas de la possibilité de faux-positifs.

4 Inconvénients

Les inconvénients de ce test plus sensible sont nombreux :

• Le test doit être fait rapidement après le prélèvement sanguin, ce qui n’est pas toujours réalisable en pratique canine courante ;

• Une réaction colorée artéfactuelle liée à l’activité « phosphatase like » endogène chez les individus sains peut exister (JONES et al., 1992) ;

• Ce test nécessite des antigènes purifiés de synthèse ou recombinés ; • Il s’agit d’une procédure longue ; • Il existe des faux-négatifs liés à une mauvaise technique, une faible capacité

de liaison, une forte dissociation des anticorps liés aux membranes érythrocytaires ou une trop faible concentration des anticorps fixés sur les globules rouges (JONES et al., 1987) ;

• Ce test semble moins spécifique que le TCD car il révèle la présence d’anticorps présents chez de nombreux chiens non atteints d’anémie immunologique (BARKER & JONES, 1993a; DAY, 1999).

Substrat

Substrat

Globule rouge du chien malade

Ajout de l’anticorps primaire

Ajout de l’anticorps secondaire

Enzyme

Ajout du substrat

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Les auteurs concluent donc que le DELAT est suffisamment sensible pour détecter

une augmentation même très faible du nombre d’immunoglobulines et de protéines du complément. Cependant ils émettent tous une réserve car ces phénomènes ne sont pas spécifiques des AHMI. D’autre part certaines conditions de réalisation du test expliquent qu’il soit surtout employé dans le domaine de la recherche.

B) Test par immunofluorescence (cytométrie de flux directe)

1 Principe et réalisation

La cytométrie de flux directe permet de déterminer la classe des anticorps présents sur les globules rouges lors d’AHMI, de détecter le pourcentage d’érythrocytes sensibilisés par les anticorps et donc de suivre la réponse à la thérapie.

On utilise un conjugué fluorescent anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA et anti-C3 qui se f ixe aux anticorps liés à la membrane érythrocytaire. Ce conjugué est spécifique et se lie donc très peu aux hématies saines (WILKERSON et al., 2000).

Chez l’homme, pour détecter les anticorps de patients atteints d’AHMI, c’est la

cytométrie de flux qui est utilisée car il s’agit d’une technique plus sensible que le TCD (ANSMUSSEN et al., 1996; ALVAREZ et al., 2000; WANG et al., 2001).

2 Avantages et inconvénients

En comparaison avec le TCD, l’utilisation de la technique par cytométrie de flux pourrait permettre un résultat plus rapide, moins cher, plus sensible et plus objectif dans la quantification des immunoglobulines et des protéines du complément sensibilisant les hématies (Mc CULLOUGH, 2003).

Récemment deux études ont comparé la sensibilité et la spécificité de cette méthode à celle du TCD chez le chien (voir tableau 12).

Etude de Wilkerson

(WILKERSON et al., 2000) Etude de Quigley

(QUIGLEY et al., 2001) TCD Cytométrie

de flux TCD Cytométrie

de flux Sensibilité (p.cent) 53 92 58 100 Spécificité (p. cent) 87,5 100 100 100

Tableau 12 : Sensibilité et spécificité comparées du TCD réalisé de manière classique sur plaque et de la cytométrie de flux.

On note une meilleure sensibilité lors de la recherche d’anticorps par la cytométrie de flux. Cependant dans l’étude de Quigley, la spécificité avait été définie par le nombre de chiens sains auparavant testés négatifs pour la liaison hématie-IgG. De plus les animaux

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anémiés n’étaient pas pris en considération, par conséquent il y a certainement un biais sur les lots réalisés lors de cette étude.

Une des dernières publications concernant la cytométrie de flux et la médecine vétérinaire date de mars 2005 (KUCINSKIENE et al., 2005). Deux réactifs spécifiques d’espèce anti-IgG sont utilisés: l’un provient d’une chèvre (GalphaD-IgG) et l’autre d’un lapin (RalphaD-IgG). Lors de l’utilisation de la technique par cytométrie de flux, avec le GalphaD-IgG, 8 patients se sont révélés positifs sur les 17 qui étaient négatifs au test de Coombs par la méthode classique. Avec le réactif RalphaD-IgG 3 des chiens se sont révélés positifs à la fois au test de Coombs classique et à la méthode par cytométrie de flux. Ainsi cette étude confirme bien la sensibilité accrue du test par cytométrie de flux par rapport au test sur plaque. Il est notable que pour les deux techniques le type de réactif utilisé fait varier la sensibilité des tests.

La sensibilité et la spécificité de l’IFD semblent donc être excellentes, mais cette

méthode manque encore de standardisation (KUCINSKIENE et al., 2005).

C) Gel tests

Les gel-tests sont une forme d’agglutination sur colonne, où les globules rouges agglutinés peuvent être retenus grâce à une matrice particulière . Ils ont été développés par Lapierre dans les années 80 et consistaient alors en une approche innovante en ce qui concerne la détermination des groupes sanguins et les tests à l’antiglobuline. En médecine humaine ils sont largement utilisés dans le cadre des groupages sanguins et de l’immuno-hématologie.

1 Principe du test

Il s’agit d’une forme d’agglutination en colonne ; les globules rouges agglutinés étant retenus dans une matrice.

La solution érythrocytaire est ajoutée dans chaque microtube directement dans le gel qui contient un réactif monospécifique anti-globuline. Le gel, du fait de sa structure réticulée, laisse traverser lors de sa centrifugation les hématies libres. Celles-ci vont donc sédimenter au fond du tube. Si l’on centrifuge dans les conditions définies, les hématies agglutinées auront du mal à pénétrer le gel ou tout du moins à le traverser et seront piégées par celui-ci (MALYSKA & WEILAND, 1994). La lecture eut se faire directement après centrifugation sans étape de lavage. Les résultats positifs se présentent de différentes façons, permettant ainsi un titrage semi quantitatif en cinq grades numérotés de 1 à 5, en fonction de la distribution des particules agglutinées dans la matrice de gel (Figure 17). Les agglutinats restent en surface ou sont piégés par le gel. Les hématies non agglutinées se retrouvent au fond du tube.

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Figure 17 : Représentation schématique des résultats obtenus lors du gel test et

gradation de ces résultats, d’après (WARDROP, 2005)

2 Réalisation

Lapierre a utilisé un gel à base de dextran et d’acrylamide afin de séparer et de stabiliser les réactions d’agglutination des érythrocytes (LAPIERRE et al., 1990). Un système utilisant des microbilles de verres en tant que gel a déjà était décrit (REIS et al., 1993). Les tests se présentent généralement sous la forme d’une plaquette formée de plusieurs microtubes dans lesquels se déroule la réaction (figure 18).

Figure 18 : Représentation schématique d’une carte de gel-test, d’après (LAPIERRE et

al., 1990).

On peut observer une zone dédiée à l’identification dans la partie inférieure de ses cartes. Chacun de ces microtubes comprend une chambre d’incubation prolongée d’une colonne de gel.

Il existe 3 types de gels en biologie humaine. Les gels neutres contiennent un gel dans un tampon osmotique et ils n’agissent qu’en tant que pièges pour les hématies agglutinées. Les gels spécifiques contiennent un mélange de gel et d’antisérum spécifique. Les gels à

4+ 3+ 2+ 1+ 0

Gel

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l’antiglobuline incorporent des globulines anti-humaines en tant que composant intégral du gel. Certains laboratoires développent des cartes contenant les réactifs (antiglobuline, anti-groupe érythrocytaire humain) ou des milieux particuliers (BFI).

Il est possible de réaliser des gels spécifiques en laboratoire, adaptés aux besoins des vétérinaires, à partir de cartes vierges et de gels fournis séparément. Cependant cette pratique nécessite des manipulations complexes car il faut respecter l’asepsie et les quantités doivent être identiques dans tous les tubes afin que les résultats soient interprétables.

Les mécanismes qui aboutissent à la rétention des agglutinats par ce gel demeurent

mal connus, même si Yves Lapierre émet l’hypothèse d’un phénomène mécanique. Lors de la centrifugation les hématies sont extraites de la suspension et elles entrent en

premier dans le gel. Le milieu environnant primitivement les hématies reste au dessus du gel et les caractéristiques du gel préviennent l’interférence du milieu avec le réactif antiglobuline. Les globules rouges sensibilisés sont agglutinés lorsqu’ils entrent en contact avec l’antiglobuline et c’est ainsi qu’ils sont piégés. Les globules rouges non sensibilisés ne sont pas agglutinés et passent au travers le gel pour former un bouton cellulaire au fond du tube.

3 Avantages et inconvénients

La capacité des gel-tests à séparer les globules rouges des fluides environnants, permet de s’affranchir de l’étape de lavage des hématies indispensable lors de la réalisation d’un TCD.

Etant donné sa facilité de mise en œuvre et la lecture rapide de ce test, de nombreu x laboratoires en médecine humaine l’utilisent de façon préférentielle pour la réalisation du test à l’antiglobuline.

Les comparaisons entre le TCD et cette nouvelle méthode couramment utilisée en

médecine humaine, ont montré que le gel-test est de façon générale plus sensible que la méthode traditionnelle (NATHALANG et al., 1997; NOVARETTI et al., 2004). Cependant une étude (TISSOT et al., 1999) sur un échantillon de 368 personnes montre une sensibilité moindre du gel-test par rapport au TCD notamment lorsque les cellules portent des C3d à leur surface. Toutefois la clinique des patients n’est pas connue dans cette étude, il est donc difficile d’accorder un plein crédit aux résultats apportés par celle-ci.

Les résultats d’une étude française réalisée en 1998 (BENDALI-AHCENE et al.,

1998) sont similaires à ceux des études précédemment citées. En médecine vétérinaire, un test avec un gel neutre a été décrit et pourrait être commercialisé. Cependant dans une publication sur ce gel, il est apparu plus de faux-positifs et de faux-négatifs lors de l’utilisation de la technique sur gel que lors de la réalisation d’un TCD. Les raisons invoquées étaient : une mauvaise technique due à un grand manque de standardisation ou bien un manque de réactivité du gel (WARDROP, 2005) .

Deux autres inconvénients liés à cette méthode sont soulevés dans l’article de

Tissot (TISSOT et al., 1999); tous deux dus à la grande sensibilité du gel test par rapport aux méthodes classiques. En effet le gel test révèle des pseudo-agglutinations à l’origine de rouleaux-formation. Ces faux-positifs peuvent être mis en évidence par des globules rouges incubés uniquement sur milieu BFI. D’autre part, certains chiens de cette étude atteints d’AHMI se sont révélés positifs alors qu’ils étaient négatifs avec le test de Coombs classique.

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Ceci pose le problème du seuil de détection des anticorps anti-érythrocytaires qui est en fait plus bas en gel que selon les techniques classiques.

En résumé, la technique sur gel présente de nombreux avantages ; plus sensible, elle

permet de détecter des anticorps présents même à titre très faible sur les hématies. Ceci devrait autoriser un diagnostique plus précoce et permettre au clinicien d’apporter un traitement mieux adapté. La facilité d’utilisation, l’absence d’étape de lavage des hématies et la standardisation de la centrifugation et de la lecture rendent les gel-tests attractifs pour une utilisation de routine en laboratoire. On observe en effet une reproductibilité ainsi qu’une objectivité de lecture du gel test très satisfaisantes ce qui autorise son automatisation (déjà effective en médecine humaine) et / ou son utilisation possible sous forme de « doctor test » au chevet du malade. Le gel test est une méthode et un outil de choix.

Les gel-tests sont aussi utilisés dans la réalisation des tests indirects à l’antiglobuline.

Bromilow et ses collaborateurs (BROMILOW et al., 1993) et Pinkerton et ses collaborateurs (PINKERTON et al., 1993) estiment que les résultats obtenus avec le gel-test et la technique traditionnelle du TCI sont similaires.

La sensibilité des tests de Coombs réalisés selon la méthode traditionnelle sur plaque

ou tube, étant parfois insuffisante, de nouvelles techniques plus sensibles ont été développées. Le gel-test et la cytométrie de flux peuvent être utilisés en cas de résultats négatifs

avec une clinique évocatrice. Par contre une meilleure sensibilité peut altérer la spécificité des tests.

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Troisième partie -

Détermination du seuil de positivité du test de Coombs : étude expérimentale.

Étude personnelle

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I. Matériel et méthode

A) Echantillon

La population étudiée est une population de référence constituée de 100 chiens en apparente bonne santé, médicalisés et appartenant à des particuliers (membres du corps enseignant, personnels, étudiants, ou clients de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon).

Les propriétaires ont été soumis à un interrogatoire sur le statut sanitaire de leur

animal ce qui permet à notre échantillon d’être le plus représentatif possible d’une population saine. Un questionnaire (annexe 3) leur était remis. Celui-ci prenait en compte le statut vaccinal du chien (vaccins contre la maladie de Carré, l’hépatite de Rubarth, la parvovirose, les leptospiroses et éventuellement la rage) ainsi que les traitements récents ou éventuellement en cours.

Parallèlement un examen clinique de routine était réalisé, comprenant l’inspection du

pelage et de la peau, la prise de la température rectale, la palpation des nœuds lymphatiques superficiels, une palpation abdominale et une auscultation cardiaque et pulmonaire.

Enfin un hémogramme était effectué.

Paramètres Valeurs usuelles Hématies (T/L) 5,5 - 8,5 Hémoglobine (g/dL) 12,0 - 18,0 Hématocrite (%) 37 - 55 VGM (fl) 60 - 77 CCMH (g/dL) 32 - 36 TCMH (pg) 19,5 - 24,5 Réticulocytes (sur 1000 hématies) 0 -15 Leucocytes (G/L) 6 -17 Polynucléaires neutrophiles (G/L) 60 - 80 % = 3,0 – 11,8 Polynucléaires éosinophiles (G/L) 2 - 10 % = 0,1- 1,25 Polynucléaires basophiles (G/L) Rares Lymphocytes (G/L) 12 - 30 % = 1 – 4,8 Monocytes (G/L) 3 – 10 % = 0,15 – 1,35 Plaquettes (103 /mm3) 200 – 500

Figure 19 : Hémogramme : valeurs de référence chez le chien, d’après (JAIN, 1973).

Les prélèvements ont tous eu lieu à la veine jugulaire après tonte et nettoyage aseptique. Ils ont été réalisés par une ponction franche de la veine avec du matériel classique (seringue de 10 mL TERUMO et aiguille TERUMO Neolus 21G, 0,8*25). Le diamètre de l’aiguille doit être suffisamment large afin d’éviter toute hémolyse, les hématies canines étant relativement fragiles. Puis environ 5 mL de l’échantillon sanguin était distribué dans un tube contenant de l’EDTA tripotassique (TERUMO, Venoject, EDTA K3) qui était retourné plusieurs fois pour homogénéiser le mélange sang-anticoagulant. Le laboratoire

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d’hématologie de l’ENVL réalisait la numération sanguine et la coloration du frottis sanguin au May-Grünwald-Giemsa permettait d’établir la formule leucocytaire.

B) Réalisation de tests de Coombs direct

Pour cette étude, le manque de spécificité et de sensibilité du test de Coombs direct lié aux manipulations a été réduit au maximum par un choix raisonné du protocole de réalisation des tests.

Celui-ci a donc été choisi en se basant sur les données bibliographiques mais aussi en

tenant compte de l’expérience des techniciennes habituées à travailler selon une méthode utilisée depuis plus de 20 ans au laboratoire d’Immunologie et d’Hématologie de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon.

1 Réalisation des tests de Coombs

L’ensemble des tests de Coombs ont été réalisés au laboratoire d’Immunologie et d’Hématologie de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon.

Le sang des chiens a été prélevé sur tube EDTA et a été traité dans la demi-journée

suivant le prélèvement. Les hématies ont été séparées du plasma par centrifugation à 2000 tours par minute,

pendant 10 minutes et à + 22°C pour un test à chaud ou + 4°C pour un test à froid (figure 20). Le plasma est éliminé et le culot érythrocytaire est lavé trois fois dans une solution de

PBS (Na2HPO4 0, 0073 M, NaH2PO4 0,0013 M et NaCl 0,140 M, pH = 7,5). Cette solution est réfrigérée et maintenue à + 4°C lors de la réalisation d’un test de Coombs à froid.

Figure 20 : Centrifugeuse utilisée dans l’étude.

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Après le dernier lavage, les hématies sont remises en suspension dans le même soluté à la concentration finale de 2 p. cent. Cela était obtenu en ajoutant 4,9 mL de solution de PBS (même solution que celle utilisée lors des lavages, maintenue à + 4°C s’il s’agit d’un test à froid) à 50 µl de la dernière solution de lavage (figure 21).

Figure 21 : Réalisation de la suspension érythrocytaire.

La technique sur microplaques à fond conique (figure 22) est la technique qui a ét é

choisie car elle est plus économique qu’une technique sur tube : elle permet de réaliser un nombre plus important de dilution du réactif et d’utiliser de plus petits volumes à la fois d’antiglobuline et de suspension érythrocytaire par puit.

Pour chaque test cinq séries de dilution de raison 1/2 (de 1/2 à 1/128) sont réalisées à

partir du réactif de Coombs polyvalent choisi (anti-IgM, anti-IgG et anti-C3 de chien), ainsi qu’un témoin d’auto-agglutination.

Le test lui-même est réalisé en mélangeant à parts égales chaque dilution

d’antiglobuline et la suspension d’hématies à 2 p. cent.

50 µL + 4,9 mL de PBS

Suspension érythrocytaire

Echantillon après trois lavages

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Figure 22 : Microplaque à fond conique

Les plaques sont ensuite laissées à incuber à + 37°C pour un test à chaud ou à + 4°C

pour un test à froid pendant 30 minutes, puis à température ambiante pendant quelques minutes avant la lecture du test.

L’agglutination est appréciée visuellement. Le degré de sensibilisation des hématies

est évalué par la plus forte dilution de l’antiglobuline pour laquelle une agglutination est observée. Toutes les lectures ont été réalisées à l’œil nu car aucune d’entre elle n’a été suffisamment ambiguë pour nécessiter une observation microscopique (figure 23).

Une ligne = Un chien

Témoin d’auto-agglutination

Dilution 1/2 Dilut ion 1/4 Dilution 1/8 …

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Figure 23 : Lecture du test de Coombs direct.

2 Choix du réactif

Le réactif employé tout au long de l’étude est une antiglobuline canine spécifique et polyvalente (anti-IgM, anti-IgG et anti-C3) et obtenue par immunisation de lapins. Elle est commercialisée par le laboratoire MP Biomedicals (Solon, OH, USA) sous le nom de : Canine Anti-globulin (Coombs reagent).

Le réactif de Coombs est livré sous forme lyophilisée. Un millilitre de matériel

reconstitué est suffisant pour faire 10 tests en utilisant la méthode sur tube, ou pour faire 50 tests lors de l’utilisation de la méthode sur plaque à fond conique.

La reconstitution du substrat lyophilisé est réalisée avec de l’eau déionisée. Il faut alors bien mélanger afin d’assurer une solubilisation parfaite du réactif lyophilisé.

Il se conserve entre 2 et 8°C sous sa forme lyophilisée. Après reconstitution avec de

l’eau déionisée, il doit être conservée à -20°C et demeure stable un an. La notice est jointe en annexe 2 de ce travail.

Témoins : zone de comparaison

Positif ++

Négatif Positif +

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3 Bilan

Le tableau 13 reprend l’ensemble des étapes du protocole suivi lors de la réalisation des tests de Coombs en ce qui concerne cette étude.

Prélèvement et préparation des échantillons de sang.

- 4 mL de sang dans un tube sec et 4 ml dans un tube EDTA. - 3 lavages successifs : du PBS est ajouté à l’échantillon le tout est mis à centrifuger durant 10 minutes à 2000 tours par minute et à 22°C. Le sérum est retiré. Puis deux autres lavages sont réalisés de la même façon.

- 4,9 mL solution de PBS (Phosphate-Buffered-Saline) est prélevé et placé dans le tube de 10 ou 12*75mm auquel était ajouté 0,1 mL de l’échantillon préparé. Ceci permet d’obtenir 5 mL d’une suspension érythrocytaire à 2%. Contrôle négatif : pas d’antiglobuline dans le premier puit.

Procédure du test Dilution du réactif de Coombs

Tous les puits sont remplis avec 50 µL de PBS. 50 µL de réactif est pipeté et placé dans le deuxième puit (correspondant à la dilution 1/2), le tout est bien mélangé. 50 µL du puit précédent est prélevé et placé dans le puit suivant (correspondant par conséquent à la dilution 1/4) Et ainsi de suite jusqu’à la dilution 1/128. Ces étapes permettent d’obtenir un réactif aux dilutions de 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, et 1/128.

Réalisation du test de Coombs 50 µL de la solution érythrocytaire lavée du chien est placé dans chaque microcupule. Le tout est mélangé doucement et mis à incuber 30 minutes à 37°C.

Interprétation Un titre important d’agglutination (comparé au témoin négatif) pour l’échantillon d’un patient indique que les hématies de ce patient sont recouvertes par des anticorps ou des protéines du complément. Le test n’est considéré positif que si le témoin négatif ne présente pas d’agglutination ou si elle est moins importante que celle observée pour l’échantillon du patient.

Tableau 13 : Protocole utilisé dans le cadre de l’étude.

La réalisation des tests de Coombs à froid repose sur le même principe, mais la

suspension érythrocytaire est réalisée sous couvert du froid. Pour cela la solution de lavage est refroidie à 4°C de même que le prélèvement sanguin. La centrifugation a lieu a 4°C ainsi que l’incubation.

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II. Résultats

L’ensemble des résultats sont consignés dans l’annexe 8.

A) Définition de la positivité du test de Coombs direct

Au cours de cette expérimentation, un test de Coombs était considéré comme positif à partir du moment où une agglutination était observée; même si celle-ci n’était évaluée que de bas grade. Ainsi un test positif au titre 2 avec un voile d’agglutination même discret (donc de grade 1) était considéré comme positif. De même un test fortement positif au titre 2 et plus faiblement positif au titre 4 était considéré comme positif au titre 4.

En résumé la positivité du test se donne en prenant le titre correspondant à la

dernière valeur positive obtenue avec un animal sain, et non pas le titre correspondant à la première valeur négative.

Les valeurs utilisées sont grisées dans l’annexe 8.

B) Résultats

Une synthèse des résultats est présentée dans le tableau 14 :

N=100 Titre 2 Titre 4 Titre 8 Titre 16 Titre 32 Titre 64

TEST A CHAUD

Résultats positifs

5

30

0

1

0

0

TEST A FROID

Résultats positifs

36

24

10

1

0

0

Tableau 14 : Résultats positifs des tests de Coombs direct à chaud et à froid en fonction du titre d’antiglobuline .

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L’observation des résultats donne une situation assez tranchée. Pour le test de Coombs à chaud il est obtenu :

• 5 p.cent de résultats positifs au titre 2 • 30 p.cent de résultats positifs au titre 4 • 1 p. cent de résultat positif au titre 16 • 100 p.cent de résultats négatifs au titre 32

Et pour le test de Coombs à froid : • 36 p.cent de résultats positifs au titre 2 • 24 p.cent de résultats positifs au titre 4 • 10 p.cent de résultats positifs au titre 8 • 1 p. cent de résultat positif au titre 16 • 100 p.cent de résultats négatifs au titre 32

A première vue le test à froid semble effectivement plus sensible (avec 10 p. cent de

positifs au titre 8 notamment contre 0 p. cent pour le test à chaud), il serait donc justifié que le seuil du test à froid soit plus élevé que celui du test à chaud. C’est ce qui va être vérifié dans la partie suivante.

C) Définition d’un seuil

L’établissement d’un seuil de positivité est l’élément qui permettra de déterminer si le

test effectué sur un chien peut être considéré comme positif ou non. Le calcul de ce seuil est primordial car il influence les caractéristiques de ce test. En

effet, la sensibilité et la spécificité du test, qui varient en sens inverse, dépendent de ce seuil. Une étude récente (OVERMANN et al., 2007) montre que les animaux atteints

d’AHMI et positifs aux test de Coombs direct présentent une agglutination à un titre supérieur ou égal à 1/32 lors de l’utilisation d’une antiglobuline du commerce : VMRD (Pullman, WA, USA). Pouvons nous conclure à un seuil de positivité de 1/32 ?

D’après Pastoret (PASTORET et al., 1990), on peut calculer le seuil de positivité

d’une épreuve à partir de la limite inférieure de détection de la méthode envisagée. Ce seuil correspond à la valeur maximale que peut atteindre un animal indemne. Lorsqu’on fait varier le seuil de positivité, on augmente ou on diminue les résultats

faussement positifs ou faussement négatifs au sein de la population. Il s’agit ici de définir le seuil de positivité du test de Coombs direct à chaud et à froid, or le seuil de positivité correspond à la valeur maximale que peut atteindre un animal sain. Par conséquent cette valeur maximale ne peut correspondre qu’au titre avec lequel on obtient le dernier résultat positif, résultat positif qui ne peut être que faussement positif au sein d’une population statistiquement indemne. Ceci s’explique par la distribution statistique des anticorps au sein de la population. Dans une population indemne, la plupart des animaux n’aura pas d’anticorps détectables. Néanmoins certains de ces animaux peuvent avoir un faible taux d’anticorps, dirigés contre les micro-organismes qui croisent du point de vue antigénique ou qui

- 99 -

interagissent faiblement et de manière non spécifique avec l’antigène. De même, dans une population de malades, si le niveau moyen des anticorps est élevé, des animaux effectivement atteints auront un taux d’anticorps faible.

En pratique, de nombreux auteurs préconisent pour établir ce seuil d’éprouver un

échantillon statistiquement représentatif d’une population indemne. Le seuil est alors calculé en ajoutant à la moyenne des valeurs obtenues deux ou trois écarts-types selon le degré de précision désiré. Cependant, dans le cas des titres du test de Coombs, il s’agit d’une variable discrète et qualitative ; aucun calcul statistique ne peut donc être réalisé ; seule une représentation graphique par diagramme est valable.

1 Seuil du test de Coombs direct à chaud

Le seuil de positivité en ce qui concerne le test de Coombs direct à chaud serait donc, de façon subjective, égal au titre 16 (tableau 14).

Pour confirmer ou infirmer cette hypothèse il convient de réaliser un diagramme (voir figure 24).

Figure 24 : Répartition des chiens positifs au test de Coombs direct à chaud

en fonction du titre pour lequel une agglutination est observée.

D’après cette répartition graphique il est notable qu’au dessus du titre 4, un seul chien est positif (au titre 1/16).

On peut donc conclure, dans le cadre d’une gamme de dilution classique, à un

seuil de positivité égal au titre 4, avec une spécificité de 99 p. cent pour le test de Coombs direct à chaud.

0

5

10

15

20

25

30

35

Titre 2 Titre 4 Titre 8 Titre 16

Titre

Nom

bre

de

chie

ns (%

)

- 100 -

2 Seuil de positivité du test de Coombs direct à froid

Selon le même principe (Figure 25) :

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Titre 2 Titre 4 Titre 8 Titre 16

Titre

No

mb

re d

e ch

iens

(%

)

Figure 25 : Répartition des chiens positifs au test de Coombs direct à froid en fonction du titre pour lequel une agglutination est observée.

D’après cette répartition graphique il est notable qu’au dessus du titre 8, un seul chien est positif (au titre 1/16).

On peut donc conclure, dans le cadre d’une gamme de dilution classique, à un

seuil de positivité égal au titre 8, avec une spécificité de 99 p. cent pour le test de Coombs direct à froid.

Finalement, dans le cadre d’une gamme de dilution classique et selon le protocole

de réalisation préalablement défini, le seuil de positivité est égal au titre 4 pour le test de Coombs direct à chaud et au titre 8 pour le test de Coombs direct à froid et cela avec une spécificité de 99 p. cent.

- 101 -

III. Discussion

La discussion va porter tout d’abord sur la représentativité de notre échantillon. En effet un échantillon non représentatif biaiserait les résultats obtenus qui ne seraient pas interprétables.

A) Représentativité de l’échantillon

Les animaux choisis sont en apparente bonne santé et tous les facteurs qui sont réputés pour influencer la sensibilité et la spécificité du test de Coombs direct comme les néoplasies, les traitements corticoïdes, les transfusions ou les gestations étaient des critères d’exclusion. Les animaux dont l’hémogramme était hors des valeurs usuelles ont également été exclus de l’étude.

L’échantillon n’est donc constitué que d’animaux sains. Bien entendu il est difficile d’être certain de ce paramètre.

La population est constituée de 100 chiens. Les races représentées sont diverses mais

avec une nette prédominance de Golden Retriever et de Labrador étant donné l’apport important de chiens issus de l’association Handi’Chien.

Les âges extrêmes vont de 3 mois à 15 ans et les deux sexes sont représentés avec un sexe ratio de 56 femelles et 44 mâles. Certains de ces animaux sont stérilisés.

Afin d’être certain que cet échantillon est représentatif, il est nécessaire de le comparer

à une population de référence plus vaste. Cette population de référence est constituée de l’ensemble des chiens présentés en consultation à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon de septembre 2006 à mai 2007.

Les variables démographiques servant de support pour cette comparaison sont issues

de la première étape de la consultation : les commémoratifs. Trois variables ont été prises en compte (tableau 15) : le sexe de l’animal, l’âge de

l’animal à la consultation, et la race.

• Le sexe est une variable binaire : « mâle »/ « femelle » • L’âge à la consultation est une variable à trois modalités : « de 0 à 3 ans », « de

3 à 7 ans » et « plus de 7 ans » • La race : chaque race est une modalité. Les races recensées sont celles définies

par la Société Centrale Canine (SCC), auxquelles on ajoute une catégorie regroupant les animaux issus de croisements ou d’origines inconnues, c'est-à-dire dont l’ascendance n’est pas contrôlable en l’absence d’inscription au Livre des Origine Française (LOF). En accord avec les usages, ces chiens ont été qualifiés de « croisés ».

- 102 -

Tableau 15 : Modalités de chaque variable démographique prises en compte pour

l’étude de la représentativité de l’échantillon.

1 Etude de la répartition des populations canines en fonction du sexe

La population de référence est constituée de 52 p. cent de mâles et de 48 p.cent de femelles. Notre échantillon est constitué de 44 p. cent de mâles et de 56 p.cent de femelles (tableau 16).

Echantillon Population de référence Mâles 44 48 Femelles 56 52

Tableau 16 : Répartition des populations canines selon leur sexe.

La réalisation d’un test de χ2 permet de prouver que notre échantillon n’est pas

signif icativement différent de la population canine de l’ENVL en ce qui concerne les sexes : χ

2 (observé) = 0,64 < χ2 (théorique, pour v = 1) = 3,84 au risque 5%.

Figure 26 : Représentation graphique de la distribution comparée de la variable « sexe », entre la population de référence et l’échantillon.

Variables Modalités Sexe Mâle Femelle Age [0 - 3 ans [ [3 ans- 7ans [ ≥ 7 ans Race Chaque race est une modalité

FemellesMâles

Echantillon

Population de référence

0

10

20

30

40

50

60

Pourcentage de chien

Echantillon

Population de référence

- 103 -

Entre 0 et 3 ansEntre 3 et 7 ans

Plus de 7 ans

Echantillon

Population de référence0

10

20

30

40

50

Pourcentage de chiens

Echantillon

Population de référence

2 Etude de la répartition des populations canines en fonction des classes d’âge

La population canine est divisée en trois classes d’âge (tableau 17) :

Echantillon Population de référence [0 – 3 ans [ 35 25 ] 3 – 7 ans [ 29 26 Plus de 7 ans 36 49

Tableau 17 : Répartition des populations canines selon leur classe d’âge.

La réalisation d’un test de χ2 permet de prouver que notre échantillon n’est pas

signif icativement différent de la population canine de l’ENVL en ce qui concerne les âges : χ

2 (observé) = 7,79 < χ2 (théorique, pour v = 3) = 7,81 au risque 5%.

Figure 27 : Représentation graphique de la distribution comparée de la variable « classes d’âge », entre la population de référence et l’échantillon.

3 Etude de la répartition des populations canines en fonction des races

Les races les plus représentées dans les deux populations étudiées sont données dans le tableau 18 :

- 104 -

Labra

dor

Gol

de

n re

trieve

r

Cro

isé

York

shire

Berg

er a

llem

and

Canic

he

Boxe

r

Epagneul b

reto

n

Rottweile

r

Aut

res race

s Echantillon

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Pourcentage de chiens

Echantillon

Population de référence

Echantillon Population de référence Labrador 10 10 Golden retriever 17 5 Croisé 8 16 Yorkshire 5 5 Berger allemand 6 6 Caniche 6 6 Boxer 6 3 Epagneul breton 5 2 Rottweiler 4 3 Autres races 33 44

Tableau 18 : Répartition des populations canines selon leur race.

Les sous-populations sont trop petites (moins de 5 individus pour certaines races de l’échantillon) pour qu’un test de χ2 puisse être réalisé. Néanmoins la figure suivante (figure 28) nous montre que la répartition raciale de l’échantillon est similaire à celle de la population de référence. Ainsi le Labrador arrive en premier rang dans les deux populations. Le Golden retriever est moins représenté dans la population de référence que dans l’échantillon car ce dernier est biaisé par le fait que les chiens prélevés appartenaient pour la plupart aux étudiants de l’ENVL dont beaucoup sont « famille d’accueil » au profit de l’association Handi-Chien qui privilégie les races Labrador et golden Retriever.

Figure 28 : Représentation graphique de la distribution comparée de la variable « race » entre la population de référence et l’échantillon .

- 105 -

En conclusion l’échantillon choisi est représentatif de la population canine présentée en consultation à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon en ce qui concerne les classes d’âge et les sexes.

B) Seuil de positivité du test de Coombs

Trouver le meilleur compromis entre sensibilité et spécificité du test, c’est définir la meilleure valeur du seuil de positivité du test.

La conséquence d’un test positif étant la mise en route d’un traitement, il s’agit donc

d’évaluer le meilleur rapport « bénéfice-coût ». Le « coût » est l’inconvénient de traiter un bien-portant à tort (en termes monétaires tant qu’en termes de santé), c'est-à-dire de mettre en place une corticothérapie sur un animal sain en sachant bien qu’il ne s’agit pas d’un traitement anodin étant donnés les risques dus aux effets secondaires des corticoïdes. Le bénéfice est l’avantage de traiter un patient à bon escient, c'est-à-dire de traiter un animal souffrant d’une anémie hémolytique à médiation immune.

En situation de grande sensibilité on prend le risque de faux-positifs. En situation de grande spécificité, celui de faux-négatifs. Si faux-positifs et faux-négatifs ont le même coût, on choisit comme seuil celui qui donne globalement plus de diagnostics exacts. Si les faux-positifs ont un coût supérieur, on choisit le seuil qui donne peu de faux-positifs, c'est-à-dire une sensibilité plus faible, même si cela se fait au dépend d’un plus grand nombre de faux-négatifs. Autrement dit, est il judicieux de mettre en place une corticothérapie sur un chien anémié et positif au grade 1 à 1/8 au test de Coombs direct à chaud?

En prenant le titre 8 comme seuil, un chien sain de l’échantillon (numéro 75), doit être considéré comme positif au test direct à chaud : en effet il est positif à 1/8 pour le grade 2 et 1/16 pour le grade 1. Pour le test à froid, plus sensible en règle générale, il y a 10 chiens sains positifs (9 au 1/8 et un au 1/16). Cependant pour ces chiens la positivité n’est que de grade un.

Aurions-nous du mettre en place un traitement ? Bien sûr, la question parait ici

insensée étant donné que nous parlons de chiens apparemment sains. Pourtant il n’existe pas de moyens sur permettant de faire une discrimination nette entre les statuts malades et indemnes.

Le contexte clinique est donc primordial. En effet avant de réaliser un test le

contexte clinique permet d’établir une probabilité d’existence de la maladie, la probabilité pré-test. Un test positif augmente la probabilité d’existence de la maladie, un test négatif la diminue. La probabilité post-test représente la situation après le test. Parfois la probabilité post-test est de 100%, si le test n’a aucun faux-positifs (par exemple la présence de tissus néoplasiques à l’histologie). Ce test est très spécifique. Parfois, la probabilité post-test est nulle, si le test n’a aucun faux-négatifs. Cet examen est alors très sensible.

Le test qu’il soit positif ou négatif peut ne pas changer la décision. Quelle est alors son

utilité ? Pour chaque action, diagnostique ou thérapeutique, le clinicien a un seuil de probabilité en dessous duquel il s’abstient, le seuil de traitement. Il dépend du bénéfice global que l’on attend de l’action, équilibre entre la l’amélioration potentielle de l’état de santé et les effets secondaires possibles. Si la possibilité de maladie dépasse largement le

- 106 -

seuil de traitement, celui-ci est entrepris sans même avoir véritablement besoin de réaliser d’autres examens para-cliniques, qui n’ont aucune chance de faire changer l’indication du traitement.

En conclusion, un chien atteint d’une anémie hémolytique, présentant une splénomégalie et / ou une hépatomégalie, pour lequel le frottis sanguin révèle des sphérocytes et / ou une agglutination sur lame avec un test de Coombs direct à chaud seulement positif au titre 4, doit être traité.

Il est donc recommandé de choisir son seuil en fonction de l’état clinique de l’animal :

une clinique très évocatrice d’une anémie hémolytique à médiation immune et associée à un test de Coombs négatif ne doit pas empêcher la mise en place d’un traitement.

- 107 -

CCOONNCCLLUUSSIIOONN

Le test de Coombs est un test de référence en immuno-hématologie. Il est encore couramment utilisé en médecine vétérinaire dans le cadre de la détection d’immunoglobulines ou de facteurs du complément fixés sur les hématies et cela particulièrement lors de suspicion d’anémie hémolytique à médiation immune.

Il est intéressant de connaître le seuil de positivité de ce test semi quantitatif car il

conditionne le résultat (positif ou négatif) du test. Cette étude a permis de déterminer un seuil de positivité pour la technique employée à

l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon. Ainsi le test de Coombs direct peut être considéré comme positif à partir du titre 4 en lorsqu’il s’agit d’un test à chaud et à partir du titre 8 pour un test à froid.

Ce travail ne devrait être que le premier pas vers la définition des conditions optimales

d’utilisation du test de Coombs, car il n’existe pas de consensus en médecine vétérinaire en ce qui concerne le protocole de réalisation du test de Coombs. Chaque laboratoire utilise une méthodologie différente adaptée des publications parues sur le sujet, ajustée selon le protocole préconisé par le laboratoire délivrant le réactif et, le plus souvent, dérivant de techniques utilisées en médecine humaine.

Néanmoins l’avenir du test de Coombs ne réside peut être pas dans l’amélioration

technique de sa réalisation, mais dans la recherche de tests alternatifs permettant de détecter les anticorps incomplets. En effet, certains de ces tests, plus sensibles et utilisés couramment en médecine humaine, semblent pouvoir être adaptés pour une utilisation pratique par les laboratoires vétérinaires.

- 108 -

- 109 -

AANNNNEEXXEESS

- 110 -

- 111 -

Annexe 1: Notice de l’antiglobuline canine de VMRD (Pullman, WA, USA)(1)

- 112 -

Annexe 1: Notice de l’antiglobuline canine de VMRD (Pullman, WA, USA)(2)

- 113 -

Annexe 2 : Notice de l’antiglobuline canine de MP Biomedicals (Solon, OH, USA) (1)

- 114 -

Annexe 2 : Notice de l’antiglobuline canine de MP Biomedicals (Solon, OH, USA) (2)

- 115 -

Annexe 2 : Notice de l’antiglobuline canine de MP Biomedicals (Solon, OH, USA) (3)

- 116 -

Annexe 3 : Fiche établie pour chacun des chiens de l’échantillon

RENSEIGNEMENTS GENERAUX Nom de l’animal Race Sexe Age Vaccinations :

o Dernière date : o Maladie de Carré o Hépatite de Rubarth o Parvovirose o Leptosirose o Rage

Vermi fugations régulières (2 fois par an) ? ANTECEDENTS PATHOLOGIQUES

-Pathologies (pathologies articulaires, insuffisance hépatique, néoplasies, atteintes pulmonaires, atteintes rénales….) :

-gestation : -transfusions : EXAMEN CLINIQUE

o D’après dossier o Réalisé o Autre :

PRELEVEMENTS o EDTA o Sec o Donneur éventuel : groupage

Gerber Emmanuelle Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon 1 avenue Bourgelat 69280 MARCY L’ETOILE

- 117 -

Numéro de l'animal Sexe Numéro de l'animal Sexe 1 Mâle 51 Mâle 2 Femelle 52 Mâle 3 Femelle 53 Mâle 4 Femelle 54 Mâle 5 Mâle 55 Mâle 6 Femelle 56 Mâle 7 Mâle 57 Mâle 8 Femelle 58 Mâle 9 Femelle 59 Mâle 10 Femelle 60 Mâle 11 Femelle 61 Mâle 12 Femelle 62 Mâle 13 Femelle 63 Mâle 14 Mâle 64 Mâle 15 Mâle 65 Mâle 16 Mâle 66 Mâle 17 Femelle 67 Mâle 18 Mâle 68 Mâle 19 Femelle 69 Femelle 20 Mâle 70 Mâle 21 Femelle 71 Mâle 22 Femelle 72 Femelle 23 Femelle 73 Mâle 24 Femelle 74 Femelle 25 Femelle 75 Femelle 26 Femelle 76 Mâle 27 Femelle 77 Femelle 28 Mâle 78 Femelle 29 Mâle 79 Femelle 30 Mâle 80 Mâle 31 Femelle 81 Femelle 32 Mâle 82 Mâle 33 Mâle 83 Mâle 34 Mâle 84 Femelle 35 Femelle 85 Mâle 36 Femelle 86 Mâle 37 Femelle 87 Femelle 38 Mâle 88 Femelle 39 Mâle 89 Femelle 40 Femelle 90 Femelle 41 Femelle 91 Femelle 42 Mâle 92 Femelle 43 Mâle 93 Mâle 44 Mâle 94 Mâle 45 Mâle 95 Femelle 46 Mâle 96 Mâle 47 Mâle 97 Femelle 48 Mâle 98 Femelle 49 Mâle 99 Mâle 50 Mâle 100 Femelle

Annexe 4 : Sexe des chiens de l’échantillon

- 118 -

Chien Age Chien Age 1 Epagneul breton 51 Croisé 2 Golden Retriever 52 Caniche 3 Golden Retriever 53 Golden Retriever 4 Golden Retriever 54 Yorkshire 5 Golden Retriever 55 Golden Retriever 6 Bouvier bernois 56 Berger Allemand 7 Beagle 57 Bichon 8 Cocker 58 Labrador 9 Caniche 59 Golden Retriever 10 Labrador 60 Caniche 11 Labrador 61 Labrador 12 Jack Russel Terrier 62 Caniche 13 Labrador 63 Berger Allemand 14 Tervueren 64 Labrador 15 Beauceron 65 Caniche 16 Berger des Pyrénées 66 Yorkshire 17 Malinois 67 Berger Allemand 18 Rottweiler 68 Boxer 19 Rottweiler 69 Boxer 20 Beauceron 70 Golden Retriever 21 Dalmatien 71 Croisé Border-Beauceron 22 Braque allemand 72 Boston Terrier 23 Pointer 73 Bichon 24 Boxer 74 Springer spaniel 25 Croisé 75 Croisé labrador 26 Epagneul breton 76 Boxer 27 Saint Bernard 77 Border Collie 28 Croisé 78 Golden Retriever

29 American Staffordshire

terrier 79 Labrador 30 Dalmatien 80 Golden Retriever 31 Bouvier bernois 81 Labrador 32 Croisé bouvier bernois 82 Beauceron 33 Rottweiller 83 Braque français 34 Croisé bull terrier 84 Terrier du Tibet

35 American Staffordshire

terrier 85 Bichon 36 Berger blanc suisse 86 Doberman 37 Bull Mastiff 87 Berger Allemand 38 Golden Retriever 88 Croisé 39 Tervueren 89 Golden Retriever 40 Labrador 90 Bichon 41 Labrador 91 Golden Retriever 42 Rottweiller 92 Berger belge Tervueren 43 Yorkshire 93 Epagneul breton 44 Berger Allemand 94 Golden Retriever 45 Yorkshire 95 Bouledogue français 46 Golden Retriever 96 Golden Retriever 47 Caniche 97 Epagneul breton 48 Berger Allemand 98 Boxer 49 Yorkshire 99 Epagneul breton 50 Golden Retriever 100 Boxer

Annexe 5 : Race des chiens de l’échantillon

- 119 -

Chien Age Chien Age 1 1 an et 2 mois 51 7 ans et 7 mois 2 1 an et 8 mois 52 8 ans et 8 mois 3 4 ans 53 11 ans et 9 mois 4 14 mois 54 14 ans et 2 mois 5 2ans 55 10 ans et 1 mois 6 1 an et 5 mois 56 6 ans 7 2 ans et demi 57 10 ans et 3 mois 8 1 an 58 9 ans et 2 mois 9 5 ans et 11 mois 59 5 ans et 10 mois 10 8 ans et 9 mois 60 8 ans et 3 mois 11 10 mois 61 7 ans et 6 mois 12 11 ans et 9 mois 62 8 ans 13 3 mois 63 5 ans et 3 mois 14 7 ans 64 8 ans et 11 mois 15 1 an et 11 mois 65 8 ans et 1 mois 16 5 ans et 7 mois 66 9 ans et 8 mois 17 1 an 67 6 ans et 4 mois 18 1 an et 3 mois 68 7 ans et 3 mois 19 1 an et 10 mois 69 12 ans et 2 mois 20 6 ans et 10 mois 70 10 ans et 10 mois 21 2 ans et 1 mois 71 4 ans et 3 mois 22 11 ans et 5 mois 72 5 ans et 9 mois 23 7 mois 73 3 ans et 6 mois 24 1 an et 3 mois 74 1 an et 11 mois 25 10 mois 75 7 ans et 3 mois 26 9 mois 76 4 mois 27 1 an et 5 mois 77 10 mois 28 1 an et 10 mois 78 11 mois 29 1 an et 2 mois 79 8 ans et 5 mois 30 4 ans 80 10 mois 31 1 an et 7 mois 81 3mois 32 7 ans 82 3 ans et 11 mois 33 7 ans et 4 mois 83 1 an et 3 mois 34 7 ans et 4 mois 84 6 ans et 3 mois 35 3 ans et 3 mois 85 5 ans et 3 mois 36 6 ans 86 6 ans et 9 mois 37 5 mois 87 7 mois 38 8 ans et 4 mois 88 9 ans et 4 mois 39 3 ans et 8 mois 89 1 an et 8 mois 40 1 an et 9 mois 90 3 ans et 5 mois 41 4 ans 91 4 ans et 2 mois 42 4 ans et 7 mois 92 4 ans et 3 mois 43 12 ans et 9 mois 93 14 ans et 11 mois 44 8 ans et 2 mois 94 3 ans et 2 mois 45 4 ans et 6 mois 95 2 ans et 7 mois 46 3 ans et 10 mois 96 7 mois 47 8 ans et 9 mois 97 2 ans et 4 mois 48 4 ans et 9 mois 98 4 ans et 10 mois 49 5 ans et 5 mois 99 9 ans et 6 mois 50 11 ans et 7 mois 100 7 ans

Annexe 6 : Age des chiens de l’échantillon

- 120 -

Hémogramme Hémogramme Chien GR HBG HCT GB PLT Chien GR HBG HCT GB PLT

(10^6/mm3) (g/dL) (%) (10^3/mm3) (10^3/mm3) (10^6/mm3) (g/dL) (%) (10^3/mm3) (10^3/mm3)

1 7,89 18,8 55,7 6,5 271 51 6,45 14,5 43,8 7,8 331 2 6,79 16,5 48,1 10,7 364 52 6,41 14,4 43,9 8 350

3 6,38 15,8 46,3 9,2 229 53 6,71 14,9 44,9 6,8 411

4 7,15 17,8 51,5 12,4 180 54 5,41 12,5 36,5 9,1 547

5 6,45 15,3 44,5 12,7 217 55 5,86 13,3 40,6 14,8 470

6 6,07 14,7 43,9 11,5 207 56 6,28 14,4 43,6 5,7 296

7 7,4 17,9 50,2 8,8 109 57 7,65 16,9 51,8 8,5 305 8 6,04 15 43,9 12,4 211 58 6,02 13,6 40,8 9,7 334

9 7,28 17,9 50,7 7,4 357 59 5,65 12,8 38,2 7,2 596

10 5,51 14,9 42,7 9,8 300 60 6,25 14,3 43,6 8,1 511

11 6,49 14,7 43,4 8,3 157 61 5,82 13,2 40,6 10,8 293

12 6,13 13,7 40,3 11 323 62 6,33 14,1 42,7 5,7 334

13 5,23 11,8 35,1 12,4 440 63 6,03 13,6 41 6,9 546

14 7,48 18 ,6 54,5 5,8 129 64 7 15,5 46,9 10,6 380 15 7,09 15,9 46 8,7 216 65 6,1 13,8 41,6 8,3 503

16 7,28 17,2 48,8 8,9 294 66 5,65 12,9 39,2 7,3 549

17 5,25 12 35,7 8,5 146 67 7,04 16,3 49,9 5,8 243

18 6,7 15,1 45,8 5,7 336 68 5,66 13,7 41 5,3 378

19 5,78 13,5 38,6 6,6 267 69 6,46 14,8 44,6 8,8 193

20 5,5 13,5 38,6 4,2 239 70 6,91 15,9 47,5 10,1 262

21 6,05 14,7 42,5 13 229 71 6,16 14,2 42,9 16,3 112 22 4,54 11,3 32,7 9,3 561 72 7,15 16,7 50,6 6,3 443

23 5,81 14,7 41,3 7,1 347 73 5,96 13,4 40,6 15,7 46

24 6,98 18,3 49,7 9 263 74 6,75 16 48,5 9,1 346

25 7,03 16,8 48,5 11,6 241 75 6,58 14,9 44,5 12,4 457

26 5,8 14,6 42,4 10 269 76 5,1 10,7 32,5 15,8 430

27 5,01 12,7 35,9 8,8 227 77 5,54 12,4 37,3 4,9 299 28 6,44 15,3 44,7 7,7 182 78 5,46 13,1 38,9 11,8 226

29 6,96 17,4 50,5 12,4 356 79 6,57 16,5 48,5 9,8 264

30 6,27 15,2 44,5 11,1 368 80 6,37 15 46 12,2 248

31 7,49 17,7 53,4 9,7 301 81 5,76 12,5 37,7 8,5 495

32 5,41 13 37,6 11,6 245 82 6,21 14 41,6 11,7 256

33 6,17 14,4 41,5 13,8 221 83 7,79 16 49,1 7,8 245

34 5,43 14 39,5 7,3 278 84 8,04 16,1 49,1 11,2 263 35 7,05 17,4 50,8 7,5 330 85 7 16,7 48,6 14,3 151

36 7,44 17,7 49,6 8,2 322 86 6,13 15,1 44,9 16,6 313

37 5,13 12 35,4 8,7 221 87 6,08 14,1 42,1 13,2 301

38 6,62 15,3 45,9 8,2 207 88 5,95 13,8 41,1 7,2 274

39 6,58 16 47,4 7,3 232 89 6,73 15,9 48,8 9,8 246

40 5,26 12,4 37,2 6,1 199 90 7,26 16,2 49,8 6,3 226

41 6,18 14,2 42 5,8 292 91 7,01 17 50,9 9,8 308 42 7,23 15,7 46,5 10,7 260 92 6,26 14,2 43,1 8,6 257

43 6,69 14,2 44,6 7,1 312 93 6,18 13,9 41,2 11,2 454

44 7,29 16,5 50,5 8,2 496 94 6,53 16,3 47,5 12,1 257

45 6,36 14,7 44,8 5,8 342 95 5,5 12,7 37,3 8 435

46 7,02 16,5 49,6 10,3 407 96 5,61 12,4 37,1 12,3 333

47 6,33 14,7 44,2 5,9 300 97 7,19 17,7 53 8,1 281 48 7,12 16,7 50,7 6,9 346 98 7,36 16,9 49,3 8,2 200

49 5,79 13,5 41,1 6,8 284 99 6,71 17,5 47,5 8 177 50 7,39 17 50,7 7,5 284 100 6,81 18,1 49,4 6,3 212

Annexe 7 : Hémogramme des chiens de l’échantillon

- 121 -

Chien Test à chaud Test à froid Chien Test à chaud Test à froid ++ + ++ + ++ + ++ + 1 1/2 1/4 négatif négatif 51 négatif négatif négatif négatif 2 1/2 1/4 1/4 négatif 52 négatif négatif négatif négatif 3 1/2 1/4 1/4 négatif 53 négatif négatif négatif négatif 4 1/2 1/4 1/8 négatif 54 négatif négatif 1/2 négatif 5 négatif 1/4 négatif 1/4 55 négatif négatif 1/2 négatif 6 négatif 1/4 1/4 1/8 56 négatif négatif 1/2 négatif 7 négatif négatif 1/4 1/8 57 négatif négatif négatif négatif 8 1/2 1/4 1/2 1/4 58 négatif négatif négatif négatif 9 négatif négatif négatif 1/4 59 négatif négatif 1/2 négatif 10 négatif négatif négatif 1/8 60 négatif négatif 1/2 négatif 11 1/4 négatif 1/4 négatif 61 négatif négatif négatif négatif 12 négatif 1/4 1/4 1/16 62 négatif négatif négatif négatif 13 négatif 1/4 1/4 1/8 63 négatif négatif négatif négatif 14 négatif 1/2 négatif 1/4 64 négatif négatif négatif négatif 15 négatif 1/4 1/4 négatif 65 négatif négatif 1/2 négatif 16 négatif 1/4 1/4 négatif 66 négatif négatif négatif négatif 17 négatif 1/4 1/4 1/8 67 négatif négatif négatif négatif 18 1/2 1/4 négatif 1/4 68 négatif négatif négatif négatif 19 1/2 1/4 1/4 négatif 69 négatif négatif négatif 1/2 20 1/2 1/4 1/2 1/4 70 négatif négatif 1/2 négatif 21 négatif 1/4 1/2 1/4 71 négatif négatif négatif 1/2 22 1/2 1/4 1/4 négatif 72 négatif négatif négatif négatif 23 1/2 1/4 1/2 1/4 73 négatif 1/2 négatif 1/2 24 1/4 négatif 1/4 négatif 74 négatif 1/2 négatif 1/2 25 1/2 1/4 négatif 1/4 75 1/8 1/16 1/2 négatif 26 négatif 1/4 négatif 1/8 76 négatif négatif 1/2 négatif 27 négatif 1/4 1/2 1/4 77 négatif négatif 1/2 négatif 28 négatif 1/4 1/2 1/4 78 négatif négatif 1/2 négatif 29 négatif 1/4 1/2 1/4 79 négatif négatif négatif négatif 30 négatif 1/2 1/2 1/4 80 négatif négatif négatif 1/2 31 négatif 1/4 négatif 1/4 81 négatif négatif négatif 1/2 32 négatif 1/4 1/2 1/4 82 négatif négatif 1/2 négatif 33 négatif 1/2 1/2 1/4 83 négatif négatif négatif négatif 34 négatif 1/4 1/4 1/8 84 négatif négatif 1/2 négatif 35 négatif 1/4 1/4 1/8 85 négatif négatif 1/2 négatif 36 négatif 1/4 négatif 1/8 86 négatif négatif 1/2 négatif 37 négatif négatif 1/2 négatif 87 négatif négatif 1/2 négatif 38 négatif négatif 1/2 négatif 88 négatif négatif 1/2 négatif 39 négatif négatif négatif 1/2 89 négatif négatif négatif 1/2 40 négatif négatif négatif 1/2 90 négatif négatif négatif négatif 41 négatif négatif négatif 1/2 91 négatif négatif négatif 1/2 42 négatif négatif négatif 1/2 92 négatif négatif 1/2 1/4 43 négatif négatif négatif 1/2 93 négatif négatif négatif négatif 44 négatif négatif 1/2 négatif 94 négatif négatif négatif négatif 45 négatif négatif négatif négatif 95 négatif négatif négatif négatif 46 négatif négatif négatif négatif 96 négatif négatif négatif négatif 47 négatif négatif 1/2 négatif 97 négatif négatif négatif négatif 48 négatif négatif négatif négatif 98 négatif négatif négatif négatif 49 négatif négatif négatif négatif 99 négatif négatif 1/2 négatif 50 négatif négatif négatif négatif 100 négatif négatif 1/2 négatif

Annexe 8 : Résultats des tests de Coombs

- 122 -

- 123 -

BBIIBBLLIIOOGGRRAAPPHHIIEE

- 124 -

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GERBER Emmanuelle

Applications du test de Coombs en médecine vétérinaire canine

Thèse Vétérinaire : Lyon, 2007 RESUME :

Le test de Coombs ou test à l'antiglobuline, grâce à un anticorps anti-anticorps (ou antiglobuline), permet de mettre en évidence la présence d'anticorps reconnus spécifiquement par cette antiglobuline.

Cette étude rappelle, en préambule, l’origine et le principe du test de Coombs. Les méthodes de réalisation des différents tests (direct et indirect) sont ensuite détaillées. L’accent est mis sur la valeur diagnostique du test de Coombs en médecine vétérinaire canine. En effet il s’agit d’un test immunohématologique manquant à la fois de sensibilité et de spécificité. C’est pourquoi l’interprétation d’un tel test reste délicate. Bien que d’autres tests aient été développés afin de suppléer à ces défauts, le test à l’antiglobuline est encore couramment utilisé en tant qu’examen complémentaire lors d’une suspicion d’anémie hémolytique à médiation immune.

Ainsi l’intérêt de ce sujet est de redéfinir le seuil de positivité du test ; seuil dont la connaissance est indispensable car il conditionne le résultat (positif ou négatif), mais également les propriétés du test comme la sensibilité et la spécificité.

MOTS CLES :

- Coombs direct - Seuil - Chien - Coombs indirect - Antiglobuline - Anémies

JURY :

Président : Monsieur le Professeur Jérôme Etienne 1er Assesseur : Monsieur le Professeur Luc Chabanne 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur Jean Luc Cadoré

DATE DE SOUTENANCE : 4 septembre 2007

ADRESSE DE L’AUTEUR :

3 chemin de chaudebourg 57100 THIONVILLE