VISOKA ZDRAVSTVENO-SANITARNA ŠKOLA STRUKOVNIH STUDIJA

SEMINARSKI RAD

TEMA: TEHNOLOGIJA REKOMBINOVANE DNK

POSTUPCI ZA UNOS REKOMBINOVANE DNK

U ĆELIJU

SADRŽAJ:

1. Uvod- nauka budućnosti.......................................................12. Biotehnologija - opšti pojam.................................................23. Tehnologija rekombinovane DNK

3.1. Molekularno kloniranje...............................................43.1.1. Restrikcioni enzimi i ligaze......................................53.1.2. Vektori..................................................................63.1.3. Postupci za unos rekombinovane DNK u ćeliju...........7

3.1.3.1. Transformacija..............................................................3.1.3.2. Elektroporacija.............................................................3.1.3.3. Mikroprecipitacija........................................................3.1.3.4. Mikroinjekcija.............................................................3.1.3.5. Lipozomi.....................................................................3.1.3.6. Genski pištolji.............................................................

3.2. Zaključak..................................................................3.3. Literatura...................................................................

1. UVOD

Nauka budućnosti 

Biotehnologi ja je nova nauka - novi predmet znat iže l je i i s t raž ivanja , od neprocenjivog je značaja za nove proizvode i novi način primene u poljoprivredi,medicini, u oblasti životne sredine. Sa ekonomskog aspekta, značajna je za razvoj industrije. Obuhvata mnoge oblasti, od genetskog inženjeringa do bioinformatike,genoma, biosenzora... Svi procesi i tehnologije biotehnologije su sredstvo za bolje razumevanje živih organizama i jedan od načina za menjanje tih organizama kako bi se poboljšalo zdravlje, opstanak i karakteristike živih organizama. Više od 10 hiljadagodina l judi mijenja ju b i l jke , ž ivot in je i ž ivotnu sredinu u nasto janju da dođu do najboljih rješenja. Biotehnologija se kao nova naučna disciplina pojavila pre dve i po decenije i to istovremeno u Bostonu, San Francisku i Kembridžu gde su naučnici došli do određenih otkrića. Od tada do danas biotehnologija se raširila na gotovo sve delove sveta, prisutna je u Evropi, na Dalekom Istoku, Azij. U Americi ona postoji u 42države. Najvažnija oblast je zdravlje, pa stručnjaci nastoje da otkriju razloge bolesti, da reše njihovo poreklo i zašto ljudski organizam reaguje na njih, kao i način na koj i one mogu da se t re t i ra ju . Danas u svetu pos to j i oko 130 lekova koj i su  proizvod biotehnologije. To je prvo polje interesovanja, sljedeće je poljoprivreda, a zatim i hrana. U središtu interesovanja su složene tehnološke intervencije na ljudskoj vrsti ali i svi oni eksperimenti u biosferi kao životnom prostoru. Visok nivo dostignuća u genetici, rezultati koji prevazilaze sva očekivanja su razlozi zbog kojih je neophodno etičko vrednovanje bioinženjeringa.

  2. BIOTEHNOLOGIJA - OPŠTI POJAM

Pod biotehnologijom se podrazumeva integrisana primena prirodnih iinženjenerskih naučnih disciplina. Cilj je da se organizmi i delovi organizamaupotrebe za dobijanje proizvoda za dobrobit čovečanstva,ili se primene za raznebiotehnološke postupke. Biotehnologija spada u ključne tehnologije 21. veka. Onaje multidisciplinarna nauka koja je povezala više nauka: genetiku, mikrobiologiju,molekularnu biologiju, biohemiju, embriologiju, ćelijsku biologiju.  Biotehnologija se u svojim oblastima primene deli na nekoliko grana:

-Crvena biotehnologija-Zelena biotehnologija-Siva biotechnologija-Bela biotehnologija-Plava biotehnologija.

Crvena biotehnologija (medicina) važi za glavno područje primenebiotehnologije. Biotehnološki postupci igraju rastuću ulogu kod razvoja novihlekova. Isto tako kod dijagnostike (DNA-čipovi,biosenzori) su za biotehnologijuod velikog značaja. Crvena biotehnologija ima najširu prihvaćenost i važi kaoključna tehnologija i motor razvoja za brojne druge privredne grane.  Zelena biotehnologija obuhvata područje primjene savremene zaštite bilja.Ovde se biotehnološkim metodama ciljano uvode otporna sredstva protiv insekata,gljiva, virusa i herbicida. Od posebnog značaja za oblast zelene biotehnologije jegenska tehnika. Ona čini osnovu metode prenošenja određene vrste gena sa jednevrste biljke na drugu kako bi se omogućilo da razviju otpornost.  Siva biotehnologija bavi se oblašću tehnike zaštite životne sredine. Ovdebiotehnološki postupci pomažu pri saniranju zemljišta, tretmanu otpadnih voda,prečišćavanju izduvnih gasova, prečišćavanju vazduha, kao i kod odvajanja otpadai ostataka.  Bela biotehnologija obuhvata područje primjene unutar hemijske industrije.Zadatak bele biotehnologije je da se, supstance poput npr. alkohola, vitamina,aminokiselina, antibiotika ili enzima proizvode sa što manjim trošenjem resursa išto manjim opterećivanjem životne sredine.

Biotehnologija svoju primjenu nalazi u sedećim industrijama: 1. hemijska i farmaceutska industrija2.industrija hrane i ukusa3.industrija tretmana otpadnih voda, otpada i izduvnih gasova4.istraživačke organizacije za prirodne i medicinske nauke5.razvoj, prodaja i savjetovanje biotehnoloških uređaja i postrojenja  Biotehnologija predstavlja primenu bioloških aktivnosti za dobijanje nekog proizvoda ili ostvarivanje nekog procesa. Ona se može podeliti na:

•tradicionalnu biotehnologiju koja obuhvata:1. Oplemenjivanje biljaka i domaćih životinja tehnikama selektivnog

ukrštanja. Pravila prenosa gena tokom selektivnog ukrštanja prvi je ustanovio Georg Mendel u 19. Veku.

2. Korišćenje mikoroorganizama za proizvodnju hrane i pića i dr , preradu otpadnih voda,proizvodnju biogasa i sl. Upotreba mikroorganizama u najvećoj meri se bazira nabiohemijskim procesima fermentacije što predstavlja anaerobnu razgradnju ugljenih hidrata do etanola ili mlečne kiseline. Ttradicionalna biotehnologija je usko vezana sa njenom primenom u zaštiti životne sredine.

•savremenu biotehnologiju u koju spadaju: 1. genetski inženjering  2. kloniranje  3 . inženjering tkiva Savremema biotehnologija je pojam koji se odnosi na specifične tehnologije manipulisanja genetskim materijalom. 1972 god. u San Francisku otkrivena je tehnologija rekombinovane DNK što je u potpunosti promenilo pristup biotehnologiji I dalo na njenom značaju. Osnovno pitanje vezano za savremenu biotehnologiju jeste kako racionalno iskoristiti prednostikoje ona pruža, a da se pri tome spreče potencijalne negativne posljedice po čoveka i njegovu životnu sredinu.

3. TEHNOLOGIJA REKOMBINOVANE DNK

3.1 MOLEKULARNO KLONIRANJE

Molekularno kloniranje ili genetičko inženjerstvo ili tehnologijarekombinovane DNK  predstavlja novu tehnologiju koja se razvila poslednjihnekoliko decenija. Pomoću ove tehnologije može se modifikovati genetička osnovaćelija i organizama putem manipulacija pojedinačnim genima. Pomoću tehnikerekombinovane DNK ljudi su stekli sposobnost precizne integracije nizova DNKkoje pripadaju različitim organizmima iste vrste ili čak različitim biološkimvrstama. Dakle, rekombinovana DNK predstavlja molekule DNK čiji sedelovi, dobijeni iz različitih organizama, veštački spajaju. Na taj način semogu dobiti hibridni molekuli DNK koji se normalno nikada ne bi mogli sresti uprirodi. Kloniranje gena je najznačajniji proces u ovoj tehnologiji i odvija se kroz 4koraka:1) Isecanje željenog fragmenta DNK iz molekula DNK donora pomoću specifičnihenzimarestrikcionih endonukleaza.2) Spajanje dobijenog fragmenta DNK sa malim molekulom DNK koji ima sposobnost replikacije (vektor za kloniranje). Hibridni molekul DNK, nastao spajanjem fragmenta DNK sa vektorom (plasmid ili virusna DNK), naziva se rekombinovani molekul DNK. Spajanjefragmenta DNK sa vektorom vrši se pomoću enzima DNK ligaze.3) Unošenje rekombinovanog molekula DNK  u ćeliju domaćina čiji enzimi obezbeđuju njegovu replikaciju.4) Identifikacija ćelija domaćina u kojima se nalazi ispitivani fragment DNK i njegovo izolovanje.

Proces molekulskog kloniranja(izvor Wikimedia)

1,2 i 3- isecanje željenog segmenta DNK; 4 i 5- spajanje segmenata DNK sa vektorom; 6-unošenje rekombinovane DNK u ćeliju domaćina; 7-propagacija ćelije sa rekombinovanom DNK

3.1.1 RESTRIKCIONI ENZIMI I LIGAZE

Restrikcioni enzimi prečišćeni su iz bakterija i spadaju u grupu nukleaza, enzima koji degraduju nukleinske kiseline ( supstrat za restrikcione enzime je dvolančana DNK). Izolovanje restrikcionih enzima omogućilo je kontrolisanu fragmentaciju hromozoma,što predstavlja prvi korak u analizi DNK. Različite vrste bakterija proizvode restrikcione enzime koji prepoznaju različita mesta na DNK. Budući da je do sada izolovano mnoštvo restrikcionih enzima, mogu se lako pronaći oni koji će iz hromozoma izrezati fragment koji u sebi nosi bilo koji pojedinačni gen.   Svaki od enzima nosi ime na osnovu prvog slova roda i prva dva slova vrste mikroorganizma iz koga su prvi put izolovani.Tako na primer naziv restrikcionog enzima EcoRI označava da je on prvi put izolovan iz bakterije Escherichia coli, slovo R označava soj, a rimski br. I označava da je ovo prvi enzim izolovan iz ovog soja. (SmaI po Serratia marcescens,  itd.).   

       Utvrđeno je da bakterije proizvode restrikcione enzime da bi se zaštitile od infekcije bakterijskim virusima. Restrikcioni enzimi prepoznaju strani molekul DNK u bakterijskoj ćeliji i onemogućavaju njen opstanak, vršeći na taj način svoju biološku funkciju. Restrikcioni enzimi ne mogu prepoznati bakterijsku DNK, jer su u bakterijskom genomu mesta prepoznavanja restrikcionih enzima zaštićena  od degradacije specifičnim modifikacionim enzimima koji vrše male hemijske izmene određenih purinskih ili pirimidinskih baza (npr. metilacijom citozina).U stranoj DNK ova mesta nisu metilovana i zato ih restrikcioni enzimi prepoznaju i degraduju virusni genom .

Po mestu dejstva ove enzime delimo u dve velike grupe:

1. Restrikcione endonukleaze koje isecaju DNK sekvence unutar samog molekula DNK

2. Restrikcione egzonukleaze koje vrše isecanje samo na krajevima DNK molekula

DNK svakog organizma je specifična pa restrikcioni enzimi je seku uvek na istim mestima stvarajući isti broj segmenata koji se nazivaju restrikcioni fragmenti.

U većini slučajeva sekvence prepoznavanja su palindromne (to su dvostruko simetrični nizovi nukleotida koji su identični kada se oba lanca čitaju u istom smeru). Tako  na primer enzim EcoRI koji je izolovan iz E. coli seče DNK na svakom mestu gde se pojavljuje sekvenca od šest baza:GAATTC.

Fragmenti DNK se nazivaju lepljivim jer se dva različita fragmenta DNK mogu lako spojiti hibridizacijom između jednolančanih krajeva, ukoliko je ispunjen uslov da su obe sekvence dobijene pomoću istog restrikcionog enzima, jer su tada njihovi krajevi komplementarni. Posle hibridizacije moguće je pomoću enzima DNK ligaze spojiti lance DNK fosfodiestarskim vezama, i na taj način dobiti hibridni tj. rekombinovani molekul DNK. Na ovaj način, restrikcijom, a potom ligacijom DNK, može se bilo koji fragment DNK putem vektora za kloniranje (to su plazmidne ili virusne DNK) ugraditi u autoreplikujući genom u kojoj će se zajedno sa vektorskom DNK umnožavati.

3.1.2 VEKTORI ZA KLONIRANJE

Kao vektori se najčešće koriste plazmidi, mali kružni dvolančani molekuli DNK koji se nalaze u bakterijama. Oni se replikuju nezavisno od bakterijskog genoma i obično nose gene koji su važni za bakteriju, na primer gene koji determinisšu osetljivost bakterija na antibiotike. Tako vi koristite te gene kao markere za izdvajanje bakterija koje su primile plazmide sa vašim fragmentom DNK od onih koji nisu. Nekada su se koristili prirodni plazmidi, a onda su počeli malo po malo da se modifikuju.. Danas su tehnike uznapredovale, pa imate svega nekoliko vrsta plazmida koji se mogu upotrebiti za različite stvari. To je omogućeno time što se u plazmid ugradi jedan region koji se naziva polylinker region i ugrade semnogobrojna restrikciona mesta za mnogobrojne endonukleaze.. Mana im je što se u bakterijsku ćeliju unose transformacijom – procesom u kome se u bakteriju unosi strain molekul DNK. Zbog navedenih ograničenja plazmida razvijene su metode za korišćenje drugih vektora. Jedan od najpoznatijih je λ fag. To je jedan bakteriofag čiji je molekul DNK linearan. Svi geni potrebni za pakovanje virusnih partikula nalaze se na krajevima hromozoma, a srednji deo hromozoma nije povezan sa litičkim ciklusom. Možemo ukloniti sredinu genoma, umesto njega staviti poprilično dugačak fragment DNK, i sve to bez ometanja litičkog ciklusa faga. Ovakav fag se može in vitro spakovati.Postoje i drugi tipovi vektora. Sve je išlo ka tome da se naprave vektori koji će moći da nose veće fragmente DNK, čime je omogućeno sekvenciranje celih genoma. Tako se krenulo sa korišćenjem kvaščevih hromozoma i veštačkih bakterijskih hromozoma. Nastali su kozmidi, koji su pomirili dobre osobine plazmida i λ faga – mogu poneti više DNK nego plazmidi, a pakuju se in vitro kao fag.

3.1.3 POSTUPCI ZA UNOS REKOMBINOVANE DNK U ĆELIJU