Diferensiasi Mikroorganisme Tipe Gram Berdasarkan Pirolisis Spektrometri Massa pada Ekstrak Bakteri Fatty Acid Methyl Ester (FAME)

AbstrakSpektrometri massa Pirolisis titik Curie (Py) telah digunakan untuk membedakan 19 mikroorganisme tipe Gram berdasarkan distribusi asam lemak metil ester mereka. Spektrum massa mikroorganisme Gram-negatif ditandai oleh adanya asam palmitoleat (C16:1) dan asam oleat (C18:1), dan juga kelimpahan tinggi dari asam palmitat (C16:0) dibanding asam pentadecanoat (C15:0). Untuk mikroorganisme Gram positif, adanya cabang C15:0 (isoC15:0 dan / atau anteisoC15:0) lebih intens dibandingkan dengan asam palmitat yang diamati pada spektrum massa. Analisis komponen utama pada data spektral massa tersebut memisahkan mikroorganisme yang diteliti dalam penelitian ini menjadi tiga kelompok/kluster diskrit yang berhubungan dengan reaksi Gram dan kepatogenikan mereka. Analisis tandem spektrometri massa lebih lanjut menunjukkan bahwa sifat dasar isomer asam lemak C15:0 (bercabang atau normal) yang terdapat dalam spektrum massa masing-masing mikroorganisme penting untuk mencapai klasifikasi menjadi tiga kelompok.

I. PENDAHULUANAplikasi instrumentasi berbasis teknik dalam mikrobiologi untuk melakukan prosedur konvensional untuk identifikasi dan diferensiasi mikroorganisme telah meningkat selama satu dekade terakhir Kromatografi gas (GC) (12, 24), spektrometri massa pemboman atom cepat (MS) (17), pirolisis titik Curie (Py) -MS (8), Py-GC MS (31), spektroskopi inframerah Fourier transform (27), spektroskopi UV resonansi Raman (7), aliran sitometri (10), dan laser berbasis pembuatan profil enzim (3, 20), semuanya telah digunakan untuk membedakan mikroorganisme. Teknik ini mengaplikasikan metode analisis yang ditetapkan untuk mengukur properti biokimia yang berbeda dan / atau distribusi bahan kimia dari taksonomi yang signifikan. Py-MS telah digunakan secara luas untuk identifikasi dan diferensiasi cepat pada bakteri secara keseluruhan. Selain itu, Py-MS telah mengidentifikasi kandungan kimia yang berguna pada bakteri atau para biomarker untuk diferensiasi dan identifikasi mikroorganisme dengan adanya latar belakang suatu lingkungan (34) .Korelasi antara komposisi bakteri lipid dan klasifikasi taksonomi telah banyak digunakan untuk identifikasi bakteri. Klasifikasi bakteri berdasarkan profil asam lemak telah dibandingkan dengan baik dengan klasifikasi berdasarkan homologi asam nukleat (5). Perbaikan dalam metodologi analisis lipid telah memperluas korelasi ini untuk banyak bakteri. GC dari ekstrak lipid umumnya digunakan untuk menentukan asam lemak seluler dalam mikroorganisme (24, 25). Metode komersial ini (22) didasarkan pada hidrolisis dan ekstraksi bakteri lipid, metilasi kelompok karboksilat untuk menghasilkan asam lemak metil ester (FAME), dan analisis GC berikutnya (25). Waktu keseluruhan persiapan sampel adalah sekitar 60 sampai 70 menit. Analisis kromatografi ekstrak FAME membutuhkan waktu sekitar 20 menit per sampel, jadi waktu total pengujian ini sekitar 1,5 jam per sampel. Selain itu, campuran FAME standar yang dibutuhkan sebelum dan pada interval-interval selama analisis bersama dengan sampel, meningkatkan total waktu analisis. Keberhasilan prosedur dalam mengidentifikasi komponen asam lemak individu bergantung pada pemilihan yang tepat dari campuran FAME standar ini.Dalam Py-MS, sampel dipanaskan dengan cepat dan menguap dalam kondisi vakum, kemudian molekul fase gas terionisasi dan analisis massa dilakukan. Sebuah histogram dari intensitas sinyal versus rasio massa terhadap muatan (m/z) mewakili spektrum massa senyawa atau campuran senyawa. Ketika Py-MS dilakukan pada mikroorganisme, spektrum massa yang dihasilkan adalah profil atau karakteristik bahan kimia dari sampel. Persiapan sampel dan pengumpulan data (tidak termasuk persiapan ekstrak FAME) termasuk cepat, yaitu memerlukan sekitar 5 menit per sampel. Instrumen dikalibrasi satu kali setiap mengawali hari dengan senyawa standar Mengganti analisis kromatografi pada ekstrak FAME dengan Py-MS menyediakan alat tes yang lebih cepat untuk identifikasi dan diferensiasi bakteri, dengan persiapan ekstrak FAME sebagai langkah pembatas. Teknik pewarnaan yang sederhana dapat menghasilkan informasi tipe Gram; Namun, secara otomatis, teknik berbasis instrumentasi untuk melakukan analisis bakteri in situ di lingkungan yang tidak bersahabat harus dikembangkan.. Menuju tujuan ini, penggunaan Py sebagai pengolahan sampel dan persiapan langkah yang cepat telah terbukti sangat sukses (6, 18, 31). Sebelum mengganti ekstraksi dan pemisahan langkah yang memakan waktu dengan Py-MS, kelayakan Py-MS dalam memberikan informasi yang berguna untuk diferensiasi dan identifikasi mikroorganisme dengan cara yang sebanding dengan pendekatan GC-FAME harus dibuktikan. Py-MS (instrumen quadrupole tunggal) membedakan senyawa berdasarkan massa untuk mengisi rasio mereka, dan karenanya, diferensiasi isomer tidak selalu memungkinkan dengan campuran yang mengandung iso-anteiso, cis-trans jenuh dan isomer posisi jenuh. Oleh karena itu, isi informasi dalam spektrum massa ekstrak FAME akan selalu lebih rendah dari itu pada ekstrak FAME kromatogram gas (ketika hanya wilayah ion molekul para FAME dianggap). Semakin rendah kandungan informasi dari spektrum massa, namun tidak berarti bahwa jumlah minimal informasi yang diperlukan untuk diferensiasi dan identifikasi mikroorganisme yang sukses pada tingkat spesies tidak hadir.Dalam studi ini, Py-MS titik Curie dari ekstrak FAME bakteri dan pengenalan pola telah digunakan untuk membedakan antara mikroorganisme gram positif dan gram negatif. Diferensiasi ini didasarkan pada distribusi asam lemak. Dengan bantuan pengenalan pola (analisis komponen utama [PCA]), perbedaan tersebut, yang dikaitkan dengan keberadaan ion fragmen asam palmitoleat, asam oleat, 3-hidroksi-asam miristat, dan asam lemak pentadekanoat bercabang dan intensitas sinyal yang lebih besar dari asam palmitat dibandingkan dengan asam pentadekanoat dalam mikroorganisme gram negatif, dipelajari. Keberadaan ion ini dikonfirmasi baik oleh Py-tandem MS (Py-MS / MS) maupun dengan cara dibandingkan dengan spektrum massa senyawa standar.

II. BAHAN DAN METODE

A. InstrumentasiPengukuran dilakukan dengan spektrometer massa Extrel triple-quadrupole (ELQ-400) dilengkapi dengan inlet titik Curie Py. Penjelasan yang lebih rinci tentang instrumen telah diterbitkan di sumber lain (8). Py bekerja pada suhu 510oC selama 10 s. Semua spektrum diperoleh dengan menggunakan ionisasi elektron 70-eV dan pemindaian massa yang berkisar antara 180 sampai 350 unit massa atom. Kisaran massa ini dipilih untuk mencocokkan kisaran FAMEs yang dideteksi oleh analisis GC-FAME. Py-MS/MS (8) bekerja dengan argon pada tekanan 0,01 millitorr (1 torr =1 mm Hg) dalam tubrukan sel (quadrupole 2).

B. Bahan KimiaSemua standar rantai lurus jenuh, tak jenuh, dan hidroksi asam lemak (Aldrich) dan asam lemak bercabang iso dan anteiso (Ultra Ilmiah) digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Semua asam lemak standar dilarutkan dalam segelas methanol sulingan (10 mg/ml). Lipid A yang termonofosforilasi dari Escherichia coli F583 Rd-mutan (Fluka Chemika) juga dilarutkan dalam segelas methanol sulingan sebelum analisis. 10 mikroliter alikuot dari setiap larutan dimuat ke kawat Py dan udara dikeringkan pada suhu kamar untuk membentuk lapisan yang seragam. Metilasi in situ pada asam lemak standar (18) dilakukan dengan menambahkan 10 mikroliter 0,1 M trimetilfenilamonium hidroksida dalam metanol (Fluka Chemika) pada kondisi kering dan asam lemak berlapis kawat yang memungkinkan untuk udara kering.C. Sampel BiologisMikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini dipilih secara acak dan tercantum dalam Tabel 1. Semua mikroorganisme ditumbuhkan pada medium agar kedelai tryptic pada suhu 37oC selama 18 jam. Sel diisolasi dengan cara dicuci dengan air suling, kemudian asam lemak terekstraksi dan termetilasi seperti yang dijelaskan oleh Miller (23). Sampel FAME dilarutkan kembali dalam 1: 1 eter-heksana seperti yang diperlukan untuk penguapan pelarut. 10 mikroliter alikuot larutan ini diaplikasikan pada titik Curie kawat dengan udara yang dikeringkan pada suhu kamar. Massa total FAMEs yang diendapkan pada kawat diperkirakan berada pada kisaran mikrogram rendah.

D. Pengenalan PolaPCA dilakukan menggunakan paket software RESOLVE yang dikembangkan di Colorado School of Mines (14, 15). Setiap spektrum massa dikumpulkan sebagai satu set intensitas baku/kasar. Data dinormalisasi menjadi intensitas total dan rata-rata terpusat. Skor dan pemuatan plot, keduanya dihasilkan. Muatan atau koefisien vektor eigen menunjukkan besarnya kontribusi variabel (dalam hal ini puncak spektrum massa) dengan komposisi dalam memproyeksikan nilai (29).

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Spektrum massa FAME pada gram negatif dan gram positif bakteri. Spektrum ekstrak FAME dari tiga mikroorganisme gram negatif berikut ditunjukkan pada Gambar. 1: Pseudomonas fluorescens, Proteus mirabilis, dan Enterobacter aerogenes. Spektrum massa ini mengandung pola molekul ion FAME rantai lurus yang divariasi oleh salah satu karbon, dari C14:0 metil ester (C14:0 ME) sampai C21:0 ME, dengan sinyal ME palmitat (C16:0 ME; M+. m/z 270) menjadi yang paling intens. Seiring dengan ion molekul, ion fragmen yang disebabkan oleh fragmentasi dari elektron terionisasi hadir Proses ini meliputi pembelahan homolitik pada ikatan metoksi dari C16:0 ME, sehingga menimbulkan ion fragmen M-31 pada m/z 239, dan seri karbometoksi pada m/z 185, 199, 213, 227, dll, dengan rumus umum CH3OCO(CH2)n+ (26). Dalam spektrum massa yang ditunjukkan pada Gambar. 1, puncak tambahan yang timbul dari FAME tak jenuh diamati. Sebagai contoh, pada spektrum massa P. fluorescens, beberapa puncak lainnya sesuai dengan ion molekul FAME monounsaturated (panjang rantai genap dan ganjil) dan ion fragmennya diidentifikasi dengan cara membadingkannya dengan spektrum massa standar murni atau dengan studi Py-MS/MS.

Kebanyakan para FAME monounsaturated yang dipelajari di laboratorium kami (C16:1 sampai C20:1) dihasilkan bersama dengan ion molekul mereka, ion fragmen pada M-32 (hilangnya CH 3OH) dan M-74. Ion fragmen ME oleat (ME C18:1; M+. m/z 296) muncul pada m/z 264 dan m/z 222, dan ion fragmen ME palmitoleat (ME C16:1; M+. m/z 268) ditemukan pada m/z 236 dan m/z 194. Ion fragmen M-32 dan M-74 dari ME FAME C17:1 jenuh (M+. m/z 282) dan/atau ME siklopropana C17:0 (ME cyC17:0; M+. m / z 282) masing-masing muncul pada m/z 250 dan 208. Ion pada m/z 208 mungkin juga sesuai dengan M-50 [M (CH3OH + H2O)]+. dan ion fragmen ME 3-hidroksimiristat (ME 3OH C14: 0) yang diamati pada spektrum massa standar yang dikenal/diketahui. Ion molekul dari para FAME hidroksi, yaitu ME 2 dan 3-hidroksilaurat (ME 2OH- dan 3OH C12:0; M+. m/z 230) dan ME 3-hidroksimiristat (ME 3OH C14:0 ; M+. m/z 258), tidak diamati. Asam lemak bercabang tidak terdeteksi oleh pemindaian Py-MS / MS pada satupun bakteri Gram negatif yang diteliti dalam karya ini. Penelitian ini setuju dengan fakta yang dikenal, yaitu bahwa sebagian besar mikroorganisme Gram-negatif mengandung kebanyakan rantai lurus jenuh dan asam lemak tak jenuh (9, 30, 34).

Gambar 2 menunjukkan spektrum massa ekstrak FAME dari tiga bakteri gram positif: Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, dan Staphylococcus aureus. Ion molekul seri ME C15:0 sampai ME C21:0 diamati pada spektrum ini. Spektrum massa ini umumnya kurang kompleks daripada spektrum massa bakteri Gram negatif. Sebuah intensitas sinyal ME palmitat (M+. m/z 270) yang relatif lebih kecil yang mana diamati pada spektrum massa gram positif dibandingkan dengan spektrum massa bakteri gram negatif (Gambar. 1). Spektrum massa B. cereus ditunjukkan pada Gambar. 2, kehadiran para FAME tak jenuh tunggal, yaitu ME C16:1 dan ME C17:1 (dan/atau ME cyC17:0) ditunjukkan oleh ion fragmen yang sesuai dengan M-32 dan M-74 (masing-masing m/z 236 dan 194 dan m/z 250 dan 208). Ion fragmen M-31 untuk ion molekul pada m/z 256 (ME C15:0) diamati pada m/z 225.

Kehadiran isomer bercabang pada m/z 256 (ME C15:0) dan 284 (ME C17:0) dalam spektrum massa mikroorganisme gram positif Bacillus thuringiensis dan S. aureus selanjutnya dipelajari melalui Py-MS/MS. Untuk B. thuringiensis, hasil Py spektrum ion dari ion pada m/z 256 (Gambar 3, spektrum puncak) adalah karakteristik dari ME isoC15:0 (puncak dasar M-43, m/z 213). Dalam kasus S. aureus, ion pada m/z 256 diidentifikasi sebagai anteiso ME C15:0 berdasarkan hasil Py spektrum ion yang ditunjukkan pada Gambar. 3. Spektrum ini sangat mirip dengan ME anteiso C15:0 standar (puncak dasar M-57, m/z 199), yang juga ditunjukkan pada Gambar. 3. Kesamaan ini menunjukkan bahwa isomer bercabang ini lebih banyak daripada rantai lurus maupun isomer isobranched ME C15:0 nya, meskipun campuran dari ME anteisoC15:0 dan isoC15:0 (sekitar 4: 1 anteisoC15:0-isoC15:0) diketahui terdapat pada strain Staphylococcus (28). Hasil Py spektrum massa ion ME C15:0 juga ditunjukkan pada Gambar. 3 sebagai perbandingan. Pengukuran di laboratorium kami menunjukkan bahwa campuran antara isomer FAME bercabang dan isomer FAME normal pada rasio beragam dari 1:1 sampai 4:1 dapat dibedakan dari isomer murninya oleh Py-MS dan/atau Py-MS/MS. Ion pada m/z 284 telah ditentukan dari eksperimen Py-MS/MS menjadi campuran dari ME iso C17:0 dan rantai lurusnya, yaitu isomer ME C17:0 (21). Temuan ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa asam lemak bercabang menjadi lebih banyak ditemukan dalam bakteri Gram positif (9, 28, 30). Kehadiran asam lemak bercabang, bagaimanapun, tidak dengan sendirinya menunjukkan jenis bakteri Gram positif, karena ada pengecualian, seperti mikroorganisme gram negatif dalam genera Xanthomonas, Legionella, Thermus, dan Desulfovibrio dan beberapa spesies Pseudomonas (yaitu, P. maltophilia dan P. pictorum), serta banyak bakteri Gram negatif lainnya, memiliki sejumlah besar asam lemak bercabang dan hidroksi-becabang (32-34).Analisis multivariasi spektra massa FAME. Diferensiasi mikroorganisme Gram positif dan Gram negatif dapat dicapai dengan inspeksi visual dari spektrum massa mereka seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1 dan 2. Puncak ME C16:0 yang menonjol pada m/z 270 relatif terhadap ME C15:0 pada m/z 256 merupakan indikasi yang jelas dari bakteri tipe Gram negatif. Sebaliknya, spektrum massa mikroorganisme Gram positif ditandai dengan puncak ME C15:0 bercabang (iso dan/atau anteiso) yang lebih besar relatif terhadap ME C16:0. Analisis visual set data yang besar (yang terdiri dari beberapa ulangan) dapat membosankan, dan analisis data berbasis komputer menyederhanakan tugas ini (4, 16, 27). PCA dilakukan dengan semua puncak spektrum massa. Gambar 4 menunjukkan plot skor komponen utama 1 dan 3. Setiap huruf atau indeks yang sama sesuai dengan ulangan analisis Py-MS pada ekstrak FAME mikroorganisme tersebut (Tabel 1). Sebanyak tiga kelompok atau kluster diamati dalam plot data.

Dua kelompok utama dibedakan sepanjang sumbu komponen 1 dan telah berkaitan dengan jenis Gram bakteri. Mikroorganisme dengan nilai-nilai positif untuk sumbu komponen 1 adalah Gram positif (kelompok II dan III), dan mikroorganisme dengan nilai-nilai negatif sebagian besar adalah Gram negatif (cluster I). Perhatikan bahwa hanya tiga mikroorganisme gram positif yang menyatakan jenis Gram yang salah dalam penelitian ini, yaitu (C, K, dan G), mereka dibedakan sebagai bakteri Gram negatif. Spektrum massa mikroorganisme ini menunjukkan kelimpahan yang lebih tinggi pada ME C16:0 daripada ME C15:0 bercabang atau normal, dan itu juga menunjukkan karakteristik ion molekul FAME tak jenuh dan ion fragmen (misalnya, ME C18:1).

Gambar 5a menunjukkan pemuatan plot 1 atau puncak spektrum massa yang bertanggung jawab untuk diferensiasi sepanjang sumbu komponen 1 pada Gambar. 4. Puncak pada arah yang positif merupakan ciri khas dari mikroorganisme gram positif, dan puncak negatif merupakan ciri khas dari mikroorganisme gram negatif. Puncak pada 256 m/z dan 270 m/z juga bertanggung jawab untuk membedakan kedua kelompok bersama dengan sumbu komponen 1. Puncak pada arah positif dalam gambar 5a sesuai dengan ion molekul dan ion fragmen dari asam lemak rantai lurus dan bercabang (iso dan anteiso) bernomor ganjil. Puncak dari ME anteisoC15:0 yaitu pada m/z 256 (M+.) dan fragmen utamanya, M-57, yaitu pada m/z 199; untuk ME isoC15:0, puncak M-43 adalah pada m/z 213. Ion pada m/z 284 sesuai dengan campuran ME C17:0 dan ME isoC17:0, seperti yang ditetapkan oleh pengukuran Py-MS/MS. Sinyal pada m/z 241 juga merupakan ion fragmen M-43 dari ME isoC17: 0. Selain itu, para FAME dengan berat molekul yang lebih besar, yaitu ME C19:0 (M+. m/z 312) dan ME C20:0 (M+. m/z 326) diamati dalam spektum massa mikroorganisme Gram positifPuncak pada arah negatif dari pemuatan 1 spektrum berkorelasi dengan ion molekul dan ion fragmen dari FAME rantai lurus bernomor genap, FAME 3-hidroksi, dan FAME tak jenuh. Semua spektrum massa bakteri gram negatif mengandung sinyal ME C16:0 (M+. m/z 270) yang tinggi. Ion-ion pada m/z 296 dan 268 masing-masing adalah ME C18: 1 dan ME C16: 1,dengan fragmen mereka di M-74 dan M-32. Selain itu, ion fragmen pada m/z 208, karakteristik asam3-hidroksimiristat, menunjukkan bahwa senyawa ini mungkin telah hadir.Gambar 5b menunjukkan, pemuatan plot 3 atau puncak spektrum massa yang bertanggung jawab untuk diferensiasi sepanjang sumbu komponen 3 pada gambar 4. Hal ini termasuk para FAME bermassa tinggi (ME C18:0 dan di atas itu) dan FAME tak jenuh, FAME hidroksi, FAME isobranched, dan FAME anteisobranched. Dalam arah positif, puncak yang sesuai dengan ME C16: 0, ME C17: 1, ME isoC15: 0, dan ME C14: 0 diamati. Semua ion ini dirangkum dalam tabel 2.Diferensiasi yang lebih baik pada tingkat spesies (adalah pemisahan yang besar antara ulangan dari Pseudomonas putrefaciens [S] dan P.mirabilis [N]) diamati untuk mikroorganisme gram negatif daripada mikroorganisme gram positif, mungkin karena keberadaan asam lemak tak jenuh dan asam lemak hidroksi (kelompok 1 di Gambar.4). Sebagian besar mikroorganisme pada genus Pseudomonas (P, Q, R, S dan T di Gambar.4) dibedakan pada tingkat spesies di sepanjang sumbu komponen 3. Genus Proteus (N) dibedakan dari genera lain; Namun, genera Serratia (u), Providencia (o), dan Enterobacter (L) tidak bisa dibedakan. Selanjutnya PCA dari spektrum massa hanya dari mikroorganisme gram negatif tercantum pada Tabel 1 membedakan semua mikroorganisme pada tingkat spesies dengan pengecualian pada Pseudomonas aeruginosa (P) dan P. fluorescens (R). Berdasarkan hasil dari analisis GC-FAME, meningkatkan diferensiasi mikroorganisme gram negatif pada tingkat spesies dapat dicapai untuk kumpulan data ini jika ion molekul 2- dan 3- asam lemak hidroksi, serta asam lemak isobranched 3-hidroksi terdeteksi (5).

Di dalam sisi positif sepanjang sumbu komponen 1 pada Gambar 4, dua kelompok (II dan III) yang hanya mengandung mikroorganisme Gram positif diamati. Bakteri yang diklasifikasikan dalam kelompok II (A, E, dan F [tabel 1]) ditandai dengan adanya ME isoC15:0 (puncak dasar pada m/z 213, M-43) dan ME C14:0 (m/z 242) pada spektrum massa mereka. Spektrum massa mikroorganisme dalam kelompok ini juga menunjukkan adanya sejumlah kecil ME C17: 1 (atau ME cyC17: 0, m/z 282) dan yang sesuai dengan fragmen pada m/z 250 (M-32) dan m/z 208 (M-74). Hal ini penting untuk dicatat bahwa mikroorganisme B. cereus (A) dalam kelompok II secara genetik dan secara patogenik sangat mirip dengan Bacillus anthracis. Kelompok III (H, I, dan J) dibedakan dari Kelompok II pada ion m/z 256, yaitu ME anteisoC15:0 yang menghasilkan puncak dasar pada m/z 199 (M-57). Selain itu, pemisahan mikroorganisme yang tercantum dalam Tabel 1 ke dalam tiga kelompok dapat dicapai terutama dengan mendapatkan hasil spektrum ion pada ion m/z 256 nya (Gambar. 3).Reproduksibilitas (tingkat reproduksi) spektrum massa ekstrak bakteri FAME diperiksa dengan membandingkan ulangan analisis Py-MS untuk dua bakteri yang berbeda. Kesamaan antara ulangan spektrum massa yang dinormalisasi, didefinisikan sebagai kebalikan dari jarak Euclidian yang telah ditentukan untuk B. cereus (A) dan Streptococcus pyogenes (K). Untuk dua spektrum massa identik kesamaannya adalah sama dengan kesatuannya (gabungan dari kedua spektrum massa tsb). Selain itu, rata- rata kesamaan untuk kelompok ideal spektrum massa identik juga merupakan kesatuannya. Oleh karena itu, perbedaan rata-rata kesamaan antara kelompok yang ideal dan kelompok ulangan untuk B. cereus telah dihitung yakni sebesar 0,007 (0,7%). Untuk S.pyogenes nilainya adalah 0,06 (6%). Nilai-nilai ini berkorelasi dengan baik dengan penyebaran indeks huruf (A dan K) dalam plot skor Gambar.4. Reproduksibilitas profil FAME sebagian diperoleh melalui variasi/keragaman MS, karena jumlah relatif masing-masing FAME terdapat dalam campuran. Selisih kesamaan rata-rata yang diamati dalam penelitian ini berkisar antara 0,007 (0,7%) sampai batas limit/tertinggi sekitar 0,1 (10%).Pengecualian terhadap pemisahan tipe Gram yang ditunjukkan pada gambar 4, Bacillus licheniformi (C), Enterococcus faecalis (G), dan S. pyogenes (K), akan dianalisis lebih lanjut untuk mengklasifikasikan dengan benar jenis Gram mereka. Disini telah diketahui bahwa bagian lipid disebut Lipid A yang secara eksklusif terdapat dalam bakteri Gram negatif lipopolisakarida (13). Lipid A adalah molekul kompleks yang terdiri dari glukosamin, fosfat, dan asam lemak, dimana sebagian besar terdapat pada asam 3-hidroksimiristat (3OH C14:0). Spektrum massa lipid A E. coli pada kisaran massa 50 sampai 400 unit massa atom menunjukkan sinyal ion yang kuat pada m/z 89. Ion ini sesuai dengan fragmen yang stabil pada asam lemak 3-hidroksi (11), seperti yang ditegaskan oleh studi Py-MS/MS dan perbandingan dengan spektrum massa 3OH C14:0 standar. Pada para FAME 3-hidroksi, ion ini menggeser 14 unit massa atom dan muncul pada m/z 103. Hanya karena bakteri Gram negatif dikenal memiliki bagian lipid A dan kebanyakan bakteri Gram positif kekurangan asam lemak hidroksi (30, 35), kehadiran fragmen ion yang stabil ini merupakan indikasi dari mikroorganisme Gram negatif. Contohnya, Gambar. 6 yang menunjukkan pemindaian massa rendah, yaitu pada spektrum massa S. pyogenes (K) dan mikroorganisme yang dikenal sebagai Gram negatif, P. mirabilis (N). Kurangnya keberadaan ion tersebut pada S. pyogenes menunjukkan bahwa S. pyogenes bukanlah bakteri Gram negatif (Gambar. 6a), dan kehadiran ion m/z 103 secara benar menetapkan P. mirabilis sebagai Gram negatif (Gambar. 6b). Mikroorganisme B. licheniformis tidak dapat diidentifikasi sebagai bakteri Gram positif dengan pendekatan ini (spektrum massa menunjukkan ion fragmen m/z 103), dan tetap menjadi satu-satunya pengecualian yang ditemui dalam studi ini.

PCA dari kumpulan data yang sama dilakukan dengan hanya menggunakan puncak yang sesuai dengan molekul FAME dan ion fragmen yang diidentifikasi dalam penelitian ini (Tabel 2). Gambar 7 menunjukkan normalisasi dan plot skor rata-rata terpusat diperoleh dengan komponen utama 1 dan 3. Plot ini mirip dengan yang diperoleh PCA dengan menggunakan semua puncak di setiap spektrum massa (bandingkan Gambar. 7 dengan Gambar. 4). Nomor kelompok yang sama diperoleh dengan hanya menggunakan 21 puncak spektrum massa yang tercantum dalam Tabel 2. Selain itu, derajat diferensiasi atau jarak antara kelompok-kelompok lebih besar berdasarkan besarnya komponen 1 dan 3. Hal ini disebabkan penghilangan/penghapusan informasi yang berlebihan (sinyal umum untuk semua sampel) dan kebisingan kimia (8). Pendekatan ini dapat berguna dalam analisis data spektral massa yang diperoleh dengan adanya latar belakang lingkungan.

IV. KESIMPULAN

Hasil yang disajikan dalam penelitian ini mengkorelasikan perbedaan distribusi asam lemak yang diamati oleh Py-MS pada mikroorganisme sesuai jenis Gram mereka. Mikroorganisme Gram negatif ditandai terutama oleh kelimpahan C16:0 yang tinggi pada spektrum massa mereka. Di sisi lain, mikroorganisme Gram positif mengandung kelimpahan cabang C15:0 (iso atau anteiso) yang tinggi pada spektrum massa mereka. Tiga kelompok PCA diidentifikasi dalam penelitian ini. Kelompok I berisi semua mikroorganisme Gram negatif dan beberapa mikroorganisme Gram positif. Spektrum ini ditandai dengan rantai lurus dan asam lemak tak jenuh dan kaya C16:0. Kelompok II mengandung mikroorganisme Gram positif saja. Spektrum dalam kelompok ini ditandai dengan asam lemak rantai lurus dan sejumlah kecil asam lemak tak jenuh dan siklopropil serta kaya isoC15:0. Spesies Bacillus patogen dikelompokkan dalam kelompok ini. Kelompok III terdiri dari mikroorganisme Gram positif saja. Spektrum massanya memiliki anteisoC15:0 tingkat tinggi. Selanjutnya, mikroorganisme yang diteliti dalam penelitian ini dapat ditentukan secara benar ke setiap kelompoknya dengan hanya memperoleh hasil Py spektrum ion dari ion mereka, yaitu pada m/z 256.Diferensiasi dan identifikasi mikroorganisme Gram positif memanfaatkan asam lemak tak jenuh dengan kelimpahan cabang yang lebih tinggi yang terdapat dalam mikroorganisme tersebut. Demikian pula, mikroorganisme Gram negatif dapat dibedakan terutama oleh jumlah relatif dari asam lemak tak jenuh mereka.Pekerjaan kedepannya akan ditujukan untuk pengembangan keseluruhan bakteri, metilasi lipid in situ, protokol Py-MS tanpa perlu prosedur ekstraksi FAME dan pemisahan kromatografi yang memakan waktu (18). Pekerjaan awal di laboratorium kami telah menunjukkan bahwa Py seluruh sel dan metilasi lipid in situ sel-sel tersebut dapat dicapai dengan total waktu penyelesaian sekitar 10 menit per sampel (persiapan sampel dan analisis spektral massa) (1, 2). Hal ini akan menghasilkan bakteri lipid berbasis teknik diferensiasi dan identifikasi yang cepat dan akurat pada mikroorganisme dengan menggunakan instrumentasi Py-MS yang sederhana.

DAFTAR PUSTAKA

1. Basile, F., T. L. Hadfield, and K. J. Voorhees. 1994. Differentiation of microorganisms by pyrolysis-mass spectrometry and pattern recognition of fatty acid methyl ester extracts. In Program and abstracts of the 36th Rocky Mountain Conference on Analytical Chemistry, Denver Colo.2. Basile, F., T. L. Hadfield, D. W. Sickenberger, and K. J. Voorhees. 1994. A critical comparison of pathogenic microorganism identification methods: GC-FAME extract, Py-MS-FAME extract, and in situ methylation-whole cell Py-MS FAME analyses. In Program and abstracts of the ERDEC Scientific Conference on Chemical and Biological Defense Research. U.S. Army ERDEC, Aberdeen Proving Ground, Md.3. Basile, F., K. D. Hughes, P. E. Wisniowski, D. G. Gorenstein, F. E. Lytle, T. S. McCay-Buis, D. M. Huber, and B. C. Hemming. 1993. Fast and sensitive laser-based enzymatic detection of the lactose operon in microorganisms. Anal. Biochem. 211:5560.4. Berkeley, R. C. W., R. Goodacre, R. J. Helyer, and T. Kelley. 1992. Pyrolysis mass spectrometry in the identification of Bacillus species, p. 257262. In R. G. Board, D. Jones, and F. A. Skinner (ed.), Identification methods in applied and environmental microbiology. Society for Applied Bacteriology, Blackwell Scientific Publications, Oxford.5. Costas, M., B. Holmes, S. L. W. On, and D. E. Stead. 1992. Identification of medically important Pseudomonas species using computerized methods, p. 1518. In R. G. Board, D. Jones, and F. A. Skinner (ed.), Identification methods in applied and environmental microbiology. Society for Applied Bacteriology, Blackwell Scientific Publications, Oxford.6. Cotter, J. R. 1984. Pyrolysis and desorption mass spectrometry, p. 4268. In K. J. Voorhees (ed.), Analytical pyrolysis. Techniques and applications. Butterworth & Co., London.7. Dalterio, R. A., W. H. Nelson, D. Britt, and J. F. Sperry. 1987. An ultraviolet (242 nm excitation) resonance Raman study of live bacteria and bacterial components. Appl. Spectrosc. 41:417422.8. DeLuca, S., E. W. Sarver, P. D. B. Harrington, and K. J. Voorhees. 1990. Direct analysis of bacterial fatty acids by Curie-point pyrolysis tandem mass spectrometry. Anal. Chem. 62:14651472.9. Dodd, C. E. R., and R. H. Dainty. 1992. Identification of Brochothrix by intracellular and surface biochemical composition, p. 299304. In R. G. Board, D. Jones, and F. A. Skinner (ed.), Identification methods in applied and environmental microbiology. Society for Applied Bacteriology, Blackwell Scientific Publications, Oxford.10. Edwards, C. 1993. The significance of in situ activity on the efficiency of monitoring methods, p. 120. In C. Edwards (ed.), Monitoring genetically manipulated microorganisms in the environment. John Wiley & Sons, New York.11. Eglinton, G., D. H. Hunneman, and A. McCormick. 1968. Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids. III. The mass spectra of the methyl esters, trimethylsilyl ethers of aliphatic hydroxy acids. A facile method of double bond location. Org. Mass Spectrom. 1:593611.12. Fox, A., and G. E. Black. 1994. Identification and detection of carbohydrate markers in bacteria. Derivatization and gas-chromatography mass spectrometry, p. 107131. In C. Fenselau (ed.), Mass spectrometry for the characterization of microorganisms. ACS symposium series 541. American Chemical Society, Washington, D.C.13. Fox, A., James Gilbart, and Stephen L. Morgan. 1990. Analytical microbiology: a perspective, p. 117. In A. Fox, S. L. Morgan, L. Larsson, and G. Odham (ed.), Analytical microbiology methods: chromatography and mass spectrometry. Plenum Press, New York.14. Harrington, P. D. B., T. E. Street, K. J. Voorhees, F. Radicati di Brozolo, and R. W. Odom. 1989. Rule-building expert system for classification of mass spectra. Anal. Chem. 61:715719.15. Harrington, P. D. B., and K. J. Voorhees. 1990. Multivariate rule building expert system. Anal. Chem. 62:729734.16. Heller, D. N., R. J. Cotter, C. Fenselau, J. A. Platt, and O. M. Uy. 1988. Computer-based linear regression analysis of desorption mass spectra of microorganisms. Anal. Chem. 60:14151419.17. Heller, D. N., R. J. Cotter, C. Fenselau, and O. M. Uy. 1987. Profiling of bacteria by fast atom bombardment mass spectrometry. Anal. Chem. 59: 28062809.18. Holzer, G., T. F. Bourne, and W. Bertsch. 1989. Analysis of in situ methylated microbial fatty acid constituents by Curie-point pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. 468:181190.19. Hronowski, X. L., R. J. Cotter, Nilofer Qureshi, and Kuni Takayama. 1993. Analysis of lipopolysaccharides from gram negative bacteria using FAB and MALDI ToF mass spectrometry. Program, abstracts, and proceedings of the 41st Annual ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Santa Fe, N. Mex.20. Hughes, K. D., D. M. Huber, and F. E. Lytle. 1988. Identification of immobilized bacteria by aminopeptidase profiling. Anal. Chem. 61:16561660.21. Jensen, N. J., and M. L. Gross. 1986. Fast atom bombardment and tandem mass spectrometry for determining iso- and anteiso-fatty acids. Lipids 21: 362365.22. Microbial ID, Inc. 1993. Microbial Identification System operating manual, version 3.0. Microbial ID, Inc., Newark, Del.23. Miller, L. T. 1982. Single derivatization method for routine analysis of bacterial whole-cell fatty acid methyl esters, including hydroxy acids. J. Clin. Microbiol. 16:584586.24. Moss, C. W. 1981. Gas-liquid chromatography as an analytical tool in microbiology. J. Chromatogr. 203:337347.25. Moss, C. W. 1990. The use of cellular fatty acids for identification of microorganisms, p. 5969. In A. Fox, S. L. Morgan, L. Larsson, and G. Odham (ed.), Analytical microbiology methods: chromatography and mass spectrometry. Plenum Press, New York.26. Murphy, R. C. 1993. Mass spectrometry of lipids, p. 7577. In F. Snyder (ed.), Handbook of lipid research, vol. 7. Plenum Press, New York.27. Naumann, D., V. Fijala, H. Labischinski, and P. Giesbrecht. 1988. The rapid differentiation and identification of pathogenic bacteria using Fourier transform infrared spectroscopic and multivariate statistical analysis. J. Mol. Struct. 174:165170.28. OLeary, W. M., and S. G. Wilkinson. 1988. Gram-positive bacteria, p. 120129. In C. Ratledge and S. G. Wilkinson (ed.), Microbial lipids, vol. 1. Academic Press, New York.29. Sharaf, M. A., D. L. Illman, and B. R. Kowalski. 1986. Chemometrics, p. 202. In P. J. Elving and James D. Winefordner (ed.), Chemical analysis, vol. 82. John Wiley & Sons, New York.30. Shaw, N. 1974. Lipid composition as a guide to the classification of bacteria, p. 97. In D. Perlman (ed.), Advances in applied microbiology. Academic Press, New York.31. Snyder, P. A., P. B. W. Smith, J. P. Dworzanski, and H. L. C. Meuzelar. 1994. Pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry. Detection of biological warfare agents, p. 6284. In C. Fenselau (ed.), Mass spectrometry for the characterization of microorganisms. ACS symposium series 541. American Chemical Society, Washington, D.C.32. Stein, S. E., and R. S. Donald. 1994. Optimization and testing of mass spectral library search algorithms for compound identification. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5:859866.33. Vesey, G., A. Corbin, and J. Dennis. 1992. Identification of Legionella species, p. 121. In R. G. Board, D. Jones, and F. A. Skinner (ed.), Identification methods in applied and environmental microbiology. Society for Applied Bacteriology, Blackwell Scientific Publications, Oxford.34. Voorhees, K. J., S. J. DeLuca, and A. Noguerola. 1992. Identification of chemical biomarker compounds in bacteria and other biomaterials by pyrolysis-tandem mass spectrometry. J. Anal. Appl. Pyrolysis 24:121.35. Wilkinson, S. G. 1988. Gram-negative bacteria, p. 449. In C. Ratledge and S. G. Wilkinson (ed.), Microbial lipids, vol. 1. Academic Press, New York.