UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLOFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DECANATO

PROYECTO DE TESIS

TÍTULO:

Caracterización de Bacillus spp. asociadas a la rizósfera de Jatropha curcas L., “piñón blanco”, en Lambayeque y su potencial como promotoras del crecimiento de plantas, 2012

AUTORES:

Est. Aguilar de la Cruz Heyner IsaacEst. Coral Cruz Jorge Eduardo

PATROCINADORA:

Dra. Blga. Carmen Rosa Carreño Farfán

APROBADO POR:

Lambayeque, setiembre de 2012

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLOFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

______________________________PRESIDENTE DEL JURADO

______________________________MIEMBRO SECRETARIO

_____________________________MIEMBRO VOCAL

________________________________JEFE CENTRO DE INVESTIGACIÓN

______________________________DECANO

______________________________JEFE DE DEPARTAMENTO

DECANATO

PROYECTO DE TESIS

I. GENERALIDADES

1. Título del proyecto

Caracterización de Bacillus spp. asociadas a la rizósfera de Jatropha curcas L.,

“piñón blanco”, en Lambayeque y su potencial como promotoras del

crecimiento de plantas, 2012

2. Personal investigador

2.1 Autores

Est. Aguilar de la Cruz Heyner Isaac

Est. Coral Cruz Jorge Eduardo

2.2 Patrocinadora

Dra. Blga. Carmen Rosa Carreño Farfán

3. Carrera profesional/especialidad

Biología/Microbiología y Parasitología

4. Tipo de investigación:

4.1 De acuerdo al fin que persigue: Aplicada

4.2 De acuerdo a la técnica de contrastación: Descriptiva

5. Régimen de investigación

Libre

6. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto

1

Lambayeque, Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de

Ciencias Biológicas en la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

7. Duración del proyecto

8 meses

8. Fechas probables de inicio y término

8.1 Inicio: Julio, 2012

8.2 Término: Febrero, 2013

9. Cronograma de actividades

Actividades 2012 2013

Jul Ago SetOct

Nov Dic Ene Feb

FASE DE PLANEAMIENTO

Revisión bibliográfica X X X

Elaboración del proyecto X X

Presentación del proyecto X

Aprobación del proyecto

Implementación del proyecto X

FASE DE EJECUCIÓN

Recolección de muestras X X X X

Procesamiento de muestras X X X X X

Registro de datos X X X X

Análisis estadístico de datos X X X

FASE DE COMUNICACIÓN

Análisis e interpretación X X

Elaboración del informe X X

Presentación del informe X

10. Recursos disponibles

2

10.1 Personal

El presente proyecto contará con el apoyo del personal técnico del laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

10.2 Equipos e instrumentos

Autoclave vertical, rango T° 0-250 °C, FANEN Balanza analítica, rango 0.01-150 g, EXCELL Cámara digital 14 mega pixeles, OLYMPUS Centrífuga GT-119-200, GREETMED Cocina eléctrica, una hornilla, CHARITO Computadora Intel (R) Pentium (R) Dual CPU E2160 1.80 GHz Dispositivo de almacenamiento de información (USB) de 4Gb

KINSTONG Espectrofotómetro digital, 335-1000 nm, GREETMED Estufa rango T° 30-110 °C, PRECISION SCIENTIFIC Horno con temperatura máxima de 200 °C, THELCO Microscopio eléctrico binocular, modelo L200, CARL ZEISS pH metro portátil, rango de pH 0.0 a 14.0, BIOCHEMICALS

INTRUMENTS S.R.L

10.3 Materiales y reactivos Material de vidrio: Placas de Petri, portaobjetos, cubreobjetos, tubos

de vidrio (13x100 mm y 15x150 mm), pipetas de 1 y 10 mL, matraces de 250 mL, vasos de precipitación, viales.

Material de metal: Gradillas, asas bacteriológicas, pinzas, bisturís, tijeras.

Material de plástico: Jeringas de 1 y 5 mL, tubos de centrífuga, bolsas. Medios de cultivo: Agar leche 1%, Agar nutritivo, Agar quitina

coloidal 1 %; Agar Sundara Rao Sinha SRSM, Agar tripticasa soya, Caldo extracto de suelo 10 %; Caldo peptonado, Caldo tripticasa soya suplementado con triptófano, Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (Nfb) semisólido.

Reactivos y colorantes: Reactivos para tinción de Gram, solución salina (NaCl 0,87 %, p/v).

10.4 Local

3

Laboratorio de Microbiología y Parasitología, sección Biotecnología Microbiana de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo en Lambayeque.

11. Presupuesto

Nº de Partida

Cantidad Producto Marca Presentación

Precio S/.

2.3.15.12 Material de escritorio 118,0004 Lápices Mongol Unidad 4,0004 Lapiceros Pilot Unidad 12,0003 Marcadores Artesco Unidad 6,0002 Correctores Artesco Unidad 5,0003 Cintas de embalaje Unidad 3,001/2 Papel Kraft Ciento 14,0002 Papel bond A4 Xerox Millar 50,0002 Cuadernos Norma Unidad 6,0004 Rollos de pabilo Unidad 12,0002 Juegos de etiqueta Docena 6,00

Bienes de consumo2.3.18.21 Material de

laboratorio4735,00

01 Agar agar Merck kg 750,0001 Agar nutritivo Merck kg 500,0001 Agar quitina Merck kg 500,0001 Agar tripticasa soya Merck kg 500,0001 Medio Nfb Merck kg 500,0001 Caldo tripticasa Merck kg 250,0001 Peptona Merck kg 250,0002 Solución salina Litro 20,00100 Placas de Petri Pyrex Unidad 450,0010 Frascos de vidrio Pyrex Unidad 20,0060 Tubos de dilución Pyrex Unidad 80,00100 Tubos de bioquímica Pyrex Unidad 40,0004 Pipetas de 1 y 10 mL Pyrex Unidad 35,0004 Asas bacteriológicas Unidad 8,0004 Portaobjetos Caja 16,0004 Cubreobjetos Caja 12,0001 Algodón 500 g 12,00

2.3.15.31 Material de limpieza 25,00Servicios 850,00

2.3.21.21 Movilidad 600,00Publicaciones

4

2.3.22.44 Servicio de impresiones, encuadernación yempastado

500,00

2.3.21.23 Otros servicios de tercerosInternet 100,00Equipamiento y bienes duraderos

640,00

2.315.99 01 Cámara digital Olympus

600,00

01 Dispositivo deAlmacenamiento (USB)4GB

Kingston

40,00

Imprevistos 700,00TOTAL 7668,00

12. FinanciaciónEl presente proyecto será financiado por los responsables, con ayuda del

laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas - Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”.

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II. PLAN DE INVESTIGACIÓN

1. REALIDAD PROBLEMÁTICA

La bioenergía y especialmente los biocombustibles son promovidos para fortalecer la independencia energética, propiciar el desarrollo rural y reducir las emisiones de los gases de invernadero. El desarrollo de la bioenergía ofrece muchos beneficios, pero éstos deben ser seleccionados y balanceados, con los impactos sobre la seguridad alimentaria. En este contexto, la Organización para la Alimentación y la Agricultura de las Naciones Unidas (FAO), con la contribución del Ministerio Federal de Alimentación, Agricultura y Protección al consumidor de la República Federal de Alemania, han ejecutado el proyecto Bioenergía y Seguridad Alimentaria (BEFS), a fin de determinar cómo el desarrollo de la Bioenergía puede ser implementado sin arriesgar la Seguridad Alimentaria. El proyecto cumple un marco analítico que ha sido implementado en Perú, Tailandia y Tanzania.

Bajo condiciones de secano, en la costa, no hay tierras disponibles para el desarrollo de cultivos relacionados a biocombustibles como son: Saccharum officinarum L. “caña de azúcar”; Elaeis oleifera “palma aceitera” y Jatropha curcas L. “piñón blanco”; sin embargo, con base a la disponibilidad de infraestructura de agua para riego existente, se puede afirmar que existe un potencial de tierras eriazas cercano a 200 000 ha ubicadas en zonas áridas entre las regiones de Piura y Lima, que podrían destinarse a la implementación de estos cultivos (FAO, 2010a).

El piñón blanco se siembra en pequeñas parcelas y como cerco vivo. Recientemente se han instalado algunos ensayos en diversas localidades del país, principalmente en la Costa Norte y en el Nororiente. Los primeros resultados indican rendimientos de 3 – 4 t año-1. Siendo un cultivo bastante rústico, se podría sembrar en áreas marginales de la costa (áridas y salinas); sin embargo, según la evaluación de aptitud de tierras (EAT) éstas son consideradas como marginalmente o muy marginalmente aptas, es decir, presentan en términos porcentuales entre 40 – 60 % y 20 – 40 %, respectivamente, de capacidad para llegar al rendimiento máximo alcanzable de 8 – 12 t ha -1 por cosecha. Según lo expuesto, se ha determinado (FAO, 2010a) que en el Perú los costos para la producción de biodiesel a partir del piñón blanco estarían entre 0,83 y 0,86 USD/L, superiores a los de la palma aceitera (0,23-0,31 USD/L) y los del etanol a partir de la caña de azúcar (0,27-0,51 USD/L) y melaza (0,43-0,64 USD/L).

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La investigación en piñón blanco tiene por finalidad obtener un paquete tecnológico para incrementar el rendimiento y disminuir los costos de producción de biodiesel. En este contexto, las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR), entre las que destacan las especies de Bacillus constituyen una alternativa que debe ser considerada, porque incrementan el rendimiento de los cultivos agrícolas a través de mecanismos directos e indirectos. Entre los primeros se incluyen la síntesis de reguladores de crecimiento (auxinas, giberelinas, citoquininas), solubilización de minerales como los fosfatos, fijación de nitrógeno atmosférico, y estimulación del sistema de absorción de iones como los nitratos. Entre los mecanismos indirectos o de biocontrol se mencionan la competencia por un nicho ecológico o por nutrientes, la interacción directa con el patógeno por parasitismo y lisis enzimática, la antibiosis, producción de sideróforos y la inducción de resistencia sistémica en las plantas.

Bacterias como Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas y Streptomyces entre otros géneros, se encuentran en los suelos rizosféricos y han demostrado su efecto benéfico en cultivos agrícolas; sin embargo, en Lambayeque no se han realizado estudios para investigar la presencia de estas bacterias en la rizósfera del piñón blanco, con la finalidad de aislarlas, caracterizarlas y determinar su potencial como promotoras de crecimiento de las plantas.

1.1. Identificación del problemaSuelos poco aptos para la siembra de los cultivos relacionados a los

biocombustibles y desconocimiento de la actividad benéfica de los microorganismos de la rizósfera de las plantas.

1.2. Delimitación del problemaCaracterización de Bacillus spp. asociadas a la rizósfera de

Jatropha curcas L. “piñón blanco” en Lambayeque y su potencial como promotoras del crecimiento de plantas.

2. PROBLEMA CIENTÍFICO¿Cuáles son las características de Bacillus spp. asociadas a la rizósfera de

Jatropha curcas L. “piñón blanco” y cuál es su potencial como promotoras del crecimiento de plantas?

3. HIPÓTESISImplícita.

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4. JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIALa producción de biodiesel en el Perú está ligada al mercado de los aceites

vegetales, por lo que sería difícil tener márgenes provechosos de rentabilidad, ya que este producto, utilizado para consumo humano, es una materia prima costosa y en su mayoría su producción es de palma aceitera. Por tanto, el precio del biodiesel será análogo al de cualquier aceite vegetal que se produce a partir de palma aceitera, maíz o especies oleaginosas como soya, canola o girasol y no constituiría una alternativa para cumplir con los requerimientos de la norma peruana que en lo que respecta al biodiesel, en el 2009 comenzó con la obligatoriedad del 2 % de mezcla y debió ser incrementado a 5 % al inicio del 2011.

El piñón blanco ofrece una materia prima de menor costo y a largo plazo la producción de biodiesel es promisoria, así como la comercialización de subproductos como la glicerina y la torta que permitirían darle un valor agregado; sin embargo, la capacidad del cultivo para competir a escala industrial es dudosa porque se desconoce su comportamiento agrícola y porque los suelos donde debe ser cultivado no presentan las condiciones óptimas para alcanzar el rendimiento adecuado. Como una alternativa está la posibilidad de utilizar bacterias del suelo como Bacillus spp., que a través de diversos mecanismos benefician el desarrollo de las plantas y aumentan el rendimiento, por lo que se les denomina rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas, PGPR.

El género Bacillus incluye una variedad de especies Gram positivas, no patogénicas, con propiedades antagonistas. Son buenas secretoras de proteínas y metabolitos, fáciles de cultivar y altamente eficientes para el control de plagas y enfermedades. Los mecanismos de acción de Bacillus spp., incluyen competencia por espacio y nutrientes, antibiosis e inducción de resistencia frente a los patógenos. Además, tienen efecto comprobado en la promoción de crecimiento de las plantas a través de la fijación de nitrógeno, solubilización del nutriente fósforo y producción de reguladores del crecimiento como el ácido indolacético. La capacidad de Bacillus spp., de formar esporas, que sobreviven y permanecen metabólicamente activas bajo condiciones adversas, las hace apropiadas para la formulación de productos viables y estables para el control biológico.

5. OBJETIVOS5.1 Aislar e identificar Bacillus spp. en la rizósfera de Jatropha curcas L.

“piñón blanco” en el distrito de Motupe, en Lambayeque.5.2 Determinar in vitro el potencial biológico de Bacillus spp. nativas como

productoras de enzimas y ácido indolacético, fijadoras de nitrógeno y solubilizadoras de fósforo.

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5.3 Determinar in vitro el poder germinativo de Jatropha curcas L. “piñón blanco” por efecto de Bacillus spp. nativas caracterizadas como promotoras del crecimiento de plantas.

6. ANTECEDENTES

6.1 Rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantasEn los suelos agrícolas existen microorganismos como las bacterias que

pueden ser benéficas y perjudiciales para la agricultura. Las bacterias benéficas pueden establecer una relación simbiótica con las plantas o pueden ser de vida libre en el suelo, en cuyo caso se encuentran muy próximas a las raíces, en lo que constituye el suelo rizosférico (Campos et al., 2007). Estas bacterias son denominadas rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas, PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria), término usado por primera vez por Kloepper para referirse a las bacterias capaces de inducir un efecto benéfico en las plantas (Peña & Reyes, 2007).

Las PGPR benefician a los cultivos agrícolas a través de mecanismos directos e indirectos. Los directos se evidencian en ausencia de otros microorganismos en estudio, mientras que los mecanismos indirectos se pueden observar en la interacción del microorganismo de interés con un fitopatógeno, mediante la cual se reducen los efectos dañinos en el cultivo. Los mecanismos directos incluyen la síntesis de reguladores del crecimiento (auxinas, giberelinas, citoquininas), solubilización de minerales como los fosfatos, fijación de nitrógeno atmosférico, producción de sideróforos y estimulación del sistema de absorción de iones como los nitratos. Entre los mecanismos indirectos o de biocontrol se encuentran la competencia por un nicho ecológico o por nutrientes, la interacción directa con el patógeno (parasitismo y lisis enzimática), antibiosis, producción de sideróforos e inducción de resistencia sistémica en las plantas (Nogales, 2005; Hernández et al., 2006; Hernández et al., 2009). Bacterias como Azospirillum, Herbaspirillium, Enterobacter y Azotobacter promueven el crecimiento de las plantas mayoritariamente a través de mecanismos directos, así como Pseudomonas, Bacillus y Streptomyces lo hacen a través de mecanismos indirectos; no obstante, todas las PGPR presentan un mayor o menor grado de efectividad en ambos mecanismos (Kloepper et al., 2004; Guillen et al., 2006; Idriss et al., 2007; Franco, 2009; Karnwal, 2009; Doumbou et al., 2010; Salaheddin et al., 2010; Cadena & Martínez, 2011). Al respecto, Bashan & Levanony (1990) y Bashan (1999) atribuyen el efecto de las PGPR a los que ellos denominan “hipótesis aditiva”, en la que más de un mecanismo está involucrado en la asociación planta-rizobacteria, los cuales operan simultáneamente o en asociación. La suma de los diferentes mecanismos refleja los cambios observados en el crecimiento de las plantas, cuando son cultivadas bajo condiciones ambientales propicias.

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El efecto positivo de las PGPR siempre está correlacionado con el incremento de longitud de las raíces laterales, así como el número y longitud de los pelos radiculares, cambios que finalmente se asocian con la síntesis de auxinas, citoquininas y giberelinas. Según el modelo P. putida, las bacterias, así como las plantas sintetizan ácido indolacético (AIA), que de por si estimula la división y alargamiento de las células, generando proliferación radicular (número y longitud de pelos radiculares). El exceso de AIA también activa la enzima ACC sintetasa en las plantas y promueve la síntesis de ácido-1-amino-ciclo-propano-1-carboxilico (ACC), que normalmente es un precursor del etileno, el cual a su vez inhibe la elongación de las raíces en las plántulas. Cuando está presente P. putida, una parte significativa del ACC es exudado por las raíces y entonces es hidrolizado por las bacterias como fuente de nitrógeno, originando α-cetobutirato y amonio (amino ciclo propano carboxilasa desaminasa, ACC desaminasa bacteriana), disminuyendo el ACC y por lo tanto el etileno, favoreciendo a su vez el incremento de la longitud radicular (Kloepper, 2003; Mantelin & Touraine, 2004).

Los PGPR pueden fijar nitrógeno; sin embargo, no proveen a las plantas de grandes cantidades de este elemento, pero si tienen un gran impacto en la nutrición nitrogenada, directamente por la estimulación de los sistemas de absorción de iones como el nitrato e indirectamente por la proliferación radicular. En laboratorio se ha demostrado que el nitrógeno incrementa su propia tasa de absorción e induce ramificación radicular; es decir, en presencia de nitratos se observa la expresión de los genes relacionados con su transporte y también elongación de las raíces laterales por incremento de la actividad meristemática de sus ápices. El incremento de la superficie de las raíces y por lo tanto del volumen del suelo al que tienen acceso, así como la estimulación de los sistemas de absorción permite a su vez, aumento en la absorción de nutrientes, especialmente nitrógeno, que conlleva a la acumulación de biomasa aérea (Mantelin & Touraine, 2004).

6.2 Especies de Bacillus spp. como rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas

Las bacterias del género Bacillus se caracterizan por ser Gram positivas con forma bacilar, aerobias estrictas o anaerobias facultativas que en condiciones estresantes forman una endospora que no deforma la estructura de la célula. Esta forma esporulada es resistente a las altas temperaturas y a los desinfectantes químicos corrientes (Kokalis et al., 2006).

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La taxonomía de Bacillus según Garrity, et al. (2004) es:

Las especies de Bacillus actúan como bacterias promotoras del crecimiento de las plantas mediante los mecanismos directos de producción de enzimas, ácido indolacético y sideróforos, fijación de nitrógeno, solubilización de fósforo y los mecanismos indirectos de antagonismo de hongos, bacterias fitopatógenas y fitonemátodos. Bacillus spp. produce antibióticos, lipopéptidos con actividad surfactante y reducen las enfermedades de las plantas (Kokalis et al., 2006; Márquez & Fernández, 2006).

En tres cepas de Bacillus amyloliquefaciens se demostró la presencia de fitasa extracelular (myo-inositol hexakisphosphate). La mayor actividad se detectó en la cepa F2B45 y sus filtrados crudos diluidos estimularon el crecimiento de plántulas de maíz bajo limitación de fósforo y en presencia de fitato. La enzima fue producida principalmente en la fase de crecimiento exponencial y durante la transición hacia la fase estacionaria. La capacidad de B. amyloliquefaciens para producir fitasas y permitir la disponibilidad de fósforo a partir de fitatos puede contribuir a la actividad promotora del crecimiento de las plantas. Los productos finales de la degradación del fitano han sido identificados como mio-inositol trifosfatos y ortofosfatos, derivados del inositol que constituyen una fuente de nutrientes para las bacterias del suelo (Idriss et al., 2002). También se ha determinado que algunas especies de Bacillus producen enzimas quitinolíticas que degradan el polímero que forma parte de los hongos fitopatógenos como Rhizoctonia solani, causando deformación y deterioro de las hifas (Reinoso et al., 2005).

Utilizando técnicas de análisis físico y genético se demostró en B. amyloliquefaciens FZB42, la biosíntesis de ácido indolacético dependiente de la presencia de triptófano, que es uno de los principales componentes presentes en los exudados radiculares. El filtrado diluido o los cultivos de células estimularon el crecimiento de Lemmna minor; sin embargo, el efecto dependió de la concentración del filtrado o de las células. Con una concentración de 0,1 % el filtrado incrementó significativamente el peso de la biomasa fresca (17,5 mg) frente al control (14,1 mg) y con una concentración de 0,5 % inhibió el crecimiento de las plantas (12,0 mg). El efecto fue más significativo cuando se inocularon bacterias en una concentración de 2 x 105 UFC mL-1 alcanzándose 19,3 mg de biomasa fresca. Por el contrario, con 1 x 107 UFC mL-1 se observó una reducción significativa del peso (13,1 mg) de la biomasa (Idriss et al., 2007).

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Dominio : BacteriaPhyllum : FirmicutesClase : BacilliOrden : BacillalesFamilia : BacillaceaeGénero : Bacillus

Para demostrar la producción de giberelinas por B. pumilus y B. licheniformis se realizaron bioensayos con la aplicación de “Paclobutrazol”, un inhibidor de la biosíntesis de estos reguladores del crecimiento y se demostró que los síntomas de enanismo inducidos en las plantas de Alnus glutinosa L. fueron revertidos con la aplicación de extractos de cultivos de las especies de Bacillus, observándose incremento en la longitud de los tallos (5,4 cm en B. licheniformis; 5,1 cm en B. pumilus y 2,8 cm en el testigo) y en el área foliar (10,4 cm2 con B. licheniformis; 9,6 cm2 con B. pumilus y 4,8 cm2 con el testigo). El análisis por cromatografía de gases indicó la producción de giberelinas C19 bioactivas de los tipos GA1: 130-150 ng/mL, GA3: 50-60 ng/mL, GA4:8-12 ng/mL y GA20: 2-3 ng/mL (Gutiérrez et al., 2001).

Los filtrados de cultivos de B. amyloliquefaciens y B. subtilis presentaron actividad promotora del crecimiento, observándose elongación en el test de coleópteros de maíz. B. amyloliquefaciens alcanzó los mayores valores comparables con los del ácido indolacético en concentraciones de 106–107 mol L-1; sin embargo, al cuantificar se detectaron bajas concentraciones, de 10-8 a 10-9 mol L-1 de AIA. Según los resultados, la concentración de AIA encontrada no es equivalente a la de AIA necesaria para inducir los efectos observados en las plántulas, por lo que es posible que éstos sean el resultado de más de una sustancia promotora del crecimiento (Idriss et al, 2004).

Diversos investigadores (Orozco & Martínez, 2009; Cuervo, 2010; Ríos & Zúñiga, 2012), han reportado especies de Bacillus como fijadoras de nitrógeno en medio Nfb; sin embargo, también existen resultados contradictorios en donde se determinó que la mejora en la toma de nitrógeno por las plantas inoculadas con B. amyloliquefaciens y B. pumilus no fue consecuencia de la fijación de nitrógeno, porque las bacterias en el laboratorio no demostraron ser fijadoras. Las plantas liberaron mayores porcentajes de carbono en los exudados radiculares, por lo que se incrementó la actividad microbiana. A su vez, el proceso incrementó el nitrógeno disponible en el suelo y el flujo de nitrógeno hacia las raíces de las plantas (Adesemoye et al., 2009).

En raíces de manglares negros (Avicennia germinans L.) y blancos (Laguncularia racemosa L.) se obtuvieron 30 aislamientos de bacterias solubilizadoras de fósforo, entre los que se identificaron B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. atrophaeus y Paenibacillus macerans. La actividad solubilizadora de fósforo se demostró por la formación de halos transparentes alrededor de las colonias desarrolladas en medio sólido con fosfato tribásico de calcio como fuente de fósforo (Vásquez et al., 2000).

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Se monitoreó el crecimiento vegetativo de Hordeum vulgare “cebada” en suelo esterilizado e inoculado con cuatro cepas de Bacillus spp. aisladas de la rizósfera de cebada y algodón, y que en laboratorio fijaron nitrógeno y solubilizaron fósforo. El fósforo disponible en el suelo se incrementó significativamente por la inoculación de las semillas de cebada con Bacillus H-13 y Bacillus RCO1. También se incrementó entre 8,9 a 16,7 % el peso de las raíces, frente al control no inoculado, así como el peso de los tallos entre 28,6 a 34,7 %. A su vez, se incrementó entre 20,3 a 25,7 % la biomasa total frente al testigo, valores superiores a 18,1 % obtenido con la aplicación de fósforo, pero inferior a 31,1 % alcanzando con fósforo-nitrógeno (Cambolat et al., 2006).

Las bacterias del género Bacillus son consideradas como ayudadoras de la micorrización (MHB, mycorrhizatium helper bacteria), concepto según el cual estas bacterias no pueden estimular directamente el crecimiento de las plantas en ausencia de un apropiado hongo micorrítico. Para investigar este efecto se realizó la co-inoculación del hongo micorrítico Pisolithus tinctorius con B. licheniformis y B. pumilus en Pinus pinea. Las bacterias del género Bacillus incrementaron el crecimiento de las plantas del pino. Debido a que se observó incremento en la longitud de las plantas inoculadas, por un mayor crecimiento de las zonas internodales pero no por un incremento en el número de nudos, se relacionó el efecto biológico con la producción de giberelinas. Por su parte, el incremento de la superficie radicular se atribuyó a la producción de ácido indolacético. A su vez, estas bacterias interfirieron con la sobrevivencia del micelio micorrítico, observándose disminución en la concentración de ergosterol (membrana citoplasmática) y quitina (pared celular), considerados como indicadores de la biomasa fúngica metabólicamente activa y de la integración del hongo en el sistema radicular, respectivamente (Probanza et al., 2001).

Bacillus subtilis es conocido como antagonista de muchos hongos fitopatógenos, debido a la continua producción de antibióticos, metabolitos volátiles, competencia por nutrientes, exclusión de sitios y colonización del patógeno por la bacteria (Butt et al., 1999, mencionados por Bernal et al., 2006).Con el objetivo de investigar la utilización de B. subtilis ATCC 6051, Pseudomonas aeruginosa 7NSK2, P. fluorescens CMR12 y Serratia phymuthica 1270, en el control de Stemphylium solani en Lycopersicon esculentum Mill. “tomate”, se realizó un experimento en invernadero. Los inóculos se obtuvieron con las bacterias cultivadas en agar King B y la concentración de las suspensiones celulares fue estandarizada a 108 UFC mL-1. Las aplicaciones foliares se realizaron cada 7 días, con un atomizador manual, iniciándose 15 días después del transplante hasta la fase fisiológica de aparición del tercer racimo floral. Todos los tratamientos presentaron efectividad frente al testigo. A los 21 días, los menores valores en el porcentaje de intensidad de ataque (5 y 8 %), se obtuvieron con oxidoruro de

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cobre y B. subtilis, respectivamente, sin diferencias significativas, concluyéndose que esta bacteria antagonista constituye una alternativa de protección frente a los hongos causantes de manchas foliares en tomate (Bernal et al., 2006).

Con Bacillus spp. la promoción del crecimiento vegetal está asociada generalmente al control biológico a través de la antibiosis (endotoxinas, sideróforos), competencia por espacio o por nutrimentos, interacción directa con el patógeno (microparasitismo y lisis enzimática) e inducción de resistencia sistémica. La resistencia inducida es definida como un perfeccionamiento de la capacidad defensiva de la planta frente a un amplio espectro de patógenos y plagas, adquirida después de un estimulo apropiado. La inducción de resistencia por rizobacterias es referida como resistencia sistémica inducida (ISR, induced systemic resistance) y no causa algún síntoma de necrosis en las plantas hospederas (Kloepper et al., 2004).

Las especies de B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. pasteurii, B. cereus, B. pumilus, B. mycoides y B. sphaericus inducen significativas reducciones en la incidencia o severidad de varias enfermedades con una diversidad de hospederos. La ISR ha sido demostrada en invernadero y campo, en Lycopersicon esculentum Mill. “tomate”, Capsicum annuum “ají”, Citrullus vulgaris Schrad “sandía”, Beta vulgaris L. “remolacha”, Nicotiana tabacum L. “tabaco”, Cucurbita maxima Duch “zapallo”, Pinus pinea L. “pino” entre otros cultivos, para enfermedades como manchas foliares fungosas y bacterianas, virosis sistémicas, nematodos del nudo de la raíz y hongos causantes de chupadera y tizón tardío. Los mecanismos para la ISR son similares en algunos casos a los de Pseudomonas; independientes del ácido salicílico, pero dependientes del ácido jasmónico, etileno y el gen regulador NPRI. En otros casos, los mecanismos son dependientes del ácido salicílico e independientes del ácido jasmónico y el gen NPRI (Kloepper, 2003; Kloepper et al., 2004).

Se investigó el potencial de mezclas de B. amyloliquefaciens, B. sphaericus y cinco cepas de B. pumilus para inducir resistencia sistémica a las enfermedades causadas por Ralstonia solanacearum en tomate, Colletotrichum gloeosporioides en ají, Rhizoctonia solani en Brassica oleracea L. var capitata “col” y el virus del mosaico (CMV) en Cucumis sativus “pepinillo”. Para determinar la compatibilidad in vitro, las siete cepas de Bacillus fueron evaluadas individualmente entre ellas y frente a tres de los patógenos identificados, no observándose algún efecto de antibiosis. A continuación, se determinó que cuatro (B. amyloliquefaciens más B. pumilus y mezclas de cepas de B. pumilus) de las 21 combinaciones de Bacillus y una cepa de B. pumilus individualmente redujeron significativamente la severidad de las

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cuatro enfermedades frente al testigo, concluyéndose que las mezclas de PGPR pueden inducir en un mayor grado la resistencia sistémica frente a hongos, bacterias y virus fitopatógenos en comparación con los testigos (Jetiyanom & Kloepper, 2002).

La resistencia sistémica inducida (ISR) es una respuesta de defensa de la planta ante la presencia y actividad de un agente biológico no patogénico, específico, que reduce la severidad o la incidencia de la enfermedad o daño causado por un patógeno que se encuentra especialmente separado del agente inductor. La resistencia sistémica también puede ser inducida por sustancias químicas o por la presencia de patógenos, denominándose entonces resistencia sistémica adquirida (SAR). Las diferencias entre ISR y SAR son el agente inductor y los signos que presenta la planta. ISR es un fenómeno independiente del ácido salicílico, etileno y ácido jasmónico y no produce la acumulación de proteínas relacionadas con la patogenicidad (PR). Estas proteínas son acumuladas en la SAR inducida por patógenos o químicos. (Chaves, 2007). Según lo expuesto, en remolacha con B. mycoides y B. pumilus la resistencia sistémica se asoció con el incremento de la actividad peroxidasa y producción de isozimas quitinasa y B, 1,3-glucanasa. En tabaco B. pumilus incrementó los niveles de ácido salicílico. En raíces de guisantes se detectó engrosamiento de las paredes de las células epidermales y corticales que limitaron la invasión por Fusarium oxysporum f. sp. pisi. Además, las paredes celulares presentaron elevados porcentajes de callosa e infiltraciones de compuestos fenólicos. En plantas de Cucumber tratadas con B. pumilus se observó una rápida lignificación en respuesta a Colletotrichum orbiculare y la actividad peroxidasa y superóxido dismutasa (SOD) se incrementó frente a los testigos no tratados (Jetiyanom & Kloepper, 2002; Kloepper et al., 2004).

En tomate cultivado en invernadero se investigó la posibilidad de reducir la dosis del fertilizante químico mediante su aplicación combinada con B. amyloliquefaciens y B. pumilus. Según la curva de respuesta a las diferentes dosis del fertilizante, los mayores valores en el peso de las plantas de tomate se alcanzaron con 100 % de fertilizante, no diferenciándose significativamente del fertilizante más Bacillus spp. (19,9 y 21,5 g respectivamente). También se observó que en los tratamientos PGPR mas 80 y 70 % de fertilizante químico se alcanzaron valores estadísticamente similares con los de 100 % de fertilizante sin PGPR (22,2; 21,3 y 19,9 g respectivamente), por lo que se concluyó que las PGPR más 75 % de la dosis del fertilizante químico pueden utilizarse como parte de una estrategia en el manejo integrado del cultivo del tomate (Adesemoye et al., 2009).

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Bajo condiciones de campo se estudió el efecto de tres niveles de fertilización con nitrógeno (0,120 y 240 kg ha-1) en el crecimiento y componentes del rendimiento de Solanum tuberosum L. “papa” inoculada con Bacillus sp. OSU-142. Esta bacteria incrementó significativamente el peso de las plantas, número de tallos por planta y peso promedio de tubérculos, pero el incremento no fue significativo en el número total de tubérculos por planta y el número de tubérculos según el tamaño (<35mm, 35-50mm, >50mm), frente a los testigos. La inoculación de Bacillus sp. en parcelas fertilizadas incrementó el rendimiento total de tubérculos frente a los testigos no fertilizados, alcanzando el mayor valor de 21,3 t ha-1 con la dosis 120 kgN ha-1. Según los resultados, Bacillus sp. OSU-142 sólo o en combinación con el fertilizante químico tiene un gran potencial para incrementar el rendimiento y sus componentes, además, de reducir la necesidad del fertilizante químico (Ekin et al., 2009).

Nueve cepas de Bacillus spp. caracterizadas como promotoras del crecimiento de diferentes cultivos agrícolas fueron inoculadas en semillas de piñón blanco con y sin la aplicación del suplemento de quitina, determinándose que B. pumilus, B. circulans, B. lentus y B. polymyxa, junto a la quitina, así como B. polymyxa y Bacillus sp. sin quitina permitieron alcanzar 100 % de emergencia frente al testigo con 80 %. Por su parte, con B. pumilus suplementado con quitina se observó promoción del crecimiento de plántulas hasta los 42 días, incrementando la altura (113 %), peso de la biomasa aérea (360 %) y radicular (467 %), área de hoja (256 %) y contenido de clorofila (74 %). A su vez, en las plántulas de semillas tratadas con esta bacteria sin quitina se incrementó la biomasa aérea (473 %), biomasa total (407 %) y el contenido de clorofila (82 %). Se concluyó que B. pumilus solo o en combinación con las otras bacterias mejoran el crecimiento inicial de las plántulas de piñón blanco y por lo tanto pueden incrementar el establecimiento en campo (Desai et al., 2007).

6.3 Cultivo de Jatropha curcas L. “piñón blanco”El piñón blanco es una oleaginosa originaria de México y Centroamérica,

pero crece en la mayoría de los países tropicales. Es cultivada en América Central, Sudamérica, Sureste de Asia, India y África. (Figura 1).Su taxonomía mencionada por Recalde & Duran (2009) es:

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Reino : PlantaeDivisión : MagnoliophytaClase : MagnoliopsidaOrden : EuphorbialesFamilia : EuphorbiaceaeGénero : JatrophaEspecie : Jatropha curcas L.

El piñón es una planta perenne, cuyo ciclo productivo se extiende entre 45 a 50 años. Es de crecimiento rápido y con una altura normal de 2 a 3 metros. El grosor del tronco es de 20 cm con crecimiento desde la base en distintas ramas. La corteza es blanco grisácea y exuda un látex translúcido. Normalmente se forman cinco raíces, una central y cuatro periféricas. Los tallos crecen con discontinuidad morfológica en cada incremento. La corteza es de color verde amarillenta, pálido y casi lisa, delgada como papel, con desprendimientos en tiras horizontales. La corteza interna blanca con rayas rojas, exuda una savia amarillenta y sabor astringente. A su vez, las hojas normalmente se forman con tres a siete lóbulos acuminados, poco profundos y grandes con pecíolos largos de 10 a 15 cm y de igual ancho. El haz es verde, el envés verde claro, glabro o este último con pelillos finos (Recalde & Duran, 2009; Quimbayo, 2010).

La inflorescencia del piñón es una panícula, con las flores femeninas (10-20 %) en los ápices del tallo principal y las ramas de las flores. Las flores masculinas son más numerosas (80-90 %) y ocupan posiciones subordinadas en la inflorescencia. Las flores masculinas se abren durante un período de 8-10 días, mientras que las flores femeninas solo se abren durante 2-4 días. El desarrollo del fruto necesita 90 días, desde la floración hasta que madura la semilla. El fruto es una cápsula drupácea verdosa-amarillenta y carnosa, pero café oscuro o negro y dehiscente cuando está seca. La fruta produce tres almendras negras, cada una aproximadamente de 2 cm de largo 1 cm de diámetro. Las semillas (dos a tres por fruto), contienen un aceite no comestible que se puede utilizar directamente para aprovisionar de combustible lámparas y motores de combustión o se puede transformar en biodiesel. Además, se usa para fabricar jabones y también se puede obtener un colorantes. Una vez colocada la semilla en el sustrato adecuado y con una buena humedad la geminación toma 5 días. Se abre la cáscara de la semilla, sale la radícula y se forman cuatro raíces periféricas pequeñas. La germinación es epígea (cotiledones surgen sobre la tierra). Poco después que las primeras hojas se han formado, los cotiledones marchitan y se caen (Quimbayo, 2010; Pérez et al., 2012).

Actualmente, existen plantaciones o planes de instalación de piñón blanco en casi todo el mundo (África, Asia, Centroamérica, Sur América, Estados Unidos), debido a su alta adaptabilidad a diferentes tipos de suelos y su característica tóxica, por lo cual, a diferencia de otros cultivos energéticos, no compiten con la seguridad alimentaria. El rango de altitud en la que crece es de 0 a 1200 msnm (con preferencia 0-600 msnm), con un requerimiento de agua entre 200 a 2000 mm y con capacidad para soportar largos periodos de sequía. En la región Lambayeque las parcelas de siembra se localizan en el distrito de Motupe en los sectores: Tongorrape, Chanduví, Motupe y Escusa Baraja, contándose en la actualidad con 33 ha de cultivo instaladas (Pérez et al., 2012).

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La producción de biodiesel a partir de piñón y palma aceitera se inicia con el ingreso de la materia prima para la extracción mecánica. El aceite obtenido se mezcla en la unidad adecuada con el material necesario para la transesterificación más un pequeño exceso del mismo catalizador. El producto de la reacción compuesto por metilésteres (biodiesel), glicerina, metanol en exceso y catalizador, ingresa a la unidad de neutralización, donde con un ácido mineral se neutraliza el catalizador remanente. Posteriormente en la unidad de destilación al vacio se despoja al producto de los volátiles, fundamentalmente compuestos por alcohol metílico. Los vapores de metanol se condensan y se envían al tanque de almacenamiento para ser nuevamente introducidos en el ciclo. El producto de fondo de la unidad de destilación, que contiene al biodiesel, glicerina y sales se envía a la unidad de decantación continua, en la cual se separa el biodiesel del resto de los productos. La fase ligera (biodiesel) se envía a la columna de lavado, mientras que la fase pesada (glicerina bruta) que contiene aproximadamente 90% de glicerina, eventuales impurezas y sales discurren al tanque de almacenamiento. En la columna de lavado, el biodiesel se “lava” retirando la trazas de glicerina que pudiera contener y el producto lavado de la parte superior de la columna se separa, y se lleva a la unidad de secado y se almacena (FAO, 2010b).

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Figura 1. Planta de Jatropha curcas L. “piñón blanco”.

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7. MATERIALES Y MÉTODOS7.1 Materiales

7.1.1 Material biológicoEl material biológico estará conformado por muestras de suelo

rizosférico de “piñón blanco” cultivado en el distrito de Motupe, en Lambayeque, por cepas nativas de Bacillus spp. y semillas de piñón blanco.

7.1.2 Material de laboratorio Placas de Petri. Láminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos. Viales. Pipetas de 1 y 10 mL Tubos de vidrio (13x100 mm y 15x150 mm). Agitadores de vidrio. Asas bacteriológicas. Algodón de 500 g Gradillas.

7.1.3 Medios de cultivo Agar leche 1 % Agar nutritivo. Agar quitina coloidal 1 % Agar tripticasa soya. Agar Sundara Rao Sinha, SRSM. Caldo extracto de suelo 10 % Caldo nutritivo. Caldo peptonado. Caldo tripticasa soya suplementado con triptófano. Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol, (Nfb)

7.1.4 Reactivos y colorantes Colorantes para tinción de Gram. Peróxido de hidrógeno. Tiras reactivas para oxidasa. Azul de bromotimol. Reactivo de Salkowski. Solución oxidante para determinación de amonio. Solución salina esterilizada 0,87 % (p/v)

7.2 Métodos

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7.2.1 Población y muestra de estudioLa población estará constituida por bacterias del género Bacillus, presentes

en el suelo rizosférico de piñón blanco y se trabajará con las bacterias aisladas de 54 muestras, durante setiembre a diciembre de 2012. El número de muestra fue calculado según la fórmula mencionada por Alvitres (2000), tomando en cuenta una prevalencia del 90 % (Desai et al., 2007).

n=Z2. p . qt2

Donde:n = Tamaño de muestraZ = 1,96 ( = 0,05); valor estándarP = tasa de prevalencia (0,90) presencia de Bacillus en rizósfera de piñón blancoq = tasa de ausencia 1-p (0,10)t = error permitido (0,08)

n=(1,96 )2 (0,90 )(0,10)

(0,08)2

n=54

7.2.2 Variables en estudioLas variables cualitativas serán las cepas nativas de Bacillus spp.

productoras de enzimas y ácido indolacético, fijadoras de nitrógeno, solubilizadoras de fósforo y que no afecten negativamente el poder germinativo del piñón blanco.

7.2.3 Tipos de estudio y diseño de contrastación de hipótesisEl trabajo de investigación será descriptivo y transeccional

(Hernández et al., 2003) y para contrastar la hipótesis se utilizará el diseño de una sola casilla (Alvitres, 2000), según el cual se aislará e identificará Bacillus spp. y se determinará la producción de enzimas y ácido indolacético, el nitrógeno fijado y el fósforo solubilizado, así como el efecto en el poder germinativo del piñón blanco.

7.2.4 Zona de muestreoPara aislar Bacillus spp. durante setiembre a noviembre de 2012 se

colectarán 54 muestras de suelo rizosférico de piñón blanco, en campos comerciales del distrito de Motupe, provincia de Lambayeque (Figura 2).

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Figura 2. Ubicación geográfica de la zona de muestreo correspondiente al distrito de Motupe, provincia de Lambayeque, en el departamento de Lambayeque, 2012.

7.2.5 Obtención de muestras de rizósfera

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En la zona rizosférica de plantas de piñón blanco se extraerán aproximadamente 100 g de suelo. Cada una de las muestras se depositarán en bolsas plásticas debidamente etiquetadas e inmediatamente se transportarán para su procesamiento en el laboratorio de Microbiología y Parasitología, sección Biotecnología Microbiana de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, en Lambayeque.

7.2.6 Aislamiento e identificación de Bacillus spp.Para el aislamiento de Bacillus spp. según Ríos y Zúñiga (2012), cada

muestra de suelo rizosférico de piñón blanco se tamizará y del material obtenido se tomarán 10 g para realizar diluciones en solución salina esterilizada (0.87 % NaCl p/v) hasta 10-2. Esta dilución se llevará a tratamiento térmico a 80 ºC durante 10 minutos y luego se enfriará rápidamente. A continuación, se tomará una alícuota y se sembrará mediante la técnica de estría sobre la superficie de agar nutritivo (Anexo 1) en placas de Petri. Se incubará en aerobiosis a 30 ºC durante 24 horas y se realizará tinción de Gram a las colonias desarrolladas. En caso de observar bacilos Gram positivos, catalasa positivos, serán cultivados en viales con agar tripticasa soya (TSA) constituyendo los cultivos puros que serán guardados en refrigeración (8 ºC).

El género Bacillus se identificará según el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática (Vos et al., 2001) identificando la posición de las esporas, crecimiento a 45 y 65º C; pH 5,7; NaCl 3,5 y 7 %; utilización del citrato como fuente de carbono y energía, prueba de oxidación – fermentación (O-F); pruebas de oxidasa y catalasa, crecimiento anaerobio en glucosa; producción de ácido a partir de arabinosa, manitol y xilosa; hidrólisis del almidón, gelatina y caseína; reducción de nitratos y producción de acetoína o 2,3 butanodiol en la prueba de Voges-Proskauer (Guillén et al., 2006; Cuervo,2010).

7.2.7 Producción de enzimas Cada una de las cepas nativas de Bacillus spp. serán sembradas mediante la

técnica de estría sobre agar leche 1 % y agar quitina coloidal al 1 % (Anexo 2) y serán incubadas a 30 oC por 48 y 120 horas, respectivamente, en aerobiosis, para la investigación de la producción de proteasas (Carreño y Muñoz, 2012) y quitinasas (Franco, 2009).

a. ProteasasSe observarán las colonias bacterianas desarrolladas sobre agar leche 1 % en

busca de halo de hidrólisis (zona clara alrededor de la colonia). La caseína es la proteína principal de la leche y se presenta como una solución coloidal responsable del aspecto blanco y opaco. Cuando los microorganismos producen caseinasa, hidrolizan la proteína originándose derivados solubles y cristaloides y observándose un halo transparente alrededor de las colonias formadas (Wiseman, 1985; Carrillo, 2003).

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b. QuitinasasSe observarán las colonias bacterianas desarrolladas sobre agar quitina

coloidal al 1 %, en busca del halo de hidrólisis a su alrededor. La quitina es degradad por las quitinasas, enzimas que hidrolizan un enlace entre dos unidades de N-acetil glucosamina (NAG) consecutivas, observándose un halo de hidrólisis alrededor de las colonias (Hoster et al., 2005).

7.2.8 Detección y cuantificación de ácido indolacético (AIA) producido in vitro

Para la detección y cuantificación de ácido indolacético producido in vitro según la reacción colorimétrica de Salkowski descrita por Mantilla (2007) cada cepa nativa de Bacillus spp. será cultivada en caldo nutritivo por 24 horas, de donde se tomarán 0,6 mL para inocularlos en 5 mL de caldo tripticasa soya suplementado con triptófano (Anexo 3). Después de la incubación a 30 ºC por 72 horas en agitación constante (150 rpm), los cultivos serán centrifugados a 2000 rpm durante 15 minutos. A continuación, 0,4 mL de cada uno de los sobrenadantes se depositarán en tubos, se agregarán 1,6 mL del reactivo de Salkowski modificado (Anexo 3) en una relación 1:4 se mezclarán y se dejarán en reposo durante 30 minutos en oscuridad. La positividad a la producción de ácido indolacético estará dada por la aparición de una coloración violácea y se leerá la absorbancia en espectrofotómetro de luz visible a 530 nm. Las concentraciones se calcularán en una recta patrón que se obtendrá con diluciones sucesivas de una solución 100 ppm de ácido indolacético.

7.2.9 Detección y cuantificación de nitrógeno fijado in vitroPara la detección y cuantificación de nitrógeno fijado in vitro por las cepas

nativas de Bacillus spp. nativas, se seguirá la metodología descrita por Lara et al. (2007) y Cadena & Martínez (2011). Cada una de las cepas de Bacillus spp. serán sembradas por puntura en 6 mL de medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (Nfb) semisólido (Anexo 4), a razón de una cepa por tubo. La incubación se realizará en aerobiosis a 30 ºC, hasta por 1 semana y se considerarán como bacterias fijadoras de nitrógeno los tubos donde se observe el viraje del indicador del verde al azul y la presencia de una película gruesa blanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficie.

Para la cuantificación del nitrógeno fijado, según el método colorimétrico del fenolhipoclorito (Anexo 4) cada una de las cepas nativas de Bacillus spp. cultivadas en agar nutritivo por 24 horas, serán inoculados en tubos de 15 x 150 mL conteniendo 5 mL de caldo extracto de suelo 10 % (Anexo 4) y se incubarán a 30 ºC por 72 horas en agitación constante (150 rpm).

A continuación, se agregarán 15 mL de KCl 2M, se agitarán a 150 rpm durante 1 hora y se dejarán en reposo por 1 hora adicional, para después tomar

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10 mL del sobrenadante y centrifugarlos (2000 rpm) durante 20 minutos. Luego, los sobrenadantes se verterán en tubos de dilución y se añadirán 0,4 mL de nitroprusiato de sodio 0,5 %; 0,4 mL de solución alcohólica de fenol 10 % y 1 mL de solución oxidante. Los tubos se agitarán para mezclar y se dejarán en reposo durante 1 hora adicional.

La positividad a la fijación de nitrógeno estará dada por la aparición de una coloración azul y se leerá la absorbancia en espectrofotómetro de luz visible a 632,9 mm. Las concentraciones se calcularán en una recta patrón obtenida con diluciones sucesivas de una solución de 100 ppm de cloruro de amonio.

7.2.10 Detección y cuantificación de fósforo solubilizado in vitroPara la detección y cuantificación de fósforo solubilizado in vitro por las

cepas nativas de Bacillus spp. se utilizará la metodología descrita por Vásquez et al (2011). Cada cepa nativa de Bacillus spp. será sembrada mediante la técnica de estría en agar para aislamiento de microorganismos solubilizadores de fósforo, Sundara Rao Sinha Medium, SRSM (Anexo 5). Las placas de Petri se incubarán a 30 ºC hasta por 96 horas y las colonias solubilizadoras de fósforo serán reconocidas por el cambio de color del indicador al amarillo y formación de un halo traslúcido alrededor de la colonia. Después, las colonias se cultivarán nuevamente por dos veces consecutivas en agar SRSM para verificar la actividad solubilizadora de fósforo y se medirá el halo de las colonias que conservan su capacidad para solubilizar fósforo.

Para la cuantificación de fósforo solubilizado, se obtendrá el inóculo de cada una de las cepas de Bacillus spp. solubilizadoras de fósforo cultivadas en 1 mL de caldo SRSM a 30 ºC durante 20 horas en agitación constante (150 rpm). A continuación, 0,6 mL de cada uno de los cultivos bacterianos serán inoculados en frascos con 20 mL de caldo SRSM e incubados a 30 ºC, con agitación constante (150 rpm) hasta por 96 horas. A partir del momento de la inoculación (0 horas) y cada 24 horas, hasta las 120 horas, se tomarán submuestras de 3 mL de caldo SRSM en los que se determinará el pH y se cuantificará el fósforo soluble mediante el método colorimétrico del molibdato según Rodier & Rodi, 2005(Anexo 5).

7.2.11 Efecto de cepas nativas de Bacillus spp. en el poder germinativo de Jatropha curcas L. “piñón blanco”

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Con cada cepa nativa Bacillus spp. cultivada en caldo nutritivo hasta alcanzar la fase exponencial, se obtendrá una suspensión con una concentración de 108 células/mL y después se mezclará con un adherente constituido por una solución de sacarosa al 10 % previamente esterilizada (8 mL de inóculo más 2 mL de solución). Ambos serán homogenizados por movimientos de rotación durante 2 minutos e inmediatamente después serán vertidos sobre semillas de piñón blanco en bolsas plásticas de primer uso, a razón de 100 mL por kg de semilla, correspondiente a 3,6 mL para 36 g de semilla por bolsa El material biológico será homogenizado por 10 minutos y después se secará en estufa a 30 ºC durante 30 minutos para favorecer la adhesión del inóculo a las semillas (Cadena & Martínez, 2011).

En bandejas de plástico de 20 x 14 cm, en cuyo fondo se colocarán tres capas de papel toalla esterilizado y humedecido con agua destilada esterilizada y con la ayuda de pinzas estériles, se depositarán 15 semillas de piñón blanco inoculadas con Bacillus spp. (en tres hileras a razón de cinco semilla por hilera). El procedimiento se realizará por triplicado para cada una de las cepas nativas de Bacillus spp. seleccionadas, teniendo como testigo semillas tratadas con caldo nutritivo no inoculado y semillas no tratadas. Las bandejas se taparán con una gasa estéril y se mantendrán a temperatura ambiente (28 ºC), realizando riegos intermediariamente. Asimismo, cada día se contarán las semillas germinadas hasta alcanzar el máximo de germinación. Los resultados serán expresados como porcentaje de germinación.

7.2.12 Análisis de los datosLos datos obtenidos serán ordenados en tablas y figuras que permitan

determinar el potencial de las cepas nativas de Bacillus spp. como promotoras del crecimiento en plantas. En el presente trabajo se utilizarán los programas Microsoft Office Word y Excel versión 2007.

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9 FECHA DE PRESENTACIÓNSetiembre de 2012

32

…………………………………………………Dra. Blga. Carmen Rosa Carreño Farfán

………………………………………………..Aguilar de la Cruz Heyner Isaac

Responsable

…………………………………………..........Coral Cruz Jorge Eduardo

Responsable

ANEXO 1

33

Medios de cultivo para el aislamiento, y mantenimiento de Bacillus spp. (Según Ríos & Zúñiga, 2012)

Agar nutritivo (AN)

Componentes g/L

PeptonaExtracto de carneAgar agarAgua destilada

5,03,015,01000 mL

Ajustar el pH a 7,0

Esterilizar en autoclave a 121 ºC y 15 lb de presión.

Agar tripticasa soya (TSA)

Componentes g/L

TriptonaPeptonaExtracto de levaduraGlucosaCloruro de sodioAgar agarAgua destilada

15,05,03,05,05,015,01000 mL

Esterilizar en autoclave a 121 ºC y 15 lb de presión.

ANEXO 2

Medios de cultivo para la detección de proteasas y quitinasas in vitro

34

a. Agar leche 1 % (en Carreño y Muñoz, 2012)

b. Agar quitina coloidal 1% (en Franco, 2008)Componentes g/L

Solución Stock K2HPO4 3 % (p/v)Solución Stock MgSO47H2O 1.5 % (p/v)Solución Stock (CaCl2 0,5 %,FeCl3 0,06 %, NaCl 0,5 % p/v)NH4Cl2

Quitina coloidal 1 % (p/v)Agar agar

10,0 mL10,0 mL10,0 mL1,0 10,015,0

Mezclar los componentes y llevar a volumen con agua destilada, calentar al fuego durante 5 minutos para disolver las sales, ajustar el pH a 6,8. Autoclavar (15 libras de presión y 121 ºC). Servir en placas de Petri esterilizadas.

Obtención de la quitina de camarón

Colocar 10 g de cáscara de camarón en 100 mL de H3PO4 al 85 %, dejar reposar 24 horas a temperatura ambiente (25 ºC) y agitar eventualmente para bajar la espuma. Los gránulos de quitina precipitan con agua destilada. Para separar los gránulos del ácido utilizar cuatro capas de gasa y filtrar al vacío en un matraz kitasato. Lavar con agua destilada hasta quitar el exceso de ácido y neutralizar el pH. Agregar alcohol etílico 96 % y dejar secar extendido en papel absorbente. A continuación, esterilizar en autoclave y guardar en refrigeración hasta su uso posterior.

ANEXO 3

35

Componentes g/L

TriptonaExtracto de levaduraGlucosaAgar agarLeche evaporadaAgua destilada

5,02,51,015,010 mL980 mL

Detección y cuantificación de ácido indolacético producido in vitro mediante la reacción colorimétrica de Salkowski (en Mantilla, 2007)

a. Caldo tripticasa soya (g/L) suplementado con triptófano (en García y Muñoz, 2009)

Componentes g/LPeptona de caseína 17,0Peptona de harina de soya 3,0

D (+) Glucosa (o dextrosa) 2,5

Cloruro de sodio 5,0

Fosfato dipotásico 2,5

Triptófano 0,01Agua destilada en cantidad suficiente 1 L

b. Reactivo para la detección y cuantificación de ácido indolacético producido in vitro (en Mantilla, 2007)

36

c. Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar ácido indolacético, AIA (en Mantilla, 2007)

c.1. Fundamento de la reacción de SalkowskiMediante la reacción de Salkowski se detectan grupos indol presentes en el

medio de cultivo y la concentración de indol es directamente proporcional a la intensidad de color rojo producido. A su vez, el cambio de color es el resultado de una reacción oxidativa con el ácido sulfúrico, donde por medio de una transaminación un grupo amino es sustituido por el cloro proveniente del FeCl3, originando un compuesto visible de color rosado a rojo en el caso del indolacético. Otras coloraciones indican la presencia de productos intermedios de la síntesis del ácido indolacético, que pueden ser generados a partir del triptófano.

c.2. Preparación de diluciones a partir de una solución madre de AlA Para obtener una curva patrón de ácido indolacético, preparar una solución

madre de 100 µg. mL-l, para lo cual se pesan 10 mg de ácido indolacético y se disuelven con unas gotas de NaOH en un matraz aforado a 100 mL. A continuación, enrasar con agua bidestilada y agitar hasta homogenizar. Posteriormente se realizan las siguientes diluciones:

37

La solución de cloruro de fierro 0,5M se obtiene al mezclar 1,61 g de cloruro de fierro (FeCl3) con 20 mL de agua destilada

Componentes mL/L

Agua destiladaÁcido sulfúrico concentradoCloruro de fierro 0,5 M en agua destilada

250,0150,07,5

N° de tubo Solución patrón(100 µgmL-1)

[µL]*

H2O bidestilada[µL]

ConcentraciónAIA (mgL - 1)

01 0 10

002 2

098

203 4

096

404 6

094

605 8

092

806 1

090

1007 1

585

1508 2

080

2009 3

070

3010 4

060

4011 5

050

5012 6

040

60

*1000 µL = 1 mL

c.3. Procedimiento para la cuantificación de AIA por colorimetríaObtenidas las concentraciones parciales de AIA extraer de cada tubo 0,4mL

de solución, verter en tubos de 13 x 75 mm y agregar 1,6 mL de reactivo de Salkowski (1:4). Dejar en reposo en oscuridad por 30 minutos. Observar la presencia de una coloración rojiza en los tubos. A continuación, leer la absorbancia de cada dilución en espectrofotómetro a 530 nm.

Una vez obtenida la absorbancia en todas las concentraciones de ácido indolacético, corregir los valores y mediante regresión lineal en el programa Microsoft Excel 2007, obtener la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación lineal (r2) que deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea de los valores sobre la recta.

38

ANEXO 4

Detección y cuantificación de nitrógeno fijado in vitro mediante el método indirecto de valoración del ión amonio empleando la técnica colorimétrica de

Berthelot (fenol – hipoclorito)

a. Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol, nfb

Ajustar el pH a 6,8-7,0 con NaOH. Para obtener medio semisólido añadir 2 g de agar agar. Para medio sólido añadir 20 mg de extracto de levadura y 15 g de agar.

a. Caldo extracto de suelo al 10 %

39

Componentes g/L

Ácido málicoKOHK2HPO4

FeSO4.7H2OMnSO4.7H2OMgSO4.7H2ONaClCaCl2

Na2MoO4

Azul de Bromotimol (0,5 % m/v en etanol)BiotinolAgua destilada en cantidad suficiente

5,04,00,5Trazas0,010,010,020,010,0022,0 mL 0,5 mL 1000 mL

Ajustar a pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10 %, depositar en un matraz 250 g de suelo agrícola y 500 mL de agua destilada. Hervir 2 horas, completar a 500 mL con agua destilada y filtrar el sobrenadante. Tomar 25 mL del filtrado y completar a 500 mL con agua destilada.

b. Reactivos

• Cloruro de potasio 2 M Cloruro de potasio 149,12 gAgua destilada 1000 mL

• Solución alcohólica de fenol 10 %Fenol concentrado 10 mL

Alcohol 97º 90 mL• Nitroprusiato de sodio 0,5 %

Nitroprusiato de sodio 0,5 gAgua destilada 100 mL

• Solución oxidanteCitrato de sodio 20 gHidróxido de sodio 1 gHipoclorito de sodio 5 % lejía comercial 2 mLAgua destilada 100 mL

d. Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar el ión amonio (Lara et al., 2007)

d.1 Fundamento del método colorimétrico de Berthelot (fenolhipoclorito)Se basa en la formación de un color azul intenso de indofenol, que resulta de la

reacción del ión amonio (NH4) con los compuestos fenólicos en presencia de un agente oxidante el cual puede ser hipoclorito de sodio u o-fenol; y la presencia de un catalizador, principalmente nitroprusiato de sodio o de potasio. El mecanismo de la reacción depende de la luz presente, la temperatura ambiente, catalizadores y pH alcalino. Cuando se utiliza fenol o sodio la reacción puede ser representada de la siguiente manera:

40

Componentes g/L

K2HPO4

MgCl2

MgSO4.7H2OFeCl3

CaCl2

TriptonaExtracto de levaduraExtracto de suelo al 10 %Agua destilada

0,40,10,050,010,11,01,0250 mL750 mL

NH3 + 2C6H60-+ 3ClO- O = C6H4= N-C6H4-O + 2H2O + OH- + 3Cl-

d.2 Preparación de diluciones a partir de una solución madre de NH4ClPara obtener la curva patrón se prepara una solución madre de 100 ppm de

NH4CI, para lo cual se pesa 0,1 g de NH4CI y se disuelve en 1 L de agua bidestilada. Posteriormente, a partir de la solución madre se efectúan las siguientes diluciones:

N° de tuboSolución patrón

[mL]H2O bidestilada

[mL]

NH4Cl(Ug/mL = ppm)

NH4Cl[µg /mL= ppm]1 0,0

10,00

2 0,2 9,8

23 0,4

9,64

4 0,6 9,4 65 0,8

9,28

6 1,0 9,0

107 1,5

8,515

8 2,0 8,0

20

d.3 Procedimiento para la cuantificación de amonio por colorimetríaObtenidas las diluciones, agregar a cada tubo 0,4 mL de solución alcohólica

de fenol al 10 %; 0,4 mL de nitroprusiato de sodio al 0,5 % y 1 mL de solución oxidante, luego agitar para mezclar y dejar en reposo durante 1 hora. Observar una coloración que varia del verde azul al azul intenso en función de la concentración de amonio. Leer la absorbancia de cada dilución en el espectrofotómetro a 632,9 nm.

Una vez obtenida la absorbancia de todas las concentraciones de amonio, corregir los valores y mediante regresión lineal con el programa Microsoft Excel

41

2007, obtener la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación lineal (r 2) que deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea de los valores sobre la recta.

ANEXO 5

Detección y cuantificación de fósforo solubilizado in vitro

a. Agar Sundara Rao Sinha SRSM (en Vazquez et al., 2000)

42

Componentes g/L

GlucosaFosfato tricálcicoSulfato de amonioCloruro de potasioSulfato de magnesioSulfato de manganesoSulfato de fierroCloruro de sodioExtracto de levaduraPúrpura de bromocresolAgar agarAgua destilada en cantidad suficientepH

10,005,000,500,200,300,00400,00205,000,500,1 151000 mL 07,2

Como fuente de fosfato se puede usar fosfato bicálcico (1 g/L de fósforo), fosfato tricálcico (1 g/L de fósforo) y roca fosfórica (0,2 % de fósforo).

b. Método colorimétrico del Molibdato para cuantificar fósforo soluble (Rodier y Rodi, 2005)

b.1. FundamentoEn medio ácido y en presencia de molibdato amónico, los ortofosfatos forman

un complejo fosfomolíbdico que, reducido por el ácido ascórbico, desarrolla una coloración azul susceptible de una determinación colorimétrica y cuya aparición se acelera utilizando el catalizador emético, tartrato doble de antimonio y potasio.

b.2 Limpieza de los recipientes de vidrio

Para la limpieza del material de vidrio no utilizar detergentes que contengan fosfato. Lavarlos con ácido clorhídrico diluido y enjuagarlos cuidadosamente con agua destilada.

b.3 Reactivos Solución de ácido sulfúrico 5N

Ácido sulfúrico (d=1.84) 14 mL Agua destilada hasta enrase 100 mL

Solución de molibdato amónico 4 % 20 mL Solución de ácido ascórbico

Ácido ascórbico 1,76 g Agua destilada hasta enrase 100 mL

Solución de emético (preparar al momento del uso) Tartrato doble de antimonio y potasio 0.0274 g Agua destilada hasta enrase 100 mL

Reactivo para determinación de ortofosfatos

43

Ácido sulfúrico 5 N 40 mL Solución de molibdato amónico 12 mL Solución de ácido ascórbico 24 mL Solución de emético 4 mL

Solución madre de 0,2 mgl-1 de fósforo Fosfato monopotásico previamente desecado en estufa a 100 ºC: 877 g Agua destilada hasta enrase 100 mL

Solución hija de 2 mgl-1 de fósforoDiluir 1 mL de solución madre en 99 de agua destilada (1/100)

b.4 Preparación de la curva de calibración Colocar en una serie de matraces aforados de 25 mL:

Número de matraces T I II

Solución de fósforo de 2 mgL-1 (mL) 0 1 2

Agua bidestilada (mL) 20

19

18 5Reactivo indicador (mL) 4 4 4

Agua destilada hasta enrase (mL) 25

25

25Correspondencia de fósforo en mgL-1 0 0

,0,

Esperar 20 minutos y efectuar las lecturas en el espectrofotómetro a la longitud de onda de 690 nm en cubetas de 10 cm. Construir la curva de calibración. Los datos de la absorbancia corregida se analizan mediante regresión lineal con el programa Microsoft Excel 2007 para obtener la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación lineal (r2) que deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea de los valores sobre la recta.

b.5 Procedimiento para cuantificar fosfatos en la muestraIntroducir 20 mL de la muestra a analizar en un matraz aforado de 25 mL

Añadir 4 mL de reactivo indicador, completar el volumen a 25 mL con agua destilada. Esperar 20 minutos y efectuar la lectura en el espectrofotómetro de luz visible con una longitud de onda de 690 nm. Tener en cuenta el valor leído para el testigo. Obtener los resultados en la curva de calibración. Para una muestra de 20 mL, la curva indica el contenido de fósforo expresado en miligramos por litro. La coloración es estable 24 horas.

44

45