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PROTEINE RICOMBINANTI:ASSORBIMENTO

Via di somministrazione preferenziale è generalmente parenterale (i.v., i.m., i.p., s.c.)La diversa via parenterale può variare l’attività terapeutica (irrorazione sanguigna, passaggio nel sistema linfatico, ecc.)


Via di somministrazione orale non valida se richiesta una elevata biodisponibilità (degradazione e scarsa permeabilità nel tratto G.I.)Via “accessibile” per vaccini orali (placche del Payer)


Vie alternative di somministrazione: naso, polmoni, retto, cavità orale, pelleProblema scarsa biodisponibilità a cui si tenta di ovviare aumentando l’assorbimento senza dare tossicità


Aumento permeabilità barriere: acidi grassi, sali biliari, saponine; liposomi.Riduzione attività peptidasica: inibitori delle proteasi, modificazione struttura.Aumento tempo di esposizione: nanoparticelle (PEG, liposomi).

Molecola AA Biodisponibilità %

Glucagone

calcitonina

insulina

Effetto del glicocolato su biodisponibilità:

somministrazione nasale

29

32

51

senza con

<1 70-90

<1 15-20

<1 10-30

PROTEINE RICOMBINANTI:BIODISPONIBILITA’

Targeting specifico:particolato colloidale (liposomi, microsfere di albumina, LDL ecc.).Liposomi sono i più usati per bassa tossicità, flessibilità, ampio “core” acquoso)

PROTEINE RICOMBINANTI:BIODISPONIBILITA’

Targeting “passivo”: fegato e milza Targeting “attivo”: veicolazione con ab specifici

Prolungamento emivita: pegilazione (< att. biologica)

PROTEINE RICOMBINANTI:DISTRIBUZIONE

Il volume di distribuzione è generalmente modesto (scarsa penetrazione nel tessuto o specificità di distribuzione tissutale) > è la permanenza nell’organismo, > è la distribuzione, ma non sempre (es. IL2-PEG)

PROTEINE RICOMBINANTI:LEGAME A PROTEINE

Provato per IGF-I, t-PA, hGH, Dnasi Per le molecole tradizionali solo il farmaco libero svolge attività farmacologicaPer proteine ricombinanti, il legame a proteine plasmatiche può favorire l’attività (es IGF-I)

PROTEINE RICOMBINANTI:METABOLISMO-ELIMINAZIONE

Metabolismo non presenta rischio di tossicitàPrincipali organi di eliminazione:rene (via principale per proteine di piccole dimensioni)fegato (endopeptidasi, esopeptidasi)altri

PROTEINE RICOMBINANTI:VARIAZIONI FARMACOCINETICHE

-modificazioni della sequenza

aminoacidica -pegilazione (ridotta vel. di

eliminazione)-variazioni nella glicosilazione

(variano interazioni recettoriali o attacchi enzimatici)

PROTEINE RICOMBINANTI:IMMUNOGENICITA’

Produzione di anticorpi più frequente per proteine estranee all’ospite

Dimostrata per varie prot. ricombinanti (insulina, interferoni, ab monocl., EPO, hGH ecc.).

PROTEINE RICOMBINANTI:IMMUNOGENICITA’ - CAUSE

Fattori associati al prodotto: presenza di impurezze/contaminanti, via di somministrazione, conservazione, variazioni di seq. aacidica/glicosilazioneFattori genetici associati al paziente:delezioni o mutazioni della proteina endogenaaplotipo del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC)


Le conseguenze di una prod. anticorpale sono diverse a seconda della regione della proteina a cui si legano:- nessun effetto (hGH) - variazione di parametri farmacocinetici (insulina)- neutralizzazione (NAB) dell’attività biologica (IFN)


CASO ERITROPOIETINA (EPREX): - fino al 1998 rari casi di prod. NAB (conseguenza aplasia eritrocitaria)-circa 200 casi dal 1998 al 2003 Dal 1998 HSA sostituita da polisorbato 80, venduta in siringhe pre-riempite (rilascio di sostanze dalla siringa?). Modifiche dei materiali della siringa e di conservazione (riduzione dei casi di NAB)

PROTEINE RICOMBINANTI:“INFUSIONAL REACTION”

Definibile come reazione “anafilattoide”, mima una reazione anafilattica (IgE mediata) ma non ha coinvolg. anticorpaleManifest. frequenti: brividi, instabilità emodinamica, dispneaSi osserva durante la prima infusione o poche ore dopo, rara alle infusioni successiveFattore importante: velocità di infusione

CITOCHINE - FATTORI DI CRESCITA EMATOPOIETICI

Regolano ematopoiesi (proliferazione, differenziazione, maturazione) e attività funzionale di cellule maturesono glicoproteine con ponti disolfuro tra gruppi cisteinici spesso essenziali per l’attività biologica


Colony-stimulating factors per granulociti (G-CSF), granulociti-macrofagi (GM-CSF), macrofagi (M-CSF), eritropioetina (EPO), IL-3, ecc.

G-CSF e GM-CSF sono prodotti in forma sia glicosilata (CHO) sia non glicosilata (E. coli), EPO in CHO


Impieghi clinici:G-CSF neutropenie, trapianto di midollo, pazienti con HIV in terapia con mielosoppressoriGM-CSF neutropenia, trapianto di midollo, pazienti con HIV in terapia con antiviraliEPO anemia associata a insufficienza renale cronica o chemioterapia


Tossicità: G-CSF, GM-CSF perdita di appetito, febbre, mal di testa GM-CSF effetto indesiderato più grave è la capillary-leak syndrome con elevati dosaggi, reazione di prima dose (tachicardia, ipotensione, vomito ecc), prod. di anticorpi EPO ipertensione/trombosi in soggetti predisposti, aplasia eritrocitaria da NAB

CITOCHINE INTERLEUCHINE-INTERFERONI

Sono glicoproteine che svolgono un ruolo di comunicazione tra cellule dei sistemi immunologico, ematologico, neurologico.Interleuchine deriva da inter-leucocitiinterferone dall’abilità di interferire con infezioni virali

CITOCHINE INTERLEUCHINE (IL)

IL-1 mediatore della risposta a infezioni, infiammazioneIL-2 prodotta da cellule TH1 stimola crescita, differenziazione, attivazione di cellule T, B, NKIL-3 fattore di crescita ematopoieticoIL-4 …………..IL-17

CITOCHINE INTERLEUCHINA -2

La proteina ricombinante è disponibile commercialmente come Proleukin, è prodotta in E. coli ed ha due modificazioni aminoacidiche rispetto alla proteina naturaleindicazione terapeutica: cancro renale metastatico, melanoma

CITOCHINE INTERLEUCHINA -2

Tossicologia:la terapia approvata dalla FDA è ad alte dosi; somm. i.v.: tox frequente, spesso seria, a volte fatale; capillary-leak syndrome che causa ipotensione con ridotta perfusione degli organi; effetti cardiaci e cardiovascolari quali aritmia, ischemia (s.c. effetti meno gravi)

CITOCHINE INTERFERONI (IFN)

Identificate tre classi prodotte da vari tipi cellulari (rispettivamente leucociti, fibroblasti, T linfociti)Gli effetti antivirali degli interferoni sono causati da più meccanismi vengono prodotte forme ricombinanti di tutte e tre le classi

CITOCHINE IFN

Identificati 14 sottotipiprodotti singoli sottotipi ricombinanti in E. coli: IFN-2a (Roferon-A), IFN-2b (Intron A) anche pegilati; disponibili miscele purificate da leucociti umani: IFN-n3 (Alfero-N), IFN-ni (Wellferon). Indicazioni terapeutiche: tumori (linfoma non Hodgkin, ter. aggiuntiva cancro rettale, etc.), epatite B e C, infezioni da Papilloma virus

CITOCHINE IFN

Tossicità:sindrome influenza-simile iniziale,alterazioni della visione, diarrea, vomito, affaticamentoanemia, cardiotossicità (aritmia atriale) leucopenia, trombocitopeniaprod. di anticorpi neutralizzanti per i non glicosilati

CITOCHINE IFN

Tre prodotti sul mercato:IFN -1b (Betaseron/Betaferon s.c.) prodotto in E. coli con modificazione aminoacidicaIFN -1a (Avonex i.m. e Rebif s.c.) prodotti nelle CHOindicazioni terapeutiche:sclerosi multipla recidivante-intermittente

CITOCHINE IFN

Tossicità:-sindrome influenza-simile-reazioni in sede di iniezione-confusione, depressione, ansia-anticorpi neutralizzanti con tutti i composti (in particolare con Betaseron)

CITOCHINE IFN

Presenti due forme con la stessa sequenza aminoacidica, ma diversa glicosilazioneProdotto ricombinante: IFN -1b (Actimmune, i.m. e s.c.) in E. coliindicazione terapeutica:granulomatosi cronica

CITOCHINE IFN

Tossicità:- sindrome influenza-simile- leucopenia, ipotensione,

neurotossicità, trombocitopenia- nessuna rilevazione di anticorpi

neutralizzanti

ANTICORPI MONOCLONALI

terapia con immunoglobuline nota da due secoliproduzione anticorpi monoclonali dal ‘751986: OKT3 approvato per prevenire rigetto dopo trapiantovari anticorpi oggi in uso per terapia o diagnostica


Problema dell’uso di anticorpi monoclonali murini: immunogenicità

sviluppo di anticorpi ricombinanti con regioni variabili murine e costanti umane - chimerici (-xi-)

sviluppo di anticorpi umanizzati (-zu-)

EVOLUTION OF ANTIBODY TECHNOLOGY


OKT3 Muromonab CD-3Ab monoclonale murino specifico per CD3 umano su cellule T è un potente immunosoppressoreuso per prevenzione di rigetto dopo trapianto di rene, cuore, fegatounica terapia efficace in casi di rigetto steroidi resistenti


OKT3 Muromonab CD-3

Effetti indesiderati:immunogenicità (prod. di “versioni” umanizzate, es HuOKT3 1(Ala-Ala))aumento incidenza infezionisindrome da rilascio di citochine


AbciximabAbciximab (REOPRO) (REOPRO) Anti-integrine (molecole di adesione)Anti-integrine (molecole di adesione) Antiglicoproteina IIb/IIIa - Antiglicoproteina IIb/IIIa - Monoclonale chimerico per la Monoclonale chimerico per la prevenzione della riocclusione prevenzione della riocclusione coronarica dopo angioplasticacoronarica dopo angioplastica

RituximabRituximab monoclonale chimerico che monoclonale chimerico che lega l’antigene CD20 su linfociti normali lega l’antigene CD20 su linfociti normali e maligni, Linfoma NHe maligni, Linfoma NH

ANTICORPO CHIMERICO (anti CD-20)ANTICORPO CHIMERICO (anti CD-20)


Trastuzumab (Herceptin, Genentech)

anticorpo umanizzato anti HER2 (epidermal growth factor receptor 2)approvato per cancro metastatico alla mammella con sovraespressione di HER2


Trastuzumab (Herceptin, Genentech)

effetti indesiderati: flu-like syndrome, nausea, vomito, insonnia, suscettibilità ad infezioni; in combinazione con chemioterapici può dare cardiotossicità, leucopenia, anemie

SINDROME DA CITOCHINESINDROME DA CITOCHINECYTOKINE SYNDROMECYTOKINE SYNDROME

Sindrome acuta a Sindrome acuta a carattere febbrile, carattere febbrile, che si verifica dopo che si verifica dopo

una o poche una o poche somministrazioni di somministrazioni di citochine impiegate citochine impiegate

nella terapia di varie nella terapia di varie patologie patologie

CYTOKINE SYNDROME - MECCANISMO E CYTOKINE SYNDROME - MECCANISMO E MANIFESTAZIONI CLINICHE IMANIFESTAZIONI CLINICHE I

Le citochine agiscono da “superantigene” Le citochine agiscono da “superantigene” attivando una frazione elevata di cellule T attivando una frazione elevata di cellule T perifericheperiferiche

Ondate successive di citochine sono prodotte, Ondate successive di citochine sono prodotte, con un ruolo centrale per TNFcon un ruolo centrale per TNF

Sintomi lievi:Sintomi lievi:a carattere influenzale con leggera febbre nelle a carattere influenzale con leggera febbre nelle prime 2-3 ore dalla somministrazione prime 2-3 ore dalla somministrazione

Di media severità:Di media severità:Lieve broncospasmo e/o ipotensione con Lieve broncospasmo e/o ipotensione con liberazione periferica di citochine (misurabili)liberazione periferica di citochine (misurabili)

Sintomi di elevata gravitàSintomi di elevata gravitàGrave febbre, broncospasmo, collassoGrave febbre, broncospasmo, collasso

Manifestazioni biochimiche Manifestazioni biochimiche aumento di creatinina, azotemia e aumento di creatinina, azotemia e bilirubina, TNF, IL6 e recettori solubili bilirubina, TNF, IL6 e recettori solubili IL-2, CD25, LPB; IL-2, CD25, LPB; Aumento periferico di cellule NK e Aumento periferico di cellule NK e linfocitosilinfocitosi

Nel caso di trattamenti anti-CD3 Nel caso di trattamenti anti-CD3 (muromonab) produzione di anticorpi (muromonab) produzione di anticorpi anti-murinianti-murini

CYTOKINE SYNDROME - MECCANISMO E CYTOKINE SYNDROME - MECCANISMO E MANIFESTAZIONI CLINICHE IIMANIFESTAZIONI CLINICHE II

SINDROME DA CITOCHINE: ESPRESSIONESINDROME DA CITOCHINE: ESPRESSIONE DIPENDENTE DA T LINFOCITI DIPENDENTE DA T LINFOCITI

Espressione da parte di Espressione da parte di mononucleatimononucleati

Tipo 1 (Th1): Tipo 1 (Th1): aumento di IL-2, TNFaumento di IL-2, TNF--, IFN-, IFN-immunità cellulo-mediata ed immunità cellulo-mediata ed effetti protettivi fagocito-effetti protettivi fagocito-dipendentidipendenti

Tipo 2 (Th2): Tipo 2 (Th2): aumento IL-4,-5,-10,-13: produzione aumento IL-4,-5,-10,-13: produzione di anticorpi, attivazione di di anticorpi, attivazione di eosinofili, inibizione di attività eosinofili, inibizione di attività macrofagica (effetti fagocito-macrofagica (effetti fagocito-indipendenti)indipendenti)

Sindrome da citochine - I meccanismi Sindrome da citochine - I meccanismi

Meccanismo molecolareMeccanismo molecolareAttivazione da parte di IFNAttivazione da parte di IFN + TNF + TNF della iNOsintasi (iNOs) della iNOsintasi (iNOs)Potenziamento di stress ossidativi Potenziamento di stress ossidativi endocellulari, inibizione del endocellulari, inibizione del metabolismo energetico, metabolismo energetico, citotossicità. citotossicità.

In vitro a livello cardiaco iNOs In vitro a livello cardiaco iNOs aumenta liberazione di CPK aumenta liberazione di CPK (creatinfosfochinasi)(creatinfosfochinasi)Aggiunta di L-NMMA al medium di Aggiunta di L-NMMA al medium di cultura blocca iNOS e riduce la cultura blocca iNOS e riduce la tossicità da TNFtossicità da TNF +IFN +IFN

ESPERIENZA CLINICA DI TOSSICITA’ DI CITOCHINA -I

OKT3 umanizzato (hOKT34) (Richards et al, Cancer Res 59: 2096, 1999)

Umanizzazione di muromonab-CD3 impiegato nel rigetto di trapianto(limiti per la formazione di anticorpi)

OKT34 è modificato per Ig4HC e Ig light chain per sede antigenica simile ad OKT3 murino

Fase I: infusione i.v. 10 min Fase I: infusione i.v. 10 min

ogni 2 settimane da 50 a 1600 ogni 2 settimane da 50 a 1600 g g per iniezione, 6 per gruppoper iniezione, 6 per gruppo

Aumento progressivo di febbre, max Aumento progressivo di febbre, max

800-1600 800-1600 ggAumento di recettori solubili Aumento di recettori solubili IL2IL2

(max 1600) e concentrazioni di IL6 (max 1600) e concentrazioni di IL6

(max 1600)(max 1600)

ESPERIENZA CLINICA DI ESPERIENZA CLINICA DI TOSSICITA’ DI CITOCHINA -IITOSSICITA’ DI CITOCHINA -II

CYTOKINE SYNDROME -FEVER AFTER hOKT34

CYTOKINE SYNDROME - Increased CYTOKINE SYNDROME - Increased soluble IL-2 R after hOKT3soluble IL-2 R after hOKT344

CYTOKINE SYNDROME CYTOKINE SYNDROME Increased IL-6 after hOKT3Increased IL-6 after hOKT344

CYTOKINE SYNDROME - hOKT3CYTOKINE SYNDROME - hOKT3

100 100 g g - leggera febbre e cefalea - leggera febbre e cefalea in un paziente; nessuna tossicitàin un paziente; nessuna tossicità

200-400 200-400 g g - febbre, cefalea, - febbre, cefalea, nausea e rigiditànausea e rigidità

800 800 g g - tutti febbre e nausea - tutti febbre e nausea variabile; 3 rigidità ; 1 dispnea variabile; 3 rigidità ; 1 dispnea con richiesta di O2con richiesta di O2

1600 1600 g g (5 pazienti) - 2 gravi (5 pazienti) - 2 gravi episodi di dispnea, 1 con rigidità episodi di dispnea, 1 con rigidità e grave cefaleae grave cefalea massima dose tollerata 800 massima dose tollerata 800 gg

CYTOKINE SYNDROMECYTOKINE SYNDROMEPOSSIBILITA’ DI TRATTAMENTOPOSSIBILITA’ DI TRATTAMENTO

Sintomatica:Sintomatica:Difenidramina e/o Difenidramina e/o paracetamoloparacetamoloMannitolo, antiossidanteMannitolo, antiossidantePentoxifillina: Pentoxifillina: teofillinico ad azione teofillinico ad azione vasodilatatrice ed vasodilatatrice ed antagonista delle antagonista delle citochine, sopprime citochine, sopprime trascrizione di TNFtrascrizione di TNF

SINDROME DA CITOCHINE DA SINDROME DA CITOCHINE DA PERFUSIONE CON rTNFPERFUSIONE CON rTNF E E

MELFALANMELFALAN

Perfusione di arto con rhTNF-Perfusione di arto con rhTNF- e e melfalan: trattamento di sarcomi melfalan: trattamento di sarcomi

Nel 12-29% dei casi sindrome da Nel 12-29% dei casi sindrome da citochine con ipotensione e citochine con ipotensione e aumento circolante di IL-1, IL-6 aumento circolante di IL-1, IL-6 e lipopolysaccharide binding e lipopolysaccharide binding protein (LPB)protein (LPB)

Protocollo di trattamento Protocollo di trattamento contemporaneo con pentossifillina contemporaneo con pentossifillina 7.5 mg/kg/h7.5 mg/kg/hOhemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003

TRATTAMENTO DI S. DA CITOCHINE CON PENTOSSIFILLINATRATTAMENTO DI S. DA CITOCHINE CON PENTOSSIFILLINA

Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003


Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003Ohemberg et al, Ann Surg Oncol 10, 562, 2003

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