UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Universidad del Perú, Decana de AméricaFACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
EAP DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Chuco Sutta Luis Alberto Domínguez Parco Sandy Espilco Villarruel Guadalupe Evangelista Tenorio Eduardo Hualan Sandoval Luis Félix
28 de Noviembre 2013
INGENIERÍA GENÉTICA
Técnicas que modifican las características hereditarias de un organismo en unsentido predeterminado mediante la alteración de su material genético
La formación de nuevas combinaciones de genes por el aislamiento de unfragmento de DNA, la creación en él de determinados cambios y la reintroducciónde este fragmento en el mismo organismo o en otro. Cuando los genes nuevos sonintroducidos en las plantas o animales, los organismos resultantes pasan a llamarsetransgénicos.
Es el conjunto de métodos y técnicas que permiten el acceso y la manipulación del DNA
1953 Watson & Crick determinación deestructura del ADN1966 Nirenberg, Ochoa y Khorana elucidaronCódigo Genético1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNren bacterias además de desarrollar las técnicasde clonaje de ADN en laboratorios1982 Tabaco, la primera planta modificadagenéticamente1983 palmiter y brinster produjeron un ratóntransgénico .2000 26 de junio se presenta 90% borradorgenoma humano2001 26 de enero borrador genóma del arrozOriza sativa
RESEÑA HISTÓRICA
Ingeniería Genética
Clonación
Producción de Proteínas
humanas
Terapia
Génica
Síntesis de Nuevas Proteínas
Nuevos
Antibióticos
Nuevas
Plantas y
Animales
BENEFICIOS FUTUROS DEL DNA RECOMBINANTE
La terapia por reemplazo de genes para el tratamiento de enfermedades hereditarias.
La obtención de evidencias mediante huellas de DNA en casos de crímenes
CONSEGUIR PRODUCTOS AGRÍCOLAS MÁS DURADEROS Y NUTRITIVOS.
Alterar los genomas de los seres vivos para dotarles de algunacualidad que no tenían (plantas resistentes a heladas, frutas quemaduran antes, cultivos que crecen más,...).
ARROZ con altos niveles de tolerancia a diferentes condicionesambientales de estrés.Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa .Los genes detrehalosa permiten la producción de arroz aún si está estresado porfrio, sequía o altos niveles de salinidad e incrementa la producciónen 20%.El azúcar trehalosa ayuda a estabilizar moléculas biológicas: lípidos,enzimas y otras proteínas, en organismos en condiciones de estrés.La composición química de los granos no cambia.
ADN RECOMBINANTE
PROPÓSITO
Enzimas Restricción Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN
ADN Ligasa Une fragmentos de ADN
Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación
Plásmidos Clase común de vector
Marcadores Genéticos Identifican a las células que han sido transformadas
Gel Electroforesis Para separar fragmentos de ADN
Secuenciación ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN
Creación de nuevascombinaciones desegmentos o demoléculas de ADNque no se encuentranjuntas de maneranatural.
1
2
3
Los fragmentos de ADN se generan utilizando unas enzimas
denominadas ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN, quereconocen y cortan las moléculas de ADN por secuenciasnucleotídicas específicas.
Eco RI:Reconoce y seune a lasecuenciapalindrómicaGAATTC
Enzimadesoxinucleotidiltransferasa terminalpara crear colascomplementariasmediante la adiciónde fragmentos depoli-dA y de poli-dT
Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentestransportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. Sonpequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentrode las células hospedadoras.
Consiste en la captación por parte deuna célula receptora de una molécula ofragmento de DNA desnudo y laincorporación de esta molécula alcromosoma del receptor en una formaheredable. En la transformación natural,el DNA procede de una bacteriadonadora.
1) La partícula viral se fija a un sitio receptorespecífico de la superficie bacteriana.2) En la segunda, el material genético delvirus que con frecuencia es DNA bicatenario,penetra entonces en la célula. Tras laadsorción y la penetración, el cromosomaviral obliga a la bacteria a fabricar ácidosnucleicos y proteínas del virus.3) La tercera fase comienza tras la síntesis delos componentes virales. Se ensamblan fagosa partir de estos componentes. El proceso deensamblaje puede ser complejo, pero entodos los casos el ácido nucleico se introduce(“se empaqueta”) en la cápside proteicaviral.• Finalmente, los virus maduros sonliberados al medio mediante la lisis de lacélula huésped.
INSULINA RECOMBINANTE
Historia
• Hasta 1983 toda la insulina utilizada para eltratamiento de la diabetes era extraída depáncreas de porcino y bovino, sin embargo, el usoprolongado de este tipo de insulina provoca, enalgunos individuos, una respuesta inmune.
• Además la disponibilidad de páncreas de losanimales mencionados es limitada, por lo que esdeseable la obtención y uso de insulina humana.
• El objetivo sería conseguir que los geneshumanos, responsables de la producción de lahormona insulina se expresaran en la bacteria.
• De este modo, lasbacterias produciríaninsulina a grandesvelocidades, pudiéndoseescalar el modelo entanques de fermentaciónpara la obtención degrandes cantidades.
(3)
Existen dos rutas para la obtención de insulinahumana utilizando microorganismosmodificados por ingeniería genética:
•Una de ellas, consiste en producir por separadoambas cadenas para , posteriormente, asociarlasquímicamente.
•La otra se basa en la producción de proinsulinaque es procesada hasta insulina maduramediante métodos enzimáticos.
(4)
Historia
-Disponibilidad de páncreas de los animales mencionados es
limitada, por lo que es deseable la obtención y uso de insulinahumana.
-Regular la diabetes mellitus (Deficiencia de insulina ), la máscomún es la de tipo 2 (No insulinodependiente) se puedecontrolar con dieta equilibrada.
Hasta 1983
La insulina para tratamiento de la diabetes
era extraída de páncreas de porcino y bovino
Uso prolongado de este tipo de insulina provoca, en algunos individuos, una
respuesta inmune
LA ESTRUCTURA DE LA INSULINA• Sir Frederick Grant Banting
descubrió la insulina en el año de1921 teniendo como antecedenteslos trabajos de Shafer.
• Dilucidación de su estructura,proeza realizada en 1954 porFrederick Sanger y suscolaboradores de la Universidad deCambridge.
• La insulina es una molécula muypequeña: sólo contiene 254 átomosde carbono, 337 de hidrógeno, 65de nitrógeno, 75 de oxígeno y 6 deazufre.
• 24 aminoácidos posibles, 17 estánpresentes en la insulina.
Secuencia crucial
• Un solo cambio en la posiciónde un aminoácido dentro dela molécula puede hacercambiar la funcionalidad dela proteína.
• Sanger utilizó el métodotradicional para estudiargrandes moléculas:romperlas en fragmentos ycolocarlas nuevamente juntascomo las piezas de unrompecabezas.
• La rotura completa de lamolécula sirve paraidentificar los aminoácidos,pero no dice nada acerca decomo están ordenados.
Trabajo de Sanger
Dilucidar no solo la estructura total de la molécula de insulina
También el orden en el que se alinean las
distintas subunidades de aminoácidos
Dilucidación de la estructura de la Insulina
Cromatografía en capa fina
Hidrólisis fraccionada
Marcador especial que se une a los grupos NH2
libre
El Marcador fue el DNP (dinitrofenol) que se une al NH2
terminal y resiste la hidrólisis.
Fraccionando la molécula de insulina , diferentes
péptidos, marcando estos con DNP y produciendo la hidrólisis
fraccionado y total de estos péptidos para identificar los
aminoácidos.
Fraccionar insulina en sus dos cadenas. Puentes disulfuro, se
pueden romper selectivamente por oxidación con acido
perfórmico.
Hidrolisis Fraccionada
• Separó ambas cadenas por electroforesis.
•Demostró que una cadena se iniciaba con glicocola, mientras que la segunda se iniciaba por fenilalanina.
La cadena de fenilalanina, con 30 aminoácidos era, con gran diferencia, el polipéptido más
complejo
Secuencia inicial de cadena de glicocola : glicocola-isoleucina-valina-ácido glutámico-ácido
glutámico
se concentró inicialmente sobre la cadena de glicocola
• El objetivo sería conseguirque los genes humanos,responsables de laproducción de lahormona insulina seexpresaran en la bacteria.
• De este modo, lasbacterias produciríaninsulina a grandesvelocidades, pudiéndoseescalar el modelo entanques de fermentaciónpara la obtención degrandes cantidades.
Producir por separado ambas cadenas para , posteriormente, asociarlas químicamente.
Producción de proinsulina que es procesada hasta insulina madura mediante métodos enzimáticos.
Rutas para obtención de
Insulina Humana utilizando
microorganismos modificados por
ingeniería genética
PRODUCCION DE INSULINA RECOMBINANTE
• Biólogos moleculares aislaban los genesresponsables de la producción del proinsulinay pronto la industria farmaceútica vislumbró laposibilidad de obtener insulina humana porclonación de genes en bacterias.
• La estrategia seguida para la producción deinsulina humana recombinante fué lasiguiente:
1
• En primer lugar, se sintetizaron químicamente las cadenas de ADN con las secuencias correspondientes a las cadenas de glicocola y fenilalanina
• siendo necesarias 63 nucleótidos para la primera y 90 para la segunda más un triplete para señalar el fin de la traducción
2• Para facilitar la separación de los productos sintetizados, se añadió a cada
gen el triplete correspondiente a la metionina.
3• Los genes sintéticos A y B se insertaron por separado en el gen bacteriano
responsable de la b-galactosidasa y presente en un plásmido
4
• Los plásmidos recombinantes se introdujeron en E. coli donde se multiplicaron, fabricando un ARNm que tradujo una proteína quimérica, en la que una parte de la secuencia de la b-galactosidasa estaba unida por una metionina a la cadena de glicocola o de fenilalanina de la insulina.
5
• Como ninguna de las cadenas de insulina contiene metionina, esto se aprovecho para separar las cadenas de la insulina del resto de proteína quimérica rompiéndola con bromuro de cianógeno que destruye la metionina
6
•Después de purificadas, las cadenas se unieron mediante una reacción que forma puentes de disulfuro.
INSULINA DE TIPO HUMANO
Proviene de bacterias alteradas por medio deingeniería genética que producen unainsulina muy similar a la de los humanos, deaquí que se le denomine insulina humana orecombinante
INSULINA DE TIPO ANIMAL
Esta se puede obtener por extraccióndel páncreas de diferentes especiesanimales en particular la bovina(buey) o la porcina (cerdo). (Lerman:1994)
BENEFICIOS
Menos inmunológicas
Son física y químicamente equivalente a la insulina pancreática humana
Produce menos formación de anticuerpos.
Su producción es más rápida y se genera en grandes cantidades.
Permite alargar la supervivencia en forma considerable,
Bajo costo ya que no esta patentada,
Adecuado control para los pacientes que no toleran la insulina transgénica
No tienen problemas en su administración puesto que se adapta fácilmente a su cuerpo.
CONSECUENCIAS
Causa atrofia (desgaste de los tejidos grasos debajo de la piel) en los sitios de inyección dejando un ligero hundimiento, la hipertrofia (hinchazón del tejido graso) abultamiento en las zonas de inyección.
El costo de esta es más caro por las empresas que la han patentado.
Puede provocar alergias causando comezón en el lugar de la inyección, por que la estructura química de esta es diferente a la humana y por lo tanto el sistema inmunológico no la reconoce como una proteína propia, también provoca lipodistrofia (trastorno en el metabolismo de las grasas) o formación de anticuerpos.
