13.02.2011
1
2
Cromozomii umani
• reprezintă structuri dinamice ca formă, aspect, grad de compactizare, activitate genetică:
• crs mono – sau bicromatidian;
• cromatină sau cromozom;
• activ pentru transcripţie sau inactiv.
• reprezintă substratul morfologic al E şi V;
• nivelul supramolecular de organizare a materialului genetic (ADN + proteine histone + proteine nonhistone + ARN)
3
• crs se autoreproduc prin replicarea ADN ce îi constituie numai în perioada S a interfazei.
• crs reprezintă grupuri de înlănţuire a genelor:
- fiecare crs conţine un număr anumit de gene;
- fiecare genă are o poziţie fixă pe cromozom – locus;
- genele unui cromozom formează grupuri lincage, ce de regulă, se transmit în bloc, înlănţuit
• setul diploid de crs a unui individ formeză cariotipul:
23 perechi: 22 perechi autozomi +
1 pereche gonozomi (XX sau XY).
Cromozomii pereche = cromozomi omologi 4
Originea gonosomilor
rep
ere
de
ide
nti
fica
re a
ca
rio
tip
ulu
i
lungimea relativă şi absolută a crs
poziţia centromerului = constricţia primară - c
prezenţa constricţiilor secundare – h
prezenţa sateliţilor - s
6
Studiul cromozomilor se poate realiza în:
• Metafază prin colorare omogenă sau în benzi
• Prometafază prin colorare în benzi
• Interfază prin hibridare cu sonde moleculare marcare fluorescent
13.02.2011
2
7
• Cromozomii au o structură neomogenă:
- Secvenţe codificatoare şi necodificatoare;
- Segmente de eucromatină şi heterocromatină,
- secvenţe unice şi repetitive;
- Secvenţe bogate în GC şi AT;
- Secvenţe transcrise şi netranscrise;
- segmente bogate în proteine acide şi bazice.
!!! Acestea explică originea benzilor cromozomiale
• Anomaliile de număr sau de structură a crs se manifestă prin anomalii multiple de dezvoltare – sindroame crs plurimalformative
8
Forma cromozomului metafazic depinde de POZIŢIA CENTROMERULUI
Structura cromozomului metafazic.
Repere cromozomiale
9
100xqp
pIc
10
Cariotipul uman
11
CLASIFICAREA CROMOZOMILOR
După lungime:
-Mari
-Medii
-Mici
După formă:
-Metacentrici
-Submetacentrici
-Acrocentrici
După tip:
-Autozomi
-Gonozomi
După prezenţa altor repere:
-Cu h pe braţul p
-Cu h pe braţul q
-Cu sateliţi
Grupe:
A 1-3
B 4,5
C X, 6-12
D 13-15
E 16-18
F 19,20
G 21, 22, Y
12
Cariotipul uman şi formula cromozomială
46,XX
46,XY
47,XXY
45,X
47,XY,+21
45,XY,-21
46,XX,5p-
13.02.2011
3
Când putem presupune o anomalie crs de NR sau de structură ?
• Anomalii de dezvoltare mutiple – sindrom plurimalformativ
• Anomalii de sexualizare
• Anomalii de reproducere
– Nou născut mort plurimalformat
– Avorturi spontane repetate
– Sterilitate primară
1. Colectarea sîngelui pentru a obţine celule nucleate
(!!! leucocitele sîngelui periferic au nuclee în interfază)
ETAPELE CARIOTIPĂRII
2. Obţinerea culturii de celule în diferite perioade ale mitozei
37º C
72 ore
Cel sâgelui
+ mediu de
creştere
Cel în diferite faze ale mitozei Peste 72 ore
3.Pregătirea cromozomilor pentru microscopie
Celule în diferite faze ale mitozei
Sol hipotonică
Citostatic - colhicină
Stoparea metafazei
Sedimentarea celulelor
Dispersarea cromozomilor
Lamă cu cel fixate Lamă cu plăci metafazice
Colorare
4. Colorarea şi microscopia preparatului cromozomic 5. Analiza cariotipului
Fotografierea
plăcii metafazice
Decuparea cromozomilor
Realizarea cariogramei = cariotipului
13.02.2011
4
19
Tehnici de citogenetică – de analiză a cariotipului:
Pentru identificarea anomaliilor de număr – analiza cromozomilor metafazici cu colorate omogenă.
Pentru identificarea anomaliilor de număr şi de structură – analiza cromozomilor metafazici cu colorare diferenţiată Q, G, R; analiza cromozomilor prometafazici cu colorare diferenţiată Q, G, R.
Pentru identificarea polimorfismului cromozomial – analiza cromozomilor metafazici cu colorare diferenţiată C, T.
Studiul cariotipului uman
Analiza crs metafazici
Analiza crs prometafazici
Analiza crs interfazici
Colorare uniformă
Colorare în benzi
G,Q,R,C,T
colorare în benzi G, R
Testul cromatinei
sexuale X şi Y
Metode molecular
citogenetice FISH, mFISH
SKY CGH
*** NR benzi pentru setul haploid: 300-400 m / 550 pm / 850p
Colorarea cromozomilor
Omogenă Diferenţiată, în benzi
G Q R C T
Benzile G+ = Q+ = R –
Benzile G- = Q- = R +
Nomenclatura benzilor
Cromozomul
benzi
braţe
subbenzi
4p22.2
5q13.4
9p21.3
regiuni
46,XY,del(1)(p11-p34)
1p35
1p22
1q23
1q41
46,XY,del(1)(p11-p34)
13.02.2011
5
46,Y,del(X)(q12.1-q24.3)
Cariotip
46,XX
46,XY
46,XX,9qh+
46,XY,16qh-
46,XX,14s++
47,XX,+21
45,XY,-12
48,XXXY
45,X
69,XXX
69,XXY
46,XX,1q-
46,XY,16p+
46,X,r(X)
46,XY,del(5p)
46,XX,t(12,22)
Normal Normal cu polimorfisme
Aneuploid Poliploid Cu aberaţii cromosomiale
Fenotip normal
inv
t
rob
Anomalii de structură echilibrate
Fenotip patologic
Trisomii – 47,XXX; 47,XXY; 47,+21; 47,+13; 47,+18; 47,+8
Monosomii – 45,X
Anomalii de număr
Fenotip normal
Crs D şi G – variaţii ph sau s:
Crs 1,9,16,9,Y – variaţii qh
Polimorfisme
Fenotip normal
46,XX
46,XY
Cariotip normal
Fenotip patologic
del
dup
r
i
Anomalii de structură neechilibrate
??? polimorfisme
• p şi q – conţin segmente cromozomiale codificatoare şi necodificatoare
• p+ sau p- - anomalii
• q+ sau q- - anomalii
• c mai mare sau mai mic – polimorfism
• t mai mare sau mai mic – polimorfism
• h+ sau h- - polimorfism • s+ sau s- - polimorfism
Testul cromatinei sexule
Testul cromatinei sexule X = testul Barr - vizualizarea crs X inactiv, heterocomatinizat pe nucleele interfazice ale celulelor somatice
Testul cromatinei sexule Y = testul F – vizualizarea a 2/3 din braţul qY pe nucleele interfazice ale celulelor somatice sau ale spermatozoizilor
Cromozomul Y ~ 300 gene:
• gene reglatoare masculinizante
• pseudogene
• !!! Braţul q conţine heterocromatină constitutivă
Cromozomul X ~2000 gene:
•gene structurale somatice
•gene reglatoare feminizante;
•gene structurale feminizante;
•gene structurale masculinizante
13.02.2011
6
!!! Important
• Cromozomul X – este indespensabil celulei somatice
şi :
• În cel 46,XX – este activ numai un X
• În cel 46,XY – este activ şi X şi Y
• În cel 47,XXX - este activ numai un X
• În cel 47, XXY- este activ numai un X şi un Y
• În cel 48, XXXY- este activ numai un X şi un Y
• Cromozomul Y – este obligator pentru
De ce? Există o explicaţie?
Dimorfismul sexual - echilibrat
• Caractere sexuale primare - diferite
• Caractere sexuale secundare - diferite
• Caractere somatice - asemănătoare
Regiunile crs X şi Y
I – regiunea pseudoautosomală (PA) cu gene comune şi pe crs X şi pe crs Y:
- Xpter - Ypter
II – regiunea crs X cu gene specifice numai X
III – regiunea crs Y cu gene masculinizante
IV – regiunea crs Y (2/3Yq) cu secvenţe necodificatoare – heterocromatină constitutivă
Concluzii: • La persoanele 46,XX:
– Sunt active genele celor 22 perechi autosomi;
– Sunt active genele unui crs X + genele regiunii PA Xpter a celui de-a doilea crs X
• La persoanele 46,XY: – Sunt active genele celor 22 perechi autosomi;
– Sunt active genele unui crs X + genele regiunii PA crs Y (Ypter) + genele de ♂ ale crs Y (Yp şi 1/3Yq pericentromeric)
• Rol: controlul dozelor genelor somatice la ♀ şi ♂ + controlul diferenţierii sexuale
!!! Dimorfism sexual echilibrat
≠
Mecanisme moleculare implicate în lyonizare (inactivarea crs X)
• X q13 - centru de inactivare a crs X (XIC) - gena XIST (450 Kb) :
• gena XIST - promotor cu trei regiuni: – regiunea activatoare; – regiunea de stabilizare a ARN – XIST la nivelul crs
inactiv; – regiunea inhibitoare asupra regiunii activatoare.
• regiunea codificatoare - codifică ARN care rămâne asociată cu crs inactivat genetic
• capătul 3' al genei - reglează numărarea cromozomilor şi determină care X (
sau
) rămâne activ.
13.02.2011
7
!!! Gena XIST este o genă atipică – a pierdut potenţialul de codificare proteică
Funcţia genei XIST (X inactivation specific transcript)
• La nivel molecular – codifică sinteza ARNm-XIST;
• La nivel celular – inactivarea unui crs X
– ARNm – XIST rămâne ataşat la crs inactiv
– Dezacetilarea H1
– Heterocromatinizarea crs X
• La nivel de organism – controlul dozelor genelor X-lincate materne şi paterne controlul dezvoltării organismului feminin
Amprentarea genomică (sau imprinting-ul parental)
• Mecanism de reglare a activitaţii transcripţionale şi expresiei fenotipice a unei gene din perechea de alele
• reprezintă represarea permanentă, dependentă de originea parentală: – a unei gene ♀ sau ♂ – a unui cromozom ♀ sau ♂ – a genomului ♀ sau ♂
• modificări epigenetice în cursul gametogenezei şi/sau embriogenezei precoce
• Ex: genele X-lincate la ♀; diferite gene autosomale (s. Angelman, s. Prader-Willy)
46,XX 46,XY
Crs X – activ
eucromatinizat
Crs X – activ
eucromatinizat
Crs Y
Braţ p - activ
Braţ q - inactiv
Crs X – neactiv
heterocromatinizat
Corpuscul F
= 0,25 μm
Corpuscul Barr
= 1μm
Testul Barr Cromatina sexuală X:
- reprezintă cromozomul X inactiv, heterocromatină facultativă,
în celulele somatice 46,XX;
- se prezintă sub forma unui corpuscul Barr de 1 m în nucleii interfazici ai celulelor somatice;
- testul Barr este util în identificarea nr de crs X în celulele somatice: NR crsX = nr corpusculilor Barr + 1 (un crs X activ). 46,XX – 1 corpuscul Barr 46,XY – 0 47,XXX – 2 47,XXY - 1 45,X – 0 48,XXXX – 3 !!! Explicaţia originii cromatinei X – ipoteza M. Lyon (1961)
Testul F Cromatina sexuală Y:
- reprezintă braţul q al crs Y, heterocromatină constitutivă (2/3q), în cel. somatice 46,XY sau în spermatozoizii 23,Y;
- se prezintă sub forma unui corpuscul F (fluorescent) de 0,25 m în nucleele interfazice;
- testul F este util în identificarea crs Y (determinarea prenatală a sexului): NR crsY = NR corpusculilor F 46,XX – 0 46,XY – 1 47,XYY – 2 47,XXY - 1 48,XXYY – 2 46,X,i(Yp) – 0 46,X,i(Yq) – 1 (0,5 m)
