IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI: REQUISITI TECNICI PER ASSICURARE IL DATO ANALITICO

Elisabetta Delibatoelisabetta.delibato@iss.it

• Le problematiche relative alla sicurezza alimentare rappresentano una priorità strategica nella tutela della salute pubblica.

• La globalizzazione dei mercati e la notevole complessità dei processi produttivi impongono la regolamentazione di tutti gli aspetti sia nell'organizzazione degli interscambi che nelle metodologie di produzione.

• Recentemente l'Unione Europea ha emanato un nuovo quadro giuridico che riflette la politica “dai campi alla tavola”, che si avvale della metodologia dell’analisi del rischio, e si snoda attraverso vari aspetti

• l’attribuzione, al mondo della produzione, dellaresponsabilità primaria nel garantire alimenti sicuri

• l’esecuzione di appropriati controlli ufficiali,

• la capacità di attuare rapide ed efficaci misure di salvaguardia di fronte ad emergenze sanitarie.

Regolamenti Comunitari Obiettivo fondamentale: alto livello di protezione

della salute pubblica

• Reg. (CE) 178/2002 - fissa le procedure nel campo della sicurezza alimentare

• Reg. (CE) 852/2004 – Igiene dei prodotti alimentari

• Reg. (CE) 853/2004 - Norme specifiche in materia di igiene degli alimenti di origine animale

• Reg. (CE) 854/2004 – Norme specifiche per l’organizzazione dei controlli ufficiali

• Reg. (CE) 882/2004 – Controlli ufficiali per la verifica della conformità alla normativa in materia di mangimi e alimenti

Reg. CE 882/2004Articolo 11

Metodi di campionamento e di analisi

• I metodi di campionamento e di analisi utilizzati nel contesto dei controlli ufficiali sono conformi alle pertinenti norme comunitarie oppure:

a) se tali norme non esistono, a norme o protocolli riconosciuti internazionalmente, ad esempio quelli accettati dal Comitato europeo di normalizzazione (CEN) o quelli accettati dalla legislazione nazionale;

oppureb) in assenza, ad altri metodi utili al

raggiungimento degli obiettivi o sviluppati conformemente a protocolli scientifici.

Reg. CE 882/2004Articolo 12

Laboratori ufficiali

1. L'autorità competente designa i laboratori che possono eseguire l'analisi dei campioni prelevati durante i controlli ufficiali.

2. Le autorità competenti, tuttavia, possono designare soltanto i laboratori che operano, sono valutati e accreditati conformemente alle seguenti norme europee:

a) EN ISO/IEC 17025 su «Criteri generali sulla competenza dei laboratori di prova e di taratura»;

b) EN 45002 su «Criteri generali per la valutazione dei laboratori di prova»;

c) EN 45003 su «Sistemi di accreditamento dei laboratori di taratura e di prova-requisiti generali per il funzionamento e il riconoscimento»

Reg. CE 882/2004Art. 12: laboratori ufficiali

L’autorità competente designa i laboratori che possono eseguire le analisi dei campioni prelevati durante i controlli ufficiali

Le autorità competenti designano soltanto i laboratori che operano, sonovalutati e accreditati conformemente alla EN/ISO/IEC 17025

Legge n. 88/2009Art.40 Disposizioni per l’accreditamento dei laboratori di autocontrollo del

settore alimentareNuovo Accordo Governo-Regioni-Province autonome

08 luglio 2010

I laboratori che effettuano analisi per l’autocontrollo devono essere accreditati conformemente alla EN/ISO/IEC 17025

L’esigenza di essere conformi alla ISO 17025 sia per l’AC che per l’OSA, nasce dalla necessità di garantire, a livello nazionale e comunitario:

• la qualità del dato analitico

• praticabilità e robustezza delle metodologie analitiche utilizzate per i controlli dei pericoli lungo la filiera alimentare e sui prodotti alimentari.

• Il laboratorio deve garantire la qualità del dato analitico, attraverso lo sviluppo e l’implementazione di un sistema di gestione della qualità, inteso come l’insieme:

1. di struttura organizzativa con definite responsabilità dei compiti assegnati

2. risorse adeguate 3. coadiuvato da procedure operative standard e

procedure gestionali.

Assicurazione della qualità dei risultati di prova e di taratura

Obiettivo del laboratorioMonitorare la validità delle prove (e delle tarature) eseguite

Sistema di Gestione della Qualità

L’insieme delle azioni pianificate e sistematiche necessarie a garantire che il laboratorio ed i dati soddisfino determinati requisiti di qualità

Deve essere inteso come l’insieme di:• Struttura organizzativa con definite responsabilità per il

conseguimento dei compiti assegnati;• Procedure generali o gestionali (PG) e procedure

operative standard (POS)• risorse

• riduce la necessità di ripetere analisi che possono essere anche costose

• fornisce dati ottenuti attraverso procedure che assicurano la accettabilità dei risultati

• prevede un addestramento del personale con adozione di procedure scritte al fine di evitare errori che possono essere anche costosi

• identifica ciò che è necessario fornire allo staff al fine di ottenere un servizio di qualità

• assicura una credibilità al laboratorio, che assume particolare rilievo quando ci sono implicazioni legali.

Documentazione del SGQ

• Manuale della Qualità• Procedure Generali o Gestionali (PG)• Procedure Operative Standard (POS)• Istruzioni operative• Metodi di analisi• Registri e Moduli

Manuale della qualità

• Descrive il sistema di conduzione del Laboratorio per garantire la qualità mediante:- descrizione sintetica delle attività dei compiti e dellefunzioni e delle risorse fornite dalla Direzione per garantire il mantenimento del SAQ

- indicazione delle PG del laboratorio

• Costituisce, insieme alle PG, alle POS e ad altri documenti del SGQ, il riferimento per la verifica della qualità del Laboratorio e per l’indicazione delle azioni di miglioramento

Settori disciplinati dal SGQ

• personale• ambiente• attrezzature• gestione campioni• materiale di riferimento• reagenti e terreni• metodologie• controllo di qualità, comprese prove intra e

interlaboratorio• registrazioni

Personale esperto in microbiologia

Saper evitare le infezioni è elemento essenziale della professionalità di un microbiologo.

Non esiste cappa biologica o altra attrezzatura o protocollo che possano garantire da soli la sicurezza, a meno che gli utenti non adottino tecniche sicure basate sull’informazione e la consapevolezza del rischio.

Nell’esecuzione delle prove sono richiesti quindi attenzione e controllo su ciò che si sta facendo, uniti ad una supervisione ed una sorveglianza adeguate.

• Il personale preposto all’attività analitica di controllo viene formato mediante corsi interni ed esterni inerenti il processo analitico e la conferma metrologica.

• Inoltre ne viene valutata l’esperienza e la qualifica mediante la partecipazione ai proficiency test

• il personale che ha la responsabilità di formulare, opinioni, interpretazioni inerenti l’emissione di un rapporto di prova, deve anche possedere la conoscenza approfondita delle tecnologie utilizzate per svolgere le analisi, sui materiali e prodotti utilizzati nonché sui requisiti espressi nella legislazione e nelle norme.

• Il personale dei laboratori di microbiologialavora con microrganismi patogeni o potenzialmente tali, è quindi fondamentale che vengano rispettate determinate norme, non solo per la qualità dei risultati, ma anche per la sicurezza dell’operatore.

• è elemento essenziale della professionalità di un microbiologo saper evitare infezioni adottando tecniche basate sull’informazione e consapevolezza del rischio.

Assicurare le migliori condizioni di asepsi, allo scopo di:

• isolare e/o numerare solo i microrganismi presenti nel campione

• non contaminare l'ambiente con i microrganismi presenti nel campione

• evitare contaminazioni crociate• proteggere l'analista dal pericolo di infezioni

Requisiti del Laboratorio

I Laboratori vengono definiti a seconda dei loro compiti e delle loro caratteristiche, come:

• laboratorio di base - livello di biosicurezza 1• laboratorio di base - livello di biosicurezza 2• laboratorio di sicurezza - livello di biosicurezza 3• laboratorio di massima sicurezza- livello di

biosicurezza 4

Ambienti1. Archivio2. Area preparazione dei terreni di coltura 3. Area sterilizzazione terreni di coltura4. Area esecuzione analisi, devono sussistere

ambienti separati a seconda del tipo di analisi che il laboratorio effettua

5. Area sterilizzazione materiale infetto6. Area smaltimento rifiuti7. Area lavanderia8. Area preparazione vetreria

• area destinata all’esecuzione dell’analisidotata di attrezzature e apparecchiature razionalmente distribuite in modo da consentire all’analista di operare agevolmente;

1. i piani di lavoro devono essere rivestiti, senza soluzione di continuità, con materiale impermeabile, liscio, anti-acido, facilmente lavabile e disinfettabile,

2. inoltre devono essere predisposte prese elettriche, punti di erogazione gas e acqua distillata.

3. devono essere predisposte le apparecchiature necessarie per l’esecuzione delle analisi e vicino ogni postazione di lavoro deve essere sistemato un numero sufficiente di contenitori per eliminare materiale monouso e contenitori per raccogliere vetreria infetta da sterilizzare.

• Area destinata alla sterilizzazione di materiale infetto deve essere dotata di un autoclave programmate per raggiungere temperature di almeno 134°C

• Area smaltimento rifiuti destinata alla raccolta dei contenitori del materiale infetto sterilizzato in attesa di essere smaltito.

• Area preparazione vetreria destinata alla vetreria riciclata dopo sterilizzazione che deve essere sottoposta a lavaggio e sterilizzazione in stufa a secco (180°C) o autoclave (121°C)

• In tali aree, soprattutto in quelle destinate all’esecuzione delle analisi e nell’archivio campioni, la 7218 consiglia un monitoraggio in continuo della temperatura (T°idonea tra 18-27 °C) e dei controlli ambientali per determinati microrganismi (L. monocytogenes, lieviti e muffe, carica microbica)

• Infine deve essere regolamentato, l’ingresso di personale esterno al laboratorio, per mezzo di apposite procedure

Strumentazione ScientificaLa dotazione strumentale del laboratorio deve essere innanzitutto

adeguata in qualità e quantità alla tipologia e al carico di analisi da effettuare.

Tutte le apparecchiature devono essere collocate in maniera taleda consentire un utilizzo confortevole ed una facile pulizia e manutenzione.

Devono essere a disposizione del personale del laboratorio POS riguardanti in dettaglio:

• la manutenzione;• i metodi, i materiali e le tabelle necessari all’uso e alla taratura

degli strumenti;• le operazioni specifiche che devono essere attuate nel caso di

avaria o cattivo funzionamento.

Ogni apparecchio deve riportare un’etichetta (o altro) con l’indicazione della data oltre la quale non può essere usato senza essere stato sottoposto a manutenzione o taratura.

Tutti gli interventi di manutenzione e taratura (ordinari e straordinari) devono essere regolarmente registrati.

Materiali e ReattiviProcedure Operative Standard: ricezione, identificazione,

registrazione, etichetta, conservazione, trasporto e modalità d’uso.

Mantenimento:• correttamente registrati e codificati;• correttamente conservati a seconda delle caratteristiche

e della necessità, in modo da assicurarne la stabilità;• ogni prodotto deve riportare in etichetta la data di

scadenza e, ove pertinente, il titolo;• per quei prodotti contenenti sostanze pericolose devono

essere disponibili schede di sicurezza, fornite dalla ditta, contenenti tutte le informazioni necessarie ( precauzioni da prendere, conservazione, misure di pronto soccorso ecc);

• devono esistere schede riguardanti i controlli di qualitàdei vari prodotti e la registrazione dell’effettuazione degli stessi .

Materiali di Riferimento• Materiale di Riferimento (RM) è un materiale o una sostanza con

una o più proprietà sufficientemente ben stabilite da usarsi per la calibrazione di uno strumento, per la verifica di un metodo di misura o per assegnare valori a materiali

• Coltura di Riferimento (RC) è una microrganismo con caratteristiche colturali sufficientemente ben stabilite da essere usato per la calibrazione/verifica di sistemi, terreni di coltura e per la validazione di metodi.

• Materiale di Riferimento Certificato (CRM) è un materiale di riferimento di cui una o più proprietà sono certificate da una procedura tecnicamente valida, accompagnato o riconducibile ad un certificato o altra documentazione rilasciata da un Organismo certificato

• Coltura di Riferimento Certificata (CRC) è un microrganismo di riferimento certificato da una procedura tecnicamente valida, accompagnato o riconducibile ad un certificato o altra documentazione rilasciata da un Organismo certificato; ad esempio i microrganismi usati per la calibrazione/verifica di sistemi, terreni di coltura e per la validazione di metodi devono essere attribuibili ad una collezione di un Organismo riconosciuto

Terreni di coltura

Per ogni terreno di coltura devono essere approntate schede di controllo riportanti:

• composizione;• modalità di preparazione del terreno;• proprietà fisiche (aspetto, pH)• conservazione (tempo e temperatura);• procedure per i controlli di qualità

Controlli di qualità dei terreni di coltura

Sterilità: condizione del terreno tale da non dare luogo ad alcuno sviluppo microbico, durante la sua conservazione e nel caso venga incubato in assenza di inoculo. Deve essere effettuato ad ogni preparazione

Produttività: attitudine del terreno di coltura nel favorire la crescita dei microrganismi da ricercare, determinare, identificare.

Selettività: capacità del terreno di impedire la crescita di microrganismi interferenti e/o diversificare la crescita dei microrganismi bersaglio.

• Per le prove finalizzate alla valutazione della produttività, selettività e specificità di un terreno, devono essere utilizzate delle colture standard di riferimento

• Le colture standard di riferimento devono essere preparate come brodocolture in fase stazionaria

• a tale scopo il ceppo di riferimento deve essere messo in coltura per 24 h in terreno liquido non selettivo alla medesima temperatura cui il ceppo sarà posto per l’esecuzione delle prove sul terreno test.

• Ad esempio per verificare la produttività di terreni utilizzati per la ricerca della salmonella negli alimenti, deve essere allestita una “Working colture” come Salmonella typhimurium ATCC al fine valutarne la crescita (assente, debole, buona) sui terreni selettivi solidi, o valutarne l’entità della crescita mediante la verifica della torbidità del terreno.

Campioni da analizzare

• In un laboratorio che effettua il controllo dei prodotti alimentari, l’identificazione e l’integrità dei campioni da sottoporre ad analisi devono essere assicurate per l’intero arco di tempo in cui i materiali da sottoporre ad analisi sono sotto la custodia del laboratorio.

Metodi analitici• Indubbiamente, considerate le implicazioni che possono

avere i risultati degli accertamenti analitici, ècomprensibile che nell’applicazione di una norma sia necessario far ricorso a metodi che offrano particolari garanzie per quanto riguarda l’affidabilità dei risultati conseguibili.

• A tal proposito, anche per armonizzare al meglio l’attività analitica nel settore della microbiologia alimentare e garantire una uniformità di comportamento sia nella fase di campionamento che nell’ambito dei controlli analitici è stato emanato il reg. 2073 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari.

ASPETTI INNOVATIVI

Æ Specifica in maniera esplicita i metodi di riferimento EN/ISO con cui verificare la conformità degli alimenti

Æ Consente l’impiego di metodi alternativi

ARTICOLO 5L’impiego di metodi alternativi è accettabile quando tali metodi sono validati in base al metodo di riferimento in accordo al protocollo definito nella EN/ISO 16140 o ad altri protocolli analoghi accettati a livello internazionale

Regolamento (CE) 2073/2005Criteri microbiologici applicabili ai prodotti

alimentari

L’introduzione di metodi di prova sviluppati dal

laboratorio per utilizzo interno deve essere:

•un’attività pianificata

•affidata a personale qualificato

•con risorse adeguate

•postazioni di lavoro e condizioni ambientali idonee

Confermare con esame e apporto di evidenze oggettive che i requisiti per l’utilizzazione prevista siano soddisfatti (EN/ISO/IEC 17025). Serie di prove di laboratorio condotte al fine di stabilire se le prestazioni caratteristiche del metodo soddisfino le richieste analitiche per le quali il metodo viene applicato.

VALIDAZIONE

NORMA EUROPEA UNI EN ISO 16140Microbiologia degli alimenti e mangimi per animali

PROTOCOLLO PER LA VALIDAZIONE DIMETODI ALTERNATIVI

•Scopo: Definire i principi generali ed il protocollo tecnico per la validazione di metodi alternativi

•Campo di applicazione: analisi microbiologiche di alimenti, mangimi per animali, campioni ambientali e veterinari

PROTOCOLLO DI VALIDAZIONE

Fase 1. Studio comparativo del metodo alternativo con un metodo di riferimento, realizzato in un laboratorio con elevate competenze

Fase 2. Studio interlaboratorio per ciascuno dei due metodi realizzato in 10 laboratori differenti

Le due fasi possono essere condotte in parallelo

Criteri da testare in funzione del metodo(qualitativo o quantitativo)

precisione relativa in rapporto al metodo di riferimento;accuratezza;sensibilità;specificità;limite minimo di rilevabilità;limite minimo di quantificazione;praticabilità ed applicabilità;incertezza di misurapossibili condizioni modificative (robustezza).

• Accuratezza (grado di accordo dei risultati ottenuti con il metodo da valutare con quelli ottenuti con il metodo di riferimento-campioni identici)

• Specificità (capacità del metodo alternativo di non individuare l’analitaquando questo non è individuato dal metodo di riferimento)

• Sensibilità (capacità del metodo alternativo di individuare l’analitaquando questo è individuato dal metodo di riferimento)

• Relative Detection Level (Il più piccolo numero di microrganismi rilevabili nel campione con entrambi i metodi nel 50% dei casi)

• Selettività (inclusività: capacità del metodo alternativo di individuare l’analita target ed esclusività: capacità del metodo alternativo di non individuare l’analita non-target)

Parametri da analizzare per i metodi qualitativi

Inclusività

Capacità del metodo alternativo di rilevare l’analita target in un range di microrganismi (inclusività)

…5.1.3.2.1.2 Target microorganismsSelect at least 50 pure cultures of microorganismsrelevant to the alternative method and the food productbeing used (see G.3), except for Salmonella.For Salmonella methods, select at least 30 pure culturesof microorganisms.

…5.1.3.2.1.3 Non-target microorganismsSelect at least 30 pure cultures of microorganismschosen from both the strains known to cause interferencewith the target microorganism and from strains naturallypresent in each food test material included in the validation (see G.4).

Mancanza di interferenza da parte di un range di microrganismi non target rilevante (esclusività)

Esclusività

Numerosità campionaria(Ac; Se; Sp)

Campioni divisi in categorie (Annex B).Almeno 60 campioni per categoriaAlmeno 20 campioni per ogni tipo di alimento in ogni categoria per almeno tre alimenti (60 campioni)

Quante categorie di alimenti testare? Metodi orizzontali almeno 5

Studio interlaboratorio

Almeno 10 laboratori di comprovata esperienza (es. accreditamento 17025) con risultati nel range di accettabilità

Una matrice rilevante (sulla base dello studio preliminare)Tre livelli di contaminazione:L0: negativoL1: intorno al RDLL2: un log sopra al RDL

8 “blind replicates” per livello di contaminazione

METODICHE APPLICABILI ALLA DETERMINAZIONE DEI BATTERI NEGLI ALIMENTI

Metodi colturali di riferimento affidabili ma lunghe: hanno l’obiettivo di isolare o numerare, mediante l’impiego di terreni colturali,i microrganismi presenti nei campioni da sottoporre ad analisi

Metodi alternativi sono rapidi, automatizzati, poco costosi e consentono di prendere misure tempestive nell’arco delle 24 h, al fine del:•controllo delle materie prime•rilascio dei prodotti•verifica del sistema HACCP•RASFF•Sorveglianza

I metodi tradizionali per il rilevamento di microrganismi in campioni alimentari possono essere divisi in due gruppi:

• quantitativi o enumerativi, nei quali viene determinato il numero di microrganismi presenti nel campione e il risultato viene espresso come numero di organismi presenti per unità in peso di campione

• qualitativi o presenza/assenza, nei quali viene richiesto semplicemente di rilevare se un particolare organismo èpresente o assente in un dato campione.

Generalmente tali metodi sono utilizzati per la ricerca di patogeni come Salmonella spp., L. monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Campylobacter spp., E.coli O 157

METODI COLTURALI CLASSICI

Prearricchimento realizzato in terreno liquido e previstoquando i germi presenti nel campione sono stressati. Tale faseè non selettiva e tende ad innalzare il numero deimicrorganismi;

Arricchimento serve a limitare lo sviluppo della flora accessoria ;

Isolamento permette l’identificazione presuntiva mediantestriscio su terreni agarizzati selettivi;

Identificazione viene effettuata mediante prove biochimiche e sierologiche.

LangtonLangton S.D. S.D. etet al. al. IntInt. J. Food . J. Food MicrobMicrob. 2002, 79, 175. 2002, 79, 175--181181Orefice Orefice L.etL.et al. Industrie Alimentari 2004, 442, 1257al. Industrie Alimentari 2004, 442, 1257--1275 1275

Ricerca della Salmonella negli alimenti: Metodo EN/ISO 6579Campione 25g

Acqua peptonata tamponata (APT)225 ml

Sacchettosterile

Omogenizzazionein "Stomacher"

per 1'

37°C x 24 h41.5 °C x 24 h

37°C x 24h

1 ansata

1 ansata

XLD BGA DES BGA

XLD BGA XLD BGA

37°C x 24h

Prelievocoloniesospette

37 °C x 24 h

RappaportVassiliadisSoyabroth (10 ml)

Mueller Kauffman(10 ml)

Trip lesugarironagar

Test di agglutinazione

0.1 m

l

1 m

l

Metodi alternativi•Metodi molecolari(PCR e Real time PCR)

•Metodi immunologici che si basano su reazioni Ag-Ab

supportati da vari sistemi di rivelazione

•Metodi microbiologici che utilizzano: fase di arricchimento (terreno +

substrato selettivo) seguito da una fase di isolamento su terreno cromogeno

SalmonellaMAb di mouse

CampylobacterSalmonella

Norme ISOPCR per la determinazione dei batteri patogeni negli

alimenti e nei mangimi

•ISO 22174:2005 PCR for the detection of food-borne pathogensGeneral requirements and definitions.

•ISO 20836:2005 Performance testing for thermal cyclers

•ISO 20837:2006 Requirements for samples preparation for qualitative detection

•ISO 20838:2006 Requirements for amplification and detection forqualitative methods

•ISO 22118:2008 Performance characteristics of molecular detection methods

ISO 22119:2011 Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions

Ricerca di patogeni negli alimenti mediante PCRISO 22174:2005

Ø Percorso analitico1. arricchimento della matrice contenente i germi patogeni2. estrazione e purificazione degli acidi nucleici3. amplificazione del target utilizzando i primers specifici4. determinazione dei prodotti della PCR

Ø Organizzazione delle aree di lavoro

Ø Controlli da effettuare

EstrazioneEstrazione di DNA di DNA battericobatterico

•trattamento termico ad elevate temperature•trattamento con detergenti ed enzimi (proteinasiK); trattamento con fenolo-cloroformio•utilizzo della tecnologia delle mebrane di silice..•utilizzo del polimero Chelex 100

E se m p i d i p ro ce d im e n ti d i e s tra z io n e d i a c id i n u c le ic i

O m o g e n a to d e l l'a l im e n t oin o p p o r tu n o te r r e n o d i c o ltu r a

p o s t o a d in c u b a r e

U n 'a l iq u o t a d e ll 'o m o g e n a to v ie n ep o s t a in p r o v e tt a e c e n t r i f u g a t a

p e r s e p a r a r e i b a tt e r i d a l t e r r e n o

I l p e l le t v ie n e r is o s p e s o in a c q u a e r is c a ld a to a b a g n o m a r ia a 1 0 0 ° C

p e r 1 0 ' c ir c a

P C R

1 0 0 ° C

D N A B A T T E R IC O

De Medici et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69: 3456-3461Hoorfar et al., APMIS, 2004, 112, 808-814.

La prima fase di qualunque tecnica di biologia molecolare applicata alla determinazione dei batteri negli alimenti consiste nell’isolare il DNA.

I protocolli sperimentali possono variare a seconda: üdella matrice alimentare di partenza üdal tipo di esperimento che si deve effettuare, ecc.

In tutti i casi occorre:

1. Rompere la parete e la membrana cellulare

2. Separare gli acidi nucleici dagli altri componenti cellulari

Estrazione del DNA da brodocolture eda campioni alimentari

VantaggiVeloce (30 min.)

SempliceEconomico

Non contiene sostanze chimiche pericolose

Ridotta manipolazione dei campioniLega i cationi dei metalli pesantiRimuove eventuali inibitori della

PCR

Tale metodo di estrazione sfrutta l'alcalinità della soluzione e il trattamento termico a 100°C per rompere la parete cellulare, la membrana cellulare e le proteine.

La sospensione viene poi centrifugata, in modo tale da separare i polimeri del chelex ed i detriti cellulari dal sovranatante contenente il DNA batterico.

Estrazione con Chelex 100

Batteri Matrici alimentari

Salmonella Pollo, uova, tacchino, suino, bovinovegetali, latte, formaggi, molluschi,

tamponi ambientaliYersinia enterocolitica Suino, tonsille suino, vegetali,

acquaL. monocytogenes Salumi, latte, formaggi freschi,

salmone affumicato,vegetali, tamponi ambientali

C. botulinum Conserve, tamponi ambientali, feci, enema

S. aureus latte, formaggi freschi, creme, gelati

Campylobacter Pollo, uova, tacchino, suino, bovinovegetali, latte, formaggi, molluschi,

tamponi ambientali,

COMPONENTI di una REAZIONE di PCR

Stampo

Deossiribonucleotidi trifosfati Miscela equimolare di dATP, dTTP, dGTP, dCTP

Primers

DNA a doppio filamento

Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio

Tampone contenentecloruro di magnesio

Lo ione Mg2+ è essenziale per il funzionamento dell’enzima

EnzimaLa Taq polimerasi, enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus aquaticus

FASI della PCR

DENATURAZIONE

ANNEALING

ALLUNGAMENTO

Campioni di pollo contaminati da Campioni di pollo contaminati da SalmonellaSalmonella-- Ricerca mediante Ricerca mediante

PCR PCR

Marker bp 100, 1-2 campioni positivi, 3-4 campioni negativi, +=controllo positivo, -=controllo negativo

Necessità di validare solo metodi che includono la presenza di InternalAmplification Control (IAC)

Introduzione di un controllo interno per potere evidenziare inibIntroduzione di un controllo interno per potere evidenziare inib izioni izioni della matrice ed evitare i falsi negativi.della matrice ed evitare i falsi negativi.

Un risultato falsamente negativo è un problema di sanità pubblica

Un risultato falsamente positivo è un problema commerciale

Campioni di pollo contaminati da

Salmonella-Ricerca mediante PCR con

controllo interno

Marker bp 100, 1-2 campioni positivi, 3-4 campioni negativi, +=controllo positivo, -=controllo negativo

Il riscontro della positivitIl riscontro della positivitàà delldell’’IAC in assenza della positivitIAC in assenza della positivitàà del del campione, indica che il campione campione, indica che il campione èè veramente negativo.veramente negativo.

Limitazioni del gel d’agarosio

- Bassa sensibilità

- Il sistema non è automatizzato

- I prodotti dell’amplificazione vengono rivelati solo

nella fase di “plateau”

- Il bromuro di etidio non dà una risposta quantitativa

ed è potenzialmente mutagenico

RealReal Time PCR Time PCR Principi della TecnologiaPrincipi della Tecnologia

Cicli

Monitoraggiodella reazione

Analisi Ct

Plateau

Fase lineare

Fase esponenziale

Log [DNA]

Determinazione dei prodotti di PCR

mediante

Gel-EtBrPCR Real-Time

PCR Classica

Metodologia che permette di:Metodologia che permette di:

•• monitorare la reazione di PCR mentre questa si verifica monitorare la reazione di PCR mentre questa si verifica

•• registrare lregistrare l’’emissione della fluorescenza durante la reazioneemissione della fluorescenza durante la reazione

•Elevata sensibilità•Elevata specificità•Rapidità di risposta•Quantifica i microrganismi presenti nel campione•Ridotta possibilità di contaminazione •Automatizione (96 campioni)

Misura “step by step” la fluorescenza che si genera durante la reazione utilizzando due diversi sistemi di rilevamento dell’accumulo dei prodotti di PCR:

--coloranti che si legano ai doppi filamenti di DNAcoloranti che si legano ai doppi filamenti di DNA

--sonde legate a molecole fluorescentisonde legate a molecole fluorescenti

La misura viene seguita in tempo reale in thermal cycler dotato di fluorimetroHoorfarHoorfar J. J. etet al J. AOAC Int., 2005, 88, 45al J. AOAC Int., 2005, 88, 45

5’ 3’R Q

QUANTIFICAZIONE del PRODOTTO di PCR

Il ciclo della PCR in cui si ha un incremento significativo della F viene definito Ct. Tale Ct è inversamente proporzionale alla concentrazione del DNA

104 copie105106

Numero cicli

Fluo

resc

enza

Curva di fluorescenza di campioni a concentrazione nota

Estrapolazione della curva standard

N.

cicli

Log concentrazione

104 copie105106

linea di base

Si può risalire alla quantità di DNA iniziale in base ad una retta di taratura che pone in relazione i Ct con la qunatità inizilae di DNA bersaglio, e quindi estrapolare il valore della concentrazione di estrapolare il valore della concentrazione di campioni a titolo ignoto.campioni a titolo ignoto.

SYBR GreenEE’’ un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filaun colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento mento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.

DENATURAZIONEDENATURAZIONENon viene rilevata fluorescenzaNon viene rilevata fluorescenza

LL’’intensitintensitàà della fluorescenza comincia della fluorescenza comincia ad aumentaread aumentare

ANNEALINGANNEALING

ALLUNGAMENTOALLUNGAMENTO

LL’’intensitintensitàà della fluorescenza continua ad della fluorescenza continua ad aumentare e diventa massima al termine aumentare e diventa massima al termine

della fase di allungamentodella fase di allungamento

LL’’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA EAUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’’REGISTRATO A 530REGISTRATO A 530nmnm

SYBR GreenPrimer

Luce emessa

Polimerasi

Comparison between two standardized culturalmethods and 24 hours Duplex SYBR Green

Real-Time PCR assay for Salmonella detectionin meat samples

Sonde legate a molecole fluorescenti

5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza

3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter

5’ 3’

R Q

QuencherReporter

Raggio Laser

Energia Trasferita

FAMVICTET

5’ 3’

Quando la sonda è intatta R e Q si trovano vicinil’emissione di fluorescenza di R è soppressa da Q

QuencherReporter

5’

Raggio Laser

Sonda tagliata

3’

Quando la sonda viene degradata dall'attività 5’-esonucleasica della Taq polimerasi, R viene separato da Q e quindi potrà emettere piena fluorescenza alla sua specifica lunghezza d'onda

Ricerca della Salmonella negli alimentiMetodo ISO 6579/2002Campione 25g

Acqua peptonata tamponata (APT)225 ml

Sacchettosterile

Omogenizzazionein "Stomacher"

per 1'

37°C x 24 h41.5 °C x 24 h

37°C x 24h

1 ansata

1 ansata

XLD BGA DES BGA

XLD BGA XLD BGA

37°C x 24h

Prelievocoloniesospette

37 °C x 24 h

RappaportVassiliadisSoyabroth (10 ml)

Mueller Kauffman(10 ml)

Trip lesugarironagar

Test di agglutinazione

0.1 m

l

1 m

l

Estrazione DNA

Real time PCR

Rivelazione ed analisi dei risultati

Ricerca della Salmonella negli alimentiPCR real time

Tempo totale di analisi:5-7 giorniTempo totale di analisi: 1 giorno20 h prearricchimento30 min estrazione DNA1-2 h real time PCR

•Ha un’elevata specificità

• In una singola reazione si possono utilizzare più sonde

•Riesce a discriminare differenti ampliconi, in quanto ciascuna sonda può legare molecole fluorescenti diverse

SondaSYBR Green

•Può essere applicato ai protocolli sperimentali che sono già in uso per l’esecuzione della PCR classica

•legandosi indiscriminatamente ad ogni doppio filamento di DNA, la specificità della reazione deve essere determinata dalla temperatura di melting (Tm) dell’amplicone ottenuto

5’ 3’

R Q

Criteri per un saggio di real time PCRda standardizzare

Metodi di analisiI metodi utilizzati devono essere raccolti e documentati per iscritto secondo lo schema :1. Titolo2. Introduzione3. Precauzioni di sicurezza4. Scopo e campo di applicazione5. Riferimenti6. Definizioni7. Principio e reazioni8. Diluenti, terreni di coltura e altri prodotti9. Apparecchiatura e vetreria10. Campionamento11. Preparazione del campione per l’analisi12. Procedimento13. Espressione dei risultati14. Precisione15. Registrazione delle prove